KR20230013261A - Cd90 및 cd326을 발현하는 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
Cd90 및 cd326을 발현하는 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암의 치료에 사용하기 위한 a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인, 및 b) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 조합을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 조합은 a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 면역 세포, b) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 상기 태그된 제1 폴리펩티드, 및 c) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 상기 태그된 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드의 태그와 제2 폴리펩티드의 태그는 동일하다. 추가의 구현예에서, 상기 제1 및 이 제2 폴리펩티드에 대해 사용되는 농도는 각각 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮지만, 두 농도의 합계는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
Description
본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암, 특히 인간 난소암을 치료하는 분야에 관한 것이며, 우선적으로 치료는 입양 세포 요법에 의하며, 여기서 유전자 조작된 면역 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 다룰 수 있게 하는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다.
암은 조절되지 않는 세포 성장과 관련된 광범위한 군의 질환이다. 암 세포는 통제할 수 없을 정도로 분열하고 성장하여, 악성 종양을 형성하고, 신체의 가까운 부분을 침범한다. 암은 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 더 먼 부분으로 확산될 수 있다.
양호한 치료 옵션이 일부 암 유형에 이용가능하지만, 다른 것들은 여전히 충족되지 않은 의학적 필요를 나타낸다. 특히, 난소암은 치료 옵션이 제한된 악성종양이다. 난소암의 가장 중요한 측면들 중 하나는 저조한 5년 생존율과 관련된 질환의 늦은 진단이다 (Matulonis, et al., 2016). 현재 난소암 환자를 위한 주요 치료 옵션은 치료 옵션과 이에 따른 전체 환자 생존을 감소시키는 빈번한 백금-내성을 동반하는 높은 재발 가능성 및 심각한 부작용을 갖는 화합 요법 및 수술이다.
따라서, 암 및 난소암에 대한 새로운 분자 표적의 식별이 특히 긴급하게 요구된다. 그리고 -결과적으로- 신생물 질환에서 새로운 표적을 표적화하는 것은 동일한 중요성을 갖는다. CAR T 세포는 다양한 암 표적을 효율적으로 표적화할 수 있는 능력을 갖는 것을 나타내었다. CAR을 도입함으로써, "비-자가 세포"로서 종양 세포를 인식하고 이에 따라 면역계가 종양 세포를 박멸하도록 지원하도록 조정되는 T 세포가 발생될 것이다. 예를 들어, CAR T 세포는 표적 세포의 표면 분자와 접촉하여 CAR T 세포의 활성화를 유발하고 표적 세포의 용해를 야기할 수 있다. CAR는 예를 들어 하기 성분들로 구성된다: 특정 에피토프, 즉, 종양 관련 항원 (TAA)에 대해 특이적인 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편 (scFv). scFv는 힌지 및 막횡단 도메인을 통해 T 세포의 세포질 신호전달 도메인에 연결된다. 이 활성화 모이어티는 T 세포 활성화 모이어티가 뒤따르는 T 세포 공동자극 도메인을 포함한다. CAR-매개 입양 면역요법은 CAR-이식 세포가 HLA-독립적인 방식으로 종양 세포 상의 TAA를 인식할 수 있게 한다. 그러나, 단일 항원은 매우 특정한 방식으로 종양 세포를 비-암성 세포와 구별하기에 충분하지 않다. CAR T 세포의 사용은 이에 따라 종양 표적 외 독성 (on-target, off-tumor toxicity)과 관련된다.
한편, 이 독성은 혈액암에서 관측될 수 있고, 예를 들어 B-세포 림프종을 리툭시맙(Rituximab)으로 치료하기 위해 CD20을 표적화하면, 정상 B-세포 구획이 고갈되고, 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위해 CD33을 표적화하면 골수 구획이 감소한다.
다른 한편, 고형 종양은 유사한 "종양 표적 외" 독성을 나타내었다. 예로써, ERBB2 양성 종양을 표적화하는 것은 심장 및 폐를 포함하는 여러 건강한 조직 상에서의 ERBB2 발현으로 인하여 환자의 사망을 야기하였다. 게다가, 카르복시 애니하이드라아제-IX를 표적화하는 신장 세포 암종을 치료하기 위한 CAR 요법은 간 독성을 야기하였다. 이 발견은 담관 상피 세포에 대한 CAR T 세포의 특이적 공격과 관련되는 것으로 여겨진다 (Lamers, et al., 2013).
"종양 표적 외" 독성의 문제점을 해결하기 위해, CAR T 세포는 이중 항원 표적화에 의한 특이성을 증가시키도록 설계되었다. 이중-표적화 방법은 단일 암 세포 상의 하나 초과의 표적의 감지에 기초한다. 인간 암 세포 상에서 발현되지만, 비-악성 세포에서 발현되지 않거나 더 낮은 수준으로 발현되는 세포 표면 항원의 구별되는 그룹이 확인되었다. 이러한 항원 (또한 "마커"로 지칭됨)은 마커에 특이적으로 결합하는 리간드를 통해 이러한 암 세포의 회피 메커니즘(escape mechanism)을 확인 및/또는 표시 및/또는 파괴 및/또는 비활성화하는 데 사용될 수 있다.
개선된 특이성은 동시에 2개의 표적을 표적화하는 이중 AND CAR T-세포를 이용함으로써 달성될 수 있다. 두 표적은 동시에 종양 상에서 발현되어야 한다. 하나의 CAR은 활성화 신호 (신호1)를 전달하고, 이는 - 그 자체로는 - CAR T 세포의 활성화 임계값을 극복하는 데 불충분하다. 추가적으로, 제2 CAR은 - 제1 CAR과의 조합에서만 - T 세포를 충분하게 활성화하기 위해 활성화 임계값을 극복하도록 제1 CAR과 상승작용되는 공동자극 도메인 (신호2)를 운반한다 (Zhao, Song, & Liu, 2019)(Lanitis, et al., 2013).
예를 들어 입양 면역 세포 요법과 같은 면역요법으로 인간 난소암을 치료할 때, 예를 들어 종양 표적 외 독성을 감소시키는 종양 관련 항원 (마커)의 조합에 대한 본 기술분야의 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
면역요법을 개선하기 위한 종양 관련 항원의 신규한 조합의 확인을 일차 인간 난소암 세포에 대해 수행하였다.
이로써 본 발명자들은 놀랍게도 표적 쌍 (또는 조합) CD90/CD326이 난소암 환자의 하위 집합에서 공동-발현되는 것을 확인하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 마커가 동일한 세포에서 발현되지 않았음을 보여주는 여러 건강한 인간 조직 상에서 이러한 마커의 공동-발현을 평가하였다. 이러한 2개의 마커 특성, 즉 (1) 종양 세포 상에서의 공동-발현 및 (2) 건강한/비-악성 세포 상에서의 (공동-)발현의 결여 또는 적어도 상당하게 더 낮은 수준의 발현은 본 발명자가 발견한 마커들이 예를 들어 이중 AND CAR 또는 어댑터 표면 활성화 매트릭스 (surface activation matrix, SAM) CAR 방법을 사용하여 항체 면역요법 또는 입양 세포 면역요법과 같은 면역요법을 사용함으로써 이러한 암의 치료를 위한 우수한 후보임을 제시한다.
SAM CAR 방법, 즉, 상이한 종양 관련 항원 (TAA), 각각 본원에서 CD90 및 CD326에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 어댑터 (2개의 태그된 폴리펩티드) 및 T 세포와 같은 면역 세포에서의 하나의 항-태그 CAR의 조합은 어댑터들의 더 낮은 농도가 이를 필요로 하는 대상체에 적용할 수 있고 그럼에도 불구하고 어댑터CAR를 보유하는 면역 세포가 적절하게 활성화될 수 있는 장점을 야기한다. 이는 하기 장점을 야기한다:
1. CAR 면역 세포를 사용하는 면역 요법에서 2개 (또는 그 초과)의 TAA를 사용할 때 더 높은 특이성, 즉 단일 표적 항원 방법과 비교하여 더 안전한 방법.
2. 면역요법 동안 종양 세포의 회피 메커니즘을 방지함으로써 암의 더 효과적인 치료 및 더 긴 효과.
3. 두 어댑터의 존재만이 어댑터CAR을 보유하는 면역세포를 활성화시키기 위한 임계값보다 높기 때문에 가능한 치료되는 대상체에서의 각 어댑터의 더 낮은 용량. 이것은 이의 세포 표면에 두 표적 항원 중 하나만을 갖는 치료되는 대상체의 건강한 세포를 절약한다. 특정 어댑터의 용량이 낮을수록 이 표적 항원의 둘 모두가 아닌 이중의 하나를 발현하는 건강한 세포에 대한 부작용이 더 적어진다.
놀랍게도 이러한 SAM CAR 방법을 위한 마커 조합 CD90/CD326은 매우 적합하다는 것이 밝혀졌다. 인간의 소수의 건강한 세포가 두 마커를 발현하지만 암 세포와 비교하여 더 낮은 수준으로 발현하기 때문에 이 두 마커의 분포가 SAM CAR 또는 CAR 방법에 사용하는 데 적합하다는 것을 보여줄 수 있다. 어댑터, 즉, 각각 CD90 및 CD326에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 농도는 놀랍게도 개별적으로 더 낮을 수 있지만 (예를 들어 "단일 CAR/어댑터 배열": 단일 어댑터로서의 1000 ng/ml 항-CD90 항체 (도 4a) 및 단일 어댑터로서의 10 ng/ml 항-CD326 항체 (도 4b)와 비교되는 SAM CAR: 어댑터로서의 0,1 ng/ml 항-CD90 항체 및 0,1 ng/ml 항-CD326 어댑터 (도 5b)에서) 두 농도의 합계로 CAR 면역 세포를 유발할 수 있음이 시험관내에서 보여질 수 있다.
따라서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암의 치료에 사용하기 위한 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인 및 CD326에 특이적인 항원 결합 도메인의 조합을 제공한다. 본원에서, 또한, AND CAR 배열에서 CD90CAR 및 CD326CAR을 발현하는 면역 세포, CD90 및 CD326에 대한 특이성과 관련되는 어댑터CAR/어댑터 배열을 수반하는 다양한 조성물이 제공된다.
도 1 유세포 분석 스크리닝 검정은 고-등급 장액성 난소 암종의 서브세트에 대한 CD90 및 CD326의 공동-발현을 나타내었다.
여러 인간 고-등급 장액성 난소 암종을 분리하고 이후 유세포 분석에 의해 분석하였다. 유세포 분석 검정은 세포 표면 분자를 표적화하는 객관적인 유세포 분석 스크리닝 검정을 이용하였다. 일부 샘플은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 별개의 집단 (굵은체 및 밑줄로 강조함)을 나타낸다.
도 2 현미경 면역형광 분석은 고-등급 장액성 난소 암종의 서브세트에 대한 CD90 및 CD326의 공동-발현을 나타내었다.
신선하게-동결된 인간 고-등급 장액성 난소 암종을 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 항체의 후속 염색을 이용함으로써 MACSimaTM 초-고-컨텐츠 영상화 플랫폼 상에서 후속 스크리닝을 수행하였다. 여기서, 관심대상의 CD90뿐만 아니라 CD326의 2개의 마커를 나타내었고 세포 공동-발현에 대해 분석하였다. A) 관심대상의 CD90 및 CD326 공동-발현 종양 1의 영역, B) 관심대상의 CD90 및 CD326 공동-발현 종양 2의 영역, C) 관심대상의 CD90 및 CD326 공동-발현 종양 3의 영역. 병합된 이미지에서 CD326은 적색으로 표시되고 CD90은 녹색으로 각각 표시된다.
