CN104937105A

CN104937105A - Kv1.3拮抗剂及其使用方法

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Publication number: CN104937105A
Application number: CN201480006077.8A
Authority: CN
Inventors: E.祁; W.埃德瓦德斯; C.黃; W-P.梁; R.斯旺森; A.维肯登
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2015-09-23
Also published as: PT2948559T; IL239927B; AU2014209227B2; DK2948559T3; PH12015501627B1; ES2671434T3; AU2014209227A1; JP2016505639A; PH12015501627A1; US20190062383A1; EP2948559A4; HUE039465T2; NZ709913A; KR102268830B1; WO2014116937A1; JP6469590B2; UA117824C2; HRP20181055T1; EA201591380A1; BR112015017795A2

Abstract

本发明涉及Kv1.3拮抗剂、编码所述Kv1.3拮抗剂的多核苷酸，以及制备和使用所述Kv1.3拮抗剂和所述多核苷酸的方法。

Description

Kv1.3拮抗剂及其使用方法

本申请要求提交于2013年1月28日的美国临时申请61/757,389和提交于2013年1月25日的美国临时申请61/756,777的权益，所述美国临时申请以引用的方式全文并入。

技术领域

本发明涉及Kv1.3拮抗剂，编码该拮抗剂的多核苷酸，以及制备和使用上述拮抗剂和多核苷酸的方法。该拮抗剂基于OdK2肽的变体。

背景技术

离子通道经由离子电流的产生来调控多种多样的细胞功能，该细胞功能包括心脏的、CNS和免疫生理学功能。据估计5-30％之间的市售药品可调控离子通道活性(Overington等人，Nat Reviews Drug Discovery 5：993-6，2006)。亚家族选择性是提高当前非选择性药物的效率和安全性的新疗法的期望特征，并且使小分子和已知的天然存在的肽毒素面临重大挑战(Wickenden等人，Future Med Chem 4：661-79，2012)。在大型同源家族中尤其如此，诸如电压门控的K⁺、Ca⁺和Na⁺通道。

Kv1.3，即钾电压门控通道亚家族A的成员3，是在T细胞上表达的并且作用为调控T细胞活化。持续的钙信号传导是T细胞活化所需的，以用于经由钙调磷酸酶依赖性脱磷酸作用和活化T细胞核因子(NFAT)的核转位来上调细胞表面活化标记物和增加细胞因子的产生和增殖。来源于内质网的细胞内钙库的肌醇三磷酸(IP3)依赖性释放激活了细胞表面上的钙释放激活钙通道(CRAC)，从而提供细胞外钙的内流和持续的钙信号传导(在Cahalan等人，Immunol Rev 231：59-87，2009中查看)。钾外流是细胞保持超级化状态和维持钙内流以达成完全的T细胞活化所需要的。这种钾外流看起来是经由电压门控的钾通道Kv1.3和钙激活的钾通道KCa3.1来调控的。对Kv1.3具有选择性的阻滞剂已显示Kv1.3是负责调控钙信号传导的钾通道，甚至当不存在对KCa3.1的任何抑制时也是如此。(Beeton等人，Mol Pharmacol 67：1369-81，2005)。阻滞Kv1.3使T细胞去极化，并且抑制外钙内流、细胞因子产生，以及活化T细胞的体外增殖(查看Cahalan等人，Immunol Rev 231：59-87，2009)。

Kv1.3阻滞剂已经显示为减少自身免疫性模型中T细胞依赖性疾病的进展，所述疾病为诸如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性关节炎、迟发型过敏(DTH)、变应性接触性皮炎和血管球性肾炎(Rangaraju等人，Expert Opin Ther Targets 13：909-24，2009；Beeton等人，Proc Natl Acad SciU S A.103：17414-9，2006；Koo等人，J Immunol 158：5120-8，1997；Hyodo等人，Am J Physiol Renal Physiol 299：F1258-69，2010)。钙的钙调磷酸酶NFAT途径抑制剂环胞素A(新山地明、山地明、环孢霉素)和他克莫司(FK-506或藤霉素)是用于严重的免疫障碍的获批治疗物，该免疫障碍包括移植排斥和严重的类风湿性关节炎。钙调磷酸酶在组织如肾中的广泛分布可导致较高程度的来自药物机理本身的毒性、使安全边际变窄，以及这些化合物的有限治疗应用。使用选择性Kv1.3阻滞剂的T细胞抑制可导致增强的药物安全性，以及T细胞介导的炎症和自身免疫性疾病的治疗的较高效率。

Kv1.3可在调控体重增长和提高胰岛素敏感性方面起作用。Kv1.3缺陷型小鼠显示出降低的体重增长，较高的胰岛素敏感性，以及降低的血浆葡萄糖水平(Xu等人，Hum Mol Genet 12：551-9，2003)。Kv1.3阻滞剂已经显示为增强骨骼肌和脂肪组织中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的细胞表面表达，并且导致正常和ob/ob肥胖小鼠中增强的胰岛素敏感性，以及增强体外原代脂肪细胞中的葡萄糖摄入(Xu等人，Proc Natl Acad Sci USA 101：3112-7，2004)。在人体中，Kv1.3基因的单核苷酸多态性(SNP)已与减少的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性异常相关联(Tschritter，Clin Endocrinol Metab91：654-8，2006)。

Kv1.3可在接受血管手术诸如血管成形术之后的患者的平滑肌细胞增生性疾病如再狭窄中具有关键的功能。Kv1.3表达在人和小鼠平滑肌细胞增殖时增强。Kv1.3阻滞剂抑制外钙内流、减少平滑肌细胞迁移，并且抑制体外人静脉样本中的血管内膜增生(Cheong等人，Cardiovasc Res 89：282-9，2011)。

越来越多的证据指示Kv1.3通道在多种类型的细胞包括肿瘤细胞(Bielanska等人，Curr Cancer Drug Targets 9：904-14，2009)、小胶质细胞(Khanna等人，Am J Physiol Cell Physiol 280：C796-806，2001)的活化和/或增殖，以及神经祖细胞的分化(Wang等人，J Neurosci 30：5020-7，2010)中有所涉及，表明在神经炎症和神经退化疾病，以及癌症的治疗中Kv1.3阻滞剂可为有益的。

由多种生物体产生的毒素肽已经演进成了靶离子通道。蛇、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、蜗牛、海葵、昆虫、蛛形纲动物、刺胞动物、爬行动物，以及软体动物是产生可充当生物活性小毒素肽或“毒素”的丰富来源的毒液的生物体的一些示例，所述小型生物活性毒素肽或“毒素”强效地和选择性地将离子通道和受体作为目标。在大多数情况中，这些毒素肽已经通过以下方式而演化为离子通道的强效拮抗剂或抑制剂：通过结合至离子通道孔并物理阻滞离子传导通路，或者通过结合至离子通道孔外部的区域(例如，电压传感器域)而拮抗通道功能。毒素肽通常为约20-80个氨基酸长，具有不同的二硫键对，并且可基于他们的二硫键连接和肽折叠而被划分成多个超家族。许多毒液毒素经工程改造以提高他们的特性，诸如选择性(King，Expert Opin Biol Ther 11：1469-84，2011；Escoubas和King，ExpertReview Proteomics 6：221-4，2009)。

显示出Kv1.3阻滞的毒素肽包括ShK、OdK2、OsK1、玛格毒素、短肤蝎毒素等(参见Chandy等人，Trends in Pharmacol Sci 25：280-9，2004)。Kv1.3阻滞剂OdK2和OsK1(α-KTx3.7)是α-KTx3蝎毒素家族的同源成员，分别来源于希腊杀人蝎(Odontobuthus doriae)和约旦柱尾蝎(Orthochirusscrobiculosus)的毒液(Abdel-Mottaleb等人，Toxicon 51：1424-30，2008；Mouhat等人，Biochem J 385(Pt 1)：95-104，2005；国际专利公布WO2006/002850)。OsK1(α-KTx3.7)被报道为强效地阻滞Kv1.3、Kv1.1和Kv1.2通道并且适度地阻滞KCa3.1通道(Mouhat等人，Biochem J385(Pt 1)：95-104，2005)。OdK2(α-KTx3.11)被报道为阻滞Kv1.3，但是对Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5和Kv1.6无活性(Abdel-Mottaleb等人，Toxicon 51：1424-30，2008；Epub 2008Mar 29)。

经工程改造的毒素肽具有提高的效能、选择性和/或半衰期，所述毒素包括已经报道的OsK1和ShK(国际专利申请公布WO2006/002850；国际专利申请公布WO2006/042151；国际专利申请公布WO2008/088422，国际专利申请公布WO2006/116156)。

存在对更强效和更具选择性的Kv1.3阻滞剂的需求，以用于Kv1.3介导的疾病的治疗处理，所述疾病为诸如T细胞介导的炎症和自身免疫性疾病，诸如狼疮和多发性硬化症。

附图说明

图1是天然OdK2(SEQ ID NO：1)和OsK1(SEQ ID NO：2)(在图中示出为OsK-1)的氨基酸序列比对。半胱氨酸残基以灰色加亮显示。示出了二硫桥键和半胱氨酸对。OdK2和OsK1之间的九个相异残基以黑色加亮显示。

图2将A)KV1C2(Odk2-Fc融合体)和B)KV1N2(OsK1-Fc融合体)结合至Kv1.3E3C细胞(实线，黑色)，在10倍过量ShK的存在下结合至Kv1.3E3C细胞(虚线，灰色)，以及结合至Kv1.5(阴性对照细胞；点线，灰色)。使用流式细胞术用抗人Fc-Cy5检测结合。数据被示出为几何平均荧光强度(GMFI)的柱状图叠层(几何平均值，红色A：Cy5)。

图3KV1C2对记忆T细胞增殖的抑制(OdK2-Fc融合体)()。每一数据点是一式三份反应的平均值±SD。阴性对照IgG4 Fc(○)不抑制T细胞增殖。

图4在使用表达Kv1.3和Kv1.1的细胞进行的结合和铊通量测定中确定的A)氨基酸序列、B)肽变体融合蛋白的活性和选择性。

图5A)经纯化的Odk2嵌合体Fc融合蛋白在单一100nM浓度时对T细胞活化的抑制。KV1B03(■)与KV1C2(OdK2Fc融合体)(□)相同。B)KV1D261对T细胞活化的浓度依赖性抑制。阴性对照IgG4 Fc不抑制T细胞的IL-2产生。C)结合至Kv1.3E3C细胞和结合至T细胞抑制之间的相关性，用于选择变体。

图6p261C端延伸HSA融合蛋白文库的活性。示出了C端延伸的氨基酸序列和所得的延伸的p261氨基酸序列，以及在结合和铊通量测定中的活性。

图7A)p261B)p579C端延伸HSA融合蛋白的表征。

图8选择OdK2变体融合蛋白的特征。

图9KV1D261_34在小型猪体内的药代动力学。

图10在小型猪体内施用KV1D261_34后，对淋巴细胞的IL-17A分泌的体外抑制。

图11在迟发型超敏反应(DTH)小型猪模型中的抗原激发之后，在第10天引流淋巴结中的细胞数目。

发明内容

本发明提供一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，所述肽拮抗剂具有包含以下的氨基酸序列：

(i)以SEQ ID NO：1示出的序列，其在位置10处甘氨酸被异亮氨酸置换(G10I)，并且任选地具有1、2、3、4、5、6或7个附加的置换；或者

(ii)与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列还包括G10I置换。

本发明还提供分离的Kv1.3肽拮抗剂，该Kv1.3肽拮抗剂包含SEQ IDNO：55或SEQ ID NO：86的序列。

本发明还提供融合蛋白，该融合蛋白包含本发明的肽拮抗剂。

本发明还提供分离的多核苷酸，该多核苷酸对本发明的肽拮抗剂或融合蛋白进行编码。

本发明还提供载体，该载体包含本发明的分离的多核苷酸。

本发明还提供宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的载体。

本发明还提供一种制备本发明的拮抗剂或融合蛋白的方法，该方法包括：培养本发明的宿主细胞，以及回收由该宿主细胞表达的拮抗剂或融合蛋白。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的拮抗剂或融合蛋白，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供一种对具有与不期望的T细胞活化相关的病症的受试者体内的T细胞活化进行抑制的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的本发明的拮抗剂或融合蛋白以抑制T细胞活化。

具体实施方式

本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均以引用方式并入本文，如同在本文中完整呈现。

说明书和权利要求书中所用的“一种”、“该”和“所述”等单数形式包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。本文描述了示例性的组合物和方法，不过类似或等同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明实践或测试。

术语“多肽”是指包含至少两个氨基酸残基的分子，该至少两个氨基酸残基由肽键连接以形成多肽。小于约80个氨基酸长度的多肽可被称为“肽”。多肽也可被称作“蛋白质”。

术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其他等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型示例。

术语“互补序列”是指第二分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与第一分离的多核苷酸序列反向平行，并且包含与第一多核苷酸序列中的核苷酸互补的核苷酸。

术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常包含有要素诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA分子或RNA分子或这些分子的杂合体。

