KR20140021485A - 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 - Google Patents

스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 변형된 SEB(staphylococcal Enterotoxin B), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터 및 숙주세포가 개시된다. 본원은 또한 본원에 따른 변형된 SEB 또는 야생형 SEB 및 이와 융합된 표적 특이적 폴리펩타이드의 융합단백질 및 이의 질환 치료제로서의 용도가 개시된다. 본원에 개시된 SEB 변이체 및 이를 포함하는 융합단백질은 특정 세포를 특이적으로 인식할 수 있도록 제조되어 면역계 활성화를 통해 암과 같은 특정 세포의 사멸을 유도하여 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 {Superantigen derived from Staphylococcal enterotoxin and fusion protein comprising target specific polypeptide linked thereto and use thereof}
스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체를 이용한 기술분야이다.
암을 포함하는 다양한 질환에서 면역계를 이용한 표적 치료가 효과적인 치료 방법으로 대두되고 있다. 기존에 면역계를 이용한 치료는 특정 항원을 발현하는 세포를 살해하는 이펙터(effector) 기능을 이용하는 것으로 이는 다음의 두 가지를 포함한다. 첫째는 T 세포나 NK세포, 대식세포 등을 타겟으로 하여 특정 면역 효능 세포를 이용하는 방법으로, 이 중 특히 T 세포를 사용하는 방법이 널리 사용되고 있는데 그 중 대표적인 것이 CD3를 타겟으로 하는 것이다. CD3은 신호 전달에 관여하며 T 세포 수용체와 복합체를 형성하고 있다. CD3은 흔히 세포독성 T 세포를 특정 항원을 발현하는 세포로 유도하여 직접적으로 사멸하는 것을 목적으로 하여 사용된다. 그러나 T 세포가 활성화되기 위해서는 다양한 공자극인자가 필요하다. 이러한 한계를 극복하는 CD3 표적 분자로는 BiTE(Bispecific T cell engager)가 있는데 기존의 다른 CD3 항체에 비해 co-stimulation 없이 T-세포 매개 세포독성을 보이는 것으로 관찰되었다(Curr Opin Mol Ther. 11, 22-30 (2009). 그러나 BiTE는 다클론적으로 T 세포 활성에 관여하나, 작은 분자 사이즈로 인하여 혈액 내 반감기가 짧아 매일 투여를 해야 하는 단점을 가지고 있다.
두 번째는 초항원을 사용하는 것이다. 초항원은 항원 특이성과 관련없이 T 세포 수용체(TCR)에 결합하여 T 세포를 활성화시키는 분자로, 바이러스나 마이코플라스마, 박테리아로부터 유래된 항원이다. 이러한 슈퍼항원은 TCR의 Vβ 영역과 주조직적합성복합체 (major histocompatibility complex, MHC II)에 동시에 결합하여 T 세포를 활성화시키므로, 특정 항원에 특이적인 아닌 다클론성으로 동시에 많은 수의 림프구를 활성화시키는 것으로 알려져 있으며(Int J Med Microbiol 2003; 292: 429-40), 활성화된 T 세포에서 만들어지는 다량의 세포독성 사이토카인은 특정 항원을 발현하는 세포를 제거하는데 효과적으로 이용된다(Proc natl Acad Sci 91: 8945-8949 (1994), Proc natl Acad Sci 92: 9791-9795 (1995)).
특히 스테필로코칼 엔테로톡신 (Staphylococcal enterotoxins(SE))은 슈퍼항원으로 불리는 박테리아 단백질로 22~30kDa의 single chain globular 단백질로 구성되어 있다. 스테필로코칼 엔테로톡신은 MHC class II와 T 세포에 동시에 결합함으로써 T 세포를 비특이적으로 활성화시키고, 그로 인해 다량의 사이토카인(TNF-α, IL-1, IFN-γ, IL-2, MIP-1 등)이 분비되는 것으로 알려져 있다. 하지만, SE는 T 세포의 활성화로 인해 생산된 향염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 세포독성 T 세포를 통하여 표적 세포를 살해하는 장점을 지닌 반면, MHC class II를 가진 세포와도 작용하여 MHC class II를 발현하는 다른 장기에도 축적되는 단점을 지니고 있으며 이의 개량이 필요하다.
대한민국 특허 제0377506호는 변이된 초항원과 표적-탐지화합물간의 복합체 및 상기 복합체를 함유하는 약학적조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것으로, 변이된 A, B, C1, C2, D 또는 E를 개시하고 있다.
미국 공개특허 공보 제 2005-0024322호는 SEB의 9번째, 23번째, 44번째, 또는 41번째 및 44번째, 또는 41번째 및 45번째에서 치환된 변이체를 개시하고 있다.
SEA에 비해 낮은 MHC class II 친화도를 나타내고, 다양한 T 세포뿐 아니라 NKT 세포의 증식도 유도할 수 있으며 면역원성이 감소되어 치료제로서의 효능이 향상된 초항원의 개발이 요구된다.
본원은 상기 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로 SEA에 비해 낮은 MHC class II 친화도를 나타내고, 다양한 T 세포뿐 아니라 NKT 세포의 증식도 유도할 수 있으며 면역원성이 감소된 SEB 및 그 용도를 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
한 양태에서 본원은 면역원성과 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 II에 대한 결합성이 감소된 변형된 SEB로 상기 SEB는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 다음의 아미노산 잔기의 모든 위치에서, 각 위치에 기재된 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 것인, 변형된 SEB를 제공한다: 7 번째 Lys이 Thr 또는 Asn; 8 번째 Pro이 Glu 또는 Gln 9 번째 Asp이 Ser 또는 Lys;14 번째 Ala이 Ser 또는 Thr;36 번째 Ile이 Glu 또는 Thr; 52 번째 Ser이 Pro; 56 번째 Thr이 Trp; 72 번째 Asp이 Trp 또는 Phe; 93 번째 Tyr이 His; 95 번째 Ser이 Pro; 96 번째 Glu이 Lys; 103 번째 Asn이 Asp 또는 Asn; 104 번째 Ser이 Glu; 105 번째 His이 Gly; 107 번째 Thr이 Trp 또는 Phe; 108 번째 Asp이 Trp 또는 Phe; 122 번째 Asn이 Asp 또는 Asn; 125 번째 His이 Gln 또는 Glu; 127 번째 Asp이 Ser; 128 번째 Lys이 Asp 또는 Gln; 138 번째 Asp이 Gly; 140 번째 Lys이 Gly; 142 번째 Leu이 Ser; 191 번째 Ser이 Asn 또는 Asp; 192 번째 Glu이 Gly; 206 번째 Asp이 Gly; 207 번째 Lys이 Tyr 또는 Phe; 및 222 번째 Leu이 Met으로의 치환.
본원에 따른 변이체는 하기 각 위치에서의 각 위치에 기재된 어느 하나의 아미노산으로의, 하나 이상의 위치에서의 치환을 부가적으로 포함한다: 43 번째 Gln이 Lys; 44 번째 Phe이 Gly 또는 His; 45 번째 Leu이 Thr; 46 번째 Tyr이 Lys; 47 번째 Phe이 His; 101 번째 Asp이 Val 또는 Ile; 209 번째 Asp이 Met; 또는 212 번째 Lys이 Ser, Glu, 또는 Val으로의 치환.
본원에 따른 일 구현예에서 본원의 변형된 SEB는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나로 표시된다.
다른 양태에서 본원은 또한 상수한 본원의 변이된 SEB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33 내지 38 중 어느 하나로 표시될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원의 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 이의 야생형 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드 발현 조절 서열을 포함하는, 벡터에 관한 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원 벡터는 표 6-2 (또한 도 26 내지 도 31 참조) 또는 표 7-2의 벡터 중 어느 하나로 표시될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또다른 양태에서 본원은 하나 이상의, 야생형 SEB 또는 본원에 따른 변형된 SEB 및 표적 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본원의 융합단백질을 링크, 특히 폴리펩타이드 링커, 더욱 특히 유연성이 있는 폴리펩타이드 링커, 예를 들면 서열번호 31 또는 32의 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 따른 융합단백질의 SEB는 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치 할 수 있다.
본원의 융합단백질에 포함되는 표적 특이적 폴리펩타이드는 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체를 포함한다. 항체는 예를 들면 항체의 키메라 항체, 인간화 항체를 포함하고, 상기 항원결합 단편은 scFv, BITE, TandAb, Immunobody, Flexibody, Nanobody, Triomab, Troybody, Pepbody, Vaccibody, SMIP, Fab(fragment antigen binding), mAb2, UniBody, Fv (fragment variable), dAB, ScFv-Fc, Diabody, Tetrabody, Minibody, scFab(single chain Fab), 또는 Fcab을 포함하며, 상기 항체 모방체는 DARPin, Tetranectin, Affibody, Transbody, Anticalin, AdNectin, Affilin, Microbody, Peptide aptamer, Phylomer, Stradobody, Avimer, Maxibodiy, Evibody, 또는 Fynomer를 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 융합단백질에 포함되는 표적 특이적 폴리펩타이드에서 표적은 특히 세포 표면에 존재하는 단백질과 같은 인자 (factor)로서, 특히 암세포의 표면에 존재하는 암의 종류에 따른 암세포에 특이적으로 발현되는 생체표지자 또는 마커이다. 예를 들면 유방암 등에 특이적으로 발현되는 HER2(Human Epidermal Growth factor 2), 또는 림프종에 발현되는 CD20 마커를 포함한다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원의 융합단백질은 HER2 또는 CD20를 표적으로 하며, 폴리펩타이드는 상기 HER2 또는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv 또는 Fab이다.
본원에 따른 융합단백질은 T 세포의 전활성화 없이, T 세포 매개된 면역시스템을 활성화시킬 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원의 HER2를 표적으로 하는 scFv 및 Fab를 포함하는 융합단백질은 각각 서열번호 39 내지 44 중 어느 하나 및 서열번호 63 내지 68 중 어느 하나와 서열번호 69의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 CD20를 표적으로 scFv 및 Fab를 포함하는 융합단백질은 각각 서열번호 45 내지 50 중 어느 하나 및 서열번호 70 내지 75 중 어느 하나와 서열번호 76의 아미노산 서열로 표시된다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 폴리뉴클레오타이드는 HER2를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 51 내지 56 중 어느 하나 또는 서열번호 77 내지 82 중 어느 하나와 서열번호 83으로 표시되며, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 CD20를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 57 내지 62 중 어느 하나 또는 서열번호 84 내지 89 중 어느 하나와 서열번호 90으로 표시된다.
또 다른 양태에서 본원에 따른 폴레뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드 발현 조절 서열을 포함하는, 벡터를 제공한다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원의 벡터는 표 3 (또한 도 3 내지 8 참조), 표 6-1 (또한 도 20 내지 도 25 참조), 표7-1, 표 10, 또는 표 13에 기재된 벡터 중 어느 하나이다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 T-세포 매개된, 표적 세포의 붕해(lysis) 방법을 제공하며, 상기 방법은 예를 들면 상기 표적 세포를 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 단백질은 상기 표적 세포의 표면에 존재하는 인자를 특이적으로 인식하는 것이다. 본원의 융합단백질이 표적으로 하는 세포는 질환 유래로, 예를 들면 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 칸디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis) 유래의 세포이다.
일 구현예에서 본원의 표적 세포는 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암, 간암을 포함하는 것이다. 또한 본원에 따른 융합단백질이 특이적으로 인식하는 세포의 인자는 암과 연관된 것으로 예를 들면 이러한 인자는 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)중 하나 이상을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 T-세포 매개된 표적 세포의 붕해용 약학 조성물을 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 표적 세포는 그 표면에 암세포 특이적 인자를 발현하는 암세포이며, 암세포 특이적 인자는 상기 언급한 바와 같다.
본원에 따른 SEB 변이체는 SEA 및 야생형 SEB와 비교하여 낮은 MHC class II 친화도를 나타내고, 면역원성이 감소되었으며, 다양한 T 세포뿐 아니라 NKT 세포의 증식 (Hayworth, Immunol Cell Biol. 2012; 90(7):699-709) 유도할 수 있어, 그 자체로서 또는 특정 인자를 특이적으로 인식하는 표적 특이적 폴리펩타이드와 융합되어 사용될 경우, T 세포와 NKT 세포를 활성화로 인하여 생성된 향염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 세포독성 T 세포를 통하여 특정 인자를 발현하는 세포를 파괴할 수 있어 암과 같은 질환 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 항-HER2 scFv-SEBwt의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 항-HER2 scFv-SEBwt를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 항-HER2 scFv-SEBwt를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 항-HER2 scFv-SEB21를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB21의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 5 항-HER2 scFv-SEB22를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB22의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 항-HER2 scFv-SEB23를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB23의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 항-HER2 scFv-SEB24를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB24의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 8은 항-HER2 scFv-SEB25를 발현하는 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB25의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 9는 최종 정제된 항-HER2 scFv-SEBwt, 항-HER2 scFv-SEB21, 항-HER2 scFv-SEB22, 항-HER2 scFv-SEB23, 항-HER2 scFv-SEB24, 항-HER2 scFv-SEB25(이하 총칭 항-HER2 scFv-SEBs)의 쿠마시염색, 실버염색 및 웨스턴블랏 결과를 나타낸 것이다. 도 10은 항-HER2 scFv-SEBs의 HER2 항원 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질들의 탈면역화(de-immunization) 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질들의 T 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a는 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질들의 IL-2 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 13b는 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질들의 세포 상해성 T 임파구를 이용한 HER2를 과발현하는 암세포 제거능력을 나타낸 것이다.
도 13c는 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질의 세포 상해성 T 임파구를 이용한 Her2를 과발현하는 암세포에서의 세포 자살 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 13d는 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질의 활성화되지 않은 T 임파구를 이용한 Her2를 과발현하는 암세포의 제거능력을 나타낸 것이다.
도 13e는 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 단백질의 인비보 항암 활성을 나타낸 것이다.
도 14는 항-CD20 scFv의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 15는 항-CD20 scFv의 코돈 최적화 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 합성된 항-CD20 scFv를 포함하는 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 17은 항-CD20 scFv의 구조를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 18은 pRSET 벡터와 pET 벡터에 포함된 SEB와 항-CD20 scFv의 구조를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 19는 항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A 항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 20은 SEBwt-항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A SEBwt-항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 21은 SEB21-항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A SEB21-항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 22는 SEB22-항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A SEB22-항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 23은 SEB23-항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A SEB23-항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 24는 SEB24-항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A SEB24-항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 25는 SEB25-항-CD20 scFv를 발현하는 pRSET A SEB25-항-CD20 scFv의 개열지도이다.
도 26은 pRSET A-SEBwt의 개열지도이다.
도 27은 pRSET A-SEB21의 개열지도이다.
도 28은 pRSET A-SEB22의 개열지도이다.
도 29는 pRSET A-SEB23의 개열지도이다.
도 30은 pRSET A-SEB24의 개열지도이다.
도 31은 pRSET A-SEB25의 개열지도이다.
도 32는 aCD20 scFv, aCD20 scFv-SEB를 IPTG로 그 발현을 유도한 결과를 나타낸 것이다. 적색 화살표는 항-CD20 scFv (왼편) 및 항-CD20 scFv-SEBwt 및 변이체 (오른편) 단백질을 나타낸다.
도 33은 aCD20 scFv, aCD20 scFv-SEB를 IPTG로 그 발현을 유도한 후, 이를 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본원에서 구축된 다양한 pRSET 벡터에서 발현되는 단백질의 용해도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 35a는 pET22 벡터를 이용하여 발현된 가용성 단백질에 대한 세포ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 35b는 항-CD20 scFv-SEB의 세포 독성 T 임파구를 이용한 CD20를 발현하는 암세포 제거능력을 나타낸 것이다.
도 35c 및 d는 각각 항-CD20 scFv-SEBwt의 인비보 항암 활성과 이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 36은 항-HER2 경쇄와 항-HER2 Fd chain의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 37은 pHA-PEG-aHER2 Fd-SEB에 포함된 단백질 발현 시스템을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 38은 pLT-2-aHER2 light에 포함된 단백질 발현 시스템을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 39는 aHER2 Fd-SEB와 aHER2 경쇄를 포함하는 플라스미드 구축 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 40은 aHER2 Fab-SEB의 IPTG 유도 발현을 ELISA 로 확인한 결과이다. 도 41은 aCD20 Fd-SEBs와 aCD20 경쇄를 포함하는 플라스미드 구축 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 42는 aCD20 Fd-SEBs와 aCD20 경쇄의 발현을 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 43은 SEB를 포함하는 bi-specific, tri-specific, tetra-specific, multi-specific 형태의 융합단백질 제조 방법을 개략적으로 보여주는 모식도이다.
한 양태에서 본원은 T 세포에 대한 결합력에는 변화가 없으면서, 면역원성과 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 II에 대한 결합성이 감소를 초래하도록 변형된 스테필로코칼 엔테로톡신 (Staphylococcal enterotoxin) 유래의 초항원 B (SEB)의 변이체에 관한 것이다.
스테필로코칼 엔테로톡신(SE)은 초항원으로 불리는 박테리아 단백질로 22~30kDa의 단쇄의 구형 단백질이다. SE는 계통발생학적으로 크게 두 그룹으로 나눌 수 있으며 clade I은 SEA, SEE, SED 및 스트렙토코칼 독소 (streptococcal toxin) 인 SPEC으로 구성되고, clade II는 SEC, SEB, 스트렙토코칼 독소 SPEA로 구성되어있다. 각 그룹의 아미노산 상동성은 51-81%(clade I) 및 42-67%(clade II)로(Int J Food Microbiol 61; 1-10 (2000)), 각각의 SEA~SEE는 서로 다른 마우스와 인간 TCR(T cell receptor)의 Vβ 영역에 결합하는 것으로 알려져 있으며(Toxins 2; 1898-1912 (2010)), 서로 다른 MHC Class II 결합 부위에 결합하는 것으로 알려져 있다(Clin Exp Immunol 133; 299-306 (2003)). 또한, SE는 MHC class II와 T 세포에 동시에 결합함으로써 T 세포를 비특이적으로 활성화시키고, 그로 인해 다량의 사이토카인(TNF-α, IL-1, IFN-γ, IL-2, MIP-1 등)이 분비되는 것으로 알려져 있다. 즉 SE는 T 세포의 활성화로 인해 생산된 향염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 세포독성 T 세포를 통하여 표적 세포를 살해하는 장점을 지닌다. 하지만 SE는 MHC class II를 가진 다른 세포와도 작용하여 MHC class II를 발현하는 다른 장기에도 축적되고, SE에 대한 항체가 생성되어 SE의 기능이 제대로 발휘되지 못하는 문제점이 있었다. 특히 SEB의 경우 혈액 내에 이미 존재하는 항체의 타이터 (TSST>SEB>SEC-1>SEC2>SEA>SED>SEE)가 높다.