도 3 건강한 조직은 CD90 및 CD326을 공동-발현하지 않는다
신선하게-동결된 건강한 조직을 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 항체의 후속 염색을 이용함으로써 MACSimaTM 초-고-컨텐츠 영상화 플랫폼 상에서 후속 스크리닝을 수행하였다. 병합된 이미지에서 CD326은 적색으로 나타내고 CD90은 녹색으로 각각 표시된다.
도 4 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 (B) 항체의 변화되는 용량의 존재하에 72시간 동안 CD90-, CD326-, 및 GFP-발현 표적 세포 (난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비-결합 항체는 표적 세포 용해를 유도하지 않으며, 어댑터 CAR의 존재는 표적 세포 용해에 대해 필수적이다 (C). GFP-형광은 시간에 따라 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 5 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 어댑터의 더 낮은 용량에서 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 및 비오틴화된 CD326 항체 (A)의 존재하에 72시간 동안 CD90-, CD326-, 및 GFP-발현 표적 세포 (난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. (B) (A)와 동일하지만 가장 강한 상승작용 용량으로 감소됨. 비-결합 항체는 표적 세포 용해를 유도하지 않고, 어댑터 CAR의 존재는 표적 세포 용해에 대해 필수적이다 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 6 형질전환 표적 세포주는 차별적으로 CD90 및 CD326을 발현한다
난소암 세포주 A2780은 CD90 및 CD326 (A)이 결핍되거나, CD326 및 CD90 (B)를 발현하거나, CD90 (C)에 대해 단일 양성이 되게 하거나, 또는 CD326 (D)에 대해 단일 양성이 되도록 유전자 변형되었다.
도 7 어댑터 CAR T 세포로 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 것은 CD326을 발현하지만 CD90가 결여된 난소암 세포에서 작용되지 않는다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 항체 (B)의 존재하에 72시간 동안 CD326- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD90이 결여된 난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비오틴화된 CD90 및 CD326 항체의 존재하에 72시간 동안의 CD326- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD90이 결여된 난소암 세포주 A2780)와의 항-비오틴 CAR T 세포의 공동-배양 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 8 어댑터 CAR T 세포로 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 것은 CD90을 발현하지만 CD326이 결여된 난소암 세포에서 작용되지 않는다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 항체 (B)의 존재하에 72시간 동안 CD90- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비오틴화된 CD90 및 CD326 항체의 존재하에 72시간 동안의 CD90- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와의 항-비오틴 CAR T 세포의 공동-배양 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 9 어댑터 CAR T 세포로 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 것은 CD90 및 CD326이 결여된 난소암 세포에서 작용되지 않는다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 항체 (B)의 존재하에 72시간 동안 GFP-발현 표적 세포 (CD90 및 CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비오틴화된 CD90 및 CD326 항체의 존재하에 72시간 동안의 GFP-발현 표적 세포 (CD90 및 CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와의 공동-배양 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 10 현미경 면역형광 분석은 건강한 조직에서의 별개의 CD90 및 CD326 발현 및 고-등급 장액성 난소 암종의 서브세트 상에의 CD90 및 CD326의 공동-발현을 나타내었다
신선하게-동결된 건강한 조직 및 고-등급 장액성 난소 암종을 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 항체의 후속 염색을 이용함으로써 MACSimaTM 초-고-컨텐츠 영상화 플랫폼 상에서 후속 스크리닝을 수행하였다. 여기서, 관심대상의 CD90뿐만 아니라 CD326의 2개의 마커를 나타내었고 세포 공동-발현에 대해 분석하였다. 병합된 이미지에서 CD326은 적색으로 표시되고 CD90은 녹색으로 각각 표시된다. 크기 막대는 100 μm을 나타낸다.
도 11 CD90 및 CD326 발현의 정량화는 건강한 인간 조직에서 CD90 및 CD326의 발현 및 고-등급 장액성 난소 암종에서는 증가된 공동-발현을 나타낸다
각각의 건강한 조직 및 종양 조직에 대한 모든 이미지 (16 비트) 데이터 세트는 QiTissueTM 소프트웨어에 도입되었다. 상기 소프트웨어는 핵 및 세포막 마커를 사용하여 개개의 세포를 식별하는 이미지 분할을 수행한다. 이는 QiTissueTM 시스템에 대해 알려진 모든 세포막 마커를 동시에 사용하기 때문에, 이는 샘플에서의 세포의 대부분 유형을 분할할 수 있다. 각 조직에 대해 유사한 분할 파라미터를 사용하였다. 세포가 식별되면, 평균 형광 강도 (MFI)와 같은 특징들이 배경에 대하여 각 세포에 대해 계산된다. 이러한 강도들을 이후 추가의 다운스트림 공정을 위해 사용한다. 다운스트림 분석 동안, 모든 계산된 MFI를 시각화 및 비교가능성을 위해 0과 1 사이의 범위로 조정한다 (16 비트 이미지에 대한 본래의 MFI는 0 내지 65535 사이의 범위이다). 이러한 값을 이후 박스플롯(boxplot)에 나타난 바와 같이 서로 비교한다.
도 12 5 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 비-결합 FAb는 표적 세포 용해를 유도하지 않으며, 어댑터 CAR의 존재는 표적 세포 용해에 필수적이다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표현 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 13 1 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 14 0,75 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 15 0,5 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 16 0,25 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 17 0,1 ng/ml의 농도로 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 18 0,05 ng/ml의 농도로 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 19 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대한 어댑터의 0,025 ng/ml의 낮은 투여량에서의 종양 성장 제어를 보여준다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 20 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대한 어댑터의 0,01 ng/ml의 낮은 투여량에서의 종양 성장 제어를 보여준다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 21 항-CD326 Fab가 항-CD90 Fab의 일정 농도에 대해 적정될 때 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 22 항-CD90 Fab가 항-CD326 Fab의 일정 농도에 대해 적정될 때 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 23 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 다양한 농도로 사이토카인을 분비한다 (0,75-0,1 ng/ml)
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 0,75 ng/ml, E) 0,5ng/ml, I) 0,25 ng/ml, M) 0,1 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 0,75 ng/ml, F) 0,5ng/ml, J) 0,25 ng/ml, N) 0,1 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 0,75 ng/ml, G) 0,5ng/ml, K) 0,25 ng/ml, O) 0,1 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 0,75 ng/ml, H) 0,5ng/ml, L) 0,25 ng/ml, P) 0,1 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 24 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 다양한 농도로 사이토카인을 분비한다 (0,1-0,01 ng/ml)
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 0,1 ng/ml, E) 0,05ng/ml, I) 0,025 ng/ml, M) 0,01 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 0,1 ng/ml, F) 0,05ng/ml, J) 0,025 ng/ml, N) 0,01 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 0,1 ng/ml, G) 0,05ng/ml, K) 0,025 ng/ml, O) 0,01 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 0,1 ng/ml, H) 0,05ng/ml, L) 0,025 ng/ml, P) 0,01 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 25 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 다양한 농도로 사이토카인을 분비한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, G) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90-/CD326+ (D) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, H) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 26 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도 (1-0,1 ng/ml)에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 및 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 1 ng/ml E) 0,75 ng/ml, I) 0,5ng/ml, M) 0,25 ng/ml, Q) 0,1 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 1 ng/ml, F) 0,75 ng/ml, J) 0,5ng/ml, N) 0,25 ng/ml, R) 0,1 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 1 ng/ml, G) 0,75 ng/ml, K) 0,5ng/ml, O) 0,25 ng/ml, S) 0,1 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 1 ng/ml, H) 0,75 ng/ml, L) 0,5ng/ml, P) 0,25 ng/ml, T) 0,1 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 27 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도 (0,1-0,01 ng/ml)에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 및 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 또는 비오틴화된 CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (CD90+/CD326+ (A) 0,1 ng/ml, E) 0,05ng/ml, I) 0,025 ng/ml, M) 0,01 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 0,1 ng/ml, F) 0,05ng/ml, J) 0,025 ng/ml, N) 0,01 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 0,1 ng/ml, G) 0,05ng/ml, K) 0,025 ng/ml, O) 0,01 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 0,1 ng/ml, H) 0,05ng/ml, L) 0,025 ng/ml, P) 0,01 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 비-결합 FAb는 T 세포 활성화를 야기하지 않고 어댑터 CAR의 존재는 어댑터 특이적 T 세포 활성화에 대해 필수적이다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 28 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 및 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, D) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), 및 CD90-/CD326+ (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 29 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, G) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90-/CD326+ (D) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, H) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 30 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, G) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90-/CD326+ (D) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, H) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰고 소진 마커에 대해 염색시켰다.
항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (I) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, M) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (J) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, N) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326+ (K) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, O) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90+/CD326- (L) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, P) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰고 활성화 마커에 대해 염색시켰다.
통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
여러 인간 고-등급 장액성 난소 암종을 분리하고 이후 유세포 분석에 의해 분석하였다. 유세포 분석 검정은 세포 표면 분자를 표적화하는 객관적인 유세포 분석 스크리닝 검정을 이용하였다. 일부 샘플은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 별개의 집단 (굵은체 및 밑줄로 강조함)을 나타낸다.
도 2 현미경 면역형광 분석은 고-등급 장액성 난소 암종의 서브세트에 대한 CD90 및 CD326의 공동-발현을 나타내었다.
신선하게-동결된 인간 고-등급 장액성 난소 암종을 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 항체의 후속 염색을 이용함으로써 MACSimaTM 초-고-컨텐츠 영상화 플랫폼 상에서 후속 스크리닝을 수행하였다. 여기서, 관심대상의 CD90뿐만 아니라 CD326의 2개의 마커를 나타내었고 세포 공동-발현에 대해 분석하였다. A) 관심대상의 CD90 및 CD326 공동-발현 종양 1의 영역, B) 관심대상의 CD90 및 CD326 공동-발현 종양 2의 영역, C) 관심대상의 CD90 및 CD326 공동-발현 종양 3의 영역. 병합된 이미지에서 CD326은 적색으로 표시되고 CD90은 녹색으로 각각 표시된다.
도 3 건강한 조직은 CD90 및 CD326을 공동-발현하지 않는다
신선하게-동결된 건강한 조직을 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 항체의 후속 염색을 이용함으로써 MACSimaTM 초-고-컨텐츠 영상화 플랫폼 상에서 후속 스크리닝을 수행하였다. 병합된 이미지에서 CD326은 적색으로 나타내고 CD90은 녹색으로 각각 표시된다.
도 4 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 (B) 항체의 변화되는 용량의 존재하에 72시간 동안 CD90-, CD326-, 및 GFP-발현 표적 세포 (난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비-결합 항체는 표적 세포 용해를 유도하지 않으며, 어댑터 CAR의 존재는 표적 세포 용해에 대해 필수적이다 (C). GFP-형광은 시간에 따라 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 5 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 어댑터의 더 낮은 용량에서 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 및 비오틴화된 CD326 항체 (A)의 존재하에 72시간 동안 CD90-, CD326-, 및 GFP-발현 표적 세포 (난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. (B) (A)와 동일하지만 가장 강한 상승작용 용량으로 감소됨. 비-결합 항체는 표적 세포 용해를 유도하지 않고, 어댑터 CAR의 존재는 표적 세포 용해에 대해 필수적이다 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 6 형질전환 표적 세포주는 차별적으로 CD90 및 CD326을 발현한다
난소암 세포주 A2780은 CD90 및 CD326 (A)이 결핍되거나, CD326 및 CD90 (B)를 발현하거나, CD90 (C)에 대해 단일 양성이 되게 하거나, 또는 CD326 (D)에 대해 단일 양성이 되도록 유전자 변형되었다.