术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。

如本文所用的术语“野生型OdK2”或“OdK2”或“天然OdK2”是指具有以SEQ ID NO：1(GVPTDVKCRGSPQCIQPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK)所示的序列的蝎子(希腊杀人蝎)OdK2多肽。

如本文所用的术语“野生型OsK1”或“OsK1”或“天然OsK1”是指具有以SEQ ID NO：2(GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK)所示的序列的蝎子(约旦柱尾蝎)OsK1多肽。

如本文所用的术语“变体”或“OdK2变体”是指与SEQ ID NO：1所示的野生型OdK2多肽相差一个或多个修饰(例如，核苷酸或氨基酸的置换、插入或缺失)的多肽。

在整个说明书中，OdK2变体的残基编号根据SEQ ID NO：1。例如，本说明书中的“G10”是指在SEQ ID NO：1的位置10处的甘氨酸残基。因此，OdK2G10I是指在位置10处甘氨酸被置换为异亮氨酸的OdK2变体，以及OdK2G10I，P12R是指在位置10处甘氨酸被置换为异亮氨酸并且在位置12处脯氨酸被置换为精氨酸的OdK2变体。

当任意给定氨基酸残基或核苷酸残基的位置是通过参考选定的氨基酸或多核苷酸序列中的相同或等同位置来指定，而不是通过该序列中所述成分的实际计数位置指定时，给定氨基酸或多核苷酸序列的编号“对应于”或者是“相对于”选定的氨基酸或多核苷酸序列的编号。因此，例如，给定多肽序列中给定氨基酸位置的编号对应于用作参考序列的选定多肽序列中的相同或等同氨基酸位置。

“等同位置”(例如，“等同氨基酸位置”或“等同核酸位置”或“等同残基位置”)在本文中被定义为测试多肽(或测试多核苷酸)序列的位置(诸如，氨基酸位置或核酸位置或残基位置)，该位置当使用如本文所描述的比对算法进行最佳比对时，与参考多肽(或参考多核苷酸)序列的对应位置比对。测试多肽的等同氨基酸位置无需具有与参考多肽的对应位置相同的计数位置编号；同样，测试多核苷酸的等同核酸位置无需具有与参考多核苷酸的对应位置相同的计数位置编号。

当两个多核苷酸序列使用定义的参数，即定义的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(也被称为空位开放罚分)和空位延伸罚分比对以便达到该对序列可能达到的最高相似性分数时，所述两个多核苷酸序列是“最佳比对的”。BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(22)：10915-10919)通常被用作多肽序列比对算法(诸如BLASTP)中的默认评分置换矩阵。将空位存在罚分施加用于将单氨基酸空位引入比对序列中的一个序列中，并且将空位延伸罚分施加于空位中的每个残基位置。除非另外指明，否则本文所采用的比对参数为：BLOSUM62评分矩阵、空位存在罚分＝11、以及空位延伸罚分＝1。比对分数由比对开始和结束(例如，比对窗口)处的每个序列的氨基酸位置限定，并且任选地通过向一个或两个序列插入一个或多个空位来限定，以便达到最高可能的相似性分数。

如本文所使用的“Kv1.3”(也被称为KCNA3、HPCN3、HGK5、HuKIII或HLK3)是指熟知的人钾电压门控通道亚家族A成员3，其具有以Uniprot登录号P22001和以SEQ ID NO：418示出的序列。

如本文所用的“Kv1.3拮抗剂”或“拮抗剂”是指本发明的OdK2变体或OdK2变体融合蛋白，该OdK2变体或OdK2变体融合蛋白抑制或阻滞Kv1.3功能达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。野生型OdK2的氨基酸序列示出于SEQID NO：1中。

如本文所用的“融合蛋白”是指包含多肽或肽成分的蛋白，该多肽或肽成分来源于多于一种的亲本多肽或肽。

如本文所用的“半衰期延长部分”是指当缀合至OdK2变体时相较于自由肽延长所得OdK2变体融合蛋白的体内半衰期的分子或蛋白或结构域。

如本文所用的“结合百分比”或“结合％”是指OdK2变体融合蛋白相较于对照的几何平均荧光强度(Geo.MFI或GMFI)比率，该比率是使用表达Kv1.3或Kv1.1通道的细胞通过FACS测定获得的。

如本文所用的“结合选择性”是指所获得的Kv1.3结合％与所获得的Kv1.1结合％的比率。

如本文所用的“选择性的”或“选择性”是指OdK2变体融合蛋白或OdK2变体的Kv1.1的IC₅₀值与Kv1.3的IC₅₀值的比率。选择性可使用多种方法来评估，例如如本文所述的电生理膜片钳测定或铊通量测定。选择性可根据选择用于测量的测定法而略有差异。

Kv1.3阻滞肽Odk2(SEQ ID NO：1)和Osk1(SEQ ID NO：2)是α-KTx3蝎毒素家族的成员，两者之间存在九个位置的氨基酸序列差异。OdK2和Osk1都是38个氨基酸长度，并且各自通过三个二硫键在Cys8-Cys28、Cys14-Cys33和Cys18-Cys35之间配对来稳定化(Abdel-Mottaleb等人，Toxicon 51：1424-30，2008；Mouhat等人，Biochem J.385(Pt 1)：95-104，2005；国际专利公布WO2006/002850)。折叠肽形成α螺旋，该螺旋通过二硫键保持为接近3个成链的反向平行的β片。OdK2和OsK1是孔阻滞剂，通过结合至孔区域的外孔腔，将赖氨酸27插入水性孔道，并且阻断离子流来抑制通道功能。OsK1(α-KTx3.7)被报道为强效地阻滞Kv1.3、Kv1.1和Kv1.2通道以及适度地阻滞KCa3.1通道，分别具有0.014nM、0.6nM、5.4nM和225nM的IC₅₀(Mouhat等人，Biochem J 385(Pt 1)：95-104，2005)。OdK2(α-KTx3.11)被报道为阻滞非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus laevisoocytes)中的Kv1.3，具有7.2nM的IC₅₀，并且被报道为不具有对所测试的其他Kv1.x亚型(Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5和Kv1.6)的活性(Abdel-Mottaleb等人，Toxicon 51：1424-30，2008)。这些数据表明OsK1是非常强效的，但是缺乏足够的亚型选择性，而OdK2看起来是选择性的，但是不够强效。

本发明提供分离的抑制Kv1.3的OdK2变体和OdK2变体融合蛋白、对OdK2变体和OdK2变体融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞进行编码，以及使用本发明的多核苷酸和多肽的方法。当与具有保持的和/或增强的选择性的亲本分子比较时，本发明的OdK2变体和OdK2变体融合蛋白对Kv1.3更强效。本发明的多肽抑制由Kv1.3活性所致的钾电流、铊通量和/或T细胞活化，并且因此可用于与活化的T细胞相关的各种病症的治疗，该病症为诸如炎症和自身免疫性疾病。

拮抗剂肽

本发明提供一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，该Kv1.3肽拮抗剂具有包含以下的氨基酸序列：

在一些实施例中，分离的肽拮抗剂包含相对于SEQ ID NO：1具有不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个，或者不超过2个置换的序列。

在一些实施例中，分离的肽拮抗剂包含与SEQ ID NO：1具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列。

在一些实施例中，因此Kv1.3肽拮抗剂可包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110中的任一者的序列。置换G10I与对Kv1.3的提高的选择性和/或提高的亲和力相关。

在本文所述的一些实施例中，Kv1.3的拮抗剂包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(SEQ ID NO：426)；其中

a)Xaa₁是I或T，Q或E；

b)Xaa₂是N或D；

c)Xaa₃是K或R，E、A或Q；

d)Xaa₄是I、E、L、D、Q、H、V、K或A；

e)Xaa₅是E、K、L、Q、D、V或H；以及

Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。例如，Kv1.3肽拮抗剂可包含以SEQ ID NO：3、13、21、22、24、26、29、30、32、34、38、39、42-46、49、51、59、63、65、69、71、73、76、78、81-83、85、87、89、92、96、101、103、104和108示出的氨基酸序列。

在本文所述的一些实施例中，Kv1.3的拮抗剂包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(SEQ ID NO：427)；其中

Xaa₁是I或T；

Xaa₂是N或D；

Xaa₃是K或R；

Xaa₄是I或E；以及

Xaa₅是E或K；以及

Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。例如，Kv1.3肽拮抗剂可包含以SEQ ID NO：3、22、34或42示出的氨基酸序列。

如将通过参照图4A看出的，本发明的肽拮抗剂保留C8-C28、C14-C33和C18-C35之间的天然二硫桥键。在本部分中和其他地方所描述的本发明的示例性拮抗剂可具有对Kv1.3相较于对Kv1.1实质上增强的选择性，相较于SEQ ID NO：1为例如100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000或至少7000倍提高的选择性。

融合蛋白

本发明的拮抗剂可为分离的融合蛋白，该融合蛋白包含本发明的拮抗剂肽。在本文所述的一些实施例中，融合蛋白包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的序列，并且该序列包含相对于SEQ ID NO：1的置换G10I。

在本文所述的一些实施例中，融合蛋白包含Kv1.3肽拮抗剂，该肽拮抗剂缀合至半衰期延长部分，其中Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：1示出的序列，还包含G10I的置换，并且任选地具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个另外的置换。

在本文所述的一些实施例中，融合蛋白包含Kv1.3肽拮抗剂，该肽拮抗剂被缀合至半衰期延长部分，其中Kv1.3肽拮抗剂包含与以SEQ ID NO：1示出的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，还包含在残基位置10处甘氨酸被异亮氨酸置换(G10I)。

在一些实施例中，融合蛋白包含Kv1.3肽拮抗剂，该肽拮抗剂被缀合至半衰期延长部分，其中Kv1.3肽拮抗剂包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMINGKCHCTPK(SEQ ID NO：426)；其中

Xaa₁是I或T，Q或E；

Xaa₂是N或D；

Xaa₃是K或R，E、A或Q；

Xaa₄是I、E、L、D、Q、H、V、K或A；

Xaa₅是E、K、L、Q、D、V或H；以及

Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

在本文所述的一些实施例中，Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：3、13、21、22、24、26、29、30、32、34、38、39、42-46、49、51、59、63、65、69、71、73、76、78、81-83、85、87、89、92、96、101、103、104和108示出的氨基酸序列。

在本文所述的一些实施例中，拮抗剂是分离的融合蛋白，被融合蛋白包含Kv1.3肽拮抗剂，该肽拮抗剂被缀合至半衰期延长部分，其中Kv1.3肽拮抗剂包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(SEQ ID NO：427)；其中

Xaa₁是I或T；

Xaa₂是N或D；

Xaa₃是K或R；

Xaa₄是I或E；并且

Xaa₅是E或K；并且

Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

在本文所述的一些实施例中，Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：3、22、34或42示出的氨基酸序列。

在本文所述的一些实施例中，C端延伸包含以SEQ ID NO：123-268示出的氨基酸序列。

在本文所述的一些实施例中，C端延伸包含以SEQ ID NO：128、143、155、188、206-210、212、214、216、219、223、224、227、230、232-235、237、239、240、243、252、261-263或268示出的氨基酸序列。

当相较于天然OdK2序列的融合蛋白，诸如以SEQ ID NO：425示出的KV1C2(亲本KV1C2融合蛋白)时，本发明的OdK2变体融合蛋白更强效并且更具选择性。本发明的示例性融合蛋白是包含以SEQ ID NO：3、22、34或42示出的OdK2变体肽的那些融合蛋白，该融合蛋白经由接头AS(AP)₂₀GS(SEQ ID NO：116)被缀合至人血清白蛋白(HSA)。

亲本KV1C2融合蛋白具有约13nM(1.3×10^-8M)的IC₅₀，以用于抑制对用人Kv1.3转染的CHO细胞的全细胞膜片钳研究中的钾电流，以及具有约21.4nM(2.14×10^-8M)的IC₅₀值，以使用Tetra仪器(MolecularDevices)来抑制表达Kv1.3的细胞中的铊通量。当在材料和方法中所述的膜片钳测定中的IC₅₀值是约13nM(1.3×10^-8M)或更少，例如1.0×10^-8M、5.0×10^-9M、1.0×10^-9M、5.0×10^-10M、1.0×10^-10M、5.0×10^-11M、1.0×10^-11M、5.0×10^-12M、1.0×10^-12M或更少时，或者当在材料和方法中所述的铊通量测定中的IC₅₀值是约21.4nM(2.14×10^-8M)或更少，例如1.0x10^-8M、5.0×10^-9M、1.0×10^-9M、5.0×10^-10M、1.0×10^-10M、5.0×10^-11M、1.0×10^-11M、5.0×10^-12M、1.0×10^-12M或更少时，如本文所述的本发明的OdK2变体融合蛋白是“等效或更强效的”Kv1.3抑制剂。示例性融合蛋白的用于膜片钳和铊通量的IC₅₀值示于图8中。