본원에 따른 변이체는 이러한 야생형 SEB가 갖는 문제점을 해결한 것으로, 다음과 같은 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 SEB의 면역원성을 감소시키고, MHC 클래스 II에 대한 결합성을 감소시켰다.
본원에 따른 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 개시된 야생형 SEB 서열을 기준으로 다음과 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: 7 번째 Lys이 Thr 또는 Asn; 8 번째 Pro이 Glu 또는 Gln; 9 번째 Asp이 Ser 또는 Lys; 14 번째 Ala이 Ser 또는 Thr; 36 번째 Ile이 Glu 또는 Thr; 43 번째 Gln이 Lys; 44 번째 Phe이 Gly 또는 His; 45 번째 Leu이 Thr; 46 번째 Tyr이 Lys; 47 번째 Phe이 His; 52 번째 Ser이 Pro; 56 번째 Thr이 Trp; 72 번째 Asp이 Trp 또는 Phe; 93 번째 Tyr이 His; 95 번째 Ser이 Pro; 96 번째 Glu이 Lys; 101 번째 Asp이 Val 또는 Ile; 103 번째 Asn이 Asp 또는 Asn; 104 번째 Ser이 Glu; 105 번째 His이 Gly; 107 번째 Thr이 Trp 또는 Phe; 108 번째 Asp이 Trp 또는 Phe; 122 번째 Asn이 Asp 또는 Asn; 125 번째 His이 Gln 또는 Glu ; 127 번째 Asp이 Ser;128 번째 Lys이 Asp 또는 Gln; 138 번째 Asp이 Gly; 140 번째 Lys이 Gly; 142 번째 Leu이 Ser; 191 번째 Ser이 Asn 또는 Asp; 192 번째 Glu이 Gly; 206 번째 Asp이 Gly; 207 번째 Lys이 Tyr 또는 Phe; 209 번째 Asp이 Met; 212 번째 Lys이 Ser, Glu, 또는 Val; 또는 222 번째 Leu이 Met으로의 치환.
본원에 따른 효과를 가지는 한, 상술한 바와 같은 치환 범위내에서 다양한 조합 (아미노산의 위치 및 각 위치에서의 아미노산의 종류)의 변이체가 본원에 포함될 수 있다.
예를 들면 본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 변이체는 하기 모든 위치에서, 각 위치에 기재된 어느 하나의 아미노산으로의 치환을 포함한다: 7 번째 Lys이 Thr 또는 Asn; 8 번째 Pro이 Glu 또는 Gln; 9 번째 Asp이 Ser 또는 Lys; 14 번째 Ala이 Ser 또는 Thr; 36 번째 Ile이 Glu 또는 Thr; 52 번째 Ser이 Pro; 56 번째 Thr이 Trp; 72 번째 Asp이 Trp 또는 Phe; 93 번째 Tyr이 His; 95 번째 Ser이 Pro; 96 번째 Glu이 Lys; 103 번째 Asn이 Asp 또는 Asn;104 번째 Ser이 Glu; 105 번째 His이 Gly; 107 번째 Thr이 Trp 또는 Phe; 108 번째 Asp이 Trp 또는 Phe; 122 번째 Asn이 Asp 또는 Asn; 125 번째 His이 Gln 또는 Glu ; 127 번째 Asp이 Ser; 128 번째 Lys이 Asp 또는 Gln; 138 번째 Asp이 Gly; 140 번째 Lys이 Gly; 142 번째 Leu이 Ser; 191 번째 Ser이 Asn 또는 Asp; 192 번째 Glu이 Gly; 206 번째 Asp이 Gly; 207 번째 Lys이 Tyr 또는 Phe;및 222 번째 Leu이 Met으로의 치환. 본원에 따른 다른 구현예에서는 상기 상기 치환은 하기 하나 이상의 치환을 부가적으로 포함한다: 43 번째 Gln이 Lys; 44 번째 Phe이 Gly 또는 His; 45 번째 Leu이 Thr; 46 번째 Tyr이 Lys; 47 번째 Phe이 His; 101 번째 Asp이 Val 또는 Ile; 209 번째 Asp이 Met; 또는 212 번째 Lys이 Ser, Glu, 또는 Val. 본원에 따른 다른 구현예에서, 본원에 따른 SEB 변이체는 서열번호 2 내지 6으로 표시될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 SEB 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로, 예를 들면 서열번호 33 내지 38 중 어느 하나로 표시될 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드의 mRNA로의 발현 또는 mRNA의 단백질로의 발현을 조절하는 서열, 예를 들면 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하는 벡터 또는 플라스미드에 관한 것이다. 본원에 따른 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포에서의 증폭 및/또는 발현을 위해 공지된 적절한 조절 서열 및 벡터에 연결될 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 벡터 및 조절서열이 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서, 이러한 벡터는 표 6-2 (도 26 내지 도 31의 기재 참조) 또는 표 7-2의 벡터 중 어느 하나를 예로 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것으로, 숙주세포는 본원에 따른 벡터의 증폭 및/또는 벡터가 발현하도록 되어 있는 단백질의 생산을 위한, 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함하는 것이다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 세포가 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 대장균(E.coli), 포유동물 세포(Mammalian cell), 효모(Yeast), 식물 세포(Plant cell), 곤충 세포(Insect cell)를 포함한다.
숙주세포를 본원에 따른 벡터로 형질전환하는 방법은 공지된 것으로, 예를 들면, 칼슘포스페이트 침전법, 샷건 방법, 리포좀을 이용한 방법, 나노니들 또는 전기천공법등 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에 따른, T 세포에 대한 결합력은 유지하면서, 면역원성이 감소되고, MHC class II 결합능력이 감소된 SEB 변이체는 T 림프구에 결합하여 면역계를 활성화하여 세포의 살해를 유도할 수 있는 효과기로서의 기능이 향상된 것이다. 이러한 측면에서 본원은 하나 이상의, 야생형 SEB 또는 상술한 바와 같은 본원의 변형된 SEB 및 표적 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.
본원에 따른 표적 특이적 폴리펩타이드는 특정 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 예를 들면 세포 표면에 존재하는 단백질 마커 또는 기타 항원으로서 작용할 수 있는 인자를 특이적으로 인식하여 이에 결합할 수 있는 것이다. 예를 들면 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현에서, 항체는 폴리클로날, 모노클로날 항체, 또는 키메라 또는 인간화 항체, 전장 항체 또는 그 단편을 포함하는 것이다. 본원에 따른 다른 구현예에서, 항원결합단편은 전장 항체 중에서 항원결합 부위의 전부 또는 일부를 포함하는 것으로, 예를 들면 scFv (후술하는 내용 참조), BITE (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), TandAb(예를 들면 미국 공개특허 제2005-089519호 참조), Immunobody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-146505호 참조), Flexibody (예를 들면 미국 특허 제6838254호 참조), Nanobody (예를 들면 미국 공개특허 제2003-088074호 참조), Triomab (예를 들면 미국 특허 제6551592호 참조), Troybody (예를 들면 미국 특허 제6294654호 참조), Pepbody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-101905호 참조), Vaccibody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-253238호 참조), SMIP (예를 들면 미국 공개특허 제2008-227958호 참조), Fab (fragment antigen binding fragment, 실시예의 내용 참조), mAb2 (예를 들면 미국 공개특허 제2009-298195호 참조), UniBody(예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Fv (Fragment variable), dAB (예를 들면 미국 공개특허 제2006-280734호 참조), ScFv-Fc, Diabody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Tetrabody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Minibody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), scFab(single chain Fab), Fcab (예를 들면 미국 공개특허 제2009-298195호 참조)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 다른 구현예에서 항체 모방체는 DARPin (예를 들면 미국 특허 제7417130호 참조), Tetranectin(예를 들면 미국 공개특허 제2004-132094호 참조), Affibody (예를 들면 미국 특허 제5831012호 참조), Transbody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-023334호 참조), Anticalin (예를 들면 미국 특허 제7250297호 참조), AdNectin (예를 들면 미국 특허 제6818418호 참조), Affilin (예를 들면 미국 특허 제7838629호 참조), Microbody (예를 들면 미국 특허 제7186524호 참조), Peptide aptamer (예를 들면 미국 특허 제6004746호 참조), Phylomer (예를 들면 미국 특허 제6994982호 참조), Stradobody (예를 들면 미국 공개특허 제2010-239633호 참조), Avimer (예를 들면 미국 특허 제7803907호 참조), Evibody (예를 들면 미국 특허 제7166697호 참조), 또는 Fynomer (예를 들면 미국 공개특허 제2010-119446호 참조)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 융합단백질에 포함되는 각 구성 즉, SEB 및 상술한 바와 같은 표적 특이적 폴리펩타이드는 각각 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있으며, 방향은 예를 들면 융합되는 특이적 폴리펩타이드의 종류에 따라 결정될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 SEB 또는 그 변이체가 N-말단에 위치한다.
본원에 따른 융합단백질은 링커를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 따른 링커는 융합단백질에 포함되는 각 단백질을 서로 연결하는 분자로서, 본원에 따른 융합단백질의 효과를 달성하는 한, 공지된 다양한 종류 및 길이의 링커가 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 폴리펩타이드 링커가 사용될 수 있으며, 유연성, 또는 비유연성 링커가 사용될 수 있으며, 당업자라면 본원에 기술된 내용 및 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여, 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 링커는 유연성(flexible)이 있어야 하며, 단백질분해효소에 의해 분해되지 않으며 면역원성이 없거나 낮은것이어야 한다. 본원에 따른 일구현예에서는 SEB가 효과적으로 기능할 수 있도록 하기 위해, 서열번호 31 또는 32로 표시되는 폴리펩타이드 링커가 사용된다 다른 구현예에서는 GGGGS, GGGGSGGGGS, 또는 GGGGSGGGGSGGGGS 또는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG와 같은 링커 (상기 서열에서 G는 글라이신, S는 세린, T는 트레오인, K는 라이신, P는 프롤린, E는 글루탐산을 나타냄)가 사용될 수 있다.
본원에 따른 융합단백질은 상술한 바와 같은 표적 특이적 폴리펩타이드를통해 특정 인자을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있다.
이런 측면에서 본원에 따른 융합단백질은 이에 포함되는 표적 특이적 폴리펩타이드의 종류에 따라 다양한 인자에 결합 할 수 있다. 이러한 인자는 주로 세포 표면에 존재하여, 본원에 따른 융합단백질의 효과를 고려하여, 일정 세포에 특이적으로 발현되는 인자를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 세포는 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포이며, 인자는 이러한 세포에서 특이적으로 발현되는 비수식 또는 수식된 (modified) 단백질일 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 암과 관련된 세포로, 암에서 특이적으로 발현되는 마커 또는 인자에 결합 수 있다. 이러한 세포 표면에서 발현되는 인자는 공지되어 있으며, 본원에 따른 융합단백질을 사용하고자 하는 구체적 표적에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 유방암, 또는 난소암 마커인 HER2, 림프종 마커인 CD20가 사용된다.
상술한 바와 같은 인자를 표적으로 하는 폴리펩타이드는 상술한 바와 같은 다양한 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체의 맥락에서 제조될 수 있으며, 본원에 따른 일 구현예에서는 ScFv 또는 Fab가 사용되나, 이로 제한하는 것은 아니다. ScFv (Single chain Fv)는 항체분자의 결합 부위 중 최소 단위인 VH와 VL을 아미노산 폴리펩타이드 링커로 연결한 형태이고(Anal Biochem 205, 263-270 (1992)), Fab는 항체 분자의 항원 결합 부분만을 사용한 것으로 scFv 보다 안정된 구조를 가진다(Int J Cancer 57, 856-864 (1994)).
본원에 따른 표적 폴리펩타이드가 결합할 수 있는 인자에 대한 결합영역을 포함하는 다양한 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체의 맥락에서 제조되어, 본원에 따른 다양한 하나 이상의 SEB와 융합될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 HER2를 표적으로 하는 scFv 및 Fab가 본원에 따른 SEB와 융합된 단백질이 제공되며, 예를 들면 이는 각각 서열번호 39 내지 44 중 어느 하나 (HER2를 표적으로 하는 ScFv 융합단백질) 및 서열번호 63 내지 68 중 어느 하나와 서열번호 69의 아미노산 서열(HER2를 표적으로 하는 Fab (Fd 서열 + light chain 서열) 융합단백질)로 표시된다. 본원에 따른 다른 구현예에서는 CD20를 표적으로 scFv 및 Fab가 본원에 따른 SEB와 융합된 단백질이 제공되며, 예를 들면 이는 각각 서열번호 45 내지 50 중 어느 하나 (CD20를 표적으로 하는 ScFv 융합단백질) 및 서열번호 70 내지 75 중 어느 하나와 서열번호 76의 아미노산 서열 (CD20를 표적으로 하는 Fab (Fd 서열 + light chain 서열) 융합단백질)로 표시되나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 효과를 나타내는 한 본원의 융합단백질에 포함되는 SEB 및 표적 특이적 폴리펩타이드는 각각 하나 이상 포함될 수 있으며, N- 또는 C-말단에 다양하게 위치할 수 있다. 또한, 하나 이상을 포함하는 경우, 각각의 구성 단백질은 중복적, 반복적 또는 무작위로 조합될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 상술한 바와 같은 본원에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 HER2를 표적으로 하는 융합단백질이 제공되며 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 51 내지 56 (scFv) 및 77 내지 82 중 어느 하나와 서열번호 83(Fab)으로 표시되며, 다른 구현예에서는 CD20를 표적으로 하는 융합단백질이 제공되며 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 57 내지 62 (scFv) 및 84 내지 89 중 어느 하나와 서열번호 90 (Fab)으로 표시되나 이로 제한하는 것은 아니다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드의 mRNA로의 발현 또는 mRNA의 단백질로의 발현을 조절하는 서열, 예를 들면 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본원에 따른 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포에서의 증폭 및/또는 발현을 위해 공지된 적절한 벡터 및 조절 서열과 연결될 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 벡터 및 조절서열이 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포, 즉 재조합 세포주에 관한 것으로, 숙주세포는 본원에 따른 벡터의 증폭 및/또는 벡터가 발현하도록 되어 있는 단백질의 생산을 위한, 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함하는 것이다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 세포가 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 이러한 벡터는 예를 들면 본원의 표 3 (또한 도 3 내지 도 8 참조), 표 6-1 (또한 도 20 내지 도 25 참조), 표 7-1, 표 10 및 표 13에 개시된 것을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
숙주세포를 본원에 따른 벡터로 형질전환하는 방법은 공지된 것으로, 예를 들면, 칼슘포스페이트 침전법, 샷건 방법, 리포좀을 이용한 방법, 나노니들 또는 전기천공법등 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한, 상기 제작된 재조합 세포주를 배양하는 단계; 및 세포주로부터 표적 특이적 융합단백질을 분리하는 단계를 포함하는 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본원에 따른 융합단백질은 특정 인자에 결합한 후 T 세포 매개된 면역시스템을 활성화하여 세포를 사멸시키는 효과를 갖는 것으로, 이러한 측면에서 본원은 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 T-세포 매개된, 표적 세포 붕해용 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 약학 조성물은 상기 붕해되는 세포의 종류의 따라 구체적 질환 치료제로 제공될 수 있다. 예를 들면 상기 표적 세포는 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포일 경우, 각각 암치료제, 자가면역질환치료제, 미생물감염 치료제 등으로 칭할 수 있다.
본원의 조성물이 사용될 수 있는 질환은 특히 제한되는 것은 아니며, 표적 세포의 종류의 따라 다양한 질환이 포함될 수 있으며, 예를 들면 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증,항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 칸디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis)을 포함하는 미생물감염과 관련된 질환 등의 치료에 사용될 수 있다.
표적 세포는 다양한 질환 유래 예를 들면 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암 및/또는 간암일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 표적 세포는 각 세포에서 특이적으로 발현되는 인자를 특히 그 표면에 발현하는 것으로, 본원에 따른 일구현예에서 상기 표적 세포는 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포이며, 특히 암세포 이며, 이 경우 상기 인자는 암세포 특이적 인자이다. 본원에 따른 상기 암세포 특이적 인자는 예를 들면 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)를 포함하나, 이로 제한 되는 것은 아니다.
또한 본원의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 담체란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.
필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명으로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본원의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.01μg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01μg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본원에 따른 융합단백질은 T 세포 매개된 면역계를 활성화시켜 특정 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. 이러한 측면에서 본원은 또한 인비보 또는 인비트로에서 T-세포 매개된, 표적 세포의 붕해(lysis) 방법이다. 일 구현예서 상기 방법은 표적 세포를 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 단백질은 상기 표적 세포의 표면에 존재하는 인자를 특이적으로 인식한다. 본원의 방법이 효과가 있는 표적 세포는 그 세포에 특이적인 인자를 발현하는 것으로, 예를 들면 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일구현예에서는 암과 관련된 것으로, 이에 관한 인자는 앞서 언급한 바와 같다.
이러한 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 표적 특이적 융합단백질, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 약학조성물의 치료적 유효량을 암과 같은 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 따른 융합단백질은 면역계의 활성을 통해 융합단백질이 결합되는 세포의 사멸을 유도하여 암을 치료하는 것으로 본원의 융합단백질에 포함된 표적 특이적 폴리펩타이드가 인식하는 인자에 따라 다양한 암의 치료에 사용될 수 있으며, 그 예는 앞서 언급한 것을 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 방법이 사용될 수 있는 암은 HER2 또는 CD2가 과발현되는 암, 예를 들면 유방암, 난소암, 자궁암 및 위암 중 어느 하나이거나, CD20가 과발현되는 암인 비호지킨 림프종, 만성림프성 백혈병, 류마티스 관절염 및 모발상세포 백혈병 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본원의 방법에 사용되는 융합단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 조성물과, 투여량, 투여방법 및 치료 가능한 암의 종류는 앞서 설명한 것을 참조하면 된다.
