KR20220113491A - 재조합 펩티드-mhc 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도 - Google Patents

재조합 펩티드-mhc 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220113491A
KR20220113491A KR1020227023763A KR20227023763A KR20220113491A KR 20220113491 A KR20220113491 A KR 20220113491A KR 1020227023763 A KR1020227023763 A KR 1020227023763A KR 20227023763 A KR20227023763 A KR 20227023763A KR 20220113491 A KR20220113491 A KR 20220113491A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
seq
target peptide
binding protein
repeat domain
Prior art date
Application number
KR1020227023763A
Other languages
English (en)
Inventor
빅토르 레빗스키
나탈리아 베네츠
마르셀 발서
Original Assignee
몰리큘라 파트너스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몰리큘라 파트너스 아게 filed Critical 몰리큘라 파트너스 아게
Publication of KR20220113491A publication Critical patent/KR20220113491A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 1개, 2개 또는 그 이상의 설계된 반복 도메인(들), 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인(들)을 포함하는 재조합 결합 단백질, 및 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 그러한 결합 단백질에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 그러한 결합 단백질 또는 반복 도메인을 인코딩하는 핵산, 그러한 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 암, 감염성 질병 및 자가면역 질병을 포함한 질병을 치료하거나 진단하는 방법에서의 그러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

재조합 펩티드-MHC 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 11일자로 출원된 EP19215433.4호; 2019년 12월 11일자로 출원된 EP19215434.2호; 2019년 12월 11일자로 출원된 EP19215435.9호; 2019년 12월 11일자로 출원된 EP19215436.7호; 2020년 3월 4일자로 출원된 EP20161059.9호; 및 2020년 6월 19일자로 출원된 EP20181234.4호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 이들 6개의 특허 출원의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 1개, 2개 또는 그 이상의 설계된 반복 도메인(들), 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인(들)을 포함하는 재조합 결합 단백질, 및 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 그러한 결합 단백질에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 그러한 결합 단백질 또는 반복 도메인을 인코딩하는 핵산, 그러한 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 암, 감염성 질병 및 자가면역 질병을 포함한 질병을 치료하거나 진단하는 방법에서의 그러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자는 세포 내의 비정상 또는 외래 단백질의 감시에서 중요한 역할을 한다. 내인성 단백질로부터 유래되는 펩티드가 MHC 클래스 I 분자의 펩티드-결합 홈(groove) 상에 로딩되고, 이어서 세포 표면 상에 디스플레이된다. 그러한 MHC 클래스 I 복합체는 악성 세포를 포함한 모든 유핵 세포에서 발현된다. 펩티드-MHC(pMHC) 복합체는 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 상의 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. 펩티드-MHC 복합체의 제시는 순환 CTL에 대해 세포내 환경의 스냅샷을 제공한다(문헌[Reeves and James, Immunology 150: 16-24 (2016)]). CTL은 비정상적인 또는 외래 항원, 예를 들어 발암단백질, 또는 세균 단백질 또는 바이러스 단백질을 검출하는 것에 반응하여 활성화되어, 제시 세포의 파괴를 가져온다. CTL은 또한 소정의 자가면역 질병에서 "자가" 항원을 잘못 인식할 때 활성화된다(문헌[Bodis et al., Rheumatol. Ther. 5: 5-20 (2018)]).
종양-특이적 또는 감염성 인자-특이적 펩티드를 제시하는 MHC 클래스 I 복합체는 암 및 감염성 질병의 면역요법을 위한 세포 표면 표적들의 특유의 유망한 클래스를 나타낸다. 이 표적 클래스를 이용하려는 시도에서 각종 접근법이 개발되어 왔으며, 이에는 백신, 입양 세포 요법 및 TCR-유사 항체가 포함된다. 종양-관련 항원 중에서, 암-고환 항원(CTA)은 면역요법에 대한 우수한 후보 표적으로 여겨지는데, 이는, 그들이 정상 체세포 조직에서는 제한된 발현을 특징으로 하고, 종양 조직에서는 재발현을 특징으로 하기 때문이다. 다양한 암 유형에 걸쳐 가장 빈번하게 보고된 CTA 중 하나는 흑색종 관련 항원 A3(MAGE-A3)이다(문헌[J Exp Clin Cancer Res. 2019 Jul 8;38(1):294. doi: 10.1186/s13046-019-1272-2]). 더욱이, 몇몇 CTA는 자발적 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀져 있으며, NY-ESO-1이 가장 면역원성이 높은 것들 중 하나이다(문헌[Thomas et al., front Immunol. 2018; 9: 947]). 감염성 인자-특이적 펩티드 중에서, EBV 핵 항원 1(EBNA-1)이 모든 EBV-관련 악성종양에서 발견되는 유일한 바이러스 단백질이다(문헌[J Gen Virol. 2009 Sep; 90(Pt 9): 2251-2259]). 더욱이, B형 간염 바이러스(HBV) 뉴클레오캡시드 항원의 서열 18 내지 27은 급성 자가-제한적인 HBV 감염을 갖는 HLA-A2-양성 환자의 CTL에 의해 폭넓게 인식되고, 만성 B형 간염을 갖는 환자에서 항바이러스 CTL 반응의 자극을 목적으로 한 펩티드-기반 치료용 백신의 주성분을 나타낸다(문헌[Hepatology. 1997 Oct;26(4):1027-34.c]).
바이러스- 또는 종양-특이적 펩티드-MHC 복합체의 치료적 이용에 대한 한 가지 장애물은 흉선 선택 후의 펩티드-MHC 복합체에 대한 TCR의 본질적으로 낮은 친화도였다. 이러한 낮은 친화도는, 특히 바이러스- 또는 종양-특이적 펩티드-MHC 복합체가 전형적으로 저밀도로 바이러스-감염된 세포 또는 종양 세포의 표면 상에 존재한다는 것을 고려할 때, 제한을 제시한다. 이러한 장애물을 극복하기 위하여, 친화도-향상된 TCR이 개발되어 왔으며, 그러한 친화도-향상된 TCR을 발현하는 조작된 T-세포가 임상 연구에서 시험되어 왔다. 친화도-향상된 TCR은 특이성이 결여되어 있을 수 있으며, 일부 경우에는 친화도-향상된 TCR을 발현하는 조작된 T-세포가 비관련 단백질로부터 유래되는 에피토프가 TCR에 의해 예기치 않게도 인식됨으로 인해 심각한, 때때로 심지어 치명적인 의학적 합병증을 야기한 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Linette et al., Blood 122(6): 863-871 (2013)] 참조). 친화도-향상된 TCR이 또한 가용성 TCR로서 개발되고 있는 중이지만, 가용성 TCR 발현은 어려운 문제이다.
바이러스- 또는 종양-특이적 펩티드를 제시하는 MHC 클래스 I 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 TCR-유사 항체가 보고되어 있다. 이들 중 일부는 하이브리도마 기술을 사용하여 단리되었다. 그러나, 하이브리도마 기술에 의한 pMHC-특이적 TCR-유사 항체의 단리는 수백 개 또는 심지어 수천 개의 클론의 스크리닝에 대한 필요성, 낮은 면역원성, 면역우세로 인한 적은 수의 특유의 클론, 및 미세-특이성(fine-specificity)의 불량한 제어를 포함한 다수의 인자에 의해 방해받아 왔다(예를 들어, 문헌[Porgador et al., Immunity 6: 715-726 (1997)]; 문헌[Bernardeau et al., Eur. J. Immunol. 35(10): 2864-2875 (2005)]; 문헌[Skora et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112(32): 9967-9972 (2015)] 참조). 파지 디스플레이를 사용하여 더 많은 TCR-유사 항체가 단리되어 왔다. 그러나, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 TCR-유사 항체의 친화도는 대체적으로 비교적 낮고 종종 치료 목적에 충분하지 않다(예를 들어, 문헌[Chames et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7969-7974 (2000)] 참조). 충분히 높은 친화도를 갖는 TCR-유사 항체를 생성하기 위하여, 친화도 성숙을 위한 시스템이 개발되어 왔다. 예를 들어, TCR-유사 항체의 친화도 성숙을 위한 그러한 하나의 시스템은 돌연변이생성, 라이브러리 및 효모 디스플레이, 및 구조 결정 및 분자 모델링을 조합한다(문헌[Zhao et al., Leukemia 29(11): 2238-2247 (2015)]). Zhao et al.은 그러한 복합체 및 노동-집약적 친화도 성숙 접근법을 사용하는 경우에만 TCR-유사 항체의 결합 친화도를 약 100배만큼 개선하여 충분한 친화도를 갖는 pMHC-특이적 결합 단백질을 얻을 수 있었다. 종합하면, 지금까지 충분한 친화도를 갖는 질병-관련 펩티드-MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 분자를 개발하는 것은 어려운 문제였으며, 현재의 접근법은 일반적으로 어려운 발현 시스템 및/또는 시간- 및 노동-소모적 절차, 예컨대 다수의 하이브리도마 클론의 스크리닝 또는 친화도 성숙을 수반한다.
따라서, pMHC-특이적 결합 단백질을 생성하는 새로운 방법, 새로운 pMHC-특이적 결합 단백질, 및 pMHC-특이적 결합으로부터 이익을 얻는 암, 자가면역 질병 및 감염성 질병을 포함한 질병의 치료 및 특성규명을 위한 치료적 및 진단적 접근법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본 발명은 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 1개, 2개 또는 그 이상의 설계된 반복 도메인(들), 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인(들)을 포함하는 재조합 결합 단백질, 및 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 그러한 결합 단백질을 제공한다. 추가로, 본 발명은 그러한 결합 단백질 또는 반복 도메인을 인코딩하는 핵산, 그러한 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 인간을 포함한 포유동물에서 질병, 예컨대 암, 자가면역 질병 및 감염성 질병을 치료하거나 진단하는 방법에서의 그러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질을 생성하는 본 발명의 방법은 선택된 표적 pMHC 복합체에 대해 높은 친화도 및/또는 특이성으로 결합하는 결합 단백질을 생성하는 데 놀라울 정도로 효율적이고 효과적이다. 지금까지 충분한 친화도를 갖는 질병-관련 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 분자를 개발하는 것은 어려운 문제였으며, 현재의 접근법은 일반적으로 어려운 발현 시스템 및/또는 시간- 및 노동-소모적 절차, 예컨대 다수의 하이브리도마 클론의 스크리닝 또는 친화도 성숙을 수반한다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 방법은 어려운 발현 시스템을 수반하지도 않고, 상기 언급된 것들과 같은 시간- 및 노동-소모적 절차를 필요로 하지도 않는다. 더욱이, 본 발명의 결합 단백질과 표적 펩티드-MHC 복합체 사이의 결합 상호작용은 예기치 않게도 표적 펩티드 내의 비교적 많은 수의 아미노산 잔기를 수반한다. 표적 펩티드 내의 다수의 상호작용 잔기는 각종 다양한 pMHC 복합체들 내의 표적 펩티드-MHC 복합체와의 고도로 선택적이거나 특이적인 결합 상호작용을 반영하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 결합 단백질의 pMHC-특이적 반복 도메인(들)은 특이적 결합 상호작용에서 복합체 펩티드-MHC 표면에 매우 잘 특이적으로 맞는 결합 표면을 제공할 수 있는 것으로 보인다. 더욱이, 본 발명의 결합 단백질의 pMHC-특이적 반복 도메인(들)은, 설계된 반복 도메인, 및 설계된 반복 도메인을 포함하는 단백질의 개선된 약동학적 특성으로 이어지는, N-말단 캡핑 분자 및/또는 C-말단 캡핑 분자 내에 특정 아미노산 서열 모티프를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법 및 결합 단백질은 2개 이상의 동일한 및/또는 상이한 pMHC-특이적 반복 도메인이 하나의 결합 단백질에서 용이하게 조합되어(예를 들어, 2가, 바이파라토프성(biparatopic) 또는 이중특이성 결합 단백질을 형성함), 결합력(binding avidity), 결합 친화도, 결합 특이성 및/또는 결합 단백질의 효력(potency)을 조정하고 최적화하게 할 수 있다는 이점을 추가로 제공한다. 더욱이, 본 발명의 결합 단백질은 심지어 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질, 예컨대 세포독성 T 세포에서 발현되는 T 세포 수용체 복합체의 일부인 단백질 또는 자연 살해(NK) 세포에서 발현되는 활성화 수용체에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 면역 세포 인게이저(engager) 포맷(예를 들어, T 세포 인게이저 포맷 또는 NK 세포 인게이저 포맷)의 본 발명의 결합 단백질은 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 활성화시키고/시키거나 국부화된 및 표적화된 방식으로 면역 시스템을 인게이징하는 방법에 유리하게 사용될 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 pMHC-특이적 반복 도메인을 결합제에 연결하는 링커의 길이는 예기치 않게도 면역 세포 인게이저 포맷, 예컨대 T 세포 인게이저 포맷에 사용하기 위한 본 발명의 결합 단백질의 효력에 영향을 준다. 더욱이, 본 발명의 방법 및 결합 단백질은, 특히 세포내 단백질을 특이적으로 표적화하게 할 수 있으며, 그럼으로써, 예를 들어 암, 감염성 질병 및 자가면역 질병에 대한 많은 새로운 진단적 및 치료적 기회를 촉진시킬 수 있다.
일 태양에서, 본 발명은 펩티드-MHC(pMHC)-특이적 결합 단백질의 생성 방법을 제공하며, 여기서 상기 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인을 포함하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 설계된 반복 도메인들의 집합체(collection)를 제공하는 단계;
(b) 재조합 표적 펩티드-MHC 복합체를 제공하는 단계; 및
(c) 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 특이적인 결합을 위한 상기 설계된 반복 도메인들의 집합체를 스크리닝하여 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 설계된 반복 도메인을 얻는 단계. 바람직한 실시 형태에서, 상기 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다.
다른 태양에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 설계된 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 제1 설계된 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 반복 도메인은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 질병 또는 장애와 관련된 단백질로부터 유래된다. 예로서, 특정 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 일 태양에서, 상기 제1 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질, 예컨대 NY-ESO-1 또는 MAGE-A3으로부터 유래된다. 바람직한 일 태양에서, NY-ESO-1로부터 유래되는 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, MAGE-A3으로부터 유래되는 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 다른 태양에서, 상기 제1 표적 펩티드는 바이러스성 감염성 인자의 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질, 예컨대 EBNA-1 또는 HBV 코어 항원(HBcAg)으로부터 유래된다. 바람직한 일 태양에서, EBNA-1로부터 유래되는 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, HBcAg로부터 유래되는 표적 펩티드는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 설계된 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 175 내지 217, 및 (2) 서열 번호 175 내지 217 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 156 내지 173의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 156 내지 173의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 156 내지 173의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
추가의 특정 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 111 내지 154, 및 (2) 서열 번호 111 내지 154 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 93 내지 110의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 93 내지 110의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 93 내지 110의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 231 내지 254, 및 (2) 서열 번호 231 내지 254 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래되고, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 220 내지 230 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 220 내지 230의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 220 내지 230의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 220 내지 230의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
추가의 바람직한 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 설계된 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 반복 도메인은 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 276의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 276에 대한 정렬에 의해 결정된다. 서열 번호 276은, 서열 번호 5의 위치 1에서의 G 및 위치 2에서의 S가 누락된 것을 제외하고는, 서열 번호 5와 동일한 N-말단 캡핑 모듈이다. 따라서, 서열 번호 276에서의 위치 8은 서열 번호 5에서의 위치 10에 상응하고, 서열 번호 276에서의 위치 15는 서열 번호 5에서의 위치 17에 상응한다. 다시 말하면, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 위치 10에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 17에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 5의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 5에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭(gap)을 포함하지 않는다. 서열 정렬 생성은 당업계에 잘 알려진 절차이다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 위치 14에서의 아미노산이 R이고/이거나 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 13의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 13에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 (i) 위치 8에서의 아미노산이 Q이고 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈, 및/또는 (ii) 위치 14에서의 아미노산이 R이고 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 바람직하게는, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 276의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 276에 대한 정렬에 의해 결정되고, 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 13의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 13에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(서열 번호 276)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(서열 번호 13)를 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 서열 번호 13의 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(서열 번호 276)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(서열 번호 13)를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 서열 번호 13의 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 설계된 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 질병 또는 장애와 관련된 단백질로부터 유래된다. 예로서, 특정 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 일 태양에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 동일한 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 반복 도메인은 상기 제1 반복 도메인과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 반복 도메인은 상기 제1 반복 도메인과 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 태양에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드의 유래가 되는 상기 단백질과 상이한 단백질로부터 유래된다.
바람직한 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 설계된 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다. 특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
특정 다른 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 175 내지 217, 및 (2) 서열 번호 175 내지 217 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 156 내지 173의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 156 내지 173의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 156 내지 173의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
특정 다른 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 111 내지 154, 및 (2) 서열 번호 111 내지 154 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 93 내지 110의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 93 내지 110의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 93 내지 110의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
특정 다른 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 231 내지 254, 및 (2) 서열 번호 231 내지 254 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래되고, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 220 내지 230 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 220 내지 230의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 220 내지 230의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 220 내지 230의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
추가의 바람직한 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 설계된 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 반복 도메인은 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 276의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 276에 대한 정렬에 의해 결정된다. 다시 말하면, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 위치 10에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 17에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 5의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 5에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다. 서열 정렬 생성은 당업계에 잘 알려진 절차이다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 위치 14에서의 아미노산이 R이고/이거나 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 13의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 13에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 (i) 위치 8에서의 아미노산이 Q이고 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈, 및/또는 (ii) 위치 14에서의 아미노산이 R이고 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 바람직하게는, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 276의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 276에 대한 정렬에 의해 결정되고, 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 13의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 13에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(서열 번호 276)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(서열 번호 13)를 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 서열 번호 13의 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(서열 번호 276)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(서열 번호 13)를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 서열 번호 13의 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공한다.
바람직한 일 태양에서, 상기 반복 도메인의 그의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 반복 도메인의 그의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 대안적으로 또는 추가로 포함한다.
특정 일 태양에서, 본 발명은 면역 세포, 바람직하게는 T-세포 또는 NK 세포, 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 그러한 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질을 제공한다. 일 실시 형태에서, T-세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질이다. 한 예로서, 특정 일 실시 형태에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 그러한 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질을 제공한다. 다른 실시 형태에서, NK 세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 NK 세포의 활성화 수용체이다. NK 세포의 그러한 활성화 수용체의 예에는 CD16(FcγRIIA로도 알려짐), NKG2D, SLAM 패밀리 구성원 및 천연 세포독성 수용체 NKp30, NKp44 및 NKp46이 포함된다.
바람직한 일 태양에서, 본 발명은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 그러한 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 결합제는 설계된 반복 도메인, 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 설계된 반복 도메인을 인코딩하거나 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질 또는 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 면역 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포의 종양-국한된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질 또는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 결합 단백질은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하고, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래된다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 면역 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포의 종양-국한된 활성화 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질 또는 핵산을 제공하며, 상기 결합 단백질은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하고, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래된다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 면역 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포의 감염-국한된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질 또는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 결합 단백질은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하고, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 감염성 인자의 단백질로부터 유래된다.
다른 태양에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 의학적 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 상기 포유동물로부터 획득된 세포 또는 조직 샘플을 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 세포 또는 조직 샘플에 대한 상기 결합 단백질의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
특정 일 태양에서, 상기 의학적 질환은 암, 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병, 또는 자가면역 질병이다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 자가면역 질병이다.
다른 태양에서, 본 발명은 종양을 갖는 환자에서 종양 세포를 파괴하기 위하여 상기 종양 세포를 표적화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 종양 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 종양 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 종양을 갖는 환자에서 종양 세포를 파괴하기 위하여 상기 종양 세포를 표적화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 종양 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 종양 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 바이러스성 감염성 질병을 갖는 환자에서 감염된 세포를 파괴하기 위하여 상기 감염된 세포를 표적화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 감염된 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 바이러스성 감염성 질병을 갖는 환자에서 감염된 세포를 파괴하기 위하여 상기 감염된 세포를 표적화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 감염된 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
도 1의 A 내지 도 1의 C: 비오티닐화 pMHC 복합체(비오틴-pMHC)의 품질 제어 시험. (A) 비오티닐화 NYESOpMHC, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC 복합체의 단리를 위한 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC). 280 nm에서의 자외선(UV) 흡광도를 용리액에서 측정하였다. (B) 스트렙타비딘의 부재 또는 존재 하에서의 농축되고 재접힘된 복합체의 SDS-PAGE 분석. (C) 3-부분 pMHC 복합체의 분석용 크기 배제 크로마토그래피. 280 nm 및 230 nm에서의 UV 흡광도를 용리액에서 측정하였다.
도 2: 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 효율적인 발현 및 정제. NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 고가용성 결합 단백질을 고수준의 순도로 E. 콜라이(E. coli) 배양물로부터 정제하였다. NYESOpMHC-특이적 DARPin® 단백질 #21에 대한 (IMAC 후의) SEC
Figure pct00001
™ 전개 후에 얻어진 용리 분획을 갖는 대표적인 SDS-PAGE 겔이 나타나 있다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 3의 A 내지 도 3의 C: 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 본 발명의 결합 단백질의 특이적이고 높은 친화도 결합. NYESOpMHC(A), NYESOAApMHC(B) 및 EBNApMHC(C)에 대한 DARPin® 단백질 #21 결합에 대한 대표적인 SPR 트레이스가 나타나 있다. DARPin® 단백질 #21은 NYESOpMHC에는 높은 친화도로 결합된 반면, 나머지 2개의 다른 pMHC 복합체에 대해서는 어떠한 결합도 검출되지 않았다. 결합 트레이스에서의 규칙적인 스파이크는 기계 아티팩트이고 무시될 수 있다.
도 4의 A 및 도 4의 B: 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 본 발명의 결합 단백질의 유리한 생물물리학적 특성 및 특이적 결합. (A) DARPin® 단백질 #21에 대한 대표적인 균일 시간 분해 형광(Homogeneous Time Resolved Fluorescence, HTRF) 검정 결과는 NYESOpMHC에 대한 고도로 특이적인 표적 결합을 나타내었다. NYESOAApMHC 또는 EBNApMHC에 대한 DARPin® 단백질 #21의 어떠한 결합도 검출되지 않았다. (B) DARPin® 단백질 #21의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 단일 단분산 피크를 나타내었는데, 이는 개별 DARPin® 단백질 #21 분자의 예상된 질량에 상응하는 위치에서 용리되었다. 응집체 또는 다량체의 어떠한 흔적도 검출되지 않았다.
도 5의 A 내지 도 5의 F: 세포에 대한 대표적인 결합 단백질의 결합. T2 세포를 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱하거나(NY-ESO 펄싱된 세포) 또는 EBNA-1(562 내지 570) 펩티드로 펄싱하거나(EBNA 펄싱된 세포), 또는 어떠한 펩티드도 함유하지 않는 완충액으로 처리하였다(비-펄싱된 세포). (A) NY-ESO 펄싱된 세포, (B) 비-펄싱된 세포, (C) NY-ESO 펄싱된 세포, (D) NY-ESO 펄싱된 세포, 및 (E) 비-펄싱된 세포에 대한 지시된 결합 단백질의 적정 결합 곡선이 나타나 있다. EBNA 펄싱된 세포에 대한 TCE DARPin® 단백질 #21의 적정 결합 곡선이 또한 나타나 있다(F).
도 6의 A 내지 도 6의 C: 표적 세포로서 T2 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. (A) NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포(검정색 막대) 및 비-펄싱된 T2 세포(회색 막대)를 하기의 상이한 TCE DARPin® 단백질(1 pM)의 존재 하에서 이펙터 CD8+ T 세포(BK112)와 인큐베이션하였다: (1) TCE DARPin® 단백질 #23, (2) TCE DARPin® 단백질 #24, (3) TCE DARPin® 단백질 #25, (4) TCE DARPin® 단백질 #26, (5) TCE DARPin® 단백질 #27, (6) TCE DARPin® 단백질 #28, (7) TCE DARPin® 단백질 #29, (8) TCE DARPin® 단백질 #30, (9) TCE DARPin® 단백질 #31, (10) TCE DARPin® 단백질 #32, (11) TCE DARPin® 단백질 #33, (12) TCE DARPin® 단백질 #21, (13) TCE DARPin® 단백질 #20, (14) TCE DARPin® 단백질 #22, 및 (15) TCE DARPin® 단백질 없음. T 세포에서의 세포내 인터페론-γ(IFN-γ)가 FACS에 의해 검출되었다. (B) 및 (C) 유사한 T 세포 활성화 검정에서, TCE DARPin® 단백질 #21(B) 및 TCE DARPin® 단백질 #32(C)를 지시된 바와 같이, 더 넓은 농도 범위(0.01 pM 내지 1 nM)에 걸쳐 적정하였다.
도 7: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. IM9 종양 세포(원 기호) 또는 MCF-7 종양 세포(삼각형 기호)를 상이한 농도의 TCE DARPin® 단백질 #21의 존재 하에서 이펙터 CD8+ T 세포(BK112)와 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 이펙터 CD8+ T 세포(BK112)를 상이한 농도의 TCE DARPin® 단백질 #21의 존재 하에서, 그러나 종양 세포의 부재 하에서 인큐베이션하였다(정사각형 기호). T 세포에서의 세포내 IFN-γ가 FACS에 의해 검출되었다. Ag: 항원(여기서는, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드). 두 종양 세포주 모두는 HLA-A2+이다.
도 8의 A 내지 도 8의 E: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. IM9 종양 세포(원 기호) 또는 MCF-7 종양 세포(삼각형 기호)를 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서 이펙터 세포로서의 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 인큐베이션하였다. 대조군으로서, PBMC를 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서, 그러나 종양 세포의 부재 하에서 인큐베이션하였다(정사각형 기호). CD8+ T 세포에서의 CD25 발현이 FACS에 의해 검출되었다.
도 9의 A 내지 도 9의 E: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. IM9 종양 세포 또는 MCF-7 종양 세포를, 도 8에 대한 것과 같이, 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서 이펙터 세포로서의 공여자의 PBMC와 인큐베이션하였다. 인터페론-γ(IFN-γ)의 수준을 T 세포 활성화의 추가적인 척도로서 세포의 상층액에서 정량화하였다.
도 10의 A 내지 도 10의 E: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. IM9 종양 세포 또는 MCF-7 종양 세포를, 도 8에 대한 것과 같이, 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서 이펙터 세포로서의 공여자의 PBMC와 인큐베이션하였다. 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 수준을 T 세포 활성화의 추가적인 척도로서 세포의 상층액에서 정량화하였다.
도 11의 A 내지 도 11의 E: 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 분석된 표적 펩티드 결합. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 및 이의 일련의 알라닌-돌연변이된 변이체에 대한 지시된 결합 단백질의 기능성 결합을, 표적 세포로서 펄싱된 T2 세포를 그리고 이펙터 세포로서 BK112 T 세포를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다. 알라닌으로 대체된 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 내의 아미노산 잔기 및 위치가 지시되어 있다. 대조군으로서, 비-펄싱된 T2 세포를 사용하였다. 세포내 IFN-γ를 T 세포 활성화의 척도로서 검출하였다.
도 12: 본 발명의 대표적인 결합 단백질에 의해 매개된 이펙터 세포에 의한 표적 pMHC-의존성 표적 세포 사멸을 보여주는 세포독성 검정. 이펙터 세포(말초 혈액 단핵 세포(PBMC)) 및 표적 세포(펄싱된 T2 세포(PT2) 또는 비-펄싱된 T2 세포(NPT2) 중 어느 하나의 세포)를 상이한 농도(0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM)의 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 결합 단백질(TCE DARPin® 단백질 #21 (D))의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 상이한 인큐베이션 시간에서의 아폽토시스 수준(총 녹색 대상 면적)이 나타나 있다.
도 13: 표적 세포로서 T2 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포(검정색 막대) 및 비-펄싱된 T2 세포(회색 막대)를 하기의 상이한 TCE 포맷의 2가 또는 바이파라토프성 결합 단백질(0.1 pM) 또는 대조군의 존재 하에서 이펙터 CD8+ T 세포(BK112)와 인큐베이션하였다: (1) TCE BP DARPin® 단백질 #20/#21, (2) TCE BP DARPin® 단백질 #21/#22, (3) TCE BV DARPin® 단백질 #21/#21, (4) NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인 대신에 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 TCE DARPin® 단백질, 및 (5) 첨가된 TCE DARPin® 단백질이 없음. T 세포에서의 세포내 인터페론-γ(IFN-γ)가 FACS에 의해 검출되었다.
도 14의 A 및 도 14의 B: 표적 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 반복 도메인을 포함하는 대표적인 결합 단백질의 세포에 대한 결합. T2 세포를 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱하거나(펄싱된 세포), 또는 어떠한 펩티드도 함유하지 않는 완충액으로 처리하였다(비-펄싱된 세포). 펄싱된 세포(A) 및 비-펄싱된 세포(B)에 대한 지시된 결합 단백질의 적정 결합 곡선이 나타나 있다.
도 15의 A 및 도 15의 B: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. IM9 종양 세포(원 기호) 또는 MCF-7 종양 세포(삼각형 기호)를, 표적 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 반복 도메인을 포함하는 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서 이펙터 세포로서의 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 인큐베이션하였다. 대조군으로서, PBMC를 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서, 그러나 종양 세포의 부재 하에서 인큐베이션하였다(정사각형 기호). CD8+ T 세포에서의 CD25 발현이 FACS에 의해 검출되었다.
도 16의 A 및 도 16의 B: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. IM9 종양 세포 또는 MCF-7 종양 세포를, 도 15에 대한 것과 같이, 표적 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 반복 도메인을 포함하는 상이한 농도의 지시된 결합 단백질의 존재 하에서 이펙터 세포로서의 공여자의 PBMC와 인큐베이션하였다. IFN-γ(A) 및 TNF-α(B)의 수준을 T 세포 활성화의 추가적인 척도로서 세포의 상층액에서 정량화하였다.
도 17: 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 분석된 표적 펩티드 결합. 표적 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 반복 도메인을 포함하는 지시된 결합 단백질의 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 및 이의 일련의 알라닌-돌연변이된 변이체에 대한 기능성 결합을, 표적 세포로서 펄싱된 T2 세포를 그리고 이펙터 세포로서 BK112 T 세포를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다. 알라닌으로 대체된 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 내의 아미노산 잔기 및 위치가 지시되어 있다. 대조군으로서, 비-펄싱된 T2 세포를 사용하였다. 세포내 IFN-γ를 표적 세포에 대한 결합 단백질의 결합에 따른 세포 활성화의 척도로서 검출하였다.
도 18의 A 내지 도 18의 F: 표적 세포로서 종양 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정. U266B1 종양 세포(원 기호) 또는 Colo205 종양 세포(정사각형 기호)((A) 및 (B)), NY-ESO-1을 발현하도록 형질감염된 MCF-7 종양 세포(원 기호) 또는 형질감염되지 않은 MCF-7 종양 세포(정사각형 기호)((C) 및 (D)), 및 IM9 종양 세포(원 기호) 및 MCF-7 종양 세포(정사각형 기호)((E) 및 (F))를 상이한 농도의 (TCE 포맷의) 본 발명의 지시된 대표적인 결합 단백질의 존재 하에서 이펙터 세포로서의 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 함께 인큐베이션하였다. TCE DARPin® 단백질 #21을 (A), (C) 및 (E)에서 사용하고, TCE DARPin® 단백질 #32를 (B), (D) 및 (F)에서 사용하였다. CD8+ T 세포에서의 CD69 발현이 FACS에 의해 검출되었다. Ag: NYESOpMHC.
도 19의 A 및 도 19의 B: 본 발명의 대표적인 결합 단백질에 의해 매개된 이펙터 세포에 의한 표적 pMHC-의존성 표적 세포 사멸을 보여주는 세포독성 검정. 펄싱된(P T2) 또는 비-펄싱된(NP T2) T2 세포(A) 및 HLA-A2+/ NY-ESO-1+ 종양 세포(IM9, U266B1) 또는 HLA-A2+/ NY-ESO-1- 종양 세포(MCF-7)(B)를 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 결합 단백질(TCE DARPin® 단백질 #21)(1 nM)의 존재 또는 부재 하에서, 표적 세포로서의 이펙터 CD8+ T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 상이한 이펙터 세포 대 표적 세포 비(E:T)를 지시된 바와 같이 사용하였다(30:1, 10:1, 5:1, 및 1:1). 크롬 방출 검정에 의해 얻어진 T2 세포(A) 또는 종양 세포(B)의 특이적 용해의 백분율을 상이한 이펙터 대 표적 비에 대해 플롯팅하였다. Ag: NYESOpMHC.