如本文所述的本发明的OdK2变体和OdK2变体融合蛋白对Kv1.3具有选择性。可使用OdK2变体融合蛋白或OdK2变体的用于Kv1.1的IC₅₀值与用于Kv1.3的IC₅₀值的比率来评估对Kv1.1的选择性。可使用标准方法进一步测试对其他Kv通道(诸如Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5)，以及对hERG、KCa3.1或Nav1.5的选择性。如本文所述的本发明的示例性OdK2变体融合蛋白可具有对Kv1.3相较于对Kv1.1实质上增强的选择性，例如100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000或至少7000倍的选择性。亲本KV1C2融合蛋白对人Kv1.3具有当相较于对人Kv1.1时为68倍高的选择性，因此如本文所述的本发明的示例性OdK2变体融合蛋白可具有实质上增强的选择性，当相较于KV1C2融合蛋白时为例如约1.5、3、4.5、6、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或至少105倍的提高的选择性。已经观察到在SEQ ID NO：426中与Xaa₅对应的位置处存在谷氨酸以提高选择性。

残基位置4、5、9、15和16(残基编号根据SEQ ID NO：1的天然OdK2肽)可在天然OdK2中经置换以提高所得变体及其融合蛋白的效能和选择性。该残基位置可用任意氨基酸残基置换，只要所得OdK2变体或其融合蛋白在上述全细胞膜片钳测定或铊通量测定中分别保持约13nM(1.3×10^-8M)或21.4nM(2.14×10^-8)或更少的IC₅₀，并且具有对Kv1.3相较于对Kv1.1至少100倍的选择性(表达为使用如上所述的膜片钳获得的IC₅₀值的比率)。可用于每个所选位置处的多样化的氨基酸组包括在位置4处的氨基酸残基TIQE，在位置5处的ND，在位置9处的REAKQ，在位置15处的ELDIQHVKA，以及在位置16处的KELQDVH。在位置15处的谷氨酸(E)与对Kv1.3的增强的选择性相关。置换G10I与对Kv1.3的提高的选择性和/或提高的亲和力相关(残基编号根据SEQ ID NO：1)。使用上述氨基酸组进行的OdK2及其融合蛋白的多样化已经产生了当相较于天然肽或其融合蛋白时，展现出对Kv1.3的提高的结合亲和力和提高的结合选择性的变体。在另一种多样化方案中，可用于每个所选位置处的多样化的氨基酸组包括在位置4处的氨基酸残基IT，在位置5处的ND，在位置9处的KR，在位置15处的IE，以及在位置16处的EK。可使用熟知的测定和本文所述的测定来评估所得变体和/或其融合蛋白的选择性、效能、结合亲和力和结合选择性。具有提高的效能和选择性的示例性OdK2变体及其融合蛋白是以SEQ ID NO：3、22、34和42示出的变体及其人血清白蛋白或Fc融合蛋白。具有提高的结合亲和力和结合选择性％的示例性OdK2变体是以SEQ ID NO：3、13、21、22、24、26、29、30、32、34、38、39、42-46、49、51、59、63、65、69、71、73、76、78、81-83、85、87、89、92、96、101、103、104和108示出的变体。

其他OdK2变体和OdK2变体融合蛋白在本发明的范围内。例如，可对天然OdK2肽中除位置4、5、9、15和16以外的位置进行置换，只要所得OdK2变体及OdK2变体融合蛋白当相较于亲本分子时，对Kv1.3保持类似的选择性和效能即可。示例性的修饰为例如保守性置换，保守性置换将产生与亲本分子具有类似特性的OdK2变体融合蛋白。保守性置换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。基因编码的氨基酸可被分为四类：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)非荷电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳族氨基酸。另选地，氨基酸所有组成成分可以分组为：(1)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、(3)脂族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸任选地分别分组为含羟基脂族的；(4)芳族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫的(半胱氨酸和甲硫氨酸)(Stryer(编)，Biochemistry，第2版，WH Freeman and Co.，1981)。可对天然OdK2肽进行非保守性置换，该非保守性置换涉及不同类别的氨基酸之间的氨基酸残基的置换，以提高OdK2变体和OdK2变体融合蛋白的特性。可以使用本文所述的测定，通过评估修饰的多肽或片段以类似于未经修饰的多肽或片段的方式产生应答的能力，容易地确定多肽或其片段的氨基酸序列中的变化是否产生功能同系物。其中已发生超过一个置换的肽、多肽或蛋白质可以容易地以相同方式进行测试。具有产生增强的结合或结合特异性的置换的其他示例性OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白是具有以SEQ ID NO：4-12、14-20、23、25、27、28、31、33、35-37、40、41、47、48、50、52-58、60-62、64、66-68、70、72、74、75、77、79、80、84、86、88、90、91、93-95、97-100、102、105-107、109和110示出的氨基酸序列的那些。

如本文所述的OdK2变体(即，根据本发明的拮抗剂)可融合至半衰期延长部分，以形成本发明的融合蛋白。可使用的示例性半衰期延长部分包括熟知的人血清白蛋白、甲状腺素运载蛋白(TTR)、甲状腺素结合球蛋白(TGB)、白蛋白结合域，或其Fc或片段。也可使用生物学上合适的聚合物或共聚物，例如乙二醇、聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20000、葡聚糖、聚赖氨酸；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸脂、花生酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等；聚赖氨酸、辛烷或碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。

在另一个实施例中，本文所述的融合蛋白的半衰期延长部分是人血清白蛋白、白蛋白结合域(ADB)，或者聚乙二醇(PEG)。

在另一个实施例中，本文所述的融合蛋白的半衰期延长部分是人血清白蛋白。

在另一个实施例中，本文所述的融合蛋白的半衰期延长部分经由接头缀合至Kv1.3肽拮抗剂。

在另一个实施例中，本文所述的融合蛋白的接头包括以SEQ ID NO：112-122示出的氨基酸序列。

半衰期延长部分可直接地或经由接头间接地缀合至本发明的OdK2变体肽拮抗剂。可在如本文所述的本发明的融合蛋白中使用的示例性肽接头是具有以SEQ ID NO：112-122示出的氨基酸序列的接头。非肽半衰期延长部分可使用熟知的化学偶联方法而直接缀合至OdK2变体。例如，OdK2变体可使用已知的方法以及那些在美国专利US8043829中描述的方法而聚乙二醇化。在编码融合蛋白的核酸的翻译期间，肽或蛋白半衰期延长部分可连接至肽，如在下文更详细地解释。

包含半衰期延长部分的OdK2变体可通过若干熟知的测定来比较功能性。例如，偶联到PEG或人血清白蛋白的OdK2变体的药代动力学特性可在熟知的体内模型中进行评估。

在将延伸的肽缀合至半衰期延长部分之前，如本文所述的本发明的OdK2变体融合蛋白可经工程改造以将四个氨基酸的C端延伸结合至Odk2变体的C端。由于不希望受任何理论约束，据信对融合蛋白中OdK2变体肽的C端进行延伸将允许所述肽与Kv1.3通道的胞外环的相互结合作用增加并且效能增强。具有C端延伸肽部分的示例性OdK2融合蛋白示于图6、图7A和图8中。具有C端延伸肽部分的融合蛋白当相较于对应的不具延伸的融合蛋白时通常为更强效的Kv1.3抑制剂。本文所述的示例性C端延伸变体的IC₅₀值可为约1×10^-8M或更少，例如约1×10^-9M或更少、约1x10^-10M或更少、约1×10^-11M或更少，或者约1×10^-12M或更少，如在下文所述的铊通量测定中所测量的。示例性C端延伸是以SEQ ID NO：123-268示出的那些。

在另一个实施例中，本发明的分离的融合蛋白包括：

以SEQ ID NO：3、22、34或42示出的Kv1.3肽拮抗剂；

任选地以SEQ ID NOs：128、143、155、188、206-210、212、214、216、219、223、224、227、230、232、235、237、239、240、243、252、261-263，或268示出的C端延伸；

以SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：119示出的接头；以及

作为半衰期延长部分的人血清白蛋白。

在另一个实施例中，本发明的分离的融合蛋白包括：

以SEQ ID NO：42示出的Kv1.3肽拮抗剂；

以SEQ ID NO：116示出的接头；以及

作为半衰期延长部分的人血清白蛋白。

在另一个实施例中，本发明的分离的融合蛋白包括：

以SEQ ID NO：42示出的Kv1.3肽拮抗剂；

以SEQ ID NO：209示出的C端延伸；

以SEQ ID NO：116示出的接头；以及

作为半衰期延长部分的人血清白蛋白。

在另一个实施例中，本发明的分离的融合蛋白包括：

以SEQ ID NO：3示出的Kv1.3肽拮抗剂；

以SEQ ID NO：235示出的C端延伸；

以SEQ ID NO：116示出的接头；以及

作为半衰期延长部分的人血清白蛋白。

在另一个实施例中，本发明的分离的融合蛋白包括：

以SEQ ID NO：42示出的Kv1.3肽拮抗剂；

以SEQ ID NO：235示出的C端延伸；

以SEQ ID NO：116示出的接头；以及

作为半衰期延长部分的人血清白蛋白。

在另一个实施例中，当选择性作为分离的融合蛋白对Kv1.1的IC₅₀值与分离的融合蛋白对Kv1.3的IC₅₀值的比率而在用Kv1.1和Kv1.3分别转染的细胞中进行的膜片钳测定中测量时，如本文所述的本发明的分离的融合蛋白具有对人Kv1.3相较于对人Kv1.1至少100倍高的选择性。

在另一个实施例中，在用人Kv1.3转染的细胞中进行的膜片钳测定中，如本文所述的本发明的分离的融合蛋白以相较于以SEQ ID NO：425示出的亲本KV1C2融合蛋白的IC₅₀值至少约1/10的IC₅₀值来抑制钾电流。

在另一个实施例中，在用人Kv1.3转染的细胞中进行的膜片钳测定中，如本文所述的本发明的分离的融合蛋白以约1.5×10^-8M或更少的IC₅₀值来抑制钾电流。

在另一个实施例中，在用人Kv1.3转染的细胞中，如本文所述的本发明的分离的融合蛋白以约2.2×10^-8M或更少的IC₅₀值来抑制体外铊通量。

本发明的另一个实施例是一种分离的融合蛋白，该融合蛋白包含经由接头缀合至半衰期延长部分的Kv1.3肽拮抗剂，该Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸，其中

Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：3-110示出的氨基酸序列；

C端延伸包含以SEQ ID NO：123-268示出的氨基酸序列；

接头包含以SEQ ID NO：116或119示出的氨基酸序列；以及

半衰期延长部分是人血清白蛋白。

本发明的另一个实施例是一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，该肽拮抗剂包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(SEQ ID NO：426)；其中

Xaa₁是I或T，Q或E；

Xaa₂是N或D；

Xaa₃是K或R，E、A或Q；

Xaa₄是I、E、L、D、Q、H、V、K或A；

Xaa₅是E、K、L、Q、D、V或H；以及

Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

在另一个实施例中，分离的Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：3、13、21、22、24、26、29、30、32、34、38、39、42-46、49、51、59、63、65、69、71、73、76、78、81-83、85、87、89、92、96、101、103、104和108示出的氨基酸序列。

本发明的另一个实施例是一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，该肽拮抗剂包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(SEQ ID NO：427)；其中

Xaa₁是I或T；

Xaa₂是N或D；

Xaa₃是K或R；

Xaa₄是I或E；并且

Xaa₅是E或K；并且

Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

在另一个实施例中，分离的Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：3、22、34或42示出的氨基酸序列。

本发明的另一个实施例是一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，该Kv1.3肽拮抗剂包含以SEQ ID NO：3-110示出的序列。

本发明的OdK2变体多肽及其融合蛋白可通过化学合成来制备，诸如在自动化肽合成仪上进行的固相肽合成。另选地，本发明的多肽可通过使用无细胞表达系统从编码这些多肽的多核苷酸获得或者通过标准的重组表达系统获得，该无细胞表达系统为诸如基于网织红细胞裂解物的表达系统。本领域的技术人员会认识到其他用于获得本发明多肽的技术。

OdK2变体的产生通常是以核酸水平实现的。多核苷酸可通过以下方法合成：使用根据在美国专利US6521427和US6670127中描述的方法的化学基因合成法，使用简并的寡核苷酸来产生所需的变体，或者通过标准PCR克隆和诱变。变体文库可通过标准克隆技术产生，以将编码OdK2变体的多核苷酸克隆到载体中进行表达。

OdK2变体融合蛋白通常通过标准分子生物学方法制备。

使用本文所述的方法测试OdK2变体及其融合蛋白抑制Kv1.3的能力。示例性的测定是使用Tetra仪器(Molecular Devices)测量在过表达Kv1.3的细胞中对铊流入细胞的抑制的测定。另一种示例性的测定采用电生理学记录以使用熟知的膜片钳技术和本文所述的技术测量跨细胞膜的离子通量。

本发明的另一个实施例是一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包括编码本发明的OdK2变体和OdK2变体融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸还可以包含至少一个非编码序列，例如转录但不翻译的序列、终止信号、核糖体结合位点、mRNA稳定序列、内含子和聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列还可以包含编码另外氨基酸的另外序列。这些另外的多核苷酸序列可例如编码标记或熟知的标签序列，诸如六聚组氨酸或HA标签，所述标记或标签序列有助于融合多肽的纯化。本文公开了某些示例性的多核苷酸，然而在给定表达系统中给定遗传密码的简并性或密码子偏好性的情况下编码本发明的拮抗剂的其他多核苷酸也在本发明的范围内。