본원에서 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SEB 및 SEB 변이체 구축
본원에서는 면역계를 이용하여 특정 항원을 발현하는 세포를 살해하는, 이펙터(effector)로서, SEB(staphylococcal Enterotoxin B)를 이용하였으며, 본원에서 이용된 야생형 SEB의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같다.
SEB 단백질에서 MHC class II와의 결합 및 면역원성(immunogenecity)을 감소시키면서 T 세포와의 결합에는 영향을 미치지 않는 SEB의 변이체 서열을 결정하였으며, SEB 변이체 서열은 서열번호 2 내지 6과 같으며 이는 각각 SEB21, SEB22, SEB23, SEB24 및 SEB25로 표시된다.
상기 고안된 SEB 및 SEB 변이체 서열들은 Cosmo Genetech (대한민국)에 의뢰하여 유전자를 합성하였으며, SEB 야생형 서열인 SEBwt, 변이체 서열인 SEB21, SEB22, SEB23, SEB24 및 SEB25 유전자는 pUC57 플라스미드에 클로닝 되었으며, 이는 각각 pCSM125-1, pCSM125-2, pCSM219-1, pCSM125-3, pCSM219-2, 및 pCSM125-4로 명명되었다.
서열번호 서열
1 SEB 야생형의 아미노산 서열
2 SEB 변이체 SEB21의 아미노산 서열
3 SEB 변이체 SEB22의 아미노산 서열
4 SEB 변이체 SEB23의 아미노산 서열
5 SEB 변이체 SEB24의 아미노산 서열
6 SEB 변이체 SEB25의 아미노산 서열
33 SEB 야생형의 염기 서열
34 SEB 변이체 SEB21의 염기 서열
35 SEB 변이체 SEB22의 염기 서열
36 SEB 변이체 SEB23의 염기 서열
37 SEB 변이체 SEB24의 염기 서열
38 SEB 변이체 SEB25의 염기 서열
실시예 2. HER2 에 특이적으로 결합하는 scFv 및 SEB 를 포함하는 융합단백질의 제조
2-1. HER2 에 대한 scFv 서열의 고안 및 발현 벡터 구축
본 실시예에서는 특정 세포에서 특이적으로 발현되는 인자로서 암세포 성장에 관여하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor 2)를 사용하고 이를 특이적으로 인식하는 항체의 단편으로 scFv(단쇄가변분절, single-chain variable fragment)(항-HER2 scFv)를 이용하였다.
scFv(Single chain Fv)는 항체 분자의 결합 부위 중 최소한의 단위로 여겨지는 VH와 VL을 15개의 아미노산 폴리펩타이드 링커(서열번호 31: GGGGSGGGGS GGGSG, G(glycine), S(serine))로 연결한 형태로(Anal Biochem 205, 263-270 (1992)), 항-HER2 scFv 서열은 Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 no. 5 pp. 481-489, (2004) 논문을 참조하여 고안하였다.
상기 고안된 항-HER2 scFv 서열은 CosmoGenetech에 유전자 합성을 의뢰하였으며, 이를 통해 합성된 항-HER2 scFv 유전자는 pUC57 플라스미드에 클로닝 되었으며,플라스미드는 pCSM137로 명명되었다.
2-2. 항-HER2 scFv 및 SEB를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제작
항-HER2 scFv 및 SEBwt, 또는 각 변이체를 포함하는 융합단백질을 제조하기 위하여, SEB-항-HER2 scFv를 발현하는 재조합 벡터를 제작하였으며, 이를 위해, 실시예 1 및 2-1에서 합성된 SEBwt, 또는 각 변이체, 또는 항-HER2 scFv 유전자 단편을 하기 기술한 바와 같이 BamHI, EcoRI, HindIII의 제한효소로 절단 한 후, 그 사이에 SEB와 항-HER2 scFv 사이에 20개의 유연(flexible) 링커(서열번호 32: GGSGGEFGGGGSGGSGSGGG; E:glutamic acid, F: phenylalanine)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 라이게이션 한 후, 이를 pRSET-A 벡터에 클로닝하여 SEBwt 또는 각 변이체와 항-HER2 scFv 융합형태로 발현하는 pRSET A SEBwt-항-HER2 scFv, pRSET A SEB21-항-HER2 scFv , pRSET A SEB22-항-HER2 scFv , pRSET A SEB23-항-HER2 scFv , pRSET A SEB24-항-HER2 scFv 벡터, 및 pRSET A SEB25-항-HER2 scFv 를 벡터를 제조하였다 (도 1 및 도 3 내지 8 참조).
구체적으로, 합성된 항-HER2 scFv는 N-말단에 HindIII 부위를 가지고 있으므로, EcoRI 부위로 대체하기 위하여 PCR을 실시하였으며, 그 PCR 방법은 다음과 같다. 항-HER2 scFv 단백질을 코딩하는 플라스미드인 pCSM137을 주형으로 하여, EcoRI 부위를 포함하는 5’ 프라이머 EcoRIscFv-F (서열번호 7; 5＇- CGG GAA TTC GGC GGT GGA GGC T-3＇)과 HindIII 부위를 포함하는 3’프라이머 scFvHidIIINotI-R (서열번호 8; 5＇-GGC CCG CGG CCG CAA GCT TTT ATT TGA-3＇)를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 EcoRI과 HinIII으로 처리한 후, BamHI과 EcoRI으로 처리된 SEBwt과 BamHI과 HindIII로 처리된 pRSET A 벡터를 1:1:1로 넣어 라이게이션을 수행하였다. 형질 전환은 RBC 사의HIT™ -DH5a Value 108 (Cat.No. RH617)을 제조자의 방법대로 사용하였다.
SEB 각 변이체에 대해서도 상술한 SEBwt과 동일한 방법으로 융합단백질을 발현하는 벡터를 구축하였으며, 조합 벡터 내 포함된 코딩 단백질 및 그 아미노산 및 염기 서열은 하기 표 3 및 4와 같다.
서열번호 프라이머 서열(5＇- 3＇)
7 EcoRIscFv-F CGG GAA TTC GGC GGT GGA GGC T
8 scFvHindIIINotI-R GGC CCG CGG CCG CAA GCT TTT ATT TGA
재조합 벡터 명칭 코딩 단백질
pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt 항-HER2 scFv-SEBwt
pRSET A 항-HER2 scFv-SEB21 항-HER2 scFv-SEB21
pRSET A 항-HER2 scFv-SEB22 항-HER2 scFv-SEB22
pRSET A 항-HER2 scFv-SEB23 항-HER2 scFv-SEB23
pRSET A 항-HER2 scFv-SEB24 항-HER2 scFv-SEB24
pRSET A 항-HER2 scFv-SEB25 항-HER2 scFv-SEB25
서열번호 서열
39 pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt 아미노산 서열
40 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB21 아미노산 서열
41 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB22 아미노산 서열
42 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB23 아미노산 서열
43 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB24 아미노산 서열
44 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB25 아미노산 서열
51 pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt 염기 서열
52 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB21 염기 서열
53 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB22 염기 서열
54 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB23 염기 서열
55 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB24 염기 서열
56 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB25 염기 서열
2-3. 재조합 융합단백질의 발현
상기 실시예 2-2에서 구축된 각 플라스미드 pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt, pRSET A 항-HER2 scFv-SEB21, pRSET A 항-HER2 scFv-SEB22, pRSET A 항-HER2 scFv-SEB23, pRSET A 항-HER2 scFv-SEB24, pRSET A 항-HER2 scFv-SEB25 (도 3, 4, 5, 6, 7 및 8)로부터 HER2 항체의 scFv 및 SEB를 포함하는 재조합 융합단백질을 획득하기 위하여, 상기 제작된 각 플라스미드를 Genlantis의 SoluBL21TM 세포를 제조자의 방법대로 형질전환시킨 후, 재조합 융합단백질의 발현을 유도하고, 수용성 형태로 정제하였다.
구체적으로, 먼저 37℃에서 하룻밤 동안 종균 배양한 후, LB Broth Miller medium(Novagen, Yeast extract 5g, peptone from casein 10g, sodium chloride 10g)에 앰피실린(Ampicillin) 50μg/ml 을 첨가한 배양액 속에서 37℃로 키웠다. OD600 nm의 흡광도에서 그 값이 0.4~0.5 사이가 되면 온도를 18℃로 낮춘 후, OD600 nm의 흡광도에서 그 값이 0.8~1.0 정도에 도달했을 때, 최종 0.5mM의 농도가 되도록 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도시킨 후 180rpm에서 15시간 동안 진탕 배양하였다. OD600nm의 흡광도에서 그 값이 1.5~2.0 정도로 자란 박테리아 세포들은 10,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 침전시킨 후, 침전된 세포2g (1L culture volume)당 50ml의 붕해 완충액(300mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Triton X-100)으로 세포가 완전히 현탁될 때까지 교반시켰다. PMSF를 최종 농도 1mM이 되게 넣은 후, 초음파 분쇄기로 세포를 융해하였다. 융해된 세포는 12000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 하여 현탁액과 총 융해물을 분리한 후, 현탁액만을 모아 0.45μm의 기공 크기의 셀룰로오스 여과 막에 여과하여 미리 평형 완충액으로 평형화시킨 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다.
150mM 이미다졸(imidazole) 근처에서 용출되어 나온 바인딩 분획을 모아 음이온 교환 수지 크로마토그래피 컬럼 평형 완충액으로 3배 희석시킨 후 음이온 교환 수지 크로마토그래피 컬럼에 로딩했다. 컬럼을 통과(flow through)한 단백질 용액을 모아 12% SDS-PAGE로 순도를 확인한 후 불순물이 분리되었는지 확인한 후 1X PBS로 완충액 교환 및 농축하여 BIO-RAD사의 protein assay dye reagent concentrate (#500-0006)을 사용하여 정량 하였다.
정제된 단백질은 SDS-PAGE 분석(Coomassie staining, Silver staining) 를 실시하고, 항-His mAb를 이용하여 웨스턴블랏을 통해 확인하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 얻어진 단백질은 엔도톡신을 제거하기 위해 단백질 부피의 1% 가량의 Triton X-114를 넣고 잘 혼합하여 제거한 후 최종 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질을 SDS-PAGE에 로딩한 다음, 쿠마시 염색, 실버 염색을 수행하여 정제된 단백질을 확인하였으며, 히스티딘 태그(his tag)를 인식할 수 있는 Anti-His 항체 및 SEB를 인식할 수 있는 항-SEB 항체를 이용하여, 웨스턴블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이, 쿠마시 염색 및 실버 염색을 통해 순수하게 정제된 항-HER2 scFv-SEB 재조합 융합단백질을 확인할 수 있었으며, Anti-SEB pAb를 사용하여 변이체간의 폴리클로날 SEB 항체 결합 능력이 상이함을 확인하였다.
2-4. 시험관내(In vitro) 분석
1) 결합 능력 분석
상기 실시예 2-3 에서 정제된 각각의 융합단백질은 ㈜에이앤알쎄라퓨틱스에서 구입한 ERBB-2 단백질을 이용하여 그 결합 능력을 분석하였다.
ERBB-2 단백질은 ERBB2 유전자에 의해 코딩되는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)로도 알려진 단백질로, 상기 정제된 단백질의 HER2 에 대한 결합 능력은 ERBB-2 단백질에 대한 ELISA를 통해 측정하였다. 그 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
HER2 단백질을 Bicarbonate/carbonate coating buffer(50mM)에 0.1μg/웰이 되게 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 코팅 용액(coating solution)을 제거한 후, 3% 탈지 분유가 들어있는 PBS로 상온에서 1시간 배양하였다. PBST 완충용액(PBS, 0.05% Tween-20)으로 4번 세척한 후, 항-HER2 scFv-SEBwt, 항-HER2 scFv-SEB21, 항-HER2 scFv-SEB22, 항-HER2 scFv-SEB23, 항-HER2 scFv-SEB24, 항-HER2 scFv-SEB25를 PBST 완충용액에 1μg/ml, 0.1μg/ml, 0.01μg/ml, 0.001μg/ml되도록 희석한 후, 상온에서 2시간 동안 배양하였다. PBST 완충용액으로 5번 세척 후 항-인간 카파 경쇄-HRP를 PBST 완충용액으로 1/3000배로 희석하여 웰당 100μl를 넣어 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 다시 PBST 완충용액으로 10번 세척 후, TMB 기질 용액을 처리한 후 상온에서 색이 변하기 시작하면 2M 황산을 넣어 중지시켰다. 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서 제작된 항-HER2 scFv 및 SEB 또는 그 변이체가 융합된 재조합 융합단백질은 HER2 항원에 대해 농도 의존적으로 결합되는 것을 확인하였으며, 항-HER2 scFv의 결합 활성은 모든 단백질에서 거의 동일한 수준으로 확인되었다.
2) 탈면역화(De-immunization) 분석
SEB의 탈면역화(de-immunization) 정도를 측정하기 위하여 인간 혈청을 이용하여 실험을 수행하였다. 인간 혈청은 건강한 자원자의 혈액을 수득하여, 이를 피콜로 처리한 후 원심분리 방법을 통해 수득하였다.
구체적으로 항-HER2 scFv-SEBwt, 항-HER2 scFv-SEB21, 항-HER2 scFv-SEB22, 항-HER2 scFv-SEB23, 항-HER2 scFv-SEB24, 항-HER2 scFv-SEB25를 Bicarbonate/carbonate coating buffer(50mM)에 0.1μg/웰이 되게 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 코팅 용액을 제거한 후, 3% 탈지 분유가 들어있는 PBS로 상온에서 1시간 배양하였다. PBST 완충용액(PBS, 0.05% Tween-20)으로 4번 세척한 후, 15명 각각의 혈청을 PBST 완충용액으로 1/1000배 희석하여, 웰당 100μl를 넣어 1시간 동안 상온에서 배양하였다. PBST 완충용액으로 10번 세척한 후 항-인간 IgG Fc 항체-HRP를 PBST 완충용액으로 1/50000배로 희석하여 웰당 100μl를 넣어 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 다시 PBST 완충용액으로 10번 세척 후 TMB 기질 용액을 처리한 후 상온에서 색이 변하기 시작하면 2M 황산을 넣어 중지시켰다. 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 개별 혈청 시험(Individual serum test) 결과, 항-HER2 scFv-SEBwt이 이미 존재하는 항체에 대한 결합 능력이 가장 높은 것으로 나왔으며, 항-HER2 scFv-SEB23> 항-HER2 scFv-SEB24> 항-HER2 scFv-SEB22> 항-HER2 scFv-SEB21= 항-HER2 scFv-SEB25 순의 강도로 결합 패턴을 확인하였다. 이는 본원에 따른 SEB 변이체가 야생형과 비교하여 탈면역화된 것을 나타낸다. SEB 같은 경우 이미 중화 항체가 상당히 존재할 가능성이 크고 이로 인해 우리가 만든 단백질이 제대로 작동하지 못할 가능성이 크기때문에,이를 방지하기 위하여 이미 존재하는 SEB에 대하여 항체가 SEB에 결합하지 못하게 SEB를 변이를 통해 탈면역화가 필요하다.
3) 인간 CD4+ T 세포 증식능 분석
항- HER2- scFv 및 SEB를 포함하는 융합단백질에서 SEB가 이펙터로서 기능하는지 알아보기 위해, T 세포 증식 정도를 분석하였으며, 이를 위해 CD4+ T 세포를 분리하여 이용하였고, 그 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
96-웰 플레이트에 항-HER2 scFv-SEBwt, 항-HER2 scFv-SEB21, 항-HER2 scFv-SEB22, 항-HER2 scFv-SEB23, 항-HER2 scFv-SEB24, 항-HER2 scFv-SEB25를 Bicarbonate/carbonate coating buffer(50mM)에 10μg/ml, 1μg /ml, 0.1μg /ml, 0.01μg /ml, 0.001μg /ml이 되게 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 단백질 코팅 후 버퍼를 제거하고 PBS로 세 번 세척하였다. 신선한 혈액으로부터 피콜(ficoll)을 이용하여 PBMC를 분리 한 후 MACS 마이크로비드(bead)(Milteny biotech, CD4 + T Cell Isolation Kit II)를 제조자의 방법대로 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다.
분리된 CD4+ T 세포를 앞서 세척이 끝난 웰에 2x105/웰이 되게 넣고 3일간 습윤한 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후 1μCi 티미딘(Thymidine)으로 18시간 동안 펄스(pulse)를 준 후 방사능을 측정하였다. 양성 대조군으로는 항-CD3 항체를 1μg/ml되게 사용하였고, 음성 대조군으로 PBS를 사용하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, CD4+ T 세포에 대한 증식능은 항-HER2 scFv-SEBwt> 항-HER2 scFv-SEB24> 항-HER2 scFv-SEB21> 항-HER2 scFv-SEB22= 항-HER2 scFv-SEB23> 항-HER2 scFv-SEB25순의 패턴임을 확인하였으며, 이를 통해 본 원에 따른 항-HER2 scFv-SEB 융합단백질들은 CD4+ 세포에 대한 증식능이 있어, 효과기로서 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.
4) 인터루킨 2 사이토카인(IL-2 cytokine) ELISA 분석
항-HER2 scFv-SEBwt, 항-HER2 scFv-SEB21, 항-HER2 scFv-SEB24, 항-HER2 scFv-SEB25 (이하 항-HER2 scFv-SEBs) 재조합 융합단백질에 의해 인간 PBMC가 활성화되는지의 여부를 확인하기 위하여, 인간 사이토카인 중 하나인 인터루킨 2 에 대한 ELISA를 수행하였다.
IL-2(Interleukin-2) 는 대표적인 면역 사이토카인의 하나로서, 특히, T 세포의 성장과 분화에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 따라서, PBMC에서의 IL-2의 발현양의 측정은 T 세포의 활성화를 간접적으로 확인할 수 있다.
본 실시예에서는 인간 혈액으로부터 분리된 말초혈액단핵세포(huPBMC)를 상기 정제된 항-HER2 scFv-SEB를 사용하여 활성화시킨 후, 인간 IL-2 사이토카인 ELISA kit(R&D Systems, DY202)를 제조자의 방법대로 사용하여 발현된 IL-2의 양을 측정하였다.