도 7 어댑터 CAR T 세포로 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 것은 CD326을 발현하지만 CD90가 결여된 난소암 세포에서 작용되지 않는다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 항체 (B)의 존재하에 72시간 동안 CD326- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD90이 결여된 난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비오틴화된 CD90 및 CD326 항체의 존재하에 72시간 동안의 CD326- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD90이 결여된 난소암 세포주 A2780)와의 항-비오틴 CAR T 세포의 공동-배양 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 8 어댑터 CAR T 세포로 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 것은 CD90을 발현하지만 CD326이 결여된 난소암 세포에서 작용되지 않는다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 항체 (B)의 존재하에 72시간 동안 CD90- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비오틴화된 CD90 및 CD326 항체의 존재하에 72시간 동안의 CD90- 및 GFP-발현 표적 세포 (CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와의 항-비오틴 CAR T 세포의 공동-배양 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 9 어댑터 CAR T 세포로 CD90 및 CD326을 공동-표적화하는 것은 CD90 및 CD326이 결여된 난소암 세포에서 작용되지 않는다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 (A) 또는 비오틴화된 CD326 항체 (B)의 존재하에 72시간 동안 GFP-발현 표적 세포 (CD90 및 CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와 공동-배양시켰다. 비오틴화된 CD90 및 CD326 항체의 존재하에 72시간 동안의 GFP-발현 표적 세포 (CD90 및 CD326이 결여된 난소암 세포주 A2780)와의 공동-배양 (C). GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다.
도 10 현미경 면역형광 분석은 건강한 조직에서의 별개의 CD90 및 CD326 발현 및 고-등급 장액성 난소 암종의 서브세트 상에의 CD90 및 CD326의 공동-발현을 나타내었다
신선하게-동결된 건강한 조직 및 고-등급 장액성 난소 암종을 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 항체의 후속 염색을 이용함으로써 MACSimaTM 초-고-컨텐츠 영상화 플랫폼 상에서 후속 스크리닝을 수행하였다. 여기서, 관심대상의 CD90뿐만 아니라 CD326의 2개의 마커를 나타내었고 세포 공동-발현에 대해 분석하였다. 병합된 이미지에서 CD326은 적색으로 표시되고 CD90은 녹색으로 각각 표시된다. 크기 막대는 100 μm을 나타낸다.
도 11 CD90 및 CD326 발현의 정량화는 건강한 인간 조직에서 CD90 및 CD326의 발현 및 고-등급 장액성 난소 암종에서는 증가된 공동-발현을 나타낸다
각각의 건강한 조직 및 종양 조직에 대한 모든 이미지 (16 비트) 데이터 세트는 QiTissueTM 소프트웨어에 도입되었다. 상기 소프트웨어는 핵 및 세포막 마커를 사용하여 개개의 세포를 식별하는 이미지 분할을 수행한다. 이는 QiTissueTM 시스템에 대해 알려진 모든 세포막 마커를 동시에 사용하기 때문에, 이는 샘플에서의 세포의 대부분 유형을 분할할 수 있다. 각 조직에 대해 유사한 분할 파라미터를 사용하였다. 세포가 식별되면, 평균 형광 강도 (MFI)와 같은 특징들이 배경에 대하여 각 세포에 대해 계산된다. 이러한 강도들을 이후 추가의 다운스트림 공정을 위해 사용한다. 다운스트림 분석 동안, 모든 계산된 MFI를 시각화 및 비교가능성을 위해 0과 1 사이의 범위로 조정한다 (16 비트 이미지에 대한 본래의 MFI는 0 내지 65535 사이의 범위이다). 이러한 값을 이후 박스플롯(boxplot)에 나타난 바와 같이 서로 비교한다.
도 12 5 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 비-결합 FAb는 표적 세포 용해를 유도하지 않으며, 어댑터 CAR의 존재는 표적 세포 용해에 필수적이다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표현 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 13 1 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 14 0,75 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 15 0,5 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 16 0,25 ng/ml의 농도에서 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 17 0,1 ng/ml의 농도로 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90-/CD326+ (C) 및 CD90+/CD326- (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 18 0,05 ng/ml의 농도로 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 19 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대한 어댑터의 0,025 ng/ml의 낮은 투여량에서의 종양 성장 제어를 보여준다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/D326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 20 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대한 어댑터의 0,01 ng/ml의 낮은 투여량에서의 종양 성장 제어를 보여준다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 21 항-CD326 Fab가 항-CD90 Fab의 일정 농도에 대해 적정될 때 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 22 항-CD90 Fab가 항-CD326 Fab의 일정 농도에 대해 적정될 때 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 세포용해 활성적이다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A), CD90-/CD326- (B), CD90+/CD326- (C) 및 CD90-/CD326+ (D) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 모든 A2780 난소암 세포주는 GFP를 발현한다. GFP-형광은 시간에 걸쳐 측정되었다. 표적 세포의 CAR T 세포 매개 용해는 감소된 GFP-형광을 유발한다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 23 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 다양한 농도로 사이토카인을 분비한다 (0,75-0,1 ng/ml)
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 0,75 ng/ml, E) 0,5ng/ml, I) 0,25 ng/ml, M) 0,1 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 0,75 ng/ml, F) 0,5ng/ml, J) 0,25 ng/ml, N) 0,1 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 0,75 ng/ml, G) 0,5ng/ml, K) 0,25 ng/ml, O) 0,1 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 0,75 ng/ml, H) 0,5ng/ml, L) 0,25 ng/ml, P) 0,1 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 24 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 다양한 농도로 사이토카인을 분비한다 (0,1-0,01 ng/ml)
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 0,1 ng/ml, E) 0,05ng/ml, I) 0,025 ng/ml, M) 0,01 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 0,1 ng/ml, F) 0,05ng/ml, J) 0,025 ng/ml, N) 0,01 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 0,1 ng/ml, G) 0,05ng/ml, K) 0,025 ng/ml, O) 0,01 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 0,1 ng/ml, H) 0,05ng/ml, L) 0,025 ng/ml, P) 0,01 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 25 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주에 대해 다양한 농도로 사이토카인을 분비한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, G) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90-/CD326+ (D) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, H) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 26 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도 (1-0,1 ng/ml)에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 및 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 1 ng/ml E) 0,75 ng/ml, I) 0,5ng/ml, M) 0,25 ng/ml, Q) 0,1 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 1 ng/ml, F) 0,75 ng/ml, J) 0,5ng/ml, N) 0,25 ng/ml, R) 0,1 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 1 ng/ml, G) 0,75 ng/ml, K) 0,5ng/ml, O) 0,25 ng/ml, S) 0,1 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 1 ng/ml, H) 0,75 ng/ml, L) 0,5ng/ml, P) 0,25 ng/ml, T) 0,1 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 27 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도 (0,1-0,01 ng/ml)에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 및 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 비오틴화된 CD90 또는 비오틴화된 CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (CD90+/CD326+ (A) 0,1 ng/ml, E) 0,05ng/ml, I) 0,025 ng/ml, M) 0,01 ng/ml), CD90-/CD326- (B) 0,1 ng/ml, F) 0,05ng/ml, J) 0,025 ng/ml, N) 0,01 ng/ml), CD90+/CD326- (C) 0,1 ng/ml, G) 0,05ng/ml, K) 0,025 ng/ml, O) 0,01 ng/ml) 및 CD90-/CD326+ (D) 0,1 ng/ml, H) 0,05ng/ml, L) 0,025 ng/ml, P) 0,01 ng/ml) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 비-결합 FAb는 T 세포 활성화를 야기하지 않고 어댑터 CAR의 존재는 어댑터 특이적 T 세포 활성화에 대해 필수적이다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 28 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 및 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, D) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), 및 CD90-/CD326+ (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 29 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 소진 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, G) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90-/CD326+ (D) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, H) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰다. 통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
도 30 CD90 및 CD326을 표적화하는 어댑터 CAR T 세포는 다양한 농도에서 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암 세포주와의 공동-배양에서 활성화 마커를 발현한다
일차 인간 T 세포를 단리하고 비오틴에 대한 나타낸 CAR 작제물로 형질도입시켰다. 항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (A) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, E) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (B) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, F) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90+/CD326- (C) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, G) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90-/CD326+ (D) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, H) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰고 소진 마커에 대해 염색시켰다.
항-비오틴 CAR T 세포를 각각 모노비오틴화된 항-CD90 또는 모노비오틴화된 항-CD326 FAb의 존재하에 48시간 동안 CD90+/CD326+ (I) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, M) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326- (J) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, N) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정), CD90-/CD326+ (K) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, O) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 및 CD90+/CD326- (L) 불변 항-CD326 Fab 및 항-CD90 적정, P) 불변 항-CD90 Fab 및 항-CD326 적정) 발현 표적 세포 난소암 세포주 A2780과 공동-배양시켰고 활성화 마커에 대해 염색시켰다.
통계적 분석은 독립표본 스튜던트 t 검정을 포함하였다.
제1 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암의 치료에 사용하기 위한
a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인
b) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인
을 포함하는 조합을 제공한다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 상기 인간 암은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암일 수 있다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함할 수 있고,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함할 수 있고,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않으며,
제2 CAR은
i) 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD326에 대해 특이적인 경우 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함할 수 있고, 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 CD90 및 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 ITAM은 바람직하게는 CD3ζ 신호전달 도메인일 수 있다.
상기 CAR의 상기 1차 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ일 수 있다.
상기 제1 CAR의 상기 막횡단 도메인 및 상기 제2 CAR의 상기 막횡단 도메인은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 제1 CAR은 상기 제1 항원 결합 도메인과 상기 막횡단 도메인 사이에 스페이서를 포함할 수 있다.
상기 제2 CAR은 상기 제2 항원 결합 도메인과 상기 막횡단 도메인 사이에 스페이서를 포함할 수 있다.
상기 제1 CAR의 상기 스페이서 및 상기 제2 CAR의 상기 스페이서는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에서 상기 제2 CAR은 또한 키메라 공동자극 수용체 (CCR)로 지칭될 수 있다.
상기 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있는 상기 CCR로서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 예컨대 CD3zeta를 포함하지 않을 수 있다.
상기 CCR로서, 여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인으로 이루어질 수 있고
상기 하나 이상의 (또는 적어도 하나의) 공동-자극 신호전달 도메인(들)은 ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, OX40, 4-1BB 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 CCR의 상기 세포내 신호전달 도메인은 하나의 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인 및 하나의 CD28 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다.
CD90에 대해 특이적인 CAR의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:1 및 서열 번호:2를 포함할 수 있다.
CD326에 대해 특이적인 CAR의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:3 및 서열 번호:4를 포함할 수 있다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않으며,
제2 CAR은
i) 상기 태그된 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 CD326에 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 상기 태그된 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하고,
상기 조합은 상기 태그된 폴리펩티드를 포함한다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고, 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 태그된 폴리펩티드의 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 CD90 또는 상기 CD326에 결합될 수 있다.
CD90에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:1 및 서열 번호:2를 포함할 수 있다.
CD326에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:3 및 서열 번호:4를 포함할 수 있다.
상기 태그된 폴리펩티드의 태그는 예를 들어 합텐일 수 있다. 상기 합텐은 예를 들어 FITC, 비오틴, PE, 티아민 또는 스트렙타비딘일 수 있다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않으며,
제2 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 상기 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD326에 대해 특이적인 경우에 상기 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하고,
상기 조합은 상기 태그된 폴리펩티드를 포함한다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고, 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) 제1 태그된 폴리펩티드의 제1 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않으며,
제2 CAR은
i) 제2 태그된 폴리펩티드의 제2 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적으로 결합되는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 제2 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적으로 결합되는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하고,
상기 조합은 상기 제1 태그된 폴리펩티드 및 상기 제2 태그된 폴리펩티드를 포함한다.
상기 조합으로서, 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고, 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 제1 태그 및 상기 제2 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 제1 태그된 폴리펩티드의 상기 제1 태그는 상기 제2 태그된 폴리펩티드의 상기 제2 태그와 상이할 수 있다.