도 20의 A 및 도 20의 B: 본 발명의 대표적인 결합 단백질에 의해 매개된 이펙터 세포에 의한 표적 pMHC-의존성 표적 세포 사멸을 보여주는 세포독성 검정. 이들 도면은 도 19의 A 및 도 19의 B에 기재된 바와 같은 실험을 보여주지만, 단, 상이한 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 결합 단백질(TCE DARPin® 단백질 #32)을 사용하였다.
도 21의 A 및 도 21의 B: X-스캐닝 돌연변이생성에 의해 분석된 표적 펩티드 결합. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 및 이의 일련의 단일-돌연변이 변이체에 대한 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 결합 단백질((A)에서의 TCE DARPin® 단백질 #21; (B)에서의 TCE DARPin® 단백질 #32)의 기능성 결합을, 표적 세포로서 펄싱된 T2 세포를 그리고 이펙터 세포로서 BK112 T 세포를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다. 표적 펩티드의 각각의 아미노산을 나머지 다른 19개의 하나하나의 모든 표준 아미노산으로 대체하였다. 다른 아미노산으로 대체된 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 내의 아미노산 잔기 및 위치는 표의 좌측에 지시되어 있고, 대체 아미노산은 표의 상단에 지시되어 있다. 세포내 IFN-γ를 표적 세포에 대한 결합 단백질의 결합에 따른 세포 활성화의 척도로서 검출하였다. 각각의 실험을 2개의 독립적인 반복시험물에서 수행하였다. 값을 평균하고, 각각의 위치에 따른 야생형 잔기(어둡게 음영처리된 필드)에 대한 100%에 대해 정규화하였다. 30% 초과의 모든 값 - 이는 T-세포 활성화의 어떠한 손실도 나타내지 않거나 완전한 손실이 아님을 나타냄 - 은 볼드체로 밝게 음영처리된 색으로 표시되어 있다.
도 22 및 도 23: pMHC-특이적 결합 도메인과 CD3-특이적 결합제를 연결하는 링커의 길이에 따른 TCE 포맷의 pMHC-특이적 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화. HLA-A2+/NY-ESO-1+ 종양 세포(IM9)(실선) 또는 HLA-A2+/NY-ESO-1- 종양 세포(MCF-7)(파선)를 상이한 링커 길이를 갖는 TCE DARPin® 단백질 #21(도 22) 또는 상이한 링커 길이를 갖는 TCE DARPin® 단백질 #32(도 23)의 존재 또는 부재 하에서 48시간 동안 PBMC와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후에, CD25 발현을 CD8+ T 세포 상에서 측정하였다. TCE DARPin® 단백질의 존재 하에서 얻어진 결과가 나타나 있다. TCE DARPin® 단백질의 부재 하에서는 어떠한 T 세포 활성화도 관찰되지 않았다. Ag: 항원/NY-ESO-1. 링커 길이: 표준, XXS, XS, S 및 L(실시예 11 참조).
도 24 및 도 25: pMHC-특이적 결합 도메인과 CD3-특이적 결합제를 연결하는 링커의 길이에 따른 TCE 포맷의 pMHC-특이적 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화. HLA-A2+/NY-ESO-1+ 종양 세포(U266B1)(실선) 또는 HLA-A2+/NY-ESO-1- 종양 세포(Colo205)(파선)를 상이한 링커 길이를 갖는 TCE DARPin® 단백질 #21(도 24) 또는 상이한 링커 길이를 갖는 TCE DARPin® 단백질 #32(도 25)의 존재 또는 부재 하에서 48시간 동안 PBMC와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후에, CD25 발현을 CD8+ T 세포 상에서 측정하였다. TCE DARPin® 단백질의 존재 하에서 얻어진 결과가 나타나 있다. TCE DARPin® 단백질의 부재 하에서는 어떠한 T 세포 활성화도 관찰되지 않았다. Ag: 항원/NY-ESO-1. 링커 길이: 표준, XXS, XS, S 및 L(실시예 11 참조).
도 26. (각각이 동일한 폴리펩티드 링커를 통해 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 동일한 설계된 안키린 반복 도메인에 유전자적으로 연결된) 설계된 안키린 반복 도메인들의 변이체의 마우스에서의 약동학적 프로파일. (a) 단백질 #281, 및 변이 단백질 #282 및 #283의 마우스에서의 약동학적 프로파일. (b) 단백질 #284, 및 변이 단백질 #285, #286, 및 #287의 마우스에서의 약동학적 프로파일. (c) 단백질 #288, 및 변이 단백질 #289, #290, 및 #291의 마우스에서의 약동학적 프로파일. (d) 단백질 #292, 및 변이 단백질 #293, #294, 및 #295의 마우스에서의 약동학적 프로파일. 이 실험은 Balb/c 마우스 및 1 mg/㎏의 정맥내 투여를 사용하여 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단백질 #281 내지 #295(서열 번호 281 내지 295를 각각 포함하며, 이때 이들 각각은 N-말단에 His-태그(서열 번호 326)를 가짐; 기호가 도면에 지시되어 있음)를 생성하고, 실시예 17에 기재된 바와 같이 정제하였다. C: [nM] 단위의 농도; t: [hr] 단위의 시간.
본 명세서에 개시되고 예시된 바와 같이, 본 발명은 펩티드-MHC 복합체를 특이적으로 표적화하는 설계된 반복 단백질, 바람직하게는 설계된 안키린 반복 단백질을 제공한다. 설계된 안키린 반복 단백질을 포함한 설계된 반복 단백질 라이브러리(국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호; 문헌[Binz et al., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004]; 문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008])는 높은 친화도로 표적에 결합하는 표적-특이적 설계된 반복 도메인의 선택에 사용될 수 있다. 결과적으로, 그러한 표적-특이적 설계된 반복 도메인은 질병의 치료를 위한 재조합 결합 단백질의 유용한 성분으로서 사용될 수 있다. 설계된 반복 단백질 라이브러리가 복합 에피토프(composite epitope), 예컨대 펩티드-MHC 복합체에 의해 제시된 것에 특이적으로 그리고 높은 친화도로 결합하는 단백질을 확인하는 데 사용될 수 있는지의 여부는 밝혀져 있지 않았다. 충분한 친화도로 질병-관련 펩티드-MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 분자를 생성하는 것은 잘 알려진 바와 같이 어려웠다.
설계된 안키린 반복 단백질은 단일클론 항체의 제한을 극복하는 잠재성을 갖는 결합 분자들의 부류이며, 이에 따라 신규한 치료적 접근법을 가능하게 한다. 그러한 안키린 반복 단백질은 단일의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함할 수 있거나, 동일하거나 상이한 표적 특이성을 갖는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 설계된 안키린 반복 도메인의 조합을 포함할 수 있다(문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008]; 미국 특허 제9,458,211호). 단지 단일의 설계된 안키린 반복 도메인만을 포함하는 안키린 반복 단백질은 높은 친화도 및 특이성으로 주어진 표적 단백질에 결합하도록 선택될 수 있는 작은 단백질(14 kDa)이다. 이들 특성, 및 하나의 단백질 내에 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 설계된 안키린 반복 도메인을 조합하는 것에 대한 가능성은 설계된 안키린 반복 단백질을 이상적인 효능적, 길항적 및/또는 억제성 약물 후보가 되게 한다. 더욱이, 상기 안키린 반복 단백질은 다양한 이펙터 기능을 갖도록 조작될 수 있어서(예를 들어, 세포독성제 또는 반감기 연장제), 완전히 새로운 약물 포맷을 가능하게 할 수 있다. 종합하면, 설계된 안키린 반복 단백질은 기존의 항체 약물을 능가할 잠재성을 갖는 차세대 단백질 치료제의 한 예이다.
DARPin®은 스위스 소재의 Molecular Partners AG가 소유한 상표이다.
일 태양에서, 본 발명은 펩티드-MHC(pMHC)-특이적 결합 단백질의 생성 방법을 제공하며, 여기서 상기 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인을 포함하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 설계된 반복 도메인들의 집합체를 제공하는 단계;
(b) 재조합 표적 펩티드-MHC 복합체를 제공하는 단계; 및
(c) 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 특이적인 결합을 위한 상기 설계된 반복 도메인들의 집합체를 스크리닝하여 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 설계된 반복 도메인을 얻는 단계.
일 실시 형태에서, 상기 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이고, 설계된 반복 도메인들의 상기 집합체는 설계된 안키린 반복 도메인들의 집합체이다.
일 실시 형태에서, 상기 집합체는 고정된 위치들 및 랜덤화된 위치들을 포함하는 설계된 반복 도메인들을 포함하고, 상기 집합체의 설계된 반복 도메인들은 상기 랜덤화된 위치들 중 적어도 하나의 위치에서 서로 상이하다.
일 실시 형태에서, 설계된 반복 단백질들의 상기 집합체는 리보솜 디스플레이에 의해 제공된다.
일 실시 형태에서, 상기 방법은 (i) 제2 재조합 펩티드-MHC 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 제2 펩티드-MHC 복합체의 펩티드는 상기 표적 펩티드와 적어도 1개의 아미노산 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는, 상기 단계; 및 (ii) 상기 제2 재조합 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인을 음성 선택에 의해 상기 집합체로부터 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만, 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다.
일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 2개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 3개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 4개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 5개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 6개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 추가의 또는 대안적인 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다.
단백질들 사이 또는 단백질과 펩티드 사이의 결합 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 결정하는 방법, 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이발생은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명과 관련하여, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 단백질 또는 설계된 반복 도메인과 표적 펩티드-MHC 복합체 사이의 결합 상호작용에 관여하는 표적 펩티드의 아미노산 잔기의 전형적이고 바람직한 결정은 실시예 7에 기재된 바와 같은 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 수행된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 결합 단백질 또는 설계된 반복 도메인과 표적 펩티드-MHC 복합체 사이의 결합 상호작용에 관여하는 표적 펩티드의 상기 아미노산 잔기는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 결정된다. 일 실시 형태에서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 결합 단백질 또는 설계된 반복 도메인과 표적 펩티드-MHC 복합체 사이의 결합 상호작용에 관여하는 표적 펩티드의 상기 아미노산 잔기는 실시예 7에 기재된 바와 같은 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 결정된다.
본 발명과 관련하여, 어구 "표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다" 또는 유사한 어구는 표적 펩티드의 임의의 아미노산 잔기의 알라닌으로의 돌연변이가 실시예 7에 기재된 바와 같은 검정(또는 유사한 검정)에서 야생형 펩티드와 대비하여 적어도 50%만큼 T 세포 활성화의 감소를 가져오는 것을 지칭한다.
본 발명의 발명자들은 놀라울 정도로 많은 수의 펩티드 잔기가 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 결합 단백질과 표적 펩티드 사이의 특이적 상호작용에 중요하다는 것을 알아내었다. 예를 들어, 첨부된 실시예에서, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 결합 단백질과 NY-ESO-1 표적 펩티드 사이의 특이적 상호작용에 중요한 몇몇 펩티드 잔기가 확인되었다(도 11 참조). 본 발명자들은 이러한 발견이 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인에 의해 형성된 결합 표면과, 다른 결합 단백질, 예컨대 항체 및 T 세포 수용체(TCR)에 의해 형성된 결합 표면 사이에 구조적 차이를 반영할 수 있다고 이론화한다. 어떠한 이론에 의해서도 구애되지 않고서, 반복 도메인과 이의 표적 펩티드의 결합에 관여하는 아미노산 잔기의 수가 많을수록, 결합 특이성은 더 높은 것으로 여겨진다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 예컨대 세균성 감염성 인자 또는 바이러스성 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 감염성 인자, 예컨대 바이러스성 감염성 인자의 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 상기 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 MHC 클래스 I은 HLA-A*02이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*02는 HLA-A*0201이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*0201은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 실시 형태에서, 상기 MHC는 HLA-A*02가 아니다. 일 실시 형태에서, 상기 MHC 클래스 I은 HLA-A*01이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*01은 HLA-A*0101이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*0101은 서열 번호 218의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 실시 형태에서, 상기 MHC는 HLA-A*01이 아니다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법들 중 하나에 의해 얻을 수 있는 설계된 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.
다른 태양에서, 본 발명은 제1 설계된 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 제1 반복 도메인은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 설계된 반복 도메인을 포함하며, 상기 제1 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 예컨대 세균성 감염성 인자 또는 바이러스성 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 종양-특이적 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 감염성 인자, 예컨대 바이러스성 감염성 인자의 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 제1 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 MHC 클래스 I은 HLA-A*02이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*02는 HLA-A*0201이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*0201은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 실시 형태에서, 상기 제1 MHC는 HLA-A*02가 아니다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 MHC 클래스 I은 HLA-A*01이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*01은 HLA-A*0101이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*0101은 서열 번호 218의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 실시 형태에서, 상기 제1 MHC는 HLA-A*01이 아니다.
일 실시 형태에서, 상기 제1 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다.
일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 2개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 3개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 4개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 5개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 6개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 추가의 또는 대안적인 실시 형태에서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 설계된 안키린 반복 도메인은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함한다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 37 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72 중 어느 하나에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72 중 어느 하나에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72 중 어느 하나에서 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69 중 어느 하나에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69 중 어느 하나에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69 중 어느 하나에서 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 111 내지 154, 및 (2) 서열 번호 111 내지 154 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 175 내지 217, 및 (2) 서열 번호 175 내지 217 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 231 내지 254, 및 (2) 서열 번호 231 내지 254 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1, 제2, 및 선택적으로 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 각각 독립적으로, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 각각 독립적으로, (1) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42, 54, 55 및 67 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 각각 독립적으로, (1) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69, 및 (2) 서열 번호 37 내지 42 및 67 내지 69 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 54, 및 (2) 서열 번호 54에서 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 55, 및 (2) 서열 번호 55의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37, 및 (2) 서열 번호 37에서 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 38, 및 (2) 서열 번호 38의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 39, 및 (2) 서열 번호 39의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 40, 및 (2) 서열 번호 40에서 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 41, 및 (2) 서열 번호 41의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 42, 및 (2) 서열 번호 42의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 67, 및 (2) 서열 번호 67에서 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 68, 및 (2) 서열 번호 68의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 69, 및 (2) 서열 번호 69의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 70, 및 (2) 서열 번호 70에서 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 71, 및 (2) 서열 번호 71의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 72, 및 (2) 서열 번호 72의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1, 제2, 및 선택적으로 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 각각 독립적으로, (1) 서열 번호 111 내지 154, 및 (2) 서열 번호 111 내지 154 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 제1, 제2, 및 선택적으로 제3 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 각각 독립적으로, (1) 서열 번호 175 내지 217, 및 (2) 서열 번호 175 내지 217 중 어느 하나에서 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 일어나며, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 치환에 의해 영향을 받지 않는다.
바람직한 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 서열 번호 37 내지 60, 62 내지 66 및 68 내지 72의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 랜덤화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15, 또는 서열 번호 61 및 67의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 랜덤화된 위치 3, 4, 6, 13 및 14 이외의 위치에서 일어난다. 바람직한 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 서열 번호 111 내지 122 및 124 내지 154의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 랜덤화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15, 또는 서열 번호 123의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 랜덤화된 위치 3, 4, 6, 15 및 16 이외의 위치에서 일어난다. 바람직한 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 서열 번호 175 내지 217의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 랜덤화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 일어난다. 바람직한 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 서열 번호 231 내지 254의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 랜덤화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 일어난다.
추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 추가로 포함한다.
본 발명에 따르면, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 안키린 반복 도메인의 N-말단 캡핑 모듈은 위치 1에서의 아미노산 G 및/또는 위치 2에서의 아미노산 S를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 아미노산 서열을 갖는다. 위치 1에서의 아미노산 G 및 위치 2에서의 아미노산 S를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 그러한 N-말단 캡핑 모듈의 한 예가 서열 번호 5에 제공되어 있다. 위치 1에서의 아미노산 G 및 위치 2에서의 아미노산 S를 포함하지 않는 아미노산 서열을 갖는 그러한 N-말단 캡핑 모듈의 한 예가 서열 번호 276에 제공되어 있다. 따라서, 서열 번호 5와 서열 번호 276은 서열 번호 5의 위치 1에서의 G 및 위치 2에서의 S가 서열 번호 276에서는 누락되어 있는 것을 제외하고는 동일하다. 따라서, 당업자는 본 발명의 표면 설계를 포함하는 N-말단 캡핑 모듈에 관해 상기 제공된 위치 넘버링이 이들 아미노산 잔기가 존재하는지 아닌지의 여부에 따라 달라질 수 있음을 용이하게 이해한다. 따라서, 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열 - 여기서, 상기 위치 번호는 서열 번호 276을 참조하여 정의됨 - 을 갖는 N-말단 캡핑 모듈은 위치 10에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 17에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열 - 여기서, 상기 위치 번호는 N-말단에서 "GS" 서열을 포함하는 서열 번호 5를 참조하여 정의됨 - 을 갖는 N-말단 캡핑 모듈에 상응한다. 이하에서는, 서열 번호 276이 일반적으로 참조 서열로서 사용될 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 276의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 276에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다. 서열 정렬 생성은 당업계에 잘 알려진 절차이다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 위치 14에서의 아미노산이 R이고/이거나 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하고, 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 13의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 13에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈, 및/또는 (ii) 위치 14에서의 아미노산이 R이고/이거나 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 위치 8에서의 아미노산이 Q이고/이거나 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈, 및 (ii) 위치 14에서의 아미노산이 R이고/이거나 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 위치 8에서의 아미노산이 Q이고 위치 15에서의 아미노산이 L인 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈, 및 (ii) 위치 14에서의 아미노산이 R이고 위치 18에서의 아미노산이 Q인 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 바람직하게는, 상기 N-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 276의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 276에 대한 정렬에 의해 결정되고, 상기 C-말단 캡핑 모듈의 위치들의 위치 번호는 서열 번호 13의 위치 번호를 사용하여 서열 번호 13에 대한 정렬에 의해 결정된다. 바람직하게는, 상기 정렬은 아미노산 갭을 포함하지 않는다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(서열 번호 276)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(서열 번호 13)를 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 서열 번호 13의 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환된다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA(서열 번호 276)를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA(서열 번호 13)를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 서열 번호 13의 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 8개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 7개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 아미노산 서열 DLGKKLLQAARAGQLDEVRELLKAGADVNA를 갖는 N-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 8 및 위치 15 이외의 위치에서 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 선택적으로 교환됨 -, 및 (ii) 아미노산 서열 QDKSGKTPADLAARAGHQDIAEVLQKAA를 갖는 C-말단 캡핑 모듈 - 여기서는 위치 14 및 위치 18 이외의 위치에서 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 선택적으로 교환됨 - 을 포함한다.
본 출원인은 놀랍게도 N-말단 캡핑 모듈에서 상기 언급된 위치(즉, 위치 8 및 위치 15)에서 그리고/또는 C-말단 캡핑 모듈에서 상기 언급된 위치(즉, 위치 14 및 위치 18)에서 상기 언급된 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 안키린 결합 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인의 그리고 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 단백질의 연장된 말단 반감기를 포함한 개선된 약동학적 특성을 가져온다는 것을 알아내었다(실시예 17 및 도 26).
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20, 21, 27, 32 및 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20, 21 및 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20, 21 및 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20, 21 및 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20, 21 및 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20, 21 및 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20, 21 및 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20, 21 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20, 21 및 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20, 21 및 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20, 21 및 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 21의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 21의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 21의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 21의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 21의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 21의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 27의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 27의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 27의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 27의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 27의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 27의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 27의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 27의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 27의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 93 내지 110의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 93 내지 110의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 93 내지 110의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 93 내지 110의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 93 내지 110의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 93 내지 110의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 93 내지 110으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 93 내지 110의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 93 내지 110의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 93 내지 110의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 156 내지 173의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 156 내지 173의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 156 내지 173의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 156 내지 173의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 156 내지 173의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 156 내지 173의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 156 내지 173으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 156 내지 173의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 156 내지 173의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 156 내지 173의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만, 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 5 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 3 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 2 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 2 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 5 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 3 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 5 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 5 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 2 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 2 x 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 21과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 21의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 21의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 21의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 21의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 27과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 27의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 27의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 27의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 27의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 27의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 27의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 32와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 32의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 32의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 32의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 33과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하고, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명과 관련하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에 의한 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 설계된 반복 도메인의 해리 상수(KD)의 전형적이고 바람직한 결정이 실시예 2에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 설계된 반복 도메인의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 결합 특이성은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 PBS 중에서 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 설계된 반복 도메인의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 결합 특이성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 PBS 중에서 결정된다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 설계된 반복 도메인을 추가로 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 예컨대 세균성 감염성 인자 또는 바이러스성 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 종양에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다.
일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다.
일 실시 형태에서, 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만, 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 일 실시 형태에서, 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합한다.
일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 2개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 3개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 4개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 5개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 6개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다. 추가의 또는 대안적인 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 상기 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 제2 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 MHC는 HLA-A*02이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*02는 HLA-A*0201이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*0201은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 실시 형태에서, 상기 제2 MHC는 HLA-A*02가 아니다.
일 실시 형태에서, 상기 제2 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 MHC는 HLA-A*01이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*01은 HLA-A*0101이다. 일 실시 형태에서, 상기 HLA-A*0101은 서열 번호 218의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 실시 형태에서, 상기 제2 MHC는 HLA-A*01이 아니다.
일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 동일한 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, 상기 제2 반복 도메인은 상기 제1 반복 도메인과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 제2 반복 도메인은 상기 제1 반복 도메인과 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시 형태에서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드의 유래가 되는 상기 단백질과 상이한 단백질로부터 유래된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 제2 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 제2 설계된 안키린 반복 도메인은 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 제3 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제3 설계된 반복 도메인을 추가로 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제3 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 제3 설계된 안키린 반복 도메인은 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
본 발명과 관련하여, 본 발명의 재조합 결합 단백질이 제1 및 제2 설계된 반복 도메인을 포함할 때, 그리고 상기 제1 및 상기 제2 반복 도메인이 동일한 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 가질 때, 즉 제2 표적 펩티드가 제1 표적 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가질 때, 그리고 상기 제1 반복 도메인과 상기 제2 반복 도메인이 서열이 동일할 때, 상기 재조합 결합 단백질은 2가이다. 본 발명과 관련하여, 본 발명의 재조합 결합 단백질이 제1 및 제2 설계된 반복 도메인을 포함할 때, 그리고 상기 제1 및 상기 제2 반복 도메인이 동일한 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 가질 때, 즉 제2 표적 펩티드가 제1 표적 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가질 때, 그리고 상기 제1 반복 도메인과 상기 제2 반복 도메인이 서열이 상이할 때, 상기 재조합 결합 단백질은 바이파라토프성이다. 본 발명과 관련하여, 본 발명의 재조합 결합 단백질이 제1 및 제2 설계된 반복 도메인을 포함할 때, 그리고 상기 제1 및 상기 제2 반복 도메인이 상이한 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 가질 때, 즉 제2 표적 펩티드가 제1 표적 펩티드와 비교하여 상이한 아미노산 서열을 가질 때, 상기 재조합 결합 단백질은 이중특이성이다. 상이한 표적 펩티드들은 동일한 단백질로부터 또는 상이한 단백질들로부터 유래될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 동일한 정의가, 제1 및 제2 및 제3 설계된 반복 도메인을 포함하며, 각각의 제1, 제2 및 제3 설계된 반복 도메인은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질에 유사하게 적용된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 1가, 2가, 3가, 다가, 모노파라토프성, 바이파라토프성, 트라이파라토프성, 멀티파라토프성, 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성, 또는 다중특이성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 1가이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 2가이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 3가이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 다가이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 모노파라토프성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 바이파라토프성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 트라이파라토프성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 멀티파라토프성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 단일특이성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 이중특이성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 삼중특이성이다. 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 다중특이성이다. 상기 실시 형태들은 서로 조합가능하다는 것이 이해되어야 한다. 한 예로서, 제1 pMHC 복합체에 대한 특이성을 갖는 2개의 동일한 반복 도메인을 포함하고, 제2, 상이한 pMHC 복합체에 대한 특이성을 갖는 제3 반복 도메인을 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질은 동시에 2가이고 이중특이성일 것이다. 따라서, 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 1가, 2가, 3가 또는 다가, 및 모노파라토프성, 바이파라토프성, 트라이파라토프성 또는 멀티파라토프성, 및/또는 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성, 또는 다중특이성의 임의의 조합이다.
비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 2가 결합 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 반복 도메인의 적어도 2개의 출현을 포함할 수 있다. 그러한 2가 단백질의 예가 서열 번호 16에 의해 제공된다. 추가의 비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 바이파라토프성 결합 단백질은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 반복 도메인 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 반복 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 그것은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 반복 도메인 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 반복 도메인을 포함할 수 있다. 그러한 바이파라토프성 단백질의 예가 서열 번호 17 및 서열 번호 18에 의해 각각 제공된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질이 2개 이상의 안키린 반복 도메인을 포함할 때, 예를 들어 본 발명의 재조합 결합 단백질이 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인을 포함할 때, 상기 2개 이상의 안키린 반복 도메인, 예를 들어 상기 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인은 펩티드 링커를 사용하여 연결될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 1 또는 2의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 2개 이상의 안키린 반복 도메인, 예를 들어 상기 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 또는 2의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커를 사용하여 연결된다. 다른 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 글리신-세린 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 3의 글리신-세린 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 2개 이상의 안키린 반복 도메인, 예를 들어 상기 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 글리신-세린 풍부 펩티드 링커를 사용하여 연결된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질이 3개 이상의 안키린 반복 도메인을 포함할 때, 상기 3개 이상의 안키린 반복 도메인은 상이한 펩티드 링커, 예를 들어 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커 및 세린-글리신 풍부 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 1 내지 3의 펩티드 링커를 사용하여 연결될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 안키린 반복 모듈을 포함한다.
일 실시 형태에서, 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 2개의 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 안키린 반복 모듈을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 2개의 안키린 반복 도메인은 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 2개의 안키린 반복 도메인은 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 제1 안키린 반복 모듈, 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 2개 또는 3개의 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 정확하게 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 2개의 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 3개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 3개의 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 정확하게 3개의 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 상기 3개의 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 펩티드 링커를 사용하여 연결된, 제1 표적 펩티드-MHC 복합체 및 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 각각 갖는 제1 안키린 반복 도메인 및 제2 안키린 반복 도메인으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 서열 번호 16 내지 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 16 내지 18의 각각의 상기 안키린 반복 도메인의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 16 내지 18의 각각의 상기 안키린 반복 도메인의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 2개의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 PBS 중에서 10-7 M 미만, 또는 5 x 10-8 M 미만, 또는 3 x 10-8 M 미만, 또는 2 x 10-8 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만, 또는 2 x 10-9 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만, 또는 3 x 10-10 M 미만, 또는 2 x 10-10 M 미만, 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체(들)에 결합한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 제1 및 상기 제2 표적 펩티드는 독립적으로 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 단일 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하거나, 또는 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 설계된 안키린 반복 도메인의 조합을 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 결합제를 추가로 포함한다.
특정 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는다. 추가의 실시 형태에서, T-세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질이다. 한 예로서, 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 분화 클러스터 3(CD3)에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함한다.
본 발명과 관련하여, 결합제는 항체, 항체 모방체 - 스캐폴드 단백질 또는 반복 단백질을 포함함 -, 설계된 반복 도메인, 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 적합한 결합 분자일 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 항체이다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합제는 설계된 반복 도메인, 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
특정 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 실시 형태에서, T-세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질이다. 한 예로서, 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 추가로 포함한다.
특정 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인, 바람직하게는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 실시 형태에서, T-세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질이다. 한 예로서, 특정 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 결합제는 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인 또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인에 연결되거나, 접합되거나, 융합되거나, 또는 달리 물리적으로 부착된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인 또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인에 공유적으로 연결된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 펩티드 링커를 사용하여 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인 또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인에 공유적으로 연결된다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 1 또는 2의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 서열 번호 1 또는 2의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커를 사용하여 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인 또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인에 공유적으로 연결된다. 다른 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 글리신-세린 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 3의 글리신-세린 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 서열 번호 3의 글리신-세린 풍부 펩티드 링커를 사용하여 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인 또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인에 공유적으로 연결된다.
놀랍게도 그리고 예기치 않게도, 상기 결합제와 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인(또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인) 사이의 링커가 짧을수록 T 세포 인게이저 포맷의 작제물의 잠재성이 더 높다는 것을 본 발명의 발명자들에 의해 알아내었다(실시예 11 참조). 따라서, 추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 펩티드 링커의 아미노산 서열은 38개 미만의 아미노산, 바람직하게는 최대 37개, 더 바람직하게는 최대 24개, 더욱 더 바람직하게는 최대 18개, 더욱 더 바람직하게는 최대 11개, 가장 바람직하게는 최대 6개의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 1 내지 37개, 1 내지 24개, 1 내지 23개, 1 내지 18개, 1 내지 17개, 1 내지 11개, 1 내지 10개, 1 내지 6개, 6 내지 37개, 6 내지 24개, 6 내지 23개, 6 내지 18개, 6 내지 17개, 또는 6 내지 11개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌-풍부 펩티드 링커이다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 18개 미만의 아미노산 길이 및 적어도 1개의 아미노산 길이를 가지며, 즉, 펩티드 링커는 1 내지 17개의 아미노산 길이를 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 링커는 서열 번호 1 및 277 내지 280 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 278에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 더 바람직한 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 279에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직한 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 280에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하고, CD3-특이적 결합제를 추가로 포함하며, 여기서 상기 결합제와 상기 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인(또는 상기 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인) 사이의 링커는 임의의 상기 실시 형태에 기재된 바와 같은 펩티드 링커이다. 바람직하게는, 상기 펩티드 링커는 1 내지 17개의 아미노산 길이를 갖는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커(예컨대, 서열 번호 279 또는 서열 번호 280에 제공된 바와 같은 아미노산을 갖는 펩티드 링커)이다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은, 상기 결합 단백질이 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하고, 상기 결합 단백질이 CD3-특이적 결합제를 추가로 포함하는 경우, T 세포의 감염- 또는 종양-국한된 활성화를 촉진시킬 수 있다. 그러한 경우에, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 종양 세포를 제시하는 표적 펩티드-MHC 복합체 및/또는 감염성 세포를 제시하는 표적 펩티드-MHC 복합체에 대해 T-세포를 국부적으로 활성화시키기 위해 T-세포 인게이저 포맷으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 T-세포 수용체에 의한 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체의 인식을 억제할 수 있고/있거나, 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체의 인식을 억제할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 면역 시스템이 표적 펩티드-MHC 복합체(들)를 인식하는 능력을 억제할 수 있다. 그러한 경우에, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 자가면역 질병의 치료에 사용될 수 있다. T-세포 수용체에 의한 표적 펩티드-MHC 복합체의 인식을 측정하는 것은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 또는 적합한 T-세포 활성화 검정, 예컨대 본 출원의 실시예에 기재된 검정 또는 이의 변형에 의해 수행될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드 태그를 추가로 포함한다. 본 발명과 관련하여, 폴리펩티드 태그는 폴리펩티드/단백질에 부착된 아미노산 서열이며, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출, 또는 표적화에 유용하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 물리화학적 거동을 개선하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 이펙터 기능을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그는 결합 단백질의 다른 부분에 직접 연결되거나 또는 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 폴리펩티드 태그는 모두 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자가 충분히 이용가능하다. 폴리펩티드 태그의 예는 작은 폴리펩티드 서열, 예를 들어 His, HA, myc, FLAG 또는 Strep-태그, 또는 폴리펩티드, 예컨대 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타제)이며, 이는 상기 폴리펩티드/단백질, 또는 표적화(예컨대, 면역글로불린 또는 이의 단편)에 그리고/또는 이펙터 분자로서 사용될 수 있는 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 본 발명과 관련하여, 펩티드 링커는, 예를 들어 2개의 단백질 도메인, 즉 폴리펩티드 태그와 단백질 도메인, 단백질 도메인과 비단백질성 화합물 또는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 단백질 도메인과 생물학적으로 활성인 분자, 단백질 도메인과 T-세포-특이적 안키린 반복 도메인, 또는 2개의 서열 태그를 연결시킬 수 있는 아미노산 서열이다. 펩티드 링커는 당업자에게 알려져 있다. 예시 목록은 국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호의 설명에 제공되어 있다. 이러한 링커의 특정 예는 가변 길이의 글리신-세린-링커 및 프롤린-트레오닌-링커이다. 글리신-세린-링커의 예는 아미노산 서열 GS 및 서열 번호 3의 아미노산 서열이고, 프롤린-트레오닌-링커의 예는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 및 서열 번호 277 내지 280의 아미노산 서열이다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 설계된 반복 도메인 또는 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 설계된 반복 도메인의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 20 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 20, 21, 25, 32 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 20, 21 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 33의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 인코딩하는, 서열 번호 78의 핵산 서열에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 인코딩하는, 서열 번호 79의 핵산 서열에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 인코딩하는, 서열 번호 80의 핵산 서열에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 핵산은 당업자에게 잘 알려져 있다. 실시예에서는, 핵산을 사용하여, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 E. 콜라이에서 생성하였다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질 및/또는 본 발명의 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 알려져 있으며, 하기에서 더 상세히 설명된다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 상기 언급된 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 특히 재조합 결합 단백질을 포함하는 진단 조성물이 제공된다.