示例性多核苷酸是包含以SEQ ID NO：429-430示出的序列的多核苷酸。

本发明的另一个实施例是载体，该载体包含分离的多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的OdK2变体及其融合蛋白。本发明的载体可用于保持多核苷酸、复制多核苷酸或驱动本发明载体编码的多肽在生物系统(包括再造生物系统)中的表达。载体可以为染色体载体、附加型载体和病毒衍生载体，诸如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入要素、酵母染色体要素、杆状病毒、乳多空病毒(例如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒、小核糖核酸病毒和逆转录酶病毒的载体，以及衍生自它们的组合的载体，例如粘粒和噬菌粒。

在本发明的一个实施例中，载体是表达载体。表达载体通常包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列要素。此类要素可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于被编码多肽在给定表达系统中的表达的其他位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。适用于所编码多肽的表达的核酸序列要素和亲本载体序列也是熟知的。可用于本发明的多肽的表达的示例性质粒来源的表达载体包括大肠杆菌(E.coli)复制起点、氨苄青霉素抗性(Amp)基因、CMV启动子、信号序列，以及SV40聚腺苷酸化位点。

本发明的另一个实施例是包含本发明载体的分离宿主细胞。示例性宿主细胞包括古生菌细胞；细菌细胞，诸如链球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、肠球菌(Enterococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、蓝细菌(cyanobacteria)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)；真菌细胞，诸如克鲁维酵母(Kluveromyces)、酵母菌(Saccharomyces)、担子菌(Basidomycete)、白假丝酵母(Candida albicans)或曲霉菌(Aspergillus)；昆虫细胞，诸如果蝇(Drosophila S2)和夜蛾(SpodopteraSf9)；动物细胞，诸如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、CV-1、人黑色素瘤和骨髓瘤细胞；以及植物细胞，诸如裸子植物或被子植物细胞。本发明方法中的宿主细胞可以单个细胞或细胞群体的形式提供。细胞群体可以包括分离的或培养的细胞群体或存在于基质(例如组织)中的细胞群体。

将多核苷酸诸如载体引入宿主细胞可通过本领域的技术人员熟知的方法来实现。这些方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染和电穿孔。

本发明的另一个实施例是一种制备本发明的分离的融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：在足以表达至少一种odK2变体融合蛋白的条件下培养宿主细胞，以及回收由宿主细胞表达的融合蛋白。

宿主细胞可以在如下条件下培养：任何适合保持或增殖给定类型的宿主细胞并足以表达多肽。足以表达多肽的培养条件、培养基和相关方法是本领域中熟知的。例如，许多哺乳类细胞类型可以在37℃下用适当缓冲的DMEM培养基进行有氧培养，而细菌、酵母和其他细胞类型可以在37℃和适当的大气条件下在LB培养基中进行培养。

在本发明的方法中，OdK2变体的表达可使用各种熟知的方法来确认。例如，可使用检测试剂或者使用SDS-PAGE或HPLC来确认多肽的表达，该检测试剂为诸如使用例如FACS或免疫荧光技术的抗体。

治疗方法

本发明的另一方面是一种调节Kv1.3在生物组织中的活性的方法，该方法包括：使表达Kv1.3的生物组织与Kv1.3调节量的本发明的OdK2变体或其融合蛋白，或其药学上可接受的盐接触。

本发明的OdK2变体和OdK2变体融合蛋白可用于其中需要治疗、减轻或缓解Kv1.3介导疾病的症状的任何疗法中，所述Kv1.3介导的疾病为诸如炎症和自身免疫性疾病、糖尿病、肥胖症或癌症。

本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的示例包括哺乳动物，诸如人、啮齿类动物、狗、猫、动物园动物和农畜。

本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白可用于Kv1.3介导的病症的预防和治疗，该病症为诸如炎性病症、过敏和过敏性病症、超敏反应、自身免疫性疾病、严重感染，以及器官或组织移植排斥。本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白还可用于制备用于此类治疗的药物，其中该药物是制备用于以本文限定的剂量给药的。

本发明的一个实施例是一种对患有与不期望的T细胞活化相关的病症的受试者体内的T细胞活化进行抑制的方法，该方法包括：将有效量的本发明的分离的融合蛋白施用至受试者以抑制T细胞活化。

可使用熟知的方法来测量T细胞活化，诸如测量由T细胞造成的IL-2产生减少。如本文所用的“抑制T细胞活化”是指本发明的OdK2变体和OdK2融合蛋白抑制T细胞活化并使其减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％的能力。

在另一个实施例中，与不期望的T细胞活化相关联的病症是炎性病症、免疫和增生性疾病、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、骨关节炎、骨质疏松、葡萄膜炎、炎性纤维化、硬皮病、肺纤维化、肝硬化、炎性肠疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性哮喘、过敏、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发硬化症、银屑病、接触介导性皮炎、系统性红斑狼疮(SLE)和其他形式的狼疮、糖尿病、I型糖尿病、肥胖症、癌症、狼疮、再狭窄、系统性硬化症、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨再吸收、移植排斥，或者移植物抗宿主病。

Kv1.3通道是在T细胞和B细胞的所有亚群上表达的，但是效应子记忆T细胞和类别转换型记忆B细胞尤其取决于Kv1.3(Wulff等人，J Immunol173：776，2004)。Kv1.3在来源于患有新发1型糖尿病的患者的Gad5/胰岛素特异性T细胞中、在来源于MS患者的髓磷脂特异性T细胞中以及在来源于类风湿性关节炎患者的滑膜的T细胞中过度表达(Beeton等人，Proc NatlAcad Sci USA 103：17414-9，2006)，在乳腺癌组织中过度表达(Abdul等人，Anticancer Res 23：3347，2003)以及在前列腺癌细胞系中过度表达(Fraser等人，Pflugers Arch 446：559，2003)。已经描述了使用Kv1.3阻滞剂的动物模型在在如下模型中对卵清蛋白和破伤风类毒素的阳性结果：超敏反应模型(Beeton等人，Mol Pharmacol 67：1369，2005；Koo等人，ClinImmunol 197：99，1999)、关于多发硬化症的模型，诸如大鼠过继性转移实验性自身免疫性脑脊髓炎(AT-EAE)模型(Beeton等人，Proc Natl Acad SciUSA 103：17414-9，2006)、炎症性骨再吸收模型(Valverde等人，J BoneMineral Res 19：155，2004)、关于关节炎(Beeton等人，Proc Natl Acad Sci103：17414，2006；Tarcha等人，J Pharmacol Exper Therap 342：642，2012)和肥胖症、糖尿病以及代谢疾病(Xu等人，Hum Mol Genet 12：551，2003；Xu等人，Proc Natl Acad Sci101：3112，2004)的模型中。

可用本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白治疗的示例性Kv1.3介导的病症是炎性病症、免疫和增生性疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、骨关节炎、骨质疏松、葡萄膜炎、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、炎性肠疾病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、哮喘(包括变应性哮喘)、过敏、COPD、多发硬化症、银屑病、接触介导性皮炎、系统性红斑狼疮(SLE)和其他形式的狼疮、糖尿病、I型糖尿病、肥胖症、癌症、狼疮、再狭窄、系统性硬化症、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨再吸收、移植排斥，或者移植物抗宿主病。

本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白至患特定疾病的动物模型的施用可用于评估OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白的改善症状和改变病程的用途。可使用的动物模型是熟知的并且包括上述模型和以下模型：诸如胶原诱导性关节炎(CIA)模型、饮食诱导肥胖模型、2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导肠炎模型或者唑酮模型，所述模型诱导结肠中的慢性炎症和溃疡(Neurath等人，Intern Rev Immunol 19：51-62，2000)、天然CD45RB^高CD4 T细胞至RAG或SCID小鼠的过继性转移模型、供体天然T细胞攻击受体肠造成类似于人炎性肠疾病的慢性肠道炎症和症状(Read和Powrie，CurrProtoc Immunol，第15章，第15.13单元，2001)、卵清蛋白激发模型和醋甲胆碱致敏模型(Hessel等人，Eur J Pharmacol 293：401-12，1995)。

药物组合物

在其中需要对Kv1.3的活性进行抑制的病症治疗中有效的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白的“治疗有效量”可通过标准研究技术来确定。例如，将在炎性病症或自身免疫性疾病(诸如狼疮、多发硬化症或银屑病)的治疗中有效的试剂的剂量可通过将所述试剂施用至相关的动物模型来确定，该动物模型为诸如本文所述的模型。

此外，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。具体有效剂量的选择可由本领域的技术人员基于对若干因素的考量来确定(例如，通过临床试验)。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状况，以及技术人员已知的其他因素。在制剂中要使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可根据来源于体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线外推得到。

用于本发明的OdK2肽变体和/或OdK2变体融合蛋白的治疗用途的给药模式可为将变体递送至宿主的任何合适途径。这些变体的药物组合物尤其可用于肠胃外给药，例如皮内注射、肌内注射、腹膜内注射、静脉注射、皮下注射或鼻内给药。

可将本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白制备为药物组合物，该药物组合物包含有效量的变体作为在药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指稀释剂、辅药、赋形剂或施用该活性化合物时所使用的媒介物。此类药物媒介物可为液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可使用0.4％的盐水和0.3％的甘氨酸。这些溶液是无菌的并且一般不含颗粒物。这些溶液可使用常规的、熟知的灭菌技术(例如，过滤)来灭菌。这些组合物可包含近似生理条件所需的药用助剂，诸如pH调节和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类制药配方中本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白的浓度可大范围变化，即，从按重量计小于约0.5％，通常在或至少约1％至多达15或20％，并且将根据所选的具体给药模式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。

因此，可将用于肌内注射的本发明药物组合物制备成包含1ml的无菌缓冲水，以及在约1ng至约100mg之间，例如约50ng至约30mg，或更优选地约5mg至约25mg的本发明的OdK2变体和/或其融合蛋白。类似地，可将用于静脉内注射的本发明药物组合物制备成包含约250ml的无菌林格氏溶液，以及约1mg至约30mg，以及优选地5mg至约25mg的本发明的拮抗剂。用于制备可肠胃外给药的组合物的实际方法是熟知的并且在例如以下文献中更详细地描述：“Remington′s Pharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing公司，Easton，PA。

本发明的OdK2变体和/或OdK2变体融合蛋白可经冻干以贮存且在使用之前在合适载体中复原。此项技术已经显示为对常规的蛋白制剂有效，并且可采用本领域内已知的冻干和复原技术。

本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。

材料和方法

Kv通道表达构建体和细胞系。使用常规方法将编码各种Kv通道和嵌合体构建体的cDNA克隆到哺乳动物表达载体中。经克隆和表达的cDNA是编码人Kv1.3(hKv1.3)(SEQ ID NO：418)、人Kv1.1(hKv1.1)(SEQ ID NO：420)、人Kv1.2(hKv1.2)(SEQ ID NO：419)、人Kv1.5(hKv1.5)(SEQ ID NO：421)、hKv1.3 E3环/hKv1.5嵌合体(具有人Kv1.5氨基酸1-455和496-613，以及Kv1.3 E3环氨基酸456-495)(Kv1.3EC3环嵌合体)、具有N端His标签的hKv1.1 E3环/hKv1.5嵌合体(具有His标签氨基酸1-9、hKv1.5氨基酸10-472和513-63，以及hKv1.1E3环氨基酸473-512)(Kv1.1EC3环嵌合体)、大鼠Kv1.3(rKv1.3)(SEQ ID NO：422)、大鼠Kv1.1(rKv1.1)(SEQ ID NO：423)、食蟹猴(Macaca fascicu/aris)通道cynoKv1.3(SEQ ID NO：424)、hKv1.3/hKv1.5尾部嵌合体(具有人Kv1.5氨基酸1-250和497-593，以及Kv1.3氨基酸序列251-496(Kv1.3尾部嵌合体)，以及hKv1.1/hKv1.5尾部嵌合体(具有人Kv1.5氨基酸1-250和492-588，以及Kv1.1氨基酸序列251-491(Kv1.1尾部嵌合体)的那些cDNA。对于HEK细胞中的通道表达，将Kv基因克隆到CMV启动子驱动的表达载体中，该表达载体编码新霉素抗性标记。使用标准技术将HEK 293-F(Invitrogen，Carlsbad，CA)细胞稳定地转染并在DMEM 10％FBS和600μg/ml的Geneticin选择培养基中培养以产生表达Kv通道的克隆细胞系。

对于CHO稳定表达，CHO-TREx细胞(Invitrogen)是使用标准技术以pcDNA4/TO-Kv1.x稳定转染的，以便产生以可用四环素诱导的方式表达每个钾通道的克隆细胞系。培养基是Ham’s F-12，其补充有10％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、5μg/ml的杀稻瘟菌素和200μg/ml的博莱霉素。在一些实验中，使用在CHO细胞中使用脂质体2000进行的瞬时转染。对于电生理学实验，使细胞与表达截短的CD4的表达载体共转染，以进行表达控制(pMACs4.1，Milteni Biotech)。在转染后24-48小、时时进行测定。