상기 조합으로서, 상기 조합은
a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제1 폴리펩티드,
b) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제2 폴리펩티드로서, 여기서 제1 폴리펩티드의 태그 및 제2 폴리펩티드의 태그는 동일한 것인 태그된 제2 폴리펩티드,
c) CAR을 포함하는 면역 세포
를 포함하고, CAR은
i) 제1 및 제2 폴리펩티드의 상기 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 1차 신호전달 도메인 및 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인
을 포함한다.
상기 조합으로서, 여기서 (이를 필요로 하는 대상체에서) 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, (이를 필요로 하는 대상체에서) 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, (이를 필요로 하는 대상체에서) 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 (상기 조합이 이를 필요로 하는 상기 대상체에 적용되는 경우) 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
상기 조합으로서, 여기서 (이를 필요로 하는 대상체에서) 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, (이를 필요로 하는 대상체에서) 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, (이를 필요로 하는 대상체에서) 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 (상기 조합이 상기 대상체에 적용되는 경우) 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높고, 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 CAR이 유일하게 상기 태그된 제1 폴리펩티드에 의해서만, 즉, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 존재 없이 활성화되는 경우에, 필요로 되는 농도보다 적어도 10% 낮고, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 CAR이 유일하게 상기 태그된 제2 폴리펩티드에 의해서만, 즉, 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 존재 없이 활성화되는 경우에, 필요로 되는 농도보다 적어도 10% 낮다.
상기 조합으로서, 여기서 (상기 조합에서) 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 x(1) μg/ml이고, (상기 조합에서) 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 x(2) μg/ml이고, x(1)은 x(합계) μg/ml보다 낮고, x(2)는 x(합계) μg/ml보다 낮고, x(1) μg/ml + x(2) μg/ml은 x(합계) μg/ml 이상이고, x(합계) μg/ml은 상기 면역 세포의 활성화를 유발하는 (상기 조합에서의) 농도이다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR을 활성화시키는 데 충분하지 않고, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR을 활성화시키는 데 충분하지 않고, 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR을 활성화시키는 데 충분하다.
상기 조합으로서, 여기서 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높고, 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값에 대한 값은 각각 개별적으로 두 태그된 폴리펩티드들 및 CD90 및 CD326을 발현하는 표적 세포를 사용하여 적정 곡선에 의해 결정될 수 있고, 이에 의해 상기 면역 세포의 활성화를 가능하게 하고 상기 면역 세포의 활성화가 일어나는 경우에 임계값을 결정한다.
어댑터 CAR 및 적어도 2개의 태그된 폴리펩티드 (적어도 2개의 상이한 항원에 대한 특이성을 가짐)를 포함하는 CAR 시스템으로서, 여기서 적어도 2개의 폴리펩티드는 동일한 태그를 갖고, 상기 CAR의 활성화는 상기 적어도 2개의 폴리펩티드의 농도에 의해 조절되고 이는 또한 표면 활성화 매트릭스 (SAM) CAR 방법으로 지칭된다. 표적 세포 어댑터 (태그된 폴리펩티드)의 복합 표면 표현형으로 인하여, 혼합물은 표적 항원의 특정 조합에 대한 활성화 임계값을 정확하게 달성하도록 조정될 수 있다.
"상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값 미만" 및 "상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값 초과"는 면역 세포의 개개의 CAR에 대해 태그된 폴리펩티드(들)을 결합시킴으로써 본원에 개시된 상기 면역 이펙터 세포의 면역 반응을 활성화시키고 자극시키는 능력과 관련된다. 태그된 폴리펩티드 또는 태그된 폴리펩티드 전체의 농도가 CAR의 활성화를 위해 너무 낮은 경우, 상기 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮다. 본원에 개시된 태그된 폴리펩티드의 농도 또는 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 농도의 합계 (조합된 농도)가 CAR을 활성화시키는 데 충분한 경우, 농도 또는 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
본원에 개시된 태그된 폴리펩티드의 농도 또는 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 농도의 합계 (조합된 농도)는 CAR을 활성화시키는 데 충분할 수 있고, 즉, 본원에 개시된 태그된 폴리펩티드의 농도 또는 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 농도의 합계 (조합된 농도)가 적어도 1 fg/ml, 적어도 1 pg/ml, 적어도 1 ng/ml, 또는 적어도 1 μg/ml일 수 있는 경우, 농도 또는 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높을 수 있다.
CD90에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:1 및 서열 번호:2를 포함할 수 있다.
CD326에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:3 및 서열 번호:4를 포함할 수 있다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암의 치료를 위해 사용하기 위한 상기 조합으로서, 상기 조합은
a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제1 폴리펩티드,
b) CD326에 대해 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제2 폴리펩티드로서, 여기서 제1 폴리펩티드의 태그 및 제2 폴리펩티드의 태그가 동일한 것인 태그된 제2 폴리펩티드,
c) CAR을 포함하는 면역 세포
를 포함하고, CAR은
i) 제1 및 제2 폴리펩티드의 상기 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 1차 신호전달 도메인 및 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인
을 포함한다.
인간 암의 치료에 사용하기 위한 상기 조합으로서, 여기서 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 이를 필요로 하는 대상체 (인간)에 적용되는 경우 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 이를 필요로 하는 상기 대상체 (인간)에 적용되는 경우 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 상기 대상체에서 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
다른 양태에서, 본 발명은 항체-약물-접합체 (ADC)를 제공하고, 여기서 상기 ADC는 CD90 및 상기 CD326에 대해 특이적인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약물에 접합된다. 상기 ADC로서, 여기서 유일하게 두 CD90 및 CD326 항원 결합 단편의 결합 친화도의 조합이 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 세포에 결합하도록 충분하게 강하다.
상기 ADC로서, 여기서 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이펙터 면역 세포에 의해 항체-의존적 세포-매개 세포독성을 매개한다.
항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 활성은 -이에 제한되지 않지만- B 림프구, 여포 수지상 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 인간 혈소판 및 비만 세포에 의해 발현되는 Fc-수용체와 항체 Fc 단편의 상호작용에 의해 매개된다.
상기 ADC로서, 여기서 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 수용체 가교-결합시 세포자멸사를 매개한다.
상기 ADC로서, 여기서 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 보체 의존성 세포독성을 매개한다.
보체 의존성 세포독성 (CDC)은 항체 Fc 단편과 보체 캐스케이드 단백질(complement cascade protein) 예컨대 C1q 및 C5와의 상호작용에 의해 매개된다.
다른 양태에서, 본 발명은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 제공하고,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않으며,
제2 CAR은
i) 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD236에 대해 특이적인 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
상기 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 상기 면역 세포로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 CD90 및 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 면역 세포.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 면역 세포.
상기 면역 세포를 포함하고, 선택적으로 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
생리학적으로 허용가능한 담체 (희석제 또는 부형제)는 버퍼 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물 예컨대 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포로서,
제1 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 상기 태그된 폴리펩티드가 CD90에 특이적으로 결합하는 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 상기 태그된 폴리펩티드가 CD326에 특이적으로 결합하는 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포,
b) 상기 태그된 폴리펩티드
를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인은 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
상기 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 선택적으로 포함하는 약학 조성물이다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포으로서,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인이 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD326에 대해 특이적인 경우에 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포,
b) 상기 태그된 폴리펩티드
를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
상기 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 선택적으로 포함하는 약학 조성물이다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포로서,
제1 CAR은
i) 제1 태그된 폴리펩티드의 제1 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인,
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 제2 태그된 폴리펩티드의 제2 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 제2 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포,
b) 상기 제1 태그된 폴리펩티드, 및
c) 상기 제2 태그된 폴리펩티드
를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 제1 태그 및 상기 제2 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
상기 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 선택적으로 포함하는 약학 조성물이다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제1 폴리펩티드,
b) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제2 폴리펩티드로서, 여기서 제1 폴리펩티드의 태그 및 제2 폴리펩티드의 태그가 동일한 것인 태그된 제2 폴리펩티드,
c) CAR을 포함하는 면역 세포로서, CAR은
i) 제1 및 제2 폴리펩티드의 상기 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 1차 신호전달 도메인 및 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 면역 세포
를 포함하는 조성물을 제공한다.
CD90에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:1 및 서열 번호:2를 포함할 수 있다.
CD326에 대해 특이적인 태그된 폴리펩티드의 상기 항원 결합 도메인은 서열 번호:3 및 서열 번호:4를 포함할 수 있다.
상기 조성물로서, 여기서 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 여기서 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 여기서 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암을 치료하는 데 사용하기 위한 상기 조성물.
상기 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 선택적으로 포함하는 약학 조성물이다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 대상체에 항체-약물-접합체 (ADC)를 투여하는 단계로서, 여기서 상기 ADC는 CD90 및 상기 CD326에 대해 특이적인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약물에 접합되는 것인 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 대상체에 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하며,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않고,
제2 CAR은
i) 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD236에 대해 특이적인 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 것인 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함한다.
상기 방법으로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 CD90 및 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 대상체에 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 투여하는 단계로서,
제1 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인,
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 상기 태그된 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 상기 태그된 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 단계,
b) 상기 대상체에 상기 태그된 폴리펩티드를 투여하는 단계
를 포함한다.
상기 방법으로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 방법의 단계 a) 및 단계 b)는 동시에 수행되거나, 또는 단계 b) 이전에 단계 a)가, 또는 단계 b) 이후에 단계 a)가 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 대상체에게 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 투여하는 단계로서,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 상기 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD326에 대해 특이적인 경우에 상기 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 단계
b) 상기 대상체에 상기 태그된 폴리펩티드를 투여하는 단계
를 포함한다.
상기 방법으로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 방법의 단계 a) 및 단계 b)는 동시에 수행되거나, 또는 단계 b) 이전에 단계 a)가, 또는 단계 b) 이후에 단계 a)가 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 대상체에 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 투여하는 단계로서,
제1 CAR은
i) 제1 태그된 폴리펩티드의 제1 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 여기서 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 제2 태그된 폴리펩티드의 제2 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 제2 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서,
여기서 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 단계,
b) 상기 대상체에 상기 제1 태그된 폴리펩티드를 투여하는 단계 및
c) 상기 대상체에 상기 제2 태그된 폴리펩티드를 투여하는 단계
를 포함한다.
상기 방법으로서, 여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 제1 태그 및 상기 제2 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 된다.
상기 방법의 단계 a), b), 및 c)는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a) 상기 대상체에 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제1 폴리펩티드를 투여하는 단계, 및
b) 상기 대상체에 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제2 폴리펩티드를 투여하는 단계로서, 여기서 제1 폴리펩티드의 태그 및 제2 폴리펩티드의 태그는 동일한 것인 단계, 및
c) 상기 대상체에 CAR을 포함하는 면역 세포를 투여하는 단계로서, CAR은
i) 제1 및 제2 폴리펩티드의 상기 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 1차 신호전달 도메인 및 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 세포네 신호전달 도메인
을 포함하는 단계
를 포함한다.
상기 방법으로서, 여기서 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 여기서 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현된 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
상기 방법의 단계 a), b), 및 c)는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 개시된 각각 CD90 및 CD326에 대해 특이적인 제1 및 제2 CAR을 발현하는 면역 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포, 예를 들어 인간 난소암을 포함하는 암을 앓는 대상체에서 암의 치료를 위해 사용하기 위한 것이다. 면역 세포, 예를 들어 대상체의 T 세포 또는 NK 세포가 단리된다. 대상체는 상기 암을 앓을 수 있거나 건강한 대상체일 수 있다. 이러한 세포는 상기 CAR을 발현하도록 시험관내 또는 생체내에서 유전자 변형된다. 이러한 조작된 세포는 시험관내 또는 생체내에서 활성화되고 증식될 수 있다. 세포 요법에서 이러한 조작된 세포는 이를 필요로 하는 수령자에게 주입된다. 이러한 세포는 약학 조성물 (상기 세포 + 약학적으로 허용가능한 담체)일 수 있다. 주입된 세포는 수령자에게 CD90 및 CD326을 발현하는 암 세포를 사멸시킬 수 있다 (또는 적어도 암 세포의 성장을 중지시킬 수 있다). 수령자는 세포를 얻은 동일한 대상체 (자가 세포 요법)일 수 있거나 동일한 종의 다른 대상체일 수 있다.