약제학적 조성물은 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 바람직하게는 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에 더 구체적으로 기재된 바와 같은 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 및, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다.
당업자에게 알려진 적합한 담체, 부형제 또는 안정제는, 예를 들어 식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 고정유, 에틸 올레에이트, 식염수 중 5% 덱스트로스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충액 및 방부제를 포함한다. 다른 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 조성물을 제공받는 개체에 유해한 항체의 생성을 스스로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 추가의 활성제, 예를 들어 항암제 또는 항혈관생성제 또는 추가의 생물활성 화합물을 포함하는 병용 제형일 수 있다.
생체내(in vivo) 투여에 사용되는 제형은 무균성 또는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 결합 단백질 및 세제(detergent), 예컨대 비이온성 세제, 완충액, 예컨대 인산염 완충액, 및 당, 예컨대 수크로스를 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 조성물은 전술한 바와 같은 재조합 결합 단백질 및 PBS를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 종양-국한된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 반복 도메인을 포함하고, 선택적으로 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 반복 도메인을 포함하고, 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 세포내 종양-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인이다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 바람직한 실시 형태에서, 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질, 예컨대 CD3이다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 도메인 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포의 종양-국한된 활성화 방법에 사용하기 위한 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 감염-국한된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 반복 도메인을 포함하고, 선택적으로 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 반복 도메인을 포함하고, 면역 세포, 바람직하게는 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 감염성 인자의 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 감염은 바이러스성 감염이다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인이다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 면역 세포, 바람직하게는 T-세포, 더욱 더 바람직하게는 CD8+ 세포독성 T-세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 바람직한 실시 형태에서, 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질, 예컨대 CD3이다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 도메인 및/또는, 존재하는 경우, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 독립적으로, 본 명세서의 임의의 태양 및 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포의 감염-국한된 활성화 방법에 사용하기 위한 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
다른 태양에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 의학적 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 pMHC-특이적 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 의학적 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 상기 포유동물로부터 획득된 세포 또는 조직 샘플을 본 발명의 재조합 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 세포 또는 조직 샘플에 대한 상기 결합 단백질의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 조직은 종양 조직이다.
본 발명과 관련하여, "의학적 질환", "질병" 및 "장애"는 상호교환 가능하게 사용되며, 암, 감염성 질병, 및 자가면역 질병을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암, 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병, 또는 자가면역 질병이다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다. 일 실시 형태에서, 그러한 암은 폐 암종, 결직장 암종, 위 암종, 방광 암종, 난소 암종 및 유방 암종을 포함하지만 이로 한정되지 않는 상피 악성종양(원발성 및 전이성), 백혈병, 림프종, 및 골수종을 포함하지만 이로 한정되지 않는 혈액 세포 악성종양, 뼈 및 연조직 육종을 포함하지만 이로 한정되지 않는 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 그러한 암은 지질육종, 신경아세포종, 활막 육종, 흑색종 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 그러한 암은 흑색종, 폐암, 간암, 위암, 피부암, 신경아세포종, 연조직 육종, 방광암, 고환암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이다. 일 실시 형태에서, 그러한 감염성 질병은 B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 야기된 바이러스성 감염이다. 다른 실시 형태에서, 그러한 감염성 질병은 엡스타인-바르 바이러스(EBV)에 의해 야기된 바이러스성 감염이다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 자가면역 질병이다. 일 실시 형태에서, 그러한 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염 및 제I형 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 핵산 또는 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 이러한 목적을 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 핵산 또는 재조합 결합 단백질은 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 투여된다. 투여는 국소 투여, 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 전형적인 투여 경로는 비경구 투여이다. 비경구 투여에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 단위 투여 주사용 형태로 상기 정의된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 것이다. 투여량 및 투여 방식은 치료하고자 하는 개체 및 특정 질병에 따라 달라질 것이다.
또한, 상기 언급된 임의의 약제학적 조성물 또는 재조합 결합 단백질은 장애의 치료를 위해 고려된다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 상기 재조합 결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 정맥내 적용된다. 비경구 적용을 위해, 상기 재조합 결합 단백질 또는 약제학적 조성물은 볼루스(bolus) 주사로서 또는 느린 주입에 의해 치료적 유효량으로 주사될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료를 위한 약제로서의 본 발명의 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 약제의 제조를 위한 본 발명의 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료를 위한 약제의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산은 약제의 활성 성분이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산을 사용한 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환, 바람직하게는 신생물성 질병, 더 바람직하게는 암의 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 치료 목적을 위한 상기 언급된 임의의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질, 및/또는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩티드-MHC-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 27, 서열 번호 32 또는 서열 번호 33의 아미노산 서열을 독립적으로 갖는 하나 이상의 펩티드-MHC-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질, 및/또는 본 발명의 하나 이상의 펩티드-MHC-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 27, 서열 번호 32 또는 서열 번호 33의 아미노산 서열을 독립적으로 갖는 하나 이상의 펩티드-MHC-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및/또는 본 발명의 하나 이상의 펩티드-MHC-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 27, 서열 번호 32 또는 서열 번호 33의 아미노산 서열을 독립적으로 갖는 하나 이상의 펩티드-MHC-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
다른 태양에서, 본 발명은 종양을 갖는 환자에서 종양 세포를 파괴하기 위하여 상기 종양 세포를 표적화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 종양 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 종양 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
종양을 갖는 환자에서 종양 세포를 파괴하기 위하여 상기 종양 세포를 표적화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물이 추가로 제공되며, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 종양 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 종양 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 바이러스성 감염성 질병을 갖는 환자에서 감염된 세포를 파괴하기 위하여 상기 감염된 세포를 표적화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 감염된 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 바이러스성 감염성 질병을 갖는 환자에서 감염된 세포를 파괴하기 위하여 상기 감염된 세포를 표적화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물이 추가로 제공되며, 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 감염된 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 치료 방법에 의해 또는 본 발명의 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물에 의해 치료하려는 의학적 질환은 지질육종, 신경아세포종, 활막 육종, 흑색종 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 또는 종양이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 대한 결합 특이성을 가지며, 여기서 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래된다.
본 발명은 실시예에 기재된 특정 실시 형태로 제한되지 않는다.
본 명세서는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 첨부된 서열 목록에 개시된 다수의 아미노산 서열, 핵산 서열 및 서열 번호를 참조한다.
정의
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "집합체"는 적어도 2개의 상이한 실체 또는 구성원을 포함하는 집단을 지칭한다. 바람직하게는, 그러한 집합체는 적어도 105개, 더 바람직하게는 107개 초과, 그리고 가장 바람직하게는 109개 초과의 상이한 구성원을 포함한다. "집합체"는 마찬가지로 "라이브러리"또는 "복수체(plurality)"로도 지칭될 수 있다.
용어 "핵산 분자"는, 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 어느 하나인 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자일 수 있고, DNA 또는 RNA의 변형된 형태 및 인공 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단리된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 재조합 핵산 분자 또는 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "단백질"은 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하는 것으로, 여기서는 폴리펩티드의 적어도 일부가 단일 폴리펩티드 사슬 내에 그리고/또는 다수의 폴리펩티드 사슬들 사이에 2차, 3차, 및/또는 4차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 갖거나 획득할 수 있다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우에, 개별 폴리펩티드 사슬들은, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 사이의 이황화물 결합에 의해 비공유적으로 또는 공유적으로 연결될 수 있다. 2차 및/또는 3차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 획득할 수 있는 단백질의 일부를 "단백질 도메인"이라 칭한다. 그러한 단백질 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다.
재조합 단백질, 재조합 폴리펩티드 등에 사용되는 바와 같이, "재조합"이라는 용어는 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 생성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, (예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성된) 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 DNA 분자가 세균 발현 플라스미드(예를 들어, pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드 또는 식물 발현 플라스미드 또는 시험관내(in vitro) 발현을 가능하게 하는 DNA 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 그러한 재조합 세균 발현 플라스미드가 적절한 세균(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)) 내로 삽입되는 경우에, 이들 세균은 이 재조합 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)를 생성할 수 있다. 상응하여 생성된 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질로 불린다.
본 발명과 관련하여, 용어 "결합 단백질"은 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은 또한 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
더욱이, 임의의 그러한 결합 단백질은 당업자에게 잘 알려진 추가의 폴리펩티드(예컨대, 폴리펩티드 태그, 펩티드 링커, 결합 특이성을 갖는 다른 단백질성 도메인에 대한 융합, 사이토카인, 호르몬, 또는 길항제), 또는 화학적 변형(예컨대, 폴리에틸렌-글리콜, 독소, 소분자, 항생제 등에 대한 커플링)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 결합 단백질은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 결합 단백질은 종양 세포 및/또는 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함한다. 독성제의 예에는 빈블라스틴, 독소루비신, 토포이소머라제 I 억제제, 칼리케아미신, 듀오카르마이신-하이드록시벤즈아미드-아자인돌(DUBA), 피롤로벤조다이아제핀 이량체(PBD), 및 오리스타틴 및 메이탄신과 같은 미세소관 억제제 패밀리의 유도체, 예를 들어 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF), 약물 메이탄시노이드 1(DM1) 및 약물 메이탄시노이드 4(DM4)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "결합 도메인"은 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 도메인을 의미한다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다.
용어 "표적"은 개별 분자, 예컨대 핵산 분자, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 또는 임의의 다른 천연 발생 분자 - 그러한 개별 분자의 임의의 부분을 포함함 -, 또는 2개 이상의 그러한 분자의 복합체, 또는 전세포(whole cell) 또는 조직 샘플, 또는 임의의 비천연 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 표적은 천연 발생 또는 비천연 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 화학적 변형, 예를 들어 천연 발생 또는 비천연 인산화, 아세틸화, 또는 메틸화를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 본 발명과 관련하여, 펩티드-MHC 복합체 및 펩티드-MHC 제시 세포 및 조직이 pMHC-특이적 결합 단백질의 표적이다. 더욱이, CD3 및 CD3-발현 세포, 예컨대 T-세포가 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질, 예컨대 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 pMHC-특이적 결합 단백질의 표적이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 시스테인의 S-S 가교에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산 사슬들을 포함한다. 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있다.
국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호 및 문헌[Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K.,
Figure pct00002
, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은 반복 단백질 특징 및 반복 도메인 특징, 기법 및 응용에 대한 전반적인 설명을 수록하고 있다. 용어 "반복 단백질"은 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 반복 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 반복 도메인을 포함한다. 더욱이, 상기 반복 단백질은 추가의 비반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및/또는 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 반복 도메인은 결합 도메인일 수 있다.
용어 "반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 반복 모듈들은 구조적 상동성 및 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 또한 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 명확성을 위하여, 캡핑 모듈은 반복 모듈일 수 있다. 그러한 반복 도메인, 반복 모듈, 및 캡핑 모듈, 서열 모티프뿐만 아니라, 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인(문헌[Binz et al., J. Mol. Biol. 332, 489-503, 2003]; 문헌[Binz et al., 2004, 인용된 곳에서 참조(loc. cit.)]; 국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호; WO2012/069655호), 류신-풍부 반복 도메인(국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호), 테트라트라이코펩티드 반복 도메인(문헌[Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003]), 및 아르마딜로 반복 도메인(국제 특허 출원 공개 WO2009/040338호)의 예로부터 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 반복 도메인은 반복 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 상이하고, 모든 반복 아미노산 서열이 개별 도메인(예를 들어, 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있다는 것이 당업자에게 추가로 잘 알려져 있다.
용어 "안키린 반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속 안키린 반복 모듈을 포함하는 반복 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 안키린 반복 모듈들은 구조적 상동성 및 서열 상동성을 갖는다.
설계된 반복 단백질, 설계된 반복 도메인 등에 사용되는 바와 같이, 용어 "설계된"은 그러한 반복 단백질 및 반복 도메인이 각각 인공이고 천연에서 발생하지 않는다는 특성을 지칭한다. 본 발명의 결합 단백질은 설계된 반복 단백질이고, 이들은 적어도 하나의 설계된 반복 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인이다.
용어 "표적 상호작용 잔기"는 표적과의 직접적인 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "프레임워크 잔기" 또는 "프레임워크 위치"는 접힘 토폴로지에 기여하거나, 즉 상기 반복 모듈의 접힘에 기여하거나, 또는 이웃 모듈과의 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러한 기여는 반복 모듈 내의 다른 잔기와의 상호작용, 또는 α-나선 또는 β-시트에서 발견되는 것과 같은 폴리펩티드 골격 입체구조에 대한 영향, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치에의 참여일 수 있다.
그러한 프레임워크 잔기 및 표적 상호작용 잔기는 물리화학적 방법, 예컨대 X선 결정구조해석, NMR 및/또는 CD 분광법에 의해 획득된 구조 데이터의 분석에 의해, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보학 실무자에게 잘 알려진 공지된 및 관련된 구조 정보와의 비교에 의해 확인될 수 있다.
용어 "반복 모듈"은 천연 발생 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래되는, 설계된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열 및 구조 단위를 지칭한다. 반복 도메인 내에 포함된 각각의 반복 모듈은 천연 발생 반복 단백질들의 패밀리 또는 하위패밀리, 바람직하게는 안키린 반복 단백질들의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유래된다. 더욱이, 반복 도메인 내에 포함된 각각의 반복 모듈은, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같은 표적에 대해 선택되고, 동일한 표적 특이성을 갖는 반복 도메인들로부터 획득된 상동성 반복 모듈들로부터 추론되는 "반복 서열 모티프"를 포함할 수 있다.
따라서, 용어 "안키린 반복 모듈"은 천연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래되는 반복 모듈을 지칭한다. 안키린 반복 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있다.
반복 모듈은 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적을 위한 라이브러리에서 랜덤화되지 않았던 아미노산 잔기를 갖는 위치("비-랜덤화된 위치" 또는 "고정된 위치"가 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용됨) 및 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적을 위한 라이브러리에서 랜덤화되었던 아미노산 잔기를 갖는 위치("랜덤화된 위치")를 포함할 수 있다. 비-랜덤화된 위치는 프레임워크 잔기를 포함한다. 랜덤화된 위치는 표적 상호작용 잔기를 포함한다. "랜덤화되었던"은 2개 이상의 아미노산이 반복 모듈의 아미노산 위치에서 허용되었음을 의미하는데, 예를 들어 통상의 20개의 천연 발생 아미노산 중 임의의 것이 허용되었거나, 또는 시스테인 이외의 아미노산, 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린 이외의 아미노산과 같이 20개의 천연 발생 아미노산 중 대부분이 허용되었다. 본 특허 출원의 목적상, 서열 번호 37 내지 60, 62 내지 66, 68 내지 72, 111 내지 122, 124 내지 154 175 내지 217, 및 231 내지 254의 아미노산 잔기 3, 4, 6, 14 및 15, 서열 번호 61 및 67의 아미노산 잔기 3, 4, 6, 13 및 14, 및 서열 번호 123의 아미노산 잔기 3, 4, 6, 15 및 16은 본 발명의 안키린 반복 모듈의 랜덤화된 위치이다.
용어 "반복 서열 모티프"는 하나 이상의 반복 모듈로부터 추론된 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 모듈은 동일한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인으로부터 유래된다. 그러한 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임워크 잔기 위치는 반복 모듈의 프레임워크 잔기의 위치에 상응한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 모듈의 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 반복 서열 모티프는 비-랜덤화된 위치 및 랜덤화된 위치를 포함한다.
용어 "반복 단위"는 하나 이상의 천연 발생 단백질의 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하며, 상기 "반복 단위"는 다수의 카피에서 발견되고, 단백질의 접힘을 결정하는 모든 상기 모티프에 일반적인 규정된 접힘 토폴로지를 나타낸다. 그러한 반복 단위의 예는 류신 풍부 반복 단위, 안키린 반복 단위, 아르마딜로 반복 단위, 테트라트라이코펩티드 반복 단위, HEAT 반복 단위 및 류신 풍부 변이 반복 단위를 포함한다.
용어 "결합 특이성", "표적에 대한 결합 특이성을 갖는다", "표적에 특이적으로 결합하는", "높은 특이성으로 표적에 결합하는", "표적에 대해 특이적인" 또는 "표적 특이성" 등은, 결합 단백질 또는 결합 도메인이 PBS 중에서 E. 콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 비관련 단백질에 결합하는 것보다 낮은 해리 상수(즉, 그것은 더 높은 친화도로 결합함)로 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, PBS 중에서 표적에 대한 해리 상수("KD")는 MBP에 상응하는 해리 상수보다 적어도 102; 더 바람직하게는 적어도 103; 더 바람직하게는 적어도 104; 또는 더 바람직하게는 적어도 105배 더 낮다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기법(예를 들어, SPR 평형 분석) 또는 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry, ITC)와 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 KD 값은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, KD 값의 측정은 표준화된 단백질 용액 및 표준화된 완충액, 예컨대 PBS에 의해 바람직하게 이루어진다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 해리 상수(KD)의 전형적인 그리고 바람직한 결정이 실시예 2에 기재되어 있다.
용어 "약"은 언급된 값 +/- 20%를 의미하며; 예를 들어 "약 50%"는 40 내지 60을 의미할 것이다.
용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 인산염 및 2.7 mM KCl을 함유하고, pH가 7.4인 인산염 완충 수용액을 의미한다.
주요 조직적합성 복합체(MHC)는 면역 시스템이 외래 물질을 인식하는 것을 돕는 세포의 표면 상에서 발견되는 단백질을 코딩하는 유전자들의 군이다. 주요 조직적합성 복합체에 의해 인코딩된 단백질, 또는 그러한 단백질들의 복합체는 "MHC 단백질" 또는 "MHC 분자"로 불린다. MHC 단백질은 모든 더 고차의 척추동물에서 발견된다. 면역 세포 수용체, 예컨대 T-세포 수용체에 펩티드를 제시하는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 당단백질이 가장 주목할 만하다. 인간에서, 주요 조직적합성 복합체는 인간 백혈구 항원(HLA) 시스템으로도 불린다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "MHC"는 주요 조직적합성 복합체, 바람직하게는 포유동물의 주요 조직적합성 복합체, 더욱 더 바람직하게는 인간의 주요 조직적합성 복합체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "HLA"는 인간 백혈구 항원 시스템을 지칭한다. MHC 분자는 펩티드를 디스플레이하고, 이것을 척추동물의 면역 시스템에 제시한다. 용어 "펩티드 항원"과 " MHC 펩티드 항원"은 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, MHC 분자의 펩티드 결합 홈에 결합할 수 있는 MHC 리간드를 지칭한다. 펩티드 항원은 전형적으로 펩티드 결합을 통해 연결된 8 내지 25개의 아미노산을 갖는다. MHC 펩티드 항원은 자가 펩티드 또는 비자가 펩티드 중 어느 하나일 수 있다. 펩티드 항원은 전형적으로 MHC 분자에 의해 면역 시스템에 제시될 수 있다. MHC-클래스 I 분자는 전형적으로 CD8 양성 T-세포에 펩티드 항원을 제시하는 반면, MHC-클래스 II 분자는 전형적으로 CD4 양성 T-세포에 펩티드 항원을 제시한다. 본 발명과 관련하여, 본 발명의 결합 단백질에 의해 특이적으로 결합되는 펩티드 항원은, 펩티드 항원이 MHC 분자에 결합될 때, "표적 펩티드"로도 지칭된다. 따라서, 용어 "펩티드-MHC 복합체", "pMHC 복합체", "펩티드-MHC", 및 "pMHC"는 본 출원에서 상호교환 가능하게 사용되며, MHC 분자에 대한 펩티드 항원의 결합에 의해 형성된 복합체를 지칭한다. 바람직하게는, MHC 분자는 MHC-클래스 I 분자이다. 또한 바람직하게는, 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, 감염성 인자, 예를 들어 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 또는 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드이다. 바람직한 일 실시 형태에서, 종양 세포에서 발현되는 상기 단백질은 종양-특이적 단백질이다.
용어 "종양-특이적 단백질"은, 종양 세포에서 발현되고, 다수의 또는 모든 비종양원성 조직에서는 발현되지 않거나 단지 더 낮은 수준으로만 발현되거나, 또는 종양 조직에 더하여 단지 제한된 수의 비종양원성 조직에서만 발현되는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 종양-특이적 단백질은 암-특이적인 면역 반응을 이끌어내는 능력을 갖는다. 종양-특이적 단백질의 예는 당업자에게 알려져 있으며, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, NY-ESO-1, PRAME, CT83, SSX2 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "바이러스-특이적 단백질"은, 바이러스-감염된 세포에서 바이러스 게놈으로부터 발현되고 감염되지 않은 숙주 세포에서는 발현되지 않는 단백질을 의미한다. 바이러스-특이적 단백질의 예는 당업자에게 알려져 있으며, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2, NSP1, NSP2, NSP4, NSP5, NSP6, E1, E2, HBx, HBsAg, HBcAg 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
자가면역 장애와 관련된 단백질의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 카르복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 인슐린, β-아레스틴, 아쿠아포린-4, 시트룰린화 단백질 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
"표적 펩티드-MHC 복합체"는 펩티드 항원이 표적 펩티드인 펩티드-MHC 복합체를 지칭한다.
더 바람직하게는, 펩티드 항원은 세포내 단백질, 더욱 더 바람직하게는 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질, 또는 종양-특이적 단백질로부터 유래된다.
가장 바람직하게는, 펩티드 항원은 NY-ESO-1로부터 유래된다. NY-ESO-1 또는 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1은 다수의 암 유형에서 재발현을 갖는 잘 알려진 암-고환 항원(CTA)이다(국제 특허 출원 공개 WO 98/14464호; 문헌[Chen Y T et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94: 1914-18]; 문헌[Scanlan et al., 2004, Cancer Immunity, 4, 1]). 그의 제한된 발현 패턴과 함께, 자발성 체액성 및 세포성 면역 반응을 이끌어내는 그의 능력은 그것을 암 면역요법에 대한 우수한 후보 표적이 되게 하였다(문헌[Thomas R et al., front Immunol. 2018; 9: 947]). 구체적으로는, NY-ESO-1은, 예를 들어 지질육종, 신경아세포종, 활막 육종, 흑색종 및 난소암에서 매우 높은 빈도로 발현된다. NY-ESO-1에 대한 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열은 Genbank 수탁 번호 U87459, 버전 U87459.1에 제공되어 있다. 바람직하게는, NY-ESO-1로부터 유래되는 펩티드 항원은 아미노산 서열 SLLMWITQV(서열 번호 19) 또는 SLLMWITQC(서열 번호 34)를 갖는다.
대안적으로, 펩티드 항원은 MAGE-A3으로부터 유래될 수 있다. MAGE-A3 또는 흑색종-관련 항원 3은 인간에서 MAGEA3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 암/고환 항원 MAGE-A3은 흑색종 항원 유전자(MAGE) 패밀리의 구성원으로서, 이는 고환으로 제한된 발현을 가지며 암 세포에서 비정상적으로 발현된다. MAGE-A3은 흑색종, 유방암, 두경부암, 폐암, 위암, 피부 편평 세포 암종, 결직장암 등을 포함한 다양한 악성종양에서 폭넓게 발현되는 것으로 확인되어 있다. MAGE-A3 및 그의 면역원성의 비교적 제한된 발현은 그것을 면역요법을 위한 이상적인 표적이 되게 하였다(문헌[Int J Med Sci. 2018; 15(14): 1702-1712]). MAGE-A3에 대한 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열은 GenPept 수탁 번호 NP_005353, 버전 NP_005353.1에 제공되어 있다. 바람직하게는, MAGE-A3으로부터 유래되는 펩티드 항원은 아미노산 서열 EVDPIGHLY(서열 번호 155)를 갖는다.
펩티드 항원은 또한 감염성 인자의 단백질, 예를 들어 바이러스성 감염성 인자의 단백질, 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래될 수 있다. 바이러스성 감염성 인자는 엡스타인-바르 바이러스(EBV)일 수 있으며, 여기서 EBV의 상기 단백질은 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질이다. 바이러스성 감염성 인자는 B형 간염 바이러스(HBV)일 수 있으며, 여기서 HBV의 상기 단백질은 바람직하게는 바이러스-특이적 단백질이다.
펩티드 항원은 EBNA-1로부터 유래될 수 있다. EBNA-1 또는 엡스타인-바르 핵 항원 1은 검출된 최초의 엡스타인-바르 바이러스(EBV)였으며, 가장 널리 연구되어 있다. EBNA1은 EBV 감염의 잠복성 모드 및 용해 모드 둘 모두에서 발현되지만, 그것은 주로 잠복기에서 연구되어 왔는데, 잠복기에서 이것은 다수의 중요한 역할을 한다. EBV 잠복기에서의 EBNA1의 중요성은, EBNA1이 증식성 세포에서의 모든 잠복기 형태에서 그리고 모든 EBV-관련 종양에서 발현되는 유일한 바이러스 단백질이라는 사실에 반영된다(문헌[Scientifica (Cairo). 2012; 2012: 438204]). 바람직하게는, EBNA-1로부터 유래되는 펩티드 항원은 아미노산 서열 FMVFLQTHI(서열 번호 92)를 갖는다.
대안적으로, 펩티드 항원은 B형 간염 바이러스 코어 항원(HBcAg)으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, HBcAg로부터 유래되는 펩티드 항원은 HBV 코어 항원의 서열 18 내지 27이며 - 본 명세서에서 "HBVc18" 또는 "c18 펩티드"로 약기됨 -, 아미노산 서열 FLPSDFFPSV(서열 번호 255)를 갖는다.
"종양-특이적 단백질로부터 유래되는 펩티드", "세포내 단백질로부터 유래되는 펩티드", "감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드", "자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드" 등에 사용되는 바와 같이, 용어 "로부터 유래되는 펩티드"는 각각의 단백질의 분자 분획 또는 펩티드 단편을 지칭한다. 그러한 펩티드 단편은 소정의 림프구, 예컨대 T 세포에 의한 인식을 위하여 세포의 표면 상의 MHC 분자와 회합된 상태로 제시되도록, 즉 디스플레이되도록 정상 단백질 또는 병원성 단백질의 분해로부터 생성될 수 있다. 제시된 펩티드는 자가 또는 비자가 중 어느 하나일 수 있으며, 유기체의 면역 시스템이 정상적으로 자가와 비자가를 구별할 수 있으며,이에 따라 유기체의 면역 시스템이 그 자신의 세포를 표적화하는 것을 방지할 수 있다. 대안적으로, 그러한 펩티드 단편은 당업계에 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드는 세포내 단백질로부터 유래된다.
용어 "결합제"는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭하고, 예를 들어 항체, 항체 단편, 압타머, 펩티드(예를 들어, 문헌[Williams et al., J Biol Chem 266:5182-5190 (1991)]), 항체 모방체, 반복 단백질, 예를 들어 설계된 안키린 반복 단백질, 수용체 단백질 및 표적 분자의 임의의 다른 천연 발생 상호작용 파트너를 포함하며, 천연 단백질, 및 비천연 잔기를 포함하고/하거나 천연 잔기를 결여시키기 위하여 변형되거나 유전자 조작된 단백질을 포함할 수 있다.
결합 도메인의 "음성 선택"또는 "탈선택(de-selection)"이라는 용어는 결합 도메인들의 집합체로부터 본 발명의 목적에 적합하지 않거나 덜 적합한 결합 도메인의 선택적 제거를 의미한다. 본 발명과 관련하여, 음성 선택 또는 탈선택은 바람직하게는 설계된 반복 도메인들의 집합체로부터의, 표적 펩티드-MHC 복합체 이외의 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖거나 상이한 pMHC 복합체들의 공통 HLA-A 스캐폴드에 대한 결합 특이성을 갖는 원치 않는 설계된 반복 도메인(들)의 선택적인 제거를 의미한다. 집합체의 원치 않는 구성원, 예컨대 결합 도메인들의 집합체의 원치 않는 결합 도메인을 음성 선택하거나 탈선택하기 위한 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 본 출원의 실시예 1에서 사용된 방법을 들 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드-MHC 제시 세포"는 세포 표면 상에 펩티드-MHC를 발현하거나 디스플레이할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 이는 종양 세포, 감염된 세포, 자가면역 장애와 관련된 세포, 고전적 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식세포, 및 B 세포뿐만 아니라, 외인적으로 투여된 펩티드에 결합된 MHC 분자를 디스플레이하도록 제조된 세포, 예컨대 펩티드-펄싱된 T2 세포를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CD3-발현 세포"는 세포 표면 상에 CD3(분화 클러스터 3)을 발현하는 임의의 세포를 지칭하며, 이에는 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼 세포(CD4+ T 세포)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "T 세포의 종양-국한된 활성화"는 T 세포가 비종양 조직에 비하여 종양 조직에서 우선적으로 활성화됨을 의미한다.
용어 "T 세포의 감염-국한된 활성화"는 T 세포가 감염되지 않은 조직에 비하여 감염된 조직에서 우선적으로 활성화됨을 의미한다.
용어 "의학적 질환"(또는 "장애" 또는 "질병")은 자가면역 장애, 염증성 장애, 망막병증(특히, 증식성 망막병증), 신경퇴행성 장애, 감염성 질병, 대사성 질병, 및 신생물성 질병을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 결합 단백질은 그러한 장애, 특히 자가면역 장애, 염증성 장애, 면역 장애, 염증성 질병(예를 들어, 바이러스성 또는 세균성 감염성 질병) 및 신생물성 질병을 포함하는 군으로부터 선택되는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. "의학적 질환"은 부적절한 세포 증식을 특징으로 하는 것일 수 있다. 의학적 질환은 과증식성 질환일 수 있다. 본 발명은 특히 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 신생물성 질병이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "신생물성 질병"은 급속하게 증식하는 세포 성장 또는 신생물을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 비정상적인 상태 또는 질환을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 악성 신생물성 질병이다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다. 바람직한 다른 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 염증성 질병이다. 바람직한 다른 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 자가면역 질병이다. 용어 "치료적 유효량"은 환자에서 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라, 면역원-결합 능력을 보유하는 항체 분자의 임의의 절편 및 변이체를 의미한다. 그러한 절편 및 변이체는 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 자주 사용된다. 따라서, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자, 항체 절편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 단일쇄 V 영역 절편(scFv), 이중특이성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합 폴리펩티드, 및 비통상적인 항체를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 질환을 지칭하거나 기재하는 데 사용된다. 암은 고형 종양 및 액성 종양뿐만 아니라 원발성 종양 및 전이를 포함한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 고형 종양은 전형적으로 또한 종양 간질을 포함한다. 암의 예에는 원발성 및 전이성 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 골수종, 흑색종 및 백혈병, 및 임의의 다른 상피 및 혈액 세포 악성종양이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 암의 더 특정한 예에는 뇌암, 방광암, 유방암, 난소암, 신장암, 결직장암, 위암, 두경부암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 악성 흑색종, 골육종, 연조직 육종, 암종, 편평 세포 암종, 투명 세포 신장암, 두경부 편평 세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포 암종, 소세포 폐암(SCLC), 삼중 음성 유방암, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL), 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN), 만성 골수원성 백혈병(CML), 소림프구성 림프종(SLL), 악성 중피종, 지질육종, 신경아세포종, 또는 활막 육종이 포함된다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적, 약리학적, 또는 치료적 결과를 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 본 발명과 관련하여 치료적 유효량은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 효과/위험 비로 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하기에 충분한 양의 결합 단백질을 의미한다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 자들은 이미 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 자들도 포함한다.