蛋白表达和纯化。

将嵌合体文库表达成肽-Fc融合体或肽-HSA融合体。该文库初始是以48孔或96孔格式在HEK 293-E细胞中转染和表达的。将细胞在DMEM、10％FBS和250μg/ml的Geneticin中培养以进行选择。对于48孔表达，将0.5ml/孔的3.0×10⁵个细胞/ml接种在48孔培养板中。所述文库使用脂质体2000、使用利用300ng的质粒DNA、25μl的OptiPRO^TMSFM培养基和2.4μl的脂质体2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)的常规方法来转染。在第二天，将转染培养基吸出，并将0.5ml的293FreeStyle^TM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)添加至每一孔中。随后将细胞再温育96小时，接着收集上清液并使其通过0.2μm的过滤器(Varian)过滤。

对于96孔转染，将细胞以500xg旋转减慢5min，去除上清液，在293FreeStyle^TM培养基中重悬细胞，以及将所述细胞以在0.2ml/孔中0.6×10⁶个细胞/ml接种到96孔培养板中。将该文库以与48孔转染相同的方法转染。

HEK 293-F细胞被用于所有小规模和中试规模的转染。

肽-Fc融合体的小规模表达是使用常规方法，用蛋白A琼脂糖4FF树脂分批纯化的。简而言之，将20ml的澄清表达上清液与已在pH 7.2的DPBS中平衡的约0.5ml的树脂混合，并且在室温下搅拌不少于1小时。将蛋白A树脂用1ml的pH 7.2的DPBS洗涤，并且将结合蛋白用450μl的0.1M乙酸钠(pH 3.0)洗脱，用50μl的2M tris(pH 7.0)中和，以及用1xDPBS(pH 7.2)在4℃下透析过夜。

中试规模的表达是在AKTA Xpress^TM色谱系统(GE Healthcare)上亲和纯化的。在转染后第4天采集来自瞬时转染的HEK293-F细胞的表达上清液，以6000rpm离心澄清，然后过滤(0.2μm PES膜，Corning，Acton，MA)。肽-Fc融合体的相对含量是通过Octet仪器(ForteBio)使用加标到消耗性培养基中以产生标准曲线的对照毒素-Fc融合蛋白来确定的。样本随后用pH 7.0的10x PBS稀释至pH 7.0的1x PBS的最终浓度，并再次过滤(0.2μm PES膜)。将经稀释的上清液上样到已用pH 7.0的PBS在每ml树脂约10mg蛋白质的相对浓度下预平衡的HiTrap MabSelect Sure蛋白A柱(GE Healthcare)上。在上样之后，用pH7.0的PBS洗涤该柱，以及用10个柱体积的pH 3的0.1M乙酸钠洗脱蛋白。该蛋白级份通过以20％级份体积洗脱到包含pH 7的2.0M Tris的试管中而被立即中和。使用具有10kMWCO膜的离心超滤装置(Millipore)汇集和浓缩峰值级分。使用AKTAFPLC，使经浓缩的样本通过已在pH7.0的PBS中平衡并跑柱的Superdex200(16/60)柱(GE Healthcare)。通过非还原性的SDS-PAGE分析峰值级分，并汇集包含单体蛋白的级份。蛋白浓度是通过在BioTek SynergyHT^TM分光光度计上在280nm和310nm处的吸光度来确定的。可根据需要，用10KMWCO离心式浓缩仪(Millipore)浓缩纯化的蛋白。经纯化的蛋白的品质是通过SDS-PAGE、分析尺寸排阻HPLC(Dionex HPLC系统)，以及所测量的内毒素水平(LAL测定)来评估的。将经纯化的蛋白贮存在4℃下。

对于肽-HSA融合体，采集上清液，澄清，以及通过0.2μm过滤器过滤。在上样到预平衡的1mL HisTrap柱上之前，将10x DPBS添加至1x的最终浓度。使用咪唑的不连续梯度来洗脱蛋白。收集包含融合体的级分，并通过SDS-PAGE进行分析。汇集和浓缩包含所感兴趣蛋白的级分，以及在Superdex 200 26/60柱上跑柱。同样，收集级分，并通过SDS-PAGE进行分析。分别汇集包含肽-HSA融合体的单体和二聚体的级分，以获得最终产物。如上文所述地分析经纯化的蛋白，并将所述蛋白贮存在4℃下。

肽融合蛋白直接结合测定(“结合测定”)。

肽-Fc融合蛋白。所有的细胞培养试剂均购自Invitrogen。将用表达各种Kv通道的质粒来稳定转染的贴壁HEK 293F细胞在DMEM中培养，该DMEM补充有10％FBS和600μg/ml的Geneticin。Kv通道HEK细胞的单细胞悬浮液是通过以下方式制备的：用1x PBS冲洗贴壁培养物，随后用0.25％的胰蛋白酶EDTA冲洗培养物，以及在补充有2％FBS(FACS缓冲液)的冷1x PBS中重悬细胞至2×10⁶个细胞/ml的最终密度，以及将100μl/孔分配到96孔V型底的聚丙烯培养板(Costar)中。从此刻开始，步骤是在冰上或者是在4℃下进行的。将细胞以450xg离心2分钟，然后滗出上清液。将在消耗性Freestyle 293培养基中或在FACS缓冲液中归一化至16nM的100μl的肽-Fc样本添加至指定孔内的细胞沉淀物中并混合。为了区分特异性结合和非特异性背景，将10倍摩尔过量的合成性ShK肽(Bachem)添加至阴性对照反应物中，以竞争与肽-Fc融合蛋白的结合。将反应物在4℃下温育60-90分钟。在200μl的FACS缓冲液中冲洗细胞，以及随后在4℃下用100μl的山羊Fab’2抗人Fc Cy5缀合抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)温育细胞1小时，该抗体已在FACS缓冲液中按1∶200稀释。在200μl的FACS缓冲液中冲洗细胞，随后用100μl的BD Cytofix^TM固定缓冲液(BDBiosciences)重悬细胞，然后在4℃下贮存过夜。在FACSArray 96孔自动采样流式细胞仪(BD Biosciences)上读取反应物。用FloWJo软件(Treestar)分析数据，以获得各个反应物的几何平均荧光强度(Geo.MFI)。对于初步筛查结合测定，将每一变体的Geo.MFI直接与瞬时转染的野生型Odk2-Fc融合体(KV1C2)对照作比较，并且报告为亲本％。

肽-HSA融合蛋白。与用于肽-Fc融合体的直接结合测定相同地执行该测定，但是具有以下区别：细胞被悬浮至1×10⁶个细胞/ml的最终密度，然后将100μl/孔分配到96孔V型底聚丙烯培养板(Costar)中，以及将50μl的肽-HSA融合体样本添加至所述细胞。使用50μl的山羊抗人HSA生物素缀合物(AbCam产品目录号ab40378)检测HSA融合体，该山羊抗人HSA生物素缀合物已在FACS缓冲液中按1∶200稀释至2μg/ml并且预混有链霉抗生物素蛋白-PE缀合物()。在150μl的FACS缓冲液中冲洗细胞，随后用50μl的BD Cytofix^TM固定缓冲液(BD Biosciences)重悬细胞，然后在4℃下温育30分钟。如上文所述地读取反应物和分析数据。对于初步筛查结合测定，将每一变体的Geo.MFI直接与对照KVlD261_26融合蛋白(经由GS(G₄S)₈接头(SEQ ID NO：120)缀合至HSA的肽261)进行比较并且报告为结合％。

竞争性结合测定(“竞争性结合”)。所有的细胞培养试剂均购自Invitrogen。将用Kv通道表达构建体稳定转染的贴壁HEK 293F细胞在DMEM中培养，该DMEM补充有10％FBS和600μg/ml的Geneticin。Kv通道HEK细胞的单细胞悬浮液是通过以下方式制备的：用1x PBS冲洗贴壁培养物，随后用0.25％的胰蛋白酶EDTA冲洗培养物，以及在补充有2％FBS(FACS缓冲液)的冷1x PBS中重悬细胞至2×10⁶个细胞/ml的最终密度，以及将100μl/孔分配到96孔V型底的聚丙烯培养板(Costar)中。从此刻开始，步骤是在冰上或者是在4℃下进行的。将细胞以450xg离心2分钟，然后滗出上清液。将在消耗性Freestyle 293培养基中或在FACS缓冲液中的45μl的肽或肽融合蛋白样本添加至指定孔内的细胞沉淀物中并混合。将反应物在4℃下温育30分钟。将在细胞培养基或FACS缓冲液中的5μl的100nM抗毒素-2-Cys-TAMRA(Alomone labs)添加到每一孔中，接着混合，然后将反应物在4℃下温育60分钟。作为冲洗步骤将200μl的FACS缓冲液添加至每孔，以及将细胞以450xg离心2分钟，然后滗出上清液。用50μl的FACS缓冲液重悬细胞，并且在FACSArray 96孔自动采样流式细胞仪(BD Biosciences)上读取反应物。用FloWJo软件(Treestar)分析数据，以获得各个反应物的几何平均荧光强度(Geo.MFI或GMFI)。要获得浓度响应曲线，将跨每一化合物的浓度范围的Geo.MFI值变化用Graphpad Prism绘图，并且使用非线性回归以及s形剂量响应(可变斜率)曲线得到IC₅₀和Ki值。为了计算Ki，为抗毒素-2-Cys-T MRA指定0.20nM的Kvl.3KD值(David Triggle(编辑)，Voltage-Gated Ion Channels as Drug Targets，第29卷，第216页，Tab.7.2.2)。

铊通量测定。Kv构建体在G418选择下在HEK293F中稳定地表达。培养基是HyQ DME/高葡萄糖，培养基补充有10％FBS和600μg/mL的G418。将细胞按每孔10K个细胞接种到涂覆有聚赖氨酸的384孔微量滴定板中，随后在37℃下温育12-36小时。使用测定缓冲液以及使用BiotekEL405(4个周期，抽出至25μL/孔，随后添加100μL/孔)来冲洗细胞培养板。测定缓冲液包含(单位为mM)：130nM的NaCl、4mM的KCl、2mM的CaCl₂、1mM的MgCl2、10mM的HEPES、5mM的葡萄糖。按照制造商的说明将FluxOR染料(Invitrogen)在测定缓冲液加2mM的丙磺舒中溶解，随后添加至细胞。在室温下于黑暗中对细胞染色30分钟。随后用测定缓冲液冲洗掉染料。在测定缓冲液加0.2％的牛血清白蛋白(BSA)和2mM的丙磺舒中制备2X测试浓度的测试化合物。在添加25μL/孔的测试化合物溶液之后，将细胞在室温下于黑暗中温育30分钟。当细胞通过添加20μL/孔的刺激缓冲液而被激发时，在Tetra(Molecular Devices)中监测铊染料荧光。刺激缓冲液包含180mM的HEPES、90mM的KOH、2mM的CaCl₂、1mM的MgCl₂、5mM的葡萄糖、lmM的Tl₂SO₄。在添加所述激动剂后20秒时测量荧光变化。将数据根据对照孔(N＝16，每一10nM ShK用作全抑制对照，并且仅有缓冲液用作零抑制对照)的平均响应进行归一化。

T细胞抑制测定(“T细胞抑制测定”)。对IL-2分泌的抑制被用作T细胞抑制的指示。将冻存的经纯化的原代正常人CD4⁺和CD8⁺T细胞(AllCells LLC)解冻并且在补充有1％正常人A/B血清(Valley BiomedicalProd&Srv Inc.)的RPMI 1640(Invitrogen)中悬浮，最终密度为2×10⁶个细胞/ml，并且将100μl的细胞分配到96孔平底组织培养板(NUNC)中。对于肽-HSA融合蛋白，将经纯化的正常人血清白蛋白(SIGMA)添加至细胞培养基中，最终浓度为3％，以便在整个浓度响应实验期间维持恒定的HSA浓度。将肽融合蛋白和对照在细胞培养基中稀释，以及将50μl/孔添加至T细胞培养物中，然后在37℃/5％CO₂下温育30分钟。使用在细胞培养基中按1∶1的珠比细胞的比率稀释的抗人CD3/CD28T细胞扩增珠(Miltenyi Biotec)活化T细胞。将培养物在37℃/5％CO₂下温育约16小时，然后将上清液采集到96孔V底聚丙烯培养板(Costar)上，以及通过离心澄清。通过采用人IL-2Quantikine试剂盒(RnD Sytems)的化学发光免疫测定法分析澄清上清液的IL-2水平。用Graphpad Prism绘制最终IL-2水平，并且使用非线性回归以及s形剂量响应(可变斜率)曲线拟合得到IC₅₀值。一些实验是在单点5nM、100nM或250nM的肽融合蛋白浓度处进行的。