상기 CAR을 발현하도록 조작된 면역 세포, 우선적으로 T 세포 또는 NK 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분들 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과의 조합되는 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게는, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합되는 본원에 기재된 유전자 변형된 세포의 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 버퍼 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물 예컨대 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다.
우선적으로는, 본 발명의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다. 세포 조성물의 대상체로의 투여는 본 기술분야에 알려진 임의의 종래의 방식으로 실시될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 치료되는 질환에 대해 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 적합한 투여량은 임상 시험으로 결정될 수 있다. 그러나 투여의 양 및 빈도는 또한 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 이러한 요인에 의해 결정되고 영향을 받을 것이다.
본원에 개시된 면역 세포, 우선적으로 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학 조성물은 104 내지 109 세포/kg 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다. 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 수회 투여될 수 있다. 세포의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
세포는 본 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 치료적 유효량으로 활성화되고 증식될 수 있다.
본 발명의 세포는 예를 들어, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 항체 또는 항체 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, a) 본원에 개시된 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 CAR 및 본원에 개시된 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제2 CAR ("항-태그 CAR")을 공동-발현하는 면역 세포 및 b) 본원에 개시된 CD90 또는 CD326에 대해 특이적으로 결합하는 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 암을 앓는 대상체에서의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있고, 여기서 상기 암은 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함한다. 세포 예컨대 면역 세포, 예를 들어 대상체의 T 세포 또는 NK 세포는 단리되거나 또는 확립된 면역 세포주가 사용될 수 있다. 대상체는 상기 암을 앓는 (환자)일 수 있거나 건강한 대상체일 수 있다. 이러한 면역 세포는 본원에 개시된 CAR을 발현하도록 시험관내에서 유전자 변형된다. 이러한 조작된 세포는 시험관내에서 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단으로 시험관내에서 활성화되고 증식될 수 있다. 세포 요법에서, 이러한 조작된 세포는 제2 약학 조성물, 본원에 개시된 태그된 폴리펩티드의 제제에 부가하여 약학 조성물 (또는 상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단의 제제)로서 이를 필요로 하는 수령자에게 주입될 수 있다. 수령자에 주입된 세포는 본원에 개시된 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암 세포를 사멸시킬 수 있다 (또는 적어도 암 세포의 성장을 중지시킬 수 있다). 수령자는 세포를 얻은 동일한 대상체 (자가 세포 요법)일 수 있거나 동일한 종의 다른 대상체 (동종 세포 요법)일 수 있다.
상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단은 대상체에 대한 태그된 폴리펩티드의 제제의 투여 전에 환자에 투여될 수 있다. 대안적으로, 태그된 폴리펩티드의 제제는 대상체에 대한 상기 CAR 발현 세포의 세포의 치료적으로 유효한 집단의 투여 이전 또는 이와 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 추가의 변형은 대상체에의 투여 이전에 태그된 폴리펩티드의 제제의 태그된 폴리펩티드와 함께 상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단을 시험관내 배양하는 것을 포함한다.
상기 CAR-발현 (면역) 세포의 집단은 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 대상체에 투여하기 위해 제제화될 수 있다.
상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단(들)을 포함하는 제제는 약학적으로 허용가능한
부형제(들) (담체 또는 희석제)를 포함할 수 있다. 제제에 포함되는 부형제는 예를 들어 항-태그-CAR의 태그-결합 도메인의 특징, 사용되는 면역 세포의 (하위)집단, 및 투여 방식에 따라 상이한 목적을 가질 것이다. 일반적으로 사용되는 부형제의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 버퍼 및 보존제, 등장화제, 증량제, 및 윤활제.
상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단(들)의 제제는 상기 CAR-발현 (면역) 세포의 하나의 집단, 또는 상기 CAR-발현 (면역) 세포의 하나 초과의 집단을 포함할 수 있다. 상기 CAR 발현 (면역) 세포의 상이한 집단은 태그-결합 도메인의 동일성, 활성화 도메인의 동일성, 면역 세포의 (하위)집단의 동일성, 또는 이들의 조합에 기초하여 변화될 수 있다.
상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단(들)의 제제는 당업자에게 알려진 방식 및 기술을 사용하여 대상체에 투여될 수 있다. 예시적인 방식은 비제한적으로 정맥내 주사를 포함한다. 다른 방식은 비제한적으로 종양내, 피내, 피하 (s.c, s.q., sub-Q, Hypo), 근육내 (i.m.), 복강내 (i.p.), 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내 (관절), 활액내 (관절액 영역), 두개내, 척수내, 및 척수강내 (척수액)을 포함한다.
대상체에 투여되는 상기 CAR 발현 세포의 치료적으로 유효한 집단(들)을 포함하는 제제는 특정 징후 또는 장애의 치료에 대해 유효한 면역 세포와 같은 다수의 상기 CAR-발현 세포를 포함한다.
일반적으로, 약 1 x 104 내지 약 1 x 1010 개의 CAR-발현 세포 예컨대 면역 세포를 포함하는 제제가 투여될 수 있다. 대부분 경우에서, 제제는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 개의 CAR-발현 세포 예컨대 면역 세포, 약 5 x 105 내지 약 5 x 108 개의 CAR-발현 세포 예컨대 면역 세포, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 107 개의 CAR-발현 세포 예컨대 면역 세포를 포함할 수 있다. 그러나, 대상체에 투여되는 CAR-발현 세포 예컨대 면역 세포의 수는 위치, 출처, 동일성, 장애의 정도 및 중증도, 치료되는 개체의 연령 및 상태 등에 따라 넓은 한계값들 사이에서 변화될 수 있다. 의사는 궁극적으로 사용되는 적절한 투여량을 결정할 수 있다.
본원에 개시된 태그된 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 대상체에 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 태그된 폴리펩티드의 제제는 약학적으로 허용가능한 부형제(들) (담체 또는 희석제)를 포함할 수 있다. 제제에 포함되는 부형제는, 예를 들어, 태그의 특징, 태그된 폴리펩티드의 항원 결합 도메인, 및 투여 방식에 따라 상이한 목적을 가질 것이다. 일반적으로 사용되는 부형제의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 버퍼 및 보존제, 등장화제, 증량제, 및 윤활제.
태그된 폴리펩티드의 제제는 태그 폴리펩티드의 하나의 유형, 또는 태그 폴리펩티드의 하나 초과의 유형을 포함할 수 있다. 태그된 폴리펩티드의 상이한 유형은 태그의 동일성, 태그된 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티, 또는 이들의 조합에 기초하여 변화될 수 있다.
태그된 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 방식 및 기술을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 예시적인 방식은 비제한적으로 정맥내, 복강내, 및 종양내 주사를 포함한다. 다른 방식은 비제한적으로 피내, 피하 (s.c, s.q., sub-Q, Hypo), 근육내 (i.m.), 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내 (관절), 활액내 (관절액 영역), 두개내, 척수내, 및 척수강내 (척수액)을 포함한다.
폴리펩티드를 포함하는 제제는 특정 징후 또는 장애를 치료하는 데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 일반적으로, 적어도 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중의 태그된 폴리펩티드를 포함하는 제제가 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 대부분의 경우에서, 투여량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여 1일 약 100 μg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중의 태그된 폴리펩티드일 수 있다. 대상체에 투여되는 제제에서의 태그된 폴리펩티드의 양은 위치, 출처, 동일성, 장애의 정도 및 중증도, 치료되는 개체의 연령 및 상태 등에 따라 넓은 한계값들 사이에서 변화될 수 있다. 의사는 궁극적으로 사용되는 적절한 투여량을 결정할 수 있다.
CAR 발현 세포 제제와 태그 폴리펩티드-제제의 투여 사이의 시점은 사용되는 (면역) 세포의 유형, CAR의 결합 특이성, 태그의 동일성, 태그된 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티, 표적 세포, 예를 들어 치료되는 암 세포의 동일성, 대상체에서의 표적 세포의 위치, 대상체에 제제를 투여하는 데 사용되는 수단, 및 치료되는 대상체의 건강, 연령 및 체중을 포함하는 요인들에 따라 넓은 범위일 수 있다. 사실상, 태그된 폴리펩티드 제제는 유전자 조작된 (면역) 세포 제제 이전에, 이와 동시에 또는 그 이후에 투여될 수 있다.
치료되는 장애에 따라, CAR 발현 세포 제제를 투여하는 단계, 또는 태그된 폴리펩티드 제제를 투여하는 단계, 또는 둘 모두는 1회 이상으로 반복될 수 있다. 태그된 폴리펩티드의 2개 이상의 제제는 대상체에게 적용될 수 있는 경우, 적용되는 제제는 동일하거나 상이한 태그된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR을 발현하는 면역 세포와 같은 조작된 세포의 2개 이상의 제제가 대상체에 적용되는 경우, 조작된 세포는 동일한 세포 유형 또는 상이한 세포 유형의 것, 예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포일 수 있다. 세포 예컨대 면역 세포의 제제는 또한 각각 본 발명의 CAR을 발현하는 하나 초과의 세포 유형을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 제1 양태와 관련된 본원에 정의된 모든 정의, 특성, 및 구현예는 또한 본원에 개시된 발명의 다른 양태의 맥락에서 필요한 수정을 가하여 적용된다.
본 발명의 상기 기재된 응용분야 및 구현예 이외에 본 발명의 추가의 구현예는 이러한 구현예로 제한되는 것으로 의도됨 없이 하기에 기재된다.
구현예
본 발명의 일 구현예에서, T 세포는 CD3zeta 신호전달 도메인 (본원에 개시된 제1 CAR)을 갖는 CD90-CAR 및 4-1BB 공동자극 도메인 (본원에 개시된 제2 CAR)을 갖는 CD326-CAR을 발현한다. T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암을 앓는 인간 환자에 의해 제공되고, 상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형되었다.
상기 유전자 변형된 T 세포의 치료적 유효량으로의 시험관내 증식 이후, CD90CAR 및 CD326CAR 둘 모두를 발현하는 T 세포는 상기 환자에 적용될 수 있고, 여기서 이러한 유전자 변형된 T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포에 의해 활성화되고 이후 상기 암 세포를 제거할 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 CD90에 특이적으로 결합되는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD326에 특이적으로 결합되는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 비오틴에 대해 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포를 포함한다. T 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암을 앓는 인간 환자에 의해 제공되고, 비오틴에 대해 특이적인 상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형되었다.
상기 조성물은 상기 환자에 적용될 수 있고, 여기서 CD90에 특이적으로 결합하는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단독 농도, 및 CD326에 특이적으로 결합하는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단독 농도는 항-비오틴-CAR을 발현하는 상기 T 세포를 활성화시키기에 너무 낮지만, 상기 농도의 합은 유전자 변형된 T 세포를 활성화시켜 이에 의해 상기 암 세포를 제거하기에 충분하다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 CD90에 특이적으로 결합하는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD326에 특이적으로 결합하는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 비오틴에 대해 특이적인 CAR을 발현하는 NK 세포를 포함한다. NK 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 난소암을 앓는 인간 환자에 의해 제공되고, 비오틴에 대해 특이적인 상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형되었다.
상기 조성물은 상기 환자에게 적용될 수 있고, 여기서 CD90에 특이적으로 결합하는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단독 농도, 및 CD326에 특이적으로 결합하는 비오틴화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단독 농도는 항-비오틴-CAR을 발현하는 상기 NK 세포를 활성화시키기에 너무 낮지만, 상기 농도의 합은 유전자 변형된 NK 세포를 활성화시켜 이에 의해 상기 암 세포를 제거하기에 충분하다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "포함함" 또는 "포함하다"는 조성물, 방법, 및 방법 또는 조성물에 필수적인 이의 개개의 성분(들)과 관련하여 사용되지만, 필수적이든 아니든 비특정된 구성요소의 포함에 개방적이다.
