TR201809377T4 - Kv1.3 antagonistleri ve kullanım yöntemleri. - Google Patents

Kv1.3 antagonistleri ve kullanım yöntemleri. Download PDF

Info

Publication number
TR201809377T4
TR201809377T4 TR2018/09377T TR201809377T TR201809377T4 TR 201809377 T4 TR201809377 T4 TR 201809377T4 TR 2018/09377 T TR2018/09377 T TR 2018/09377T TR 201809377 T TR201809377 T TR 201809377T TR 201809377 T4 TR201809377 T4 TR 201809377T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
prt
giy
pro
lys
odk2
Prior art date
Application number
TR2018/09377T
Other languages
English (en)
Inventor
Chi Ellen
Edwards Wilson
Huang Chichi
Leung Wai-Ping
swanson Ronald
Wickenden Alan
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Publication of TR201809377T4 publication Critical patent/TR201809377T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, Kv1.3 antagonistleri ve bunları kodlayan polinükleotitler ve bunları yapma ve kullanma yöntemleri ile ilgilidir.

Description

Tarifname boyunca, OdK2 varyantlarinin kalinti numaralandirmasi SEQ ID NO: 1'e göredir. Örnegin, tarifnamedeki "GlO", SEQ ID NO: 1'in 10 pozisyonundaki glisin kalintisina atifta bulunmaktadir. Buna uygun olarak, OdK2 GlOI, 10 pozisyonunda izolösin yerine ikame edilen glisin içeren bir OdK2 varyantina karsilik gelir ve OdK2 GlOI, P12R, pozisyon lO'da izolösin yerine ikame edilmis glisin ve pozisyon 12'de arginin yerine ikame edilmis prolin içeren bir OdK2 varyantina karsilik gelir. Belirli bir amino asit veya polinükleotit dizisinin numaralandirilmasi, herhangi bir belirli amino asit kalintisi veya nükleotit kalintilarinin pozisyonunun, sekanstaki bilesenin gerçek sayisal konumu yerine, seçilen amino asit ya da polinükleotit sekansinda ayni ya da esdeger bir konum referans alinarak belirlenmesi halinde, seçilmis bir amino asit veya polinükleotit sekansinin numaralandirilmasina belirli bir polipeptit sekansinda verilen belirli bir amino asit pozisyonunun numaralandirilmasi, bir referans sekansi olarak kullanilan seçilmis bir polipeptit sekansinda ayni veya esdeger amino asit pozisyonuna karsilik gelir. Burada bir "esdeger konum", (örnegin, "esdeger amino asit pozisyonu" veya "esdeger nükleik asit pozisyonu" veya "esdeger kalinti pozisyonu") burada tarif edildigi gibi bir hizalama algoritmasi kullanilarak optimal olarak hizalandiginda bir referans polipeptit (veya referans polinükleotit) sekansinin karsilik gelen bir pozisyonu ile hizalanan bir test pOlIpeptIdI (veya test polinükleotidi) sekansinin bir pozisyonu (bir amino asit pozisyonu veya nükleik asit pozisyonu veya kalinti pozisyonu gibi) olarak tanimlanir. Test polipeptidinin esdeger amino asit pozisyonunun, referans pOlIpeptidin karsilik gelen pozisyonu ile ayni sayisal pozisyon numarasina sahip olmasi gerekmez; ayni sekilde, test polinükleotidinin esdeger nükleik asit pozisyonunun, referans polinükleotidin karsilik gelen pozisyonuyla ayni sayisal pozisyon numarasina sahip olmasi gerekmemektedir. Iki polipeptit sekansi, tanimlanmis parametreler, yani tanimlanmis bir amino asit ornatim matrisi, bosluk varligi cezasi ve bosluk uzatma cezasi (bosluk açigi cezasi olarak da adlandirilir) kullanilarak hizalandiginda, bu sekans çifti için mümkün olan en yüksek benzerlik skoruna ulasacak sekilde Henikoff ( :10915- 10919) genellikle polipeptit sekans hizalama algoritmalarinda varsayilan puanlama ikame matrisi (BLASTP gibi) olarak kullanilmaktadir. Karma sekanslarin birinde tek bir amino asit boslugunun girmesi için bosluk varligi cezasi uygulanir ve bosluktaki her kalinti konumu için bosluk uzatma cezasi uygulanir. Aksi belirtilmedikçe, burada kullanilan hizalama parametreleri sunlardir: BLOSUM62 puanlama matrisi, bosluk varligi cezasi = JJ, ve bosluk uzatma cezasi = 1" Hizalama skoru, hizalamanin basladigi ve bittigi (örnegin hizalama penceresi) her bir sekansin amino asit pozisyonlari ile ve istege bagli olarak mümkün olan en yüksek benzerlik skoruna ulasacak sekilde bir veya her iki sekansa bir bosluk ya da çoklu bosluklarin eklenmesi ile tanimlanir. Burada kullanildigi sekliyle "Kv1.3" (KCNA3, HPCN3, HGKS, HUKIII veya HLK3 olarak da bilinir), UniProt erisim numarasi P22001'de ve SEO ID NO: 418'de gösterilen bir sekansa sahip olan iyi bilinen insan potasyum voltaj kapili kanal alt ailesi A, uye 3'e karsilik gelir. kullanildigi sekilde, Kv1.3 fonksiyonunu en az %10, %20, %30, inhibe eden veya bloke eden mevcut bulusun bir OdKZ varyanti veya OdKZ varyanti füzyon proteini anlamina gelir. Yabani tip OdK2'nin amino asit sekansi SEQ ID NO: 1'de gösterilmistir. Burada kullanilan "füzyon proteini" ifadesi. birden fazla parental polipeptit veya peptitten türetilen polipeptit veya peptit bilesenlerini içeren bir proteine karsilik gelir. Burada kullanildigi sekliyle "yarilanma ömrü uzatan kisim", OdK2 varyantina konjuge edildiginde, serbest peptitle kiyaslandiginda ortaya çikan OdK2 varyant füzyon proteininin in VIVO yarilanma ömrünü arttiran bir molekülü veya proteini veya domeni belirtir. Burada kullanilan "baglanma yüzdesi" veya "%Baglanma", bir OdK2 varyant füzyon proteini için, Kvl.3 veya Kvl.l kanallari eksprese eden hücrelerin kullanildigi FACS analizinden elde edilen, geometrik ortalama floresan yogunluklarinin (Geo. MFI veya GMFI) bir oranini belirtir. Burada kullanilan "baglanma seçiciligi", Kv1.3 için elde edilen %Baglanma'nin %Kvl.l için elde edilen %Baglanma oranina karsilik gelir. Burada kullanilan "seçici" veya "seçicilik", bir OdK2 varyant füzyon proteini veya OdK2 varyanti için Kvl.l için bir SeÇICIIIk, burada tarif edilen sekilde, örnegin elektrofizyolojik patch clamp testleri veya talyum akis testleri gibi çesitli metodolojiler kullanilarak degerlendirilebilir. Seçicilik, ölçümler için seçilen analize bagli olarak biraz degisebilir. Kv ve Oskl (SEQ farkli olan d-KTX3 akrep toksin familyasinin üyeleridir. Hem OdK2 hem de Oskl, 38 amino asit uzunlugundadir ve her bIH üç disülfid bagi tarafindan stabilize edilir (Abdel-Mottaleb tarafindan 3 iplikçikli anti paralel ß-tabakasinin yakininda tutulan bir d sarmalini olusturur. OdKZ ve OsKl, gözenek bölgesinin dis vestibülüne baglanmak, lizin 27'yi suyla dolu gözenege sokmak ve iyon akisini tikamak suretiyle kanal fonksiyonunu inhibe eden gözenek blokörleridir. OsKl (alfa-KTx3.7)lin, Kv1.3, Kv1.1 ve Kv1.2 kanallarini güçlü sekilde ve KCa3.l kanalini orta derecede, bloke ettigi bildirilmistir (Mouhat ve digerleri, Biochem J laevis oositlerdeki Kv1.3'ü, 7,2 nM'Iik bir IC50 ile bloke ettigi ve test edilen diger Kvl.x alt tipleri (Kvl.1, Kvl.2, Kvl.4, Kv1.5 ve Kv1.6) üzerinde herhangi bir aktivitesi olmadigi bildirilmistir (Abdel-Mottaleb ve digerleri, Toxicon ancakr yeterli alt tip seçiciliginden yoksun oldugunu gösterirken OdKZ'nin selektif fakat oldukça güçlü olmadigi görülmüstür. Mevcut bulus, SEQ ID NO: l'e en az %84 özdes olan bir amino asit sekansini içeren, ayrica glisinin Kvl.3'ü inhibe eden 10 pozisyonundaki (GlOI) izolösine ornatimini ihtiva eden bir amino asit sekansina sahip izole edilmis OdKZ varyantlari ve OdK2 varyant füzyon proteinleri, onlari kodlayan polinükleotitler, vektörler, konak hücreleri ve mevcut bulusun polinükleotitleri ve polipeptitlerini kullanma yöntemlerim saglamaktadir. Mevcut bulusun OdKZ varyantlari ve OdK2 varyant füzyon proteinleri, daha korunmus ve/veya yüksek ana moleküllere kiyasla Kvl.3'e yönelik olarak daha güçlüdür. Mevcut bulusun polipeptitleri, Kvl.3 aktivitesinden dogan potasyum akimlari, talyum akisi ve/veya T hücresi aktivasyonunu inhibe eder ve bu yüzden aktive olan T hücreleriyle iliskili çesitli durumlar, örnegin enflamatuvar ve otoimmün hastaliklarin tedavisinde faydali olabilir. Antagonist Peptitleri Tarifname, asagidakileri içeren bir amino asit sekansina sahip olan KV1.3'ün izole edilmis bir peptit antagonistini (I) glisinin 10 pozisyonunda izolösine (GlOI) ornatimina sahip olan ve istege bagli olarak 1, 2, 3, 4, 5, 6 veya 7 ilave ornatima sahip olan SEQ 1D NO: 1'de gösterilen sekans; veya (ii) ayrica bir GlOI ornatimi içeren, en az %80 SEQ ID NO: 1 ile özdes olan bir amino asit sekansi. Bazi uygulamalarda izole edilmis peptit antagonisti, SEQ ID NO: l'e göre en fazla 7, en fazla 6, en fazla 5, en fazla 4, en fazla 3 veya en fazla 2 ornatim içeren bir sekans içerir. Bazi uygulamalarda izole edilmis peptit antagonisti, SEQ 1D en az %97, en az %98 veya en az %99 oraninda özdes bir sekans Tarifnamenin bazi uygulamalarinda, bu yuzden, KV1.3'ün peptit antagonisti SEQ ID No'lari: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, içerebilir. GlOI ornatimi, KV1.3 için gelismis seçicilik ve/Veya gelismis afinite ile iliskilidir. Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, KV1.3'ün antagonisti, GVPXaaiXaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK sekansini içerir; burada a) Xaai, I veya T, Q veya E'dir; b) Xaaz, N veya D'dir; c) Xaa3, K veya R, E, A veya Q'dur; d) Xaa4, I, E, L, D, Q, H, v, K veya A'dir; e) Xaas, E, K, L, Q, D, V veya H'dir; ve KV1.3'ün peptit antagonisti, dört amino asidin istege bagli bir C ucu uzantisina sahiptir. Örnegin, Kvl.3'ün peptit sekansini içerebilir. Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, KV1.3'ün antagonisti, GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK sekansini içerir; burada Xaai, I veya T'dir; Xaai N veya D'din Xaag, K veya R'dir; Xaa4, I veya E'dir; ve Xaas, E veya K'dir; ve KV1.3'ün peptit antagonisti, dört amino asidin istege bagli bir C ucu uzantisina sahiptir. Örnegin, KV1.3'ün peptit antagonisti, SEQ ID NO'lari: 3, 22, 34 veya 42'nin amino asit sekansini içerebilir. Sekil 4A'ya referansla görülebilecegi gibi, bulusun peptit disülfid köprülerini muhafaza eder. Bu bölümde ve diger kisimlarda tarif edilen mevcut bulusun örnekleyici antagonistleri ve KVl.l karsisinda KVl.3 için önemli ölçüde gelismis seçicilige, örnegin SEQ ID NO: 1'e kiyasla 100, 200, 7000 kat gelismis seçicilige sahip olabilir. Füzyon proteinleri Mevcut bulusa ait antagonist, bulusun bir antagonist peptidini içeren izole edilmis bir füzyon proteini olabilir. Burada açiklanan bazi uygulamalarda füzyon proteini, SEQ ID NO: 1'e en az %80 özdeslige sahip olan ve SEQ ID NO: 1'e göre GlOI ornatimi içeren bir sekansi içerir. Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, füzyon proteini KV1.3'ün bir yarilanma ömrü uzatan parçaya kOnjuge edilmis bir peptit antagonistini ihtiva eder, burada Kv1.3'ün peptit antagonisti ayrica bir GlOI ornatimini içeren ve tercihe göre 1, 2, 3, 4, 5, 6 veya 7 ilave ornatima sahip olan SEQ ID NO: 1'de gösterilen sekansini ihtiva eder. Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, füzyon proteini, bir yarilanma ömrü uzatan parçaya konjuge edilmis Kvl.3'ün bir peptit antagonistini ihtiva eder, burada Kv1.3'ün peptit antagonisti, SEQ ID NO: 1'de gösterilen amino asit sekansina en az %80 özdes olan, ayrica glisinin, 10 pozisyonundaki (GlOI) kalintidaki izolösine bir ornatimini içeren sekansi ihtiva Bazi uygulamalarda, füzyon proteini, bir yarilanma Ömrü uzatan parçaya konjuge edilmis Kvl.3'ün bir peptit antagonistini ihtiva eder, burada Kv1.3'ün peptit antagonisti GVPXaaiXaazVKCXaaglSRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK sekansini içerir; burada Xaai, I veya T, Q veya E'dir; Xaaz, N veya D'dir; Xaa3, K veya R, E, A veya Q'dur; Xaa4, I, E, L, D, Q, H, V, K veya A'dir; Xaas, E, K, L, Q, D, V veya H'dir; ve Kv1.3'ün peptit antagonisti, dört amino asidin istege bagli Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, KV1.3'ün peptit sekansini içerir. Burada, tarif edilen bazi uygulamalarda, antagonist, bir yarilanma ömrü uzatan parçaya konjuge edilmis KV1.3'ün bir peptit antagonistini içeren izole edilmis bir füzyon protei ni cli r, burada Kv1. 3' ün pept it antagoni sti GVPXaa1XaazVKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK sekansini içerir; burada Xaai, l veya T' di r; Xaaz, N veya D" di r; Xaag, K veya R' di r; Xaa4, I veya E'dir; ve Xaas, E veya K'dir; ve KV1.3'ün peptit antagonisti, dört amino asidin istege bagli Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, KV1.3'ün peptit antagonisti, SEQ ID NO'lari: 3, 22, 34 veya 42'nin amino asit sekansini içerir. Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, C ucu uzantisi, SEQ Burada tarif edilen bazi uygulamalarda, C ucu uzantisi, SEQ veya 268'in amino asit sekansini içerir. Mevcut bulusun OdK2 varyant füzyon protei nleri, natif OdK2 sekansinin füzyon proteinine kiyasla, örnegin SEQ ID NO: 425'in KV1C2' si ne (ana KV1C2 füzyon proteini) daha güçlü ve seçi ci cli r. Mevcut bulusun örnekleyici füzyon proteinleri, bir AS(AP)mGS (SEQ 1D NO: 116) baglantilayicisi yoluyla insan serumu albuminine (HSA) konjuge edilmis SEQ ID No'lari: 3, 22, 34 veya 42' ni ri OdKZ varyant peptitleri ni ihtiva edenlerdi r. Ana KV1C2 füzyon proteini, insan Kv1.3, üne transfekte edilmis CHO hücrelerindeki tam hücre patch clamp çalismalarindaki potasyum akimlarini inhibe etmek için yaklasik 13 nM'lik (1,3x104 M) bir IC50 ve FLIPR® Tetra cihazi (Molecular Devices) kullanilarak Kvl.3'ü eksprese eden hücrelerdeki talyum akisini inhibe etmek için yaklasik bir IC50 degerine sahiptir. Burada tarif edilen bulusun OdKZ varyant füzyon proteini, malzemeler ve yöntemlerde açiklanan patch clamp testindeki ICso degeri veya malzeme ve yöntemlerde tarif edilen talyum akis analizi ndeki IC50 degeri yaklasik veya X10-12 M veya daha az oldugunda "esit derecede güçlü veya daha güçl ü" Kv1.3 inhi bitörüdür. Patch clamp içi n IC50 degerleri ve örnekleyici füzyon proteinleri için talyum akisi Sekil 8'de gösterilmistir. Burada tarif edilen bulusun OdKZ varyanti ve OdKZ varyant füzyon proteinleri Kv1.3 için seçicidir. 0dK2 varyant füzyon proteini veya OdK2 varyanti için seçicilik, Kvl.l için bir ICso degerinin, Kvl.3 için bir 1050 degerine orani kullanilarak Kvl.l'e karsi degerlendirilebilir. Seçicilik, KV1.2, Kv1.4, Kvl.5 gibi diger KV kanallarina karsi ve ve hERG, KCa3.l veya Nav1.5'e karsi standart yöntemler kullanilarak. ayrica. test edilebilir. Mevcut bulusun burada tarif edilen örnek OdKZ varyanti füzyon proteinleri, Kvl.l'e karsi Kvl.3 için örnegin, veya en az 7000 kat seçicilik gibi büyük bir seçicilige sahip olabilir. Ana KV1C2 füzyon proteini, insan Kv1.1 ile karsilastirildiginda insan Kvl.3'üne karsi 68 kat daha seçicidir, bu yüzden, bulusun burada tarif edilen örnek OdK2 varyant füzyon proteinleri, KV1C2 füzyon proteinine kiyasla önemli Ölçüde gelismis seçicilige, örnegin yaklasik 1,5, 3, seçicilige sahip olabilirler. Seçiciligi arttirmak için, GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK,daki Xaas'e karsilik gelen. pozisyondaki glutamik asidin 'varligi gözlemlenmistir. 4, 5, 9, 15 ve 16 kalinti pozisyonlari (SEQ ID NO: 1'in natif OdK2 peptidine göre kalinti numaralamasi), ortaya çikan varyantlarin ve bunlarin füzyon proteinlerinin hem kuvvetini hem de seçiciligini gelistirmek için natif OdKZ'de ornatilabilir. Kalinti pozisyonlari, yukaridaki tam hücre patch clamp testinde veya talyum akis testinde, ortaya çikan OdKZ varyanti veya bunun füzyon proteinin, sirasiyla yaklasik 13 nM'lik (1,3x10-8 M) veya veya daha az bir ICso'ye ve KV1.3 için Kvl.1'e karsi en az 100 seçiciligine (yukarida tarif edildigi gibi patch clamp kullanilarak elde edilen ICso degerlerinin bir orani olarak ifade edilir) sahip oldugu sürece herhangi bir amino asit artigi ile ornatilabilir. Seçilen her pozisyonda çesitlendirme için kullanilabilen amino asit setleri arasinda, 4 pozisyonundaki 'TIQE, 5 pozisyonundaki ND, 9 pozisyonundaki REAKQ, 15 pozisyonundaki ELDIQHVKA ve 16 pozisyonundaki KELQDVH amino asit kalintilari bulunur. 15 pozisyonundaki bir glutamik asit (E), KV1.3 için artan seçicilik ile iliskilidir. GlOI ornatimi, Kvl.3 için gelistirilmis seçicilik ve/Veya gelistirilmis afinite ile iliskilidir (SEQ ID NO: l'e göre kalinti numaralandirmasi). OdKZ'nin ve bunun füzyon proteinlerinin yukarida tarif edilen amino asit setleri kullanilarak çesitlendirilmesi, natif peptit veya füzyon proteini ile karsilastirildiginda Kv1.3 için gelismis baglanma afinitesi ve gelistirilmis baglanma seçiciligi gösteren varyantlara sebep olmustur. Baska bir çesitlendirme semasinda, seçilen her pozisyonda çesitlendirme için kullanilabilen amino asit setleri arasinda, 4 pozisyonundaki IT, 5 pozisyonundaki ND, 9 pozisyonundaki KR, 15 pozisyonundaki IE ve 16 pozisyonundaki EK amino asit kalintilari bulunur. Ortaya çikan varyantlar ve/veya bunlarin füzyon proteinleri, iyi bilinen testler ve tarif edilenler kullanilarak seçicilik, kuvvetlilik, baglanma afinitesi ve baglanma seçiciligi açisindan degerlendirilebilir. Örnek OdK2 varyantlari ve artmis kuvvet ve seçicilige sahip füzyon proteinleri, SEQ ID No'lari: 3, 22, 34 ve 42'nin varyantlari ve onlarin insan serumu albümini veya FC füzyon proteinleridir. Gelistirilmis baglanma. afinitesine ve %Baglanma seçiciligine sahip örnek varyantlaridir. Ilave OdK2 varyantlari ve OdK2 varyanti füzyon proteinleri bulusun kapsami dahilindedir. Örnegin, natif OdK2 peptidinde, 4, 5, 9, 15 ve 16 pozisyonlari disindaki pozisyonlara, ortaya çikan OdK2 varyanti ve OdK2 varyant füzyon proteini, ana molekülle kiyaslandiginda Kvl.3'e karsi benzer seÇICIIIk ve kuvveti korudugu sürece ornatimlar yapilabilir. Örnek modifikasyonlar, örnegin ana moleküllerinkine benzer özelliklere sahip OdK2 varyant füzyon proteinleri ile sonuçlanan konservatif sübstitüsyonlardir. Konservatif replasmanlar, yan Zincirleri ile alakali olan bir amino asit ailesi içinde yer alanlardir. Genetik olarak kodlanmis amino asitler dört aileye ayrilabilir: (l) asidik (aspartat, glutamat); (2) bazik (Iizin, arginin, histidin); (3) kutuplu olmayan (alanin, valin, Iösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metiyonin, triptofan); ve (4) yüksüz kutupsal (glisin, asparagin, glutamin, sistein, serin, treonin, tirozin). Fenilalanin, triptofan ve tirozin bazen aromatik amino asitler olarak birlikte siniflandirilir. Alternatif olarak, amino asit repertuvari su sekilde siniflandirilabilir: (l) asidik (aspartat, glutamat); (2) bazik (lizin, arginin histidin), (3) alifatik (glisin, alanin, valin, Iösin, izolösin, serin, treonin), serin ve treonin tercihe göre alifatik-hidroksH olarak ayrica gruplanabilir; (4) aromatik (fenilalanin, tirozin, triptofan); (5) amit (asparagin, glutamin); ve (6) sülfür-Içeren (sistein ve metiyonin) (Striyer (ed ), Biochemistry, 2'inci baski, WH Freeman and Co., 1981). OdK2 varyantlarinin ve OdK2 varyant füzyon proteinlerinin özelliklerini gelistirmek için farkli amino asit siniflari arasindaki amino asit kalintilarinin ornatimlarini içeren natif OdK2 peptidine konservatif olmayan ornatimlar yapilabilir. Bir polipeptidin veya bunun fragmaninin amino asit sekansindaki bir degisikligin, fonksiyonel bir homolog ile sonuçlanip sonuçlanmadigi, modifiye edilmis polipeptit veya fragmanin, burada tarif edilen testler kullanilarak modifiye edilmemis polipeptide veya fragmana benzer bir tarzda bir yanit üretme kabiliyetini degerlendirmek