치료 목적상, 용어 "포유동물"은 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭하며, 이러한 포유동물에는 인간, 가축 및 농장 동물, 비인간 영장류, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다. 본 명세서에서, 용어 "자가면역 질병" 및 "자가면역 장애"는 포유동물의 면역 시스템이 포유동물의 그 자신의 조직에 대해 또는 포유동물에 본질적으로 유해하지 않은 항원에 대해 체액성 또는 세포성 면역 반응을 개시함으로써 그러한 포유동물에서 조직 손상을 일으키는 장애를 지칭하거나 기재하는 데 사용된다. 자가면역 장애의 예는 다수이며, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염 및 제I형 당뇨병을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 자가면역 질병은 또한 급성 사구체신염, 애디슨병, 성인 발병 특발성 부갑상선 기능저하증(AOIH), 전두 탈모증, 근위축성 측삭 경화증, 강직성 척추염, 자가면역 무형성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 베체트병, 셀리악병, 만성 활동성 간염, CREST 증후군, 크론병, 피부근염, 확장 심근병증, 호산구증가증-근육통 증후군, 후천성 수포성 표피박리증(EBA), 거대 세포 관절염, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 혈색소증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 특발성 IgA 신경병증, 인슐린-의존성 진성 당뇨병(IDDM), 소아 류마티스성 관절염, 람버트-이튼 증후군, 선형 IgA 피부병, 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근염, 기면증, 괴사성 혈관염, 신생아 루푸스 증후군(NLE), 신증후군, 유사천포창, 천포창, 원발성 경화성 담관염, 건선, 급속 진행성 사구체신염(RPGN), 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 갑상선염, 및 궤양성 결장염을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "감염성 질병"및 "감염"은, 특히 병리학적 증상을 야기하는, 신체 조직에서의 미생물의 침입 및 증식을 지칭하거나 기재하는 데 사용된다. 감염성 질병의 예에는, 제한 없이, 바이러스성 질병 및 세균성 질병, 예컨대 HIV 감염, 웨스트 나일 바이러스 감염, A형, B형, 및 C형 간염, 천연두, 결핵, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 감염, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염, 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염, SARS, 인플루엔자, 에볼라, 바이러스성 수막염, 헤르페스, 탄저병, 라임병, 및 E. 콜라이 감염이 특히 포함된다.
실시예
하기에 개시되는 출발 물질 및 시약은 당업자에게 알려져 있으며, 구매가능하고/하거나 잘 알려진 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
재료
화학물질은 Sigma-Aldrich(미국 소재)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 Microsynth(스위스 소재)로부터 입수하였다. 달리 언급되지 않는 한, DNA 폴리머라제, 제한 효소 및 완충액은 New England Biolabs(미국 소재) 또는 Fermentas/Thermo Fisher Scientific(미국 소재)으로부터 입수하였다. 유도성 E. 콜라이 발현 균주를 클로닝 및 단백질 생성에 사용하였으며, 이는, 예를 들어 E. 콜라이 XL1-블루(Stratagene, 미국 소재) 또는 BL21(Novagen, 미국 소재)이다.
분자 생물학
달리 언급되지 않는 한, 알려진 프로토콜에 따라 방법을 수행하였다(예를 들어 문헌[Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York] 참조).
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리를 생성하는 방법이, 예를 들어 미국 특허 제7,417,130호; 문헌[Binz et al. 2003, 인용된 곳에서 참조]; 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 기재되어 있다. 그러한 방법에 의해, 랜덤화된 안키린 반복 모듈들 및/또는 랜덤화된 캡핑 모듈들을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리가 구축될 수 있다. 예를 들어, 따라서 그러한 라이브러리는 고정된 N-말단 캡핑 모듈(예를 들어 서열 번호 5, 6 또는 7의 N-말단 캡핑 모듈) 또는 서열 번호 8에 따른 랜덤화된 N-말단 캡핑 모듈, 서열 번호 9, 10 또는 11의 서열 모티프에 따른 하나 이상의 랜덤화된 반복 모듈, 및 고정된 C-말단 캡핑 모듈(예를 들어 서열 번호 12, 13 또는 14의 C-말단 캡핑 모듈) 또는 서열 번호 15에 따른 랜덤화된 C-말단 캡핑 모듈을 기반으로 조립될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 라이브러리는 반복 모듈 또는 캡핑 모듈의 랜덤화된 위치에서 아미노산 C, G, M, N(G 잔기의 앞쪽에) 및 P 중 어느 것도 갖지 않도록 조립된다. 게다가, 서열 번호 9, 10 또는 11의 서열 모티프에 따른 랜덤화된 반복 모듈은 위치 10 및/또는 위치 17에서 추가로 랜덤화될 수 있고; 서열 번호 8의 서열 모티프에 따른 랜덤화된 N-말단 캡핑 모듈은 위치 7 및/또는 위치 9에서 추가로 랜덤화될 수 있고; 서열 번호 15의 서열 모티프에 따른 랜덤화된 C-말단 캡핑 모듈은 위치 10, 11 및/또는 17에서 추가로 랜덤화될 수 있다.
더욱이, 그러한 라이브러리에서 그러한 랜덤화된 모듈은 랜덤화된 아미노산 위치를 갖는 추가의 폴리펩티드 루프 삽입을 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드 루프 삽입의 예는 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 루프 라이브러리, 또는 드 노보(de novo)로 생성된 펩티드 라이브러리이다. 예를 들어, 그러한 루프 삽입은 지침으로서 인간 리보뉴클레아제 L의 N-말단 안키린 반복 도메인의 구조를 사용하여 설계될 수 있다(문헌[Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929-3938, 2004]). 10개의 아미노산이 2개의 안키린 반복체의 경계 부근에 존재하는 베타-턴(beta-turn) 내에 삽입되는 이러한 안키린 반복 도메인과 유사하게, 안키린 반복 단백질 라이브러리는 안키린 반복 도메인의 하나 이상의 베타-턴 내에 삽입된 다양한 길이(예를 들어, 1 내지 20개의 아미노산)의 (고정된 위치 및 랜덤화된 위치를 갖는) 랜덤화된 루프를 함유할 수 있다.
안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 그러한 N-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 RILLAA, RILLKA 또는 RELLKA 모티프(예를 들어, 서열 번호 20에서 위치 21 내지 26에 존재함)를 갖고, 안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 그러한 C-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 KLN, KLA 또는 KAA 모티프(예를 들어 서열 번호 20에서 마지막 3개의 아미노산에 존재함)를 갖는다.
그러한 안키린 반복 단백질 라이브러리의 설계는, 표적과 상호작용하는 안키린 반복 도메인의 알려진 구조에 의해 안내될 수 있다. 단백질 데이터 뱅크(PDB) 고유 수탁 또는 식별 코드(PDB-ID)에 의해 확인되는, 그러한 구조의 예는 1WDY, 3V31, 3V30, 3V2X, 3V2O, 3UXG, 3TWQ-3TWX, 1N11, 1S70 및 2ZGD이다.
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리, 예컨대 N2C 및 N3C 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리의 예가 기재되어 있다(미국 특허 제7,417,130호; 문헌[Binz et al. 2003, 인용된 곳에서 참조]; 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]). N2C 및 N3C에서 숫자는 N-말단 캡핑 모듈과 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 랜덤화된 반복 모듈의 수를 기재한다.
반복 단위 및 모듈 내부의 위치를 정의하는 데 사용된 명명법은 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 기초하되, 안키린 반복 모듈 및 안키린 반복 단위의 경계가 1개의 아미노산 위치에 의해 이동되는 변형을 갖는다. 예를 들어, 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]의 안키린 반복 모듈의 위치 1은 본 발명의 안키린 반복 모듈의 위치 2에 상응하고, 결과적으로 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]의 안키린 반복 모듈의 위치 33은 본 발명의 뒤따르는 안키린 반복 모듈의 위치 1에 상응한다.
모든 DNA 서열은 생거 서열분석에 의해 확인되었다.
실시예 1 : NY-ESO-1 펩티드-MHC 복합체(NYESOpMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
개요
리보솜 디스플레이(문헌[Hanes, J. and
Figure pct00003
, A., PNAS 94, 4937-42, 1997])를 사용하여, NY-ESO-1 펩티드-MHC 복합체(NYESOpMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 안키린 반복 도메인을, 하기에 기재된 바와 같은 구체적인 조건 및 추가의 탈선택 단계를 가지면서 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 의해 기재된 것과 유사한 방식으로 DARPin® 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 NYESOpMHC 및 NYESOAApMHC 표적에 대해 선택된 클론들의 결합 및 특이성은 E. 콜라이 조(crude) 추출물 균일 시간 분해 형광(HTRF)에 의해 평가하였는데, 이는 다수의 NYESOpMHC-특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 20 내지 33의 안키린 반복 도메인은 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 그러한 안키린 반복 도메인들로부터의 개별적인 안키린 반복 모듈들은, 예를 들어 서열 번호 37 내지 72에 제공되어 있다. NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 그러한 안키린 반복 도메인을 인코딩하는 핵산의 예는 서열 번호 78 내지 80에 제공되어 있다.
표적 및 선택 물질로서의 비오티닐화 pMHC 복합체의 생성
HLA-A*0201(서열 번호 73), 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m; 서열 번호 74), 및 펩티드 NY-ESO-1-9V(aa 157 내지 165; SLLMWITQV; 서열 번호 19), NY-ESO-1-9VAA(aa 157 내지 165; SLLAAITQV; 서열 번호 35) 및 EBNA-1(aa 562 내지 570; FMVFLQTHI; 서열 번호 36) 중 하나의 3-부분 복합체(3-tripartite complex)를 확립된 프로토콜(문헌[Garboczi et al, 1992]; 문헌[Celie et al, 2009])에 따라 생성하였다. 링커(GSGGSGGSAGG; 서열 번호 75) 및 비오티닐화를 위한 Avi-태그(GLNDIFEAQKIEWHE; 서열 번호 76; 문헌[Fairhead & Howarth, 2015])를 포함하는 코돈-최적화된 HLA-A*0201(HLA-A*0201avi; 서열 번호 77) 및 야생형 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m)을 봉입체(inclusion body, IB)로서 37℃에서 E. 콜라이 BL21(DE3)에서 발현시키고, IB 정제 후에 50 mM MES, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 8 M 우레아(pH 6.5) 중에 용해시켰다. HLA-A*0201avi 및 hβ2m 분자를 각각의 펩티드들의 존재 하에서 50 mM Tris(pH 8.3), 230 mM L-아르기닌, 3 mM EDTA, 255 μM GSSG; 2.5 mM GSH; 250 μM PMSF 중에서 500 mL 부피당 각각 25, 30 및 15 mg의 최종 농도로 재접힘하였다. 3개의 생성된 pMHC 복합체는 (1) NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드를 포함하는 NYESOpMHC, (2) NY-ESO-1-9VAA(157-165) 펩티드를 포함하는 NYESOAApMHC, 및 (3) EBNA-1(562 내지 570) 펩티드를 포함하는 EBNApMHC였다(표 1 참조).
비오티닐화를 위하여, 샘플을 7.5 mL의 부피로 농축시키고, 완충액을 PD10 컬럼을 사용하여 100 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2(pH 7.5)로 교환하였다. HLA-A*0201avi를 5 mM ATP, 400 μM 비오틴, 200 μM PMSF 및 20 ㎍ BirA 효소를 첨가함으로써 비오티닐화하였다. BirA는 문헌[Shen et al, 2009]에 기재된 절차에 따라 사내에서 생성하였다. 재접힘된 3-부분 비오티닐화 복합체를 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤이 보충된 PBS 중에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 HiLoad 16/600)를 사용하여 단리하였다. 샘플을 약 1 mg/mL로 농축시키고, 액체 질소에 의해 25 및 50 μL의 분취물로 급속-동결시켰다.
[표 1]
Figure pct00004
품질 제어 목적을 위하여, 25 ㎍의 비오티닐화 pMHC 복합체(비오틴-pMHC)를, 100 mM DTT를 첨가하거나 첨가하지 않고서 50 ㎍의 스트렙타비딘(IBA Lifesciences)과 인큐베이션하고, 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎍의 샘플을 분석용 크기 배제 크로마토그래피(GE Superdex 200 10/300 GL) 위로 전개시켰다. 비오티닐화 NYESOpMHC, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC 복합체 모두는 Superdex 200 HiLoad 16/600 컬럼으로부터 약 82 mL의 최대 피크에서 용리되었다(도 1의 A). 크기 배제 후에 얻어진 NYESOpMHC, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC 복합체의 최종 양은 각각 약 3.5, 3.5 및 5 mg이었다. 농축되고 해동된 급속-동결된 재접힘된 복합체의 SDS-PAGE 분석은 효율적인 비오티닐화를 나타내었는데, 그 이유는 HLA-A*0201avi가 스트렙타비딘에 거의 완전히 결합되었기 때문이다(도 1의 B). 분석용 크기 배제 크로마토그래피는 3-부분 pMHC 복합체의 이론적 MW인 약 48 kDa에 가까운 45 kDa의 겉보기 분자량에 상응하는 체류 부피에서 단일 피크들을 보여주었다(도 1의 C).
리보솜 디스플레이에 의한 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택
pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택은, 표적으로서의 NYESOpMHC 복합체, 전술된 바와 같은 안키린 반복 단백질들의 라이브러리, 및 확립된 프로토콜(예를 들어, 문헌[Zahnd, C., Amstutz, P. and
Figure pct00005
, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007] 참조)을 사용하여 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes and
Figure pct00006
, 인용된 곳에서 참조])에 의해 수행하였다. 매 선택 라운드 후마다 역전사(RT)-PCR 사이클의 횟수를 결합제의 풍부화로 인한 수율에 따라 조정하여 지속적으로 감소시켰다. 처음 4회의 라운드의 선택은, 라운드 1부터 라운드 4까지 선택압(selection pressure)을 증가시키기 위해 표적 농도를 감소시키고 세척 엄격성을 증가시키는 것을 사용하는 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였지만(문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]), 통상적이지 않은 탈선택 단계를 포함시켰다.
리보솜 디스플레이 라운드 동안, 탈선택(또는 음성 선택) 단계를 포함시켰는데, 여기서는 3원(ternary) 복합체를 다른 펩티드를 함유하는 상응하는 동종형(isotype) HLA 분자와 함께 사전-인큐베이션하고, 그리고 나서야 비로소 표적 NYESOpMHC 복합체에 옮겨서, 공통 HLA-A 스캐폴드로부터 멀어져서 펩티드-매립된 에피토프를 향하는 안키린 반복 단백질의 직접 결합을 수행하였다. 다시 말하면, 매립된 펩티드에 의해 제공되는 특이적 에피토프에 결합하기보다는 pMHC 복합체의 공통 HLA-A 스캐폴드에 주로 결합하는 안키린 반복 단백질을 탈선택하기 위하여 탈선택(또는 음성 선택)을 수행하였다. 더욱이, 탈선택에 사용되는 매립된 펩티드에 의해 제공되는 에피토프와 교차-반응하는 안키린 반복 단백질을 또한 탈선택하였다. 여기서는, EBNA-1(562 내지 570) 펩티드를 포함하는 EBNApMHC 복합체를 탈선택에 사용하였다.
상세히 설명하면, 탈선택 단계를 위하여, Nunc MaxiSorp 플레이트를 PBS 중 66 nM 뉴트라비딘의 100 μl 용액으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, MaxiSorp 96웰 마이크로플레이트를 웰당 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 300 μl의 PBST-BSA로 블로킹하고, 700 rpm으로 회전시킨 후, 탈선택 단계를 수행하였다. 웰을 비운 후에, PBST-BSA 중 50 nM 비오티닐화 pMHC 탈선택 표적 용액 100 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 700 rpm으로 회전시켰다. 이러한 인큐베이션 단계 동안, 리보솜 디스플레이 프로토콜에 따른 mRNA 시험관내 번역을 별도로 수행하였다. 시험관내 번역 및 3원 복합체(즉, mRNA, 리보솜, 및 번역된 안키린 반복 단백질)의 생성 직후에, pMHC-PBST-BSA 용액을 폐기하고, Nunc MaxiSorp 마이크로플레이트 웰을 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 마지막으로 BSA를 함유하는 Tris-세척 완충액(WBT-BSA)과 함께 인큐베이션하였다. 실제의 탈선택 단계 직전에는, WBT-BSA 용액을 폐기하고, 시험관내 번역 3원 복합체의 150 μl(1회째의 선택 라운드를 위해) 또는 100 μl(선택 라운드 2 내지 4를 위해)의 분취물을, 고정화된 탈선택 pMHC 복합체가 담긴 준비된 Nunc MaxiSorp 웰에 연속적으로 3회 옮기고, 4℃에서 20분 동안 3개의 웰 각각에서 인큐베이션하였다. 탈선택 과정의 종료 시점에서, 각각의 선택 풀의 모든 100 μl의 3원 복합체 분취물을 합하고, 전술된 바와 같이 실제의 표적 pMHC 복합체에 대한 선택에 따른 부피를 취하였다.
선택된 클론은 조 추출물 HTRF에 의해 나타나는 바와 같이 NYESOpMHC 복합체에 특이적으로 결합한다
용액 상태의 NYESOpMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 개별적으로 선택된 안키린 반복 단백질을, 표준 프로토콜을 사용하여 안키린 반복 단백질-발현 에스케리키아 콜라이 세포의 조 추출물을 사용하여 균일 시간 분해 형광(HTRF) 검정에 의해 확인하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 선택된 안키린 반복 단백질 클론을 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 클로닝하고, E. 콜라이 XL1-블루(Stratagene) 내로 형질변환시키고, (1% 글루코스 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는) LB-한천 상에서 플레이팅하고, 이어서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 165 μl의 성장 배지(1% 글루코스 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB)가 담긴 96웰 플레이트 내로 픽킹(picking)하고(각각의 클론을 단일 웰 내로), 800 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 신선한 LB 배지 150 μl에 신선한 96-딥-웰 플레이트 내에서 8.5 μl의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 37℃ 및 850 rpm으로 120분 동안 인큐베이션한 후에, IPTG(0.5 mM 최종 농도)를 사용하여 발현을 유도하고, 6시간 동안 지속하였다. 플레이트의 원심분리에 의해 세포를 수합하고, 상층액을 폐기하고, 펠릿을 -20℃에서 하룻밤 동결시킨 후, 8.5 μl의 B-PERII(Thermo Scientific) 중에 재현탁시키고, 진탕하면서(600 rpm) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 160 μl의 PBS를 첨가하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다(15분 동안 3220 g).
각각의 용해된 클론의 추출물을, 384웰 플레이트의 웰에 20 nM(최종 농도) 비오티닐화 pMHC 복합체, 1:400(최종 농도)의 항-6His-D2 HTRF 항체 - FRET 수용체 접합체(Cisbio) 및 1:400(최종 농도)의 항-strep-Tb 항체 FRET 공여체 접합체(Cisbio)와 함께 PBSTB(0.1% Tween 20® 및 0.2% (w/v) BSA가 보충된 PBS(pH 7.4)) 중 1:200 희석물(최종 농도)로서 적용하고, 4℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. HTRF는 340 nm 여기 파장, 및 백그라운드 형광 검출을 위한 620 ±10 nm 방출 필터 및 특이적 결합에 대한 형광 신호를 검출하기 위한 665 ±10 nm 방출 필터를 사용하여 Tecan M1000 상에서 판독하였다.
각각의 용해된 클론의 추출물을 3개의 비오티닐화 pMHC 복합체, 즉 NYESOpMHC, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC 각각에 대한 결합에 대해 시험하여, 표적 NYESOpMHC 복합체에 대한 결합 및 특이성을 평가하였다. NYESOAApMHC 및 EBNApMHC는 NYESOpMHC와 구별되는 pMHC 복합체로서의 역할을 해서 NYESOpMHC에 대한 높은 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 선택을 가능하게 하였다.
NYESOpMHC에 대한 각각의 안키린 반복 단백질의 특이성을 계산하기 위하여, 표적 NYESOpMHC에 대한 HTRF 신호 대 이와 구별되는 NYESOAApMHC에 대한 HTRF 신호의 비를 결정하였다. 표적 NYESOpMHC에 대해 NYESOAApMHC보다 적어도 25배 더 높은 HTRF 신호를 발생시킨 모든 결합제를 특이적 히트로서 간주하고 서열분석을 위하여 취하였다. 놀랍게도, 그러한 조 세포 추출물 HTRF 분석에 의한 수백 개의 클론의 스크리닝은 NYESOpMHC에 대한 특이성을 갖는 많은 상이한 안키린 반복 도메인들을 밝혀주었다. HLA 스캐폴드 및 짧은 펩티드를 포함하는 복합 에피토프 - 여기서는 단지 펩티드만이 특이적으로 결합되지 않는 다른 복합 에피토프와 상이함 - 에 대한 안키린 반복 단백질의 특이적 결합은 결코 이전에 밝혀진 적이 없으며, 항체 또는 TCR 기술을 사용하여 그러한 복합 에피토프에 대한 특이적 결합제를 개발하는 것은 어려운 문제였다.
총 95개의 히트를 Microsynth(Balgach; 스위스 소재)에서의 서열분석 서비스를 사용하여 서열분석하였다. NYESOpMHC에 특이적으로 결합하는 선택된 안키린 반복 도메인의 아미노산 서열의 예가 서열 번호 20 내지 33에 제공되어 있다.
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 이들 안키린 반복 도메인을, 하기에 기재된 바와 같이 단순 단백질 정제를 용이하게 하도록 N-말단 His-태그(서열 번호 4)를 제공하는 pQE(QIAgen, 독일 소재) 기반 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 예를 들어, 하기 안키린 반복 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 작제하였다:
DARPin® 단백질 #20(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 20);
DARPin® 단백질 #21(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 21);
DARPin® 단백질 #22(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 22);
DARPin® 단백질 #23(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 23);
DARPin® 단백질 #24(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 24);
DARPin® 단백질 #25(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 25);
DARPin® 단백질 #26(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 26);
DARPin® 단백질 #27(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 27);
DARPin® 단백질 #28(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 28);
DARPin® 단백질 #29(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 29);
DARPin® 단백질 #30(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 30);
DARPin® 단백질 #31(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 31);
DARPin® 단백질 #32(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 32); 및
DARPin® 단백질 #33(His-태그(서열 번호 4)가 N-말단에 융합된 서열 번호 33).
NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 높은 수준 및 가용성 발현
추가 분석을 위하여, 전술된 바와 같은 조 세포 추출물 HTRF에서 특이적 NYESOpMHC 결합을 나타내는 선택된 클론을 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 표준 프로토콜에 따라 이들의 His-태그를 사용하여 정제하였다. 25 ml의 안정 상태의 하룻밤 배양물(TB, 1% 글루코스, 50 mg/l의 암피실린; 37℃)을 사용하여 500 ml의 배양물(TB, 50 mg/l의 암피실린, 37℃)을 접종시켰다. 600 nm에서의 1.0 내지 1.5의 흡광도에서, 배양물을 0.5 mM IPTG를 사용하여 유도하고, 진탕시키면서 4 내지 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 원심분리하고, 생성된 펠릿을 25 ml의 TBS500(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl(pH 8)) 중에 재현탁시키고, 용해시켰다(초음파 처리 또는 프렌치 프레스(French press)). 용해 후에, 샘플을 50 KU DNase/ml와 혼합하고, 15분 동안 인큐베이션한 후, 62.5℃에서 30분 동안 열처리 단계를 수행하고, 원심분리하고, 상층액을 수집하고 여과하였다. Triton X100(1% (v/v) 최종 농도) 및 이미다졸(20 mM 최종 농도)을 균질액에 첨가하였다. 단백질을 Ni-니트릴로트라이아세트산(Ni-NTA) 컬럼으로 정제한 후, 당업자에게 알려진 표준 프로토콜 및 수지에 따라
Figure pct00007
™ 시스템 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 대안적으로, His-태그가 없는 선택된 안키린 반복 도메인을 E. 콜라이에서 높은 세포 밀도 발효에 의해 생성하고, 당업자에게 알려진 표준 수지 및 프로토콜에 따라 일련의 크로마토그래피 및 한외/투석여과 단계에 의해 정제한다. NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 고가용성 안키린 반복 단백질을, 4 내지 12% SDS-PAGE로부터 추정될 때 95% 초과의 순도로 E. 콜라이 배양물(배양물 1 리터당 최대 200 mg의 안키린 반복 단백질)로부터 정제하였다. 그러한 SDS-PAGE 분석의 대표적인 예가 DARPin® 단백질 #21에 대해 도 2에 나타나 있다.
실시예 2 : 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 해리 상수(K D )의 결정
NYESOpMHC 표적에 대한 정제된 안키린 반복 단백질의 결합 친화도를 ProteOn 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기기(BioRad)를 사용하여 분석하고, 당업자에게 알려진 표준 절차에 따라 측정을 수행하였다. 유사하게, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC 복합체에 대한 정제된 안키린 반복 단백질의 결합 친화도를 또한 분석하여 결합을 비교하고, NYESOpMHC 표적에 대한 안키린 반복 단백질의 결합 특이성을 확인하였다.
간략하게 말하면, 비오티닐화 NYESOpMHC, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC를 PBST(0.005% Tween 20®을 함유하는 PBS(pH 7.4)) 중에 희석시키고, NLC 칩(BioRad) 상에 약 500 공명 단위(RU)의 수준으로 코팅하였다(멀티-트레이스 SPR 측정을 위해서는 각각 1000 RU). 이어서, 멀티-트레이스 SPR 측정을 위해서는 3.7 nM 내지 300 nM의 농도 범위 또는 단일 트레이스 측정을 위해서는 250 mM의 농도를 포함하는 안키린 반복 단백질의 단일 농도 또는 연속 희석물 중 어느 하나를 함유하는 150 μl의 전개 완충액(0.005% Tween 20®을 함유하는 PBS(pH 7.4))을 주입한 후(결합 속도(on-rate) 측정), 100 μl/분의 일정 유량으로 적어도 60분 동안 전개 완충액 유동을 수행함으로써(해리 속도(off-rate) 측정), 안키린 반복 단백질과 pMHC의 상호작용을 측정하였다. 표적 재생은 수행하지 않았다. 안키린 반복 단백질의 주입 후 획득된 RU 트레이스로부터 스폿간의 신호(즉, 공명 단위(RU) 값)를 차감하였다. 결합 속도 및 해리 속도 측정으로부터 획득된 SPR 트레이스에 기초하여, pMHC 복합체에 대한 상응하는 안키린 반복 단백질의 결합 속도 및 해리 속도를 결정하였다.
대표적인 예로서, 도 3의 A 내지 도 3의 C는 NYESOpMHC(도 3의 A), NYESOAApMHC(도 3의 B) 및 EBNApMHC(도 3의 C)에 대한 DARPin® 단백질 #21의 결합에 대해 획득된 SPR 트레이스를 나타낸다. 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 추정된 결합 속도 및 해리 속도로부터 해리 상수(KD)를 계산하였다. 선택된 안키린 반복 단백질과 NYESOpMHC의 결합 상호작용의 KD 값은 낮은 나노몰 범위 또는 그 이하인 것으로 결정되었다. 이들 선택된 안키린 반복 단백질의 어느 것도 NYESOAApMHC 또는 EBNApMHC와의 측정가능한 결합 상호작용을 나타내지 않았다. 표 2는 예로서 일부 선택된 안키린 반복 단백질의 KD 값을 제공한다.
[표 2]
Figure pct00008
도 4의 A 및 도 4의 B는 본 발명의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인의 대표적인 예로서의 DARPin® 단백질 #21의 추가의 특성규명을 나타낸다. NYESOpMHC, NYESOAApMHC 및 EBNApMHC에 대한 DARPin® 단백질 #21의 결합을 HTRF 검정을 사용하여 조사하였으며, 이는 NYESOpMHC에 대한 고도로 특이적인 표적 결합을 입증하였다(도 4의 A). NYESOAApMHC 또는 EBNApMHC에 대한 DARPin® 단백질 #21의 어떠한 결합도 관찰되지 않았다.
DARPin® 단백질 #21의 생물물리학적 특성을 또한 Superdex 200 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 조사하였다. DARPin® 단백질 #21을 50 μM 농도로 주입하였다. SEC 용리 프로파일은 단일 단분산 피크를 나타내었는데, 이는 개별 DARPin® 단백질 #21 분자의 예상된 질량에 상응하는 위치에서 용리되었다(도 4의 B). 응집체 또는 다량체의 어떠한 흔적도 검출되지 않았다.
이들 실험 데이터 및 KD 값은 특정 pMHC 복합체, 예를 들어 NYESOpMHC 복합체에 대해 높은 결합 친화도 및 친화성을 가질 뿐만 아니라 유익한 생물물리학적 특성을 갖도록 설계된 안키린 반복 단백질이, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같은 스크리닝 및 선택 절차를 사용하여 생성될 수 있음을 입증한다.
실시예 3 : NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 세포에 대한 결합
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 생물물리학적 특성규명 후에, 이들을 또한 세포 결합에 대해 시험하였다. 이러한 목적상, T2 세포(ATCC® CRL-1992™)를 사용하였는데, 이는 항원 처리와 관련된 수송체(TAP) 단백질 복합체가 결여되어 있는 T-림프아구와 B-림프아구의 하이브리드이며, 이에 따라 항원 처리 및 T 세포 인식을 연구하기 위한 모델 시스템이다. T2 세포는 HLA-A2 양성 및 NY-ESO-1 음성이다. 이들 세포는 HLA-A2에 결합하는 펩티드, 예컨대 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 로딩될 수 있으며, 그럼으로써 그들의 표면 상에 상응하는 pMHC 복합체를 생성할 수 있다.
펩티드의 적정은, T2 세포에 대한 μM 범위의 펩티드의 첨가가 HLA-A2와 첨가된 펩티드 사이에 형성된 pMHC 복합체에 대한 안키린 반복 도메인의 결합을 연구할 수 있게 하기에 충분한 pMHC 복합체를 생성한다는 것을 보여주었다. T2-세포를 20 μM의 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 또는 EBNA-1(562 내지 570) 펩티드를 사용하여 37℃에서 하룻밤 펄싱하였다. 동시에, T2 세포를 어떠한 펩티드도 함유하지 않는 완충액으로 처리하였다(비-펄싱된 세포). NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질을 세포에 상이한 농도로 첨가하고, 4℃에서의 30분의 인큐베이션 후에, 세포에 대한 안키린 반복 단백질의 결합을 항-His 태그 항체(Penta·His Alexa Fluor 488 접합체, Qiagen)를 사용하여 유세포측정에 의해 결정하였다.
대표적인 예로서, 도 5의 A 및 도 5의 B는 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포(도 5의 A) 및 비-펄싱된 T2 세포(도 5의 B)를 사용하여 DARPin® 단백질 #20, DARPin® 단백질 #21, 및 DARPin® 단백질 #22에 대해 얻어진 결합 곡선을 나타낸다. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포에 대한 결합에 대한 EC50 값을 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 결정하였다. 선택된 안키린 반복 단백질의 EC50 값은 낮은 나노몰 범위인 것으로 결정되었는데, 이는 세포에 대한 효율적인 결합을 입증한다. 표 3은 예로서 선택된 안키린 반복 단백질의 EC50 값을 제공한다.
[표 3]
Figure pct00009
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이 면역 세포 인게이저 포맷으로 기능하는 능력을 시험하기 위하여, 선택된 안키린 반복 도메인을 통상적인 클로닝 방법을 사용하여, 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 유전자적으로 연결하였다. 이 절차에 의해, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 결합 단백질을 생성하였다.
T 세포 인게이저(TCE) 포맷의 그러한 결합 단백질이 펄싱된 T2 세포에 결합하는 능력을 전술된 바와 같이 시험하였다. 도 5의 C 및 도 5의 D에 나타낸 바와 같이, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포에 대한 DARPin® 단백질 #20, DARPin® 단백질 #21, 및 DARPin® 단백질 #22의 특이적 결합이 T 세포 인게이저 포맷(TCE DARPin® 단백질 #20, TCE DARPin® 단백질 #21 및 TCE DARPin® 단백질 #22)에서 보존되었다. TCE DARPin® 단백질 #20, TCE DARPin® 단백질 #21 및 TCE DARPin® 단백질 #22는 비-펄싱된 T2 세포에 결합되지 않거나(도 5의 E), 또는 TCE DARPin® 단백질 #21에 대해 예시적으로 나타낸 바와 같이, (높은 농도에서의 미소한 결합은 제외하고) EBNA-1(562 내지 570) 펩티드로 펄싱된 T2 세포에 결합하지 않았다(도 5의 F). NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질과 TCE 포맷의 동일한 결합 단백질 사이에 결합에 있어서의 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 5의 D). T 세포 인게이저 포맷의 안키린 반복 단백질의 EC50 값은 낮은 나노몰 범위인 것으로 결정되었는데, 이는 세포에 대한 효율적인 결합을 입증한다. 표 4는 예로서 T 세포 인게이저 포맷의 선택된 안키린 반복 단백질의 EC50 값을 제공한다.