항체-약물 접합체 (ADC): 약물, 예컨대 세포 독성제에 접합되는 항체 (또는 항체의 항원-결합 단편)를 포함하는 분자. ADC는 세포 표면 상에서 발현되는 종양 항원에 대한 항체의 특이적인 결합을 통해 암 세포에 약물을 특이적으로 표적화하는 데 사용될 수 있다. ADC과 함께 사용하기 위한 예시적인 약물은 항-미세소관제 (anti-microtubule agent) (예컨대 메이탄시노이드, 아우리스타틴 E 및 아우리스타틴 F) 및 가닥내 가교제 (예를 들어, 피롤로벤조디아제핀; PDB)를 포함한다.
항-미세소관제: 유사분열을 중지함으로써 세포 성장을 차단하는 약물의 유형. 항-미세소관제는 또한 암을 치료하기 위해 사용되는 "항-유사분열제"로 지칭된다.
이중특이적 단클론 항체 (BsMAb, BsAb)는 2개의 상이한 유형의 항원에 동시에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. BsMab는 다수의 구조적 형태로 제조될 수 있고, 현재 응용분야는 암 면역요법 및 약물 전달을 위해 탐색되고 있다. bsMab의 여러 형태가 존재하지만, 2개의 주요 카테고리는 IgG-유사 및 비-IgG-유사이다. 제조 방법의 주요 형태는 쿼드로마 (quadroma), 화학적 접합, 및 유전자 재조합이고, 각 방법은 독특한 형태를 야기한다.
일반적으로, CAR은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인 (세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 세포외 도메인 (세포외 부분)을 포함할 수 있다. 세포외 도메인은 링커 또는 스페이서에 의해 막횡단 도메인에 연결될 수 있다. 세포외 도메인은 또한 단일 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 폴리펩티드 ("합텐화된(haptenylated)" 또는 "태그된" 폴리펩티드)에 결합되는 태그 또는 합텐에 결합되고, 여기서 폴리펩티드는 본원에서 CD90 또는 CD326의 암 세포의 표면 상에서 발현될 수 있는 질환-관련 항원 예컨대 종양 관련 항원 (TAA)에 결합될 수 있다.
이러한 CAR은 예를 들어 US9233125B2에 개시된 "항-태그" CAR 또는 "어댑터CAR" 또는 "유니버설 CAR"로서 지칭될 수 있다.
합텐 또는 태그는 폴리펩티드 (태그된 폴리펩티드)에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있고, 여기서 폴리펩티드는 예를 들어 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포와 같은 표적의 (세포) 표면 상에서 발현되는 상기 질환 관련 항원에 결합될 수 있다. 태그는 예를 들어 덱스트란 또는 합텐 예컨대 비오틴 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 피코에리트린 (PE) 또는 티아민일 수 있지만, 태그는 또한 예를 들어 태그된 폴리펩티드의 폴리펩티드 일부에 화학적으로 또는 재조합적으로 결합된 펩티드 서열일 수 있다. 태그는 또한 스트렙타비딘일 수 있다. 태그된 폴리펩티드의 태그 부분은 CAR의 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 분자에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 태그가 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트)인 경우, 태그-결합 도메인은 항-FITC scFv을 구성할 수 있다. 대안적으로, 태그가 비오틴 또는 PE (피코에리트린)인 경우, 태그-결합 도메인은 각각 항-비오틴 scFv 또는 항-PE scFv를 구성할 수 있다.
"신호 펩티드"는 예를 들어 세포 소기관 (예컨대 소포체) 및/또는 세포 표면으로의 세포 내의 단백질의 수송 및 편재화를 유도하는 펩티드 서열을 지칭한다.
일반적으로, "항원 결합 도메인"은 항원, 예를 들어 종양 관련 항원 (TAA) 또는 종양 특이적 항원 (TSA)에 특이적으로 결합하는 CAR의 영역을 지칭한다. 본 발명의 CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어 탠덤(tandem) CAR)을 포함할 수 있다. 일반적으로, CAR 상의 표적화 영역은 세포외이다. 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 전장 중쇄, Fab 단편, 단쇄 Fv (scFv), 2가 단쇄 항체 또는 디아바디를 포함할 수 있다. 주어진 항원 예컨대 어피바디(affibody)에 특이적으로 결합하는 임의의 분자 또는 자연 발생 수용체로부터의 리간드 결합 도메인은 항원 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. 종종 항원 결합 도메인은 scFv이다. 보통, scFv에서, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 유연한 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이러한 링커는 예를 들어 "(G4/S)3-링커"일 수 있다.
일부 경우에서, 항원 결합 도메인이 CAR이 이에 사용될 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유리하다. 예를 들어, 이것이 인간에서 치료적으로 사용되도록 계획되는 경우, CAR의 항원 결합 도메인이 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 기술분야에 잘 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 "스페이서" 또는 "힌지"는 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 있는 친수성 영역을 지칭한다. 본 발명의 CAR은 세포외 스페이서 도메인을 포함할 수 있지만, 이러한 스페이서를 제외하는 것도 가능하다. 스페이서는 예를 들어 항체 또는 이의 단편의 Fc 단편, 항체 또는 이의 단편의 힌지 영역, 항체의 CH2 또는 CH3 영역, 보조 단백질, 인공 스페이서 서열 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 스페이서의 주요 예는 CD8alpha 힌지이다.
CAR의 막횡단 도메인은 이러한 도메인에 대한 임의의 바람직한 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질으로부터 유래될 수 있다. 막횡단 도메인은 예를 들어 CD8alpha 또는 CD28로부터 유래될 수 있다. 핵심 신호전달 및 항원 인식 모듈 (도메인)이 2개의 (또는 심지어 그 초과의) 폴리펩티드 상에 있는 경우, CAR은 2개의 (또는 그 초과의) 막횡단 도메인을 가질 수 있다. 분할 핵심 신호전달 및 항원 인식 모듈은 CAR의 각 폴리펩티드에서의 소분자-의존성 이종이량체화 도메인으로 인해 CAR 세포 발현에 대한 소분자 의존성, 적정 가능 및 가역적 제어 (예를 들어 WO2014127261A1)를 가능하게 한다.
CAR의 세포질 신호전달 도메인 (세포내 신호전달 도메인 또는 활성화 엔도도메인)은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화와 관련된다. "이펙터 기능"은 예를 들어 T 세포에서의 세포의 특수한 기능을 의미하고, 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 변환하고 CAR를 발현하는 세포가 특수한 기능을 수행하도록 유도하는 단백질 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포 이펙터 기능을 개시하거나 차단하는 신호를 전달하기에 충분한 주어진 단백질의 세포질 신호전달 도메인의 임의의 완전한, 돌연변이된 또는 절단된 부분을 포함할 수 있다.
CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 주요 예는 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동-수용체의 세포질 신호전달 서열을 포함한다.
일반적으로, T 세포 활성화는 2개의 별개의 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개될 수 있고, 첫 번째는 TCR (1차 세포질 신호전달 서열, 1차 세포질 신호전달 도메인)을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것이고, 두 번째는 2차 또는 공동-자극 신호 (2차 세포질 신호전달 서열, 공동-자극 신호전달 도메인)을 제공하기 위해 항원 독립적 방식으로 작용하는 것이다. 따라서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포질 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 2차 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 도메인 (1차 (세포내) 신호전달 도메인)은 ITAM (면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프)를 함유할 수 있다.
CAR에 종종 사용되는 ITAM 함유 1차 세포질 신호전달 도메인의 예는 TCRζ (CD3ζ), FcRgamma, FcRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것이다. 가장 중요한 것은 CD3ζ로부터 유래된 서열이다.
CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 그 자체 또는 임의의 다른 바람직한 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. CAR의 세포질 도메인은 공동-자극 신호전달 영역 (도메인)의 CD3ζ 사슬 부분을 포함할 수 있다. 공동-자극 신호전달 영역은 공동-자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동-자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동-자극 분자에 대한 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3이다.
CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호전달 서열은 무작위적 또는 특정 순서로 링커를 사용하거나 사용하지 않고 서로 연결될 수 있다. 길이가 2 내지 10개의 아미노산인 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 연결을 형성할 수 있다. 주요 링커는 글리신-세린 더블릿(doublet)이다.
일례로서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인 및 CD137의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 신호전달 도메인, CD28의 신호전달 도메인, 및 CD137의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, CAR의 세포외 부분 또는 막횡단 도메인 또는 세포질 도메인은 또한 CAR의 분할 핵심 신호전달 및 항원 인식 모듈의 목적을 위한 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 자살 스위치(suicide switch)에 의해 CAR 발현 면역 세포를 제거하기 위해 CAR을 코딩하는 핵산의 수준으로 하나 이상의 작동 요소를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 자살 스위치는 예를 들어 세포자멸사 유도 신호전달 연쇄반응 또는 세포 사멸을 유도하는 약물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CAR을 발현하고 코딩하는 핵산은 티미딘 키나아제 (TK) 또는 시토신 데아미나아제 (CD)와 같은 효소를 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. CAR은 또한 면역 세포에서 CAR의 제어된 발현을 가능하게 하는 유전자 발현 시스템의 일부일 수 있다. 이러한 유전자 발현 시스템은 유도성 유전자 발현 시스템일 수 있고, 여기서 유도제가 상기 유도성 유전자 발현 시스템으로 형질도입되는 세포에 투여되는 경우, 유전자 발현 시스템이 유도되고 상기 CAR은 상기 형질도입된 세포의 표면 상에서 발현된다.
본 발명의 일부 구현예에서, CAR은 "SUPRA"(스플릿(split), 유니버설 및 프로그램 가능) CAR일 수 있으며, 여기서 "zipCAR" 도메인은 세포내 공동자극 도메인 및 세포외 류신 지퍼(extracellular leucine zipper)를 연결할 수 있다 (WO2017/091546). 이 지퍼는 예를 들어 scFv 영역에 융합되는 상보성 지퍼로 표적화되어 SUPRA CAR T 세포가 종양 특이적이도록 할 수 있다. 이 방법은 다양한 종양에 대한 유니버설 CAR T 세포를 발생시키는 데 특히 유용할 것이고; 어댑터 분자는 종양 특이성을 위해 설계될 수 있고, 선택 압력 및 항원 탈출(antigen escape)의 상황에 중요한 입양 전달 후 특이성을 변경하는 선택사항을 제공할 것이다.
키메라 공동자극 수용체 (CCR)는 본원에 개시된 제2 항원 결합 수용체이고, 특별한 종류의 CAR로 여겨질 수 있다 (본원에서 일정하게 면역 세포에서의 제2 CAR은 CCR이다).
본원에 사용되는 용어 "최대로 세포독성이다"은 본원에 개시된 제1 CAR 및 제2 CAR을 발현하는 면역 세포는 제1 CAR에 부가하여 제2 CAR이 동시에 활성화되는 경우에만 완전하게 활성화될 수 있음을 의미한다. 상기 면역 세포는 상기 두 CAR 중 하나만의 활성화에 의해 충분하게 활성화될 수 없다. 본원에 사용되는 용어 최대로 세포독성이다는 항상 세포 독성의 최대 가능한 값 또는 수준이 도달되어야 하는 것을 의미하는 것은 아니지만, 이는 예를 들어 최대 값의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 도달되는 것으로 충분할 것이지만, 이 값은 항상 상기 면역 세포에서의 상기 두 CAR 중 하나만의 활성화에 의해 도달되는 값보다 더 크다.