suretiyle kolayca belirlenebilir. Birden fazla replasmanin yapildigi peptitler, polipeptitler veya proteinler ayni sekilde kolayca test edilebilir. Artmis baglanma veya baglanma spesifitesi ile sonuçlanan ornatimlara sahip örnek ilave OdK2 varyantlari ve/Veya OdK2 varyant füzyon proteinleri, SEQ ID NO'lari: 4-12, sekansina sahip olanlardir. Burada tarif edilen OdK2 varyantlari (yani, bulusa göre olan antagonistler), bulusun füzyon proteinlerini olusturmak için bir yarilanma ömrü uzatan parçaya kaynastirilabilir. Kullanilabilecek yarilanma ömrü uzatan parçalar arasinda, iyi bilinen insan serum albümini, transtiretin (TTR), bir tiroksin baglayici globülin (TGB), albümin baglama bölgeleri veya bir FC veya bunun fragmanlari bulunur. Biyolojik olarakr uygun polimerler veya kopolimerler de, örnegin PEGSOOO veya PEGZOOOO, dekstran, pol i l izi n gi bi eti I en gl i kol, po| i eti l en glikol (PEG) molekülleri, farkli zincir uzunluklarindaki yag asitleri ve yagli asit esterleri, örnegin laurat, miristat, stearat, arasidat, behenat, oleat, arasidonat, oktandioik asi t, tetradekandi oi k asi t, oktadekandi oi k asi t, beherii k asi t, ve benzerleri , pol i I izi n, oktan veya kar bohi dratl ar (dekstran, selüloz, oligo- veya polisakkaritler kullanilabilir. Baska bir uygulamada, burada tarif edilen füzyon proteininin yarilanma ömrü uzatan parçasi, insan serum albümini, albümin baglama bölgesi (ADB) veya polietilen glikol (PEG)'dür. Baska bir uygulamada, burada tarif edi I en füzyon protei ni ni n yarilanma ömrü uzatan parçasi, insan serum albüminidir. Bir baska uygulamada, burada tarif edilen füzyon proteininin yarilanma ömrü uzatan parçasi, bir baglayici vasitasiyla Kv1.3' ün pept it ant agoni sti ne konjuge edi I i r. Baska bir uygulamada, burada tarif edilen füzyon proteininin baglayicisi, SEQ ID NO: 112-122'nin amino sekansini içerir. Yarilanma ömrü uzatan parça, bulusun OdK2 varyant peptit antagonistine dogrudan veya bir baglayici yoluyla dolayli olarak konjuge edilebilir. Burada tarif edilen› bulusa ait füzyon proteinlerinde kullanilabilen örnek peptit baglayicilari, SEQ ID NO: 112-122'nin amino asit sekansina sahip olan baglayicilardir. Peptit olmayan yarilanma ömrü uzatan parçalar, iyi bilinen kimyasal kenetl eme yöntemleri kullanilarak dogrudan OdK2 varyantina konjuge edilebilir. yöntemler kullanilarak peglenebilir. Peptit veya protein yarilanma ömrü uzatan parçalari, asagida daha detayli olarak açiklandigi gibi füzyon proteinini kodlayan nükleik asidin translasyonu sirasinda peptide baglanabilir. Yarilanma ömrü uzatan parçalari içeren OdK2 varyantlari, iyi bilinen birkaç analiz ile islevsellik açisindan karsilastirilabilir. Örnegin, PEG veya insan serum albümini ile baglanmis OdKZ varyantlarinin farmakokinetik öze|likleri iyi bilinen in VIVO modellerde degerlendirilebilir. Mevcut bulusun burada tarif edilen OdKZ varyant füzyon proteinleri, genisletilmis peptidin bir yarilanma ömrü uzatan parçaya konjügasyonundan önce OdkZ varyantinin C ucuna dört amino asitlik bir C ucu uzantisi dahil edilecek sekilde tasarlanabilir. Herhangi bir teoriye bagli kalmak istememekle birlikte, füzyon proteinleri içindeki OdK2 varyanti peptidinin C ucunun uzatilmasinin, Kv1.3 kanalinin hücre disi halkalari ve artan kuvvet ile peptidin baglanma etkilesimlerinin artmasina imkan verecegine inanilmaktadir. C ucu genisletilmis peptit kismi ile örnek OdKZ füzyon proteinleri Sekil 6, Sekil 7A ve Sekil 8'de gösterilmistir. C ucu uzatilmis peptit kismina sahip füzyon proteinleri, tipik olarak, karsilik gelen uzantisiz füzyon proteinlerine kiyasla daha güçlü KV1.3 inhibitörleridir. Burada tarif edilen C ucundan uzatilmis örnek varyantlar Için IC50 degerleri, asagida tarif edilen talyum akis testinde ölçülen sekilde, yaklasik lxlO'8 M veya daha az, örnegin yaklasik 1x10-9 M veya daha az, yaklasik 1x10- w M veya daha az, yaklasik 1x10_11 M veya daha az veya yaklasik 1X10_12 M veya daha az olabilir. Örnek C ucu uzantilari, SEQ ID NO: 123-268'de gösterilenlerdir. Baska bir uygulamada, bulusun izole edilmis füzyon proteini sunlari içerir: SEQ ID NO: 3, 22, 34 veya 42'nin Kv1.3'ün peptit antagonisti; SEQ ID NO: 116 veya SEQ ID NO: ll9'un. baglayicisi; ve yarilanma ömrü uzatan parça olarak insan serum albümini. Baska bir uygulamada, bulusun izole edilmis füzyon proteini, SEQ ID NO: 42'nin Kv1.3'ünün peptit antagonistini; SEQ ID NO: ll6'nin baglayicisini; ve yarilanma ömrü uzatan parçasi olarak insan serum albüminini Baska bir uygulamada, bulusun izole edilmis füzyon proteini sunlari içerir: SEQ ID NO: 42`nin Kv1.3'ünün peptit antagonisti; SEQ ID NO: 209'un C ucu uzantisi; SEQ ID NO: 116'nin baglayicisi; ve yarilanma ömrü uzatan parçasi olarak insan serum albüminini Baska bir uygulamada, bulusun izole edilmis füzyon proteini sunlari içerir: SEQ ID NO: 3'ün Kv1.3'ünün peptit antagonisti; SEQ ID NO: 235'in C ucu uzantisi; SEQ ID NO: 116'nin baglayicisi; ve yarilanma Ömrü uzatan parçasi olarak insan serum albüminini Baska bir uygulamada, bulusun izole edilmis füzyon proteini sunlari içerir: SEQ ID NO: 42`nin Kv1.3'ünün peptit antagonisti; SEQ ID NO: 235'in C ucu uzantisi; SEQ ID NO: ll6'nin baglayicisi; ve yarilanma ömrü uzatan parçasi olarak insan serum albüminini Baska bir uygulamada, burada tarif edilen sekildeki bulusun izole edilmis füzyon proteini, seçicilik Kvl.l için izole füzyon proteininin bir ICu)degerinin, KV1.3 için izole edilmis füzyon proteininin bir ICMidegerine bir orani olarak sirasiyla Kv1.1 ve Kv1.3 ile transfekte edilen hücrelerde bir patch clamp testiyle ölçüldügünde, insan Kvl.3'e yönelik olarak Kvl.1'e yönelik olandan en az 100 kat daha seçicidir. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun burada tarif edilen sekildeki izole edilmis füzyon proteini potasyum akimlarini, insan Kvl.3'ü ile transfekte edilmis hücrelerdeki bir patch clamp testindeki SEQ ID NO: 425'in bir ana KV1C2 füzyon proteini Için bir |C50 degerinden en az yaklasik 10 kat daha azlik bir ICso degeriyle inhibe eder. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun burada tarif edilen sekildeki izole edilmis füzyon proteini potasyum akimlarini, insan Kvl.3'ü ile transfekte edilmis hücrelerdeki bir patch clamp testinde yaklasik l,5X10"8 M veya daha azlik bir ICm degeriyle inhibe eder. Bir baska uygulamada, mevcut bulusun burada tarif edilen sekildeki izole edilmis füzyon proteini, insan Kvl.3'ü ile transfekte edilmis hücrelerdeki talyum akisini yaklasik 2,2X10'8 M veya daha az ICw degeri ile in vitro sekilde inhibe Tarifnamenin bir baska uygulamasi, antagonistin, bir baglayici ile yarilanma ömrü uzatan bir parçaya baglandigi Kv1.3'ün bir peptit antagonisti, Kv1.3'ün dört amino asitlik istege bagli bir C ucu uzantisina sahip peptit antagonistini içeren izole edilmis bir füzyon proteinidir, burada Kvl.3'ün peptit antagonisti, SEQ ID No'lari: 3-110'un amino asit sekansini içerir; C ucu uzantisi, SEQ ID No'lari: 123-268'In amino asit sekansini içermesi; baglayici, SEQ lD NO: 116 Veya ll9'un amino asit sekansini; yarilanma ömrü uzatan parçanin, insan serum albümini içerir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK sekansini içeren KVl.3'ün izole edilmis bir peptit antagonistidir; burada Xaai, I veya T, Q veya Eidin Xaaz, N veya D'din Xaag, K veya R, E, A veya Q'dur; Xaa4, I, E, L, D, Q, H, V, K veya A'dir; Xaas, E, K, L, Q, D, V veya H'dir; ve Kvl.3'ün peptit antagonisti, dört amino asidin istege bagli Bir baska uygulamada, Kv1.3'ün izole edilmis peptit sekansini içerir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, GVPXaa1XaazVKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK sekansini içeren KVl.3'ün izole edilmis bir peptit antagonistidir; burada Xaah I veya T'din Xaaz, N veya D"din Xaag, K veya R,din Xaa4, I veya E'dir; ve Xaas, E veya K'dir; ve Kvl.3'ün peptit antagonisti, dört amino asidin istege bagli Baska bir uygulamada, Kvl.3'ün izole edilmis peptit antagonisti, SEQ I[) NO: 3, 22, 34 veya 42'nin amino asit sekansini içerir. Tarifnamenin bir baska uygulamasi, SEQ ID NO: 3-110'un sekansini içeren KVl.3'ün izole edilmis bir peptit antagonistidir. Mevcut bulusun OdK2 varyant polipeptitleri ve füzyon proteinleri, bir otomatik peptit sentezleyici üzerindeki kati halli peptit sentezi gibi kimyasal sentezle üretilebilir. Alternatif olarak, mevcut bulusun polipeptitleri, retikülosit lizat bazli ekspresyon sistemleri gibi hücresiz ekspresyon sistemlerinin kullanilmasiyla veya standart rekombinant ekspresyon sistemleriyle polipeptitleri kodlayan polinükleotitlerden elde edilebilir. Teknikte uzman kisiler, bulusun polipeptitlerini elde etmek için baska teknikleri taniyacaktir. OdK2 varyantlarinin üretimi tipik olarak nükleik asit düzeyinde elde edilir. Polinükleotitler, ABD Pat. No. yöntemlere uygun olarak, arzu edilen varyantlari üretmek için dejenere oligonükleotitler ya da standart PCR klonlama ve mutagenezden faydalanarak kimyasal gen sentezi kullanilarak sentezlenebilir. Varyant kütüphaneleri, ekspresyon için vektöre OdKZ varyantlarini kodlayan polinükleotitleri klonlamak için standart klonlama teknikleriyle olusturulabilir. OdK2 varyant füzyon proteinleri tipik olarak standart moleküler biyoloji yaklasimlari ile yapilir. OdK2 varyantlari ve bunlarin füzyon proteinleri, burada tarif edilen yöntemler kullanilarak Kv1.3'ü inhibe etme kabiliyetleri açisindan test edilir. Örnekleyici bir test, FLIPR® Tetra cihazi (Molecular Devices) kullanilarak Kv1.3'ü asiri ekprese eden hücrelerdeki hücrelere talyum girisi inhibisyonunu ölçen bir testtir. Bir baska örnekleyici test, iyi bilinen patch clamp teknikIeH ve burada tarif edilen teknikler kullanilarak hücre zari boyunca iyonik akisi ölçmek için elektrofizyolojik kayitlari kullanir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bulusun OdKZ varyantini ve OdKZ varyant füzyon proteinini kodlayan bir polinükleotit içeren izole edilmis bir polinükleotittir. Mevcut bulusa ait polinükleotitler ayrica, transkripsiyona ugramis fakat translasyona ugramamis sekanslar, sonlandirma sinyalleri, ribozom baglama bölgeleri, mRNA stabilize edici sekanslar, intronlar ve poliadenilasyon sinyalleri gibi en az bir kodlayici olmayan sekansi da içerebilir. Polinükleotit sekanslari ayrica ilave amino asitleri kodlayan ilave sekanslar içerebilir. Bu ilave polinükleotit sekanslari, örnegin, kaynasmis polipeptitlerin saflastirilmasini kolaylastiran bir heksa-histidin veya bir HA etiketi gibi bir markör veya iyi bilinen bir etiket sekansini kodlayabilir. Bununla birlikte, belirli örnek polinükleotitler burada açiklanmistir, ancak, belirli bir sentezleme sistemindeki genetik kod veya kodon tercihlerinin dejenereligi göz önüne alindiginda, bulusun antagonistlerini kodlayan diger polinükleotitler de bulusun kapsami dahilindedir. örnek polinükleotitler, SEQ ID NO: 429-430'da gösterilen bir sekansi içeren polinükleotitlerdin Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, OdKZ varyantlarini kodlayan bir izole edilmis polinükleotit ve bunlarin bulusun füzyon proteinlerini içeren bir vektördür. Mevcut bulusa ait vektörler, polinükleotitlerin, Çogaltici polinükleotitlerin muhafaza edilmesinde veya yeniden olusturulmus biyolojik sistemler dahil olmak üzere biyolojik sistemlerde bulusun bir vektörüyle kodlanan bir polipeptidin ekspresyonunun harekete geçirilmesinde yararlidir. Vektörler, bakteriyel plazmidler, bakteriyofajlar, transpozonlar, maya epizomlari, insersiyon elemanlari, maya kromozomal elemanlari, bakulovirüsler, SV4O gibi papova virüsleri, vaksinia virüsleri, adenovirüsler, tavuk çiçegi virüsleri, yalanci Virüsler, pikornavirüsler ve retrovirüsler ve kozmidler ve fajmidler gibi bunlarin kombinasyonlarindan türetilen vektörler gibi kromozomal, epizomal ve Virüs kaynakli olabilir. Mevcut bulusun bir uygulamasinda, vektör bir ekspresyon vektörüdür. Ekspresyon vektörleri tipik olarak, böyle bir vektör tarafindan kodlanan bir polipeptitin ekspresyonunu kontrol edebilen, düzenleyen, sebep olan veya buna izin verebilen nükleik asit sekans elemanlari içerir. Bu elemanlar, transkripsiyon arttirici baglanma bölgelerini, RNA polimeraz baslatma bölgelerini, ribozom baglanma bölgelerini ve belirl bir ekspresyon sisteminde kodlanmis polipeptitlerin ekspresyonunu kolaylastiran diger bölgeleri içerebilir. Bu tip ekspresyon sistemleri, teknikte iyi bilinen hücre bazli veya hücresiz sistemler olabilir. Kodlanmis polipeptitlerin ekspresyonunda kullanim için uygun nükleik asit sekansi elemanlari ve ana vektör sekanslari da iyi bilinmektedir. Bulusun polipeptitlerinin ekspresyonu için yararli örnek bir plazmid türevli ekspresyon vektörü, bir E. coli replikasyon kaynagi, bir ampisilin direnci (Amp) geni, bir CMV promotörü, bir sinyal sekansi ve bir SV40 poliadenilasyon bölgesi içerir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, bulusun bir vektörünü içeren izole edilmis bir konakçi hücredir. Örnekleyici konak hücreler arasinda, Archaea hücreleri; bakteriyel hücreler örnegin Streptokoklar, Stafilokoklar, Enterokoklar, E. coli, Streptomiçes, siyanobakteriler, B. subtilis ve S. aureus; fungal hücreler örnegin Kluveromiçes, Sakkaromiçes, Basidomiset, Candida albicans veya Aspergillus; böcek hücreleri örnegin Drosophila 52 ve Spodoptera Sf9; hayvan hücreleri örnegin CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, CV- l, Bowes melanom ve miyelom ve bitki hücreleri, örnegin açik tohumlu veya kapali tohumlu hücreler bulunmaktadir. Mevcut bulusun yöntemlerinde konakçi hücreler, münferit hücreler veya hücre popülasyonlari olarak saglanabilir. Hücrelerin popülasyonlari, bir doku gibi bir matris içinde bulunan hücrelerin veya hücrelerin izole edilmis veya kültürlenmis bir popülasyonunu Içerebilir. Bir vektör gibi bir polinükleotidin bir konakçi hücreye sokulmasi, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen yöntemlerle gerçeklestirilebiliru Bu yöntemler, kalsiyum fosfat transfeksiyonu, DEAE-dekstran mediyatli transfeksiyon, mikroenjeksiyon, katyonik IIpIt-mediyatli transfeksiyon ve elektroporasyonu içerir. Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, en az bir odK2 varyant füzyon proteininin ekspresyonu için yeterli kosullar altinda konakçi hücrenin kültürlenmesir ve konakçi hücre tarafindan eksprese edilen füzyon proteininin geri kazanilmasi asamalarini içeren bulusun izole edilmis füzyon proteinini üretme yöntemidir. Konakçi hücreler, belirli bir konakçi hücre tipinin muhafaza edilmesi veya çogaltilmasi için uygun olan ve bir polipeptidi eksprese etmeye yetecek herhangi bir kosul altinda kültürlenebilir. Polipeptitlerin ekspresyonu için yeterli olan kültür kosullari, ortani ve ilgili yöntemler, teknikte iyi bilinmektedir. Örnegin, birçok memeli hücre tipi, uygun sekilde tamponlanmis DMEM ortami kullanilarak 37 °C'de aerobik olarak kültürlenebilirken, bakteri, maya ve diger hücre tipleri, LB ortaminda uygun atmosferik kosullar altinda 37 °C'de kültürlenebilin Mevcut bulusun yöntemlerinde OdK2 varyantinin ekspresyonu, çesitli iyi bilinen yöntemler kullanilarak dogrulanabilir. Örnegin bir polipeptidin ekSpresyonu, örnegin FACS veya immünofloresan teknikleri kullanilarak antikorlar veya SDS- PAGE veya HPLC kullanilarak tespit ayiraçlari kullanilarak teyit edilebilin Tedavi Yöntemleri Tarifnamenin bir baska görünümü, bir biyolojik dokuda Kv1.3'ün aktivitesini modüle etmenin bir yöntemi olup, yöntem, Kv1.3'ü eksprese eden bir biyolojik dokunun, bir Odk2 varyantinin veya bunun füzyon proteininin veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunun Kv1.3"ü modüle eden bir miktari ile temas ettirilmesini içerir. Mevcut bulusun OdK2 varyantlari ve OdKZ varyant füzyon proteinl eri, enflamatuvar ve otoimmün hastaliklar, diyabet, obezite veya kanserler gibi Kvl.3 aracili hastaliklarin semptomlarinin tedavi edilmesi, azaltilmasi veya hafifletilmesi istenen herhangi bir terapide kullanilabilir. Mevcut bulusa ait peptit antagonistleri veya füzyon proteinleri, herhangi bir siniflandirmaya ait olan bir hayvan hastayi tedavi etmek için kullanilabilir. Bu tür hayvanlara örnekler arasinda insanlar, kemirgenler, köpekler, kediler, hayvanat bahçesi hayvanlari ve çiftlik hayvanlari gibi memeliler bulunur. Mevcut bulusun OdK2 varyantlari ve/veya OdK2 varyant füzyon proteinleri, örnegin enflamatuvar durumlar, alerjiler ve alerjik durumlari, asiri hassasiyet reaksiyonlari, otoimmün hastaliklar, siddetli enfeksiyonlar ve organ veya doku transplant rejeksiyonu gibi Kvl.3 aracili durumlarin proflaksisi ve tedavisi için faydali olabilir. Mevcut bulusun OdK2 varyantlari ve/veya OdK2 varyant füzyon proteinleri, ayrica böyle bir tedavi için bir ilacin hazirlanmasinda faydalidir, burada ilaç burada tanimlanan dozajlarda uygulama için hazirlanir. Mevcut. bulusun bir uygulamasi, arzu edilmeyen. T hücresi aktivasyonu ile baglantili bir duruma sahip bir bireyde T hücresi aktivasyonunu baskilamak için bir yöntemdir. T hücresi aktivasyonu, T hücreleri tarafindan IL-Z üretiminin azaltiminin ölçülmesi gibi iyi bilinen yöntemlerle ölçülebilir. Burada kullanilan "T hücresi aktivasyonunun baskilanmasi" ifadesi, bulusun OdK2 varyantlarinin ve OdK2 füzyon proteinlerinin T hücresi aktivasyonunu en az %20, %30, %40, kabiliyetini belirti r. Bir baska uygulamada, arzu edilmeyen T hücresi aktivasyonu ile iliskili durum, bir enflamatuvar durum, bir immün ve proliferatif bozukluk, romatoid artrit (RA), ankilozan spondilit, psoriatik artrit, osteoartrit, osteoporoz, üveit, enflamatuvar fibroz, skleroderma, akciger fibrozu, siroz, enflamatuvar bagirsak hastaligi, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, astim, alerjik astim, alerjiler, Kronik Obstrüktif Akciger Hastaliklari (KOAH), multipl skleroz, psoriazis, kontakt-aracili dermatit, sistemik lupus eritematozus (SLE) ve lupusun diger formlari, diyabet, tip I diyabet, obezite, kanser, Iupus, restenoz, sistemik skleroz, skleroderma, glomerülonefrit, Sjögren sendromu, enflamatuvar kemik rezorpsiyonu, transplant reddi veya graft-versus-host hastaligidir. Kvl.3 kanali, T hücreleri ve B hücrelerinin tüm alt kümelerinde eksprese edilir, ancak efektör bellek T hücreleri ve sinif anahtarlamali bellek B hücreleri, özellikle Kv1.3'e Kvl.3, yeni baslangiçli tip 1 diyabetli hastalara ait GadS/insülin-Spesifik T hüCrelerinde, MS hastalarindan alinan miyelin spesifik T hücrelerinde ve romatoid artrit hastalarinin sinoviyumundan alinan T hücrelerinde (Beeton ve kanseri örneklerinde (Abdül ve digerleri, Anticancer Res KV1.3 bloklayici hayvan modellerinde pozitif sonuçlar, ovalbumin ve tetanoz toksoide karsi hipersensitivite modellerinde (Beeton ve digerleri, Mol Pharmacol 67:1369, adoptif transfer deneysel otoimmün ensefalomiyelit (AT-EAE) modeli gibi multipl skleroz modelleri (Beeton ve digerleri, rezorpsiyonu modeli (Valverde ve digerleri, J Bone Mineral Res 19:155, 2004), artrit için modeller (Beeton ve digerleri, Proc metabolik hastaliklar (Xu ve digerleri, Hum Mol Genet 12:551, tarif edilmistir. Mevcut bulusun