[표 4]
Figure pct00010
결론적으로, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질은 낮은 나노몰 범위의 EC50으로 세포의 표면 상의 NYESOpMHC에 특이적으로 결합할 수 있었다. 세포의 표면 상의 NYESOpMHC에 대한 결합은 특이적이었는데, 그 이유는, 비-펄싱된 T2 세포 또는 비관련 펩티드로 펄싱된 T2 세포에 대해 어떠한 결합도 관찰되지 않았기 때문이다. NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질, 예컨대 T 세포의 표면 상에서 발현되는 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 결합되었을 때(T 세포 인게이저(TCE) 포맷), 특이적 결합 특성이 보존되었다.
실시예 4 : 펄싱된 T2 세포를 사용하여, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화
TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 시에 T 세포를 활성화시키는 능력을 T 세포 활성화 검정에서 분석하였다.
NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포를 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포로서 사용하였다. 이펙터 세포는 BK112 T 세포였는데, 이는 건강한 공여자로부터 증폭된 단일클론 CD8+ T 세포이다(문헌[Levitsky et al., J. Immunol. 161:594-601 (1998)]). T 세포 활성화 검정을 위하여, T2 세포를 10 μM의 펩티드와 함께 37℃에서 하룻밤 펄싱하였다. 이펙터 BK112 T 세포를 상이한 농도(예를 들어, 1 pM)의 TCE DARPin® 단백질의 존재 하에서 1:5의 이펙터 대 표적 세포 비로 첨가하고, 37℃에서 4 내지 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, CD8+ T 세포에서의 세포내 IFN-γ를 T 세포 활성화의 척도로서 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 결정하였다. FACS에 사용된 시약은 BD Biosciences로부터의 APC 마우스 항-인간 IFN-γ 및 Pacific Blue™ 마우스 항-인간 CD8을 포함하였다.
도 6은 이러한 T 세포 활성화 검정에서 상이한 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인들(1 pM)의 패널을 시험한 결과를 나타낸다. TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인은 (도 6에서의 x-축에 있는 번호에 상응하여) (1) TCE DARPin® 단백질 #23, (2) TCE DARPin® 단백질 #24, (3) TCE DARPin® 단백질 #25, (4) TCE DARPin® 단백질 #26, (5) TCE DARPin® 단백질 #27, (6) TCE DARPin® 단백질 #28, (7) TCE DARPin® 단백질 #29, (8) TCE DARPin® 단백질 #30, (9) TCE DARPin® 단백질 #31, (10) TCE DARPin® 단백질 #32, (11) TCE DARPin® 단백질 #33, (12) TCE DARPin® 단백질 #21, (13) TCE DARPin® 단백질 #20, 및 (14) TCE DARPin® 단백질 #22였다. 대조군으로서, 이 실험을 또한 TCE DARPin® 단백질이 첨가되지 않은 상태에서 수행하였다(15). 4시간의 인큐베이션 후에, T 세포에서의 세포내 IFN-γ를 FACS에 의해 결정하였다.
14개의 모든 TCE DARPin® 단백질은 펄싱된 T2 세포에서 표적 펩티드-MHC 복합체의 존재 하에서는 T 세포 활성화를 특이적으로 매개하였지만, 비-펄싱된 T2 세포에서 표적 펩티드-MHC 복합체의 부재 하에서는 그렇지 않았다(또는 훨씬 더 적었다). 1 pM의 TCE DARPin® 단백질에서 비-펄싱된 T2 세포에 대해 또한 신호가 검출된 TCE DARPin® 단백질의 경우, 펄싱된 T2 세포와 비-펄싱된 T2 세포 사이의 더 큰 창(window)이 TCE DARPin® 단백질의 더 낮은 농도에서 얻어졌다(데이터는 도시되지 않음). 따라서, TCE 포맷의 이들 모든 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인은 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포의 존재에 따라 이펙터 T 세포를 특이적으로 활성화시킬 수 있었다.
NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포의 존재에 대한 이펙터 T 세포의 특이적 활성화의 의존성은 유사한 T 세포 활성화 검정에서 추가로 밝혀졌는데, 이 검정에서는 TCE DARPin® 단백질을 더 넓은 농도 범위에 걸쳐 적정하였다. 도 6의 B 및 도 6의 C는 TCE DARPin® 단백질#21(B) 및 TCE DARPin® 단백질#32(C)에 대한 그러한 실험의 결과를 나타낸다. 펄싱된 T2 세포의 존재 하에서 매우 낮은 농도(피코몰 미만)에서 출발하여 그리고 (최대 나노몰까지) 시험된 전체 농도 범위에 걸쳐 두 TCE DARPin® 단백질 모두에 의해 이펙터 T 세포의 특이적 활성화가 달성되었다. 대조적으로, 비-펄싱된 T2 세포의 존재 하에서는 전체 농도 범위에 걸쳐 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다. 이는 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포의 존재에 따라 이펙터 T 세포를 특이적으로 활성화시키는 능력을 확인시켜 주었다.
실시예 5 : 종양 세포를 사용하여, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화
TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 시에 T 세포 활성화를 매개하는 능력을 또한, 표적 세포로서 종양 세포주를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 분석하였다. HLA-A2 및 NY-ESO-1을 내인적으로 발현하고(따라서, HLA-A2+ NY-ESO-1+ 세포) 그의 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하는 종양 세포주(IM9; ATCC® CCL-159™)), 및 HLA-A2는 발현하지만 NY-ESO-1은 발현하지 않고(따라서, HLA-A2+ NY-ESO-1- 세포) 그의 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하지 않는 종양 세포주(MCF-7; ATCC® HTB-22™)를 사용하여 T 세포 활성화를 비교하였다. BK112 T 세포를 이펙터 세포로서 사용하였으며, 실험은 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였지만, 상이한 표적 세포를 사용하여 수행하였다. 대조군으로서, 표적 세포가 첨가되지 않은 것을 제외하고는, 이펙터 BK112 T 세포를 동일하게 처리하였다.
TCE DARPin® 단백질 #21에 대해 예시적으로 나타낸 바와 같이, TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-발현 종양 세포(IM9)의 존재 하에서 T 세포를 효과적으로 활성화시킬 수 있다(도 7, 원 기호). 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 TCE DARPin® 단백질 #21에 의한 IM9 종양 세포의 활성화에 대한 EC50 값이 18.7 nM인 것으로 결정되었는데, 이는 TCE DARPin® 단백질의 강력한 활성을 입증한다. 대조적으로, 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는 종양 세포(MCF-7)의 존재 하에서는(도 7, 삼각형 기호), 또는 종양 세포가 T 세포에 첨가되지 않은 경우에는(즉, BK112 T 세포 단독)(도 7, 정사각형 기호) T 세포의 어떠한 활성화도 관찰되지 않았다.
이들 데이터는 TCE 포맷의 pMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 종양 세포의 표면 상의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 시에 T 세포를 강력하게 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6 : 종양 세포를 사용하여, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의한 면역 세포 활성화
TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 시에 T 세포 활성화를 매개하는 능력을 또한, 표적 세포로서 종양 세포주를 그리고 이펙터 세포로서 공여자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 분석하였다. HLA-A2 및 NY-ESO-1을 내인적으로 발현하고, 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하는 종양 세포주(IM9), 및 HLA-A2는 발현하지만 NY-ESO-1은 발현하지 않고, 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하지 않는 종양 세포주(MCF-7)를 사용하여 면역 세포 활성화를 비교하였다(실시예 5를 또한 참조). 공여자로부터 단리된 PBMC를 이펙터 세포로서 사용하였다.
T 세포 활성화 검정을 위하여, 표적 종양 세포와 이펙터 PBMC를 5:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 합하고, TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인을 상이한 농도로 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상층액을 추가의 분석(예를 들어, IFN-γ 및 TNF-α 정량화)을 위하여 -80℃에서 저장하고, CD8+ T 세포 상의 활성화 마커(CD25 및 CD69)의 수준을 FACS(CD25 단일클론 항체(BC96), PerCP-시아닌5.5, eBioscience™; 및 Alexa Fluor® 488 마우스 항-인간 CD8 및 PE-Cy™7 마우스 항-인간 CD69(BD Biosciences로부터 입수됨)를 사용함)에 의해 결정하였다. 대조군으로서, 표적 세포가 첨가되지 않은 것을 제외하고는, 이펙터 PBMC를 동일하게 처리하였다. TCE DARPin® 단백질 #20, TCE DARPin® 단백질 #21, TCE DARPin® 단백질 #27, TCE DARPin® 단백질 #32 및 TCE DARPin® 단백질 #33과의 인큐베이션 시에 얻어진 CD25 수준이 도 8의 A 내지 도 8의 E에 지시된 바와 같이 나타나 있다. 유사한 결과가 CD69에 대해서도 얻어졌다(데이터는 도시되지 않음).
이 데이터는 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-발현 종양 세포(IM9)의 존재 하에서 공여체로부터 유래되는 천연 CD8+ T 세포를 강력하게 활성화시킬 수 있음을 입증한다(도 8의 A 내지 도 8의 E, 원 기호). TCE DARPin® 단백질에 의한 IM9 종양 세포의 존재 하에서의 T 세포의 활성화에 EC50 값을 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 결정하였다. EC50 값은 낮은 nM 범위 또는 그 이하였는데(표 5), 이는 TCE DARPin® 단백질의 강력한 활성을 입증한다.
[표 5]
Figure pct00011
IM9 세포와는 대조적으로, 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는 종양 세포(MCF-7)의 존재 하에서는(도 8의 A 내지 도 8의 E, 삼각형 기호), 또는 종양 세포가 T 세포에 첨가되지 않은 경우에는(즉, PBMC 단독)(도 8의 A 내지 도 8의 E, 정사각형 기호) T 세포의 어떠한 활성화도 관찰되지 않았다(또는 단지 훨씬 더 높은 TCE DARPin® 단백질 농도에서만 더 작은 활성화가 관찰되었다).
면역 세포 활성화의 추가의 척도로서, 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 수준을 인큐베이션 후의 세포의 상층액에서 정량화하였다(상기 참조). 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따랐다(ProcartalPlexTM 멀티플렉스 면역검정(Multiplex Immunoassay) EPX01A-10228-901 및 -10223-90, Thermo Fischer Scientific). 간략하게 말하면, 상층액을 사이토카인 특이적 포획 항체로 사전-코팅된 색상-코딩된 비드의 혼합물에 첨가하였다. 관심 사이토카인에 특이적인 2차 비오티닐화 검출 항체를 첨가하고, 항체-사이토카인 샌드위치를 형성하였다. 이어서, PE-접합된 스트렙타비딘을 첨가하고, 비오티닐화 검출 항체에 결합시켰으며, 판독 완충액의 첨가는 MAG/Pix Luminex 기기를 사용한 데이터의 획득을 가능하게 하였다. 사이토카인 수준은 제공된 표준을 사용하여 계산될 수 있었다.
상층액 중의 IFN-γ(도 9의 A 내지 도 9의 E) 및 TNF-α(도 10의 A 내지 도 10의 E)의 수준이 TCE DARPin® 단백질 농도-의존적 방식으로 IM9 종양 세포의 존재 하에서 강하게 증가되었다. 이들 결과는 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 NYESOpMHC-발현 종양 세포(IM9)의 존재 하에서 T 세포 활성화를 강력하게 매개할 수 있음을 확인시켜 준다. 더욱이, 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는 종양 세포(MCF-7)의 존재 하에서는 IFN-γ(도 9의 A 내지 도 9의 E) 및 TNF-α(도 10의 A 내지 도 10의 E)의 어떠한 증가도 관찰되지 않았다(또는 단지 훨씬 더 높은 TCE DARPin® 단백질 농도에서만 더 작은 증가가 관찰되었다). 이 실시예에 기재된 모든 검정에서, TCE DARPin® 단백질 #33은 나머지 다른 시험된 TCE DARPin® 단백질보다 더 낮은 농도에서 이미 강력하였지만, 더 높은 농도에서는 덜 특이적이었다.
이 실시예에서는 전술된 바와 유사한 T 세포 활성화 검정을 또한, HLA-A2 및 NY-ESO-1을 내인적으로 발현하고, 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하는 다른 종양 세포주(U266B1), 및 HLA-A2는 발현하지만 NY-ESO-1은 발현하지 않고, 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하지 않는 다른 종양 세포주(Colo205)를 사용하여 수행하였다. 더욱이, (세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는) MCF-7 종양 세포와, NY-ESO-1을 발현하고, 이에 따라 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하도록 형질감염된 MCF-7 종양 세포를 비교하는 유사한 검정을 또한 수행하였다. TCE DARPin® 단백질 #21 또는 TCE DARPin® 단백질 #32와의 인큐베이션 시에 얻어진 CD69 수준이 T 세포 활성화의 척도로서 도 18의 A 내지 도 18의 F에 지시된 바와 같이 나타나 있다. 본 발명의 각각의 시험된 결합 단백질에 대해, 유의한 T 세포 활성화가 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하는 종양 세포(U266B1, 형질감염된 MCF-7, IM9)의 존재 하에서만 관찰되었으며, 그러나 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는 종양 세포(Colo205, MCF-7)의 존재 하에서는 관찰되지 않았다.
결론적으로, 이들 데이터는 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제 둘 모두를 포함하는 재조합 결합 단백질이 종양 세포의 표면 상의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 시에 T 세포를 강력하게 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 7 : 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 분석된, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의한 표적 펩티드 결합의 특이성
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인과 NYESOpMHC 표적 사이의 특이적 상호작용을 분석하기 위하여, 알라닌-스캐닝 돌연변이생성을 수행하였다. 이러한 목적상, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드, 및 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드의 1개의 아미노산이 알라닌으로 각각 대체된 이들의 일련의 변이체를 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다. 이 검정은, 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이, 표적 세포로서 펄싱된 T2 세포를 그리고 이펙터 세포로서 BK112 T 세포를 사용하였다. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 내의 아미노산 잔기가 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인과 NYESOpMHC 표적 사이의 결합 상호작용에 있어서 중요하다면, 이러한 아미노산 잔기가 알라닌으로 대체되는 경우, 감소된 T 세포 활성화가 관찰되거나 어떠한 T 세포 활성화도 관찰되지 않을 것이다.
알라닌-돌연변이된 펩티드는 Genscript로부터 입수되었으며, 하기 서열을 가졌다: ALLMWITQV(서열 번호 81; 위치 1에서 S에서 A로), SLAMWITQV(서열 번호 82; 위치 3에서 L에서 A로), SLLAWITQV(서열 번호 83; 위치 4에서 M에서 A로), SLLMAITQV(서열 번호 84; 위치 5에서 W에서 A로), SLLMWATQV(서열 번호 85; 위치 6에서 I에서 A로), SLLMWIAQV(서열 번호 86; 위치 7에서 T에서 A로), SLLMWITAV(서열 번호 87; 위치 8에서 Q에서 A로), 및 SALMWITQA(서열 번호 88; 위치 2에서 L에서 A로, 그리고 위치 9에서 V에서 A로). 서열 번호 88을 갖는 펩티드에서는, 고정 위치 2와 9 둘 모두가 알라닌으로 치환되었다. 위치 2 및 9에서의 고정 잔기는 HLA 분자에 대한 펩티드의 결합에 중요하다. T2 세포를 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 및 각각의 돌연변이된 펩티드(10 μM)로 펄싱하였다. 펄싱된 T2 세포를 TCE DARPin® 단백질의 존재 하에서 1:5의 이펙터 대 표적 세포 비로 이펙터 BK112 T 세포와 함께 인큐베이션하였다.
알라닌 스캐닝 돌연변이생성 분석은 어느 펩티드 잔기가 TCE DARPin® 단백질과 NYESOpMHC 표적 사이의 결합 상호작용에 중요한지를 보여주었다(도 11의 A 내지 도 11의 E). 이들 데이터는, 각각의 경우에, 적어도 3개의 펩티드 잔기가 이러한 결합 상호작용에 중요하여, 알라닌으로 돌연변이될 때 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드와 대비하여 T 세포 활성화에 있어서 적어도 50%만큼의 감소를 야기한다는 것을 입증한다. 놀랍게도, 일부 경우에는, 거의 전체 펩티드 서열에 걸쳐 위치된 적어도 5개의 펩티드 잔기와의 상호작용이 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 안키린 반복 도메인의 결합에 중요하였다. 한 예로서, DARPin® 단백질 #20의 경우, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드의 적어도 위치 3, 4, 5, 6, 및 7이 T 세포 활성화로 이어지는 기능성 결합 상호작용에 중요하였다(도 11의 A). 다른 예로서, DARPin® 단백질 #21의 경우, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드의 적어도 위치 4, 5, 6, 7 및 8이 T 세포 활성화로 이어지는 기능성 결합 상호작용에 중요하였다(도 11의 B). 다른 예로서, DARPin® 단백질 #32의 경우, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드의 적어도 위치 1, 3, 4, 5, 6, 및 7이 T 세포 활성화로 이어지는 기능성 결합 상호작용에 중요하였다(도 11의 D). 예상된 바와 같이, 위치 2 및 9에서의 2개의 고정 잔기가 돌연변이되었을 때이거나 또는 비-펄싱된 T2 세포가 사용되었을 때에는, T 세포 활성화로 이어지는 어떠한 기능성 결합 상호작용도 관찰되지 않았다.
결론적으로, 이들 데이터는 놀라울 정도로 많은 수의 펩티드 잔기가 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질과 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드 사이의 특이적 상호작용에 중요하다는 것을 나타낸다. 이는 설계된 안키린 반복 도메인에 의해 형성된 결합 표면과, 다른 결합 단백질, 예컨대 항체 및 T 세포 수용체(TCR)에 의해 형성된 결합 표면 사이에 구조적 차이를 반영할 수 있다.
실시예 8 : NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의해 매개된 이펙터 세포에 의한 pMHC-의존성 표적 세포 사멸
TCE 포맷의 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질이 이펙터 세포에 의한 표적 세포의 pMHC-의존성 사멸을 매개하는 능력을 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 Incucyte® 검정(Essen Biosciences)에서 시험하였다.
간략하게 말하면, 이펙터 세포(말초 혈액 단핵 세포(PBMC)) 및 표적 세포(펄싱된 T2 세포(PT2) 또는 비-펄싱된 T2 세포(NPT2) 중 어느 하나의 세포)를 상이한 농도(0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM)의 TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질(TCE DARPin® 단백질 #21 (D))의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 이펙터 대 표적 세포의 비는 20:1이었다. 세포 아폽토시스 동안 절단되어 녹색-형광 DNA 염료를 방출하며, 이에 따라 핵 DNA를 염색하는 기질인 Incucyte® Caspase 3/7 시약을 첨가하였다. 세포를 매 2시간마다 스캐닝하고, 종양 세포사의 수준을 시간 경과에 따라 추적할 수 있었다.
결과는 도 12에 제시되어 있는데, 이는 세포 아폽토시스의 수준(총 녹색 대상 면적)을 나타낸다. TCE 포맷의 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질은 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하는 표적 세포(PT2 세포)의 사멸을 농도-의존적 방식으로 효과적으로 매개할 수 있었다. 대조적으로, 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하지 않는 표적 세포(NPT2 세포)에 대해서는 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다.
TCE 포맷의 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질이 이펙터 세포에 의한 표적 세포의 pMHC-의존성 사멸을 매개하는 능력을 상이한 유형의 검정에서 시험하였다. 여기서는, 펄싱된 또는 비-펄싱된 T2 세포를 표적 세포로서 사용하였을 뿐만 아니라, 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하는 종양 세포(IM9; U266B1) 또는 이를 발현하지 않는 종양 세포(MCF-7)도 표적 세포로서 사용하였다.
간략하게 말하면, 방사성 표지된(Cr51) T2 세포(NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱되거나 비-펄싱됨) 또는 방사성 표지된(Cr51) HLA-A2+/NY-ESO-1+ 종양 세포주(IM9, U266B1) 또는 HLA-A2+/ NY-ESO-1- 종양 세포주(MCF-7)를 표적 세포로서, 1 nM의 TCE DARPin® 단백질 #21 또는 TCE DARPin® 단백질 #32의 존재 또는 부재 하에서, 사전활성화된 이펙터 CD8+ T 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 용해된 표적 세포로부터의 방사능 방출의 양을 LumaPlate TopCount NXT 마이크로플레이트 섬광 계수기를 사용하여 상층액에서 결정하였다. 크롬 방출 검정에 의해 얻어진 T2 세포 또는 종양 세포주의 특이적 용해의 백분율을 상이한 이펙터 세포 대 표적 세포 비(30:1; 10:1; 5:1; 1:1)에 대해 플롯팅하였다.
결과가 TCE DARPin® 단백질 #21에 대해서는 도 19의 A 및 도 19의 B에, 그리고 TCE DARPin® 단백질 #32에 대해서는 도 20의 A 및 도 20의 B에 나타나 있다. 결과는 TCE 포맷의 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질이 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하는 표적 세포(펄싱된 T2 세포 또는 IM9 또는 U266B1 종양 세포)의 사멸을 이펙터 세포 대 표적 세포 비에 의존적인 방식으로 효과적으로 매개할 수 있었음을 나타낸다. 더 높은 농도의 TCE DARPin® 단백질에 대해 훨씬 더 높은 수준의 표적 세포 사멸이 달성되었다(데이터는 도시되지 않음). 대조적으로, 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하지 않는 표적 세포(비-펄싱된 T2 세포 또는 MCF-7 종양 세포)에 대해서는 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다.
종합하면, 이들 데이터는 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 T 세포의 표면 상에 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 결합 단백질이 이펙터 세포(T 세포)에 의한 표적 세포(종양 세포를 포함함)의 표적 펩티드-MHC-의존성 사멸을 효과적으로 매개할 수 있음을 입증한다. 따라서, 본 발명의 안키린 반복 도메인은 이펙터 세포(T 세포)에 의한 NYESOpMHC-특이적 표적 세포(예컨대, 종양 세포) 사멸을 매개하기 위해 T 세포 인게이저 포맷으로 사용될 수 있다.
실시예 9 : NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 2가 및 바이파라토프성 결합 단백질
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 다양한 2가 및 바이파라토프성 결합 단백질을 작제하였는데, 이는 그러한 작제물이 표면 상에 NYESOpMHC를 디스플레이하는 세포에 대한 특이적 결합에 기능적인지를 시험하기 위함이었다. 더욱이, 면역 세포의 표면 상에 발현되는 단백질, 예컨대 T 세포의 표면 상에 발현되는 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 2가 및 바이파라토프성 결합 단백질을 작제하였다. T 세포 인게이저 포맷의 이들 2가 또는 바이파라토프성 결합 단백질을 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 시에 T 세포 활성화를 매개하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 모든 작제물은 통상적인 클로닝 방법에 의해 생성하였다.
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 2가 결합 단백질의 예는 펩티드 링커에 의해 연결된 서열 번호 21의 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질(서열 번호 16 BV DARPin® 단백질 #21/#21)이다. BV DARPin® 단백질 #21/#21을 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 연결시킴으로써 T 세포 인게이저 포맷의 2가 결합 단백질(TCE BV DARPin® 단백질 #21/#21)이 생성되었다.
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 바이파라토프성 결합 단백질의 예는 펩티드 링커에 의해 연결된 서열 번호 20의 1개의 안키린 반복 도메인과 서열 번호 21의 1개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질(서열 번호 17; BP DARPin® 단백질 #20/#21) 또는 펩티드 링커에 의해 연결된 서열 번호 21의 1개의 안키린 반복 도메인과 서열 번호 22의 1개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질(서열 번호 18; BP DARPin® 단백질 #21/#22)이다. BP DARPin® 단백질 #20/#21 또는 BP DARPin® 단백질 #21/#22를 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 연결시킴으로써 T 세포 인게이저 포맷의 바이파라토프성 결합 단백질(TCE BP DARPin® 단백질 #20/#21 및 TCE BP DARPin® 단백질 #21/#22)이 생성되었다.
표적 세포로서의 펄싱된 T2 세포 및 이펙터 세포로서의 BK112 T 세포를 사용한 T 세포 활성화 검정
TCE 포맷의 2가 및 바이파라토프성 결합 단백질이 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 시에 T 세포를 활성화시키는 능력을 실시예 4에 기재된 T 세포 활성화 검정을 사용하여 분석하였다. 간략하게 말하면, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포를 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포로서 사용하고, BK112 T 세포를 이펙터 세포로서 사용하였다. 이 T 세포 활성화 검정은 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 13은 이러한 T 세포 활성화 검정에서 상이한 TCE 포맷의 2가 및 바이파라토프성 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질(0.1 pM)을 시험한 결과를 나타낸다. TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질은 (도 13에서의 x-축에 있는 번호에 상응하여) (1) TCE BP DARPin® 단백질 #20/#21, (2) TCE BP DARPin® 단백질 #21/#22, 및 (3) TCE BV DARPin® 단백질 #21/#21이었다. 대조군으로서, 이 실험을 또한, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인 대신에 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 TCE DARPin® 단백질(4)을 사용하여, 그리고 어떠한 TCE DARPin® 단백질도 첨가되지 않은 상태에서(5) 수행하였다.
3개의 모든 2가 또는 바이파라토프성 TCE DARPin® 단백질은 펄싱된 T2 세포의 존재 하에서는 T 세포 활성화를 특이적으로 매개하였지만, 비-펄싱된 T2 세포에서의 존재 하에서는 그렇지 않았다(또는 훨씬 더 적었다). 따라서, TCE 포맷의 2가 및 바이파라토프성 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질은 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포의 존재에 따라 이펙터 T 세포를 특이적으로 활성화시킬 수 있었다.
NYESOpMHC-디스플레이하는 세포에 대한 특이적 결합
2가 또는 바이파라토프성 pMHC-특이적 결합 단백질이 표적 펩티드-MHC 복합체-디스플레이하는 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 실시예 3에 기재된 T2 세포 결합 검정을 사용하여 조사하였다. 결합 단백질은 또한 TCE 포맷으로 시험하였다. 이 실험은 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
한 예로서, 도 14의 A 및 도 14의 B는 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포(도 14의 A) 및 비-펄싱된 T2 세포(도 14의 B)를 사용하여 BP DARPin® 단백질 #21/#22 및 TCE BP DARPin® 단백질 #21/#22에 대해 얻어진 결합 곡선을 나타낸다. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드로 펄싱된 T2 세포에 대한 결합에 대한 EC50 값을 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 결정하였다. 이들 바이파라토프성 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 EC50 값은 낮은 나노몰 범위인 것으로 결정되었는데(표 6), 이는 세포에 대한 효율적인 결합을 입증한다. 바이파라토프성 결합 단백질(BP DARPin® 단백질 #21/#22)과 TCE 포맷의 동일한 바이파라토프성 결합 단백질(TCE BP DARPin® 단백질 #21/#22) 사이에 펄싱된 또는 비-펄싱된 T2 세포에 대한 결합에 유의한 차이가 없었다.
[표 6]
Figure pct00012
결론적으로, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질은 낮은 나노몰 범위의 EC50으로 세포의 표면 상의 NYESOpMHC에 특이적으로 그리고 효율적으로 결합할 수 있었다. 세포의 표면 상의 NYESOpMHC에 대한 결합은 특이적이었는데, 그 이유는, 비-펄싱된 T2 세포에 대해 어떠한 결합도 관찰되지 않았기 때문이다. 2개의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인이 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질, 예컨대 T 세포의 표면 상에서 발현되는 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 결합되었을 때(T 세포 인게이저(TCE) 포맷), 특이적이고 효율적인 결합 특성이 보존되었다.
NYESOpMHC-발현 종양 세포의 존재 하에서의 면역 세포 활성화
TCE 포맷의 2가 및 바이파라토프성 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질이 NYESOpMHC-디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 시에 T 세포를 활성화시키는 능력을 또한, 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행된 검정에서, 표적 세포로서 종양 세포주를 그리고 이펙터 세포로서 공여자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 분석하였다.
2가 결합 단백질 TCE BV DARPin® 단백질 #21/#21 또는 바이파라토프성 결합 단백질 TCE BP DARPin® 단백질 #20/#21과의 인큐베이션 시에 얻어진 T 세포 활성화 마커 CD25의 수준이 도 15의 A 및 도 15의 B에 지시된 바와 같이 나타나 있다. 이 데이터는 TCE 포맷의 2가 또는 바이파라토프성 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질이 NYESOpMHC-발현 종양 세포(IM9)의 존재 하에서 공여체로부터 유래되는 CD8+ T 세포의 활성화를 강력하게 매개할 수 있음을 입증한다(도 15의 A 및 도 15의 B, 원 기호). 2가 또는 바이파라토프성 TCE DARPin® 단백질에 의한 IM9 종양 세포의 존재 하에서의 T 세포의 활성화에 EC50 값을 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 결정하였다. EC50 값은 낮은 nM 범위 또는 그 이하였는데(표 7), 이는 2가 및 바이파라토프성 TCE DARPin® 단백질의 강력한 활성을 입증한다.
[표 7]
Figure pct00013
IM9 세포와는 대조적으로, 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는 종양 세포(MCF-7)의 존재 하에서는(도 15의 A 및 도 15의 B, 삼각형 기호), 또는 종양 세포가 T 세포에 첨가되지 않은 경우에는(즉, PBMC 단독)(도 15의 A 및 도 15의 B, 정사각형 기호) T 세포의 어떠한 활성화도 관찰되지 않았다(또는 단지 훨씬 더 높은 TCE DARPin® 단백질 농도에서만 더 작은 활성화가 관찰되었다).
면역 세포 활성화의 추가의 척도로서, 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 수준을, 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이, 바이파라토프성 결합 단백질(TCE BP DARPin® 단백질 #20/#21)과의 인큐베이션 후의 세포의 상층액에서 정량화하였다. 상층액 중의 IFN-γ(도 16의 A) 및 TNF-α(도 16의 B)의 수준이 TCE DARPin® 단백질 농도-의존적 방식으로 IM9 종양 세포의 존재 하에서 강하게 증가되었다. 이들 결과는 TCE 포맷의 바이파라토프성 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 단백질이 NYESOpMHC-발현 종양 세포(IM9)의 존재 하에서 T 세포 활성화를 강력하게 매개할 수 있음을 확인시켜 준다. 세포 표면 상에 NYESOpMHC를 발현하지 않는 종양 세포(MCF-7)의 존재 하에서는 IFN-γ(도 16의 A) 및 TNF-α(도 16의 B)의 어떠한 유의한 증가도 관찰되지 않았다.
결론적으로, 이들 데이터는 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 포함하는 재조합 결합 단백질이 종양 세포의 표면 상의 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 시에 T 세포를 강력하게 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 분석된 표적 펩티드 결합의 특이성
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질과 NYESOpMHC 표적 사이의 특이적 상호작용을 분석하기 위하여, 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 알라닌-스캐닝 돌연변이생성을 수행하였다.
바이파라토프성 결합 단백질 TCE BP DARPin® 단백질 #20/#21(1 pM)에 대한 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 분석이 도 17에 나타나 있다. 이들 데이터는 적어도 3개의 펩티드 잔기, 즉, 위치 4, 5 및 6의 잔기가 이 바이파라토프성 결합 단백질과 표적 세포의 표면 상의 표적 펩티드-MHC 복합체 사이의 결합 상호작용에 중요하였음을 입증한다. 예상된 바와 같이, 위치 2 및 9에서의 2개의 고정 잔기가 돌연변이되었을 때이거나 또는 비-펄싱된 T2 세포가 사용되었을 때에는, 어떠한 결합도 관찰되지 않았다.
실시예 10 : X-스캐닝 돌연변이생성에 의해 분석된, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의한 표적 펩티드 결합의 특이성
NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인과 NYESOpMHC 표적 사이의 특이적 상호작용을 추가로 분석하기 위하여, X-스캐닝 돌연변이생성을 수행하였다. 이러한 목적상, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드 및 이의 일련의 단일-돌연변이 변이체를 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다. 변이 펩티드의 경우, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드의 각각의 아미노산을 단백질에서 발견되는 나머지 다른 19개의 하나하나의 모든 표준 아미노산으로 대체하였다. 이들 돌연변이된 펩티드는 Genscript로부터 입수하였다. 이 검정은, 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이, 표적 세포로서 펄싱된 T2 세포를 그리고 이펙터 세포로서 BK112 T 세포를 사용하였다. 간략하게 말하면, T2 세포를 각각의 돌연변이된 펩티드(10 μM)로 펄싱하고, 야생형 펩티드에 대해 EC90 수준을 가능하게 하는 농도의 TCE DARPin® 단백질(TCE DARPin® 단백질 #21: 1 pM; TCE DARPin® 단백질 #32: 10 pM)의 존재 하에서 이펙터 CD8+ T 세포(BK112 T 세포)와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포내 IFN-γ를 FACS에 의해 검출하였다. 각각의 실험을 2개의 독립적인 반복시험물에서 수행하였다.