구체적으로 인간 혈액 100ml을 1x PBS(바이오세상, P2007P)와 1:1로 희석한 뒤, 그 혼합액 40ml을 10ml 피콜(ficoll)(BD, 17-1440-03)이 담겨있는 50ml 튜브에 층이 이루어지도록 로딩한 뒤, 2000rpm으로 30분 동안 20℃에서 원심분리를 수행하였다. 이후 얻어진 백혈구층(buffy coat)을 분리하여 1x PBS로 1회 세척한 후, 1500rpm 4℃ 5분 동안 원심분리하여 PBMC를 분리하였다. 이후 얻어진 PBMC는 RPMI(Gibco, GIB-11875-093)에 10% FBS(Gibco, GIB-16000-044)가 함유된 유지 배지에 1 x 106 세포/ml 로 배양하였다. 48웰 플레이트의 웰당 분리된 PBMC 2 x 106 세포를 넣고, 정제 단백질은 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml의 농도로 각각 넣었다. 그 후 21시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
이어, 인간 IL-2 사이토카인 ELISA kit(R&D Systems, DY202)를 제조자의 방법대로 사용하여 발현된 IL-2의 양을 측정하였다. 흡광도는 각기 450nm, 540nm로 측정하였으며 보정을 위해 매뉴얼에서 제시하는 방법에 따라 450nm 측정값에서 540nm 측정값을 빼고 계산하였다.
그 결과, 도 13a에 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로 사용한 5μg/ml의 PWM(pokeweed mitogen, Sigma)에서 IL-2의 분비가 2000pg/ml 이상으로 높게 측정되었고, 인간 PBMC만 넣어주고 정제 단백질을 넣어주지 않은 음성 대조군 1 (spontaneous release)과 배양 배지만을 측정한 음성 대조군 2 (no protein)에서는 IL-2가 전혀 측정되지 않았다. 또한, 항-HER2 scFv-SEBwt 은 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml 농도에서 각각 5000pg/ml이상의 IL-2를 생산 유도한 것으로 측정되었으며, IL-2의 생산량은 항-HER2 scFv-SEBwt> 항-HER2 scFv-SEB21> 항-HER2 scFv-SEB24> 항-HER2 scFv-SEB25 순의 패턴임을 확인하였다. 이를 통해, 본원에 따른 항-HER2 scFv-SEBs 재조합 융합단백질들에 의해 인간 PBMC가 활성화되는 것을 나타낸다.
5) 항-Her2 scFv-SEB 변이체의 세포 상해성 T 임파구를 이용한 HER2 과발현 암세포 제거능력(세포괴사) 분석
본원에 따른 실시예에서 제조된 항-Her2 scFv-SEBs의 세포 상해성 T 임파구(Cytotoxic T cell)를 이용한 Her2 과발현 암세포 제거능력을 보기 위하여 다음과 같이 Calcein AM 방출 분석을 수행하였다.
이를 위해 먼저 SEB에 반응하는 세포 상해성 T 임파구를 다음과 같이 제조하였다. 인간 혈액에서 상술한 바와 같이 PBMC를 분리한 후 매 주 20 U/ml의 IL-2 와 SEB로 프리코팅된 Mitomycin C가 처리된 BSM 세포로 20일 이상 자극한 후 실험에 사용하였다.
SKOV-3 세포 (ATCC HTB-77)는 Her2가 과발현되는 난소암세포로 항-Her2 scFv-SEBs의 Her2 과발현 암세포 제거능력을 보기위해 사용되었으며 Raji 세포 (ATCC CCL86)는 MHCII가 발현되는 세포로써 항-Her2 scFv-SEBs에 의한 부작용을 간접적으로 보기 위해 사용되었다.
Calcein AM 방출 분석을 위해서는 먼저 Raji (5000 개 세포) 혹은 SKOV-3 (7500 개) 세포를 Calcein AM (Sigma)으로 표지 한 후 10 배 많은 세포 상해성 T 임파구와 도 13b에 기재된 양의 각 항-Her2 scFv-SEBwt 또는 변이체를 섞은 후 (RPMI1640 FBS 10% 배지) 37°C 5% CO2에서 4시간 동안 배양 되었다. 이후 세포 배지를 검은색 마이크로플레이트로 옮긴 후 흡수파장 485 nm, 방출파장 530 nm에서 형광강도를 측정 후 sigmaplot를 이용하여 EC50을 계산하였다.
그 결과, 도 13b에 나타난 바와 같이 항-Her2 scFv-SEB 변이체가 세포 상해성 T 임파구(Cytotoxic T cell)를 이용하여 Her2를 과발현하는 SKOV-3 난소 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 in vitro에서 확인되었으며 항-Her2 scFv-SEBwt이 가장 강력한 세포 독성을(EC50 = 0.7pM) 가지는 것으로 확인되었다. 하지만 몸 안에서의 부작용을 반영하는 MHC II 의존적인 세포독성을(A) 고려할 때는 항-Her2 scFv-SEB23가 보다 좋은 효과를 갖는 것임을 나타낸다.
6) 항-Her2 scFv-SEB 변이체의 세포 상해성 T 임파구를 이용한 Her2 과발현 암세포의 세포자살 유도
상기의 독성실험에서 항-Her2 scFv-SEB가 상해성 T 임파구를 이용하여 Her2 과발현 암세포의 세포자살을 유도할 수 있는지 annexin V 와 PI의 이중 염색을 수행 한 후 accuri c6 flow cytometer (BD bioscience, USA)를 제조자의 방법대로 분석하였다.
요약하면, PKH26 염료로 표지된 2 x 104 개의 SKOV-3를 105 개의 세포 상해성 T 임파구와 섞은 후 항-Her2 scFv-SEBwt 를 1μg/ml 로 처리한 후 37 ℃ 5% CO2에서 4시간 배양하였다. PBS로 1회 세척, 1x 결합 완충액 (10mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)으로 1회 세척후 1x 결합 완충액 100μl로 재현탁하였다. 5μl의 annexin V 를 넣고 상온에서 15분 배양한 후 1x 결합 완충액으로 1회 세척하였다. 1x 결합 완충액 100μl로 재현탁 한 후 PI (0.5μg/ml) 를 추가한 후 즉시 유세포분석기로 분석하였다.
그 결과 도 13c에 나타난 바와 같이 항-Her2 scFv-SEBwt와 상해성 T 임파구가 존재하는 경우 표지된 SKOV-3 세포 중 16.8% 세포에서 세포괴사(necrosis)가 발생하였으며 초기 세포괴사는 61.5% 세포에서 발생하였다. 이는 Her2 과발현 암세포의 상당수가(61.5%) 4시간만에 세포괴사의 초기단계에 있으며 시간이 좀더 흐르면 대부분이 세포 괴사로 이어지는 것을 나타낸다. 음성대조군으로서 항-Her2 scFv-SEBwt 만 처리한 경우에는 세포괴사 및 초기 세포자살이 관찰되지 않았으며, 상해성 T 임파구만 존재하는 경우에도 약간의 세포괴사 및 초기 세포자살이 관찰되었다.
7) 항-Her2 scFv-SEB 변이체의 활성화되지 않은 T 임파구를 이용한 Her2 과발현 암세포 제거능력 분석
Micromet사의 BiTe 분자는 활성화되지 않은 T 임파구를 이용하여 암세포를 제거할 수 있다. 항-Her2 scFv-SEB 역시 활성화되지 않은 T 임파구를 이용하여 암세포를 제거할 수 있는지 여부를 조사하였다. 활성화되지 않은 T 임파구는 인간 유래의 PBMC로부터 CD3 T cell enrichment column(R&D system)을 제조자의 방법대로 분리되었다. 이어 PKH26 염료로 표지된 2 x 104 개의 SKOV-3를 105 개의 분리된 T 임파구와 섞은 후 항-Her2 scFv-SEBwt 를 1μg/ml 로 처리한 후 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. FACS 완충액 (0.1% sodium azide, 2% FBS in PBS) 200μl/웰로 2회 세척 후 100μl의 FACS 완충액으로 재현탁한 후 PI(0.5 μg/ml)를 넣은 후 accuri C6 flowcytometer 를 이용하여 분석되었다. 독성(%)은 다음과 같은 수식에 의해서 계산되었으며 이후 Sigmaplot을 이용하여 EC50 값을 구하였다.
독성(%) = (PKH26으로 표지된 SKOV3 세포 중 PI로 표지된 세포수)/(PKH26으로 표지된 SKOV3 총 세포수) * 100
그 결과, 도 13d에 나타난 바와 같이, 항-Her2 scFv-SEBwt이 활성화 되지 않은 T 임파구를 이용하여 Her2를 과발현하는 SKOV-3 세포를 죽일 수 있음을 확인하였고 EC50 값은 16 pg/ml (약 0.3 pM)정도로 나타났으며 이 값은 Micromet 사의 BiTe 분자에(subpicomolar 농도) 필적하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는,
기존에 T 세포를 이용한 면역 치료제 후보물질이 T 세포를 어느정도 활성화 시키는 전처리(pre-treatment)를 수행한 후에야만(예: IL-2 처리) 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 본원에 따른 융합단백질은 이러한 전처리 없이도 효과가 발휘될 수 있음을 나타내는 것이다.
2-5 항-Her2 scFv-SEB의 in vivo 항암 활성
항-Her2 scFv-SEB의 in vivo 에서의 항암활성을 보기 위하여 SKOV-3 xenograft 마우스모델 (Faratian et al. Clin Cancer Res. 2011;17(13):4451-61) (5주령의 암컷 Balb/c 누드마우스)이 이용되었다. 암세포로는 SKOV-3 1×107 세포/ml의 농도로 준비하여, 마우스당 0.3 ml(3×106 개 세포)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와 부위 피하에 주입 하였다. 또한 SKOV-3 암세포와 PBMC 혼합 이식군은 각각 두 배 농도로 만들어 1:1로 섞은 후 최종 농도1×107 세포/ml로 앞과 동일한 방법으로 마우스 이식하였다.
항-HER2 scFv-SEB wt는 세포이식 한시간 후 마우스 당 0.2 ml씩 5회(days 0-4) 연속 미정맥 주사 하였으며 양성대조물질 (Herceptin)은 마우스 당 0.2 ml씩 단회 (day 0) 미정맥 주사 하였다. 평균 (Mean) 종양 부피는 암세포 이식 후 측정 가능한 종양이 형성 되었을 때부터 23일째까지 총 6회 개체 별로 vernier caliper를 이용하여 3 방향을 측정한 후 length×width×height/2로 계산하였다.
그 결과 도 13e에 나타난 바와 같이 시험기간 동안 특이한 일반증상은 관찰 되지 않았으며 용매 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 체중 감소는 없었다. 실험 결과 항-Her2 scFv-SEB는 인간 PBMC의 존재하에서 농도 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였으며 10μg, 50μg, 100μg 의 용량에서 암의 크기가 각각 55.9%, 74.6%, 81.7% 정도 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 PBMC 가 없을 때에는 10μg, 50μg 두 용량에서는 암세포 억제 효과를 확인할 수 없었으며 100μg의 용량에서만 30%의 암세포 억제효과를 확인하였다. 양성 대조군으로 사용한 Herceptin 의 경우 동 모델에서 암세포의 억제 효과를 보였으며 암의 크기가 67.7% 정도 억제됨을 확인 할 수 있었다.
이러한 결과는 in vivo에서 항-Her2 scFv-SEB가 면역 세포를(특히 T 임파구) 이용하여 Her2 과발현 암세포를 죽일 수 있음을 나타내는 것이고 또한 면역세포 없이도 Her2 신호억제를 통해 암세포 성장을 어느 정도 억제할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 3. CD20 에 특이적으로 결합하는 scFv 및 SEB 를 포함하는 융합단백질의 제조
3-1. CD20 에 대한 scFv 서열의 고안 및 유전자 합성
본 실시예에서는 표적 인자로서, CD20를 인지하는 scFv(항-CD20-scFv)를 이용하였으며, 항-CD20-scFv 서열은 DrugBank Rituximab (Accession number DB00073)을 참조하였다.
구체적으로, Rituximab의 VH와 VL 영역의 서열을 사용하였으며 VH와 VL 사이에 scFv 링커로 15개의 아미노산으로 이뤄진 (G4S)3를 이용하였다(도 14). E.coli에서의 발현을 위해 항-CD20 scFv를 genescript의 코돈 최적화 프로그램(codon optimization program)을 이용하여 코돈을 최적화하였다(도 15).
상기 코돈 최적화된 항-CD20-scFv 서열은 Genescript에 유전자 합성을 의뢰하였고, pUC57 벡터내에 도입되었다(도 16). 이때, SEB-항-CD20 scFv의 구축을 위해 항-CD20 scFv의 경우 N-말단에 EcoRI 부위와 C-말단에 HindIII 부위를 포함하도록 합성하였으며, VH와 VL 사이는 15개의 아미노산으로 이루어진 (G4S)3 링커(linker)로 연결하였다(도 17).
3-2. 항-CD20 scFv 및 SEB를 포함하는 재조합 벡터의 제작
항-CD20 scFv 및 SEB를 포함하는 재조합 융합단백질을 제조하기 위하여, SEB-항-CD20 scFv를 발현하는 재조합 벡터를 제작하였으며, 상기 실시예 1에서 제작된 wt SEB 및 그 변이체를 포함하는 플라스미드 및 실시예 3-1에서 구축된 플라스미드를 이용하여 항-CD20 scFv 유전자와 wtSEB 및 그 변이체가 융합된 형태의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터를 구축하였다.
구체적으로 상기 각 유전자를 발현 벡터인 pRSET A 및 pET22b에 클로닝하였고, 이를 통해 얻어진 플라스미드를 각각 pRSET-항-CD20 scFv, pRSET-항-CD20 scFv-SEBs(TE; target-effector), pRSET-SEBs, pET22b-항-CD20 scFv, pET22b-항-CD20 scFv-SEBs(ET; effector-target), pET22b-SEB라 명명하였다(도 18). 구축된 항 CD20 scFv와 SEB 변이체의 융합단백질의 아미노산 서열과 유전자의 염기서열을 하기 표 5에 기재하였다.
서열번호 서열
45 항-CD20 scFv-SEBwt의 아미노산 서열
46 항-CD20 scFv-SEB21의 아미노산 서열
47 항-CD20 scFv-SEB22의 아미노산 서열
48 항-CD20 scFv-SEB23의 아미노산 서열
49 항-CD20 scFv-SEB24의 아미노산 서열
50 항-CD20 scFv-SEB25의 아미노산 서열
57 항-CD20 scFv-SEBwt의 염기 서열
58 항-CD20 scFv-SEB21의 염기 서열
59 항-CD20 scFv-SEB22의 염기 서열
60 항-CD20 scFv-SEB23의 염기 서열
61 항-CD20 scFv-SEB24의 염기 서열
62 항-CD20 scFv-SEB25의 염기 서열
구체적인 각각의 플라스미드의 제작 방법은 하기와 같다. 실시예 2에서 사용한 pRSET A 항-HER2 scFv-SEBwt 및 각 변이체를 EcoRI과 HindIII 로 절단하여 항-HER2 scFv을 제거하고 그 자리에 같은 제한효소로 처리한 pUC57-항-CD20-ScFv의 항-CD20 scFv을 라이게이션하여 pRSET A-항-CD20 scFv-SEBwt 및 각 변이체를 제작하였다.
또한, 합성된 pUC57-항-CD20 scFv를 주형으로 하여 프라이머 scFv-CD20-F(BamHI)(서열번호 9; 5＇-CG GGATCC CAA GTG CAG CTG CAG CAG CC-3＇)와 scFv-CD20-R(EcoRI)(서열번호 10; 5＇-CG GAATTC TTATTA TTT GAT TTC CAG TTT GGT ACC GCC-3＇)을 사용하여 PCR로 증폭하고, 항-CD20 scFv를 얻은 후 BamHI과 EcoRI 절단한 후 같은 제한효소로 절단한 pRSET A 벡터에 클로닝하여 pRSET A-항-CD20 scFv를 제작하였다.
또한, 상기 제작된 pRSET A-SEBwt-항-CD20scFv, pRSET A-SEB21-항-CD20scFv, pRSET A-SEB23-항-CD20scFv, pRSET A-SEB25-항-CD20scFv를 주형으로 하여, 프라이머 SEB-F(BamHI)(서열번호 11, 5＇-CG GGATCC GAA TCT CAG CCG GAC CCG A-3')와 SEB-R(EcoRI)(서열번호 12, 5'- CG GAATTC TTATTA TTT TTT TTT GGT GGT CAG GT-3')를 사용하여 PCR로 증폭하고, SEBwt, SEB21, SEB23, SEB25를 얻은 후 BamHI과 EcoRI 로 절단하여 같은 제한효소로 절단한 pRSET A 벡터에 클로닝하였고, 이를 통해 SEBwt, SEB21, SEB23, SEB25를 발현하기 위한 pRSET A-SEBwt, pRSET A-SEB21, pRSET A-SEB23, pRSET A-SEB25을 제작하였다.
아울러, 상기 제작된 pRSET A-SEB22-항-CD20 scFv, pRSET A-SEB24-항-CD20 scFv를 주형으로 하여 프라이머 SEB-F2224(BamHI)(서열번호 13, 5'-CG GGATCC GAA AGC CAG CCG GAC CCG A-3'와 SEB-R2224(EcoRI)(서열번호 14, 5'- CG GAATTC TTATTA TTT TTT TTT GGT GGT CAG ATA C-3')를 사용하여 PCR 증폭하여 SEB22, SEB24를 얻은 후, BamHI 및 EcoRI으로 절단하여 같은 제한효소로 절단한 pRSET A 벡터에 클로닝하였으며, 이를 통해 SEB22, SEB24를 발현하기 위한 pRSET A-SEB22, pRSET A-SEB24를 제작하였다.