OdK2 varyantlari ve/veya OdK2 varyant füzyon proteinleri ile tedavi edilebilen örnek Kv1.3 aracili durumlar, romatoid artrit (RA), ankilozan spondilit, psoriatik artrit, osteoartrit, osteoporoz, üveit, enflamatuvar fibrozis (örnegin skleroderma, akciger fibrozu ve siroz), enflamatuvar bagirsak bozukluklari (örnegin, Crohn hastaligi, ülseratif kolit ve enflamatuvar bagirsak hastaligi) dahil enflamatuvar durumlar, immün ve proliferatif bozukluklar, astim (alerjik astim dahil), alerjiler, KOAH, multipl skleroz, psoriyazis, kontakt aracili dermatit, sistemik lupus eritematozus (SLE) ve lupusun diger formlari, diyabet, tip 1 diyabet, obezite ve kanser, lupus, restenoz, sistemik skleroz, skleroderma, glomerülonefrit, Sjögren sendromu, enflamatuvar kemik rezorpsiyonu, transplant rejeksiyonu ve greft-versus-host hastaligidir. Mevcut bulusun OdK2 varyantlarinin ve/veya OdK2 varyant füzyon proteinlerinin belirli bir hastaligin hayvan modellerine uygulanmasi, semptomlari iyilestirmek ve hastaliklarin seyrini degistirmek için OdK2 varyantlarinin ve/veya OdK2 varyant füzyon proteinlerinin kullanimini degerlendirmek için kullanilabilir. Kullanilabilecek hayvan modelleri iyi bilinmektedir ve yukarida açiklanan modelleri ve kolajen kaynakli artrit (CIA) modeli, diyet kaynakli obezite modeli, ile indüklenmis koiit modeli veya kolonda kronik enflamasyon ve ülserasyonu indükleyen oksazalon modeli (Neurath ve digerleri, naif CD45RBYIjksek CD4 T hücrelerinin adoptif transfer modelh donör naif T hücreleri alici bagirsaklara saldirir, kronik bagirsak iltihabina ve insan enflamatuvar bagirsak hastaliklarina benzer semptomlara neden olur (Read ve Powrie, zorluk modeli ve metakolin sensitizasyon modelleri (Hessel ve Farmasötik Bilesimler KV1.3 aktivitesinin baskilanmasinin arzu edildigi durumlarin tedavisinde etkili olan OdKZ varyanti ve/veya OdK2 varyant füzyon proteininin "terapötik olarak etkili miktari", standart arastirma teknikleri ile belirlenebilir. Örnegin, enflamatuvar bir durumun veya Iupus. multipl skleroz veya psöriyazis gibi otoimmün hastaliklarin tedavisinde etkili olacak maddenin dozaji, ajanin burada tarif edilen modeller gibi ilgili hayvan modellerine uygulanmasiyla belirlenebilir. Ayrica, optimum dozaj araliklarinin belirlenmesine yardimci olmak Için tercihe göre in vitro deneyler kullanilabilir. Belirli bir etkin dozun seçimi, Çesitli faktörlerin göz önüne alinmasina dayanarak, teknikte uzman kisilerce (örnegin, klinik denemeler yoluyla) belirlenebilir. Bu faktörler, tedavi edilecek veya önlenecek hastaliklari, ilgili semptomlari, hastanin vücut kütlesini, hastanin bagisiklik durumunu ve teknikte uzman kisilerce bilinen diger faktörleri içerir. Formülasyonda kullanilacak kesin doz, ayni zamanda, uygulama yoluna ve hastaligin siddetine bagli olacaktir ve uygulayicinin karari ve her bir hastanin durumuna göre kararlastirilmalidir. Etkin dozlar, in vitro veya hayvan modeli test sistemlerinden türetilen doz-yanit egrilerinden ekstrapole edilebilin Mevcut bulusun OdK2 peptit varyantlarinin ve/veya OdK2 varyant füzyon proteinlerinin terapötik kullanimi için uygulama modu, varyanti konakçiya ileten herhangi uygun bir yol olabilir. Bu varyantlarin farmasötik bilesimleri, parenteral uygulama için, örnegin intradermal, intramüsküler, intraperitonal, intravenöz, subkutan veya intranazal uygulama için Özellikle yararlidir. Mevcut bulusun OdKZ varyantlari ve/veya OdKZ varyant füzyon proteinleri, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içinde aktif bilesen olarak varyantin etkili bir miktarini içeren farmasötik bilesimler olarak hazirlanabilir. "Tasiyici" terimi, aktif bilesigin uygulandigi bir seyreltici, yardimci madde, eksipiyan veya araci belirtir. Bu tür farmasötik araçlar, yer fistigi yagi, soya fasulyesi yagi, madeni yag, susam yagi ve benzerleri gibi petrol, hayvansal, bitkisel veya sentetik kökenli olanlar dahil olmak üzere su ve yaglar gibi sivilar olabilir. Örnegin %0,4 salin ve %0,3 glisin kullanilabilir. Bu çözeltiler sterildir ve genellikle parçacikli madde içermez. Geleneksel, iyi bilinen sterilizasyon teknikleriyle (örnegin, filtrasyon) sterilize edilebilirler. Bilesimler, pH ayarlama ve tamponlama maddeleri, stabilize edici, kalinlastirici, yaglayici ve renklendirici maddeler Vb. gibi fizyolojik kosullara benzesim için gerekli olan farmasötik olarak kabul edilebilir yardimci maddeleri içerebilir. Bu tür farmasötik formülasyondaki mevcut bulusun OdK2 varyantlarinin ve/veya OdKZ varyant füzyon proteinlerinin konsantrasyonu genis ölçüde, yani, agirlikça yaklasik %0,5'ten az, genellikle %1 veya en az yaklasik %1 ila göre, gerekli doz, sivi hacimleri, Viskoziteler ve benzerlerine dayali olarak seçilecektir. Bu yüzden, intramüsküler enjeksiyon için mevcut bulusun farmasötik bir bilesimi, 1 ml steril tamponlu su ve yaklasik 1 mg ila yaklasik 100 mg arasinda, örnegin yaklasik 50 ng ila yaklasik 30 mg veya daha tercihen, yaklasik 5 mg ila yaklasik mg OdKZ varyantlari ve/veya onlarin mevcut bulusa ait füzyon proteinlerini içerecek sekilde hazirlanabilir. Benzer sekilde, intravenöz infüzyon için mevcut bulusun bir farmasötik bilesimi, yaklasik 250 ml steril Ringer çözeltisi ve yaklasik 1 mg ila yaklasik 30 mg ve tercihen 5 mg ila yaklasik 25 mg'lik mevcut bulusun bir antagonistini ihtiva edecek sekilde olusturulabilir. Parenteral olarak uygulanabilen bilesimlerin hazirlanmasi için gerçek yöntemler iyi bilinmektedir ve örnegin "Remington's Pharmaceutical Science", lS'inci baski, Mack Publishing Company, Easton, PA'de daha detayli sekilde tarif edilmektedir Mevcut bulusun OdK2 varyantlari ve/veya OdKZ varyant füzyon proteinleri, saklama amaciyla liyofilize edilebilir ve kullanimdan önce uygun bir tasiyici içinde yeniden olusturulabilir. Bu teknigin, konvansiyonel protein preparasyonlari ile etkili oldugu gösterilmis ve teknikte bilinen Iiyofilizasyonun ve rekonstitüsyon tekniklerinin kullanilabilecegi gösterilmistir. Mevcut bulus simdi asagidaki spesifik, sinirlayici olmayan örneklere referansla açiklanacaktir. Malzemeler ve Yöntemler Kv Kanali Ekspresyon Yapilari ve Hücre Hatlari. Çesitli Kv kanallarini ve kimerik yapilari kodlayan cDNA'lar memeli ekspresyon vektörlerine rutin yöntemler kullanilarak klonlanmistir. Klonlanmis ve eksprese edilen cDNA'lar, insan KVl.5'i (hKV, hKV1.3 E3 halkasi/hKV1.5 E3 halkasi amino asitleri 456-495'e sahip) (Kvl.3 EC3 halkasi kimerasi), hKvl.l E3 halkasi/hKvl.5 kimerasi, N ucu His etiketi ile (His etiketi amino asitleri 1-9, hKv1.5 amino asitleri 10- sahip) (Kv1.l EC3 halkasi kimerasi), siçan KV1.3'ü (rKv1.3) (SEQ ID NO: , sinomolgus maymun (Macaca fascicularis) kanali sinoKvl.3 (SEQ 251-496'a sahip (Kvl.3 kuyruk kimerasi), ve hKVl.1/hKvl.5 ve Kvl.l amino asit sekanslari 251-491'I (KV1.1 kuyruk kimerasi) kodlayanlardir. HEK hücrelerinde kanal ekspresyonu için, Kv genleri, neomisin direnç markörünü kodlayan bir CMV promotör güdümlü ekspresyon vektörüne klonlanmistir. HEK 293- F (Invitrogen, Carlsbad, CA) hücreleri kararli bir sekilde transfekte edilmis ve standart teknikler kullanilarak Kv kanallarini eksprese eden klonal hücre hatlarini üretmek üzere DMEM %10 FBS ve 600 pg/ml Geneticin seçim ortaminda kültürlenmistir. CHO stabil ekspresyonu için CHO-TREX hücreleri (Invitrogen), her bir potasyum kanalini bir tetrasiklin ile indüklenebilir tarzda eksprese eden klonal hücre hatlarini olusturmak için standart teknikler kullanilarak pcDNA4/TO-Kv1.x ile kararli bir sekilde transfekte edilmistir. Kültür ortami, %10 fetal sigir serumu, 2 mM L-glutamin, 5 ug/ml blastisidin ve 200 ug/ml zeosin ile takviye edilmis Ham's F-12 olmustur. Bazi deneylerde, CHO hücrelerinde Lipofectamine 2000 kullanilarak. geçici transfeksiyon kullanilmistir. Elektrofizyolojik deneyler için hücreler, ekspresyon kontrolü için (pMACs4.1, Milteni Biotech) budanmis bir CD4'ü eksprese eden bir ekspresyon vektörü ile birlikte transfekte edilmistir. Testler transfeksiyondan 24-48 saat sonra gerçeklestirilmistir. Protein Ekspresyonu ve Saflastirilmasi Kimera kütüphanesi, peptIt-Fc füzyonlari veya bir peptit- HSA füzyonu olarak eksprese edilmistir. Kütüphane baslangiçta transfekte edilmis ve HEK 293-E hücrelerinde 48 çukurlu veya 96 çukurlu formatta eksprese edilmistir. Hücreler, seçim için DMEM, %10 PES ve 250 üg/ml Geneticin içinde kültürlenmistir. 48 çukurlu ekspresyon için, 3,0 x 105 hücre/ml'nin 0,5 mI/çukuru, 48 çukurlu plakalara kaplanmistir. Kütüphane, 300 ng plazmid DNA, 25 ul OptiPROTM SFM ortami ve 2,4 pl Lipofectamine 2000'i (Invitrogen, Carlsbad, CA) kullanan rutin yöntemlerle Lipofectamine 2000 kullanilarak transfekte edilmistir. Ertesi gün, transfeksiyon ortami aspire edilmis ve her bir çukura 0,5 ml 293 FreestyleTM ortami (Invitrogen, Carlsbad, CA) eklenmistir. Hücreler daha sonra üst faz toplanmadan önce bir 96 saat daha enkübe edilmis ve 0,2 üm'lik bir filtreden (Varian) süzülmüstür. 96 çukurlu transfeksiyon için, hücreler 5 dakika boyunca 500xg'de döndürülmüs, üst faz uzaklastirilmis ve hücreler 293 FreestyleTM ortaminda yeniden süspanse edilmis ve 0,2 ml/çukur miktarinda 0,6 x 106 hücre/ml'de 96 çukurlu bir plakaya kaplanmistir. Kütüphane, 48 çukurlu transfeksiyon ile ayni yöntemle transfekte edilmistir. Tüm küçük ve pilot ölçekli transfeksiyonlar için HEK 293-F hücreleri kullanilmistir. Peptit-Fc füzyonlarinin küçük ölçekli ekspresyonlari, rutin yöntemler kullanilarak Protein A Sepharose 4FF reçinesi kullanilarak seri sekilde saflastirilmistir. Kisaca, 20 Hd berraklastirilmis ekspresyon üst fazi DPBS, pH 7.2'de dengelenmis yaklasik 0,5 ml reçine ile karistirilmis ve 1 saatten az olmayan bir süre boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Protein A reçineleri, 1 ml DPBS, pH 7.2 ile yikanmis ve bagli protein, 450 ul 0,1 M sodyum asetat, pH 3.0 ile yikanmis, 50 pl 2M tris, pH 7.0 ile nötralize edilmis ve lX DPBS'ye karsi pH 7.2'ye kadar 4 °C'de diyalize edilmistir. Pilot ölçekteki ekspresyonlar AKTA XpressTM kromatografi sisteminde (GE Healthcare) afinite ile saflastirilmistir. Geçici olarak transfekte edilmis HEK293-F hücrelerinden ekspresyon üst fazlari transfeksiyondan 4 gün sonra toplanmis, 6000 rpm'de santrifüjleme ile berraklastirilmis ve filtrelenmistir (. Nispi peptIt-Fc füzyon miktari, standart egriyi olusturmak için harcanan ortama eklenmis bir kontrol toksini-FC füzyon proteini kullanilarak Octet enstrümani (ForteBio) ile belirlenmistir. Örnekler daha sonra 10x PBS, pH 7.0 ile nihai bir` 1x PBS, pH 7.0 konsantrasyonuna kadar` seyreltilmis ve tekrar filtre edilmistir (. Seyreltilmis üst fazlar, her` bir` ml reçine için ~lO mg protein nispi konsantrasyonunda PBS, pH 7.0 ile önceden dengelenmis bir HiTrap MabSeIect Sure Protein A kol onuna (GE Healthcare) yüklenmistir. Yüklemeden sonra, kolon pH7.0 PBS ile yikanmis ve protein lO kolon hacimli 0,1 M Na-Asetat, pH 3 ile elüte edilmistir. Protein fraksiyonlari, 2,0 M Tris, %20 fraksiyon hacminde pH 7 içeren tüplere elüsyon ile hemen nötralize edilmistir. Pik fraksiyonlar toplanmis ve 10k MWCO membranli santrifüjlü 'ultrafiltrasyon cihazlari (Millipore) kullanilarak konsantre edilmistir. Konsantre edilmis örnekleri, bi r Superdex 200 (16/60) kol onuna (GE Healthcare) aktarilmis ve bir AKTA. FPLC kullanilarak PBS'de, pH7.0'da dengelenmis ve çalistirilmistir. Pik fraksiyonlari indirgeyici olmayan SBS-PAGE ile analiz edilmis ve monomerik protein içeren fraksiyonlar toplanmistir- Protein konsantrasyonlari, 280nm ve 310nm'de bir BioTek SynergyHTTM spektrofotometre üzerindeki emilim ile belirlenmistir. Gerektiginde, aritilmis proteinler bir lOK MWCO santrifüj yogunlastirici (Millipore) ile konsantre edilmistir. Saflastirilmis proteinlerin kalitesi, SOS-PAGE, analitik boyut dislama HPLC (Dionex HPLC sistemi) ile degerlendirilmis ve endotoksin seviyeleri (LAL deneyi) ölçülmüstür. Saflastirilmis proteinler 4 °C'de saklanmistir. Peptit-HSA füzyonlari için, üst fazlar toplanmis, berraklastirilmis ve 0,2 pm'lik bir filtreden süzülmüstür. Önceden dengelenmis bir lmL HisTrap kolonuna yüklenmeden önce, lx'lik bir son konsantrasyona 10X DPBS eklenmistir. Protein, kademeli bir imidazol gradyani kullanilarak elüte edilmistir. Füzyon içeren fraksiyonlar toplanmis ve SBS-PAGE ile analiz edilmistir. Ilgilenilen proteini ihtiva eden fraksiyonlar toplanmis ve konsantre edilmis ve bir Superdex 200 26/60 kolonunda çalistirilmistir. Yine, fraksiyonlar toplanmis ve SÜS-PAGE ile analiz edilmistir. Monomer ve peptid-HSA füzyonlarinin dimerini içeren fraksiyonlar, nihai ürün için ayri ayri toplanmistir. Saflastirilan protein, yukarida tarif edilen sekilde analiz edilmis ve 4 °C'de saklanmistir. Peptit Füzyon Proteini Dogrudan Baglanma Deneyi ("Baglanma Peptit-FC Füzyon proteinleri. Tüm hücre kültürü ayiraçlari eksprese eden plazmitlerle stabil olarak transfekte edilen yapisik HEK 293F hücreleri, %10 PES ve 600 pg/ml Geneticin takviyeli DMEM içinde kültürlenmistir. KV kanali HEK hücrelerinin tek hücre süspansiyonlari, lx PBS ile yapisik kültürlerin durulanmasi, daha sonra %O,25 tripsin EDTA ile kültürlerin durulanmasi ve hücrelerin 2xlO6 hücre/ml'lik bir son yogunluga kadar %2 PES (FACS tamponu) takviyeli soguk 1x PBS içinde yeniden süspanse edilmesi ve 96 çukurlu V tabanli polipropilen plakalara (Costar) 100 ul/çukur olarak dagitilmasiyla hazirlanmistir. Bu noktada prosedür, buz üzerinde veya 4 °C`de gerçeklestirilmistir. Hücreler 2 dakika süreyle 450xg'de santrifüje edilmis ve üst fazlar dökülmüstür. Harcanan Freestyle 293 ortaminda veya 16 nM'ye normalize edilmis FACS tamponu içinde 100 pl peptit-Fc örnegi, belirlenmis çukurlardaki hücre topaklarina eklenmis ve karistirilmistir. Spesifik baglanma ve spesifik olmayan arka planin ayirt edilmesi için, peptit-Fc füzyon proteininin baglanmasiyla rekabet etmek üzere negatif kontrol tepkimelerine 10 kat sentetik ShK peptit (Bachem) molar fazlasi eklenmistir. Reaksiyonlar 4 °C'de 60-90 dakika süreyle enkübe edilmistir. Hücreler 200 pl FACS tamponunda yikanmis ve daha sonra FACS tamponu içinde 1:200 seyreltilmis lOO ul Keçi Fab'2 anti insan Fc Cy5 konjuge antikoru (Jackson ImmunoResearch 200 pl FACS tamponu içinde yikanmis ve daha sonra 100 ul BD CytofixTM fiksasyon tamponu (BD Biosciences) ile yeniden süspanse edilmis ve gece boyunca 4 °C'de saklanmistir. Tepkimeler, FACSArray 96 çukurlu otomatik örnekleyici akis sitometresinde (BD Biosciences) okunmustur. Veri, her bir tepkime için geometrik ortalama floresans yogunluklari (Geo. MFI) elde etmek üzere FlowJo yaziliminda (TreeStar) analiz edilmistir. Birincil tarama baglanma analizleri için, her bir varyant için Geo. MFI'lar geçici olarak transfekte edilmis yabani tip OdkZ-Fc füzyonu (KV1C2) kontrolüyle karsilastirilmis ve % ana olarak bildirilmistir. PeptIt-HSA Füzyon Proteinleri. Testler, asagidakiler hariç, peptId-Fc füzyonlari için dogrudan baglanma testine benzer sekilde gerçeklestirilmistir: hücreler 96 çukurlu V tabanli polipropilen plakalara (Costar) 100 ul/çukur dagitmadan önce lXlO6 hücre/ml'lik bir nihai yogunluga kadar süspanse edilmis ve 50 ul peptit-HSA füzyon örnekleri hücreye ilave edilmistir. HSA füzyonlari, 2 ug/ml'ye seyreltilmis ve FACS tamponu içinde streptavidin-PE konjugati () 1 200 ile önceden karistirilmis 50 ul keçi anti-insan HSA biyotin konjugati (AbCam kat# ab40378) kullanilarak tespit edilmistir. Hücreler 150 ul FACS tamponunda yikanmis, 50 ul BD CytofixTM fiksasyon tamponunda (BD Biosciences) yeniden süspanse edilmis ve 30 dakika boyunca 4 °C'de enkübe edilmistir. Reaksiyonlar okunmus ve yukarida açiklandigi gibi analiz edilmistir. Birincil tarama baglanma analizleri için her bir varyant için Geo. MFI'ler dogrudan kontrol KVs baglayicisi (SEQ ID NO: 120) yoluyla konjuge edilmis peptit 261) ile karsilastirilmis ve %Baglanma olarak rapor edilmistir. Rekabetçi Baglanma Testi ("Rekabetçi baglanma"). Tüm hücre kültürü ayiraçlari Invitrogen'den elde edilmistir. Kv kanali ekspresyon yapilari ile stabil olarak transfekte edilen yapisik HEK 293F hücreleri, %10 PES ve 600 ug/ml Geneticin takviyeli DMEM içinde kültürlenmistir. Kv kanali HEK hücrelerinin tek hücre süspansiyonlari, 1x PBS ile yapisik kültürlerin durulanmasi, daha sonra %0,25 tripsin EDTA ile kültürlerin durulanmasi sonra hücrelerin lxlO6 hücre/ml'lik bir son yogunluga kadar %2 PES (FACS tamponu) takviyeli soguk 1x PBS içinde yeniden süspanse edilmesi ve 96 çukurlu V tabanli polipropilen plakalara (Costar) 100 uI/çukur olarak dagitilmasiyla hazirlanmistir. Bu noktada prosedür, buz üzerinde veya 4 °C'de gerçeklestirilmistir. Hücreler 2 dakika süreyle 450xg'de santrifüje edilmis ve üst fazlar dökülmüstür. Zayif Freestyle 293 ortami veya FACS tamponu içinde 45 pl peptit veya peptit füzyon proteini örnekleri belirlenmis çukurlarda hücre topaklarina eklenmis ve karistirilmistir. Tepkimeler 30 dakika süreyle 4 °C'de enkübe edilmistir. Hücre kültür ortami veya FACS tamponu içerisindeki lOO nM Agitoksin- Z-CyS-TAMRA'nin (Alomone laboratuvarlari) 5 ul'si, her bir göze ilave edilmistir, ardindan karistirilmis ve tepkimeler, 4 °C'de 60 dakika süreyle enkübe edilmistir. Her bir çukura 200 pl FACS tamponu bir yikama adimi olarak ilave edilmis ve hücreler 2 dakika süreyle 450xg'de santrifüjlenmis ve üst fazlar dökülmüstür. Hücreler 50 ul FACS tamponu ile yeniden süspanse edilmis ve tepkimeler FACSArray 96 çukurlu otomatik örnekleyici akis sitometresinde (BD Biosciences) okunmustur. Veri, her bir tepkime için geometrik ortalama floresans yogunluklari (Geo. MFI veya GMFI) elde etmek üzere FlowJo yaziliminda (TreeStar) analiz edilmistir. Konsantrasyon yanit egrileri için, her` bir bilesik için çesitli konsantrasyon araliklari için Geo. MFI degerlerindeki degisim Graphpad Prism ile çizilmis ve bir sigmOIdal doz-yanit (degisken egim) egrisi ile lineer olmayan regresyon kullanilarak elde edilen ICm ve Ki degerleri türevlenmistir. Ki'yi hesaplamak için, 0,20 nM'Iik bir AgItOkSIn-Z-CyS-TAMRA Kvl.3 KD degeri atanmistir (David Triggle (eds). Voltage-Gated lon Channels as Drug Targets, Cilt 29, Sayfa 216, Tab. 7.2.2). Talyum akis testi. KV yapilari, G418 seçimi altinda HEK293F'de kararli bir sekilde eksprese edilmistir. Kültür ortami, %10 FBS ve 600 pg/mL G418 ile takviye edilmis HyQ DME/yüksek glikoz olmustur. Hücreler, çukur basina lOK hücre miktarinda poli-lisin kapli 384 çukurlu mikrotitre plakalarina kaplanmis, daha sonra 12-36 saat süreyle 37 °C' de enkübe edilmistir. Hücre plakalari bir Biotek EL405 (4 döngü, 25uL/çukur aspirat, daha sonra lOOuL/çukur ekleme) kullanilarak test tamponu ile yikanmistir. Test tamponu (in mM glukoz içermistir. FluxOR boyasi (Invitrogen), test tamponu arti 2mM probenesid içinde üreticinin talimatlari uyarinca çözülmüs ve daha sonra hücrelere ilave edilmistir. Hücreler karanlikta oda sicakliginda 30 dakika süreyle lekelenmistir. Leke daha sonra test tamponu ile yikanmistir. Test bilesikleri, test tamponu arti %0,2 sigir serum albümini (BSA) ve 2mM probenisidde 2X test konsantrasyonunda hazirlanmistir. 