破伤风类毒素(TTX)T细胞测定。人PBMC是从接种破伤风类毒素疫苗的健康供体血液中通过使用Ficoll Pague(GE Healthcare Life Science)的不连续梯度离心纯化的。在96孔平底培养板中用3μg/ml的破伤风类毒素(Univ.of Massachusetts Biologic)在RPMI培养基中刺激10⁶个细胞/孔的PBMC达3天，所述RPMI培养基补充有2％的人血清、2mM的谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、10mM的HEPES、1mM的MEM非必需氨基酸溶液，以及各100U/ml的青霉素G和链霉素(Life Technologies)。在培养的第2天收集培养物上清液，以及通过用1uCi/孔的³H-胸苷(Perkin Elmer)脉冲过夜来测量细胞增殖。将结合有放射性胸苷的增殖细胞采集到玻璃纤维过滤板(Perkin Elmer)上，浸泡在闪烁体(Perkin Elmer)中以使用Topcount(Packard)对放射性活度进行计数。使用MSD检测技术(Meso Scale Discovery)来测量上清液中的细胞因子。

电生理学。将经转染的CHO或HEK细胞、CD4⁺或CD8⁺T细胞用于电生理学中。将细胞以低密度接种到玻璃盖玻片上。在实验的那天，将玻璃盖玻片放置到倒置显微镜的载物台上的浴槽中，并且用含以下成分的细胞外溶液灌流(大约1ml/分钟)：137mM的NaCl、2mM的CaCl₂、5.4mM的KCl、1mM的MgCl₂、5mM的葡萄糖，以及10mM的HEPES，0.1％牛血清白蛋白，pH为7.4。移液管填充有包含以下成分的细胞内溶液：40mM的KCl、100mM的KF、2mM的MgCl₂、10mM的EGTA、10mM的HEPES，pH为7.3至7.4，并且具有2至4MΩ的电阻。所有的记录是使用Multiclamp 700A放大器和pClamp 9软件(Axon Instruments)在室温(22-24℃)下进行的。瞬时转染的CHO细胞是使用涂覆有抗CD4的微珠(Dynabeads，InVitrogen)来鉴定的。外向钾电流是使用膜片钳技术的全细胞配置在从-80mV的细胞钳制电位至20-40mV的测试电位处测量的。液体接界电势被计算为在20℃时为7.1mV，并且电压命令未经校正。在2-5KHz处获得电流记录，并且在1-2KHz处对其滤波。每隔20s读出电流一次，并且在记录之前使所述电流稳定5-10分钟。使用SF-77B快速步进程控灌流装置(Warner Instruments)施加化合物。对每种细胞测试化合物的1-4种浓度。

数据分析：

浓度响应数据或剂量响应数据是通过非线性回归(Graph Pad Prism，第4.0版)，使用以下的四参数广义逻辑斯谛方程拟合的：

效能被表达为产生50％的最大效应(pIC₅₀或pEC₅₀)的浓度的-log 10。

肽合成。Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂(0.47mmol/g的取代)可购自Peptide International，而伪脯氨酸二肽，即Fmoc-Ile-Ser(ΨMeMe pro)-OH可购自Novabiochem。所有其他的氨基酸可购自Applied Biosystems(ABI)或Anaspec。用于自动固相肽合成(SPPS)的试剂可购自ABI。化学合成所需的其他试剂购自Sigma/Aldrich。肽合成在Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂(222mg，0.104mmol)上通过使用ABI 433A型自动化肽合成仪的SPPS进行。根据制造商的协议来使用用于HBTU/HOBt/DIEA活化的标准0.1-mmol标度的FastMoc MonPrevPeak协议。将伪脯氨酸二肽，即Fmoc-Ile-Ser(Ψ^MeMe pro)-OH结合到在序列GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-树脂(SEQ IDNO：42)中以粗体和下划线示出的位置处。氨基酸侧链官能团是如下保护的：Arg(Pme)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Glu(OtBu)、Gln(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)和Thr(tBu)。

在环境温度下，在(TFA(20mL)、苯酚(1.5g)、1，2-乙二硫醇(4.0mL)、苯甲硫醚(1.0mL)、水(1.0mL)和三异丙基硅烷(1.0mL))中从树脂裂解肽达六小时。通过过滤移除树脂，并且用额外的TFA(2mL)冲洗该树脂。合并滤液，以及将肽用预冷的乙醚(400mL)沉淀。通过过滤分离肽，用二乙醚冲洗肽，以及真空干燥得到370.0mg的粗制直链产物：(GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK；SEQ ID NO：42)。在环境温度下，将粗制直链肽以100μg/mL的肽浓度在0.1M的Tris-HCL、1.0M的胍-HCL、1.0mM的EDTA、3.0mM的还原型谷胱甘肽和0.3mM的氧化型谷胱甘肽中氧化。在25小时后通过逐滴添加冰醋酸将pH降低至3.9来终止反应，以及冷冻和冻干所述肽。通过Vydac C-18RP-HPLC来纯化粗制肽。分析性RP-HPLC、毛细管电泳和LC/MC确定了纯度和分子量。

实例1

野生型OdK2和OsK1肽及其融合蛋白的表征

将野生型OdK2(SEQ ID NO：1)和OsK1(SEQ ID NO：2)肽使用常规和如本文所述的方法，使用接头GS(G₄S)₄(SEQ ID NO：119)克隆和表达为IgG4 Fc融合蛋白。所得的融合蛋白分别被命名为KV1C2(OdK2-Fc融合体)和KV1N2(OsK1-Fc融合体)。天然OdK2肽是从伊朗黄蝎(Iranianscorpion Odonthobuthus)的毒液中分离和纯化的，伊朗黄蝎可从比利时卢汶大学的教授Jan Tytgat处获得，并且重组OsK1肽可得自Alomone实验室。天然肽及其融合蛋白通过使用电生理学将其结合至Kv1.3后Kv1.3的效能和选择性，抑制T细胞活化的能力，以及药代动力学研究来表征。

结合至表达Kv1.3的细胞

如上文所述地在表达hKv1.3EC3环嵌合体的稳定细胞中进行结合测定。KV1C2(OdK2-Fc融合体)在FACS测定中产生为本底的12.8倍的信号，并且KV1N2(OsK1-Fc融合体)产生为本底的133.0倍的信号(图2)，表明对所表达的Kv1.3通道的高水平结合。结合看起来是特异性的，因为在存在10倍过量ShK的情况下未观察到至表达人Kv1.3EC3环嵌合体的细胞的结合。结合还是选择性的，因为KV1C2(OdK2-Fc融合体)和KV1N2(OsK1-Fc融合体)并不结合至表达人Kv1.5的细胞。

电生理学

对用人Kv1.3、Kv1.1、Kv1.2和Kv1.5离子通道转染的CHO细胞进行全细胞膜片钳研究。Osk1和Odk2皆强效地抑制Kv1.3电流。OsK1肽对Kv1.3比OdK2显著地更强效，但是这两种肽对Kv1.1的选择性倍数相似。KV1C2(OdK2-Fc融合体)和KV1N2(OsK1-Fc融合体)当相较于天然肽时对Kv1.3具有约1/30-1/100的效能。然而，KV1C2选择性(计算为Kv1.1IC₅₀除以Kv1.3IC₅₀)相对于天然肽提高了约3-4倍。通过电生理学测定的IC₅₀值和选择性比率示出于表1。

表1.

*接头＝GS(G4S)4，SEQ ID NO：119

**IC₅₀(Kv1.1)/IC₅₀(Kv1.3)

NA＝未进行

对T细胞活化的抑制

KVlC2(OdK2-Fc融合体)阻滞Jurkat T细胞系、原代CD4⁺人T细胞(从正常人供体中分离)以及用Kv1.3转染的HEK和CHO细胞中的Kv1.3细胞电流。KV1C2(OdK2-Fc融合体)还阻滞由用抗CD3/CD28活化的原代人CD4⁺和CD8⁺T细胞产生细胞因子。KV1N2(OsK1-Fc融合体)阻滞Jurkat T细胞系中的Kv1.3细胞电流，与抗毒素2-cys-TAMRA竞争结合至表达hKv1.3 EC3环嵌合体的细胞，抑制来自表达hKv1.3 EC3环嵌合体的细胞的铊通量，以及测试KV1N2抑制CD4⁺T细胞活化的能力。表1示出了从手动膜片钳电生理学所获得的IC₅₀值。KV1C2(OdK2-Fc融合体)还在如上所述的测定中在用经丝裂霉素C处理的自体抗原呈递细胞活化后抑制T细胞增殖，该自体抗原呈递细胞展示破伤风类毒素抗原(图3)。

OdK2-Fc融合蛋白的半衰期

通过以5ml/kg静脉内推注给药在pH7.0的1xPBS中的2mg/ml原液，最终剂量为10mg/kg来对Sparague Dawley大鼠施用KV1C2(OdK2-Fc融合体)。血浆浓度通过如上所述的抗Fc ELISA或FACS确定。大鼠体内的KV1C2半衰期(T_1/2)是60小时。

实例2

OdK2嵌合肽Fc融合体(“OdK2/Osk1嵌合体文库”或 “KV1C2L1”)的产生

天然OdK2和OsK1毒素肽序列具有高度的序列相似性，在9个氨基酸残基处相异(图1)。为了形成具有增强的Kv1.3效能和Kv1.x亚型选择性的肽变体，使用GS(G₄S)₄接头(SEQ ID NO：119)产生肽-接头-Fc变体的组合文库，其中OdK2肽氨基酸序列在9个位置中的8个位置处有差异，OdK2序列与OsK1相异(在OdK2，SEQ ID NO：1中的位置3、4、5、9、10、12、16和20)。位置15不包含在文库多样化中，这是因为在此位置处异亮氨酸与亮氨酸的相似性。所述位置使用在每一位置处存在的OdK2和OsK1氨基酸残基来多样化。因此，位置3使用PI来多样化，而位置4、5、9、10、12、16和20分别使用TI、DN、RK、GI、RP、EQ和KD来多样化。文库设计还基于先前的报告加入了六个变体与位置16处的赖氨酸置换，所述先前报告为这种突变增强了OsK1肽的效能(Mouhat等人，Biochem J 385：95-104，2005)，以及由于在正确的OdK2氨基酸序列中的初始不一致而加入了在位置38处的谷氨酰胺置换。因此，OdK2/Osk1嵌合体文库由264个全体成员构成，成员包括赖氨酸置换变体、OdK2K3gQ变体，以及亲本分子KV1C2(Odk2融合体)和(OsK1融合体)。位置编号根据SEQ ID NO：1所示的天然OdK2肽序列。

文库使用常规分子生物学方法以及如上文所述的方法产生和表达。

使用粗制上清液并使用以hKv1.3EC3环嵌合体转染的HEK细胞系来筛查文库对hKv1.3的结合，以及通过结合至如上文所述的以hKv1.1EC3环嵌合体通道转染的HEK细胞系来筛查文库的选择性。在初级筛查中，结合被测量为对照KV1C2的结合％(结合％)，并且选择性被测量为对Kv1.3的结合％与对Kv1.1的结合％的比率。图4示出了从铊通量测定获得的氨基酸序列、结合％、选择性和IC₅₀值，以用于选择从OdK2/Osk1嵌合体文库(KV1C2L1文库)以及从在实例4中所述的氨基酸扫描文库(KV126L1文库)获得的变体。

进一步表征当相较于亲本KV1C2(OdK2-Fc融合体)时表现出＞80％的对Kv1.3的结合以及＞1.3倍的对Kv1.1的选择性的选择融合蛋白。

实例3

OdK2嵌合肽Fc融合体的表征。

将在实例2中鉴定的选择OdK2嵌合肽Fc融合蛋白如上文所述地纯化，并且用次级结合测定、电生理学和T细胞抑制测定来表征。

电生理学

在全细胞膜片钳研究中，使用如上文所述稳定转染的CHO评估选择变体的效能和选择性。以单一浓度(对于Kv1.3为1nM或者对于Kv1.1为100nM)评估经纯化的变体对人Kv1.3或人Kv1.1的抑制(表2)。相对于亲本KV1C2，所选的变体具有对Kv1.3显著增强的活性，但是对Kv1.1相似的活性。

IC₅₀值是使用以如在材料和方法中所描述的人Kv1.3或Kv1.1稳定转染的CHO细胞，从对选择OdK2嵌合肽Fc融合体的手动膜片钳电生理学研究获得的。选择性倍数被计算为IC₅₀(Kv1.1)与IC₅₀(Kv1.3)的比率。表3分别示出了选择变体和亲本OdK2以及OsK1融合体KV1C2和KV1N2的IC₅₀值。

表2.

融合蛋白	Kv1.3在1nM处的抑制％	Kv1.1在100nM处的抑制％
			KV1D197	83	37
KV1D37	67	40
			KV1D267	64	49
KV1D229	85	54
			KV1D261	85	61
KV1D161	76	63
			KV1D69	86	64
KV1C2*	36	40
			KV1D280	-	97**

*亲本(OdK2-Fc融合体)

**10nM处的融合蛋白

表3.