이때, 벡터에 포함된 제한효소 인식부위와 각각의 벡터에서 발현된 단백질의 세포 내 위치, scFv와 6XHis tag의 위치와 IPTG 유도 유무에 대한 정보를 요약하여 하기 [표 6] 및 [표 7]에 나타내었다.
pRSET A 벡터를 이용한 발현 컨스트럭트 요약
벡터 유전자 제한효소
인식부위		 세포 내 위치 scFv 6His tag 발현 유도
(IPTG)
pRSET A 항-CD20 scFv BamHI/EcorI Cytoplasmic - N-term 유도
pRSET A ScFv-SEBwt(ET) EcorI/HindIII Cytoplasmic C-term N-term 유도
pRSET A ScFv-SEB21(ET) EcorI/HindIII Cytoplasmic C-term N-term 유도
pRSET A ScFv-SEB22(ET) EcorI/HindIII Cytoplasmic C-term N-term 유도
pRSET A ScFv-SEB23(ET) EcorI/HindIII Cytoplasmic C-term N-term 유도
pRSET A ScFv-SEB24(ET) EcorI/HindIII Cytoplasmic C-term N-term 유도
pRSET A ScFv-SEB25(ET) EcorI/HindIII Cytoplasmic C-term N-term 유도
pRSET A SEBwt BamHI/EcoRI Cytoplasmic - N-term 유도
pRSET A SEB21 BamHI/EcoRI Cytoplasmic - N-term 유도
pRSET A SEB22 BamHI/EcoRI Cytoplasmic - N-term 유도
pRSET A SEB23 BamHI/EcoRI Cytoplasmic - N-term 유도
pRSET A SEB24 BamHI/EcoRI Cytoplasmic -- N-term 유도
pRSET A SEB25 BamHI/EcoRI Cytoplasmic N-term 유도
pET22b 벡터를 이용한 발현 컨스트럭트 요약
벡터 유전자 제한효소
인식부위		 세포 내 위치 scFv 6His tag 발현 유도
(IPTG)
pET22b 항-CD20 scFv NcoI/HindIII Periplasmic - C-term 유도
pET22b ScFv-SEBwt (TE) NcoI/HindIII Periplasmic N-term C-term 유도
pET22b ScFv-SEB21 (TE) NcoI/HindIII Periplasmic N-term C-term 유도
pET22b ScFv-SEB22 (TE) NcoI/HindIII Periplasmic N-term C-term 유도
pET22b ScFv-SEB23 (TE) NcoI/HindIII Periplasmic N-term C-term 유도
pET22b ScFv-SEB24 (TE) NcoI/HindIII Periplasmic N-term C-term 유도
pET22b ScFv-SEB25 (TE) NcoI/HindIII Periplasmic N-term C-term 유도
pET22b SEBwt NcoI/HindIII Periplasmic - C-term ND
pET22b SEB21 NcoI/HindIII Periplasmic - C-term ND
pET22b SEB22 NcoI/HindIII Periplasmic - C-term ND
pET22b SEB23 NcoI/HindIII Periplasmic - C-term ND
pET22b SEB24 NcoI/HindIII Periplasmic - C-term ND
pET22b SEB25 NcoI/HindIII Periplasmic - C-term ND
상술한 바와 같은 재조합 벡터의 클로닝을 위해 사용된 형질전환은 RBC 사의 HIT™ -DH5a Value 108 (Cat.No. RH617)을 제조자의 방법대로 사용하여 수행되었다.
3-3. 재조합 융합단백질의 발현
상기 실시예 3-2에서 구축된 각각의 플라스미드 pRSET A 항-CD20 scFv, pRSET A SEBwt-항-CD20 scFv, pRSET A SEB21-항-CD20 scFv, pRSET A SEB22-항-CD20 scFv, pRSET A SEB23-항-CD20 scFv, pRSET A SEB24-항-CD20 scFv, pRSET A SEB25-항-CD20 scFv (도 19, 20, 21, 22, 23, 24 및 25 또는 표 6-1)로부터 항-CD20 scFv, 항-CD20 scFv-SEBwt, 항-CD20 scFv-SEB21, 항-CD20 scFv-SEB22, 항-CD20 scFv-SEB23, Anti-CD20 scFv-SEB24, 항-CD20 scFv-SEB25 융합단백질을 획득하기 위하여, 상기 제작된 각 플라스미드를 Genlantis의 SoluBL21TM 세포에 제조자의 방법대로 형질전환 시킨 후, 재조합 융합단백질의 발현을 유도하고, 이를 불용성으로 정제하였다.
구체적으로, 박테리아는 Novagen의 LB Broth Miller 배지 (Yeast extract 5g, peptone from casein 10g, sodium chloride 10g)에 앰피실린(Ampicillin) 50μg/ml 을 첨가한 배지로 37℃에서 배양하였다. OD600nm의 흡광도에서 그 값이 0.8~1.2 사이에서 최종 농도 0.2mM이 되도록 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도시킨 후, 3시간 추가 배양하였다. IPTG로 발현이 유도된 단백질은 SDS-PAGE 분석을 통하여 확인하였다(도 32).
그 결과, 항-CD20 scFv의 경우 IPTG 유도 전 샘플의 29.5KDa 근처에서 희미하게 보이던 밴드가 IPTG 유도 후 샘플에서는 두꺼운 밴드로 확인되어 재조합 융합단백질의 발현이 유도됨을 확인하였으며, 항-CD20 scFv-SEBwt 및 변이체의 경우에도 IPTG 유도 후에 59.2KDa 근처에서 밴드를 확인할 수 있었다.
또한, 상기 항-CD20 scFv-SEBwt 및 그 변이체에 대하여 1차 항체로 항-His-HRP를 사용하여 검출했을 때에는 도 33에서 보는 바와 같이 IPTG 유도 전 샘플에서는 밴드가 검출되지 않지만 IPTG 유도 후 샘플에서는 밴드가 검출됨을 확인할 수 있었다. 아울러, 유도된 단백질들의 용해도를 분석한 결과 모두 불용성인 것으로 확인되었다(도 34).
불용성하게 발현되는 단백질의 대량 배양 방법은 하기를 제외하고는 상기 단백질 발현 방법과 동일하게 수행되었다. 즉 IPTG 유도 후 3시간 배양 후에, 다음의 과정을 수행하였다. 박테리아 세포들은 5000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 침전물을 수득 한 후 세포 2g(1L culture volume)당 50ml의 붕해 완충액(100mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 5mM DTT, 1mM EDTA)으로 완전히 현탁될 때까지 교반시킨 후 초음파 분쇄하였다. 세포를 파쇄한 후 1mM PMSF를 넣고 10,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 상등액과 침전 펠렛을 분리하였다. 분리한 펠렛은 세척 완충액 I 20ml (1L 세포 배양액 기준, 50mM Tris (pH 8.0), 100mM NaCl, 2M Urea, 1mM EDTA, 1mM DTT)로 펠렛이 완전히 현탁될 때까지 30분간 실온에서 회전시켰다. 다시 10,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상등액과 펠렛을 분리 후, 분리한 펠렛은 세척 완충액 II 20ml (1L 세포 배양액 기준, 50mM Tris (pH 8.0), 2% Triton X-100, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT)로 다시 현탁시킨 후 30분간 실온에서 회전시킨 다음, 10,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상등액과 펠렛을 분리하였다. 분리한 펠렛은 가용화 완충액 20ml (1L 세포 배양액 기준, 8M urea, 50mM Tris (pH 8.0), 100mM NaCl)로 4℃에서 하룻밤 동안 배양하여 완전히 가용화시켰다. 가용화한 후 18,000rpm, 4℃에서 1시간 원심분리하여 상등액과 펠렛을 분리하고, 상등액은 1:100으로 희석하여 Bradford assay로 정량하였다. 정량 후 400mg/L의 농도로 재접힘 완충액 (50mM Tris-HCl (pH8.5), 0.4mM KCl, 9.6mM NaCl, 15mM β-Mercaptoethanol, 1mM GSH, 0.1mM GSSH)에 적가 방식으로 천천히 희석하였다. 희석 후 4℃에서 3시간 이상 계속 교반하면서 재접힘을 진행하였다. 이어 재접힘 완충액에서 1mM GSH, 0.1mM GSSH를 제거한 완충액에 10,000kDa MWCO 투석 멤브레인을 이용하여 투석하였다. 투석하면서 생긴 침전물을 제거하기 위하여 12,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리 한다. 상등액만을 모아 0.45μm의 기공 크기의 셀룰로오스 여과 막에 여과하여 미리 평형 완충액으로 평형화시킨 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩했다. 150mM 이미다졸(Imidazole) 근처에서 용출되어 나온 바인딩 분획을 모아 12% SDS-PAGE로 밴드를 확인한 후 한외 여과 방식으로 농축한 후 1X PBS로 완충액 교환을 수행하였다. 얻어진 단백질은 엔도톡신을 제거하기 위해 단백질 부피의 1%가량의 Triton X-114를 넣고 잘 혼합하여 제거한 후 최종 단백질을 얻었다.
이와 함께, SEBwt, SEB21, SEB22, SEB23, SEB24, SEB25를 발현시키기 위한 플라스미드 pRSET A-SEBwt, pRSET A-SEB21, pRSET A-SEB22, pRSET A-SEB23, pRSET A-SEB24, pRSET A-SEB25(도 26, 도 27, 도 28, 도 29, 도 30 및 도 31)를 Genlantis의 SoluBL21TM 세포에 형질전환한 후, 가용성하게 발현시켰으며, 이때 발현 방법과 정제 방법은 실시예 2와 동일하게 수행되었다.
아울러, 항-CD20 scFv는 가용성 발현을 위해 pET22b-항-CD20 scFv을 상기 SEBs의 발현과 동일한 방법(실시예 2)으로 수행하였다.
3-4. 시험관 내(In vitro) 분석
1) 결합 능력 분석
가용성하게 발현한 항-CD20 scFv와 항-CD20 scFv-SEBwt의 세포표면 항원인 CD20에 대한 결합능력은 Cell surface ELISA 분석으로 확인하였으며, 실험방법은 다음 논문을 참조하였다(Journal of Immunological methods 171, 93-102, 1994).
요약하면 사용한 세포주로는 CD20 표면 항원 제시 세포인 Raji와 MHC II 발현이 결핍된 Raji 유래의 세포인 RJ2.2.5 (Banca Biologica e cell factory) 그리고 음성 대조군으로 Jurkat 세포(ATCC TIB-152)를 사용하였다. 실험에 앞서, V bottom 96-웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 200μl/웰 블락킹 용액(blocking solution)(PBS, 0.1% NaN3, 10% FBS)으로 30분간 37℃에서 배양하여 블락킹하였다. 세포의 경우 107 개 세포당 10μl의 FcR blocking reagent(human, MACS 130-059-901)를 처리하여 15분간 4℃에서 반응시켰다. 반응이 끝난 세포는 105 개의 세포(50μl)/웰로 블락킹된 플레이트에 넣고 박테리아 세포로부터 분비된 배지 또는 항-CD20 항체(1:1000)를 50μl 를 추가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200μl 의 세척 완충용액(PBS, 0.1% NaN3, 1% FBS)으로 3번 세척 후, 항-xpress (1:5000, Invitrogen) 100μl/웰을 처리 후 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200μl의 세척 완충용액(PBS, 0.1% NaN3, 1% FBS)으로 3번 세척 후, 항-mouse IgG-HRP (1:2000, Santa Cruz) 100μ/웰을 처리 후 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 200μl의 세척 완충용액으로 5-6번 세척한 후 기질 용액을 처리한 다음 상온에서 색이 변하기 시작하면 2M 황산을 넣어 중지시킨 후 평편한 바닥의 측정 플레이트에 옮긴 후 ELISA 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 35a에 나타난 바와 같이, 항-CD20 scFv-SEBwt, 항-CD20 scFv-SEB21, 항-CD20 scFv-SEB24 모두 CD20 만을 발현하는 RJ2.2.5 에 비슷한 정도로 결합함을 확인하였다. 흥미롭게도 Raji 세포에 대해서는 항-CD20 scFv-SEBwt가 10 배 더 적은 농도에서 다른 두 변이체와 비슷한 정도로 결합함을 확인하였으며 세 단백질 모두 MHCII 가 결핍되어있는 RJ2.2.5 5세포보다 MHC II가 발현되는 Raji 세포에 더 강하게 결합하였다. 음성 대조인 Jurkat 세포에 대해서는 세 단백질 모두 결합하지 않음이 확인되었다. 이러한 결과는 항-CD20 scFv가 CD20 항원에 특이적으로 결합하며 항-CD20 scFv-SEBwt 및 각 변이체가 Raji 세포에 결합할 때 MHC II 단백질과의 상호작용도 관여함을 나타내는 것이다.
2) 항-CD20 scFv-SEB 변이체의 세포 상해성 T 임파구를 이용한 CD20 발현 암세포 제거능력 분석
항-CD20 scFv-SEBwt 및 변이체의 세포 상해성 T 임파구(Cytotoxic T cell)를 이용한 CD20 발현 암세포 제거능력을 보기 위하여 Calcein AM 방출 분석을 수행하였다. 이를 위해 먼저 SEB에 반응하는 세포 상해성 T 임파구를 다음과 같이 제조하였다. 인간 혈애으로부터 PBMC를 분리하였으며 매 주 20 U/ml의 IL-2 와 SEB로 코팅된 된 Mitomycin C가 처리된 BSM 세포로 20일 이상 자극한 후 실험에 사용하였다.
CD20을 발현하는 인간 B 세포 림프종 세포주인 Raji 세포가 CD20 발현 암세포로써 이용되었다.
Calcein AM 방출 분석을 위해, 먼저 Raji (5000 개) 세포를 Calcein AM으로 표지한 후 10 배 많은 세포 상해성 T 임파구와 도 35 b에 개시된 양의 항-Her2 scFv-SEBs 혹은 항-CD20 scFv-SEBwt 또는 각 변이체를 섞은 후 (RPMI1640 FBS 10% 배지) 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 세포 배지를 검은색 마이크로플레이트로 옮긴 후 흡수파장 485 nm, 방출파장 530 nm에서 형광강도를 측정 후 sigmaplot를 이용하여 EC50을 계산하였다.
그 결과, 도 35b에 나타난 바와 같이 항-CD20 scFv-SEBs가 세포 상해성 T 임파구를 이용하여 CD20을 발현하는 세포주인 Raji 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을(picomolar 농도 수준) in vitro에서 확인하였으며, 항-CD20 scFv-SEB wt의 경우 20 fM의 매우 낮은 EC50 값을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 항-CD20 scFv-SEB 변이체경우 Raji 세포를 타겟팅 하지못하는 항 Her2 scFv-SEB 변이체와 비해 200 에서 500 배 정도 더 강력한 세포살상 효과를 가지는 것으로 보이며 이 타게팅으로 인한 효과는 변이체간에 큰 차이를 보이지는 않았다.
3-5 항-CD20 scFv-SEBwt의 in vivo 항암 활성
항-CD20 scFv-SEB wt의 in vivo 에서의 항암활성을 보기 위하여 Disseminated Raji xenograft 마우스모델이 이용되었다. 실험에 사용할 세포주로는 lentiviral system (pCDH1-MS1-EF-Luciferase/Puro)을 이용하여 루시퍼라제가 발현되도록 개조된 Raji 세포주가 이용되었다. 실험에 사용한 동물은 ARC(Perth, WA, Australia)에서 생산한 NOD.CB17/scid 마우스 (5W, female)로 1주간 순화 시킨 후 6 주령째의 동물이 본 시험에 사용되었다. Raji-luciferase 암세포는 1×107 cells/ml, PBMC는 1×108 cells/ml 로 조절하여 1:1로 섞은 후 최종 암세포의 농도는 5×106 cell/ml 로 맞추었으며, 마우스 당 0.2 ml(1×106 Raji-luciferase cells/mouse+1×107 PBMC/mouse)씩 미정맥 주사하였다. 세포 주입 후 1시간 뒤에 시험물질 항-CD20 scFv-SEBwt는 마우스 당 0.2 ml씩(100μg) 5회 (days 0-4)연속 미 정맥 주사하였다. 살아있는 상태에서의 촬영을 위해 루시페린을 15 mg/ml의 농도로 동물의 복부 양쪽에 각각 50 μl씩 복강투여 한 후 PHOTON IMAGER(Biospace)을 활용하여 마우스 영상을 촬영개시 하였으며 시험 최종일인 day 17일까지 총 6회 (day 0, 3, 7, 10, 14, 17) 영상 촬영하였다. 촬영 최종일 (day 17)의 영상신호 측정값(photons/s/sr)을 비교해보면 용매 대조군에 비해 항-CD20 scFv-SEBwt 투여군에서 80 % (p<0.05) 정도 감소하는 것으로 나타났다 (도 35c).
상기의 항암효과를 보다 명확하게 관찰하기 위하여 영상신호 측정이외에 혈액내의 사람의 GAPDH 유전자의 양을 측정하는 방법을 수행하였다. 실험 최종 일에 마우스 혈액을 채취하여 총 RNA를 Trizol (Gibco)을 제조자의 방법대로 추출하였다. 추출한 RNA를 cDNA로 전사시켜 real-time RT-PCR 방법을 활용해 humanGAPDH (Applied Biosystems; 4352934) 및 mouseGAPDH (Applied Biosystems; 4352932)의 발현량을 용매 대조군과 항-CD20 scFv-SEBwt 100 μg/mouse 투여군에서 비교하였다. HumanGAPDH의 양은 마우스 혈액 내 존재하는 암세포의 양을 대변하고, mouseGAPDH은 내부 대조군으로 humanGAPDH/ mouseGAPDH으로 마우스 혈액 내 존재하는 암세포의 양을 대조군 대비 상대적으로 정량 하였다. 실험결과 혈액내에 존재하는 암세포의 양이 대조군 대비 항-CD20 scFv-SEBwt을 처리한 군에서 88.7%(p<0.01) 감소하는 것으로 나타났다 (도 35d).
상기 실험결과 모두 항-CD20 scFv-SEBwt가 in vivo에서 CD20 발현 암세포에 대해 항암효과를 가짐을 일관되게 나타낸다.
실시예 4. HER2 에 특이적으로 결합하는 Fab 및 SEB 를 포함하는 융합단백질의 제조
4-1. HER2 에 대한 특이적인 Fab 서열의 고안 및 유전자 합성
본 실시예에서는 특정 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는 인자로서, 암세포 성장에 관여하는 HER2를 인지하는 항체의 Fab 단편을 이용하였다.