25 uL/çukur test bilesigi çözeltisi eklendikten sonra, hücreler karanlikta oda sicakliginda 30 dakika süreyle enkübe edilmistir. Talyum boya floresani, hücreler 20 uL/çukur uyarici tampon ilave edilerek test edildigi için Tetra'da (Molecular Devices) izlenmistir. Uyarici tampon, 180 mM HEPES, 90 mM KOH, 2 mM CaClL 1 mM MgCIz, 5 mM glükOZ, 1 mM TI2504 içermistir. Floresans degisimi agonisti ekledikten 20 saniye sonra ölçülmüstür. Veriler kontrol çukurlarinin ortalama yanitlarina normalize edilmistir (tam inhibisyon kontrolleri için lOnM ShK'nin her biri N:l6 ve sifir inhibisyon kontrolleri için sadece tampon). T hücresi Inhibisyon Testi ("T hücresi inhibisyon testi"). gösterge olarak kullanilmistir. Donuk sekilde muhafaza edilmis saflastirilmis birincil normal insan CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin (AllCells LLC) buzu çözülmüs ve %1 normal insan A/B serumu (Valley Biomedical Prod & Srv Inc.) takviyeli RPMI içinde 2x106 hücre/ml'lik nihai bir konsantrasyonda süspanse edilmis ve 100 ul hücre 96 oyuklu düz tabanli doku kültürü plakalarina (NUNC) dagitilmistir. Peptit- HSA füzyon proteinleri için, saflastirilmis normal insan serum albümini (SIGMA), konsantrasyon-yanit deneyleri boyunca sabit bir HSA konsantrasyonunu korumak için %3'Iük bir son konsantrasyonda hücre kültür ortamina ilave edilmistir. Peptit füzyon proteinlerj, ve kontrolleri, hücre kültürü. ortaminda seyreltilmis ve T hücre kültürlerine 50 ul/Çukur ilave edilmis ve 30 dakika süreyle 37 °C/%5 COz'de enkübe edilmistir. T hücreleri, hücre kültürü ortami içinde lzl'lik bir tanecik hücre oranina seyreltilmis anti-insan CD3/CD28 T hücresi genisleme tanecikleri (Miltenyi Biotec) kullanilarak aktive edilmistir. Kültürler, 37 °C/%5 COz'de ~l6 saat enkübe edilmis ve üst fazlar, 96 çukurlu V tabanli polipropilen plakalara (Costar) toplanmis ve santrifüjleme ile berraklastirilmistir. Aritilmis üst fazlar, IL-2 seviyeleri için, insan IL-2 Quantikine Kitinden (RnD Sytems) türetilen bir kemilüminesan immünolojik test ile analiz edilmistir. Nihai IL-2 seviyeleri Graphpad Prism'de çizilmis ve ICso degerleri, sigmoidal doz-yanit (degisken egim) egrisi uyumu ile lineer olmayan regresyon kullanilarak. elde edilmistir. Bazi deneyler tek nokta 5 nM, lOO nM veya 250 nM peptit füzyon proteini konsantrasyonunda yapilmistir. Tetanoz Toksoid (TTX) T hücresi Testi. Insan PBMC'si, Ficoll Pague (GE Healthcare Life Science) kullanilarak kademeli santrifüjleme ile tetanoz toksoid asili saglikli donör kanindan saflastirilmistir. 106 hücre/çukurdaki PBMC; %2 insan serumu, 2 mM glutamin, lmM sodyum pirüvat, 10mM HEPES, lmM MEM esansiyel olmayan amino asit solüsyonu ve 100 U/ml penisilin G ve streptomisin (Life Technologies) takviyeli RPMI ortaminda Bug/ml tetanoz toksoid (Massachusetts Biologic Univ ) ile 96 çukurlu düz tabanli kültür plakasinda 3 gün boyunca stimüle edilmistir. Kültür üst fazlari 2'nci gün kültürde toplanmis ve hücre proliferasyonu, gece boyunca 3H-timidin (Perkin Elmer) luCi/çukur ile titresim yoluyla ölçülmüstür. Birlestirilmis radyoaktif timidin ile çogalan hücreler, cam elyaf filtre plakalari (Perkin Elmer) üzerine toplanmis ve bir Topcount (Packard) kullanilarak radyoaktivitenin sayilmasi için sintilatöre (Perkin Elmer) batirilmistir. Üst fazlardaki sitokinler, MSD tespit teknolojisi (Meso Scale Discovery) ile ölçülmüstür. Elektrofizyoloji. Elektrofizyolojide, transfekte CHO veya HEK hücreleri, CD4+ veya CD8+ T hücreleri kullanilmistir. Hücreler` düsük yogunlukta cam. lamellere yerlestirilmistir. Deney gününde, cam kapak slipleri, bir ters çevrilmis mikroskop lamindaki bir banyoya yerlestirilmis ve asagidaki bilesimin hücre disi çözeltisi serpilmistir (yaklasik 1 ml/dakika): 137 mM NaCI, 2 mM CaCIz. 5,4 mM KCI, 1 mM MgCIz. 5 mM glükoz ve 10 mM HEPES, %O,l sigir serum albümini, pH 7.4. Pipetler, asagidaki bilesimin bir hücre içi çözeltisi ile doldurulmustur: 40 mM KCl, lOOmM KF, 2 mM MgClz, 10 mM EGTA, lO mM HEPES, pH 7.3 ila 7.4 ve 2 ila 4 MQ'luk bir dirence sahip olmustur. Tüm kayitlar Multiclamp 7OOA amplifikatörü ve pClamp 9 yazilimi (Axon Instruments) kullanilarak oda sicakliginda (22 - 24 °C) yapilmistir. Geçici olarak transfekte edilmis CHO hücreleri, anti CD4 kapli tanecikler (Dynabeads, InVitrogen) kullanilarak tanimlanmistir. Disa dogru potasyuni akimlari, patch clamp tekniginin tam hücre konfigürasyonu kullanilarak, - 40mV'Iik bir test potansiyelinde - 80mV'lik bir tutma potansiyelinden ölçülmüstür. Sivi jonksiyon potansiyeli 20 °C'de 7,1mV olarak hesaplanmis ve gerilim komutlari düzeltilmemistir. Mevcut kayitlar 2 - 5 KHz'de elde edilmis ve 1 - 2 KHz'de filtre edilmistir. Akimlar her ZOs'de bir belirlenmis ve kayittan önce 5 - 10 dakika süreyle stabilize olmalarina izin verilmistir. Bilesikler bir SF-77B Fast-Step Perfüzyon cihazi (Warner konsantrasyonlari her bir hücre için test edilmistir. Veri analizi: Konsantrasyon veya doz yanit verileri, asagidaki dört parametre genel lojistik denklemi kullanilarak lineer olmayan regresyon (Graph Pad Prism, versiyon 4.0) ile uydurulmustur: Yanit : Bazal + (Maks - bazal) / [1 + 10 aoücw Kuvvet, %50 maksimal etkiyi (pleo veya pECso) üreten konsantrasyonun log lO'u olarak ifade edilmistir. Peptit Sentezi. Fmoc-Lys(Boc)-Wang reçinesi (0,47 mmoI/g ornatimi) Peptide International'dan elde edilmis ve psödoprolin dipeptit, FmOC-IIe-Ser(WMeMe pro)-OH Novabiochem'den elde edilmistir. Diger tüm amino asitler Applied Biosystems (ABI) veya Anaspec'ten elde edilmistir. Otomatik kati fazli peptit sentezi için ayiraçlar (SPPS) ABI'dan temin edilmistir. Kimyasal sentez için gerekli diger ayiraçlar Sigma/Aldrich'den satin alinmistir. Peptit sentezi, bir ABI Model 433A otomatik peptit sentez|eyicisi kullanilarak, SPPS yoluyla Fmoc-LyS (Boc)-Wang reçinesi (222 mg, 0,104 mmol) üzerinde gerçeklestirilmistir. HBTU/HOBt/DIEA aktivasyonu için standart 0,1 mmol ölçekli FastMoc MonPrevPeak protokolleri üreticinin protokolüne göre kullanilmistir. Psödoprolin dipeptit, FmOC-IIe-Ser (WMWe pro)-0H, GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-reçinesi (SEQ ID NO: 42) içinde kalin ve alti çizili olarak gösterilen pozisyonda birlestirilmistir. Amino asit yan zincir islevselligi asagidaki gibi korunmustur: Arg(Pmc), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Glu(OtBu), Gln(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu) ve Thr(tBu). Peptit, (TFA (20 mL), fenol (1,5 9), 1,2 etanditiyol ( ve triizopropilsilan ( içinde alti saat süreyle ortam sicakliginda reçineden ayrilmistir. Reçine, filtrasyon yoluyla uzaklastirilmis ve ilave TFA (2 mL) ile durulanmistir. Filtratlar toplanmis ve peptit önceden sogutulmus etil eter ( ile çökeltilmistir. Peptit filtrasyon ile izole edilmis, dietil eter ile yikanmis ve 370,0 mg ham, lineer ürün elde etmek üzere (GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK; SEQ ID NO: 42). Ham dogrusal peptit, 100 üg/mL'lik bir peptit konsantrasyonunda 0,1 M Tris-HCL, 1,0 M Guanidin-HCL, 1,0 mM EDTA, 3,0 m içinde; indirgenmis M glutatiyon ve oksitlenmis 0,3 mM Glutatiyon içinde ortam sicakliginda oksitlenmistir. Tepkime, pH'i 3.9'a düsürmek için damla damla ek glasiyal asetik asit ilavesiyle saat sonra durdurulmus ve peptit dondurulmus ve liyofilize edilmistir. Ham peptit Vydac C-18 RP-HPLC ile saflastirilmistir. Analitik RP-HPLC, kilcal elektroforez ve LC/MC safligi ve moleküler kütleyi dogrulamistir. Yabani tip OdK2 ve OsKl peptitlerinin ve füzyon proteinlerinin karakterizasxonu Yabani tip OdK2 (SEQ ID NO: 1) ve OsKl (SEQ ID NO: 2) peptitleri klonlanmis ve GS baglayicisi (G4S)4 (SEQ ID NO: 119) kullanarak rutin yöntemlerle ve yukarida tarif edilen sekilde Ortaya çikan füzyon proteinleri, sirasiyla KV1C2 (OdKZ-FC füzyon) ve KV olarak adlandirilmistir. Natif OdKZ peptit izole edilmis ve Iran akrebi zehirinden arindirilmistir, Odonthobuthus Leüven Üniversitesi'nden Profesör Jan Tytgat'tan alinmis ve rekombinant OsKl peptidi Alomone labaratuvarlarindan alinmistir. Natif' peptitler` ve füzyon proteinleri, Kvl.3'e baglanma, elektrofizyoloü kullanilarak Kv1.3 kuvveti ve seçiciligi ve farmakokinetik çalismalarda T hücresi aktivasyonünu inhibe etme kabiliyeti açisindan karakterize edilmistir. Kv1.3 eksprese eden hücrelere baglanma Baglanma testleri yukarida açiklandigi gibi hKvl.3 EC3 halka kimerayi eksprese eden kararli hücrelerde gerçeklestirilmistir. KVlC2 (0dK2-Fc füzyonu), FACS testinde zemin degerin 12,8 kat üzerinde olan bir sinyal üretmis ve KV zemin degerin 133,0 kat üzerinde bir sinyal 'üretmis (Sekil 2), bu durunn eksprese edilen KV1.3 kanalina yüksek bir baglanma düzeyi oldugunu göstermistir. Baglanma spesifik olarak ortaya çikmis, çünkü insan Kv1.3 EC3 halka kimerayi eksprese eden hücrelere hiçbir baglanma lO katlik bir ShK varliginda gözlenmistir. Baglanma da seçici olmustur, çünkü Kv ve KV1N2 (OsKl-Fc füzyonu) insan Kv1.5'ini eksprese eden hücrelere baglanmamistir. Elektrofizyoloji Tam hücre patch clamp çalismalari, insan Kvl.3, Kvl.l, Kvl.2 ve Kvl.5 iyon kanallari ile transfekte edilmis CHO hücrelerinde gerçeklestirilmistir. Oskl ve Odk2, her ikisi de Kvl.3 akimlarini güçlü bir sekilde inhibe etmistir. OsKl peptidi, Kvl.3'e karsi OdKZ'den anlamli ölçüde daha güçlü olmus, ancak Kvl.l'e karsi kat seçiciligi iki peptit için benzer olmustur. KV, natif peptitlere kiyasla Kvl.3'e yönelik olarak yaklasik 30 - seçiciligi hesaplanmistir) Elektrofizyoloji kuvvetli ile belirlenen olmustur. oranlari Tablo 1'de gösterilmistir. birlikte, KV1C2 bölünmesiyle natif peptide göre yaklasik 3-4 kat artmistir. degerleri ve seçicilik Elektrofizyoloji Seçicili CD4+T HücreCD8+T Hücre Protein Kv1.3 Kv1.1 inhibisyonu inhibisyonu baglayici- OSKl- 0,30 7 2,79 NA baglayici- **ICKÃKV1.1)/ICw(Kv1.3) NA = yapilmadi T-hücre aktivasyonunun inhibisyonu CD4+ insan T hücrelerindeki Jurkat T hücresi hatti, birincil (normal insan vericilerinden izole edilmis) Kv1.3 hücresel akimlarini ve Kvl.3 ile transfekte edilmis HEK ve CHO hücrelerini bloke etmistir. ve anti-CD3/CD28 ayrica, birincil insan CD4+'ünden ile aktive edilmis CD8+ T hücrelerinden sitokin üretimini bloke etmistir. KVlNZ (OsKl-FC füzyonuL Jurkat T hücre hattindaki KV1.3 hücresel akimlarini bloke etmis, hKvl.3 EC3 halka kimerayi ekprese eden hücrelere agitoksin2-cys-TAMRA baglanmasiyla rekabet etmis, hKVl.3 EC3 halka kimerayi ekprese eden hücrelerden talyum akisini inhibe etmis ve CD4+ T hücresi aktivasyonunu inhibe etme kabiliyeti açisindan test edilmistir. Tablo 1, manuel patch-clamp elektrofizyolojisinden elde edilen ICyi degerlerini göstermektedir. KVlCZ (OdK2-FC füzyonu) ayrica, yukarida tarif edilen bir testte, tetanoz toksoid antijeni sergileyen mitomisin C ile muamele edilmis otolog antijen sunan hücrelerle aktivasyon üzerine T hücre proliferasyonunu inhibe etmistir OdK2-FC füzyon proteininin yarilanma ömrü Sprague Dawley Siçanlari, 10 mg/kg'lik bir son doz için 5mI/kg'da 1xPBS pH7.0'da 2 mg/ml'lik bir stoktan intravenöz bolus uygulamasi yoluyla KV ile dozlanmistir. Plazma konsantrasyonlari, bir anti-FC ELISA veya FACS ile yukarida tarif edilen sekilde belirlenmistir. KVlCZ yarilanma ömrü (Tuz) siçanlarda 60 saat olmustur. OdK2 kimera peptidi Fc füzyonlarinin üretimi ("OdK2/Osk1 kimera kütüphanesi" veya "KV1C2L1") Natif OdK2 ve OsKl toksin peptit sekanslari, 9 amino asit kalintisinda (Sekil 1) iraksama ile yüksek bir sekans benzerligine sahiptir. Gelistirilmis Kvl.3 kuvveti ve Kvl.x alt tip seçiciligine sahip peptit varyantlari olusturmak için, OdK2 peptit amino asit sekansinin 9 pozisyonunun 8*inde, OdK2 sekansinin OsK2, SEQ ID NO: 1'de OsKl'den (pozisyonlar 3, 4, (SEQ ID NO: 119) kullanilarak bir peptit baglayici-FC varyantlarinin birlesimsel bir kütüphanesi olusturulmustur. Izolösin ve bu konumdaki lösin arasindaki benzerlikten dolayi pozisyonu kütüphane çesitlendirmesine dahil edilmemistir. Pozisyonlar, her pozisyonda mevcut olan OdK2 ve OsKl amino asit kalintilari kullanilarak çesitlendirilmistir. Bu yüzden, sirasiyla TI, DN, RK, GI, RP, EQ ve KD ile çesitlendirilmistir. Kütüphane tasarimi, ayni zamanda, bu Hmtasyonun OsKl peptidinin kuvvetini arttirdigi önceki raporlara dayanarak, lG'inci pozisyonda bir lizin ornatimina sahip alti varyantini OdK2 amino asit sekansindaki bir baslangiç uyusmazliginin bir sonucu olarak 38 pozisyonunda bir glutamin ornatimi içermistir. Böylece OdK2/Oskl kimera kütüphanesi, Iizin ornatim.varyantlari, OdK2 K38Q varyanti ve her iki ana molekülü KV dahil olmak üzere toplam 264 üyeden olusmustur. Pozisyon numaralandirmasi, SEQ ID NO: 1'in natif OdK2 peptit sekansina göre yapilir. Kütüphane, rutin moleküler biyoloji yöntemleri kullanilarak ve yukarida. tarif edilen sekilde olusturulmus ve eksprese edilmistir. Kütüphane, ham üst fazlar kullanilarak, hKVl.3 EC3 halka kimera ile transfekte edilmis bir HEK hücre hattini kullanarak hKVl.3'e baglanma için ve yukarida açiklandigi gibi hKVl.l EC3 halka kimera kanali ile transfekte edilmis bir HEK hücre hattina baglanarak seçicilik için taranmistir. Birincil taramada baglanma, KVlCZ kontrolünün %baglanmasi (%Baglanma) ve seçicilik için Kvl.3'e %Baglanmanin Kvl.l'e %Baglanmaya bir orani olarak ölçülmüstür. Sekil 4, OdK2/Oskl kimera kütüphanesinden (KV1C2L1 kütüphanesi) ve Ornek 4'te tarif edilen amino asit tarama kütüphanesinden (KV126L1 kütüphanesi) elde edilen seçilmis varyantlar için amino asit sekanslarini, göstermektedir. KV1.3'e 2 %80 baglanma ve ana KV1C2'ye (OdK2-FC füzyonu) kiyasla KVl.l'e göre 21.3 kat seçiciligi gösteren seçme füzyon proteinleri ayrica karakterize edilmistir. 0dK2 kimera peptit Fc füzyonlarinin karakterizasyonu. Örnek 2'de tanimlanan seçme OdK2 kimera peptit Fc füzyon proteinleri, yukarida tarif edilen sekilde saflastirilmis ve ikincil baglanma deneyleri, elektrofizyoloji ve T hücresi inhibisyon deneylerinde karakterize edilmistir. Elektrofizyoloji Seçme varyantlari, yukarida tarif edilen sekilde stabil olarak transfekte edilmis CHO kullanilarak tam hücre patch Clamp çalismalarinda kuvvet ve seçicilik açilarindan degerlendirilmistir. Insan Kvl.3'ün veya insan KV1.1'In inhibisyonu, saflastirilmis varyantin tekli bir konsantrasyonunda (Kv1.3 için 1 nM veya Kv1.1 için 100nM) degerlendirilmistir (Tablo 2). Seçilen varyantlar Kvl.3'e karsi aktiviteyi önemli ölçüde arttirmis, ancak ana KvlCZ'ye göre Kv1.1'e karsi benzer aktiviteye sahip olmustur. sekilde insan Kvl.3 ya da Kvl.l ile stabil olarak transfekte edilmis CHO hücreleri kullanilarak, seçme OdK2 kimera peptit Fc füzyonlari için manuel patch-Clamp elektrofizyoloh çalismalarindan elde edilmistir. Kat seçiciligi IC50 (Kv1.1)'nin ICw (Kvl.3)'ye orani olarak hesaplanmistir. Tablo 3, seçilmis varyantlar ve sirasiyla OdK2 ve OsKl füzyonlari KV1C2 ve KVINZ için IC50 degerlerini göstermektedir. Füzyon pr0teini Kv1.3 %Inhibisyon @1nM KV1.1 %Inhibisyon @100nM KV1D197 83 37 KV1D37 67 40 KV1D267 64 49 KV1D229 85 54 KV1D261 85 61 KV1D161 76 63 KV1D69 86 64 KV1D280 _ 97 *i ana (OdK2-Fc füzyonu) .1. .i. nM'de füzyon proteim Füzyon proteini KV1C2 13 865 67 KV1N2 0,3 2 7 **seçicilik = ICsmKw.u/IC5mKn.m Patch clamp çalismalari baz alinarak, OdKZ kimera peptit Fc füzyon proteinleri, ana KVlCZ'ye kiyasla (OdKZ-FC füzyon) yaklasik 28 ila yaklasik 87 kat gelismis Kvl.3 kuvvetine ve yaklasik 3 ila 9 kat gelismis seçicilige, ve ana KVlNZ'e kiyasla (OsKl-Fc füzyon) yaklasik ~85 kat gelismis seçicilige sahip olmustur. T hücresi aktivasyonunun inhibisyonu Seçme Odk2 kimera peptit FC füzyonlari, malzemeler ve yöntemlerde tarif edilen sekilde anti-CD3/C28'in indükledigi T hücrelerinden IL-2 sekresyonunun inhibisyonu olarak ölçülen T hücresi aktivasyonunu inhibe etme kabiliyetleri için karakterize edilmistir. Inhibisyon, OdK2 kimera peptit Fc füzyonlarinin tek bir konsantrasyonunda (lOO nM) ölçülmüs ve sonuçlar, Sekil 5A'daki maksimum IL-2 üretiminin %inhibisyonu olarak sunulmustur. KVlBO3, ana KV ile özdestir ve kütüphane yapimi sirasinda tesadüfen yeniden olusturulmustur. Sekil SB, KVlD26l tarafindan aktive edilen T-hücrelerince, IL-2 üretiminin konsantrasyona bagli inhibisyonunu göstermektedir. KV1D261 füzyon proteini için CD4+ T hücresi inhibisyonu için T hücresi aktivasyonunun inhibisyonu ve kütüphanenin ana ekrani sirasinda yürütülen ham üst fazlar kullanilarak KV1.3'e baglanmanin korelasyonu, baglanma analizi ile fonksiyonel Kvl.3 blokörlerini tanimlama kabiliyetini anlamak için degerlendirilmistir (Sekil 5C). Iki analiz arasinda anlamli korelasyon bulunmustur (Pearson's korelasyonu r 0,9339, p Füzyon proteinlerinin antagonistik etkileri peptit kismina atfedilebilin Engelleyici özelliklerin yani sira OdKZ kimera peptit FC füzyonlarinin seçiciliginin peptit kismi tarafindan muhafaza edilip edilmedigini belirlemek için seçme OdKZ kimera füzyonlari, karsilik gelen sentetik peptitler ile karakteristikleri açisindan karsilastirilmistir. KV1D26l ve karsilik gelen sentetik peptit p261 (SEQ ID NO: 42), KV1.3 kuvveti ve seçicilik, siçan Kvl.3 kanallarina çapraz reaktivite ve T hücresi aktivasyonunun inhibisyonu için karakterize edilmistir. hERG, Dubin ve digerleri, J Biomol yöntemler kullanilarak test edilmistir. Kullanilan tüm hücre hatlari, siçan Kvl.3 ve hKCa3.l'si hariç, ilgili kanali stabil bir sekilde eksprese etmistir. KV1D261 ve karsilik gelen sentetik peptit. p26l için deneylerin sonuçlari Tablo 4'te gösterilmistir. Sentetik peptit, hem elektrofizyoloji hem de T hücresi inhibisyonu ile Fc füzyonundan ~10 kat daha güçlüdür ve karsilik gelen füzyon proteinine kiyasla seçicilik korunmustur, bu da, gelistirilen peptit bölgesinin, kuvvet ve seçicilik özelliklerinin tasinmasindan sorumlu oldugunu göstermektedir. Artan moleküler agirlikla artan entropiye bagli olarak FC ile kaynastirildiginda kuvvet kaybi beklenmistir. KV1D261 sentetik p261 Kanal/hücre - ' ' ' ' Test IC50 Seçicil Seçicilik hatti ik ICso (nM) kati* insan CD4+ T- , i_ _ Inhibis ~Z - 0,02 - hucresi insan hKv1.3/CHO efiz 0,15 - 0,02 - siçan Kvl.3/CHO efiz Kv1.3/insan CD4+ _ T-hucresi K 1.3/ V Slçan efi z 0, 29 - - CD4+T-hücresi hERG/CHO efiz 1000 6000 - - KCa3 l/insan _ CD4+ T-hücresi efiz: elektrofizyoloji manuel patch-clamp *CHO hücrelerinde |C50(hKv1.x)/| C50(hKv1. 