*通过膜片钳电生理学研究获得的IC₅₀值

**选择性＝IC₅₀(Kv1.1)/IC₅₀(Kv1.3)

基于膜片钳研究，OdK2嵌合肽Fc融合蛋白当相较于亲本KV1C2(OdK2-Fc融合体)时具有从约28至约87倍提高的Kv1.3效能和约3至9倍提高的选择性，以及当相较于亲本KV1N2(OsK1-Fc融合体)时具有约85倍提高的选择性。

对T细胞活化的抑制

选择OdK2嵌合肽Fc融合体的特征在于其抑制T细胞活化的能力，该能力被测量为对从如在材料和方法中所描述的抗CD3/C28诱导的T细胞分泌IL-2的抑制。抑制是以单一浓度(100nM)的OdK2嵌合肽Fc融合体测量的，并且结果在图5A中被示出为对最大IL-2产量的抑制％。KV1B03与亲本KV1C2(OdK2融合体)相同，并且在文库构建期间被附带地重新形成。图5B示出用KV1D261活化的T细胞对IL-2产生的浓度依赖性抑制。KV1D261融合蛋白的CD4⁺T细胞抑制的IC₅₀值为1.66nM。

在文库的初级筛查期间使用粗制上清液来评估对T细胞活化的抑制和对Kv1.3的结合之间的相关性，以使用结合测定来评估鉴定功能性Kv1.3阻滞剂的能力(图5C)。经确定在两种测定之间存在显著的相关性(Pearson相关性r 0.9339，p＜0.0001)。

融合蛋白的拮抗效应归因于肽部分

为了确定OdK2嵌合肽Fc融合体的抑制特性和选择性是否由肽部分保持，比较选择OdK2嵌合融合体与对应合成肽的特性。

KV1D261和对应的合成肽p261(SEQ ID NO：42)表征为Kv1.3的效能和选择性，对大鼠Kv1.3通道的交叉反应性，以及对T细胞活化的抑制。hERG是使用常规方法测定的，诸如在Dubin等人，J Biomol Screen.10：168-81，2005中提及的那些。除了大鼠Kv1.3和hKCa3.1以外，所使用的所有细胞系稳定地表达所关注的通道。KV1D261和对应合成肽p261的实验结果示出于表4中。合成肽在电生理学和T细胞抑制两方面比Fc融合体的效能高约10倍，并且当与对应的融合蛋白比较时保留选择性，这表明经工程改造的肽区域负责表达效能和选择性的特性。由于随着分子量增大而熵增加，所以预计当与Fc融合时效能损失。

表4.

ephys：电生理手动膜片钳

*CHO细胞中的IC₅₀(hKv1.x)/IC₅₀(hxv1.3)比率

KV1D261的药代动力学特性

通过以1.2ml/kg静脉内推注给药在pH7.0的1xPBS中的8.3mg/ml原液，最终剂量为10mg/kg来对Sparague Dawley大鼠施用KV1D261(261-Fc融合体)。使用ELISA和FACS测定两者来测量蛋白。半衰期被评估为约72小时。

实例4

氨基酸扫描文库(KV1D26L1文库)的产生

为了进一步提高Kv1.3阻滞肽的选择性，通过对KV1D26(对应肽p26，SEQ ID NO：111)的肽区域的每一非半胱氨酸残基处的9种氨基酸(A，R，Q，E，H，L，K，V，D)进行单一置换来设计扫描文库，KV1D26为从在实例2中所述的OdK2/Osk1嵌合体文库鉴定的强效但是非选择性的变体。该氨基酸扫描文库由270种变体构成。

该文库使用常规分子生物学方法以及如上文所述的方法产生和表达。简而言之，编码所述变体肽的基因是使用合成基因装配(美国专利US6521427和美国专利US6670127)合成的并且符合读框地用GS(G₄S)₄(SEQ ID NO：119)接头IgG4 Fc融合配偶体在哺乳动物表达载体中克隆。

文库如上所述地表达，并且作为粗制上清液来筛查所述文库对用人Kv1.3EC3环嵌合体通道转染的HEK细胞系的结合，以及通过结合至以如上所述的人Kv1.1EC3环嵌合体通道转染的HEK细胞系来筛查所述文库的选择性。活性按照每一变体的定量而归一化。对Kv1.3的结合％和对Kv1.1的结合％被表示为如在材料和方法中描述的亲本KV1C2(OdK2-Fc融合体)的百分比。还在铊通量测定中使用如在材料和方法中所述的两种细胞系来筛查文库。

图4A示出了选择变体的序列。结合以及铊通量数据汇总于图4B中。

来自所述氨基酸扫描文库的多种变体表现出对Kv1.3比对Kv1.1增强的结合和选择性。根据所述结合测定筛查，赖氨酸置换为谷氨酰胺一致地导致对Kv1.3相较于对Kv1.1增强的选择性。进一步纯化和表征表现出＞80％的对Kv1.3的结合和＞1.3倍的相较于Kv1.1的选择性的选择变体。

实例5

从氨基酸扫描文库(KV1D26L1文库)获得的变体的表征

与Kv毒素抑制剂的竞争

纯化选择变体，并且用如上文所述的单点和浓度响应测定评估所述选择变体与已知的Kv1.3抑制剂、抗毒素-2-CysTAMRA竞争的潜能。在表达人Kv1.3EC3环嵌合体的稳定HEK293细胞中，使用10nM的抗毒素-2-CysTAMRA评估抑制，其中每一变体为40nM以用于单点读取，或者从0.015nM至4μM以用于浓度响应研究。

对抗毒素-2-CysTAMRA结合的抑制％和选择变体的IC₅₀值示出于表5中。选择变体以与KV1D261相似的水平抑制抗毒素-2-CysTAMRA对Kv1.3的结合，并且IC₅₀值在从5nM至1.3μM的范围内，而且所述变体中的若干者处于KV1D261的低纳摩尔级范围内。

表5.

NA：未进行

0：无可测得的抑制

对T细胞活化的抑制

选择变体抑制T细胞活化的能力是如上所述使用IL-2分泌作为活化的标记来评估的。

以5nM或250nM的单一变体浓度或者使用用于浓度响应的从0.015nM至250nM的范围来进行评估。选择变体对最大值信号的抑制％示出于表5中。

KV1D579是强效和选择性的Kv1.3抑制剂

用如上文所述的人Kv1.3、Kv1.1或Kv1.6转染的HEK细胞来在全细胞膜片钳研究和铊通量测定中研究KV1D579。KV1D579与亲本KV1D26的IC₅₀值一起列出于表6中，亲本KV1D26为在实例2中分离的OdK嵌合体-Fc融合变体。括号中的值从铊通量测定获得，不在括号中的值从膜片钳研究获得。

表6.

括号中的值是从铊通量抑制测定获得的

*IC₅₀(Kv1.x)/IC₅₀(Kv1.3)的比率

实例6

C端延伸文库(KV1D819L1文库)的产生

已发现使用接头GS(G₄S)₄(SEQ ID NO：119)缀合的若干肽-Fc融合蛋白诱导体外的休眠人外周血单核细胞的培养物中的不期望的炎性细胞因子释放，而对应的合成肽自身则不会。因此，不期望的细胞因子释放可归因于二价肽-Fc融合体或Fc自身的格式。

为了阻止不希望的细胞因子释放，肽261(p261)(SEQ ID NO：42)使用接头GS(G₄S)₄(SEQ ID NO：119)合成为人血清白蛋白融合蛋白。

所得融合蛋白(KV1D261_23)的效能通过以下方式而被进一步优化：基于KV1D261_23产生融合蛋白文库，其中肽p261在其C端处延伸四个氨基酸。假设延伸KV1D261_23融合蛋白的肽区域的C端将使得肽与Kv1.3通道的细胞外环的结合相互作用增强，从而增强效能。

KV1D261_23融合蛋白是通过以下方式修饰的：在肽的C端与居间GS(G₄S)₄接头(SEQ ID NO：119)之间插入4个额外的氨基酸，其中在261肽中的新位置39、40、41和42处具有每个位置以下12个残基的完整组合(Q、R、P、H、K、T、N、S、E、G、A，以及D)。各残基的比率为1，不同的是R为1.5，以及S为0.5，并且该文库的可能变体的所得理论数目为12⁴(20,736)。用于具有变体C端延伸的肽的基因编码是如先前所述合成的，并且使用常规分子生物学方法，符合读框地用GS(G₄S)₄接头(SEQ IDNO：119)和人血清白蛋白融合配偶体在哺乳动物表达载体中克隆。

文库在瞬时转染的HEK293细胞中重组表达。使用直接结合测定和功能性铊通量测定，以及使用以人Kv1.3尾部嵌合体通道转染的HEK细胞系筛查粗制上清液对Kv1.3的效能，并且用人Kv1.1尾部嵌合体通道转染的HEK细胞系来筛查该粗制上清液的选择性。对该文库的较高命中为碱性(R、H和K)、酸性(T、N和G)，以及无极性(A和P)残基。图6示出选择融合蛋白的结合和铊通量测定的结果。

实例7

C端延伸文库(KV1D819L1文库)的表征

纯化从C端延伸文库中鉴定的选择候选序列，并确认该候选序列对Kv1.3的结合。浓度响应曲线是针对铊通量测定产生的。表7示出了在铊通量测定中测定的IC₅₀值，以及每一变体的C端延伸的氨基酸序列。KV1D261_26(使用GS(G₄S)₈接头(SEQ ID NO：120)的p261-HSA融合体)在所述测定中用作对照。大部分p261C端延伸肽融合体当相较于具有非延伸肽部分的对照时，在铊通量测定中展示出相似或增强的效能。相较于KV1D261_23一直具有更长接头的KV1D261_26融合体被测试出效能为KV1D261_23(使用Gs(G₄S)₄接头(SEQ ID NO：119)的p261-HSA融合蛋白)的约5倍高。

表7.

*人血清白蛋白

**SEQ ID NO：119

实例8

肽HSA融合蛋白工程改造

使用各种接头将肽261工程改造为与人血清白蛋白(HSA)融合的融合蛋白，并且测试所得融合蛋白的Kv1.3效能和选择性，以及对T细胞活化的抑制。以对IL-2分泌的抑制来测量的T细胞抑制的结果以及铊通量抑制的结果示出于表8中，其中使用经由各种接头缀合至HSA的肽261来抑制IL-2分泌和铊通量。

表8.

接头工程改造指示将更结构化的丙氨酸脯氨酸(AP)重复接头插入至融合蛋白来替代更灵活的甘氨酸丝氨酸(GS)接头显著提高了效能，并且增加接头长度进一步增强了效能。IDC1(13AA)₂(SEQ ID NO：113)和IDC1(13AA)₃(SEQ ID NO：114)以及(EAAAK)₈(SEQ ID NO：118)接头也提高了效能，但是在用纯化后存在的融合蛋白片段进行蛋白质生产期间看起来较不稳定。具有经由AS(AP)₂₀GS接头(SEQ ID NO：116)缀合至HSA的肽261的融合蛋白KV1D261_34在T细胞抑制测定中具有对Kv1.3约4nM的IC₅₀，以及在铊通量测定中具有约0.4nM的IC₅₀。

p261和p579HSA融合体的表征

融合蛋白KV1D261_34和对应合成肽p261，以及经由AS(AP)₂₀GS接头(SEQ ID NO：116)缀合至人HSA以产生融合蛋白KV1G49.KV1W720的肽p579进一步用各种功能测定来进行测试，并且测试所述蛋白和肽对人Kv通道的选择性，如表9中所示。

表9.

ephys：膜片钳电生理学

*IC₅₀在1％BSA中为20pM以及在5％FCS中为13pM

**由于低效能而产生不完全的浓度响应。IC₅₀被报告为大于所测试的最高浓度

#CHO细胞中IC₅₀(KV1.1)/IC₅₀(Kv1.3)的比率

还测试了KV1D261_34的抑制从人和猪(犹加敦小型猪)全血产生毒胡萝卜素诱导的IL-17A的能力。人和小型猪两者中抑制的IC₅₀值为0.5nM。KV1D261_34还抑制小型猪CD4⁺T细胞活化(IL-2分泌)，具有1.6nM的IC₅₀值。

实例9

其他C端延伸肽融合体的产生和表征

肽p261(SEQ ID NO：42)和p579(SEQ ID NO：3)使用若干C端延伸来延伸，并且经由AS(AP)₂₀GS(SEQ ID NO：116)或GS(AP)₂₀AS接头(SEQ IDNO：428)缀合至HSA。对选择融合蛋白进行表达、纯化以及在测定中表征，所述测定包括竞争性结合、铊通量、对体外人CD4⁺T细胞活化的抑制，以及电生理学测定。

图7A示出了在肽p261上具有各种C端延伸的融合蛋白的特征。为了评估T细胞抑制，以1nM的单一浓度(在1nM处的T细胞抑制％)测试选择变体对抗CD3/CD28的经刺激的人CD4⁺T细胞的IL-2产生的抑制％，或者使用相同的测定从浓度响应曲线获得IC₅₀值(T细胞抑制IC₅₀nM)。选择性倍数是使用来自铊通量测定的值，以IC₅₀(Kv1.1)/IC₅₀(Kv1.3)的比率来测量的。

相较于亲本KV1D261_34非延伸肽融合体的约1nM的Ki，C端延伸肽融合蛋白的竞争性结合Ki值在从约0.15nM至约18.0nM的范围内。该变体中的若干变体相较于亲本KV1D261_34具有提高的效能和选择性，其中铊通量IC₅₀值在从约10pM至约1nM的范围内，并且对Kv1.1的选择性倍数为从约30至约800。