항-HER2 Fab 서열은 Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 no. 5 pp. 481-489, (2004)와 DrugBank (DB00072)의 내용을 참조하였고, 항-HER2 중쇄의 경우 힌지(hinge) 서열인 EPPKSCDKTHTCPPCPA(서열번호 15)를 EPPKSCDKTHTSPPSPA(서열번호 16)로 변경하여 고안하였으며, 상기 고안된 항-HER2 Fab의 서열은 Cosmogenetech에 유전자 합성을 의뢰하여 수득하였다.
이때, 항-HER2 중쇄(VH-CH1-hinge)와 항-HER2 경쇄(VL-CL)의 컨스트럭트를 위해 두 chain의 합성을 의뢰하였다(도 36).
4-2. 항-HER2 중쇄 및 경쇄를 포함하는 재조합 벡터의 구축
항-HER2 Fab 및 SEB를 포함하는 재조합 융합단백질을 제조하기 위하여, 우선적으로, 상기 실시예 4-1에서 제작된 항-HER2 중쇄 및 경쇄 서열을 각각 포함하는 재조합 벡터를 제작하였으며, 제작된 플라스미드는 RBC 사의 HIT™ -DH5a Value 108 (Cat.No. RH617)에 형질전환하였다.
합성된 항-HER2 중쇄(VH-CH1-hinge) 및 항-HER2 경쇄(VL-CL)를 이용하여 pHA-PEG aHER2 Fd-SEBwt, pHA-PEG aHER2 Fd-SEB21, pHA-PEG aHER2 Fd-SEB22, pHA-PEG aHER2 Fd-SEB23, pHA-PEG aHER2 Fd-SEB24, pHA-PEG aHER2 Fd-SEB25 (이하 pHA-PEG aHER2 Fd-SEBs), pLT-2-항-HER2 Light의 벡터를 제조하였다(도 37). 구축된 항-HER2 Fab와 SEB 변이체의 융합단백질의 아미노산 및 염기서열을 하기 표 8과 같다. 구체적인 벡터 제조방법은 도 38에 도식화하였다.
서열번호 서열
63 항-HER2 Fd-SEBwt의 아미노산 서열
64 항-HER2 Fd-SEB21의 아미노산 서열
65 항-HER2 Fd-SEB22의 아미노산 서열
66 항-HER2 Fd-SEB23의 아미노산 서열
67 항-HER2 Fd-SEB24의 아미노산 서열
68 항-HER2 Fd-SEB25의 아미노산 서열
69 항-HER2 Light chain의 아미노산 서열
77 항-HER2 Fd-SEBwt의 염기 서열
78 항-HER2 Fd-SEB21의 염기 서열
79 항-HER2 Fd-SEB22의 염기 서열
80 항-HER2 Fd-SEB23의 염기 서열
81 항-HER2 Fd-SEB24의 염기 서열
82 항-HER2 Fd-SEB25의 염기 서열
83 항-HER2 Light chain의 염기 서열
구체적으로, 합성된 항-HER2 중쇄(VH-CH1-hinge)의 N-말단에 SfiI 부위(primer1)와 C-말단에 BamHI 부위 (primer2)을 추가하기 위하여 PCR을 실시하고, 합성된 항-HER2 경쇄(VL-CL)는 N-말단에 SacI 부위 (primer3)와 C-말단에 NotI 부위 (primer4)을 추가하기 위하여 PCR을 실시하였다. SEB 변이체는 N-말단에 BamHI 부위 (primer5)와 C-말단에 EcoRI 부위 (primer6)을 추가하기 위하여 실시예 2에서 사용한 pRSET A 항-HER2 scFv-SEB 변이체 벡터를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 [표 9]와 같다.
서열번호 Primer Sequence (5＇- 3＇) 제한효소
절단부위
17 Primer1 GGC CCA GCC GGC CGA AGT GCA GCT GGT GG SfiI
18 Primer2 GGA TCC TCC CGC CGG GCT CG BamHI
19 Primer3 GAG CTC GAT ATT CAG ATG ACC CAG SacI
20 Primer4 GCG GCC GCG CAT TCG CCG C NotI
21 Primer5 GGA TCC GAA TCT CAG CC BamHI
22 Primer6 GAA TTC ATG ATG ATG ATG ATG ATG TTT TTT TTT GGT GGT CAG GTA A EcoRI
이후, PCR에 의해 만들어진 단편은 우선 pGEM-T EASY 벡터(Promega)에 제공된 제조사의 방법에 따라 클로닝을 실시하였다. 클로닝 된 벡터를 사용하여 항-HER2 중쇄 부분은 SfiI 및 BamHI으로 절단하고 SEB 변이체 부분은 BamHI 및 EcoRI으로 절단하여 SfII 및 EcoRI으로 절단한 pHA-PEG 벡터에 클로닝을 실시하여 pHA-PEG-aHER2 Fd-SEB 변이체를 제작하였다. 또한 항-HER2 경쇄는 PCR 후 pGEM T EASY 벡터에 클로닝하고 클로닝된 벡터는 SacI과 NotI으로 절단하고 같은 제한효소로 절단한 pLT-2 플라스미드에 클로닝하였다. 이때 발현 벡터로 사용한 pHA-PEG와 pLT-2는 ㈜아이지세라피로부터 제공받았다.
4-3. 항-HER2 Fab 및 SEB를 포함하는 재조합 융합단백질의 발현
항-HER2 Fab-SEBwt 및 변이체의 발현을 위해서 중쇄와 경쇄를 동시에 발현시키는 dual 벡터 시스템을 사용하였다(Journal of Immunological Methods (2008) Volume: 333, Issue: 1-2, Pages: 24-37 참조). 항-HER2 Fab-SEBwt 및 변이체의 발현을 위한 중쇄와 경쇄의 조합 및 플라스미드는 하기 [표 10]에 나타내었다.
단백질 조합 플라스미드
Anti-HER2 Fab-SEBwt
 항-HER2 Fd-SEBwt pHA-PEG-항-HER2 Fd-SEBwt
항-HER2 light pLT-2-항-HER2 light
Anti-HER2 Fab-SEB21
항-HER2 Fd-SEB21 pHA-PEG-항-HER2 Fd-SEB21
항-HER2 light pLT-2-항-HER2 light
Anti-HER2 Fab-SEB22
항-HER2 Fd-SEB22 pHA-PEG-항-HER2 Fd-SEB22
항-HER2 light pLT-2-항-HER2 light
Anti-HER2 Fab-SEB23
항-HER2 Fd-SEB23 pHA-PEG-항-HER2 Fd-SEB23
항-HER2 light pLT-2-항-HER2 light
Anti-HER2 Fab-SEB24
항-HER2 Fd-SEB24 pHA-PEG-항-HER2 Fd-SEB24
항-HER2 light pLT-2-항-HER2 light
Anti-HER2 Fab-SEB25
항-HER2 Fd-SEB25 pHA-PEG-항-HER2 Fd-SEB25
항-HER2 light pLT-2-항-HER2 light
가용성 단백질의 발현을 위해, 숙주 세포로는 TG1 electroporation-competent cells(Stratagene)을 사용하였으며(Journal of Immunological Methods (2008) Volume: 333, Issue: 1-2, Pages: 24-37), 전기천공법은 제조사의 메뉴얼에 따라 수행하였다. Dual 벡터 시스템의 사용방법은 다음과 같다.
우선, pHA-PEG-aHER2 Fd-SEBwt 및 각 변이체 100ng을 TG1 세포에 전기천공한 후 2XYT/Amp plate(1L 기준 Yeast extract 10g, peptone from casein 16g, sodium chloride 5g, 15% Agar, Amp 50mg)에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. E.coli 콜로니를 분리하여, 2% 글루코오스(glucose)가 포함된 2XYT 배지에서 OD600 nm의 흡광도에서 그 값이 0.5가 되게 배양하였다. 10% 글리세롤(glycerol)이 포함된 멸균 증류수로 세 번 세척한 후 TG1 세포에 100ng의 pLT-2-aHER2 light 플라스미드를 전기천공하였다. 다시 2XYT/Amp+Tet(Tet; tetracycline 15μg/ml) 플레이트에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. E.coli 콜로니를 분리하여 30ml의 2%의 글루코오스가 포함된 2XYT/Amp+Tet에 배양하였다. OD600 의 흡광도에서 그 값이 0.5가 되면 3300Xg에서 10분간 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 세포 펠렛을 0.02%의 아라비노스(arabinose)와 0.1mM IPTG가 첨가된 15ml의 2XYT/Amp+Tet 배지에 재부유 하고 27℃ 에서 하룻밤 동안 배양하였다.
4-4. 시험관 내(In vitro) 분석
1) 결합 능력 분석
분비된 단백질의 결합능을 분석하기 위해 ㈜에이앤알쎄라퓨틱스에서 구입한 ERBB-2 단백질로 ELISA를 수행하여 결합 분석 시험을 실시하였으며, 실험방법은 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행하였다. 이때, 사용한 HER2 단백질은 0.05μg/웰이며 결합된 단백질을 검출하기 위한 이차 항체로는 항-인간 카파(kappa) 경쇄-HRP(sigma A7164)를 1/3000배로 희석하여 사용하였다.
그 결과, 도 40에서 나타난 바와 같이, IPTG로 단백질의 발현을 유도하기 전과 후를 비교해 볼 때, 발현 유도 후 단백질이 분비되어, 항원에 결합함으로써, 신호가 강하게 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 분비된 단백질의 HER2 결합 부위가 HER2 항원과 결합능이 있음을 알 수 있다.
실시예 5. CD20 항체의 Fab 및 SEB 를 포함하는 융합단백질의 제조
5-1. CD20 항체의 Fab 서열의 고안
항-CD20 Fab 서열은 DrugBank Rituximab (Accession number DB00073)을 참조하여 고안하였다.
5-2. 항-CD20 중쇄 및 경쇄를 포함하는 재조합 벡터의 제작
항-CD20 중쇄(VH-CH1-hinge)-SEBs과 항-CD20 경쇄(VL-CL)의 구축을 위해 상기 실시예 3에서 제작된 항-CD20 scFv와 실시예 3에서 제작된 SEBwt 과 변이체를 사용하였다. 중쇄와 경쇄를 도입하기 위한 벡터로는 실시예 4에서 사용한 pHA-PEG와 pLT-2를 사용하였다. 구축된 항-HER2 Fab와 SEBwt 및 변이체의 융합단백질의 아미노산 서열 및 유전자의 염기서열은 하기 표 11에 기재된 바와 같다.
서열번호 서열
70 항-CD20 Fd-SEBwt의 아미노산 서열
71 항-CD20 Fd-SEB21의 아미노산 서열
72 항-CD20 Fd-SEB22의 아미노산 서열
73 항-CD20 Fd-SEB23의 아미노산 서열
74 항-CD20 Fd-SEB24의 아미노산 서열
75 항-CD20 Fd-SEB25의 아미노산 서열
76 항-CD20 Light chain의 아미노산 서열
84 항-CD20 Fd-SEBwt의 염기 서열
85 항-CD20 Fd-SEB21의 염기 서열
86 항-CD20 Fd-SEB22의 염기 서열
87 항-CD20 Fd-SEB23의 염기 서열
88 항-CD20 Fd-SEB24의 염기 서열
89 항-CD20 Fd-SEB25의 염기 서열
90 항-CD20 Light chain의 염기 서열
구체적인 실험 방법은 도 41과 같으며, 이때 PCR 증폭에 이용된 프라이머는 하기 [표 12]에 기재한 바와 같다. pRSET A 항-CD20 scFv를 주형으로 하여 프라이머 1과 2를 사용하여 항-CD20 VH 영역을, 프라이머 3과 4를 이용하여 항-CD20 VL 영역을 PCR로 증폭하였다. 또한 pRSET A 항-HER2 Fd와 pRSET A 항-HER2 light을 주형으로 하여 프라이머 5와 6을 이용하여 CH1+hinge 영역을, 프라이머 7과 8을 이용하여 CL 영역을 PCR로 증폭하였다. 각각의 PCR 수행 후 항-CD20 VH 영역과 항-HER2 CH1+hinge 영역을 프라이머 1과 6을 이용하여 sewing PCR 하였다. 아울러, 항-CD20 VL region과 항-HER2 CL region을 프라이머 3과 8을 이용하여 sewing PCR 하였다.
서열번호 Primer 서열(5'-3') 결합 부위 제한효소
인식부위
23 Primer 1 GGC CCA GCC GGC CCA AGT GCA GCT GCA G 항-CD20 VH SfiI
24 Primer 2 GCC TTT GGT GCT CGC GGC GCT AA 항-CD20 VH
25 Primer 3 GAG CTC CAG ATT GTG CTG AG 항-CD20 VL SacI
26 Primer 4 GCC ACG GTG CGT TTG ATT TC 항-CD20 VL
27 Primer 5 GCG AGC ACC AAA GGC CCG AGC 항-HER2 CH1+H
28 Primer 6 GGA TCC TCC CGC CGG GCT CG 항-HER2 CH1+H BamHI
29 Primer 7 CGC ACC GTG GCG GC 항-HER2 CL
30 Primer 8 GCG GCC GCG CAT TCG CCG 항-HER2 CL NotI
아울러, 항-CD20 Fd는 sewing PCR 후, SfiI과 BamHI으로 절단하고 같은 제한효소로 절단한 pHA-PEG aHER2 Fd-SEBwt 및 각 변이체의 항-HER2 Fd부분을 제거하고 항-CD20 Fd를 클로닝하였다. 마찬가지로 항-CD20 Light부분도 SacI과 NotI으로 절단하고, 같은 제한효소로 절단한 pLT-2 플라스미드에 클로닝하였다.
5-3. 항-CD20 Fab 및 SEB를 포함하는 재조합 융합단백질의 발현
항-CD20 Fab-SEBwt 및 각 변이체의 발현을 위해서, 중쇄와 경쇄를 동시에 발현시키는 dual 벡터 시스템을 사용하였다(참고 논문Journal of Immunological Methods (2008) Volume: 333, Issue: 1-2, Pages: 24-37). 항-CD20 Fab-SEBs의 발현을 위한 중쇄와 경쇄의 조합 및 플라스미드는 하기 [표 13]에 나타내었다.
단백질 조합 플라스미드
Anti-CD20 Fab-SEBwt
 항-CD20 Fd-SEBwt pHA-PEG-항-CD20 Fd-SEBwt
항-CD20 light pLT-2-항-CD20 light
Anti-CD20 Fab-SEB21
항-CD20 Fd-SEB21 pHA-PEG-항-CD20 Fd-SEB21
항-CD20 light pLT-2-항-CD20 light
Anti-CD20 Fab-SEB22
항-CD20 Fd-SEB22 pHA-PEG-항-CD20 Fd-SEB22
항-CD20 light pLT-2-항-CD20 light
Anti-CD20 Fab-SEB23
항-CD20 Fd-SEB23 pHA-PEG-항-CD20 Fd-SEB23
항-CD20 light pLT-2-항-CD20 light
Anti-CD20 Fab-SEB24
항-CD20 Fd-SEB24 pHA-PEG-항-CD20 Fd-SEB24
항-CD20 light pLT-2-항-CD20 light
Anti-CD20 Fab-SEB25
항-CD20 Fd-SEB25 pHA-PEG-항-CD20 Fd-SEB25
항-CD20 light pLT-2-항-CD20 light
가용성 단백질의 발현은 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 수행되었고, 발현 단백질의 확인을 위해 웨스턴블랏 분석을 수행하였다.
구체적으로, 환원조건으로 얻어진 배양 전(B: before) 및 배양 후(A:after) 샘플의 웨스턴블랏 분석은, 항-CD20 Fd의 경우 항-His-HRP(sc-8036)로 검출하고, 항-CD20 Light의 경우는 항-인간 카파(kappa) 경쇄-HRP(sigma A7164)로 검출하여 수행하였다.