대안적으로, CCR은 제1 CAR 및 CCR (제2 CAR) 둘 모두를 발현하는 면역 세포의 이펙터 반응의 규모를 향상시킬 수 있고, 연장된 생존을 촉진할 수 있다. 제1 CAR 및 CCR (제2 CAR) 둘 모두를 발현하는 면역 세포의 이펙터 반응의 향상 규모는 제1 CAR에 의해 유일하게 활성화되고 자극되고 CCR에 의해 증강되지 않는 면역 세포의 이펙터 반응과 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배 또는 적어도 50배일 수 있다. 면역 세포의 이펙터 반응의 규모의 증가는 예를 들어 이펙터 사이토카인 예컨대 IL-2, IFN-γ, TNF-α의 분비에 의해 측정되거나 결정될 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 CAR 및 CCR 둘 모두를 발현하는 면역 세포에 의한 이펙터 사이토카인 예컨대 IL-2, IFN-γ, TNF-α의 분비의 양은 상기 제1 CAR에 의해 유일하게 활성화되고 자극되고, CCR에 의해 증강되지 않는 면역 세포의 이펙터 사이토카인 예컨대 IL-2, IFN-γ, TNF-α의 분비의 양과 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배 또는 적어도 50배 더 높을 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 CAR 및 CCR 둘 모두를 발현하는 면역 세포에 의한 사멸된 표적 세포의 수는 상기 제1 CAR에 의해 유일하게 활성화되고 자극되고, CCR에 의해 증강되지 않는 면역 세포에 의한 사멸된 표적 세포의 수와 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배 또는 적어도 50배 더 높을 수 있다.
CCR은 자체적으로 면역 세포의 상기 면역 반응을 매개할 수 없고, 즉, 면역 세포가 제1 CAR을 발현할 수 있고, CCR은 단지 상기 면역 세포의 상기 면역 반응을 증강시킬 수 있는 것이 (지원)할 수 있는 것이 상기 면역 반응을 유발하는 데 필요할 수 있다.
상기 제1 CAR과 달리, CCR은 CD3ζ 또는 FcεRIγ과 같은 ITAM 함유 도메인을 함유할 수 없고, 이에 따라 시스- 및/또는 트랜스-활성화를 포함하는 일반적으로 알려진 TCR-매개 신호전달 사건은 CCR 유발시 유도될 수 없다.
CCR은 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 부분을 포함하는 적어도 하나의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 CCR의 상기 적어도 하나의 공동-자극 신호전달 도메인은 ICOS, CD154, CD5, CD2, CD46, HVEM, CD8, CD97, TNFRSF18, CD30, SLAM, DAP10, CD64, CD16, CD89, MyD88, KIR-2DS, KIR-3DS, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, ICAM, CD27, OX40, 4-1BB 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제1 CAR은 기능성 CAR, 즉, CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포의 면역 이펙터 반응을 매개하는 CAR을 생성하는 임의의 순서 및/또는 조합으로 본원에 기재된 상술한 도메인의 임의의 부분 또는 일부를 포함하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 CCR은 기능성 CCR, 즉, CAR 및 CCR을 발현하는 면역 이펙터 세포의 면역 이펙터 반응을 증강시키는 CRR을 생성하는 임의의 순서 및/또는 조합으로 본원에 기재된 상술한 도메인의 임의의 부분 또는 일부를 포함하도록 설계될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "태그된 폴리펩티드"는 적어도 하나의 추가의 성분, 즉, 태그에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 사용되는 태그된 폴리펩티드는 표적 세포 상에 발현되는 항원에 결합할 수 있다. 폴리펩티드는 표적 세포의 표면 상에서 발현되는 항원 예컨대 암 세포 상의 종양 관련 항원 (TAA)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 태그된 폴리펩티드의 폴리펩티드는 대안적으로 표적 세포의 항원에 결합할 수 있는 사이토카인 또는 성장 인자 또는 다른 가용성 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "어댑터" 또는 "어댑터 분자" 또는 "태그된 폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
태그는 예를 들어 합텐 또는 덱스트란일 수 있고, 합텐 또는 덱스트란은 항원 결합 도메인에 의해 태그에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR에 결합할 수 있다.
예를 들어 FITC, 비오틴, PE, 티아민, 스트렙타비딘 또는 덱스트란과 같은 합텐은 큰 담체 예컨대 단백질에 부착될 때에만 면역 반응을 유도하는 소분자이고; 담체는 자체적으로 면역 반응을 또한 유도하지 않는 것일 수 있다. 신체가 합텐-담체 부가체에 항체를 발생시키는 경우, 소분자 합텐은 또한 항체에 결합될 수 있으나, 이는 보통 면역 반응을 개시하지 않을 것이며; 보통 유일하게 합텐-담체 부가체만이 이를 행할 수 있다.
그러나 태그는 또한 예를 들어 태그된 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분에 화학적으로 또는 재조합적으로 결합되는 펩티드 서열일 수 있다. 펩티드는 c-Myc-태그, Strep-태그, Flag-태그, 및 폴리히스티딘-태그(Polyhistidine-tag)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 태그는 또한 스트렙타비딘일 수 있다. 태그된 폴리펩티드의 태그 부분은 CAR의 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 분자인 것에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 태그가 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트)인 경우, 태그-결합 도메인은 항-FITC scFv을 구성할 수 있다. 대안적으로, 태그가 비오틴 또는 PE (피코에리트린)인 경우, 태그-결합 도메인은 항-비오틴 scFv 또는 항-PE scFv를 구성할 수 있다.
용어 "면역 세포" 또는 "면역 이펙터 세포"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 면역계의 일부일 수 있고 특정 이펙터 기능 예컨대 알파-베타 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 선천 림프구 세포 (ILC), 사이토카인 유도 킬러 (CIK) 세포, 림포카인 활성화 킬러 (LAK) 세포, 감마-델타 T 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 기질 세포 (MSC), 단핵구 또는 대식세포를 실행시키는 세포를 지칭한다. 바람직한 면역 세포는 세포독성 이펙터 기능을 갖는 세포 예컨대 알파-베타 T 세포, NK 세포, NKT 세포, ILC, CIK 세포, LAK 세포 또는 감마-델타 T 세포이다. 가장 바람직한 면역 이펙터 세포는 T 세포 및/또는 NK 세포이다. "이펙터 기능"은 예를 들어 T 세포에서의 세포의 특수한 기능을 의미하고 이펙터 기능은 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성 (사이토카인의 분비를 포함함)일 수 있다. 대안적으로, 상기 면역 세포 또는 면역 이펙터 세포는 인간 면역계와 관련된 특정 이펙터 기능을 실행할 수 있는 인간 기원의 면역 유사 세포일 수 있다.
항원 결합 수용체, 예를 들어 CAR의 활성화의 맥락에서 용어 "상기 면역 이펙터 세포의 면역 반응을 활성화시키고 자극한다"는 이에 제한되지 않지만 증식, 분화, 사이토카인 방출, 세포용해 이펙터 기능 등을 포함하는 면역 반응을 개시하는 면역 이펙터 세포에서의 변경된 유전자 발현 상태와 관련된 신호전달 연쇄반응의 1차 유도를 의미한다. 예로써, MHC-의존성 TCR-결합은 TCR-클러스터링 및 다른 CD3, CD4, CD8 중에서 포함되는 면역학적 시냅스의 형성을 야기한다. 이후, 활성화를 가능하게 하는 CD3ζ에 대한 ZAP70의 결합을 야기한다. 이후, 여러 경로는 예를 들어 증식 및 T 세포 매개 면역 반응을 가능하게 하는 증가된 IL-2 생산을 위해 필요한 AP-1, NFAT 및 NF-κB와 같은 전사 인자를 궁극적으로 활성화시키는 T 세포의 발현을 야기한다. 그러나, 지속되는 면역 반응을 유도하기 위해, 공동자극 수용체 예컨대 CD28, CD27, CD137 (4-1BB) 또는 ICOS는 동반하여 활성화되어야 한다. 공동자극 신호 (신호 2)가 없는 임의의 TCR-결합 (신호 1)는 T 세포 이펙터 기능의 억제와 관련되고, 이는 T 세포가 무반응성이게 되는 것을 의미한다. 용어 "상기 면역 이펙터 세포의 면역 반응을 매개한다"는 "상기 면역 이펙터 세포의 면역 반응을 활성화시키고 자극한다"와 동일한 의미를 갖고, 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮다" 및 "상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다"는 면역 세포의 각각의 CAR에 태그된 폴리펩티드(들)을 결합시킴으로써 본원에 개시된 상기 면역 이펙터 세포를 활성화시키고 자극하는 능력을 지칭한다. 태그된 폴리펩티드 또는 전체 태그된 폴리펩티드의 농도가 CAR의 활성화를 위해 너무 낮은 경우, 상기 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮다. 본원에 개시된 태그된 폴리펩티드의 농도 또는 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 농도의 합계 (조합된 농도)가 CAR을 활성화시키는 데 충분한 경우, 농도 또는 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높다.
CCR의 활성화의 맥락에서의 용어 "상기 면역 이펙터 세포의 상기 면역 반응을 증강시키고 및/또는 상기 면역 이펙터 세포의 생존을 보장한다"는 생존을 촉진하고 강화된 신호-1-독립적 면역 반응을 가능하게 하는 세포내 조건을 제공하는 면역 이펙터 세포에서의 신호-1-독립적 공동자극 신호전달 연쇄반응의 활성화를 의미한다. 예로써, 제1 CAR 및 CCR 둘 모두를 공동-발현하는 면역 이펙터 세포는 예를 들어 활성화 도메인 CD3ζ을 포함하는 CAR에 의해 유일하게 활성화되지만, 세포용해 가능성은 CCR을 통한 공동자극 경로 (예를 들어 4-1BB 또는 CD28)의 추가적인 유발에 의해 증강될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "항체"는 비제한적으로 표적 항원을 특이적으로 인식하는 (즉, 결합하는) 단클론 및 다클론 항체 (전장 항체 포함), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 단편, 즉, 항체의 항원 결합 단편, 면역접합체 및 항체-면역접합체 키메라를 포함하는 다양한 형태의 항체 구조를 포괄하도록 가장 넓은 의미로 사용된다. "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 이의 가변 도메인, 또는 적어도 이의 항원 결합 부위 ("항체의 항원 결합 단편")를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab (항원 결합 단편), scFv (가변 단쇄 단편), 단일 도메인 항체, 디아바디, dsFv, Fab', 디아바디, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "항원"은 하나 이상의 항체에 결합하거나 이의 생성을 자극하는 물질을 포함하는 것으로 의도되고, 비제한적으로 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 지질, 탄수화물 예컨대 덱스트란, 합텐 및 이의 조합, 예를 들어, 글리코실화된 단백질 또는 당지질을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "항원"은 표적 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고 이에 제한되지 않지만 항체 또는 TCR을 포함하는 적응 면역계, 또는 이에 제한되지 않지만 내인성 또는 형질전환 TCR, CAR, scFv 또는 이의 다량체, Fab-단편 또는 이의 다량체, 항체 또는 이의 다량체, 단쇄 항체 또는 이의 다량체, 또는 높은 친화도를 갖는 구조에 결합을 실행할 수 있는 임의의 다른 분자를 포함하는 조작된 분자에 의해 인식될 수 있는 분자 개체를 지칭한다.
분화의 클러스터 (CD로 약칭됨)는 세포의 면역표현형화를 위한 표적을 제공하는, 세포 표면 분자, 일정하게 폴리펩티드의 식별 및 조사를 위해 사용되는 프로토콜이다.
CD90 (또는 Thy-1)은 본래 흉선세포 항원으로 발견된 단일 V-유사 면역글로불린 도메인을 가진 25-37 kDa의 중질로 N-글리코실화된, 글리코포스파티딜이노시톨 (GPI)이 부착된 보존된 세포 표면 단백질이다.