在如上所述的Kv1.3转染的CHO细胞系中进行对选择肽融合蛋白的手动膜片钳研究。KV1G15.KV1W686(肽p261使用AHRH(SEQ ID NO：209)经由AS(AP)₂₀GS接头(SEQ ID NO：116)融合至HSA的C端延伸)的IC₅₀值是199pM。一些C端插入导致相较于亲本KV1D261_34约5-10倍的效能增长。

具有或不具有使用居间GS(AP)₂₀AS(SEQ ID NO：116)缀合至HSA的选择C端延伸的p579融合蛋白表征为竞争性结合(与10nM抗毒素-cys-TAMRA竞争结合至HEK细胞)和T细胞抑制(IL-2分泌)，并且所述结果示出于图7B中。一些C端插入导致相较于亲本KV1G49.KV1W720产生约3-5倍的效能增长。

测试使用AS(AP)₂₀GS接头(SEQ ID NO：116)缀合至肽变体的若干HSA融合蛋白的诱导从PBMC分泌细胞因子和趋化因子(IFNγ、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL12p70和IL-13)的能力。在这些HSA融合体中未观察到诱导。

实例10

KV1D261_34在小型猪体内的药代动力学和药效学

将KV1D261_34(具有居间AS(AP)₂₀GS接头(SEQ ID NO：116)的261肽HSA融合蛋白)以单次静脉注射(30nmol/Kg)的方式施用至小型猪。在施用后的多个时间点收集肝素化血浆样本，并使用抗261捕获抗体/抗pentaHis-HRP ELISA测定血浆水平。图9所示出的结果为4只动物在第36天的平均值±标准偏差，以及2只动物在最后第54天的时间点处的平均值±标准偏差。该融合蛋白的半衰期(T1/2)是5-7天，清除率(CL)为0.008-0.01mL/min/Kg，以及分布容积(Vss)＝90-120mL/Kg。

通过测定从体外全血中的淋巴细胞分泌的IL-17A来评估靶向结合。在给药之前的-48、-24、-1小时时间点处，以及在施用KV1D261_34(30nmol/Kg)之后的0.017-1296小时(54天)之间的多个时间点处，收集每个受试动物的全血样本。在不存在或存在1μM外源261肽的情况下，用毒胡萝卜素处理全血样本，其中每个样本在每种条件下为一式三份。通过抗猪IL-17A ELISA测量IL-17细胞因子水平，外源肽261的抑制％按照如下公式计算：

100-(在加入毒胡萝卜素和1μM外源261的反应中的平均IL-17pg/mL浓度/在仅加入毒胡萝卜素的反应中的平均IL-17pg/mL浓度)×100。

实验结果表示为外源261肽对毒胡萝卜素诱导的IL-17分泌的抑制％(4只动物在除第54天以外的时间点的平均值±标准偏差，在第54天只分析了2只动物)，该结果示于图10中。外源261对所有预配药样本和未配药的对照动物的毒胡萝卜素诱导的IL-17分泌的平均抑制％(所有时间点)为75.3±14.1％。在静脉注射KV1D261-34之后大约14天时，体外全血中外源261对毒胡萝卜素诱导的IL-17分泌的平均抑制％＜25％，表明通过循环KV1D261_34实现了高水平的靶向结合。在这些时间点处的血浆浓度＞10nM。在之后的时间点处，第36天外源261对毒胡萝卜素诱导的1L-17分泌的抑制％增长到＞65％，并且在第54天达到＞80％的基线水平，表明当血浆水平下降时靶向结合逐渐减少。本研究的结果显示，KV1D261_34在体内血浆中是稳定的并且在小型猪体内具有较长的血浆半衰期。循环KV1D261_34具有生物可利用性，并且在静脉注射给药之后抑制淋巴细胞中毒胡萝卜素诱导的IL-17分泌。对毒胡萝卜素诱导的IL-17分泌的抑制似乎与血浆浓度密切相关，并且有效血浆浓度与所提出的KV1D261_34作用机理(Kv1.3阻滞)相符。

实例11

小型猪钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)诱导的迟发型超敏反应(DTH)模型

使用小型猪迟发型超敏反应(DTH)模型作为体内模型来评估KV1D261_34抑制T细胞功能的能力。使用媒介物(PBS，n＝6)或KV1D261_34(30nmol/kg，n＝6)对小型猪静脉注射给药。作为阳性对照，从第-1天至验尸，以10mg/mL的浓度按1mL/kg每日皮下注射施用环胞素A两次(n＝6)。在用KLH抗原进行免疫的前一天(第-1天)开始给药。在第0天通过皮下注射1mL不完全弗氏佐剂(IFA)中的5mg/mLKLH来用KLH使小型猪获得免疫，或者皮下注射1mLIFA中的PBS作为对照组。在后腿的尾部方位上的大约5个位置处进行注射。然后，在第7天将10、5、2.5、1.25mg/mL的KLH或者PBS按0.1mL/注射点的量进行皮内注射，以激发动物，其中按照激发剂量的一个注射点在左侧腹上，以及双重激发注射点在右侧腹上。在第9天和第10天，即激发后一至两天时测定硬化程度，并且在第10天采集组织和血液样本以用于对引流淋巴结细胞密度、抗抗原抗体效价和激发位点组织结构的其他测定。

在第10天，即激发后两天时采集引流淋巴结，以确定淋巴结细胞密度。结果示于图11中。与使用媒介物处理过的激发动物相比时，用KV1D261_34处理过的动物具有显著减小的细胞密度。细胞密度降低至与在未免疫的对照动物中所观察到的细胞密度相当的水平。

在第9天和第10天(即激发后一天和两天时)，在施用了KV1D261_34的动物体内没有检测到显著的抗KLH抗体效价或硬化程度的减少。

Claims

1. 一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，具有包含以下的氨基酸序列：

(i) 以SEQ ID NO: 1示出的序列，所述序列在位置10处甘氨酸被异亮氨酸置换(G10I)，并且任选地具有1、2、3、4、5、6或7个附加的置换；或者

(ii) 具有与SEQ ID NO: 1至少80%同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列还包含G10I置换。

2. 根据权利要求1所述的拮抗剂，包含序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK (SEQ ID NO: 426)；其中

a) Xaa₁是I或T，Q或E；

b) Xaa₂是N或D；

c) Xaa3是K或R，E、A或Q；

d) Xaa₄是I、E、L、D、Q、H、V、K或A；

e) Xaa₅是E、K、L、Q、D、V或H；并且

所述Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

3. 根据权利要求1或权利要求2所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂是融合蛋白，所述融合蛋白包含被缀合至半衰期延长部分的所述Kv1.3肽拮抗剂，其中所述Kv1.3肽拮抗剂包含所述序列GVPXaa₁Xaa₂VKCXaa₃ISRQCXaa₄Xaa₅PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK (SEQ ID NO: 426)；其中

a) Xaa₁是I或T，Q或E；

b) Xaa₂是N或D；

c) Xaa₃是K或R，E、A或Q；

d) Xaa₄是I、E、L、D、Q、H、V、K或A；

e) Xaa₅是EK、L、Q、D、V或H；并且

所述Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

4. 根据权利要求1、2或3所述的拮抗剂，其中

a) Xaa₁是I或T；

b) Xaa₂是N或D；

c) Xaa₃是K或R；

d) Xaa₄是I或E；

e) Xaa₅是E或K；并且

所述Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选的C端延伸。

5. 根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的拮抗剂，其中所述Kv1.3肽拮抗剂包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：42、3、13、21、22、24、26、29、30、32、34、38、39、43、44、45、46、49、51、59、63、65、69、71、73、76、78、81、82、83、85、87、89、92、96、101、103、104和108。

6. 根据权利要求5所述的拮抗剂，其中所述Kv1.3肽拮抗剂包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：3、22、34或42。

7. 根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的拮抗剂，其中所述C端延伸包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或268。

8. 根据权利要求7所述的拮抗剂，其中所述C端延伸包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：128、143、155、188、206-210、212、214、216、219、223、224、227、230、232-235、237、239、240、243、252、261、262、263或268。

9. 根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的拮抗剂，其中所述半衰期延长部分是人血清白蛋白、白蛋白结合结构域(ADB)或聚乙二醇(PEG)。

10. 根据权利要求9所述的拮抗剂，其中所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

11. 根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的拮抗剂，其中所述半衰期延长部分经由接头缀合至所述Kv1.3肽拮抗剂。

12. 根据权利要求11所述的拮抗剂，其中所述接头包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122或428。

13. 根据权利要求12所述的拮抗剂，其中

a) 所述Kv1.3肽拮抗剂包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：3、22、34或42；

b) 任选地，所述C端延伸包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：128、143、155、188、206-210、212、214、216、219、223、224、227、230、232-235、237、239、240、243、252、261、262、263或268；

c) 所述接头包含SEQ ID NO: 116或SEQ ID NO: 119所示的氨基酸序列；并且

d) 所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

14. 根据权利要求12所述的拮抗剂，其中

a) 所述Kv1.3肽拮抗剂包含SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列；

b) 所述接头包含SEQ ID NO: 116所示的氨基酸序列；并且

c) 所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

15. 根据权利要求12所述的拮抗剂，其中所述

a) 所述Kv1.3肽拮抗剂包含SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列；

b) 所述C端延伸包含SEQ ID NO: 209所示的氨基酸序列；

c) 所述接头包含SEQ ID NO: 116所示的氨基酸序列；并且

d) 所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

16. 根据权利要求12所述的拮抗剂，其中所述

a) 所述Kv1.3肽拮抗剂包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；

b) 所述C端延伸包含SEQ ID NO: 235所示的氨基酸序列；

c) 所述接头包含SEQ ID NO: 116所示的氨基酸序列；并且

d) 所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

17. 根据权利要求12所述的拮抗剂，其中所述

a) 所述Kv1.3肽拮抗剂包含SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列；

b) 所述C端延伸包含SEQ ID NO: 235所示的氨基酸序列；

c) 所述接头包含SEQ ID NO: 116所示的氨基酸序列；并且

d) 所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

18. 根据权利要求3至17所述的拮抗剂，其中在使用分别用Kv1.1和Kv1.3转染的细胞进行的膜片箝测定中，按照所述分离的融合蛋白对Kv1.1的IC₅₀值与所述分离的融合蛋白对Kv1.3的IC₅₀值的比率测定选择性时，与人Kv1.1相比，所述拮抗剂对人Kv1.3的选择性高至少100倍。

19. 根据权利要求3至18所述的拮抗剂，其中在用人Kv1.3转染的细胞中进行的膜片箝测定中，所述拮抗剂以小于SEQ ID NO: 425所示的亲本KV1C2融合蛋白的IC₅₀值的至少1/10的IC₅₀值来抑制钾电流。

20. 根据权利要求3至19所述的拮抗剂，其中在用人Kv1.3转染的细胞中进行的膜片箝测定中，所述融合蛋白以约1.5×10^-8M或更小的IC₅₀值来抑制电流。

21. 根据权利要求3至20所述的拮抗剂，其中在用人Kv1.3转染的细胞中，所述融合蛋白以约2.2×10^-8M或更小的IC₅₀值来抑制体外铊通量。

22. 根据权利要求1所述的拮抗剂，包含以下SEQ ID NO中任一者所示的序列：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416或417。

23. 一种分离的Kv1.3肽拮抗剂，包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:86所示的序列。

24. 根据权利要求22或23所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂是融合蛋白，所述融合蛋白包含经由接头缀合至半衰期延长部分的Kv1.3肽拮抗剂，所述Kv1.3肽拮抗剂具有四个氨基酸的任选C端延伸，其中

a) 所述Kv1.3肽拮抗剂包含SEQ ID NO: 3-110所示的氨基酸序列；

b) 所述C端延伸包含SEQ ID NO: 123-268所示的氨基酸序列；

c) 所述接头包含以下SEQ ID NO所示的氨基酸序列：112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122或428；并且

d) 所述半衰期延长部分是人血清白蛋白。

25. 一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂。

26. 一种载体，包含根据权利要求25所述的分离的多核苷酸。

27. 一种宿主细胞，包含根据权利要求26所述的载体。

28. 一种制备根据权利要求1至23所述的分离的融合蛋白的方法，所述方法包括培养根据权利要求27所述的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞表达的所述融合蛋白。

29. 一种药物组合物，包含根据权利要求1至23所述的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

30. 一种对患有与不期望的T细胞活化相关的病症的受试者体内T细胞活化进行抑制的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至23所述的分离的融合蛋白施用至所述受试者以抑制T细胞活化。

31. 根据权利要求30所述的方法，其中与不期望的T细胞活化相关的所述病症是炎性病症、免疫和增生性疾病、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、骨关节炎、骨质疏松、葡萄膜炎、炎性纤维化、硬皮病、肺纤维化、肝硬化、炎性肠疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性哮喘、过敏、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发硬化症、银屑病、接触介导性皮炎、系统性红斑狼疮(SLE)和其他形式的狼疮、糖尿病、I型糖尿病、肥胖症、癌症、狼疮、再狭窄、系统性硬化症、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨再吸收、移植排斥或移植物抗宿主病。

32. 用于治疗的根据权利要求1至23所述的拮抗剂。