그 결과, 항-CD20 Fd는 55.8kDa 근처에서 배양 후에서 밴드가 검출되었으며, 항-CD20 light의 경우 26.5kDa으로 25kDa 근처에서 배양 전에도 희미하게 검출되었으며 발현 유도 후에는 강하게 검출되었다. 이를 통해 항-CD20 Fab-SEBwt 및 각 변이체가 성공적으로 발현됨을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> Handok Inc. <120> Superantigen derived from Staphylococcal enterotoxin and fusion protein comprising target specific polypeptide linked thereto and use thereof <130> DP201306003P <150> KR 2012-0087478 <151> 2012-08-09 <160> 90 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> SEB(Staphylococcal Enterotoxin B) wild type amino acid sequence <400> 1 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ala Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser 85 90 95 Glu Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn His Leu Asp Lys 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu 165 170 175 Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Ser 180 185 190 Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 205 Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Leu Val Asp 210 215 220 Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB21(SEB mutant) amino acid sequence <400> 2 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Glu Ser Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Glu Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Gly Leu Tyr His Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Pro Ile Lys Asp Trp Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Trp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys His Phe Pro 85 90 95 Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asp Glu Gly Gln Trp Trp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln Leu Ser Asp 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Gly Gly Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu 165 170 175 Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn 180 185 190 Gly Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Gly Tyr Phe 195 200 205 Asp Gln Ser Ser Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp 210 215 220 Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB22(SEB mutant) amino acid sequence <400> 3 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Glu Ser Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Thr Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Lys His Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Pro Ile Lys Asp Trp Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Trp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys His Phe Pro 85 90 95 Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asp Glu Gly Gln Trp Trp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln Leu Ser Asp 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Gly Gly Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu 165 170 175 Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn 180 185 190 Gly Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Gly Tyr Phe 195 200 205 Asp Gln Ser Glu Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp 210 215 220 Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB23(SEB mutant) amino acid sequence <400> 4 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Glu Ser Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Glu Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln His Leu Lys Phe Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Pro Ile Lys Asp Trp Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Trp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys His Phe Pro 85 90 95 Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asp Glu Gly Gln Trp Trp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln Leu Ser Gln 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Gly Gly Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu 165 170 175 Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn 180 185 190 Gly Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Gly Tyr Phe 195 200 205 Asp Gln Ser Val Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp 210 215 220 Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB24(SEB mutant) amino acid sequence <400> 5 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Glu Lys Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Glu Asn Val Lys Ser Ile Asp Lys Phe Leu Tyr His Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Pro Ile Lys Asp Trp Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Trp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys His Phe Pro 85 90 95 Lys Lys Thr Asn Val Ile Asp Glu Gly Gln Trp Trp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln Leu Ser Asp 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Gly Gly Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu 165 170 175 Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn 180 185 190 Gly Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Gly Tyr Phe 195 200 205 Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp 210 215 220 Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB25(SEB mutant) amino acid sequence <400> 6 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Asn Glu Ser Glu Leu His Lys Ser Ser Lys 1 5 10 15 Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His 20 25 30 Val Ser Ala Glu Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln His Thr Lys His Asp 35 40 45 Leu Ile Tyr Pro Ile Lys Asp Trp Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val 50 55 60 Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Trp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys His Phe Pro 85 90 95 Lys Lys Thr Asn Ile Ile Asp Glu Gly Gln Trp Trp Lys Arg Lys Thr 100 105 110 Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln Leu Ser Asp 115 120 125 Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Gly Gly Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu 165 170 175 Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn 180 185 190 Gly Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Gly Tyr Phe 195 200 205 Met Gln Ser Val Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp 210 215 220 Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRIscFv-F primer sequence <400> 7 cgggaattcg gcggtggagg ct 22 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFvHindIIINotI-R primer sequence <400> 8 ggcccgcggc cgcaagcttt tatttga 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-CD20-F(BamHI) primer sequence <400> 9 cgggatccca agtgcagctg cagcagcc 28 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-CD20-R(EcoRI) primer sequence <400> 10 cggaattctt attatttgat ttccagtttg gtaccgcc 38 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB-F(BamHI) primer sequence <400> 11 cgggatccga atctcagccg gacccga 27 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB-R(EcoRI) primer sequence <400> 12 cggaattctt attatttttt tttggtggtc aggt 34 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB-F2224(BamHI) primer sequence <400> 13 cgggatccga aagccagccg gacccga 27 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB-R2224(EcoRI) primer sequence <400> 14 cggaattctt attatttttt tttggtggtc agatac 36 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 heavy chain hinge sequence <400> 15 Glu Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 heavy chain hinge sequence <400> 16 Glu Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ala <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 for Anti-HER2 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 17 ggcccagccg gccgaagtgc agctggtgg 29 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 for Anti-HER2 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 18 ggatcctccc gccgggctcg 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 for Anti-HER2 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 19 gagctcgata ttcagatgac ccag 24 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 for Anti-HER2 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 20 gcggccgcgc attcgccgc 19 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 for Anti-HER2 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 21 ggatccgaat ctcagcc 17 <210> 22 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 for Anti-HER2 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 22 gaattcatga tgatgatgat gatgtttttt tttggtggtc aggtaa 46 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 23 ggcccagccg gcccaagtgc agctgcag 28 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 24 gcctttggtg ctcgcggcgc taa 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 25 gagctccaga ttgtgctgag 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 26 gccacggtgc gtttgatttc 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 27 gcgagcacca aaggcccgag c 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 28 ggatcctccc gccgggctcg 20 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 29 cgcaccgtgg cggc 14 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 for Anti-CD20 Fab-SEB recombinant fusion vector construct <400> 30 gcggccgcgc attcgccg 18 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 32 Gly Gly Ser Gly Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly 20 <210> 33 <211> 710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB wild type nucleotide sequence <400> 33 gaatctcagc cggacccgaa accggacgaa ctgcacaagg cttctaaatt caccggtctg 60 atggaaaaca tgaaagttct gtacgacgac aaccacgttt ctgctatcaa cgttaaatct 120 atcgaccagt tcctgtactt cgacctgatc tactctatca aagacaccaa actgggtaac 180 tacgacaacg ttcgtgttga gttcaaaaac aaagacctgg ctgacaaata caaagacaaa 240 tacgttgacg ttttcggtgc taactactac taccagtgct acttctctga aaaaaccaac 300 gacatcaact ctcaccagac cgacaaacgt aaaacctgca tgtacggtgg tgttaccgaa 360 cacaacggta accacctgga caaataccgt tctatcaccg ttcgtgtttt cgaagacggt 420 aaaaacctgc tgtctttcga cgttcagacc aacaaaaaaa aagttaccgc tcaggaactg 480 gactacctga cccgtcacta cctggttaaa aacaaaaaac tgtacgagtt caacaactct 540 ccgtacgaaa ccggttacat caaattcatc gaatctgaaa actctttctg gtacgacatg 600 atgccggctc cgggtgacaa attcgaccag tctaaatacc tgatgatgta caacgacaac 660 aaactggttg actctaaaga cgttaaaatc gaagtttacc tgaccaccaa 710 <210> 34 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB21 nucleotide sequence <400> 34 gaatctcagc cggacccgac cgaatctgaa ctgcacaaat cttctaaatt caccggtctg 60 atggaaaaca tgaaagttct gtacgacgac aaccacgttt ctgctgaaaa cgttaaatct 120 atcgaccagg gtctgtacca cgacctgatc tacccgatca aagactggaa actgggtaac 180 tacgacaacg ttcgtgttga gttcaaaaac aaatggctgg ctgacaaata caaagacaaa 240 tacgttgacg ttttcggtgc taactactac taccagtgcc acttcccgaa aaaaaccaac 300 gacatcgacg aaggtcagtg gtggaaacgt aaaacctgca tgtacggtgg tgttaccgaa 360 cacgacggta accagctgtc tgactaccgt tctatcaccg ttcgtgtttt cgaaggtggt 420 ggtaactctc tgtctttcga cgttcagacc aacaaaaaaa aagttaccgc tcaggaactg 480 gactacctga cccgtcacta cctggttaaa aacaaaaaac tgtacgagtt caacaactct 540 ccgtacgaaa ccggttacat caaattcatc gaaaacggta actctttctg gtacgacatg 600 atgccggctc cgggtggtta cttcgaccag tcttcttacc tgatgatgta caacgacaac 660 aaaatggttg actctaaaga cgttaaaatc gaagtttacc tgaccaccaa aaaaaaaggt 720 ggttctggtg gt 732 <210> 35 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB22 nucleotide sequence <400> 35 gaaagccagc cggacccgac cgaaagcgaa ctgcataaaa gcagcaaatt taccggcctg 60 atggaaaaca tgaaagtgct gtatgatgat aaccatgtga gcgcgaccaa cgtgaaaagc 120 attgatcagt ttctgaaaca tgatctgatt tatccgatta aagattggaa actgggcaac 180 tatgataacg tgcgcgtgga atttaaaaac aaatggctgg cggataaata taaagataaa 240 tatgtggatg tgtttggcgc gaactattat tatcagtgcc attttccgaa aaaaaccaac 300 gatattgatg aaggccagtg gtggaaacgc aaaacctgca tgtatggcgg cgtgaccgaa 360 catgatggca accagctgag cgattatcgc agcattaccg tgcgcgtgtt tgaaggcggc 420 ggcaacagcc tgagctttga tgtgcagacc aacaaaaaaa aagtgaccgc gcaggaactg 480 gattatctga cccgccatta tctggtgaaa aacaaaaaac tgtatgaatt taacaacagc 540 ccgtatgaaa ccggctatat taaatttatt gaaaacggca acagcttttg gtatgatatg 600 atgccggcgc cgggcggcta ttttgatcag agcgaatatc tgatgatgta taacgataac 660 aaaatggtgg atagcaaaga tgtgaaaatt gaagtgtatc tgaccaccaa aaaaaaaggt 720 ggttctggtg gt 732 <210> 36 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB23 nucleotide sequence <400> 36 gaatctcagc cggacccgac cgaatctgaa ctgcacaaat cttctaaatt caccggtctg 60 atggaaaaca tgaaagttct gtacgacgac aaccacgttt ctgctgaaaa cgttaaatct 120 atcgaccagc acctgaaatt cgacctgatc tacccgatca aagactggaa actgggtaac 180 tacgacaacg ttcgtgttga gttcaaaaac aaatggctgg ctgacaaata caaagacaaa 240 tacgttgacg ttttcggtgc taactactac taccagtgcc acttcccgaa aaaaaccaac 300 gacatcgacg aaggtcagtg gtggaaacgt aaaacctgca tgtacggtgg tgttaccgaa 360 cacgacggta accagctgtc tcagtaccgt tctatcaccg ttcgtgtttt cgaaggtggt 420 ggtaactctc tgtctttcga cgttcagacc aacaaaaaaa aagttaccgc tcaggaactg 480 gactacctga cccgtcacta cctggttaaa aacaaaaaac tgtacgagtt caacaactct 540 ccgtacgaaa ccggttacat caaattcatc gaaaacggta actctttctg gtacgacatg 600 atgccggctc cgggtggtta cttcgaccag tctgtttacc tgatgatgta caacgacaac 660 aaaatggttg actctaaaga cgttaaaatc gaagtttacc tgaccaccaa aaaaaaaggt 720 ggttctggtg gt 732 <210> 37 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB24 nucleotide sequence <400> 37 gaaagccagc cggacccgac cgaaaaagaa ctgcataaaa gcagcaaatt taccggcctg 60 atggaaaaca tgaaagtgct gtatgatgat aaccatgtga gcgcggaaaa cgtgaaaagc 120 attgataaat ttctgtatca tgatctgatt tatccgatta aagattggaa actgggcaac 180 tatgataacg tgcgcgtgga atttaaaaac aaatggctgg cggataaata taaagataaa 240 tatgtggatg tgtttggcgc gaactattat tatcagtgcc attttccgaa aaaaaccaac 300 gtgattgatg aaggccagtg gtggaaacgc aaaacctgca tgtatggcgg cgtgaccgaa 360 catgatggca accagctgag cgattatcgc agcattaccg tgcgcgtgtt tgaaggcggc 420 ggcaacagcc tgagctttga tgtgcagacc aacaaaaaaa aagtgaccgc gcaggaactg 480 gattatctga cccgccatta tctggtgaaa aacaaaaaac tgtatgaatt taacaacagc 540 ccgtatgaaa ccggctatat taaatttatt gaaaacggca acagcttttg gtatgatatg 600 atgccggcgc cgggcggcta ttttgatcag agcaaatatc tgatgatgta taacgataac 660 aaaatggtgg atagcaaaga tgtgaaaatt gaagtgtatc tgaccaccaa aaaaaaaggt 720 ggttctggtg gt 732 <210> 38 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB25 nucleotide sequence <400> 38 gaatctcagc cggacccgaa cgaatctgaa ctgcacaaat cttctaaatt caccggtctg 60 atggaaaaca tgaaagttct gtacgacgac aaccacgttt ctgctgaaaa cgttaaatct 120 atcgaccagc acaccaaaca cgacctgatc tacccgatca aagactggaa actgggtaac 180 tacgacaacg ttcgtgttga gttcaaaaac aaatggctgg ctgacaaata caaagacaaa 240 tacgttgacg ttttcggtgc taactactac taccagtgcc acttcccgaa aaaaaccaac 300 atcatcgacg aaggtcagtg gtggaaacgt aaaacctgca tgtacggtgg tgttaccgaa 360 cacgacggta accagctgtc tgactaccgt tctatcaccg ttcgtgtttt cgaaggtggt 420 ggtaactctc tgtctttcga cgttcagacc aacaaaaaaa aagttaccgc tcaggaactg 480 gactacctga cccgtcacta cctggttaaa aacaaaaaac tgtacgagtt caacaactct 540 ccgtacgaaa ccggttacat caaattcatc gaaaacggta actctttctg gtacgacatg 600 atgccggctc cgggtggtta cttcatgcag tctgtttacc tgatgatgta caacgacaac 660 aaaatggttg actctaaaga cgttaaaatc gaagtttacc tgaccaccaa aaaaaaaggt 720 ggttctggtg gt 732 <210> 39 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 scFv-SEBwt amino acid sequence <400> 39 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Arg Trp Gly Ser 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<400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser 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aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 420 ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 600 tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg 660 ccgaaaagct gcgataaaac ccataccagc ccgccgagcc cggcgggagg atccgaatct 720 cagccggacc cgaaaccgga cgaactgcac aaggcttcta aattcaccgg tctgatggaa 780 aacatgaaag ttctgtacga cgacaaccac gtttctgcta tcaacgttaa atctatcgac 840 cagttcctgt acttcgacct gatctactct atcaaagaca ccaaactggg taactacgac 900 aacgttcgtg ttgagttcaa aaacaaagac ctggctgaca aatacaaaga caaatacgtt 960 gacgttttcg gtgctaacta ctactaccag tgctacttct ctgaaaaaac caacgacatc 1020 aactctcacc agaccgacaa acgtaaaacc tgcatgtacg gtggtgttac cgaacacaac 1080 ggtaaccacc tggacaaata ccgttctatc accgttcgtg ttttcgaaga cggtaaaaac 1140 ctgctgtctt tcgacgttca gaccaacaaa aaaaaagtta ccgctcagga actggactac 1200 ctgacccgtc actacctggt taaaaacaaa aaactgtacg agttcaacaa ctctccgtac 1260 gaaaccggtt acatcaaatt catcgaatct gaaaactctt tctggtacga catgatgccg 1320 gctccgggtg acaaattcga ccagtctaaa tacctgatga tgtacaacga caacaaactg 1380 gttgactcta aagacgttaa aatcgaagtt tacctgacca ccaaaaaaaa acatcatcat 1440 catcatcatg aattc 1455 <210> 78 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 Fd-SEB21 nucleotides sequence <400> 78 gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcggctt taacattaaa gatacctata ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgcgc atttatccga ccaacggcta tacccgctat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agcgcggata ccagcaaaaa caccgcgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcag ccgctggggc 300 ggcgatggct tttatgcgat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 420 ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 600 tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg 660 ccgaaaagct gcgataaaac ccataccagc ccgccgagcc cggcgggagg atccgaatct 720 cagccggacc cgaccgaatc tgaactgcac aaatcttcta aattcaccgg tctgatggaa 780 aacatgaaag ttctgtacga cgacaaccac gtttctgctg aaaacgttaa atctatcgac 840 cagggtctgt accacgacct gatctacccg atcaaagact ggaaactggg taactacgac 900 aacgttcgtg ttgagttcaa aaacaaatgg ctggctgaca aatacaaaga caaatacgtt 960 gacgttttcg gtgctaacta ctactaccag tgccacttcc cgaaaaaaac caacgacatc 1020 gacgaaggtc agtggtggaa acgtaaaacc tgcatgtacg gtggtgttac cgaacacgac 1080 ggtaaccagc tgtctgacta ccgttctatc accgttcgtg ttttcgaagg tggtggtaac 1140 tctctgtctt tcgacgttca gaccaacaaa aaaaaagtta ccgctcagga actggactac 1200 ctgacccgtc actacctggt taaaaacaaa aaactgtacg agttcaacaa ctctccgtac 1260 gaaaccggtt acatcaaatt catcgaaaac ggtaactctt tctggtacga catgatgccg 1320 gctccgggtg gttacttcga ccagtcttct tacctgatga tgtacaacga caacaaaatg 1380 gttgactcta aagacgttaa aatcgaagtt tacctgacca ccaaaaaaaa acatcatcat 1440 catcatcatg aattc 1455 <210> 79 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 Fd-SEB22 nucleotides sequence <400> 79 gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60 agctgcgcgg cgagcggctt taacattaaa