3› orani KV1D261'in farmakokinetik özellikleri Sprague Dawley Siçanlari, lO mg/kg'lik bir son doz için 1,2 ml/kg'da 1xPBS pH7.0'da 8,3 mg/ml'lik bir Stoktan intravenöz bolus uygulamasi yoluyla KV1D261 (26l-FC füzyonu) ile dozlanmistir. Protein, hem ELISA hem de FACS testi kullanilarak ölçülmüstür. Yarilanma ömrünün yaklasik 72 saat oldugu degerlendirilmistir. Bir amino asit tarama kitapliginin üretilmesi (KV1D26L1 kütüphanesi) Kv1.3 bloke edici peptitlerin seçiciligini daha da iyilestirmek için, bir tarama kütüphanesi, KVlD26'nin peptit bölgesinin (karsilik gelen peptit p26, SEQ ID NO: 111) her bir SISteIn-olmayan kalintisindaki 9 amino asidin (A, R, Q, E, H, L, K, V, D) tekli ikamesiyle tasarlanmis olup, OdK2/Oskl kimera kütüphanesinden tanimlanan kuvvetli ancak seçici olmayan bir varyant Örnek 2'de tarif edilmistir. Bu amino asit tarama kütüphanesi 270 varyanttan olusmustur. Kütüphane, rutin moleküler biyoloji yöntemleri kullanilarak ve yukarida. tarif edilen sekilde olusturulmus ve eksprese edilmistir. Kisaca, varyant peptitleri kodlayan genler, sentetik gen toplulugu (ABD Pat. NO. U56521427 ve ABD Pat. NO. US6670l27) kullanilarak sentezlenmis ve bir memeli ekspresyon vektöründeki GS (G4S)4 (SEQ ID NO: 119) baglayicisi IgG4 Fc füzyon partneri ile çerçevede klonlanmistir. Kütüphane, yukaridaki gibi eksprese edilmis ve insan KV1.3 EC3 halka kimera kanali ile transfekte edilmis bir HEK hücre hattina baglanmak için ve insan Kvl.l EC3 halka kimera kanali ile transfekte edilmis bir HEK hücre hattina baglanarak seçicilik için ham üst fazlar olarak yukarida açiklanan sekilde taranmistir. Aktivite, her varyantin nicellendirilmesinden sonra. normallestirilmistirx KV1.3 ve Kvl.l için %Baglanma, malzemeler ve yöntemlerde tarif edilen sekilde ana KVlCZ'nin (OdKZ-Fc füzyonu) yüzdesi olarak ifade edilmistir. Kütüphane ayrica malzeme ve yöntemlerde tarif edilen sekilde iki hücre hatti kullanilarak talyum akis testinde taranmistir. Sekil 4A seçme varyantlarinin sekanslarini göstermektedir. Baglanma ve talyum akis verileri Sekil 4B'de özetlenmistir. Amino asit tarama kitapligindan birçok varyant, Kvl.1'e göre KV1.3 için artan baglanma ve seçicilik göstermistir. Baglanma deneyi taramasindan, lizinin glutamin ornatimlari tutarli bir sekilde Kvl.l'e göre Kvl.3 için daha fazla seçicilige neden olmustur. Kvl.3'e 2 %80 baglanma ve Kv1.l'e göre 21,3 kat seçicilik gösteren seçme varyantlar saflastirilmis ve ayrica karakterize edilmistir. Amino asit tarama kitapligindan elde edilen varyantlarin karakterizasyonu (KV1D26L1 kütüphanesi) Kv toksin inhibitörleri ile rekabet Seçme varyantlar saflastirilmis ve bilinen KV1.3 inhibitörü, agItOkSIn-Z-CysTAMRA, yukarida tarif edilen sekildeki tek nokta ve konsantrasyon-tepki testleri ile rekabet etme potansiyelleri açisindan degerlendirilmistir. Inhibisyon, lO nM AgItOkSIn-Z-CysTAMRA kullanilarak insan Kvl.3 EC3 halka kimerasini eksprese eden stabil HEK293 hücrelerinde ve tek nokta Okumalari için 40 nM'de veya konsantrasyon yanit çalismalari için 0,0l5 nM ila 4 pM arasinda her bir varyantta degerlendirilmistir. Seçme varyantlar için agitoksin-Z-CysTAMRA baglanmasi ve Seçme varyantlar, KV1D261'e benzer seviyelerde agitoksin-Z- CysTAMRA'nin Kvl.3'e baglanmasini inhibe etmistir ve IC50 degerleri, 5 nM ila 1,3 pM araliginda olmustur ve ayni zamanda varyantlarin birkaçi da KV1D26l'in düsük nanomolar araliginda olmustur. Rekabetçi baglanma %Rekabet %I hucre _ . _ . _ _ Inhibisyon " . Protein _ u Tekli . Konsantras a ICso Konsantras ICso(nM) (40nM) lKVlDGGS 5,6 1394 0 NA NA lKVlD414 32,2 NA 0 NA NA Inhibisyo Kontrolu NA: yapilmadi O: ölçülebilir inhibisyon yok T hücresi aktivasyonunun inhibisyonu Seçme varyantlarin T hücresi aktivasyonunu inhibe etme yetenegi, aktivasyon için bir markör olarak IL-2 sekresyonu kullanilarak yukarida tarif edilen sekilde degerlendirilmistir. Testler, 5 nM ya da 250 nM'Iik tekli varyant konsantrasyonunda veya bir konsantrasyon yaniti için 0,015 nM ila 250 nM arasindaki bir aralik kullanilarak gerçeklestirilmistir. Seçme varyantlar için maksimal sinyalden KV1D579 güçlü ve seçici bir Kv1.3 inhibitörüdür Tam hücre patch clamp çalismalarinda KV1D579 çalisilmis ve yukarida açiklanan sekilde insan Kvl.3, KVl.l veya Kvl.6'si ile transfekte edilmis HEK hücreleri kullanilarak talyum akisi incelenmistir. Protein Seçicilik * (nl/'l (nl/ll IC50 (nM) Seçicilik* O,21/(O,32) / / Parantez içindeki degerler, talyum akis inhibisyon testlerinden elde edilir. *IOSvaix)/ICsomvL3› orani C ucu uzantisi kütüphanesinin olusturulmasi (KV1D819L1 kutüghanesi) GS(C4S)4 (SEQ ID NO: 1l9) baglayicisi kullanilarak konjuge edilmis birkaç peptit-FC füzyonu proteinlerinin, dingin insan periferik kan mononükleer hücrelerinin kültürlerinden arzu edilmeyen enflamatuvar sitokin salimini in vitro sekilde indükledigi, karsilik gelen sentetik peptitlerin kendilerinin ise indüklemedigi bulunmustur. Bu nedenle istenmeyen sitokin salimi, bivalent peptid-Fc füzyonu formatina veya Fc'nin kendisine atfedilebilir olmustur. Arzu edilmeyen sitokin salimini önlemek için, peptIt 261 (p baglayicisi kullanilarak bir insan serumu albümin füzyon proteini olarak sentezlenmistir. Elde edilen füzyon proteininin (KV1D261_23) kuvveti, KV1D261_23'e dayanan bi r füzyon protein kütüphanesi nin üretilmesiyle daha da optimize edilmis olup, burada peptit p26l, C ucundan dört amino asitle uzatilmistir. KVlD261_23 füzyon proteininin peptit bölgesinin C ucunun uzatilmasinin, peptidin KVl.3 kanalinin hücre disi halkalari ile artan baglanma etkilesimlerine imkan taniyacagi ve böylece kuvveti arttiracagi varsayilmistir. KV1D579 için IC50 degerleri, Örnek 2'de izole edilen bir OdK kimera-Fc füzyon varyanti olan ana KVlD26 ile birlikte Tablo 6'da listelenmistir. Parantez içindeki degerler, talyum akis analizlerinden türevlenir ve parantez içinde olmayan degerler, patch clamp çalismasindan elde edilir. KV1D261_23 füzyon proteini, peptidin C ucu ve araya giren GS(G4S)4 baglayicisi (SEQ 1D NO: 119› arasina, 261 peptidindeki yeni 39, 40, 41 ve 42 pozisyonlarindaki tam kombinasyon (Q, R, P, H, K, T, N, S, E, G, A, ve D) halindeki pozisyon basina sayilan 12 kalinti ile 4 ilave amino asit eklenmesiyle modifiye edilmistir. Her bir kalinti için oran, R'nin 1,5 ve S'nin 0,5 olmasi haricinde l olmus ve bu kütüphanenin olasi varyantlarinin ortaya çikan teorik sayisi 124 (20.736) olmustur. Varyant C ucu uzantilarina sahip peptitleri kodlayan genler, daha Önce tarif edilen sekilde sentezlenmis ve rutin moleküler biyoloji yöntemleri kullanilarak bir memeli ekspresyon vektöründe GS(G4S)4 baglayicisi (SEQ ID NO: 119) çerçevesinde ve insan serum al bümin füzyon partneri ile klonlanmistir. Kütüphane, geçici olarak transfekte edilmis HEK293 hücrelerinde rekombinant olarak eksprese edilmistir. Ham üst fazlar, KV1.3 kuvveti için insan KVl.3 kuyruk kimera kanali ile transfekte edilmis bir HEK hücre hatti ve insan Kvl.1 kuyruk kimera kanali ile transfekte edilmis bir HEK hücre hatti kullanilarak dogrudan baglama testleri ve fonksiyonel talyum akisi testleriyle taranmistir. Bu kütüphaneden elde edilen eslesmeler, bazik (R, H ve K), asidik (T, N ve G) ve polar olmayan (A ve P) kalintilar açisindan yüksek olmustur. Sekil 6, seçme füzyon proteinleri için baglanma ve talyum akis testlerinin sonuçlarini göstermektedir. C ucu uzantisi kütüphanesinin (KV1D819L1 kütüphanesi) karakterizasxonu C ucu uzantisi kütüphanesinden belirlenen seçme adaylar saflastirilmis ve KV1.3'e baglanma dogrulanmistir. Talyum akis analizleri Için konsantrasyon-yanit egrileri olusturulmustur. Tablo 7, talyum akis testinde belirlenen IC50 degerlerini ve her bir varyant için C ucu uzantisinin amino asit sekansini göstermektedir. KV1D261_26 ( GS(G4S)g baglayicisi (SEQ ID NO: testte bir kontrol olarak kullanilmistir. Çogu p261 C ucu uzantisi peptit füzyonlari, kontrol uzatilmamis peptit parçalari ile karsilastirildiginda, talyum akisinda benzer veya yüksek kuvvet göstermistir. KV4 baglayicisi (SEQ ID NO: 119) kullanilarak) ~5 kat daha güçlü test edilmistir. . Yarila _ C-ucu uzantisi %Baglanm Talyum Protein " "Baglayi Peptit ma omru Amino SEQ IDa Akis artiri asit NO: (KV1D261 lCx i sekansi 26'nin) (nM) p4 AQRP 210 76,2% 7,6 uzatilmis p4 ATRP 206 95,2% 5,9 uzatilmis p4 NHRT 222 88,4% 5,9 uzatilmis p4 PNRT' 223 66,2% 6,7 uzatilmis p4uzatilmis PTrR 241 55, 0% 9, 1 p4 RHNT 226 34,5% 6,7 uzatilmis p4 RKKP 173 73,?% 6,0 uzatilmis uzatilmis uzatilmis uzatilmis KV1D2612 p4 6 uzatilmis 99,&% 1,0 *insan serum albümim **SEQ ID NO: 119 Peptit HSA füzyon proteini mühendisligi Peptit 261, çesitli baglayicilar kullanilarak insan serum albümini (HSA) ile füzyon proteini olarak tasarlanmis ve elde edilen füzyon proteinleri, Kvl.3 kuvveti ve seçiciligi ve T hücresi aktivasyonunun inhibisyonu açisindan test edilmistir. salgisinin inhibisyonu olarak ölçülen, T hücresi inhibisyonunun sonuçlari ve çesitli baglayicilarla HSA'ya konjuge edilmis peptit 261 ile talyum akisinin inhibisyonu Tablo 8'de gösterilmistir. T hucresi Protein Inhibisyonu adi SEQ ID NO: KV1.3 IC50 Baglayici mühendisligi daha yapisal alanin prolin (AP) tekrarli baglayicisini, daha esnek glisin serin (GS) baglayicisi yerine füzyon proteinine eklemenin kuvveti önemli ölçüde arttirdigini ve baglayici uzunlugunu arttirmanin kuvveti gelistirdigini göstermistir. IDC1(13AA)2 (SEQ ID NO: 3(SEQ ID NO: 118) baglayicilari ayrica kuvveti arttirmis, fakat saflastirmanin ardindan mevcut olan füzyon protein fragmanlari ile protein üretimi sirasinda daha az kararli görünmüstür. AS(AP)20GS baglayicisi (SEQ ID NO: 116) yoluyla HSA'ya konjuge için T hücresi inhibisyon testinde yaklasik 4 nM'lik bir olmustur. p261 ve p579 HSA füzyonlarinin karakterizasyonu KV20GS baglayicisi (SEQ ID NO: 116) yoluyla konjuge edilmis karsilik füzyon proteini üretmek için ayrica çesitli fonksiyonel analizlerde ve Tablo 9'da gösterildigi gibi insan Kv kanallarina karsi seçicilikleri için test edilmistir. p261 sentetik Kanal/hücre Seçici hatti ICy) lik Seçicili Seçicil Test IC50 (nM) Rekabetçi baglanma talyum 0,03- hKv1.3/CHO 0,3 - - 9,0 hKvl.3/CHO efiz 1,2 - 0,02* - 3,0 efiz NA - 0,016 - insan CD4+T hücresi T-hücresi hucresi talyum hKv1.5/CHO efiz 100 100 - - efiz: patch clamp elektrofizyolojisi *%1 BSA'da ICSO 20 pM ve %5 FCS'de 13 pM ** Düsük güç nedeniyle eksik konsantrasyon yaniti. IC5m CHO hücrelerinde test edilen en yüksek ICsmKw.n/ICsmKn.n konsantrasyon #oranindan daha büyük olarak bildirilmistir. KV1D261_34 ayrica insan ve domuz (Yucatan minipig) tam kanindan thapsigargin kaynakli IL-17A üretimini inhibe etme kabiliyeti açisindan test edilmistir. Hem insanlarda hem de minipigde inhibisyon için IC50 degeri 0,5 nM olmustur. KV1D261_34 ayrica minipig CD4+ T hücresi aktivasyonunu (IL-2 sekresyonunu) 1,6 nM'Iik bir IC50 degeri ile inhibe etmistir. Ilave C ucu uzantisi peptit füzyonlarinin üretimi ve karakterizasyonu p peptitlen, birkaç C ucu uzantisi kullanilarak uzatilmis ve AS(AP)20GS (SEQ HSA'ya konjuge edilmistir. Füzyon proteinlerinin seçilmesi, rekombinant. baglanma, talyum akisi, in vitro insan CD4+ T hücresi akt i vasyonunun i nhi bi syonu ve el ekt rofi zyol oji testlerini içeren analizlerde eksprese edilmis, saflastirilmis ve karakterize edilmistir. Sekil 7A, peptit p261 üzerinde çesitli C ucu uzantilarina sahip füzyon proteinlerinin özelliklerini göstermektedir. T hücresi inhibisyonunu degerlendirmek için, seçme varyantlarI ya 1 nM' lik tekli bi r konsant rasyonda anti CD3/CD28 ile uyarilmis insan CD4+ T hücresi IL-2 üretimini n %i nhi bi syonu için (T hücresi %Inhibisyonu @lnM) ya da ayni analiz kullanilarak konsantrasyon-yanit egrilerinden elde edilen IC50 degerleri için (T hücresi inhibisyonu ICyJnM) test edilmistir. Kat seçiciligi, talyum akis deneyi degerlerinden yararlanilarak IC50 (KV1.1)/IC50 (KV1.3) orani olarak ölçülmüstür. C ucuyla uzatilmis peptit füzyon proteinleri için rekabetçi baglanma Ki degerleri, ana KV1D261434 uzatilmamis peptit füzyonu için yaklasik 1 nM'lik Ki'ye kiyasla yaklasik 0,15 nM ila yaklasik 18,0 nM arasinda olmustur. Varyantlarin birçogu, ana KV1D261_34 ile karsilastirildiginda, yaklasik 10 pM ila yaklasik 1 nM arasinda degisen talyum akisi IC50 degerleri ve KV1.1 üzerinde yaklasik 30 ila yaklasik 800 araligindaki seçicilik degerleri ile gelismis bir etki ve seçicilik saglamistir. Yukarida açiklandigi gibi Kv1.3 transfekte edilmis CHO hücre hatlarinda seçilmis peptit füzyon proteinleri için manuel patch clamp çalismalari gerçeklestirilmistir. (AS(AP)mGS baglayicisi (SEQ ID NO: 116) araciligiyla AHRH (SEQ ID NO: p261'in C ucu uzantisi) için IC50 degerleri 199 pM olmustur. Bazi C ucu eklentileri, ana KV1D261_34'e göre ~5-10 kat kuvvet artisi göstermistir. Araya giren bir GS(AP)20AS (SEQ ID NO: 116) ile HSA'ya konjuge edilmis seçme C ucu uzantisi ile birlikte veya uzantisiz sekildeki p579'un füzyon proteinleri, rekabetçi baglanma (HEK hücrelerine baglanan lO nM agitoksin-CyS-TAMRA ile rekabet) ve T hücresi inhibisyonunda (IL-2 sekresyonu) karakterize edilmis ve sonuçlar Sekil 7B'de gösterilmistir. Bazi C ucu eklemeleri, ana, KV1G49.KV1W720 üzerinde ~3-5 katlik bir artisla sonuçlanmistir. AS(AP)20GS baglayicisi (SEQ ID NO: 116) kullanilarak peptit varyantlarina konjuge edilen birkaç HSA füzyon proteini, sitokinler ve kimokinlerin (lFNy, lL-lß, TNF-d, iL-Z, IL-4, kabiliyetleri açisindan test edilmistir. Bu HSA füzyonlari Minipiglerde KV1D261 34 farmakokinetigi ve farmakodinamigi KV1D261_34, (araya giren AS(AP)20GS baglayicisi (SEQ ID NO: tek bir intravenöz enjeksiyon (30nmol/Kg) olarak minipiglere uygulanmistir. Heparinize edilmis plazma örnekleri uygulama sonrasi çesitli zaman noktalarinda toplanmis ve anti-261 yakalama/anti-penta HIS-HRP ELISA kullanilarak plazma seviyeleri belirlenmistir. Sekil 9, sonuçlari, 36 gün boyunca 4 hayvan ve son 54 günlük zaman noktasinda 2 hayvanin ortalama ±SS'si olarak göstermektedir. Füzyon proteininin yarilanma ömrü (Tl/2) 5-7 gün olmustur, açiklik (CL) 0,008-0,0l ml/dak/Kg ve dagilim hacmi (VSS) = 90-120ml/Kg olmustur. Hedef katilimi, tam kan ex-vivo olarak lenfositlerden IL- 17A sekresyonu ölçülerek degerlendirilmistir. Tam kan Örnekleri, her çalisma hayvanindan uygulama öncesi -48, -24, -l saatte toplanmis ve KV1D261_34 (30nmol/Kg) uygulamasindan toplanmistir. Tam kan örnekleri, örnek basina üç kopya halinde her kosulda 1 uM eksojen 261 peptidin yoklugunda veya varliginda thapsigargin ile muamele edilmistir. IL-17 SItOkIn seviyeleri bir anti-domuz IL-17A ELISA'da ölçülmüs ve eksojen peptit 261 ile %inhibisyon asagidaki gibi hesaplanmistir: lOO- (+thapsigargin+ luM eksojen 261 tepkimelerindeki ortalama IL- 17 pg/ml konsantrasyonlari/ithapsigargin tepkimelerindeki ortalama IL-17 pg/ml konsantrasyonlari)x100. Eksojen 261 peptidi tarafindan thapsigargin kaynakli IL-17 sekresyonunun %inhibisyonu olarak ifade edilen deneyin sonuçlari (2 hayvanin analiz edildigi 54 gun hariç 4 hayvanin ortalama ±SS'si) Sekil 10'da gösterilmektedir. Önceden dozlanmis örneklerin tümü ve dozlanmamis kontrol hayvani (tüm zaman noktalari) için ekzojen 261 tarafindan thapsigargin kaynakli IL-17 sekresyonunun ortalama %inhibisyonu %75,3 ± 14,1 olmustur. Tam kanda ex-vivo olarak eksojen 261 tarafindan thapsigargin kaynakli lL-l7 sekresyonunun ortalama % Inhibisyonu, KV1D261- 34 IV uygulamasini takiben yaklasik 14 gün boyunca 5 %25 olmustur, bu durum, dolasimdaki KV1D261_34 tarafindan yüksek bir hedef angajman düzeyini isaret etmektedir. Bu zaman noktalarindaki plazma konsantrasyonlari 1O nM olmustur. Daha sonraki zaman noktalarinda, eksojen 261 tarafindan thapsigargin kaynakli lL-17 sekresyonunun inhibisyonu 36'nci günde %65'e yükselmis ve 54'üncü gün itibariyle 2%8O'lik referans hatti düzeylerine ulasmis, bu da azalan plazma düzeyleri olarak hedef angajmaninin kademeli olarak azaldigini göstermistir. Bu çalismanin bulgulari KV1D261_34'ün in Vivo olarak plazmada stabil oldugunu ve minipiglerde uzun bir plazma yarilanma ömrüne sahip oldugunu göstermektedir. Dolasan KV1D261I34, biyolojik olarak kullanilabilir ve intravenöz dozlamayi takiben lenfositler üzerinde thapsigargin kaynakli IL-17 sekresyonunu inhibe eder. Thapsigargin kaynakli IL-17 sekresyonunun inhibisyonu, plazma konsantrasyonu ile iyi bir korelasyon içinde görünmekte ve etkili plazma konSantrasyonlari, KVlD26l_34'ün önerilen etki mekanizmasi (Kv1.3 blogu) ile tutarli olmustur. Minipig anahtar deligi limpet hemosiyanin (KLH) ile indüklenen gecikmis tip hipersensitivite (DTH) modeli Minipig Gecikmis Tip Hipersensitivite (DTH) modeli, KV1D261_34'ün T hücre fonksiyonunu inhibe etme kabiliyetim degerlendirmek için bir in vivo model olarak kullanilmistir. = 6) ile IV dozlanmistir. Pozitif kontrol olarak, Cyclosporine A, günde iki kez 1 ml/kg ile, 10 mg/ml konsantrasyonda, -1'inci günden nekropsiye (n = 6) kadar subkütan yoldan uygulanmistir. Dozlama, KLH antijeniyle immünizasyondan bir gün önce (-1"inci Gün) baslamistir. Minipigler, tamamlanmamis Freund. Adjuvan (IFA) içindeki 5 mg/ml KLH ya da kontrol grubu için IFA içinde PBS ile O'inci günde, subkütan olarak yapilan 1 ml'lik enjeksiyonlar yoluyla KLH ile immünize edilmistir. Enjeksiyonlar arka bacaklarin kaudal yönü üzerinde ~ 5 yerden yapilmistir. Daha sonra hayvanlar 7'nci günde O,l ml/noktalik intradermal enjeksiyonlar ile 10, 5, 2,5, 1,25 mg/ml'lik KLH ile veya sol yandan her bir test dozu için bir noktadan ve sag yandan çift test noktasindan PBS ile test edilmistir. Endürasyon seviyesi, 9 ve lO'uncu günlerde, test dozundan bir ve iki gün sonra ölçülmüs ve lO'uncu günde doku ve kan örnekleri, drene olan lenf bezi hücreselligi, anti antijen antikor titreleri ve test alani histolojisinin ilave ölçümleri için toplanmistir. Drenaj lenf nodlari, lenf nodu hücreselliginin belirlenmesi için, lO'uncu günde, mücadeleden iki gün sonra toplanmistir. Sonuçlar, Sekil ll'de gösterilmektedir. KVlD26l_34 ile tedavi edilmis hayvanlar, araçla tedavi edilen hayvanlara kiyasla, hücreselligi önemli ölçüde azaltmistir. Hücresellik, bagisiklanmamis kontrol hayvanlarinda gözlemlenenle kiyaslanabilecek bir düzeye indirilmistir. uygulanmis hayvanlarda anti-KLH antikor titrelerinde veya endürasyonunda önemli bir azalma saptanmamistir. Sekans Listesi <110 Janssen Biotech Inc. Chi. Ellen Edwards. Wilson Humg. Chichi Leung, Wai-Pmg Swanson. Ronald Wickend (120› Kv|.3 anwgonistlen' ve kullanim yöntemleri <130 JBI5021WOPCT (170› Patent Versiyonu 3.5 (213› Odontobuthus doriae <400 1 Q10 2 411› 38 Q12 PRT Q13Orîhochirus <400 2 Pro rh: Aip Vii iyi Cyi Azq Giy si: D:: Gin Cyi :1. Sin 10 15 iyi Asp Ala Giy Met At; Phe Giy Ly: Cys Met Asu Giy ::ya 25 30 scrobiculosus 10 15 Lys Lys Aia Giy mt Ar; Ph. Giy :iyi Cyi Met Ann Giy :iyi 25 30 <213 Yapay dizi <4UU 'J Gly Vai Pro 'rhr Asp Vai Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cya Glu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 25 30 (210› 4 <211 38 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Thr Asp vai Lys Cys Ari; Iie Ser Arg Gin Cya Leu Lys 1 5 10 1.5 Pro Cys Lys Asp Aia Giy Met Arg Ehe Gly Lys Cys Met Asu Giy Lys 25 30 <21Ü 5 Q11 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› Giy Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 1.0 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met. Arg Phe Giy Lya Cys Met vii Giy Lya 25 30 Cys His Cye Thr Pro Lys<223 OdIQ varyanti <400 <21Ü 7 <21138 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <400 7 <21Ü8 <21138 Q12 PRT <213› Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <4ÜÜ Asp Vai Lys Cys Arq Ile Se: Ala Gin Cya Leu Lya Ala Gly mt Arg :ini Gly Lya oya mt Am Gly Lya Asp Vai Lys Cys Arg :lo Sor Arg Gin Cyi Lou Lya A1: Giy Mit Arg Ph. Giy Ly: Cy: mot Asn Giy Lyi Thr Asp Vai Lys Cys Arq Ile Ser Arq Gin Cyi Leu Lys Q109 (211› 38 <212 PRT <213› Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti (400› <21010 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› OdIQ varyanti <4ÜU <21Ü11 <21138 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Thr Asp Vai Lye Cys Arq Ile Ala Arq Gin Cya Leu Lya 10 15 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met Asu Giy Lyi 25 30 rh: Asp Vai Lys Cys Arg Ile Se: Arg Gin Cyi Lou Lyi lü 15 Asp Ala Giy Mut His Ph. Gly Lyi Cyi Met Asn Giy Lys 25 30 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 <210 12 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ Giy Vai Pro rh: Asp Vsi Lys Cys Arq Iio Ser Arq Gin Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Giu Asp Aia Giy Mot Arg Pho Giy Lys Cys mot Ain Giy Lyi 25 30 <210 13 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ Giy Vsi Pro 'rhr Asp Vsi Lys Oya Giu Ile Ser Arq Gin Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Als Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys 25 30 <21014 <211 38 <212 PRT <21015 (211› 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 (210› 16 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 rh: Asp Vsi Lya Cys Arc Ile Se: Arq Gin Cya Leu Lya Asp Aia Giy Mst Arg Ph. Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys rh: Asp Vsi Lys Cys Arg :is s.: Arg Asp Cys Lou Lys Asp Aia Giy Mat Arg Ph. Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Cys His Oy:<21017 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met Asn Giy Lyi 25 30 10 15 Asp Aia Giy Mat Arg Pho Giy Ly: Cyi Not Ain Giy Lyi 25 30 rh: Asp Vai Lys Cys Arg Iie Ser Arg Gin Cyi Lou Lyi 10 15 Asp Aia Giy Mit Arg Ph. Giy Arq Cyi Not Asn Giy Lyi 25 30 <4UU 19 <21020 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <400 <21Ü21 <211›38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Asp Vai Lys Cys Arq Ile Ser Arq Gin Cyi Leu Lys 10 15 A1: Giy Met Lys Phe Giy Lya Cya Met Asn Giy Lya Asp vai Lys Cyi Arg Iio Sor Lou Gin Cyi Lou Lyi 10 15 Ala Giy Met Arc Phe Giy Lyi Cyi Met Asn Giy Lyi Asp vai Lys Cys Aia Iio Sor Arq Gin Cys Lou Lys 10 15 Ala Gly mt Arg Ph. Gly Lyi Cya mt Asn Gly Lya <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 23 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 24 (211› 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Asp Ala Giy Met Arc ?he Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Th: Asp Vai iyi Cyi Arq Iio Sir Arq Gin Cyi Lou Lyi Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Giu 25 30 <210 25 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 Giy Vsi Pro Thr Asp Vsi Lys Oys Arq Iio sir Arq Gin Cys Lou Lys 1 5 i0 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 (210› 26 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 0de varyanti <400 Giy Vol ?:0 Ile Asp Vsi Lys Cys &:9 Ile Set ?:0 Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lys Cys Not Asn Gly Lys 25 30 Q10 27 Q11 38 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 Giy Vai Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 1.0 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ala Asn Gly Lys 25 30 <21Ü 28 Q11 38 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› His Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 <21Ü 29 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys<213 Yapay dizi <220 (223› Odl<2 varyanti (400› <210 31 <211 38 Giy Vsi Pro 'rhr Asp Vsi Lys Cys Arg Iio Sor Giu Gin Cys Lou Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Als Giy Met Ari; Phe Giy iyi Cya Met &sn Giy Lya 25 30 Q12 PRT <213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 32 <211 38 Giy Vsi Pro Th:: Asp Vsi Lys Cys Arq Iio Sor Arq Gin Cys Lou Lys 1 5 10 15 Pro Cys Vsi Asp Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met aan Giy Lys 25 30 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› Pro Cyi iyi Aip Ala Giy Mit Arg Ph. Gly iyi Cyi Hot Ain Giy Lyi 25 30 <21033 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti (400› 33 Giy vai Pro Thr Asp vai Giu Cyi Arq Iio Sor Arq Gin Cyi Ldu Lyi 1 5 10 15 Pro Cys Ly: Asp Aia Giy Mat Arg Ph. Giy Ly: Cyi Not Ain Giy Lyi 25 30 <21Ü 34 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Thr Ann Vai iyi Cyi iyi :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi 25 30 <213 Yapay dizi <400 35 Giy Vai Pro :1. Asp Vai iyi Cyi iyi Iio Sor Pro Gin Cyi Iio Giu Pro Cys Lys Lys Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met &en Giy Lys <210 36 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Gly Vai Ile ?hr Asp Vii Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gin Cys Ile Giu Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mit Arg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy Lyi <21Ü 37 <211›38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Thr asp Vai Lya Oy: &:9 Ile Ser Arq Gin Cya Lou Lya Pro Cys Lys Asp Ala Gly Mot Arg Ph. Gly Lyi Cya Met Ann Gly Lya Oy: His Cys Thr Pro Leu<213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vii Pro Thr Asp Vii Lys Cys Ari; Ile Ser Arg Gin Cyi His :by: Pro Cys Lys Asp Aia Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cys Mct nin Giy Lys 25 30 Oya His Cys Thr Pro Lys<210 39 <211 38 Q12 PRT <213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› Giy Vai Pro ?hr Asp Vii &ya Cys arc Ile Se: Arc Gin Cys &en &su Pro Cys Lys Alp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy :by: <21Ü 40 <21138 <212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Cys Gin Oy:<21041 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met han Giy Lyi 25 30 10 15 Asp Aia Giy Mat Arg Ph. Giy Ly: Cyi Not Ain Giy Lyi 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Mit Ann Gly Lyi 25 30 <4UU 45 <21044 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü45 <211 38 <212 PRT <213Yapaydüi<220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› Asp vai iyi CYI iyi :1. Sir Pro Gln Cyi Iio Gln 10 15 Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Ain Vai iyi Cyi Arq :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Giu 10 15 Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Giy Lys Asp Vai iyi Cyi iyi Iio Sir Arq Gin Cyi Il. Gin 10 15 Ala Giy Mat Arg Ph. Gly iyi Cyi Mit Ann Giy Lyi <21Ü 48 <21138 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ 410› 47 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 48 <211 38 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Mot Ann Giy Lyi 25 30 Thr Asp Vai Lys Cys Arq Iio Sor Arg Gin Cyi Lou Ly: 10 15 Asp Ala Giy Met Arg ?he Giy Lyi Oya Met Asu Giy Lys 25 30 (210› 49 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 (210› 50 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 0de varyanti <400 Q10 51 Q11 38 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 Asp Aia Giy Mit Arg Ph. Giy Lya Cya Mat han Giy Lya 25 30 Thr Asp Vai iyi Cyi Arq Iio Sir Arq Gin Cyi Lou Aip 10 15 Ala Giy Met Arg Phe Giy iyi Cya Met Asn Giy Lys 25 30 Thr Asp Vii Lys Cys arg Ile Ser Arg Gin Cyi Lou Lyi 10 15 Ala Giy mt Arg Ph. Giy Lyi Cyi mt Am Giy Lyi Giy Vsi Pro Thr Asp Vsi Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cys Lou Vsi Pro Cys Lys Asp Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys (219 52 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› OdIQ varyanti <400 Asp Vsi Pro Thr Asp Vsi Lys Cys Arq Ile Ser Arg Gin Cys Lou Lys 10 15 Pro Cys Lys Asp Als Giy Met Ari; Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys <21D53 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti (400› Giy Vsi Pro 'rhr Asp Vsi Lys Cys Arq Ile Ser Arg Gin Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Aia Giy Asp Arg Ph. Giy Lyi Cys Mit Ain Giy LysOya His Cys Thr Pro Lys <210 54 <211 38 (425› UOKZ varyanti <4UU <21055 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 Ode varyanti <400 <21058 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Ode varyanti <400 rh: asp Vai Lys Cys Arq Ile Ser Arq Gin Cya Lou Lya io 15 Asp Ala Giy Met Ari; Phe Giy Lyi Cyi Met Asn Giy Lys Asp A1: Giy Met Arc Phe Giy iyi Cya Met &en Giy :ya Cys His Oy:<21057 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 Cys His Oy:<21Ü 58 <21138 <212 PRT <213`Yapaydui<220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi Aia Asp Mat Arg Ph. Giy Lys Cys not Asn Giy Lys Asp Vai Sin Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cyi Leu Lyi 10 15 A1: Giy Mat Arg Pho Giy Lys Cys Not Asn Giy Lys Asp vai Lys Cys Arg :1. Sir Arq Gin Cys Lou Lys 10 15 Aia Giy mt Arg Ph. Giy Lyi Cyi mt Am Giy Lyi <4UU 39 <21080 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü81 <21138 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti (400› 81 Asp Vai Lys Cys Gin Iio Sor Arq Gin Cys Lou Lys 10 15 A1: Giy Met Arg Phe Giy Lya Cya Met Asu Giy Lya Asp Vsi Lys Cys Arq Iio Sor Arg Gin Cys Lou Lys 10 15 A1: Giy Mit Arg Pho Giy Lys Cys Met Asn Asp Lys Asp Vsi ala Cys Arc Ile Se: Arq Gin Cya Lou Lya 10 15 Ala Gly mt Arg ph. Gly Lys Cys mt Asn Gly Lys <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 63 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 84 (211› 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Thr Asp Vii Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cyi Leu Lys Asp Aia Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cys Mct nin Giy Lys Th: Ain Vai iyi Cyi iyi :1. Sir Arq Gin Cyi Il. Gin Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Cyi His Oy:<21085 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 <210 86 <21138 <212 PRT <213`Yapaydui<220 <223 0dk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met han Giy Asp 25 30 10 15 Asp Aia Giy Mat Arg Ph. Giy Ly: Cyi Not Ain Giy Lyi 25 30 Thr Asp Vai iyi Cyi Arq :1. Sir Arq Gin Cyi Lou Lyi 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Mit Ann Giy Gln 25 30 <4UU ö( Giy Vai Pro Thr Asp vai Lys Cys Arg Iio Sor Arq Gin Cys Lou Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp ala Giy Met Arg Phe Giy Lya Cya Met Asn Giy ala 25 30 <210 88 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy vai Pro Thr Asp Aia Lys Oy: Arq Iio Sor Arg Gin Cy: Lou Ly: 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met Asu Giy Lyi 25 30 <21D 69 <211 38 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro :1. lap Vai iyi Cyi iyi :1. Sir Arq Gln Oy. 110 Gln 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy net Arc Phe Giy iyi Cyi Met Asn Gly Lys 25 30 Oya His Cys ?hr Pro iys<210 70 Q23 OdIQ varyanti <4OU <21Ü 71 <21138 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 72 <211 38 <212 PRT 413› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Th: Asp Vai iyi Cyi iyi Iio Sor Arq Gin Cyi Iio Giu 10 15 Asp Ala Giy Mut Arg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy Lyi 25 30 10 15 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met Asu Giy Lyi 25 30 (210› 73 <211 38 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 <212 PRT 413 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 74 Q11 38 Giy Vai Pro Ile Asu Vii Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Lyi 25 30 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 75 <211 38 Giy vai Pro rh: Asp vai Lou Cys Arq :1. Sir Arg Gin Cya Lou Lya 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lya Cyi Mat Ann Giy Lyi 25 30 <212 PRT <21076 (211› 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 (210› 77 <211 38 <212 PRT <213`Yapaydui<220 <223 OdIQ varyanti <400 Thr Asp Vai Lys Cys Arg Iio s.: Arg Gin Cya Lou Lya Asp Ala Giy Met Ari; Phe Giy Lyi Cyi Met Asn Giy Lys Thr Asp Vai Lys Cys Arg Il. s.: Arg Gin Cyi Lyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Met Ain Giy Lya Cys His Oy:<21078 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 <21Ü 79 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi Aia Arg Mit Arg Ph. Giy Lys Cys not Asn Giy Lys Asp vai Lys Cys Arq Iio Sor Arg Gin Cys Lou Lys 10 15 A1: Giy Mat Arg Ph. Giy Lys Cys Not Asn Giy Lys Asp Vsi Lys Cys Arg Iie Ser Arg Gin Cyi Lou Lyi 10 15 Ala Giu Mit Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Asn Giy Lyi <400 80 <21081 <211 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Cys His Oy:<21Ü82 <211›38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Thr Asp Vsi Lys Cys Arg Iio Sor Arq Gin Cys Lou Lys 10 15 Ala His Met Arg Phe Giy Lya Cya Met Asn Giy Lya 25 30 Thr Asp Vsi Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cyi Ala Lyi 10 15 Asp Aia Giy Mit Arg Ph. Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 Thr Asp Vai iyi Cys Arq :1. Sir Arq Gin Cyi Lou Giu 10 15 Ala Gly Mit Arg ph. Gly iyi Cya Mit Asn Gly iyi 25 30 <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vii ?to :Ph: Asp Vii Lys Cys Arg Ile Se:: Arg 6111 Oy: Ile Gin Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit Ain Giy Lyi 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi<210 84 <211 38 Q12 PRT <213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› Giy Vai Pro Ile &en Vii &ya Cys iyi Ile Se: Arc Gin Cys Ile Giu Pro Cys Lys Lys Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy :by: <21Ü 85 <21138 <212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 <21086 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Lyi <21Ü 87 <21138 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro ?hr Asu Vii Lys Cys Arq Ile Ser Pro Gin Cys Ile Giu Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi <213 Yapay dizi Giy Vai Ile Ile Asp Vii Lys Oy: &:9 Gly Ser Arg Gin Cys Ile Giu <400 88 Giy Vai Pro ?hr Aan Vai Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Azg ?he Giy iyi Cys Met Asn Gly iyi 25 30 <21138 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy vai Pro Thr Asp Vai iyi Cyi Arq :1. Sir Pro Gin Oya 11. Gin 1 5 10 15 Pro Cys Lys Agp Ala Gly Met Arc Phe Gly Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 <21D 90 <211 38 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Ile Asu Vai Lys Cys Arc Ile Se: Pro Gln Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy net Arc Phe Giy iyi Cyi Met Asn Gly Lys 25 30 Q23 Odk2 varyanti <4OU Ala Vai Pro '1211: Asp Vai Lys Cys Arq Ile Ser Arc Gin Cys Leu Lys 1 5 :LG 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi not nin Giy Lyi 25 30 <210 92 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› Giy Vai Pro Thr Asp Vai iyi Cyi Arq :1. Sir Arq Gin Cyi Lou Gin 1 5 10 15 Pro Cys Lys Alp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy :by: 25 30 <21Ü 93 (211› 38 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Pro Cys Lys Asp Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 <210 94 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 Giy Vsi Pro Thr Asp Vsi Lys Cys Arq ne Ser Arg Gin Cys Lou Lys l 5 10 15 Pro Cys by: Asp Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Oy: ver Asu Giy Lys 25 30 (210› 95 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti (400› 95 Giy Vsi Pro Thr Asp Vsi Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cys Lou Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lys Cys Mat Asn Giu Lys 25 30 Q10 96 Q11 38 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 <210 97 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Ode varyanti <400 <21098 <211 38 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Cyi His Oy:<21099 Asp vai Lys Cys Arg Iio Sor Arq Gin Cys Lou Lys 10 15 Ala Giy Mat Arg En. Giy Lyi Cyi Mo: Asn Giy Ly: Ain Vai iyi Cyi iyi :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Gin 10 15 Ala Giy Mat irg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy iyi Ann Vai iyi Cyi iyi :1. Sir Arq Gin Oy. :10 Gin 10 15 A1; Giy net Arc Phe Giy iyi Cyi Met Asn Gly Lys <223 OdIQ varyanti <400 <21Ü 100 <21138 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <400 100 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› Lyi Ala Giy Mut Arg Ph. Giy Lyi Cyi Mat Ann Gly Lyi Lyi Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi mat Ain Giy Lyi <210102 <211 38 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 <210103 <211 38 412› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <4OU Giy Va!. Pro <213 Yapay dizi Ala Giy Mit Arg Ph. Gly iyi Cyi Hot Ain Giy Lyi Aip vai iyi Cys Arq :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Giu 10 15 Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mat nin Giy Lyi Ann Vai iyi Cyi Arq :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Gin 10 15 Ala Gly Mat Arg Ph. Gly Lyi Cyi Mit Ann Gly Lyi <400 104 <210105 <211 38 <212 PRT <213Yapawdti<220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü106 C211 38 <212 PRT <213Yapaydüi<220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ Ain Vai iyi Cyi iyi Iio Sor Arq Gin Cyi Iio Gin 10 15 Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met &en Giy Lys Asn Vii Lys Cys Lys Ile Ser Arc Gin Cys Ile Giu 10 15 Ala Giy Mit Arg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy Lyi Asp Vai Lys Cys :ya Ile Se: Arq Gin Cys Ile Giu 10 15 Ala Gly Mit irg ph. Gly iyi Cya Mit Ann Gly iyi <213 Yapay dizi <220 (223› Odl<2 varyanti (400› Giy Vii ?to ne Asp Vii Lys Cys Arg Ile Se:: Pro 6111 Oy: Ile Sin 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Not &:9 Ph. Giy iyi Cyi Not Aon Giy Lyi 25 30 <210 108 <211 38 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› Giy Vai Pro rh: Asp Vai Lys Cys Arq Ile Se: Arc Gin Cyi Lou ati l 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Mg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 (210› 109 <211 38 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti (400› Pro Cys Lys Asp Gin Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 (210› 110 (211› 38 (212› PRT (213› Yapay dizi (220› (223› Odk2 varyanti (400› Giy Vsi Pro ?hr Asp Vsi Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gin Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Aia Giy Lou Arg Ph. Giy Lys Cys Not Ain Giy Lys 25 30 (210› 111 Q11 38 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti (400› Giy Vsi Pro Thr Asp Vsi Lys Cys Arq :1. Sir Arq Gin Cys Lou Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asu Gly Lys 25 30 Q10 112 Q11 38 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 A1: 89: Lou Asp rh: rh: Ala Giu Asn Gin Ala Lya Aan Giu His Lou 1 5 10 15 Gin Lys Giu Ain Giu Arg Lou Lou Arg Asp Trp Asn Asp Vai Gin Giy 25 30 Ari; Phe Giu Lys Giy Sa: <21Ü 113 <211 30 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Linker <400113 Aia Sir Giu Lys Asn Lys Arg Sir Thr Pro Ty: Iio Giu Arg Ala Glu 1 5 10 15 Lys Asn Lys Ar; Se: ?hr Pro Ty: Ile Giu Arq Ala Giy Sa: 25 30 410 114 <211 43 412› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Linker <400114 Aia Sor Giu Lys Ann Lys Arg Sir Thr Pro Tyr :lo Giu Arq Aia Giu 1 5 10 15 Lys Aan Lys Ari; Ser rh: Pro Ty: Ile Giu Art; Ala Glu Lyi Asn :by: 25 30 Arg Sir Thr Pro Ty:: IJ.. Giu Arg Ala Gly S.: Q10 115 Q11 24 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Giy Ser (210› 1 16 (211› 44 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Linker <400116 1 5 10 15 25 30 Ala Pro Ala Pro Aia Pro Aia Pro Aia Pro Giy s.: <21Ü 117 