X-스캐닝 돌연변이생성 분석은 실시예 7에 기재된 알라닌-스캐닝 돌연변이생성에서 확장된다. NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드의 각각의 위치에서 나머지 다른 19개의 아미노산 각각을 시험함으로써, NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 결합 단백질과 세포의 표면 상에 디스플레이되는 NYESOpMHC 복합체 사이의 결합 상호작용의 특이성을 특성규명할 수 있게 한다. 그러한 분석은 펩티드의 주어진 위치에 있는 어느 아미노산 잔기(들)가 효율적인 결합 상호작용을 가능하게 하는지 또는 가능하게 하지 않는지를 나타낸다. 더욱이, 그러한 분석은 잠재적으로 교차-반응성인 펩티드를 확인시켜 줄 수 있다.
추가의 분석을 위하여, T 세포 활성화 검정의 독립적인 반복시험물에서 얻어진 세포내 IFN-γ 값을 평균하고, 각각의 위치에 따른 야생형 잔기(어둡게 음영처리된 필드)에 대한 100%에 대해 정규화하였다. 이 분석의 평균한 그리고 정규화된 결과가 도 21의 A에 TCE DARPin® 단백질 #21에 대해, 그리고 도 21의 B에 TCE DARPin® 단백질 #32에 대해 나타나 있다. 30% 초과의 모든 값 - 이는 T-세포 활성화의 어떠한 손실도 나타내지 않거나 완전한 손실이 아님을 나타냄 - 은 볼드체로 밝게 음영처리된 색으로 표시되어 있다.
X-스캔 분석은 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 결합 단백질이 MHC 클래스 I 분자의 펩티드 결합 홈에 제시된 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 펩티드의 다수의 잔기와 상호작용한다는 것을 확인시켜 주었다. 시험된 TCE DARPin® 단백질, 즉 TCE DARPin® 단백질 #21 및 TCE DARPin® 단백질 #32의 경우, 적어도 5개의 펩티드 잔기와의 상호작용이 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 안키린 반복 도메인의 결합에 중요하였다. DARPin® 단백질 #21의 경우, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드의 적어도 위치 4, 5, 6, 7, 및 8이 T 세포 활성화로 이어지는 기능성 결합 상호작용에 중요하였다(도 21의 A). DARPin® 단백질 #32의 경우, NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드의 적어도 위치 3, 4, 5, 6, 및 7이 T 세포 활성화로 이어지는 기능성 결합 상호작용에 중요하였다(도 21의 B). 위치 2 및 9는 이들 결론에서 고려되지 않았는데, 그 이유는, 이들 위치에서의 잔기는 고정 잔기로서, 이들은 HLA 분자에 대한 펩티드의 결합에 중요하기 때문이다.
Expasy Prosite 데이터베이스(https :// prosite . expasy . org / scanprosite /)를 사용한 잠재적인 교차-반응성 펩티드에 대한 검색은, TCE DARPin® 단백질 #21에 대해서는 43개의 특유의 인간 펩티드 서열을, 그리고 TCE DARPin® 단백질 #32에 대해서는 68개의 특유의 인간 펩티드 서열을 확인시켜 주었다. 이들 수치는 천연 T-세포 수용체에 대해 이전에 보고된 값과 비견된다.
결론적으로, 역시 이들 데이터는 놀라울 정도로 많은 수의 펩티드 잔기가 NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질과 NY-ESO-1-9V(157 내지 165) 표적 펩티드 사이의 특이적 상호작용에 중요하다는 것을 나타낸다. 이는 설계된 안키린 반복 도메인에 의해 형성된 결합 표면과, 다른 결합 단백질, 예컨대 항체 및 T 세포 수용체(TCR)에 의해 형성된 결합 표면 사이에 구조적 차이를 반영할 수 있다.
더욱이, 이들 결과는 본 명세서에 기재된 펩티드-MHC(pMHC)-특이적 결합 단백질을 생성하는 방법이 pMHC 복합체, 예컨대 종양-특이적 또는 종양-관련 pMHC 복합체를 표적화하고, 유리한 특성을 갖는 결합 단백질의 효율적인 확인 및 특성화를 가능하게 한다는 것을 입증한다. 이 방법은 표적 pMHC 복합체에 대해 높은 친화도를 갖고 천연 또는 친화성-성숙된 T-세포 수용체와 비견되는 특이성 수준을 갖는 pMHC-특이적 결합 단백질을 효율적으로 생성할 수 있게 하는데, 이는, 낮은 수의 잠재적으로 교차-반응성인 펩티드가 X-스캔 및 시험관내 세포 검정에 의해 확인됨으로써 평가된 바와 같다.
실시예 11 : NYESOpMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 의한 면역 세포 활성화에 미치는 링커 길이의 영향
T 세포 인게이저(TCE) 포맷의 본 발명의 결합 단백질 내의 pMHC-특이적 결합 도메인과 CD3-특이적 결합제 사이의 링커의 길이가 TCE 포맷의 그러한 결합 단백질의 효력에 미치는 영향을 시험하기 위하여, 다양한 길이의 링커를 사용하여 CD3 결합 도메인에 연결된 NYESOpMHC 결합 도메인을 포함하는 상이한 작제물들을 상이한 종양 세포주들을 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다.
링커 길이 설계 및 약어
NYESOpMHC-특이적 결합 도메인으로서 DARPin® 단백질 #21 또는 DARPin® 단백질 #32를 포함하는 TCE 포맷의 하기 결합 단백질을 생성하였다:
[표 8]
Figure pct00014
[표 9]
Figure pct00015
T 세포 활성화 검정에서 TCE 포맷의 결합 단백질의 효력 및 특이성
상이한 링커들을 사용하여 생성된 TCE 포맷의 결합 단백질의 효력 및 특이성을 T 세포 활성화 검정에서 상이한 종양 세포주들을 사용하여 시험하였다. 종양 세포주들(IM9 및 U266B1) 중 일부는 NY-ESO-1을 내인적으로 발현하고, pMHC 복합체에서 NY-ESO-1 표적 펩티드를 그의 세포 표면 상에 제시한다. 다른 종양 세포주들(MCF7 및 Colo205)은 NY-ESO-1을 발현하지 않으며, 이에 따라 pMHC 복합체에서 NY-ESO-1 표적 펩티드를 그의 세포 표면 상에 제시하지 않는다.
T 세포 활성화 검정은 본질적으로 실시예 6에서 전술된 바와 같이 수행하였다. 따라서, 표적 종양 세포와 이펙터 PBMC를 5:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 합하고, TCE 포맷의 NYESOpMHC-특이적 안키린 반복 도메인(표 8에서의 작제물 참조)을 상이한 농도로 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포 상의 활성화 마커 CD25의 수준을 (CD25 단일클론 항체(BC96), PerCP-시아닌5.5, eBioscience™; 및 Alexa Fluor® 488 마우스 항-인간 CD8(BD Biosciences로부터 입수됨)을 사용하여) FACS에 의해 결정하였다. 대조군으로서, 표적 세포가 첨가되지 않은 것을 제외하고는, 이펙터 PBMC를 동일하게 처리하였다. 동일한 종양 세포 세트를 실시예 6에서와 같이 사용하였다.
결합 단백질의 존재 하에서 얻어진 T 세포 활성화 수준이 도 22 내지 도 25에 나타나 있다. 링커 길이가 감소함에 따라 향상된 효력이 관찰되었다. 최고의 효력은 최단 링커(XXS)를 사용하여 설계된 작제물에 대해 관찰되었으며, 두 번째의 최단 링커(XS)를 사용하여 설계된 작제물의 효력이 또한 더 긴 링커를 사용하여 설계된 작제물에 비해 강하게 향상되었다. 시험된 어떠한 세포주에 대해서도 비특이적 활성화 수준의 어떠한 증가도 관찰되지 않았다.
도 22에 나타낸 데이터로부터 얻어진 EC50 값이 하기 표 10에 열거되어 있다.
[표 10]
Figure pct00016
도 23에 나타낸 데이터로부터 얻어진 EC50 값이 하기 표 11에 열거되어 있다.
[표 11]
Figure pct00017
도 24에 나타낸 데이터로부터 얻어진 EC50 값이 하기 표 12에 열거되어 있다.
[표 12]
Figure pct00018
도 25에 나타낸 데이터로부터 얻어진 EC50 값이 하기 표 13에 열거되어 있다.
[표 13]
Figure pct00019
데이터로부터, TCE 포맷의 pMHC-특이적 결합 도메인의 경우, 바람직하게는 적어도 L 링커만큼 짧은, 더 바람직하게는 적어도 표준 링커만큼 짧은, 더 바람직하게는 적어도 S 링커만큼 짧은, 더 바람직하게는 적어도 XS 링커만큼 짧은, 더 바람직하게는 적어도 XXS 링커만큼 짧은, 그리고 가장 바람직하게는 XXS 링커만큼 짧거나 대략 그만큼 짧은 링커가 사용된다. 이 실시예에 제공된 특정 링커들은 바람직한 길이를 갖는 그러한 링커들의 예이다.
실시예 12 : EBNA-1 펩티드-MHC 복합체(EBNA1pMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
개요
리보솜 디스플레이(문헌[Hanes, J. and
Figure pct00020
, A., PNAS 94, 4937-42, 1997])를 사용하여, EBNA-1 펩티드-MHC 복합체(EBNA1pMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 안키린 반복 도메인을, 하기에 기재된 바와 같은 구체적인 조건 및 추가의 탈선택 단계를 가지면서 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 의해 기재된 것과 유사한 방식으로 DARPin® 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 EBNA1pMHC 및 다른 pMHC 복합체에 대해 선택된 클론들의 결합 및 특이성은 E. 콜라이 조 추출물 HTRF(균일 시간 분해 형광)에 의해 평가하였는데, 이는 다수의 EBNA1pMHC-특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 93 내지 110의 안키린 반복 도메인은 EBNA1pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. EBNA1pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 그러한 안키린 반복 도메인들로부터의 개별적인 안키린 반복 모듈들은, 예를 들어 서열 번호 111 내지 154에 제공되어 있다.
표적 및 선택 물질로서의 비오티닐화 pMHC 복합체의 생성
HLA-A*0201(서열 번호 73), 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m; 서열 번호 74), 및 EBNA-1(FMVFLQTHI; 서열 번호 92) 또는 서열 번호 19 또는 서열 번호 35의 NY-ESO-1 관련 펩티드의 펩티드들 중 하나의 3-부분 복합체를 확립된 프로토콜(문헌[Garboczi et al, 1992]; 문헌[Celie et al, 2009])에 따라 생성하였다. 링커(GSGGSGGSAGG; 서열 번호 75) 및 비오티닐화를 위한 Avi-태그(GLNDIFEAQKIEWHE; 서열 번호 76; 문헌[Fairhead & Howarth, 2015])를 포함하는 코돈-최적화된 HLA-A*0201(HLA-A*0201avi; 서열 번호 77) 및 야생형 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m)을 봉입체(IB)로서 37℃에서 E. 콜라이 BL21(DE3)에서 발현시키고, IB 정제 후에 50 mM MES, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 8 M 우레아(pH 6.5) 중에 용해시켰다. HLA-A*0201avi 및 hβ2m 분자를 각각의 펩티드들의 존재 하에서 50 mM Tris(pH 8.3), 230 mM L-아르기닌, 3 mM EDTA, 255 μM GSSG; 2.5 mM GSH; 250 μM PMSF 중에서 500 mL 부피당 각각 25, 30 및 15 mg의 최종 농도로 재접힘하였다. 생성된 pMHC 복합체는 (1) 서열 번호 92의 EBNA-1 펩티드를 포함하는 EBNA1pMHC, (2) 서열 번호 19의 펩티드를 포함하는 NYESOpMHC, 및 (3) 서열 번호 35의 펩티드를 포함하는 NYESOAAPMHC였다.
비오티닐화를 위하여, 샘플을 7.5 mL의 부피로 농축시키고, 완충액을 PD10 컬럼을 사용하여 100 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2(pH 7.5)로 교환하였다. HLA-A*0201avi를 5 mM ATP, 400 μM 비오틴, 200 μM PMSF 및 20 ㎍ BirA 효소를 첨가함으로써 비오티닐화하였다. BirA는 문헌[Shen et al, 2009]에 기재된 절차에 따라 사내에서 생성하였다. 재접힘된 3-부분 비오티닐화 복합체를 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤이 보충된 PBS 중에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 HiLoad 16/600)를 사용하여 단리하였다. 샘플을 약 1 mg/mL로 농축시키고, 액체 질소에 의해 25 및 50 μL의 분취물로 급속-동결시켰다.
품질 제어 목적을 위하여, 25 ㎍의 비오티닐화 pMHC 복합체(비오틴-pMHC)를, 100 mM DTT를 첨가하거나 첨가하지 않고서 50 ㎍의 스트렙타비딘(IBA Lifesciences)과 인큐베이션하고, 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎍의 샘플을 분석용 크기 배제 크로마토그래피(GE Superdex 200 10/300 GL) 위로 전개시켰다. 비오티닐화 EBNA1pMHC, NYESOpMHC 및 NYESOAApMHC 복합체 모두는 Superdex 200 HiLoad 16/600 컬럼으로부터 약 82 mL의 최대 피크에서 용리되었다. 농축되고 해동된 급속-동결된 재접힘된 복합체의 SDS-PAGE 분석은 효율적인 비오티닐화를 나타내었는데, 그 이유는 HLA-A*0201avi가 스트렙타비딘에 거의 완전히 결합되었기 때문이다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피는 3-부분 pMHC 복합체의 이론적 MW에 가까운 겉보기 분자량(45 kD)에 상응하는 체류 부피에서 단일 피크들을 보여주었다.
리보솜 디스플레이에 의한 EBNA1pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택
pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택은, 표적으로서의 EBNA1pMHC 복합체, 전술된 바와 같은 안키린 반복 단백질들의 라이브러리, 및 확립된 프로토콜(예를 들어, 문헌[Zahnd, C., Amstutz, P. and
Figure pct00021
, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007] 참조)을 사용하여 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes and
Figure pct00022
, 인용된 곳에서 참조])에 의해 수행하였다. 매 선택 라운드 후마다 역전사(RT)-PCR 사이클의 횟수를 결합제의 풍부화로 인한 수율에 따라 조정하여 지속적으로 감소시켰다. 처음 4회의 라운드의 선택은, 라운드 1부터 라운드 4까지 선택압을 증가시키기 위해 표적 농도를 감소시키고 세척 엄격성을 증가시키는 것을 사용하는 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였지만(문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]), 통상적이지 않은 탈선택 단계를 포함시켰다.
리보솜 디스플레이 라운드 동안, 탈선택(또는 음성 선택) 단계를 포함시켰는데, 여기서는 3원 복합체를 다른 펩티드를 함유하는 상응하는 동종형 HLA 분자와 함께 사전-인큐베이션하고, 그리고 나서야 비로소 표적 EBNA1pMHC 복합체에 옮겨서, 공통 HLA-A 스캐폴드로부터 멀어져서 펩티드-매립된 에피토프를 향하는 안키린 반복 단백질의 직접 결합을 수행하였다. 다시 말하면, 매립된 펩티드에 의해 제공되는 특이적 에피토프에 결합하기보다는 pMHC 복합체의 공통 HLA-A 스캐폴드에 주로 결합하는 안키린 반복 단백질을 탈선택하기 위하여 탈선택(또는 음성 선택)을 수행하였다. 더욱이, 탈선택에 사용되는 매립된 펩티드에 의해 제공되는 에피토프와 교차-반응하는 안키린 반복 단백질을 또한 탈선택하였다. 여기서는, NYESOpMHC 복합체를 탈선택에 사용하였다.
상세히 설명하면, 탈선택 단계를 위하여, Nunc MaxiSorp 플레이트를 PBS 중 66 nM 뉴트라비딘의 100 μl 용액으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, MaxiSorp 96웰 마이크로플레이트를 웰당 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 300 μl의 PBST-BSA로 블로킹하고, 700 rpm으로 회전시킨 후, 탈선택 단계를 수행하였다. 웰을 비운 후에, PBST-BSA 중 50 nM 비오티닐화 pMHC 탈선택 표적 용액 100 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 700 rpm으로 회전시켰다. 이러한 인큐베이션 단계 동안, 리보솜 디스플레이 프로토콜에 따른 mRNA 시험관내 번역을 별도로 수행하였다. 시험관내 번역 및 3원 복합체(즉, mRNA, 리보솜, 및 번역된 안키린 반복 단백질)의 생성 직후에, pMHC-PBST-BSA 용액을 폐기하고, Nunc MaxiSorp 마이크로플레이트 웰을 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 마지막으로 BSA를 함유하는 Tris-세척 완충액(WBT-BSA)과 함께 인큐베이션하였다. 실제의 탈선택 단계 직전에는, WBT-BSA 용액을 폐기하고, 시험관내 번역 3원 복합체의 150 μl(1회째의 선택 라운드를 위해) 또는 100 μl(선택 라운드 2 내지 4를 위해)의 분취물을, 고정화된 탈선택 pMHC 복합체가 담긴 준비된 Nunc MaxiSorp 웰에 연속적으로 3회 옮기고, 4℃에서 20분 동안 3개의 웰 각각에서 인큐베이션하였다. 탈선택 과정의 종료 시점에서, 각각의 선택 풀의 모든 100 μl의 3원 복합체 분취물을 합하고, 전술된 바와 같이 실제의 표적 pMHC 복합체에 대한 선택에 따른 부피를 취하였다.
선택된 클론은 조 추출물 HTRF에 의해 나타나는 바와 같이 EBNA1pMHC 복합체에 특이적으로 결합한다
용액 상태의 EBNA1pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 개별적으로 선택된 안키린 반복 단백질을, 표준 프로토콜을 사용하여 안키린 반복 단백질-발현 에스케리키아 콜라이 세포의 조 추출물을 사용하여 균일 시간 분해 형광(HTRF) 검정에 의해 확인하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 선택된 안키린 반복 단백질 클론을 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 클로닝하고, E. 콜라이 XL1-블루(Stratagene) 내로 형질변환시키고, (1% 글루코스 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는) LB-한천 상에서 플레이팅하고, 이어서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 165 μl의 성장 배지(1% 글루코스 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB)가 담긴 96웰 플레이트 내로 픽킹하고(각각의 클론을 단일 웰 내로), 800 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 신선한 LB 배지 150 μl에 신선한 96-딥-웰 플레이트 내에서 8.5 μl의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 37℃ 및 850 rpm으로 120분 동안 인큐베이션한 후에, IPTG(0.5 mM 최종 농도)를 사용하여 발현을 유도하고, 6시간 동안 지속하였다. 플레이트의 원심분리에 의해 세포를 수합하고, 상층액을 폐기하고, 펠릿을 -20℃에서 하룻밤 동결시킨 후, 8.5 μl의 B-PERII(Thermo Scientific) 중에 재현탁시키고, 진탕하면서(600 rpm) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 160 μl의 PBS를 첨가하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다(15분 동안 3220 g).
각각의 용해된 클론의 추출물을, 384웰 플레이트의 웰에 20 nM(최종 농도) 비오티닐화 pMHC 복합체, 1:400(최종 농도)의 항-6His-D2 HTRF 항체 - FRET 수용체 접합체(Cisbio) 및 1:400(최종 농도)의 항-strep-Tb 항체 FRET 공여체 접합체(Cisbio)와 함께 PBSTB(0.1% Tween 20® 및 0.2% (w/v) BSA가 보충된 PBS(pH 7.4)) 중 1:200 희석물(최종 농도)로서 적용하고, 4℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. HTRF는 340 nm 여기 파장, 및 백그라운드 형광 검출을 위한 620 ±10 nm 방출 필터 및 특이적 결합에 대한 형광 신호를 검출하기 위한 665 ±10 nm 방출 필터를 사용하여 Tecan M1000 상에서 판독하였다.
각각의 용해된 클론의 추출물을 2개의 비오티닐화 pMHC 복합체, 즉 EBNA1pMHC 및 NYESOpMHC 각각에 대한 결합에 대해 시험하여, 표적 EBNA1pMHC 복합체에 대한 결합 및 특이성을 평가하였다. NYESOpMHC는 EBNA1pMHC와 구별되는 pMHC 복합체로서의 역할을 해서 EBNA1pMHC에 대한 높은 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 선택을 가능하게 하였다.
EBNA1pMHC에 대한 각각의 안키린 반복 단백질의 특이성을 계산하기 위하여, 표적 EBNA1pMHC에 대한 HTRF 신호 대 이와 구별되는 NYESOpMHC에 대한 HTRF 신호의 비를 결정하였다. 표적 EBNA1pMHC에 대해 NYESOpMHC보다 적어도 25배 더 높은 HTRF 신호를 발생시킨 모든 결합제를 특이적 히트로서 간주하고 서열분석을 위하여 취하였다. 놀랍게도, 그러한 조 세포 추출물 HTRF 분석에 의한 수백 개의 클론의 스크리닝은 EBNA1pMHC에 대한 특이성을 갖는 많은 상이한 안키린 반복 도메인들을 밝혀주었다. HLA 스캐폴드 및 짧은 펩티드를 포함하는 복합 에피토프 - 여기서는 단지 펩티드만이 특이적으로 결합되지 않는 다른 복합 에피토프와 상이함 - 에 대한 안키린 반복 단백질의 특이적 결합은 결코 이전에 밝혀진 적이 없으며, 항체 또는 TCR 기술을 사용하여 그러한 복합 에피토프에 대한 특이적 결합제를 개발하는 것은 어려운 문제였다.
실시예 13 : MAGE-A3 펩티드-MHC 복합체(MAGEA3pMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
개요
리보솜 디스플레이(문헌[Hanes, J. and
Figure pct00023
, A., PNAS 94, 4937-42, 1997])를 사용하여, MAGE-A3 펩티드-MHC 복합체(MAGEA3pMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 안키린 반복 도메인을, 하기에 기재된 바와 같은 구체적인 조건 및 추가의 탈선택 단계를 가지면서 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 의해 기재된 것과 유사한 방식으로 DARPin® 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 MAGEA3pMHC 및 다른 pMHC 복합체에 대해 선택된 클론들의 결합 및 특이성은 E. 콜라이 조 추출물 HTRF(균일 시간 분해 형광)에 의해 평가하였는데, 이는 다수의 MAGEA3pMHC-특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 156 내지 173의 안키린 반복 도메인은 MAGEA3pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. MAGEA3pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 그러한 안키린 반복 도메인들로부터의 개별적인 안키린 반복 모듈들은, 예를 들어 서열 번호 175 내지 217에 제공되어 있다.
표적 및 선택 물질로서의 비오티닐화 pMHC 복합체의 생성
HLA-A*0101(서열 번호 218), 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m; 서열 번호 74), 및 MAGE-A3(EVDPIGHLY; 서열 번호 155) 또는 Titin(ESDPIVAQY; 서열 번호 174)의 펩티드들 중 하나의 3-부분 복합체를 확립된 프로토콜(문헌[Garboczi et al, 1992]; 문헌[Celie et al, 2009])에 따라 생성하였다. 링커(GSGGSGGSAGG; 서열 번호 75) 및 비오티닐화를 위한 Avi-태그(GLNDIFEAQKIEWHE; 서열 번호 76; 문헌[Fairhead & Howarth, 2015])를 포함하는 코돈-최적화된 HLA-A*0101(HLA-A*0101avi; 서열 번호 219) 및 야생형 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m)을 봉입체(IB)로서 37℃에서 E. 콜라이 BL21(DE3)에서 발현시키고, IB 정제 후에 50 mM MES, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 8 M 우레아(pH 6.5) 중에 용해시켰다. HLA-A*0101avi 및 hβ2m 분자를 각각의 펩티드들의 존재 하에서 50 mM Tris(pH 8.3), 230 mM L-아르기닌, 3 mM EDTA, 255 μM GSSG; 2.5 mM GSH; 250 μM PMSF 중에서 500 mL 부피당 각각 25, 30 및 15 mg의 최종 농도로 재접힘하였다. 생성된 pMHC 복합체는 (1) 서열 번호 155의 MAGE-A3 펩티드를 포함하는 MAGEA3pMHC, 및 (2) 서열 번호 174의 Titin 펩티드를 포함하는 TITINpMHC였다.
비오티닐화를 위하여, 샘플을 7.5 mL의 부피로 농축시키고, 완충액을 PD10 컬럼을 사용하여 100 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2(pH 7.5)로 교환하였다. HLA-A*0101avi를 5 mM ATP, 400 μM 비오틴, 200 μM PMSF 및 20 ㎍ BirA 효소를 첨가함으로써 비오티닐화하였다. BirA는 문헌[Shen et al, 2009]에 기재된 절차에 따라 사내에서 생성하였다. 재접힘된 3-부분 비오티닐화 복합체를 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤이 보충된 PBS 중에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 HiLoad 16/600)를 사용하여 단리하였다. 샘플을 약 1 mg/mL로 농축시키고, 액체 질소에 의해 25 및 50 μL의 분취물로 급속-동결시켰다.
품질 제어 목적을 위하여, 25 ㎍의 비오티닐화 pMHC 복합체(비오틴-pMHC)를, 100 mM DTT를 첨가하거나 첨가하지 않고서 50 ㎍의 스트렙타비딘(IBA Lifesciences)과 인큐베이션하고, 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎍의 샘플을 분석용 크기 배제 크로마토그래피(GE Superdex 200 10/300 GL) 위로 전개시켰다. 비오티닐화 MAGEA3pMHC 및 TITINpMHC 복합체 둘 모두는 Superdex 200 HiLoad 16/600 컬럼으로부터 약 82 mL의 최대 피크에서 용리되었다. 농축되고 해동된 급속-동결된 재접힘된 복합체의 SDS-PAGE 분석은 효율적인 비오티닐화를 나타내었는데, 그 이유는 HLA-A*0101avi가 스트렙타비딘에 거의 완전히 결합되었기 때문이다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피는 3-부분 pMHC 복합체의 이론적 MW에 가까운 겉보기 분자량에 상응하는 체류 부피에서 단일 피크들을 보여주었다.
리보솜 디스플레이에 의한 MAGEA3pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택
pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택은, 표적으로서의 MAGEA3pMHC 복합체, 전술된 바와 같은 안키린 반복 단백질들의 라이브러리, 및 확립된 프로토콜(예를 들어, 문헌[Zahnd, C., Amstutz, P. and
Figure pct00024
, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007] 참조)을 사용하여 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes and
Figure pct00025
, 인용된 곳에서 참조])에 의해 수행하였다. 매 선택 라운드 후마다 역전사(RT)-PCR 사이클의 횟수를 결합제의 풍부화로 인한 수율에 따라 조정하여 지속적으로 감소시켰다. 처음 4회의 라운드의 선택은, 라운드 1부터 라운드 4까지 선택압을 증가시키기 위해 표적 농도를 감소시키고 세척 엄격성을 증가시키는 것을 사용하는 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였지만(문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]), 통상적이지 않은 탈선택 단계를 포함시켰다.
리보솜 디스플레이 라운드 동안, 탈선택(또는 음성 선택) 단계를 포함시켰는데, 여기서는 3원 복합체를 다른 펩티드를 함유하는 상응하는 동종형 HLA 분자와 함께 사전-인큐베이션하고, 그리고 나서야 비로소 표적 MAGEA3pMHC 복합체에 옮겨서, 공통 HLA-A 스캐폴드로부터 멀어져서 펩티드-매립된 에피토프를 향하는 안키린 반복 단백질의 직접 결합을 수행하였다. 다시 말하면, 매립된 펩티드에 의해 제공되는 특이적 에피토프에 결합하기보다는 pMHC 복합체의 공통 HLA-A 스캐폴드에 주로 결합하는 안키린 반복 단백질을 탈선택하기 위하여 탈선택(또는 음성 선택)을 수행하였다. 더욱이, 탈선택에 사용되는 매립된 펩티드에 의해 제공되는 에피토프와 교차-반응하는 안키린 반복 단백질을 또한 탈선택하였다. 여기서는, TITINpMHC 복합체를 탈선택에 사용하였다.
상세히 설명하면, 탈선택 단계를 위하여, Nunc MaxiSorp 플레이트를 PBS 중 66 nM 뉴트라비딘의 100 μl 용액으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, MaxiSorp 96웰 마이크로플레이트를 웰당 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 300 μl의 PBST-BSA로 블로킹하고, 700 rpm으로 회전시킨 후, 탈선택 단계를 수행하였다. 웰을 비운 후에, PBST-BSA 중 50 nM 비오티닐화 pMHC 탈선택 표적 용액 100 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 700 rpm으로 회전시켰다. 이러한 인큐베이션 단계 동안, 리보솜 디스플레이 프로토콜에 따른 mRNA 시험관내 번역을 별도로 수행하였다. 시험관내 번역 및 3원 복합체(즉, mRNA, 리보솜, 및 번역된 안키린 반복 단백질)의 생성 직후에, pMHC-PBST-BSA 용액을 폐기하고, Nunc MaxiSorp 마이크로플레이트 웰을 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 마지막으로 BSA를 함유하는 Tris-세척 완충액(WBT-BSA)과 함께 인큐베이션하였다. 실제의 탈선택 단계 직전에는, WBT-BSA 용액을 폐기하고, 시험관내 번역 3원 복합체의 150 μl(1회째의 선택 라운드를 위해) 또는 100 μl(선택 라운드 2 내지 4를 위해)의 분취물을, 고정화된 탈선택 pMHC 복합체가 담긴 준비된 Nunc MaxiSorp 웰에 연속적으로 3회 옮기고, 4℃에서 20분 동안 3개의 웰 각각에서 인큐베이션하였다. 탈선택 과정의 종료 시점에서, 각각의 선택 풀의 모든 100 μl의 3원 복합체 분취물을 합하고, 전술된 바와 같이 실제의 표적 pMHC 복합체에 대한 선택에 따른 부피를 취하였다.
선택된 클론은 조 추출물 HTRF에 의해 나타나는 바와 같이 MAGEA3pMHC 복합체에 특이적으로 결합한다
용액 상태의 MAGEA3pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 개별적으로 선택된 안키린 반복 단백질을, 표준 프로토콜을 사용하여 안키린 반복 단백질-발현 에스케리키아 콜라이 세포의 조 추출물을 사용하여 균일 시간 분해 형광(HTRF) 검정에 의해 확인하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 선택된 안키린 반복 단백질 클론을 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 클로닝하고, E. 콜라이 XL1-블루(Stratagene) 내로 형질변환시키고, (1% 글루코스 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는) LB-한천 상에서 플레이팅하고, 이어서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 165 μl의 성장 배지(1% 글루코스 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB)가 담긴 96웰 플레이트 내로 픽킹하고(각각의 클론을 단일 웰 내로), 800 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 신선한 LB 배지 150 μl에 신선한 96-딥-웰 플레이트 내에서 8.5 μl의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 37℃ 및 850 rpm으로 120분 동안 인큐베이션한 후에, IPTG(0.5 mM 최종 농도)를 사용하여 발현을 유도하고, 6시간 동안 지속하였다. 플레이트의 원심분리에 의해 세포를 수합하고, 상층액을 폐기하고, 펠릿을 -20℃에서 하룻밤 동결시킨 후, 8.5 μl의 B-PERII(Thermo Scientific) 중에 재현탁시키고, 진탕하면서(600 rpm) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 160 μl의 PBS를 첨가하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다(15분 동안 3220 g).
각각의 용해된 클론의 추출물을, 384웰 플레이트의 웰에 20 nM(최종 농도) 비오티닐화 pMHC 복합체, 1:400(최종 농도)의 항-6His-D2 HTRF 항체 - FRET 수용체 접합체(Cisbio) 및 1:400(최종 농도)의 항-strep-Tb 항체 FRET 공여체 접합체(Cisbio)와 함께 PBSTB(0.1% Tween 20® 및 0.2% (w/v) BSA가 보충된 PBS(pH 7.4)) 중 1:200 희석물(최종 농도)로서 적용하고, 4℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. HTRF는 340 nm 여기 파장, 및 백그라운드 형광 검출을 위한 620 ±10 nm 방출 필터 및 특이적 결합에 대한 형광 신호를 검출하기 위한 665 ±10 nm 방출 필터를 사용하여 Tecan M1000 상에서 판독하였다.
각각의 용해된 클론의 추출물을 2개의 비오티닐화 pMHC 복합체, 즉 MAGEA3pMHC 및 TITINpMHC 각각에 대한 결합에 대해 시험하여, 표적 MAGEA3pMHC 복합체에 대한 결합 및 특이성을 평가하였다. TITINpMHC는 MAGEA3pMHC와 구별되는 pMHC 복합체로서의 역할을 해서 MAGEA3pMHC에 대한 높은 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 선택을 가능하게 하였다.