gatacctata ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgcgc atttatccga ccaacggcta tacccgctat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agcgcggata ccagcaaaaa caccgcgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcag ccgctggggc 300 ggcgatggct tttatgcgat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 420 ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 600 tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa 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taacattaaa gatacctata ttcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgcgc atttatccga ccaacggcta tacccgctat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agcgcggata ccagcaaaaa caccgcgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcag ccgctggggc 300 ggcgatggct tttatgcgat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 420 ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 600 tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg 660 ccgaaaagct gcgataaaac ccataccagc ccgccgagcc cggcgggagg atccgaaagc 720 cagccggacc cgaccgaaaa agaactgcat aaaagcagca aatttaccgg cctgatggaa 780 aacatgaaag tgctgtatga tgataaccat gtgagcgcgg aaaacgtgaa aagcattgat 840 aaatttctgt atcatgatct gatttatccg attaaagatt ggaaactggg caactatgat 900 aacgtgcgcg tggaatttaa aaacaaatgg 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ccagcaaaaa caccgcgtat 240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcag ccgctggggc 300 ggcgatggct tttatgcgat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 420 ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 600 tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg 660 ccgaaaagct gcgataaaac ccataccagc ccgccgagcc cggcgggagg atccgaatct 720 cagccggacc cgaacgaatc tgaactgcac aaatcttcta aattcaccgg tctgatggaa 780 aacatgaaag ttctgtacga cgacaaccac gtttctgctg aaaacgttaa atctatcgac 840 cagcacacca aacacgacct gatctacccg atcaaagact ggaaactggg taactacgac 900 aacgttcgtg ttgagttcaa aaacaaatgg ctggctgaca aatacaaaga caaatacgtt 960 gacgttttcg gtgctaacta ctactaccag tgccacttcc cgaaaaaaac caacatcatc 1020 gacgaaggtc agtggtggaa acgtaaaacc tgcatgtacg gtggtgttac cgaacacgac 1080 ggtaaccagc tgtctgacta ccgttctatc accgttcgtg ttttcgaagg tggtggtaac 1140 tctctgtctt tcgacgttca gaccaacaaa aaaaaagtta ccgctcagga actggactac 1200 ctgacccgtc actacctggt taaaaacaaa aaactgtacg agttcaacaa ctctccgtac 1260 gaaaccggtt acatcaaatt catcgaaaac ggtaactctt tctggtacga catgatgccg 1320 gctccgggtg gttacttcat gcagtctgtt tacctgatga tgtacaacga caacaaaatg 1380 gttgactcta aagacgttaa aatcgaagtt tacctgacca ccaaaaaaaa acatcatcat 1440 catcatcatg aattc 1455 <210> 83 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 Light chain nucleotides sequence <400> 83 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcca ggatgtgaac accgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatagc gcgagctttc tgtatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagccgcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcag cattatacca ccccgccgac ctttggccag 300 ggcaccaaag tggaaattaa acgcaccgtg gcggcgccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac agctgaaaag cggcaccgcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgcgaag cgaaagtgca gtggaaagtg gataacgcgc tgcagagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcagggc 600 ctgagcagcc cggtgaccaa gagctttaac cgcggcgaat gc 642 <210> 84 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD20 Fd-SEBwt nucleotides sequence <400> 84 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctggtgaaac cgggtgcaag tgttaaaatg 60 agctgcaaag catctggcta tacctttacg agctacaaca tgcattgggt taaacagacg 120 ccgggccgtg gtctggaatg gattggtgcg atctatccgg gcaacggtga taccagctac 180 aatcagaaat tcaaaggcaa agcaaccctg acggcggata aaagctctag tacggcgtat 240 atgcagctga gctctctgac cagcgaagat tctgcggtgt attactgcgc ccgctctacg 300 tattacggtg gcgattggta ctttaatgtt tggggcgcgg gtaccacggt gaccgttagc 360 gccgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc 420 ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgccgaaaa gctgcgataa aacccatacc agcccgccga gcccggcggg aggatccgaa 720 tctcagccgg acccgaaacc ggacgaactg cacaaggctt ctaaattcac cggtctgatg 780 gaaaacatga aagttctgta cgacgacaac cacgtttctg ctatcaacgt taaatctatc 840 gaccagttcc tgtacttcga cctgatctac tctatcaaag acaccaaact gggtaactac 900 gacaacgttc gtgttgagtt caaaaacaaa gacctggctg acaaatacaa agacaaatac 960 gttgacgttt tcggtgctaa ctactactac cagtgctact tctctgaaaa aaccaacgac 1020 atcaactctc accagaccga caaacgtaaa acctgcatgt acggtggtgt taccgaacac 1080 aacggtaacc acctggacaa ataccgttct atcaccgttc gtgttttcga agacggtaaa 1140 aacctgctgt ctttcgacgt tcagaccaac aaaaaaaaag ttaccgctca ggaactggac 1200 tacctgaccc gtcactacct ggttaaaaac aaaaaactgt acgagttcaa caactctccg 1260 tacgaaaccg gttacatcaa attcatcgaa tctgaaaact ctttctggta cgacatgatg 1320 ccggctccgg gtgacaaatt cgaccagtct aaatacctga tgatgtacaa cgacaacaaa 1380 ctggttgact ctaaagacgt taaaatcgaa gtttacctga ccaccaaaaa aaaacatcat 1440 catcatcatc atgaattc 1458 <210> 85 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD20 Fd-SEB21 nucleotides sequence <400> 85 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctggtgaaac cgggtgcaag tgttaaaatg 60 agctgcaaag catctggcta tacctttacg agctacaaca tgcattgggt taaacagacg 120 ccgggccgtg gtctggaatg gattggtgcg atctatccgg gcaacggtga taccagctac 180 aatcagaaat tcaaaggcaa agcaaccctg acggcggata aaagctctag tacggcgtat 240 atgcagctga gctctctgac cagcgaagat tctgcggtgt attactgcgc ccgctctacg 300 tattacggtg gcgattggta ctttaatgtt tggggcgcgg gtaccacggt gaccgttagc 360 gccgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc 420 ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgccgaaaa gctgcgataa aacccatacc agcccgccga gcccggcggg aggatccgaa 720 tctcagccgg acccgaccga atctgaactg cacaaatctt ctaaattcac cggtctgatg 780 gaaaacatga aagttctgta cgacgacaac cacgtttctg ctgaaaacgt taaatctatc 840 gaccagggtc tgtaccacga cctgatctac ccgatcaaag actggaaact gggtaactac 900 gacaacgttc gtgttgagtt caaaaacaaa tggctggctg acaaatacaa agacaaatac 960 gttgacgttt tcggtgctaa ctactactac cagtgccact tcccgaaaaa aaccaacgac 1020 atcgacgaag gtcagtggtg gaaacgtaaa acctgcatgt acggtggtgt taccgaacac 1080 gacggtaacc agctgtctga ctaccgttct atcaccgttc gtgttttcga aggtggtggt 1140 aactctctgt ctttcgacgt tcagaccaac aaaaaaaaag ttaccgctca ggaactggac 1200 tacctgaccc gtcactacct ggttaaaaac aaaaaactgt acgagttcaa caactctccg 1260 tacgaaaccg gttacatcaa attcatcgaa aacggtaact ctttctggta cgacatgatg 1320 ccggctccgg gtggttactt cgaccagtct tcttacctga tgatgtacaa cgacaacaaa 1380 atggttgact ctaaagacgt taaaatcgaa gtttacctga ccaccaaaaa aaaacatcat 1440 catcatcatc atgaattc 1458 <210> 86 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD20 Fd-SEB22 nucleotides sequence <400> 86 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctggtgaaac cgggtgcaag tgttaaaatg 60 agctgcaaag catctggcta tacctttacg agctacaaca tgcattgggt taaacagacg 120 ccgggccgtg gtctggaatg gattggtgcg atctatccgg gcaacggtga taccagctac 180 aatcagaaat tcaaaggcaa agcaaccctg acggcggata aaagctctag tacggcgtat 240 atgcagctga gctctctgac cagcgaagat tctgcggtgt attactgcgc ccgctctacg 300 tattacggtg gcgattggta ctttaatgtt tggggcgcgg gtaccacggt gaccgttagc 360 gccgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc 420 ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgccgaaaa gctgcgataa aacccatacc agcccgccga gcccggcggg aggatccgaa 720 agccagccgg acccgaccga aagcgaactg cataaaagca gcaaatttac cggcctgatg 780 gaaaacatga aagtgctgta tgatgataac catgtgagcg cgaccaacgt gaaaagcatt 840 gatcagtttc tgaaacatga tctgatttat ccgattaaag attggaaact gggcaactat 900 gataacgtgc gcgtggaatt taaaaacaaa tggctggcgg ataaatataa agataaatat 960 gtggatgtgt ttggcgcgaa ctattattat cagtgccatt ttccgaaaaa aaccaacgat 1020 attgatgaag gccagtggtg gaaacgcaaa acctgcatgt atggcggcgt gaccgaacat 1080 gatggcaacc agctgagcga ttatcgcagc attaccgtgc gcgtgtttga aggcggcggc 1140 aacagcctga gctttgatgt gcagaccaac aaaaaaaaag tgaccgcgca ggaactggat 1200 tatctgaccc gccattatct ggtgaaaaac aaaaaactgt atgaatttaa caacagcccg 1260 tatgaaaccg gctatattaa atttattgaa aacggcaaca gcttttggta tgatatgatg 1320 ccggcgccgg gcggctattt tgatcagagc gaatatctga tgatgtataa cgataacaaa 1380 atggtggata gcaaagatgt gaaaattgaa gtgtatctga ccaccaaaaa aaaacatcat 1440 catcatcatc atgaattc 1458 <210> 87 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD20 Fd-SEB23 nucleotides sequence <400> 87 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctggtgaaac cgggtgcaag tgttaaaatg 60 agctgcaaag catctggcta tacctttacg agctacaaca tgcattgggt taaacagacg 120 ccgggccgtg gtctggaatg gattggtgcg atctatccgg gcaacggtga taccagctac 180 aatcagaaat tcaaaggcaa agcaaccctg acggcggata aaagctctag tacggcgtat 240 atgcagctga gctctctgac cagcgaagat tctgcggtgt attactgcgc ccgctctacg 300 tattacggtg gcgattggta ctttaatgtt tggggcgcgg gtaccacggt gaccgttagc 360 gccgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc 420 ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgccgaaaa gctgcgataa aacccatacc agcccgccga gcccggcggg aggatccgaa 720 tctcagccgg acccgaccga atctgaactg cacaaatctt ctaaattcac cggtctgatg 780 gaaaacatga aagttctgta cgacgacaac cacgtttctg ctgaaaacgt taaatctatc 840 gaccagcacc tgaaattcga cctgatctac ccgatcaaag actggaaact gggtaactac 900 gacaacgttc gtgttgagtt caaaaacaaa tggctggctg acaaatacaa agacaaatac 960 gttgacgttt tcggtgctaa ctactactac cagtgccact tcccgaaaaa aaccaacgac 1020 atcgacgaag gtcagtggtg gaaacgtaaa acctgcatgt acggtggtgt taccgaacac 1080 gacggtaacc agctgtctca gtaccgttct atcaccgttc gtgttttcga aggtggtggt 1140 aactctctgt ctttcgacgt tcagaccaac aaaaaaaaag ttaccgctca ggaactggac 1200 tacctgaccc gtcactacct ggttaaaaac aaaaaactgt acgagttcaa caactctccg 1260 tacgaaaccg gttacatcaa attcatcgaa aacggtaact ctttctggta cgacatgatg 1320 ccggctccgg gtggttactt cgaccagtct gtttacctga tgatgtacaa cgacaacaaa 1380 atggttgact ctaaagacgt taaaatcgaa gtttacctga ccaccaaaaa aaaacatcat 1440 catcatcatc atgaattc 1458 <210> 88 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD20 Fd-SEB24 nucleotides sequence <400> 88 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctggtgaaac cgggtgcaag tgttaaaatg 60 agctgcaaag catctggcta tacctttacg agctacaaca tgcattgggt taaacagacg 120 ccgggccgtg gtctggaatg gattggtgcg atctatccgg gcaacggtga taccagctac 180 aatcagaaat tcaaaggcaa agcaaccctg acggcggata aaagctctag tacggcgtat 240 atgcagctga gctctctgac cagcgaagat tctgcggtgt attactgcgc ccgctctacg 300 tattacggtg gcgattggta ctttaatgtt tggggcgcgg gtaccacggt gaccgttagc 360 gccgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc 420 ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgccgaaaa gctgcgataa aacccatacc agcccgccga gcccggcggg aggatccgaa 720 agccagccgg acccgaccga aaaagaactg cataaaagca gcaaatttac cggcctgatg 780 gaaaacatga aagtgctgta tgatgataac catgtgagcg cggaaaacgt gaaaagcatt 840 gataaatttc tgtatcatga tctgatttat ccgattaaag attggaaact gggcaactat 900 gataacgtgc gcgtggaatt taaaaacaaa tggctggcgg ataaatataa agataaatat 960 gtggatgtgt ttggcgcgaa ctattattat cagtgccatt ttccgaaaaa aaccaacgtg 1020 attgatgaag 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ctttaatgtt tggggcgcgg gtaccacggt gaccgttagc 360 gccgcgagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggcgc cgagcagcaa aagcaccagc 420 ggcggcaccg cggcgctggg ctgcctggtg aaagattatt ttccggaacc ggtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcgct gaccagcggc gtgcatacct ttccggcggt gctgcagagc 540 agcggcctgt atagcctgag cagcgtggtg accgtgccga gcagcagcct gggcacccag 600 acctatattt gcaacgtgaa ccataaaccg agcaacacca aagtggataa aaaagtggaa 660 ccgccgaaaa gctgcgataa aacccatacc agcccgccga gcccggcggg aggatccgaa 720 tctcagccgg acccgaacga atctgaactg cacaaatctt ctaaattcac cggtctgatg 780 gaaaacatga aagttctgta cgacgacaac cacgtttctg ctgaaaacgt taaatctatc 840 gaccagcaca ccaaacacga cctgatctac ccgatcaaag actggaaact gggtaactac 900 gacaacgttc gtgttgagtt caaaaacaaa tggctggctg acaaatacaa agacaaatac 960 gttgacgttt tcggtgctaa ctactactac cagtgccact tcccgaaaaa aaccaacatc 1020 atcgacgaag gtcagtggtg gaaacgtaaa acctgcatgt acggtggtgt taccgaacac 1080 gacggtaacc agctgtctga ctaccgttct atcaccgttc gtgttttcga aggtggtggt 1140 aactctctgt ctttcgacgt tcagaccaac 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agagcggcaa cagccaggaa 480 agcgtgaccg aacaggatag caaagatagc acctatagcc tgagcagcac cctgaccctg 540 agcaaagcgg attatgaaaa acataaagtg tatgcgtgcg aagtgaccca tcagggcctg 600 agcagcccgg tgaccaagag ctttaaccgc ggcgaatgc 639

Claims (35)

  1. 면역원성과 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 II에 대한 결합성이 감소된 변형된 SEB로 상기 SEB는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 다음의 아미노산 잔기의 모든 위치에서, 각 위치에 기재된 어느 하나의 아미노산 잔기로 치환된 것인, 변형된 SEB:
    7 번째 Lys이 Thr 또는 Asn;
    8 번째 Pro이 Glu 또는 Gln
    9 번째 Asp이 Ser 또는 Lys;
    14 번째 Ala이 Ser 또는 Thr;
    36 번째 Ile이 Glu 또는 Thr;
    52 번째 Ser이 Pro;
    56 번째 Thr이 Trp;
    72 번째 Asp이 Trp 또는 Phe;
    93 번째 Tyr이 His;
    95 번째 Ser이 Pro;
    96 번째 Glu이 Lys;
    103 번째 Asn이 Asp 또는 Asn;
    104 번째 Ser이 Glu;
    105 번째 His이 Gly;
    107 번째 Thr이 Trp 또는 Phe;
    108 번째 Asp이 Trp 또는 Phe;
    122 번째 Asn이 Asp 또는 Asn;
    125 번째 His이 Gln 또는 Glu ;
    127 번째 Asp이 Ser;
    128 번째 Lys이 Asp 또는 Gln;
    138 번째 Asp이 Gly;
    140 번째 Lys이 Gly;
    142 번째 Leu이 Ser;
    191 번째 Ser이 Asn 또는 Asp;
    192 번째 Glu이 Gly;
    206 번째 Asp이 Gly;
    207 번째 Lys이 Tyr 또는 Phe; 및
    222 번째 Leu이 Met으로의 치환.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 치환은 하기 하나 이상의 치환을 부가적으로 포함하는 것인 변형된 SEB:
    43 번째 Gln이 Lys;
    44 번째 Phe이 Gly 또는 His;
    45 번째 Leu이 Thr;
    46 번째 Tyr이 Lys;
    47 번째 Phe이 His;
    101 번째 Asp이 Val 또는 Ile;
    209 번째 Asp이 Met; 또는
    212 번째 Lys이 Ser, Glu, 또는 Val.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 변형된 SEB는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 것인, 변형된 SEB.
  4. 제 1 항에 따른 SEB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33 내지 38 중 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제 4 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 이의 야생형 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드 발현 조절 서열을 포함하는, 벡터.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 벡터는 표 6-2 (도 26 내지 도 31) 또는 표 7-2의 벡터 중 어느 하나 인 것인, 벡터.
  8. 제 7 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 하나 이상의 야생형 SEB 또는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 변형된 SEB 및 표적 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 융합단백질은 링커를 추가로 포함하는 것인, 융합단백질.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 링커는 폴리펩타이드인, 융합단백질.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 31 또는 32 인, 융합단백질.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 SEB는 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치하는 것인, 융합단백질.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 표적 특이적 폴리펩타이드는 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체인 것인, 융합단백질.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 항체는 항체의 키메라 항체, 인간화 항체를 포함하고, 상기 항원결합 단편은 scFv, BITE, TandAb, Immunobody, Flexibody, Nanobody, Triomab, Troybody, Pepbody, Vaccibody, SMIP, Fab(fragment antigen binding), mAb2, UniBody, Fv (fragment variable), dAB, ScFv-Fc, Diabody, Tetrabody, Minibody, scFab(single chain Fab), 또는 Fcab을 포함하는 것인, 융합단백질.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 항체 모방체는 DARPin, Tetranectin, Affibody, Transbody, Anticalin, AdNectin, Affilin, Microbody, Peptide aptamer, Phylomer, Stradobody, Avimer, Maxibodiy, Evibody, 또는 Fynomer를 포함하는 것인, 융합단백질.
  17. 제 9 항에 있어서, 상기 표적은 세포 표면에 존재하는 인자인, 융합단백질.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인, 융합단백질.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 인자는 HER2(Human Epidermal Growth factor 2), 또는 CD20인 것인, 융합단백질.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 HER2 또는 CD20를 표적으로 하는 폴리펩타이드는 상기 HER2 또는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv 또는 Fab인, 융합단백질.
  21. 제 9 항에 있어서, 상기 융합단백질은 T 세포의 전활성화 없이, T 세포 매개된 면역시스템을 활성화시키는 것인, 융합단백질.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 HER2를 표적으로 하는 scFv 및 Fab를 포함하는 융합단백질은 각각 서열번호 39 내지 44 중 어느 하나 및 서열번호 63 내지 68 중 어느 하나와 서열번호 69의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 CD20를 표적으로 scFv 및 Fab를 포함하는 융합단백질은 각각 서열번호 45 내지 50 중 어느 하나 및 서열번호 70 내지 75 중 어느 하나와 서열번호 76의 아미노산 서열로 표시되는 것인 융합단백질.
  23. 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 HER2를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 51 내지 56 중 어느 하나 또는 서열번호 77 내지 82 중 어느 하나와 서열번호 83으로 표시되며, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 CD20를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 57 내지 62 중 어느 하나 또는 서열번호 84 내지 89 중 어느 하나와 서열번호 90으로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제 23 항에 따른 폴레뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드 발현 조절 서열을 포함하는, 벡터.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 벡터는 표 3 (도 3 내지 8), 표 6-1 (도 20 내지 도 25), 표7-1, 표 10, 또는 표 13에 기재된 벡터 중 어느 하나인, 벡터.
  27. 제 25 항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  28. T-세포 매개된, 표적 세포의 붕해(lysis) 방법으로, 상기 표적 세포를 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 단백질은 상기 표적 세포의 표면에 존재하는 인자를 특이적으로 인식하는 것인, 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 표적 세포는 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증,항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 칸디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis)을 포함하는 미생물감염과 관련된 세포인, 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 표적 세포는 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암, 간암인 방법.
  31. 제 28 항에 있어서, 상기 인자는 암과 연관된 것인, 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 인자는 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 방법.
  33. 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 T-세포 매개된 표적 세포의 붕해용 약학 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 표적 세포는 그 표면에 암세포 특이적 인자를 발현하는 암세포인, 약학조성물.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 암세포 특이적 인자는 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a), GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, a Type I membrane protein), IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR, 14-3-3 eta. 5T4, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약학 조성물.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023128594A1 (ko) * 2021-12-28 2023-07-06 제이더블유크레아젠 주식회사 면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드

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