Q11 26 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Linker <400117 Aia Sor Ala Giu Aia Aia Aia Lys Giu Ala Aia Ala Lya Giu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Giu Ala Ala Ala Lys Ala. Giy Sor (210› 113 <211 46 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Linker <400 118 25 30 Lys Giu Ala Ala. Ala. Lys Giu Ala. Ala. Ala. Lyi Ala. Giy Sor 40 45 <210 119 <211 22 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Linker (400› 119 1 5 10 15 <210 120 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Linker <400 120 1 5 10 15 25 30 <210 121 411 62 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Linker <400 121 25 30 40 45 50 55 GO <21Ü 122 <211 82 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Linker <400122 1 5 10 15 25 30 40 45 65 70 75 30 <21Ü 123 <2114 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terrriinal peptit uzantisi <4OU <210 125 <211 4 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ Q10 126 <211 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 <210 127 <211› 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü128 (211› 4 <212 PRT Pro :by: Pro Sin Ala His Ana' Pro <210 129 <211 4 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 Q10130 fln Pro iI'hr His Q114 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <400 <21Ü131 <2114 !img Giu Gin ?hr <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210132 <2114 412› PRT ::0 Pro Lya ::o <213› Yapay dizi <220 (223› Cvterrninal peptit uzantisi <400 1öö <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210› 134 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 135 Ala Pro His Lyi <211 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 Q10136 <2114 Arc Thr Giu His (212› PRT 1 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <21 3› Yapay ciizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 Q10 138 1' (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 (210›139 Pro Ala Pro Ala <211 4 1 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 O-terminal peptit uzantisi <400 Q10140 . <2114 Sir HiI Arq Pro (212› PRT 1 (213› Yapay dizi <220› <223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 141 Q114 Q12› PRT Ser His Arg Pro Q13 Yapay dizi <220 1 <21Ü 142 (211› 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 143 <211 4 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210144 !In Arg Pro Ala <2114 <212 PRT <213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü145 <2114 :ya Ala His Pro <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OU› 81:: Thr Thr Gin 146 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210› 147 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü143 Thr Gin Ala Pro <211 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 Q1Ü149 . <2114 Arg Lys Pro 3.18 (212› PRT 1 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 Q10150 <211 4 (210› 151 (211› 4 <212 PRT Q13› Yapay dizi <220› <223› C-terrninal peptit uzantisi <400 (210›152 ::o Arg Pro Thr <2114 <212 PRT <213 Yapay dizi <220› 423› C-terrriinal peptit uzantisi <400› <21Ü153 1. s Gin Thr Ala. Q114 iY <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223› C-terrninal peptit uzantisi <400› Q10 154 <2114 <212 PRT îro His ?hr Pro <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400› (210› 155 Q11› 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 His Ala. Lyi Pro (210› 156 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 <210157 !hr :uç :uç Pro <211 4 1 412› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <210158 (2194 Pro Thr ?hr Pro Q12 PRT 1 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 Arg Gin His Ala. Yapay ciizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 159 Q10 160 (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4U0 160 <210› 161 <211 4 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 161 Q10 162 <211 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220› <223› C-terminal peptit uzantisi <400 162 <210 183 Q11 4 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 Pro IIt'hi': Arc Pro <210 164 <211 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 165 <211 4 Q12 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 <210 166 (211› 4 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ (210› 167 <211 4 Q12 PRT <213› Yapay dizi <220 <223 Cvterrninal peptit uzantisi <400 Ari; Pro Asp Ala 1811 Hi' Arg Pro 1öö <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210169 1' <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü170 Pro Sor Arq Pro <211 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 Q10 171 <211 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Pro 8111 His 6111 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 Q10172 <211 4 810 rh: Lya Pro (210› 173 <211 4 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Cvterrninal peptit uzantisi <400 <210› 174 Ara lay: Ly: Pro <211› 4 1 m2› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210175 <211›4 His Asu Ari; Pro Q12 PRT 1 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 Q10176 Q114 Q12 PRT Pro Glu Lya Pro Q13 Yapay dizi <220 1 <210 177 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 178 (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 179 <211 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 180 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ Arg Ala Giri Thr Pro Ala Ala 'rhr Giu Pro Ari; Pro <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 <210 182 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ (210› 183 (211› 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 184 Q11 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <210 185 <211 4 (212› PRT Ala His Pro 1-11: <210 186 <211 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ (210›187 ::o Asp Lya Pro Q114 412› PRT 413 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <400 <21Ü138 . (211›4 î'hr Pro HI.. Pro <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <400 (210› 189 (211› 4 <212 PRT <213› Yapay dizi <220› Ari; rh: Ari; Pro Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 190 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210 191 <211 4 (212› PRT <213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210 192 <211 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OU <21Ü 193 Q11 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <21 3› Yapay ciizi <220 <223 @terminal peptit uzantisi <400 Q10 195 1 (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 <210›196 Giy His 'I'hr Ala <211 4 1 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 Q10197 <2114 Pro rh: Lys Pro (212› PRT 1 (213› Yapay dizi <220› <223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 198 Q114 Q12› PRT Pro 'rhr ?hr Pro Q13 Yapay dizi <220 1 <210 199 (211› 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 (210› 200 (211› 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ (210› 201 Hit Arg Arg Gin Q11 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <210 202 (2114 His Asu Ala Pro <212 PRT 1' <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ ZUÖ <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210 204 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210› 205 Gin Ala Ala Pro <211 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 Q10 206 (212› PRT 1 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <211 4 <213 Yapay dizi <220 4223› C-terminal peptit uzantisi <400 <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <213 Yapayi dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 <213 Yapay dizi Arg Ari; Arg Pro 119. Bis Arg Hi: <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 (213› Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <400 <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <400 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 215 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrni'nal peptit uzantisi <400 <210› 217 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 218 :L <211 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <210 219 <2114 Ala Pro Hi. Thr 412› PRT 1 <213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <213 Yapay dizi <220 <223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 221 (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 His Thr Arq 'rhr <210 222 1 (211› 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 223 <2114 Asu His Ari; rh: <212 PRT i Q13 Yapay dizi <220 (223› C~terrriina| peptit uzantisi <400 Q10 224 (211›4 (212, PRT Pro Ann Arg ?11: (213› Yapay dizi <220 1 <210 225 (211› 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 rh: Arc; Mg Pro Q10 226 J' (211› 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <40U <210 227 :L (211› 4 <212 PRT 413› Yapay dizi (220› <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210 228 <2114 Thr Asp &li kg 412› PRT 1 <213› Yapay dizi <220 <223 Cvterrninal peptit uzantisi <400 229 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210› 230 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210› 231 Ara Pro Arq Hi: <211 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 Q10 232 <211 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 His Asu Giu 'rhr Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <211 4 (212› PRT Ala- Arg A311. Äia 410› 234 411› 4 412› PRT 413› Yapay dizi 420› 423› C-terminal peptit uzantisi <400 (210› 235 411› 4 412› PRT 413› Yapay dizi 420› 423› C-terminal peptit uzantisi <40U› 410› 236 411› 4 412› PRT 413› Yapay dizi 420› 423› Cvterminal peptit uzantisi <400› 410› 237 411› 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220› <21Ü 238 (211› 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 239 <211 4 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 240 Irc Arg rh: Aia <211 4 <212› PRT <213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 241 <2114 ?an ?hr Ari; ?hr <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OU› Pro 'rhr Thx' Mi: <213 Yapay dizi <220 423› O-terminal peptit uzantisi <400 <210 243 <211 4 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ (210, 244 :la His Arq .un <211 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 423› Cvterrninal peptit uzantisi <400 Q10 245 <211 4 1 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OU› <21 O› 246 <2114 (212› PRT îin Arg Gin SC: Sin Mg Ana' Lys (21 0› 247 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Cvterrninal peptit uzantisi <400 A1 Ar AJ. Ii <210248 l a 9 3 y' <2114 <212PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ 410› 249 <211›4 1 9 g G <212 PRT <213› Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 250 <211 4 <212 PRT ?la :by: Ari; Asp Q13 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OU 251 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 <210 252 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210› 253 <211 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 <210 254 Q11 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 Arg Gin 'rhr Arg <213 Yapay dizi <220 <223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <21Ü 256 (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 <210 257 (211› 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 253 <211 4 (212› PRT Q13 Yapay dizi <220 (223› C~termina| peptit uzantisi <4OÜ Q10 259 (211› 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 1-15.: Ari; han An; Mg Ala Lys Ari; Ala rh:: Arg Hit <210 280 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 261 1' (211› 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210 262 Ala :iyi Thr Arg <211 4 1 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› C-terminal peptit uzantisi <4OÜ Aan Ala Ari; Gin <21Ü 263 (211› 4 1 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OIJ› 254 <211 4 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terrninal peptit uzantisi <400 Pro 'rhr Jun Ala <210› 265 1 <211 4 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi <4OÜ <210› 235 Sbt Ärq !hr asp <211 4 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› C-terminal peptit uzantisi <400 Q10 267 <2114 Ala Asp 'rhr Arc (212› PRT 1 <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 (211› 4 (212› PRT Thr 5.!` !Iq Gln (210› 269 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 <210270 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <400 412› PRT <213Yapawdgi<220 <223 Odk2 varyanti Arq Arg Pro ThrGiy vai Pro Ile Aan vii Lya cya iyi Iie ser nrq Gin cys Iie Giu 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Aip Ala Giy Hot Arg Ph. Gly Lyi Cyi MOt Ain Gly Lyi 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Ala sir iyi Pro <210272 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› OdIQ varyanti <400 Giy Vai Pro :1. Ann Vii iyi Cyi iyi :1. Sir Arq Gin Cyi Il. Glu 1 5 10 15 Pro Cyo iyi Asp Ala Giy Mot Arg Pho Giy iyi Cyi mot Ann Giy Lyi 25 30 Cys His Cys ?hr Pro Lys Pro Lys Pro Gin <21Ü 273 <211 42 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Ile &en Vii Lye Cye Lys Ile Ser arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Ara Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 Oya His Cys ?hr Pro Lys Gin Asp Gin ?hr <213 Yapay dizi <4UU Cyi His Oy.<210275 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü276 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Cys His Oya<21Ü 277 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 (210› 278 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 0de varyanti <400 <210279 <21142 Q12 PRT <213Yapaydki<220 Asp Aia Giy Mat Arg ?ho Giy Lys Cys mot Asn Giy Lys <21Ü 280 <21142 <212 PRT <213Yapaydûi<220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21D281 <21142 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Cyi His Oy:<210282 <223 OdIQ varyanti <400 <21Ü 283 <21142 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü284 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› Asp Ala Giy Mut Arg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy Lyi Aip Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi mat Ain Giy Lyi Cyi His Oy:(210› 285 (211› 42 (212› PRT (213› Yapay dizi (220› (223› Odk2 varyanti (400› (210›286 (211› 42 412› PRT (213› Yapay dizi (220› (223› 0de varyanti (400› Giy Va!. Pro (213› Yapay dizi <4UUZÖI Giy Va!. Pro <210288 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü289 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi <220 (223› Odl<2 varyanti (400› <21Ü 291 <21142 <212 PRT <213Yapaydti<220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 292 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› Lyi Ala. Hi: Pro Cyi His Oy:<210293 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 i0 15 Asp Ala Gly Mit Arg Ph. Gly iyi Cyi Mct Ain Giy Lyi 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro Lyi Thr Gin Ala Pro Q10 294 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi 10 15 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lya Cys Met &en Giy Lys 25 30 <400 295 Giy Vai Pro :1. Asn Vsi iyi Cyi iyi Iio Sor Arq Gin Cyi Iio Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Thr Pro Pro 410› 296 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ` Giy Vsi Pro Ile Asn Vsi Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys 25 30 Oy: His Cys Thr Pro Lys Thr Lys Pro Pro <21D 297 <211 42 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vsi Pro Ile Asn Vsi Lys Cys Lys Ile Ser Arq Gln Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lyi Asp Ala. Gly Mit Arq Ph. Gly Lya Cyi Mat Asn Gly Lys 25 30 Oy: His Cys Thr Pro iyi Pro Arg Pro Thr <21Ü 298 423› OdIQ varyanti <400 <21Ü 299 <21142 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 300 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› Asp Ala Giy Mut Arg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy Lyi Aip Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi mot Ain Giy Lyi Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Hii Thr Pro Pro <210301 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti (400› 301 Giy Vol Pro Ile Asu Vol Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Not nin Giy Lyi 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi His Aia iyi Pro <21Ü 302 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vol Pro Ile Asu Voi Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi 25 30 Cya His Cya ?hr Pro Lya Thr Arg Arq Pro <213 Yapay dizi <400 303 <210304 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 305 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 307 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 308 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Asp Ala Giy Met Arc ?he Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Cyi His Oy:(210› 309 (211› 42 (212› PRT (213› Yapay dizi (220› (223› Odk2 varyanti (400› (210› 310 <21142 (212› PRT <213`Yapaydui<220 (223› Odk2 varyanti (400› <210311 (211› 42 (212› PRT Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya <210312 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 Gly Va!. Pro Ile (210› 313 <211 42 <212 PRT <213`Yapaydui<220 <223 OdIQ varyanti <400 Thr Ala Pro Pro<213 Yapay dizi <220 (223› Odl<2 varyanti (400› Giy Vai Pro Iio Ann vai iyi Cyi iyi Iio Sor Arq Gin Cyi Iio Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi irg His Pro Hit <21Ü 315 411› 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Ode varyanti <400 Giy Vai Pro Ile &en Vol &ya Cys iyi Ile Se: Arc Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mit Arg Ph. Giy iyi Cyi Not Ann Giy Lyi 25 30 Oy: His Cys Thr Pro iyi Pro Sir Arq Pro <21Ü 316 (211› 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Giy Vai Pro Ile Aan Vai Lys Cys Lys Ile Ser Arq Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 <211 42 <212 PRT <213`Yapaydui<220 <223 Ode varyanti <400 <21Ü 318 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ <210319 <211 42 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 10 15 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lya Cys Met han Gly Lys 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Not Ann Giy Lv. 25 30 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Arg iyi iyi Pro (210› 320 (211› 42 (212› PRT (213› Yapay dizi (220› (223› Odk2 varyanti (400› (210› 321 (211›42 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti (400› Giy Va!. Pro (213› Yapay dizi 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Not nin Giy Lyi 10 15 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys <400 322 (210› 323 (211› 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› <21Ü 324 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ A1; Giy Mit Arg <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti (400› <210 326 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 327 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Cyi Hi. Oy.