MAGEA3pMHC에 대한 각각의 안키린 반복 단백질의 특이성을 계산하기 위하여, 표적 MAGEA3pMHC에 대한 HTRF 신호 대 이와 구별되는 TITINpMHC에 대한 HTRF 신호의 비를 결정하였다. 표적 MAGEA3pMHC에 대해 TITINpMHC보다 적어도 25배 더 높은 HTRF 신호를 발생시킨 모든 결합제를 특이적 히트로서 간주하고 서열분석을 위하여 취하였다. 놀랍게도, 그러한 조 세포 추출물 HTRF 분석에 의한 수백 개의 클론의 스크리닝은 MAGEA3pMHC에 대한 특이성을 갖는 많은 상이한 안키린 반복 도메인들을 밝혀주었다. HLA 스캐폴드 및 짧은 펩티드를 포함하는 복합 에피토프 - 여기서는 단지 펩티드만이 특이적으로 결합되지 않는 다른 복합 에피토프와 상이함 - 에 대한 안키린 반복 단백질의 특이적 결합은 결코 이전에 밝혀진 적이 없으며, 항체 또는 TCR 기술을 사용하여 그러한 복합 에피토프에 대한 특이적 결합제를 개발하는 것은 어려운 문제였다.
실시예 14 : 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 MAGEA3pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 해리 상수(K D )의 결정
MAGEA3pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이 면역 세포 인게이저 포맷으로 기능하고 그러한 포맷에서 MAGEA3pMHC에 결합하는 능력을 시험하기 위하여, 선택된 안키린 반복 도메인을 통상적인 클로닝 방법을 사용하여, 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 유전자적으로 연결하였다. 이 절차에 의해, MAGEA3pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 결합 단백질을 생성하였다. 이들 단백질은 통상적인 크로마토그래피 방법으로 정제하였다.
MAGEA3pMHC 표적에 대한 정제된 안키린 반복 단백질의 결합 친화도를 ProteOn 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기기(BioRad)를 사용하여 분석하고, 당업자에게 알려진 표준 절차에 따라 측정을 수행하였다.
당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 추정된 결합 속도 및 해리 속도로부터 해리 상수(KD)를 계산하였다. 선택된 안키린 반복 단백질과 MAGEA3pMHC의 결합 상호작용의 KD 값은 대개 낮은 나노몰 범위 또는 그 이하인 것으로 결정되었다. 이들 선택된 안키린 반복 단백질의 어느 것도 대조 펩티드와의 측정가능한 결합 상호작용을 나타내지 않았다. 대조군으로서, Titin 펩티드-MHC에 대한 결합을 동시에 시험하였다. Titin 펩티드-MHC에 대한 어떠한 유의한 결합도 검출되지 않았는데, 이는 결합의 특이성을 입증한다. 표 14는 예로서 일부 선택된 안키린 반복 단백질의 KD 값을 제공한다.
[표 14]
Figure pct00026
실시예 15 : HBVc18 펩티드-MHC 복합체(HBVc18pMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
개요
리보솜 디스플레이(문헌[Hanes, J. and
Figure pct00027
, A., PNAS 94, 4937-42, 1997])를 사용하여, HBVc18 펩티드-MHC 복합체(HBVc18pMHC)에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 안키린 반복 도메인을, 하기에 기재된 바와 같은 구체적인 조건 및 추가의 탈선택 단계를 가지면서 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 의해 기재된 것과 유사한 방식으로 DARPin® 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 HBVc18pMHC 및 다른 pMHC 복합체에 대해 선택된 클론들의 결합 및 특이성은 E. 콜라이 조 추출물 HTRF(균일 시간 분해 형광)에 의해 평가하였는데, 이는 다수의 HBVc18pMHC-특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 220 내지 230의 안키린 반복 도메인은 HBVc18pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. HBVc18pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 그러한 안키린 반복 도메인들로부터의 개별적인 안키린 반복 모듈들은, 예를 들어 서열 번호 231 내지 254에 제공되어 있다.
표적 및 선택 물질로서의 비오티닐화 pMHC 복합체의 생성
HLA-A*0201(서열 번호 73), 인간 베타-2-마이크로글로불린(hβ2m; 서열 번호 74), 및 표 15에 열거된 펩티드들 중 하나의 비오티닐화 3-부분 복합체를 확립된 프로토콜(문헌[Garboczi et al, 1992]; 문헌[Celie et al, 2009])에 따라 생성하였다.
[표 15]
Figure pct00028
HBVc18 펩티드와 상동성을 갖는 아미노산은 밑줄이 그어져 있다.
실험에 사용된 모든 pMHC 복합체는 사전 품질 제어 시험을 거쳤다.
리보솜 디스플레이에 의한 HBVc18pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택
pMHC-특이적 안키린 반복 단백질의 선택은, 표적으로서의 HBVc18pMHC 복합체, 전술된 바와 같은 안키린 반복 단백질들의 라이브러리, 및 확립된 프로토콜(예를 들어, 문헌[Zahnd, C., Amstutz, P. and
Figure pct00029
, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007] 참조)을 사용하여 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes and
Figure pct00030
, 인용된 곳에서 참조])에 의해 수행하였다. 매 선택 라운드 후마다 역전사(RT)-PCR 사이클의 횟수를 결합제의 풍부화로 인한 수율에 따라 조정하여 지속적으로 감소시켰다. 처음 4회 또는 5회의 라운드의 선택은, 라운드 1부터 라운드 4까지 선택압을 증가시키기 위해 표적 농도를 감소시키고 세척 엄격성을 증가시키는 것을 사용하는 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였다(문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]). 통상적이지 않은 탈선택 단계를 하기에 기재된 바와 같이 선택 전략 내로 포함시켰다.
리보솜 디스플레이 라운드 동안, 탈선택(또는 음성 선택) 단계를 포함시켰는데, 여기서는 3원 복합체를 다른 펩티드를 함유하는 상응하는 동종형 HLA 분자와 함께 사전-인큐베이션하고, 그리고 나서야 비로소 표적 HBVc18pMHC 복합체에 옮겨서, 공통 HLA-A 스캐폴드로부터 멀어져서 펩티드-매립된 에피토프를 향하는 안키린 반복 단백질의 직접 결합을 수행하였다. 다시 말하면, 매립된 펩티드에 의해 제공되는 특이적 에피토프에 결합하기보다는 pMHC 복합체의 공통 HLA-A 스캐폴드에 주로 결합하는 안키린 반복 단백질을 탈선택하기 위하여 탈선택(또는 음성 선택)을 수행하였다. 더욱이, 탈선택에 사용되는 매립된 펩티드에 의해 제공되는 에피토프와 교차-반응하는 안키린 반복 단백질을 또한 탈선택하였다. 여기서는, 펩티드 HBe183(FLLTRILTI), HBe183mut(FLLRILTI), EBNA-1(FMVFLQTHI) 및 NY-ESO-1(SLLMWITQV)을 탈선택에 사용하였다.
상세히 설명하면, Nunc MaxiSorp 플레이트를 PBS 중 66 nM 뉴트라비딘의 100 μl 용액으로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, MaxiSorp 96웰 마이크로플레이트를 웰당 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 300 μl의 PBST-BSA로 블로킹하고, 700 rpm으로 회전시킨 후, 탈선택 단계를 수행하였다. 웰을 비운 후에, PBST-BSA 중 50 nM 비오티닐화 pMHC 탈선택 표적 용액 100 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 700 rpm으로 회전시켰다. 이러한 인큐베이션 단계 동안, mRNA 시험관내 번역을 수행하였다. 3원 복합체 믹스의 번역 및 생성 직후에, pMHC-PBST-BSA 용액을 폐기하고, Nunc MaxiSorp 마이크로플레이트 웰을 300 μl의 PBST로 3회 세척하고, 마지막으로 WBT-BSA와 함께 인큐베이션하였다. 실제의 탈선택 단계를 위하여, WBT-BSA 용액을 폐기하고, 번역된 3원 복합체의 100 μl(선택 라운드 2 내지 5 각각을 위해), 150 μl(1회째의 선택 라운드를 위해)의 분취물을, 고정화된 탈선택 pMHC 표적이 담긴 준비된 Nunc MaxiSorp 웰에 후속으로 3회 옮기고, 4℃에서 20분 동안 3개의 웰 각각에서 인큐베이션하였다. 탈선택 과정의 종료 시점에서, 각각의 선택 풀의 100 μl의 3원 복합체 분취물을 합하고, 실제의 표적에 대한 선택에 따른 부피를 취하였다.
4회째 및 5회째의 리보솜 디스플레이 선택 라운드 후에, 풀들을 BamHI 및 PstI를 사용하여 세균 발현 벡터 내로 클로닝하고, E. 콜라이 XL-1 블루 내로 형질전환시키고, LB/Glu/Amp 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다.
선택된 클론은 조 추출물 HTRF에 의해 결정된 바와 같이 HBVc18pMHC 복합체에 특이적으로 결합한다(데이터는 도시되지 않음).
더욱이, 단백질은 통상적인 크로마토그래피 방법으로 정제하였다.
실시예 16 : 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 HBVc18pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 해리 상수(K D )의 결정
HBVc18pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이 면역 세포 인게이저 포맷으로 기능하고 그러한 포맷에서 HBVc18pMHC에 결합하는 능력을 시험하기 위하여, 선택된 안키린 반복 도메인을 통상적인 클로닝 방법을 사용하여, 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제에 유전자적으로 연결하였다. 이 절차에 의해, HBVc18pMHC에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 결합 단백질을 생성하였다. 이들 단백질은 통상적인 크로마토그래피 방법으로 정제하였다.
HBVc18pMHC 표적에 대한 정제된 안키린 반복 단백질의 결합 친화도를 ProteOn 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기기(BioRad)를 사용하여 분석하고, 당업자에게 알려진 표준 절차에 따라 측정을 수행하였다.
당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 추정된 결합 속도 및 해리 속도로부터 해리 상수(KD)를 계산하였다. 선택된 안키린 반복 단백질과 HBVc18pMHC의 결합 상호작용의 KD 값은 낮은 나노몰 범위 또는 그 이하인 것으로 결정되었다. 이들 선택된 안키린 반복 단백질의 어느 것도 대조 펩티드와의 측정가능한 결합 상호작용을 나타내지 않았다. 표 16은 예로서 일부 선택된 안키린 반복 단백질의 KD 값을 제공한다.
[표 16]
Figure pct00031
실시예 17 : 단백질 변이체의 마우스 약동학적 프로파일
본 실시예는 개선된 약동학적 프로파일로 이어지는 설계된 안키린 반복 도메인에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 놀랍게도, 설계된 안키린 반복 도메인에 소정의 아미노산 돌연변이를 적용함으로써 약동학적 특성이 조절될 수 있다는 것을 알아내었다.
단백질의 발현 및 정제
서열 번호 281 내지 325로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인 각각을 인코딩하는 DNA를, 하기에 기재된 바와 같이 단순 단백질 정제를 용이하게 하도록 N-말단 His-태그를 제공하는 pQE(QIAgen, 독일 소재) 기반 발현 벡터 내로 클로닝하였다. N-말단에 융합된 His-태그(서열 번호 326)를 추가로 갖는 서열 번호 281 내지 325로 이루어진 단백질을 E. 콜라이에서 생성하고, 균일하게 정제하고, PBS 완충액 중에 저장하였다. 단백질의 생성 및 정제 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단백질 #281 내지 #325는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인으로 이루어지며, 이들 중 하나는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
대안적으로, N-말단에 아미노산 GS를 추가로 갖는 서열 번호 281 내지 325로 이루어진 단백질을 E. 콜라이에서 생성하고, 균일하게 정제하고, PBS 완충액 중에 저장한다. 아미노산 GS가 N-말단에 있는 경우에, 발현 벡터에 의해 추가로 인코딩되는 Met 잔기는 발현된 폴리펩티드로부터 E. 콜라이의 세포질 중에서 효율적으로 절단되는데, 이는 출발 Met 뒤에 작은 Gly 잔기가 뒤따르기 때문이다. N-말단에 아미노산 GS를 추가로 갖는 서열 번호 281 내지 325로 이루어진 단백질은 하기에 기재된 약동학적 프로파일링 실험에서 N-말단에 융합된 His-태그(서열 번호 326)를 추가로 갖는 서열 번호 281 내지 325로 이루어진 단백질과 동등한 결과를 나타낸다.
마우스 약동학적 프로파일 측정
전술된 바와 같이 생성된 단백질 #281 내지 #295를 사용하여 암컷 Balb/c 마우스에서 약동학적 분석을 수행하였다. 단백질을 정맥내 주사에 의해 꼬리 정맥 내로 1 mg/㎏으로 적용하였다. 각각의 단백질에 대해 6 마리의 마우스를 사용하였는데, 이들은 각각 3 마리씩의 마우스로 된 2개의 군으로 나누었다. 모든 단백질에 대해, 하나의 군의 마우스로부터는 주사 후 5분째, 24시간째, 72시간째, 및 168시간째에, 그리고 다른 군의 마우스로부터는 주사 후 6시간째, 48시간째, 96시간째, 및 168시간째에 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 실온에서 정치되게 하고 원심분리하여 당업자에게 잘 알려진 절차를 사용하여 혈청을 생성한 후, 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 포획 시약으로서 토끼 단일클론 항-DARPin 항체를 그리고 검출 시약으로서 항-RGS-His 항체-HRP 접합체를 사용하고 표준 곡선을 사용하여, 샌드위치 ELISA에 의해 단백질 #281 내지 #295의 혈청 농도를 결정하였다. 당업자에게 잘 알려진 통상적인 토끼 면역화 및 하이브리도마 생성 기법을 사용하여 단일클론 항-DARPin 항체를 생성하고, 농도 결정 실험 전에 단백질 #281 내지 #295에 대한 단일클론 항체의 결합을 검증하였다. 간략하게 말하면, 웰당 PBS 중 염소-항-토끼 항체(10 nM)(Thermo Scientific) 100 μl를 4℃에서 하룻밤 Maxisorp 플레이트(Nunc, 덴마크 소재)에서 고정화하였다. 300 μl의 PBST(0.1% Tween 20이 보충된 PBS)를 사용하여 5회 세척 후, 웰을 Titramax 1000 진탕기(Heidolph, 독일 소재) 상에서 450 rpm으로 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 300 μl의 PBST-C(0.25% 카제인이 보충된 PBST)로 블로킹하였다. 전술된 바와 같이 5회 세척 후, PBST-C 중 토끼-항-DARPin 항체(5 nM) 100 μl/웰을 450 rpm으로 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 전술된 바와 같이 5회 세척 후, PBST-C 중에 희석된, 혈청 샘플 또는 표준 참조물의 상이한 희석물들을 450 rpm으로 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 전술된 바와 같이 5회 세척 후, PBST-C 중 마우스 항-RGS-His 항체-HRP 접합체(QIAgen)(100 ng/ml) 50 μl를 450 rpm으로 진탕하면서 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 전술된 바와 같이 5회 세척 후에, 50 μl TMB 기질을 사용하여 ELISA를 전개하였다. 100 μl의 1 M H2SO4를 사용하여 5분 후에 반응을 정지시켰다. 이어서, OD(OD 450 nm - OD 620 nm)를 기록하였다. 모두 당업자에게 잘 알려진, Phoenix WinNonLin(미국 프린스턴 소재의 Certara) 또는 GraphPadPrism(미국 라호이아 소재의 GraphPad Software)과 같은 표준 소프트웨어, 및 비구획 분석과 같은 표준 분석을 사용하여 약동학적 파라미터를 결정하였다. 얻어진 약동학적 프로파일이 도 26에 나타나 있다. 이들 측정으로부터 도출된 약동학적 파라미터인 곡선 아래 면적, 제거율(clearance), 분포 부피, 및 반감기가 각각 표 177, 표 188, 표 1919, 및 표 2020에 열거되어 있다.
[표 17]
Figure pct00032
[표 18]
Figure pct00033
[표 19]
Figure pct00034
[표 20]
Figure pct00035
이들 조사결과는 본 명세서에 기재된 서열 변형이 개선된 약동학적 특성으로 이어진다는 것을 나타낸다. 구체적으로는, 단백질 #282 및 #283은 단백질 #281보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 또한, 단백질 #285, #286 및 #287은 단백질 #284보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 유사하게, 단백질 #289, #290 및 #291은 단백질 #288보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 그리고, 단백질 #293, #294 및 #295는 단백질 #292보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다.
단백질 #296 내지 단백질 #310의 마우스 약동학적 파라미터를 비교할 때 유사한 결과가 얻어진다. 구체적으로는, 단백질 #297 및 #298은 단백질 #296보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 또한, 단백질 #300, #301 및 #302는 단백질 #299보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 유사하게, 단백질 #304, #305 및 #306은 단백질 #303보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 그리고, 단백질 #308, #309 및 #310은 단백질 #307보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 마찬가지로, 단백질 #311 내지 단백질 #325의 마우스 약동학적 파라미터를 비교할 때 유사한 결과가 얻어진다. 구체적으로는, 단백질 #312 및 #313은 단백질 #311보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 또한, 단백질 #315, #316 및 #317은 단백질 #314보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 유사하게, 단백질 #319, #320 및 #321은 단백질 #318보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 그리고, 단백질 #323, #324 및 #325는 단백질 #322보다 더 느린 제거율, 더 큰 곡선 아래 면적, 및 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 따라서, 마우스에서 단백질의 약동학적 특성에 대한 서열 변형의 효과는, 반감기 연장을 위한 수단으로서 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상이한 설계된 안키린 반복 도메인들을 사용할 때 관찰된다. 따라서, 마우스에서 단백질의 약동학적 특성에 대한 서열 변형의 효과는 또한 상이한 링커 서열들(예를 들어, Gly-Ser-풍부 링커 대신 Pro-Thr-풍부 링커)을 사용할 때 관찰된다.
SEQUENCE LISTING <110> Molecular Partners AG <120> RECOMBINANT PEPTIDE-MHC COMPLEX BINDING PROTEINS AND THEIR GENERATION AND USE <130> AC2398 PCT S3 <150> EP20 18 1234.4 <151> 2020-06-19 <150> EP20 16 1059.9 <151> 2020-03-04 <150> EP19 21 5433.4 <151> 2019-12-11 <150> EP19 21 5434.2 <151> 2019-12-11 <150> EP19 21 5435.9 <151> 2019-12-11 <150> EP19 21 5436.7 <151> 2019-12-11 <160> 326 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT-rich peptide linker <400> 1 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT-rich peptide linker <400> 2 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr 20 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus GS linker <220> <221> VARIANT <222> 1..5 <223> [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, wherein n is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag <400> 4 Met Arg Gly Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 5 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 6 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 7 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-Cap <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 8 Gly Ser Asp Leu Gly Xaa Lys Leu Leu Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized repeat module <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 9 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized repeat module <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 10 Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized repeat module <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 11 Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 12 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 12 Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Asn Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 20 25 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 13 Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly 1 5 10 15 His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 20 25 <210> 14 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 14 Gln Asp Ser Ser Gly Phe Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Val Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 20 25 <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 15 Gln Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 20 25 <210> 16 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 16 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Lys His 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly 145 150 155 160 Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro 165 170 175 Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala 180 185 190 Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Phe Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Ser Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His 245 250 255 Val Ala Ala Lys His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys 260 265 270 Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Phe Thr Pro Leu 275 280 285 His Leu Ala Ala Gln Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu 290 295 300 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro 305 310 315 320 Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu 325 330 335 Gln Lys Ala Ala 340 <210> 17 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 17 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Ser Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Val Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ser Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 100 105 110 Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly 145 150 155 160 Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro 165 170 175 Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala 180 185 190 Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Phe Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Ser Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His 245 250 255 Val Ala Ala Lys His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys 260 265 270 Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Phe Thr Pro Leu 275 280 285 His Leu Ala Ala Gln Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu 290 295 300 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro 305 310 315 320 Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu 325 330 335 Gln Lys Ala Ala 340 <210> 18 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 18 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Lys His 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly 145 150 155 160 Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro 165 170 175 Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala 180 185 190 Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Phe Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His 245 250 255 Val Ala Ala Leu Tyr Gly His Leu Val Ile Val Glu Val Leu Leu Lys 260 265 270 Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Ala Gly Glu Thr Pro Leu 275 280 285 His Leu Ala Ala Phe Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu 290 295 300 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro 305 310 315 320 Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu 325 330 335 Gln Lys Ala Ala 340 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 target peptide <400> 19 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 20 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 20 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Ser Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Val Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ser Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 100 105 110 Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 21 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 21 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Lys His 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Leu Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 22 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 22 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Val Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Lys Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe 100 105 110 Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 23 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 23 Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Asn Ser Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Lys Ala Ala Glu Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Lys Gly His Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Phe 100 105 110 Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 24 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 24 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Phe Tyr Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Thr Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Arg Ala Ala Thr His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Trp Gly Thr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ile Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Glu Gln Gly Asn Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Val 100 105 110 Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 25 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 25 Gly Ser Asp Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ser Ala Ala Ile Arg Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ile His Gly His Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Gln Phe Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Glu Glu Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Val 100 105 110 Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 26 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 26 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Phe Ala Ala Phe Ile Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Tyr Gly His Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Gln His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ile Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp His Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 27 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 27 Gly Ser Asp Leu Gly Phe Lys Leu Leu Gln Ala Ala His Tyr Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His His Ala Ala Leu Lys Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Phe Gly Thr Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Ile Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ser Ser Gly Phe Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 28 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 28 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Lys Ala Ala Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Asp Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Gln Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Thr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp His Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ala Ala Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Glu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 29 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 29 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Arg Ala Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ala Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 30 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 30 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Arg Phe Gly Ile Pro Leu His Ile Ala Ala Ser Gln Gly His 35 40 45 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 50 55 60 Lys Asp His Trp Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Phe Gly 65 70 75 80 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 85 90 95 Ala Lys Asp His Thr Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Leu 100 105 110 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 115 120 125 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 130 135 140 Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 31 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 31 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ala Thr Gly Gln Thr Pro Leu His Val Ala Ala Phe Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Ala 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile 100 105 110 Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 32 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 32 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Gln Leu Gly His 35 40 45 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 50 55 60 Lys Asp Tyr Gln Gly His Thr Pro Leu His Val Asp Ala Phe His Gly 65 70 75 80 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Trp Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Trp 100 105 110 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 115 120 125 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 130 135 140 Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 33 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 33 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ala Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ala Tyr Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe 100 105 110 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> NY-ESO-1 target peptide <400> 34 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 modified peptide <400> 35 Ser Leu Leu Ala Ala Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Eppstein Barr Virus <220> <223> EBNA-1 peptide <400> 36 Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile 1 5 <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 37 Lys Asp Gln Ser Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 38 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 38 Lys Asp Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Val Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 39 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 39 Lys Asp Ser Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 40 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 40 Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 41 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 41 Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Lys His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 42 Lys Asp Leu Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 43 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 43 Lys Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 44 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 44 Lys Asp Val Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Leu Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Val Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 45 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 45 Lys Asp Lys Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 46 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 46 Lys Asp Glu Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Lys Ala Ala Glu Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 47 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 47 Lys Asp Val Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 48 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 48 Lys Asp Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Arg Ala Ala Thr His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 49 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 49 Lys Asp Glu Trp Gly Thr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ile Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 50 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 50 Lys Asp Ile His Gly His Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Gln Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 51 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 51 Lys Asp Phe Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 52 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 52 Lys Asp Glu Tyr Gly His Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Gln His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 53 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 53 Lys Asp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ile Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 54 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 54 Lys Asp Glu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His His Ala Ala Leu Lys Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 55 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 55 Lys Asp Glu Phe Gly Thr Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Ile Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 56 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 56 Lys Asp Tyr Gln Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 57 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 57 Lys Asp His Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 58 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 58 Lys Asp Arg Ala Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 59 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 59 Lys Asp Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 60 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 60 Lys Asp His Ala Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 61 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 61 Lys Asp Arg Phe Gly Ile Pro Leu His Ile Ala Ala Ser Gln Gly His 1 5 10 15 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 62 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 62 Lys Asp His Trp Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 63 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 63 Lys Asp His Thr Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Leu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 64 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 64 Lys Asp Ala Thr Gly Gln Thr Pro Leu His Val Ala Ala Phe Arg Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 65 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 65 Lys Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 66 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 66 Lys Asp His Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Leu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 67 Lys Asp Tyr Phe Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Gln Leu Gly His 1 5 10 15 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 68 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 68 Lys Asp Tyr Gln Gly His Thr Pro Leu His Val Asp Ala Phe His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 69 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 69 Lys Asp Gln Trp Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 70 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 70 Lys Asp Ala Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 71 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 71 Lys Asp Val Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 72 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 72 Lys Asp Ala Tyr Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Gln Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 73 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-A*0201 <400> 73 Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro 1 5 10 15 Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr 20 25 30 Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro 35 40 45 Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu 50 55 60 Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val 85 90 95 Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys 115 120 125 Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr 130 135 140 Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly 165 170 175 Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His 180 185 190 His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser 195 200 205 Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp 210 215 220 Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly 225 230 235 240 Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln 245 250 255 Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr 260 265 270 Leu Arg Trp Glu Pro 275 <210> 74 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> beta-2-microglobulin <400> 74 Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala 1 5 10 15 Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His 20 25 30 Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu 35 40 45 Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 50 55 60 Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp 85 90 95 Asp Arg Asp Met 100 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 75 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avi-tag <400> 76 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 77 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A*0201avi <400> 77 Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro 1 5 10 15 Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr 20 25 30 Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro 35 40 45 Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu 50 55 60 Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val 85 90 95 Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys 115 120 125 Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr 130 135 140 Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly 165 170 175 Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His 180 185 190 His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser 195 200 205 Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp 210 215 220 Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly 225 230 235 240 Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln 245 250 255 Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr 260 265 270 Leu Arg Trp Glu Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly 275 280 285 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 290 295 300 <210> 78 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 78 gacctgggta aaaaactgct gcaagcagca cgtgcaggtc agctggatga agttcgtgaa 60 ctgctgaaag caggcgccga tgttaatgca aaagatcagt ctggcgctac cccgctgcat 120 ctggctgctt tccgtggtca cctggaaatt gttgaagttc tgctgaaagc cggtgcagat 180 gttaatgcaa aagatgctgc tggctacacc ccgctgcata tcgctgctgt gtacggtcac 240 ctggaaattg ttgaagttct gctgaaagcc ggtgcagatg ttaatgcaaa agattctgct 300 ggcgaaaccc cgctgcatct ggctgcttac gctggtcacc tggaaattgt tgaagttctg 360 ctgaaagccg gtgcagatgt taacgcacag gataaaagcg gtaaaacccc tgccgatctg 420 gcagctcgcg ccggtcatca agatattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471 <210> 79 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 79 gacctgggta aaaaactgct gcaagcagca cgtgcaggtc agctggatga agttcgtgaa 60 ctgctgaaag caggcgccga tgttaatgca aaagatctga tcggcgtgac cccgctgcat 120 ctggctgctt tctctggtca cctggaaatt gttgaagttc tgctgaaagc cagtgcagat 180 gttaatgcaa aagatgtgtc tggcagaacc ccgctgcatg tggctgctaa gcacggtcac 240 ctggaaattg ttgaagttct gctgaaagcc ggtgcagatg ttaatgcaaa agatctgatc 300 ggcttcaccc cgctgcatct ggctgctcaa ttcggtcacc tggaaattgt tgaagttctg 360 ctgaaagccg gtgcagatgt taacgcacag gataaaagcg gtaaaacccc tgccgatctg 420 gcagctcgcg ccggtcatca agatattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471 <210> 80 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding ankyrin repeat domain specific for NY-ESO-1 pMHC <400> 80 gacctgggta aaaaactgct gcaagcagca cgtgcaggtc agctggatga agttcgtgaa 60 ctgctgaaag caggcgccga tgttaatgca aaagattact tcggctctac cccgctgcat 120 cttgctcaac tgggtcacct ggaaattgtt gaagttctgc tgaaagccgg tgcagatgtt 180 aatgcaaaag attaccaagg ccacaccccg ctgcatgtgg atgctttcca cggtcacctg 240 gaaattgttg aagttctgct gaaagccggt gcagatgtta atgcaaaaga tcaatggggc 300 gtgaccccgc tgcatctggc tgctgagtgg ggtcacctgg aaattgttga agttctgctg 360 aaagccggtg cagatgttaa cgcacaggat aaaagcggta aaacccctgc cgatctggca 420 gctcgcgccg gtcatcaaga tattgctgaa gtgctgcaga aggcagcg 468 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 81 Ala Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 82 Ser Leu Ala Met Trp Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 83 Ser Leu Leu Ala Trp Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 84 Ser Leu Leu Met Ala Ile Thr Gln Val 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 85 Ser Leu Leu Met Trp Ala Thr Gln Val 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 86 Ser Leu Leu Met Trp Ile Ala Gln Val 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (Valine-modified and alanine-mutated) <400> 87 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Ala Val 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1 peptide (alanine-mutated) <400> 88 Ser Ala Leu Met Trp Ile Thr Gln Ala 1 5 <210> 89 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA-specific ankyrin repeat domain <400> 89 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 90 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA-specific ankyrin repeat domain <400> 90 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 91 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA-specific ankyrin repeat domain <400> 91 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 4 <220> <223> EBNA-1 peptide <400> 92 Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile 1 5 <210> 93 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 93 Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Phe Ala Ala Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Thr Ile Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala His Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ile Tyr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Thr Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Val 100 105 110 Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 94 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 94 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Lys Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Leu Lys Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Glu Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 95 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 95 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Arg Ala Ala Gln Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Val Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Trp Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp His Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Glu Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Leu Ala Gly Arg Ala Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Glu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 96 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 96 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Trp Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Leu Leu Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 97 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 97 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Asp Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Thr Trp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Leu Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Val 65 70 75 80 Gly Pro Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Gln His Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala 100 105 110 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 98 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 98 Gly Ser Asp Leu Gly Asp Lys Leu Leu Phe Ala Ala Glu Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ser Phe Gly Gln Thr Pro Leu His Arg Val Ala Ala Asn His 35 40 45 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 50 55 60 Asn Ala Lys Asp Ser Ser Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Leu 65 70 75 80 Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Val Asn Ala Gln Asp Glu Ser Gly Phe Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 100 105 110 Asp Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 99 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 99 Gly Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ile Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Thr Gly His Thr Pro Leu His His Ala Ala His Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Tyr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Asp Asp Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala 100 105 110 His Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 100 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 100 Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Ala Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Asp Phe Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Gln Gly Phe Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Leu Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Gln Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asn 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 101 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 101 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Ala Ala Ala Leu Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Val Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Ala Gly Arg Thr Pro Leu His Arg Ala Ala Leu Ala Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Ser Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Glu Ile Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 100 105 110 Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 102 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 102 Gly Ser Asp Leu Gly His Lys Leu Leu Ile Ala Ala Tyr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Asp Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Val Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Asp Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Tyr Ser Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ser 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 103 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 103 Gly Ser Asp Leu Gly Asn Lys Leu Leu Trp Ala Ala Tyr Gln Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Trp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp 100 105 110 Ser Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 104 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 104 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Thr Phe Gly Gln Thr Pro Leu His Pro Ala Ala Trp Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Trp Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Ser 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Arg Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Gln Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 105 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 105 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Glu Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Glu Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Lys Tyr Gly Glu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Leu 100 105 110 Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 106 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 106 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Ala Gly Val Thr Pro Leu His Val Ala Ala Arg Ala Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Gln 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu His Val Ala Ala Glu 100 105 110 Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Leu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 107 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 107 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Arg Ser Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Tyr Lys 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Gln Leu Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 108 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 108 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Thr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Val Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Trp Ser 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asp Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Thr Ser Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 109 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 109 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Trp Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Glu His 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Leu Gly Ser Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ser 100 105 110 His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 110 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for EBNA-1 pMHC <400> 110 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ala Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Val Gly Gln Thr Pro Leu His Val Ala Ala Val Ile 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ser Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg 100 105 110 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 111 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 111 Lys Asp Thr Ile Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala His Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 112 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 112 Lys Asp Ile Tyr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 113 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 113 Lys Asp Lys Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 114 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 114 Lys Asp Val Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Gln Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 115 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 115 Lys Asp Glu Val Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 116 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 116 Lys Asp His Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Glu Leu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 117 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 117 Lys Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 118 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 118 Lys Asp Ala Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Trp Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 119 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 119 Lys Asp Leu Leu Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 120 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 120 Lys Asp Thr Trp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 121 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 121 Lys Asp Glu Leu Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Val Gly 1 5 10 15 Pro Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 122 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 122 Lys Asp Gln His Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 123 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 123 Lys Asp Ser Phe Gly Gln Thr Pro Leu His Arg Val Ala Ala Asn His 1 5 10 15 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 20 25 30 Asn Ala <210> 124 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 124 Lys Asp Ser Ser Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 125 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 125 Lys Asp Glu Thr Gly His Thr Pro Leu His His Ala Ala His Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 126 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 126 Lys Asp Gln Tyr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 127 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 127 Lys Asp Asp Phe Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 128 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 128 Lys Asp Glu Gln Gly Phe Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 129 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 129 Lys Asp Val Ala Gly Arg Thr Pro Leu His Arg Ala Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 130 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 130 Lys Asp Gln Ser Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Asp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 131 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 131 Lys Asp Asp Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 132 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 132 Lys Asp Lys Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Asp Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 133 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 133 Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 134 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 134 Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 135 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 135 Lys Asp Thr Phe Gly Gln Thr Pro Leu His Pro Ala Ala Trp Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 136 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 136 Lys Asp Lys Trp Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 137 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 137 Lys Asp Gln Glu Gly Arg Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 138 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 138 Lys Asp Ala Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Glu Val Asn 20 25 30 Ala <210> 139 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 139 Lys Asp Lys Tyr Gly Glu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 140 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 140 Lys Asp Leu Ala Gly Val Thr Pro Leu His Val Ala Ala Arg Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 141 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 141 Lys Asp Ala Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Gln Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 142 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 142 Lys Asp Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu His Val Ala Ala Glu Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 143 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 143 Lys Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Arg Ser Gly 1 5 10 15 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 144 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 144 Lys Asp Ala Trp Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Tyr Lys Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 145 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 145 Lys Asp Gln Leu Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 146 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 146 Lys Asp Gln Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala His Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 147 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 147 Lys Asp Ala Val Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Trp Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asp Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 148 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 148 Lys Asp Thr Ser Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 149 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 149 Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 150 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 150 Lys Asp Ala Trp Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Glu His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 151 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 151 Lys Asp His Leu Gly Ser Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ser His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 152 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 152 Lys Asp Ala Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 153 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 153 Lys Asp Val Val Gly Gln Thr Pro Leu His Val Ala Ala Val Ile Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 154 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 154 Lys Asp Ser Ala Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MAGE-A3 peptide <400> 155 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 156 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 156 Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Gln Ala Ala His Gln Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Gln Gly His Thr Pro Leu His Glu Ala Ala Gln Lys Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Arg Phe Gly Gln Thr Pro Leu His His Ala Ala Val Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Val Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 157 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 157 Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Thr Asp Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Glu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 158 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 158 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Ala Ala Ala Arg Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ala Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Arg Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Glu Leu Gly Leu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 159 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 159 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Ala Ala Ala Arg Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Asn Phe Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln His Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ala Gln Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 160 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 160 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Trp Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Tyr Trp Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ser Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Gln Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 161 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 161 Gly Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ala Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Thr Ala Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Val Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Glu Gly Leu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 162 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 162 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ser Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ser Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Arg Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 163 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 163 Gly Ser Asp Leu Gly Arg Lys Leu Leu Ala Ala Ala Arg Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Trp Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Tyr Trp Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Tyr Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Glu Gly Arg Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Glu 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 164 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 164 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Ala Ala Ala Gln Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Thr Trp Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Phe Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Thr Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Ser 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Arg Lys Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 165 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 165 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Gln Ala Ala Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Leu Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Trp Val Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Arg Glu Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Leu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 166 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 166 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Arg Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Leu Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Val Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ala Lys Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 167 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 167 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ser Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Thr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln 100 105 110 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 168 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 168 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Thr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Val Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp His Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Glu Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val 100 105 110 Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 