(210› 328 (211› 42 (212› PRT (213› Yapay dizi (220› <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ (210› 329 <21142 (212› PRT <213`Yapaydui<220 (223› Odk2 varyanti (400› (213› Yapay dizi Aip Ala Giy M.t Arg Ph. Gly iyi Cyi uct Ain Giy Lyi 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mit Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Ly. 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mit Arg Ph. Giy Lyi Cyi M.t Ain Gly Lyi 25 30 <400 330 (210› 331 (211› 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› <21Ü 332 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi <220 (223› Odl<2 varyanti (400› 333 813! Vai Pro <21Ü 334 <21142 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 335 (211› 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ Cys His Oy:(210› 336 (211› 42 (212› PRT (213› Yapay dizi (220› <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ (210› 337 (211› 42 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 (223› 0de varyanti <400 (210› 338 (211› 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Asp Als Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy :ya 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg :ini Giy Lyi Cys mt mn Gly Ly: 25 30 10 15 Asp Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 <21Ü 339 <211 42 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Üye I-Iis ::ya ?11: <210340 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyariti <400 340 Ann VE 1 lay. Pro :by: Ari; 1311:: <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 342 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 343 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Arc Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Mit Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit Ann Giy Lyi Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Pro Thr Thr Pro <210344 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 Cya His Cya<21Ü 345 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Not nin Giy Lyi 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi <4UU 545 <210347 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <400 <21Ü 348 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 350 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Ode varyanti <400 <21Ü 351 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Arc ?he Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Cyi His Oy:<210352 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 <21Ü 353 <21142 <212 PRT <213`Yapaydui<220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210354 <21142 Q12 PRT <213Yapaydki<220 Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya Ain Arq Pro ProGiy Va!. Pro <21Ü 355 <21142 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21D356 <21142 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ 10 15 Asp Ala Giy Met Are Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 10 15 Asp Ala Giy Mat irg Ph. Giy iyi Cyi Met Aon Giy iyi 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mut Arg Ph. Giy iyi Cyi Mat Ann Giy Lyi 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro Lyi Ala Gin Arg Pro <223 Odk2 varyanti <400 357 <210 358 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 359 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 10 15 Asp Ala Giy Met Arc ?he Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys 25 30 10 15 Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys 25 30 10 15 <210 360 <211 42 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210361 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› OdIQ varyanti <4ÜU <21D 362 <211 42 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 10 15 Asp Ala Gly Mit Ari; Ph. Gly Lyi Cyi Mut Ain Giy :ya 25 30 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Not Ann Giy Lv. 25 30 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Arg Hii iyi Arq <210363 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 Giy Vai Pro Ile Asu Vii Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Lyi 25 30 Cya His Cya ?hr Pro Lya Aan Ala Ala iyi <210 364 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Ile Asu Vii Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi 25 30 Oy: His Cys Thr Pro iyi Aia Pro Hii Thr <213 Yapay dizi <4ÜÜ 365 <210366 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 367 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ A1; Giy Mit irg <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 369 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 370 (211› 42 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 4223› OdIQ varyanti <400 Arc Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arc Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Oya His Cys ?hr Pro &ya Pro iyi Thr Ala <210371 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odk2 varyanti <400 Cya His Cya<21Ü 372 <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Va!. Pro (213› Yapay dizi 10 15 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Lyi 10 15 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys <400 373 Giy Va!. ?:0 ne &en Vii Lys Cys Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arc Cyi Hi. Cyi Thr Pro iyi Thr Asp <210 374 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <400 Giy Vai Pro :1. Ann Val iyi Oy. Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Cys His Cys ?hr Pro Lys His Arg<21Ü 375 Q11 42 <212 PRT 413› Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <4OÜ ne Sex: &:9 Gin Cys Ile Glu 25 30 Cys His Cys Thr Pro iyi Asn Gin Arq Thr <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 376 (210› 377 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 0de varyanti <400 6210› 378 6211› 42 6212› PRT (213› Yapay dizi <220 nin Vai iyi Cys iyi 11. s.: Arq Gin Cyi Il. Giu Als Giy Mat Axg ?he Giy Lys Cys Met Asn Giy &ye Elis Oya ?11: Pro Lys Ari; Pro Ari; His Asu Vai iyi Cys iyi Iio sir Arq Gin Cyi Ile Giu Als Giy Met Arg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy :by: <21Ü 379 <21142 <212 PRT <213Yapaydûi<220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü380 <21142 <212 PRT <213Yapawdmi<220 <223› Odk2 varyanti «mm <210 381 <21142 389 599 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ (210› 382 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 Ode varyanti <400 <210383 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Ode varyanti (400› 383 Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Hii Giu Arq Thr (210› 384 (211› 42 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy vai Pro :1. Ain vai iyi Cys iyi :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Giu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala. Giy Met Mg Phe Gly Lys Cys Met han Giy :by: 25 30 Cya His Cya ?hr Pro Lya Thr Pro ni: Arq <210 385 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 Giy Vai Pro Ile Asu Vii Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi 25 30 Oy: His Cys Thr Pro iyi Arg Arg Thr Ala <213 Yapay dizi <4ÜÜ 386 <210387 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220› e <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ 387 <21Ü 388 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odl<2 varyanti <4ÜÜ A1; Giy Mit irg <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 390 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4OÜ› <21Ü 391 (211› 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Arc ?he Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Mit Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit Ann Giy Lyi Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Oya His Cys ?hr Pro &ya Gin Arg Gin Sa: (210› 392 (211› 42 (212› PRT 413 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy vai Pro :1. Ain vai iyi Cys iyi :1. Sir Arq Gin Cyi Iio Giu 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Lyi 25 30 Cya His Cya ?hr Pro Lya Sin Arc Arq iyi <21Ü 393 411› 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Giy Vai Pro Ile Asu Vii Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gin Cys Ile Giu 1 5 10 15 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi 25 30 Cya His Cya ?hr Pro Lya Ala Arg Ala iyi <213 Yapay dizi <400 394 <210395 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 396 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210 397 A1; Gly Met &:9 Asp Asp Gly Ala<223› Odk2 varyanti <400397 <21Ü 398 <21142 <212 PRT Q13 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü 399 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› Odk2 varyanti <4ÜÜ› 10 15 Asp Ala Giy Mut Arg Ph. Giy iyi Cyi Met Ann Giy Lyi 25 30 10 15 Aip Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi mat Ain Giy Lyi 25 30 10 15 Cys His Oya<210400 <211 42 Q12 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <210401 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 (223› OdIQ varyanti <400 Cya His Cya<21Ü402 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met Asn Giy Lyi 25 30 Oy: His Cys Thr Pro Lys His Arg nin Arq 410› 403 411 42 <212 PRT 413› Yapay dizi 420› 423› OdIQ varyanti <400 Giy Vai Pro Ile Ann Vii iyi Cys Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mot Arg Cyi His Cyi Thr Pro Lyi Arg Ala410› 404 411› 42 412 PRT <213 Yapay dizi 420› 423› (3de varyanti <400 404 Giy Vii Pro Ile Ann Vii iyi Cys Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met Are Oy: His Cyi Thr Pro iyi Gin irg 410› 405 411› 42 412› PRT Cyi His Oy:(210› 406 (211› 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 OdIQ varyanti <400 (210› 407 <211 42 <212 PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Ode varyanti <400 Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mot Ann Giy Lyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mot Ann Giy Lyi Pro Cys Lys Asp Ala Giy Met &:9 Phe Giy Lys Cys Met han Giy :ya 25 30 Cyi His Cyi Thr Pro iyi Ala iyi Thr Arq <210 408 <211 42 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 Giy Vai Pro Ile Ain Vii Lys Cys Lys Ile Ser Mg Gin Cys Ile Git: 1 5 10 15 Pro Cyi iyi Asp Ala Giy Mat Arg Ph. Giy iyi Cyi Mit nin Giy Lyi 25 30 Cya His Cya ?hr Pro :iyi Aan Ala Arq Gin <210 409 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 Giy Va!. Pro Ile Asu Vii Lys Cys Lys Ile Ser Mg 6111 Oy: ne Giu 1 5 10 1.5 Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy mt Arg Ph. Giy Lyi Cyi Not Ann Gly Lyi 25 30 Oy: His Cys Thr Pro iyi Ann Ari; Gin :mg <213 Yapay dizi <400 410 <210411 <21142 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ <21Ü412 <211›42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ÜÜ A1; Giy Mit Arg <213 Yapay dizi <220 (223› Odl<2 varyanti (400› <210 414 <211 42 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <4ûÜ <21Ü 415 <211 42 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 OdIQ varyanti <400 Asp Ala Giy Met Arc ?he Giy Lys Cys Met Asu Giy Lys Asp Ala Giy Met Axg Phe Giy Lys Cys Met Asn Giy Lys <21142 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 423› Odl<2 varyanti <400 <210417 <21142 Q12 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 0de varyanti <400 (210› 413 (211› 575 (212› PRT Q13› Insan <400 418 Asp Ala Giy Met Arg Phe Giy Lyi Cyi Met han Giy Lyi 1.611 A511. <211 499 (212› PRT <213 Insan (400› 419 1311: Giy His Pro Gin Asp Thr Ty:: Asp Pto Giu Ala Asp Bis Giu Cys Oy: (3111 (311.1 (311.1 <210 420 <211 495 <212 PRT 1.3:: 1.61.: 1.61: (31.1: <213 Homo sapiens <400 421 1311: 1.318 01.3( Q1Ü 422 <211 525 (212› PRT Q13› Rattus (400› 422 norvegius 1.61.! 611.: Gly Gly Gly Gly Asp Pro Pro Gln Gly Gly Cys Val S.: Oy: Asp Arg Tyr Glu Pro Lou Pro Pro Ala Leu Pro Ala 40 45 Gin Asp Cys Cys Giy Giu Arq Vai Vai Ile &sn Ile Ser 50 55 60 Pho Giu rh: Gin Lou Lys Thr Lou Cy: Gin Ph. Pro Giu 1'3313 10911 <210423 <211495 <212 PRT <213 Ratlus norvegius <400423 14011 181.1 290 295 305 310 Sor Mit Thr Thr Val Giy Ty): 370 375 305 390 450 455 465 470 <210424 <211575 <212 PRT <213 Pap'io cynocephalus <400424 A811. (3111 61.11 Glu Glu Leu Arg by: Ala Arg Ser Asu Ser ?hr Leu Ser Lys Ser Glu 515 520 525 Ty: Mit vai Iio Giu Giu Giy Giy Met Asu His Sor Ala Ph. Pro Gin 530 535 540 Thr Pro Ph. Lys Thr Giy Asu Sor ?hr Ala Thr Cys Thr Thr Ata Ata Asn Pro Asn Ser Cys Vai Asn Ile Lys Lys Ile Phe Thr Asp Val 565 570 575 <210 425 <211 282 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 Odk2 füzyon proteini (400› 425 Q1U 426 <211 48 <212 PRT 1.31: Q13 Yapay dizi <220 (223› Ode varyanti <220 (221› VARYANTI <222 (4)..<4› (223› Xaa; Ile. Thr, an or Glu olabilir Q21 VARYANTI <222 (5)..(5) Q23 Xaa Asn or Asp olabilir <220 (221› misc_feature <222 (7)"(7) <223 Xaa dogal olarak olusmus aminoasit 0Iabilir<220 (221› VARYANTI 1.61.! (223› Xaa; Glu, Lys, Leu, an, Asp, Val or His olabilir <220 (223› Xaa dogal olarak olusmus aminoasit olabilirQ20 <223 Xea dogal olarak olusmus aminoasit olabilir<400 426 Giy Vai Pro xia Ala Ala Xaa Ala Ala Vai Lyi Cys xaa. ala al: ::10 i 5 :LG 15 S.: Arg Gin Cys xaa Aia Ala xaa Ala Ala Pro Cy: Ly: Asp Ala Giy 25 30 Met Ari; Pha Giy Lys Cys Met Asn Giy Lya Oya :-11: Oya Thr Pro Lya 40 45 <213 Yapay dizi <220 <223 Odk2 varyanti <220 <223 Xaa Ile yada Thr olabilir <220 <223› Xaa Asn ya da Asp olabilir 423› Xaa dogal olarak olusmus aminoasit olabilirQ20 <223 Xaa Lys ya da Arg olabilir 4220› Q21 diger_özellik <222 (13).,(13) (223› Xaa dogal olarak olusmus aminoasit olabilir<220 (223› Xaa Ile ya da Glu olabilirQZÜ› <223 Xaa Lys ya da Glu olabilir (220› (223› Xaa dogal olarak olusmus aminoasit olabilir<220 <223 Xaa dogal olarak olusmus aminoasit olabilir<400 Giy vai pro xia 11:. 11:. xaa Aia Aia vai Ly: Cy: xaa Ala A1; :10 sir Arg Gin Cys Xaa Ala Ala xia Ala Ala Pro Cyi Lyi Asp Ala Giy Met Arg Pha Giy Lys Cys Met Asu Giy Lyi Oya His Oy: '1211: Pro Lys Q10 428 <211 44 <212 PRT <213 Yapay dizi <220 <223 Linker <400 428 25 30 <210 429 <211 114 <212 DNA Q13 Yapay dizi <220 <223› pepüt 261 CDNA <400 429 <210› 430 <211 114 <212 DNA <213› Yapay dizi <220› 423› Peptit p579 cDNA <21Ü 431 <211 4 (212› PRT <213 Yapay dizi <220 Q23 C-terminal peptit uzantisi <400 <210 432 <211 4 <212 PRT <210 433 <211 4 (212› PRT (213› Yapay dizi <220 <223 C-terminal peptit uzantisi TR
TR2018/09377T 2013-01-25 2014-01-24 Kv1.3 antagonistleri ve kullanım yöntemleri. TR201809377T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361756777P 2013-01-25 2013-01-25
US201361757389P 2013-01-28 2013-01-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809377T4 true TR201809377T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=51228060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09377T TR201809377T4 (tr) 2013-01-25 2014-01-24 Kv1.3 antagonistleri ve kullanım yöntemleri.

Country Status (28)

Country Link
US (2) US10179808B2 (tr)
EP (1) EP2948559B1 (tr)
JP (1) JP6469590B2 (tr)
KR (1) KR102268830B1 (tr)
CN (1) CN104937105A (tr)
AU (1) AU2014209227B2 (tr)
BR (1) BR112015017795A2 (tr)
CA (1) CA2898496A1 (tr)
CY (1) CY1120481T1 (tr)
DK (1) DK2948559T3 (tr)
EA (1) EA037308B1 (tr)
ES (1) ES2671434T3 (tr)
HR (1) HRP20181055T1 (tr)
HU (1) HUE039465T2 (tr)
IL (1) IL239927B (tr)
LT (1) LT2948559T (tr)
MX (1) MX365987B (tr)
NZ (1) NZ709913A (tr)
PH (1) PH12015501627B1 (tr)
PL (1) PL2948559T3 (tr)
PT (1) PT2948559T (tr)
RS (1) RS57422B1 (tr)
SG (1) SG11201505508TA (tr)
SI (1) SI2948559T1 (tr)
TR (1) TR201809377T4 (tr)
UA (1) UA117824C2 (tr)
WO (1) WO2014116937A1 (tr)
ZA (1) ZA201506131B (tr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10246496B2 (en) * 2014-08-15 2019-04-02 La Trobe University Potassium channel blockers and use thereof in the treatment of autoimmune diseases
WO2016141266A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 President And Fellows Of Harvard College Compliant adaptive robot grasper
JP7082065B2 (ja) * 2016-05-02 2022-06-07 テトラジェネティクス， インコーポレイテッド 抗Ｋｖ１．３抗体ならびにその産生方法および使用方法
US10336812B2 (en) * 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof
TW201808987A (zh) * 2016-06-08 2018-03-16 健生生物科技公司 Ｇｍ－ｃｓｆ變體及使用方法
CN106589092A (zh) * 2016-12-22 2017-04-26 中国科学技术大学先进技术研究院 一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法
CN106957357B (zh) * 2017-04-01 2021-02-19 合肥科生景肽生物科技有限公司 一种蝎毒素多肽及其合成方法
AU2020351273A1 (en) 2019-09-20 2022-04-07 Zealand Pharma A/S Kv1.3 blockers
CA3208713A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 Henrik Fischer MUNCH Kv1.3 blockers
WO2024083919A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Zealand Pharma A/S Inhibitors

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ATE462004T1 (de) 1997-09-16 2010-04-15 Centocor Inc Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
GB0414272D0 (en) * 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives
CN101072577B (zh) 2004-10-07 2013-12-18 加利福尼亚大学董事会 ShK毒素类似物及其在选择性抑制Kv1.3钾通道中的应用
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
US8043829B2 (en) 2006-10-25 2011-10-25 Amgen Inc. DNA encoding chimeric toxin peptide fusion proteins and vectors and mammalian cells for recombinant expression
US8420779B2 (en) * 2007-05-22 2013-04-16 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
WO2009075773A2 (en) * 2007-12-07 2009-06-18 Goldstein Steven A Identification of toxin ligands
US20110236461A1 (en) * 2008-08-13 2011-09-29 Underhill T Michael Methods for stimulating chondrogenesis utilizing a potassium channel inhibitor
MX347295B (es) * 2009-03-20 2017-04-20 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
US9695228B2 (en) * 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
US20190062383A1 (en) 2019-02-28
KR102268830B1 (ko) 2021-06-24
CN104937105A (zh) 2015-09-23
WO2014116937A1 (en) 2014-07-31
MX365987B (es) 2019-06-20
AU2014209227B2 (en) 2017-11-23
ZA201506131B (en) 2017-06-28
HRP20181055T1 (hr) 2018-09-07
PL2948559T3 (pl) 2018-09-28
EP2948559A1 (en) 2015-12-02
IL239927B (en) 2020-10-29
IL239927A0 (en) 2015-08-31
SG11201505508TA (en) 2015-08-28
RS57422B1 (sr) 2018-09-28
EA037308B1 (ru) 2021-03-10
JP2016505639A (ja) 2016-02-25
PH12015501627A1 (en) 2015-09-21
LT2948559T (lt) 2018-06-25
PT2948559T (pt) 2018-07-24
HUE039465T2 (hu) 2019-01-28
PH12015501627B1 (en) 2015-09-21
EP2948559B1 (en) 2018-05-02
US10179808B2 (en) 2019-01-15
BR112015017795A2 (pt) 2017-11-21
CA2898496A1 (en) 2014-07-31
CY1120481T1 (el) 2019-07-10
NZ709913A (en) 2019-05-31
EA201591380A1 (ru) 2015-12-30
US20140255401A1 (en) 2014-09-11
KR20150108912A (ko) 2015-09-30
SI2948559T1 (en) 2018-08-31
DK2948559T3 (en) 2018-05-28
AU2014209227A1 (en) 2015-07-30
UA117824C2 (uk) 2018-10-10
EP2948559A4 (en) 2016-10-19
JP6469590B2 (ja) 2019-02-13
ES2671434T3 (es) 2018-06-06
MX2015009632A (es) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201809377T4 (tr) Kv1.3 antagonistleri ve kullanım yöntemleri.
US11919931B2 (en) Anti-cancer fusion polypeptide capable of binding both CD137 and glypican-3 (GPC3)
EP3292148B1 (en) Anti-cancer fusion polypeptide
JP7225116B2 (ja) Ｌａｇ－３に対する結合親和性を有するリポカリンムテイン
JP7108535B2 (ja) Ｌａｇ－３に特異的な新規タンパク質
KR20220113491A (ko) 재조합 펩티드-mhc 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도
CN113474367A (zh) 结合cd3和hla-a*02限制性肽的半衰期延长的immtac
CN114945584A (zh) 重组肽-mhc复合物结合蛋白及其生成和用途
KR20220002526A (ko) Cd80 단백질 돌연변이체 및 그 응용
KR20210091220A (ko) 부착된 세포에 직접 신호를 보내지 않는 비-천연 nkg2d 수용체