169 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 169 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp His Trp Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Leu Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ser Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln 100 105 110 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 170 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 170 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ser Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Val Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ala Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ser Val Gly His Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg 100 105 110 Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 171 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 171 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Thr Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Thr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Trp Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Glu Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Trp 100 105 110 His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 172 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 172 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Trp Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Ala Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Arg Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Val Ala Ala Val Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Ile Glu Gly Glu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Phe 100 105 110 Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Val Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 173 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for MAGE-A3 pMHC <400> 173 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ser Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala 100 105 110 Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Val Gly Val Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Titin peptide <400> 174 Glu Ser Asp Pro Ile Val Ala Gln Tyr 1 5 <210> 175 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 175 Lys Asp Glu Gln Gly His Thr Pro Leu His Glu Ala Ala Gln Lys Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 176 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 176 Lys Asp Arg Phe Gly Gln Thr Pro Leu His His Ala Ala Val Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 177 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 177 Lys Asp Tyr Phe Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 178 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 178 Lys Asp Arg Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 179 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 179 Lys Asp Ala Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 1 5 10 15 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 180 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 180 Lys Asp Arg Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 181 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 181 Lys Asp Asn Phe Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 182 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 182 Lys Asp Gln His Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 183 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 183 Lys Asp Glu Trp Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Tyr Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 184 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 184 Lys Asp Ser Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 185 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 185 Lys Asp Thr Ala Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 186 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 186 Lys Asp Gln Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Val Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 187 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 187 Lys Asp Ser Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 188 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 188 Lys Asp Ser Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 189 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 189 Lys Asp Glu Trp Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Tyr Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 190 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 190 Lys Asp Lys Tyr Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 191 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 191 Lys Asp Thr Trp Gly Lys Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 192 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 192 Lys Asp Thr Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Ser Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 193 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 193 Lys Asp Leu Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Arg Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 194 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 194 Lys Asp Trp Val Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 195 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 195 Lys Asp Val Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 196 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 196 Lys Asp Leu Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Val Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 197 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 197 Lys Asp Ser Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 198 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 198 Lys Asp Gln Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 199 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 199 Lys Asp His Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln Gln Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 200 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 200 Lys Asp Glu Thr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Val Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 201 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 201 Lys Asp His Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 202 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 202 Lys Asp Glu Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 203 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 203 Lys Asp His Trp Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 204 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 204 Lys Asp Leu Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 205 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 205 Lys Asp Ser Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 206 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 206 Lys Asp Ser Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Arg Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Val Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 207 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 207 Lys Asp Ala Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 208 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 208 Lys Asp Ser Val Gly His Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Ile Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 209 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 209 Lys Asp Thr Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 210 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 210 Lys Asp Glu Trp Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 211 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 211 Lys Asp Glu Ala Gly Glu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Trp His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 212 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 212 Lys Asp Glu Trp Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Ala Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 213 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 213 Lys Asp Arg Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Val Ala Ala Val Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 214 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 214 Lys Asp Ile Glu Gly Glu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Phe Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 215 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 215 Lys Asp Ser Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 216 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 216 Lys Asp Glu Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 217 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 217 Lys Asp Val Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Val Gly Val Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 218 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-A0101 <400> 218 Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro 1 5 10 15 Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr 20 25 30 Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Lys Met Glu Pro 35 40 45 Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu 50 55 60 Thr Arg Asn Met Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Ala Asn Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile 85 90 95 Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn 115 120 125 Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr 130 135 140 Lys Arg Lys Trp Glu Ala Val His Ala Ala Glu Gln Arg Arg Val Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Gly Arg Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly 165 170 175 Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His 180 185 190 His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly 195 200 205 Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp 210 215 220 Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly 225 230 235 240 Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln 245 250 255 Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr 260 265 270 Leu Arg Trp Glu Pro 275 <210> 219 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A*0101avi <400> 219 Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro 1 5 10 15 Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr 20 25 30 Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Lys Met Glu Pro 35 40 45 Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu 50 55 60 Thr Arg Asn Met Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Ala Asn Leu Gly 65 70 75 80 Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile 85 90 95 Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn 115 120 125 Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr 130 135 140 Lys Arg Lys Trp Glu Ala Val His Ala Ala Glu Gln Arg Arg Val Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Gly Arg Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly 165 170 175 Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His 180 185 190 His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly 195 200 205 Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp 210 215 220 Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly 225 230 235 240 Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln 245 250 255 Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr 260 265 270 Leu Arg Trp Glu Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly 275 280 285 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 290 295 300 <210> 220 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 220 Gly Ser Asp Leu Gly His Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ser Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr 100 105 110 Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 221 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 221 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ile Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Ser Gly His Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Asp Val Asn Ala 50 55 60 Lys Asp His Arg Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Ile Gly 65 70 75 80 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 85 90 95 Ala Gln Asp Asn Trp Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Trp Trp 100 105 110 Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 222 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 222 Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Phe Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 223 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 223 Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Trp Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp His Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ile Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Ser Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Trp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Thr Thr Gly Asn Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala His 100 105 110 Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 224 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 224 Gly Ser Asp Leu Gly Phe Lys Leu Leu Glu Ala Ala Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr 100 105 110 Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 225 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 225 Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Asn Phe Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Trp Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Val Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Val Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Tyr Thr Gly His Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 226 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 226 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Ser Ala Ala Gln Ser Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Gly Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Lys Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Lys Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Lys Lys Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Val Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 227 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 227 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Phe Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 228 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 228 Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu His Ala Ala Thr Thr Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr 100 105 110 Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 229 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 229 Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr 100 105 110 Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Val Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 230 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for HBVc18 pMHC <400> 230 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Leu Asp Glu Val His Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln His Gly Lys Thr Pro Met His Leu Ala Ala Gln Ile Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp His Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Val 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp Gln Glu Gly Trp Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln 100 105 110 Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Arg Ala Gly His Gln Asp Ser Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 231 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 231 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 232 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 232 Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 233 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 233 Lys Asp Glu Ser Gly His Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 234 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 234 Lys Asp His Arg Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Ile Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 235 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 235 Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 236 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 236 Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 237 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 237 Lys Asp His Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ile Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 238 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 238 Lys Asp Ser Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 239 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 239 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 240 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 240 Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 241 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 241 Lys Asp Gln Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Trp Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 242 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 242 Lys Asp Val Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Val Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 243 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 243 Lys Asp Lys Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 244 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 244 Lys Asp Glu Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 245 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 245 Lys Asp Lys Lys Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Val Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 246 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 246 Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 247 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 247 Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 248 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 248 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 249 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 249 Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 250 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 250 Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 251 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 251 Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 252 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 252 Lys Asp Gln His Gly Lys Thr Pro Met His Leu Ala Ala Gln Ile Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 253 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 253 Lys Asp His Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 254 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat module <400> 254 Lys Asp Gln Glu Gly Trp Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Leu Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 255 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <223> HBV core antigen protein 18-27 <400> 255 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 256 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <223> HBV envelope protein 183-191 <400> 256 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 257 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBe183 peptide mutated <400> 257 Phe Leu Leu Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 258 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Peptide (human off-target) <400> 258 Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Ser Val 1 5 <210> 259 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Peptide (human-off target) <400> 259 Phe Leu Pro Asp Ala Asn Ser Ser Val 1 5 <210> 260 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Peptide (human-off target) <400> 260 Phe Leu Pro Gln Gly Phe Pro Asp Ser Val 1 5 10 <210> 261 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Peptide (human-off target) <400> 261 Arg Leu Pro Pro Asp Phe Phe Gly Val 1 5 <210> 262 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Peptide (human-off target) <400> 262 Tyr Leu Asp Leu Phe Gly Asp Pro Ser Val 1 5 10 <210> 263 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 263 Ala Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 264 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 264 Phe Leu Ala Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 265 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 265 Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 266 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 266 Phe Leu Pro Ser Ala Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 267 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 267 Phe Leu Pro Ser Asp Ala Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 268 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 268 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Ala Pro Ser Val 1 5 10 <210> 269 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 269 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Ala Ser Val 1 5 10 <210> 270 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBc18 peptide (alanine mutated) <400> 270 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ala Val 1 5 10 <210> 271 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 271 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 272 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 272 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 273 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cap <400> 273 Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 274 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 274 Gln Asp Gln Phe Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 20 25 <210> 275 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 275 Gln Asp Tyr Thr Gly His Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Ile Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 20 25 <210> 276 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal capping module <400> 276 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 <210> 277 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker L <400> 277 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 20 25 30 Pro Thr Pro Thr Gly Ser 35 <210> 278 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker S <400> 278 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ser <210> 279 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker XS <400> 279 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Gly Ser 1 5 10 <210> 280 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker XXS <400> 280 Gly Ser Pro Thr Gly Ser 1 5 <210> 281 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 281 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 145 150 155 160 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile 245 250 255 Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 260 265 270 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 275 280 285 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 290 295 300 <210> 282 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 282 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile 245 250 255 Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 260 265 270 Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 275 280 285 Arg Ala Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 290 295 300 <210> 283 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 283 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile 245 250 255 Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 260 265 270 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 275 280 285 Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 290 295 300 <210> 284 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 284 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Leu Lys Leu Leu Thr Ala Ala Trp Glu Gly Gln 145 150 155 160 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn Glu Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Trp 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Trp 245 250 255 Gln Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 285 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 285 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Trp Glu Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn Glu Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Trp 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Gln Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 286 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 286 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn Glu Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Trp 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 287 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 287 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Leu Lys Leu Leu Gln Ala Ala Trp Glu Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn Glu Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Tyr Trp 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Gln Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 288 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 288 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu Glu Ala Ala Val Ile Gly Gln 145 150 155 160 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Arg 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala His 245 250 255 Glu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 289 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 289 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Val Ile Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Arg 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Glu Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 290 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 290 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Arg 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 291 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 291 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu Gln Ala Ala Val Ile Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly 180 185 190 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Arg 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Glu Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 292 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 292 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Gln 145 150 155 160 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr Lys Gly 180 185 190 His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Asn His 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ile 245 250 255 Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 293 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 293 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Tyr Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr Lys Gly 180 185 190 His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Asn His 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Trp Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 294 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 294 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr Lys Gly 180 185 190 His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Asn His 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 295 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 295 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Tyr Gly Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 165 170 175 Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr Lys Gly 180 185 190 His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Asn His 210 215 220 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 225 230 235 240 Asn Ala Gln Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg 245 250 255 Trp Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 296 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 296 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 260 265 270 Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu 275 280 285 Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala 290 295 300 Ala 305 <210> 297 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 297 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 260 265 270 Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu 275 280 285 Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala 290 295 300 Ala 305 <210> 298 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 298 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 260 265 270 Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu 275 280 285 Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala 290 295 300 Ala 305 <210> 299 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 299 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Leu Lys Leu Leu Thr Ala Ala Trp Glu 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Trp Gln Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 300 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 300 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Trp Glu 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Gln Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 301 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 301 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 302 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 302 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Leu Lys Leu Leu Gln Ala Ala Trp Glu 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Gln Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 303 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 303 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu Glu Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala His Glu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 304 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 304 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Glu Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 305 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 305 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 306 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 306 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu Gln Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Glu Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 307 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 307 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Glu Ala Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 308 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 308 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Trp Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 309 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 309 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 310 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 310 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Trp Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 311 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 311 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 260 265 270 Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu 275 280 285 Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala 290 295 300 Ala 305 <210> 312 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 312 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 260 265 270 Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu 275 280 285 Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala 290 295 300 Ala 305 <210> 313 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 313 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 260 265 270 Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu 275 280 285 Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala 290 295 300 Ala 305 <210> 314 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 314 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Leu Lys Leu Leu Thr Ala Ala Trp Glu 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Trp Gln Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 315 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 315 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Trp Glu 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Gln Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 316 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 316 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 317 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 317 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Leu Lys Leu Leu Gln Ala Ala Trp Glu 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Asn 180 185 190 Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Val Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Tyr Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Gln Thr Gly Gln Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Gln Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 318 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 318 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu Glu Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala His Glu Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 319 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 319 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Glu Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 320 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 320 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 321 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 321 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu Gln Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His 180 185 190 Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Glu Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Trp Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Glu Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 322 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 322 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Glu Ala Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Ile Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 323 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 323 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Thr Gln Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Trp Gly His Gln Gln Ile Ala Ser Val Leu Gln Gln Ala Ala 260 265 270 <210> 324 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 324 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 325 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein <400> 325 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Thr Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Val Asp Gly Ala Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly His Pro Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Ala Val Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala 210 215 220 Asn His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Arg Trp Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 326 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Tag <400> 326 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 1 5 10

Claims (78)

  1. 하기 단계들을 포함하는 펩티드-MHC(pMHC)-특이적 결합 단백질의 생성 방법으로서,
    상기 결합 단백질은 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인을 포함하는, 방법:
    (a) 설계된 반복 도메인들의 집합체(collection)를 제공하는 단계;
    (b) 재조합 표적 펩티드-MHC 복합체를 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 특이적인 결합을 위한 상기 설계된 반복 도메인들의 집합체를 스크리닝하여 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 설계된 반복 도메인을 얻는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 설계된 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 집합체는 고정된 위치들 및 랜덤화된 위치들을 포함하는 설계된 반복 도메인들을 포함하고, 상기 집합체의 설계된 반복 도메인들은 상기 랜덤화된 위치들 중 적어도 하나의 위치에서 서로 상이한, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 반복 단백질들의 집합체는 리보솜 디스플레이에 의해 제공되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (i) 제2 재조합 펩티드-MHC 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 제2 펩티드-MHC 복합체의 펩티드는 상기 표적 펩티드와 적어도 1개의 아미노산 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는, 상기 단계; 및 (ii) 상기 제2 재조합 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 반복 도메인을 음성 선택에 의해 상기 집합체로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 반복 도메인의 상기 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 상기 반복 도메인과 상기 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래되고, 바람직하게는 상기 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 펩티드는 EBNA-1로부터 유래되고, 바람직하게는 상기 표적 펩티드는 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 펩티드는 MAGE-A3으로부터 유래되고, 바람직하게는 상기 표적 펩티드는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 펩티드는 HBcAg로부터 유래되고, 바람직하게는 상기 표적 펩티드는 서열 번호 255의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC는 MHC 클래스 I인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 설계된 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질.
  16. 제1 설계된 반복 도메인을 포함하며, 상기 제1 반복 도메인은 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 가지며, 바람직하게는 상기 제1 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 결합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 제1 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하는, 결합 단백질.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함하는, 결합 단백질.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제1 반복 도메인의 결합은 상기 제1 반복 도메인과 상기 제1 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함하는, 결합 단백질.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 MHC는 MHC 클래스 I인, 결합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I은 HLA-A*02인, 결합 단백질.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 펩티드는 NY-ESO-1로부터 유래되는, 결합 단백질.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 펩티드는 서열 번호 19 또는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인인, 결합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되는, 결합 단백질.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인은 제2 설계된 반복 도메인을 추가로 포함하며, 상기 제2 반복 도메인은 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 가지며, 바람직하게는 상기 제2 표적 펩티드는 (i) 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는 펩티드, (ii) 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는 펩티드, 및 (iii) 자가면역 장애와 관련된 단백질로부터 유래되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드는 세포내 단백질, 바람직하게는 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2 반복 도메인은 PBS 중에서 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 결합하는, 결합 단백질.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 표적 펩티드의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함하는, 결합 단백질.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 상기 제2 반복 도메인의 결합은 상기 제2 반복 도메인과 상기 제2 MHC의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 상호작용을 포함하는, 결합 단백질.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 MHC는 MHC 클래스 I인, 결합 단백질.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 동일한 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 반복 도메인은 상기 제1 반복 도메인과 동일한 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
  37. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 반복 도메인은 상기 제1 반복 도메인과 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
  38. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드와 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
  39. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 제1 표적 펩티드의 유래가 되는 상기 단백질과 상이한 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 MHC는 HLA-A*02인, 결합 단백질.
  41. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 MHC는 HLA-A*02가 아닌, 결합 단백질.
  42. 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 반복 도메인은 설계된 안키린 반복 도메인인, 결합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 37 내지 72, 및 (2) 서열 번호 37 내지 72 중 어느 하나에서 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 제2 안키린 반복 도메인은 서열 번호 20 내지 33 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 20 내지 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되어 있으며, 서열 번호 20 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 20 내지 33의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되는, 결합 단백질.
  45. 제28항 내지 제34항, 제40항, 및 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 서열 번호 16 내지 18 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 결합 단백질.
  46. 제15항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  47. 제46항에 있어서, 상기 면역 세포는 T-세포인, 결합 단백질.
  48. 제47항에 있어서, 상기 T-세포는 CD8+ 세포독성 T-세포인, 결합 단백질.
  49. 제46항 또는 제47항에 있어서, 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 상기 단백질은 T-세포 수용체 복합체의 일부인 단백질인, 결합 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 상기 T-세포 수용체 복합체의 일부인 상기 단백질은 분화 클러스터 3(CD3)인, 결합 단백질.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 항체, 항체 모방체, 스캐폴드 단백질, 반복 단백질, 또는 설계된 반복 도메인인, 결합 단백질.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 설계된 안키린 반복 도메인인, 결합 단백질.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 펩티드 링커를 사용하여 상기 제1 반복 도메인, 및/또는 존재하는 경우, 상기 제2 반복 도메인에 공유적으로 연결되는, 결합 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌-풍부 펩티드 링커인, 결합 단백질.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 1 내지 17개의 아미노산 길이를 갖는, 결합 단백질.
  56. 제15항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 T-세포 수용체에 의한 상기 제1 표적 펩티드-MHC 복합체의 인식을 억제할 수 있고/있거나, 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드-MHC 복합체의 인식을 억제할 수 있는, 결합 단백질.
  57. 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 또는 제2 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 반복 도메인을 인코딩하거나, 또는 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  58. 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제57항의 핵산, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  59. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 T-세포의 종양-국한된 활성화 방법으로서,
    상기 포유동물에게 제15항 내지 제55항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제57항의 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는, 방법.
  60. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 T-세포의 종양-국한된 활성화 방법에 사용하기 위한 제15항 내지 제55항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제57항의 핵산으로서,
    상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질 또는 핵산.
  61. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 T-세포의 감염-국한된 활성화 방법으로서,
    상기 포유동물에게 제15항 내지 제55항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제57항의 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는, 방법.
  62. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 T-세포의 감염-국한된 활성화 방법에 사용하기 위한 제15항 내지 제55항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제57항의 핵산으로서,
    상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 감염성 인자의 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질 또는 핵산.
  63. 의학적 질환을 치료하는 방법으로서,
    이를 필요로 하는 환자에게 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제57항의 핵산, 또는 제58항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 의학적 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제57항의 핵산, 또는 제58항의 약제학적 조성물.
  65. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 의학적 질환을 진단하는 방법으로서,
    (i) 상기 포유동물로부터 획득된 세포 또는 조직 샘플을 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 세포 또는 조직 샘플에 대한 상기 결합 단백질의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. 제63항 또는 제65항의 방법에 있어서, 또는 제64항의 결합 단백질에 있어서, 상기 의학적 질환은 암, 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병, 또는 자가면역 질병인, 방법, 또는 상기 사용을 위한 결합 단백질.
  67. 제63항 또는 제65항의 방법에 있어서, 또는 제64항의 결합 단백질에 있어서, 상기 의학적 질환은 암인, 방법, 또는 상기 사용을 위한 결합 단백질.
  68. 제63항 또는 제65항의 방법에 있어서, 또는 제64항의 결합 단백질에 있어서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병인, 방법, 또는 상기 사용을 위한 결합 단백질.
  69. 제63항 또는 제65항의 방법에 있어서, 또는 제64항의 결합 단백질에 있어서, 상기 의학적 질환은 자가면역 질병인, 방법, 또는 상기 사용을 위한 결합 단백질.
  70. 종양을 갖는 환자에서 종양 세포를 파괴하기 위하여 상기 종양 세포를 표적화하는 방법으로서,
    상기 환자에게 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제57항의 핵산, 또는 제58항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 종양 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 결합 단백질은 종양 세포를 사멸할 수 있는 독성제(toxic agent)를 추가로 포함하는, 종양 세포를 표적화하는 방법.
  72. 종양을 갖는 환자에서 종양 세포를 파괴하기 위하여 상기 종양 세포를 표적화하는 방법에 사용하기 위한 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제57항의 핵산, 또는 제58항의 약제학적 조성물로서,
    상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 종양 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 종양 세포에서 발현되는 세포내 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 결합 단백질은 종양 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함하는, 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물.
  74. 바이러스성 감염성 질병을 갖는 환자에서 감염된 세포를 파괴하기 위하여 상기 감염된 세포를 표적화하는 방법으로서,
    상기 환자에게 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제57항의 핵산, 또는 제58항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 감염된 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 감염된 세포에서 발현되는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래되는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 결합 단백질은 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함하는, 종양 세포를 표적화하는 방법.
  76. 바이러스성 감염성 질병을 갖는 환자에서 감염된 세포를 파괴하기 위하여 상기 감염된 세포를 표적화하는 방법에 사용하기 위한 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제57항의 핵산, 또는 제58항의 약제학적 조성물로서,
    상기 제1 표적 펩티드, 및/또는 상기 결합 단백질이 상기 제2 반복 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 표적 펩티드는 상기 감염된 세포에서 발현되는 단백질, 바람직하게는 상기 감염된 세포에서 발현되는 바이러스-특이적 단백질로부터 유래되는, 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 결합 단백질은 감염된 세포를 사멸할 수 있는 독성제를 추가로 포함하는, 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물.
  78. 제63항, 제66항 및 제67항, 제69항 및 제70항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 또는 제64항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 의학적 질환 또는 종양은 지질육종, 신경아세포종, 활막 육종, 흑색종 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법, 또는 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 성물.
KR1020227023763A 2019-12-11 2020-12-11 재조합 펩티드-mhc 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도 KR20220113491A (ko)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19215436 2019-12-11
EP19215433 2019-12-11
EP19215435 2019-12-11
EP19215434.2 2019-12-11
EP19215436.7 2019-12-11
EP19215434 2019-12-11
EP19215435.9 2019-12-11
EP19215433.4 2019-12-11
EP20161059.9 2020-03-04
EP20161059 2020-03-04
EP20181234 2020-06-19
EP20181234.4 2020-06-19
PCT/EP2020/085863 WO2021116469A2 (en) 2019-12-11 2020-12-11 Recombinant peptide-mhc complex binding proteins and their generation and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220113491A true KR20220113491A (ko) 2022-08-12

Family

ID=73790118

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227023764A KR20220113492A (ko) 2019-12-11 2020-12-11 변경된 표면 잔기를 갖는 설계된 안키린 반복 도메인
KR1020227023763A KR20220113491A (ko) 2019-12-11 2020-12-11 재조합 펩티드-mhc 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227023764A KR20220113492A (ko) 2019-12-11 2020-12-11 변경된 표면 잔기를 갖는 설계된 안키린 반복 도메인

Country Status (11)

Country Link
US (4) US20220106707A1 (ko)
EP (2) EP4073091A1 (ko)
JP (2) JP2023506765A (ko)
KR (2) KR20220113492A (ko)
CN (2) CN115003689A (ko)
AU (2) AU2020402581A1 (ko)
BR (2) BR112022011177A2 (ko)
CA (2) CA3161321A1 (ko)
IL (2) IL293698A (ko)
MX (2) MX2022007120A (ko)
WO (2) WO2021116462A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3161321A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Victor LEVITSKY Recombinant peptide-mhc complex binding proteins and their generation and use
IL297940A (en) 2020-05-06 2023-01-01 Molecular Partners Ag New ankyrin repeat binding proteins and their uses
US11981710B2 (en) 2020-08-18 2024-05-14 Athebio Ag N-terminal capping modules of ankyrin repeat domains
EP3957649A1 (en) 2020-08-18 2022-02-23 Athebio AG Improved n-terminal capping modules of ankyrin repeat domains
EP4304731A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 Molecular Partners AG Novel darpin based multi-specific t-cell engagers
EP4137508A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-22 Athebio AG Variants of ankyrin repeat domains
WO2023021050A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Athebio Ag Variants of ankyrin repeat domains
KR20240116828A (ko) * 2021-12-14 2024-07-30 씨디알-라이프 아게 이중 mhc-표적화 t 세포 관여자
CA3239407A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Simon FONTAINE Designed repeat domains with dual binding specificity and their use
US20240228545A9 (en) 2022-08-01 2024-07-11 Molecular Partners Ag Charge modified designed repeat domains and their use
WO2024179981A1 (en) 2023-02-27 2024-09-06 Molecular Partners Ag Darpins for use in reducing renal accumulation of drugs

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
CA2476625A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
NZ581958A (en) 2004-11-12 2011-01-28 Bayer Schering Pharma Ag Recombinant newcastle disease virus comprising a transgene encoding a prodrug-converting enzyme or protease for use in the treatment of cancer
US8846577B2 (en) 2005-07-08 2014-09-30 University Of Zurich Phage display using cotranslational translocation of fusion polypeptides
ES2553270T3 (es) 2007-07-27 2015-12-07 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevo epítopo inmunogénico para inmunoterapia
WO2009040338A1 (en) 2007-09-24 2009-04-02 University Of Zürich Designed armadillo repeat proteins
RU2550258C2 (ru) 2008-11-03 2015-05-10 Молекьюлар Партнерс Аг Связывающие белки, ингибирующие взаимодействия vegf-a рецептора
TWI510246B (zh) 2010-04-30 2015-12-01 Molecular Partners Ag 抑制ｖｅｇｆ－ａ受體交互作用的經修飾結合性蛋白質
PL2643349T3 (pl) 2010-11-26 2020-03-31 Molecular Partners Ag Zaprojektowane białka z powtórzeniami wiążące się z albuminą surowicy
AU2012249359A1 (en) * 2011-04-29 2013-11-14 Janssen Biotech, Inc. IL4/IL13 binding repeat proteins and uses
CA2877584A1 (en) 2012-06-28 2014-01-03 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat proteins binding to platelet-derived growth factor
CA2883264A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Universitat Zurich Prorektorat Mnw Bispecific her2 ligands for cancer therapy
EP2738180A1 (en) 2012-11-30 2014-06-04 Molecular Partners AG Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2.
WO2014191574A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat proteins binding to hepatocyte growth factor
CA2942433C (en) 2014-03-14 2023-08-01 Immunocore Limited Tcr libraries
US20170226158A1 (en) * 2014-08-11 2017-08-10 Medimmune Limited Intracellular antigen binding
CA2980292A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 The Johns Hopkins University Hla-restricted epitopes encoded by somatically mutated genes
KR20220109488A (ko) * 2015-04-02 2022-08-04 몰리큘라 파트너스 아게 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인
CN109952319B (zh) 2016-06-02 2023-08-25 英美偌科有限公司 对gp100具有特异性的TCR-抗CD3 scFv融合蛋白的定量用药方案
BR112019005587A2 (pt) 2016-09-22 2019-06-11 Molecular Partners Ag proteínas de ligação recombinantes e sua utilização
CA3082782A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-23 The Regents Of The University Of California Force sensor cleavage domain containing chimeric polypeptides and methods of use thereof
BR112021024236A2 (pt) 2019-06-04 2022-04-26 Molecular Partners Ag Proteínas multiespecíficas
SG11202112927UA (en) 2019-06-04 2021-12-30 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat domain with improved stability
EP3980045A1 (en) 2019-06-04 2022-04-13 Molecular Partners AG Recombinant fap binding proteins and their use
EP3980452A1 (en) 2019-06-04 2022-04-13 Molecular Partners AG Recombinant 4-1bb binding proteins and their use
CA3161321A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Victor LEVITSKY Recombinant peptide-mhc complex binding proteins and their generation and use
CN114945584A (zh) 2019-12-11 2022-08-26 分子合作伙伴股份公司 重组肽-mhc复合物结合蛋白及其生成和用途
IL297940A (en) * 2020-05-06 2023-01-01 Molecular Partners Ag New ankyrin repeat binding proteins and their uses
EP4149960A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Molecular Partners AG Recombinant cd40 binding proteins and their use
US20240279290A1 (en) 2020-05-14 2024-08-22 Molecular Partners Ag Multispecific proteins

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022011177A2 (pt) 2022-09-27
KR20220113492A (ko) 2022-08-12
WO2021116469A2 (en) 2021-06-17
EP4073092A2 (en) 2022-10-19
JP2023506765A (ja) 2023-02-20
JP2023506757A (ja) 2023-02-20
IL293704A (en) 2022-08-01
MX2022007122A (es) 2022-09-09
IL293698A (en) 2022-08-01
US20220064234A1 (en) 2022-03-03
CA3161321A1 (en) 2021-06-17
US20230243070A1 (en) 2023-08-03
US11578427B2 (en) 2023-02-14
BR112022011456A2 (pt) 2022-08-23
US20230340698A1 (en) 2023-10-26
MX2022007120A (es) 2022-09-09
AU2020402581A1 (en) 2022-06-23
AU2020399230A1 (en) 2022-06-23
CA3161326A1 (en) 2021-06-17
EP4073091A1 (en) 2022-10-19
WO2021116462A1 (en) 2021-06-17
US20220106707A1 (en) 2022-04-07
CN114929730A (zh) 2022-08-19
CN115003689A (zh) 2022-09-02
WO2021116469A3 (en) 2021-12-02
AU2020402581A9 (en) 2022-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220113491A (ko) 재조합 펩티드-mhc 복합체 결합 단백질 및 이의 생성 및 용도
US20210198380A1 (en) Anti-cancer fusion polypeptide
EP3298030B1 (en) Anti-cancer fusion polypeptide
JP6041799B2 (ja) Ｔｒａｉｌｒ２特異的多量体足場
KR20180132844A (ko) T 세포 수용체
US20230041822A1 (en) Recombinant peptide-mhc complex binding proteins and their generation and use
KR20160058767A (ko) Ｔ 세포 수용체
US20220242973A1 (en) Recombinant fap binding proteins and their use
KR20230120139A (ko) 재조합 cd3 결합 단백질 및 이의 용도
WO2020108636A1 (zh) 全人抗gitr抗体及其制备方法
KR20190137831A (ko) Fgfr3 결합 분자
WO2024064713A1 (en) Novel fusion protein specific for cd137 and cd228
KR20140021485A (ko) 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도