CD326 (또는 상피 세포 접착 분자 (EpCAM))은 상피에서 Ca2+-독립적 동형 세포-세포 접착을 매개하는 막횡단 당단백질이다. CD326은 또한 세포 신호전달, 이동, 증식, 및 분화에 관련된다. 추가적으로, CD326은 c-myc, e-fabp, 및 시클린(cyclin) A & E를 상향조절하는 이의 능력을 통해 발암 가능성을 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "표적 세포"는 본원에 개시된 항원 결합 수용체에 의해 및/또는 본원에 개시된 CCR에 의해 및/또는 본원에 개시된 태그된 폴리펩티드에 의해 인식될 (결합될) 이의 세포 표면 상에 항원을 발현하는 세포를 지칭한다. 일정하게 본원에서 표적 세포는 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 (암) 세포이다.
CD90 및 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인의 맥락에서의 용어 "조합"은 또한 예를 들어 CD90 및 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 "키트" 또는 CD90 및 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 "조성물의 조합" 또는 CD90 및 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 "시스템"일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "대상체"는 포유동물 예컨대 마우스, 래트, 소, 돼지, 염소, 닭, 개, 원숭이 또는 인간을 지칭한다. 우선적으로, 대상체는 인간이다. 대상체는 장애 예컨대 암을 앓는 대상체 (환자)일 수 있으나, 대상체는 또한 건강한 대상체일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "자가"는 이후에 재도입되는 동일한 대상체로부터 유래된 임의의 물질과 관련된다.
본원에 사용되는 용어 "동종"은 물질이 재도입되는 대상체와 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 임의의 물질과 관련된다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 유효한 집단"은 대상체에서 치료적 이점을 제공하는 세포 집단의 양을 의미한다.
예를 들어 본원에 개시된 CAR 및 CCR에 사용되는 항체, 이의 항원 결합 단편의 항원 결합 도메인과 관련되는 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "에 대해 특이적인"은 특이적인 항원을 인식하고 이에 결합되지만, 샘플에서의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 지칭한다. 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인은 또한 다른 종으로부터의 이 항원에 결합할 수 있다. 이러한 교차-종 반응성은 다수의 항체에 대해 통상적이고 이에 따라 특이적인 이 항원 결합 도메인의 정의에 상반되지 않는다. 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인은 또한 상이한 대립형질 형태의 항원 (대립형질 변이체, 스플라이스 변이체, 이소형 등) 또는 동일한 유전자 패밀리로부터의 이 항원의 상동 변이체에도 결합할 수 있다. 이 교차 반응성은 다수의 항체에 대해 통상적이고 이에 따라 특이적인 이 항원 결합 도메인의 정의에 상반되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "조작된 세포" 및 "유전자 변형된 세포"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 세포 또는 이의 자손의 유전자형 및/또는 표현형을 차례로 변형시키는 외래 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 및/또는 발현하는 것을 의미한다. 특히, 상기 용어는 세포, 우선적으로 면역 세포가 자연 상태에서 이들 세포에서 발현되지 않는 펩티드 또는 단백질을 안정적으로 또는 일시적으로 발현시키기 위해 본 기술 분야에 잘 알려진 재조합 방법에 의해 조작될 수 있다는 사실과 관련된다. 예를 들어, 면역 세포는 그의 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체와 같은 인공 작제물을 발현하도록 조작된다.
본원에 사용되는 용어 장애 (예를 들어 암)을 "치료하다" (이의 치료)는 대상체가 겪고 있는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "발현"은 세포에서 그의 프로모터에 의해 유도되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
서열 목록 프로토콜에 주어진 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 4의 아미노산 서열은 본원에 개시된 CAR의 부분 서열이다. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 4의 상기 서열은 또한 각각 이 서열의 변이체를 포함할 수 있고, 이는 여전히 본원에 기재된 의도된 기능을 유지하면서 결실되거나, 첨가되거나 또는 대체된 일부 아미노산을 갖는다. 따라서, 각각 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 4에서의 아미노산 서열, 예컨대 아미노산 서열 수준에서 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 각각 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 4에 본질적으로 유사한 아미노산 서열의 변이체가 이 정의에 포함된다. 일반적으로, 각각 서열 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 4의 의도된 기능의 의도적 변화를 야기하지 않는 모든 아미노산 변이는 이 정의에 포함된다. 본 발명의 맥락에서, "서열 동일성"은 본 기술 분야에 잘 알려진 아미노산 서열에 대한 정렬 프로그램을 사용하여 쌍별 정렬을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "암"은 악성 신생물로 의학적으로 알려져 있다. 암은 조절되지 않는 세포 성장과 관련된 광범위한 군의 질환이며 모든 종류의 백혈병을 포함한다. 암에서 세포 (암 세포)는 통제할 수 없을 정도로 분열하고 성장하여 악성 종양을 형성하고 신체의 가까운 부분을 침범한다. 암은 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 더 먼 부분으로 퍼질 수 있다. 인간에 영향을 미치는 200개 초과의 상이한 알려진 암이 존재한다.
본원에 사용되는 용어 "CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암"은 암을 지칭하고, 여기서 적어도 상기 암의 하위집단은 동일한 세포 상에 CD90 및 CD326 둘 모두를 발현한다.
용어 "CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 난소암"은 인간 난소암을 지칭하고, 여기서 적어도 상기 인간 난소암의 하위집단은 동일한 세포 상에 CD90 및 CD326 둘 모두를 발현한다.
난소암은 난소 안에 또는 그 위에 형성되는 암이다. 이는 신체의 다른 부분에 침습되거나 이에 퍼지는 능력을 갖는 비정상적인 세포를 야기한다. 이 과정이 시작되면 증상이 없거나 단지 모호한 증상이 존재할 수 있다. 암이 진행됨에 따라 증상이 더 현저하게 된다. 이러한 증상은 무엇보다도 팽만감, 골반 통증, 복부 팽윤, 및 식욕 감소를 포함할 수 있다. 암이 퍼질 수 있는 일반적인 영역은 복부 내벽, 림프절, 폐 및 간을 포함한다.
이러한 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 이의 범위에 대해 제한을 부여하는 임의의 방식으로 해석되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 보다 상세한 설명을 위한 것이지만 본 발명을 이들 실시예로 제한되지 않는다.
실시예 1: 조합이 난소암 (OvCa) 세포와 비-OvCa 세포 간을 식별을 가능하게 하는 형광 모이어티 및 항원 인식 모이어티를 포함하는 접합체의 조합의 식별.
고-등급 장액성 난소 암종 절제부를 분리하고 단일 세포 현탁액을 유세포 분석에 의해 분석하였다 (도 1). 편향되지 않은 표면 마커 스크리닝 라이브러리를 사용하는 것은 고-등급 난소 암종 환자의 하위세트 상의 CD90 및 CD326의 공동-발현이 나타내었다 (도 2). 이후, 이 별개의 표적 조합은 순환 면역형광 현미경으로 검증되었다. 신선하게-동결된 고-등급 장액성 난소 암종 절제부를 절편하고 아세톤으로 고정하였다. 개개의 생물학적 샘플의 완전하게 자동화된 순환 형광 이미징을 가능하게 하는 새로운 고 컨텐츠 영상화 플랫폼을 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 형광 모이어티에 접합된 다수의 항원 인식 모이어티로의 OvCa 시편의 순차적 염색은 다수의 항원의 발현을 나타내었다. 인간 상피 조직 및 암종에 대한 잘 알려진 마커인 EpCAM (CD326)과 CD90이 조합되는 공동-발현은 환자의 하위세트에서 검증되었다 (도 3). 데이터 분석 및 추가의 공동-염색은 CD326 및 CD90이 OvCa 샘플의 하위세트에서 공동-발현된 것을 확인하였다.
CAR T 세포 요법의 종양 표적 외 독성, 즉, CAR T 세포가 생리학적 조건하에 CAR 표적을 발현하는 비-종양 세포에 결합하고 이를 용해하는 것은 여러 CAR T 세포 생성물에 대해 기재되었기 때문에 표적 발현은 건강한 조직에서 분석되어야 한다. 그러나, 건강한 조직에 대한 발현은 적어도 부분적으로 차별적인 것이며 이는 건강한 세포로부터 OvCa를 구별하기 위해 세포의 선택적 표지를 얻기 위해 두 마커를 조합할 가능성을 열어준다 (도 3).
따라서, CD326 및 CD90의 조합은 OvCa의 이중 표적화 CAR T 세포 치료에 대한 가능성을 열어준다. CD326 및 CD90은 OvCa 세포의 하위세트에서 공동-발현되지만 건강한 조직에서는 그렇지 않거나 덜하다. 따라서, CD326 및 CD90의 공동-검출에 의해 활성화되지만 2개의 마커 중 하나의 부재 하에 활성화되지 않는 CAR T 세포를 사용하는 것은 영향을 미치지 않는 건강한 세포를 남겨두는 OvCa 세포의 효율적인 사멸을 야기할 것이고, 그 이유는 CD326 또는 CD90이 발현되지 않고, 즉, CD90 및 CD326은 동일한 (건강한) 세포에 대해 공동-발현되지 않기 때문이다.
실시예 2: 조합이 난소암 (OvCa) 세포와 비-OvCa 세포 간을 구별할 수 있게 하는 항원 인식 모이어티의 조합의 사용
CAR T 세포 요법의 종양 표적 외 독성을 방지하기 위해, 여러 기술적 해법이 CAR T 세포 특이성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 하나의 선택사항은 이중-표적화 CAR의 사용이고, 즉, T 세포 활성화는 CAR T 세포에 의해 복수의 마커를 인식함으로써 결정되는 임계값을 극복함으로써 달성된다. AND CAR에서 CAR T 세포는 항원 결합 모이어티, 힌지, 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 2개의 독립적인 CAR 작제물을 공동-발현한다. 별개의 에피토프를 인식하는 하나의 CAR은 활성화 신호 (신호1)을 전달하고, 이는 - 그 자체로는 - CAR T 세포의 활성화 임계값을 극복하는 데 불충분하다. 추가적으로, 다른 에피토프를 인식하는 제2 CAR은 - 제1 CAR과의 조합에서만 - T 세포를 완전하게 활성화하기 위해 활성화 임계값을 극복하도록 제1 CAR과 상승작용되는 공동자극 도메인 (신호2)를 운반한다.
AND CAR T 세포는 하나의 종양-관련 항원 A를 인식하는 제1 CAR로 구성된다. 제1 CAR은 활성화 세포내 도메인, 예를 들어 CD3zeta를 사용한다. 세포 상의 항원 A에 대한 CAR T 세포의 결합시 CAR T 세포는 활성화 임계값을 극복할 수 없다. 활성화 임계값을 극복하기 위해, 제2 CAR은 항원 A-발현 종양 세포에서 공동-발현되는 항원 B에 결합하는 T 세포에 의해 공동-발현된다. 항원 B를 인식하는 CAR은 하나 이상의 공동-자극 도메인, 예를 들어 CD28 또는 4-1BB를 함유한다. 동일한 세포에서의 항원 A 및 B를 인식하는 것에 의해서만 CAR T 세포는 활성화 임계값을 극복하고 완전하게 활성화되고, 즉, 사이토카인을 분비하고, 증식하고, 항원 A 및 B를 발현하는 세포를 용해한다.
대안적으로, 종양 세포의 이중-표적화를 위한 다른 기술은 하나 초과의 어댑터 특이성 (즉, 표면 활성화 매트릭스, SAM)을 사용하는 어댑터 CAR T 세포에 기초할 수 있다. 여기서, 그 자체 상의 각각의 단일 어댑터 분자는 어댑터 CAR T 세포 활성화를 야기하지 않고, 하나 초과의 어댑터 분자의 조합 사용만이 어댑터 CAR T 세포 활성화를 야기할 수 있다. 상세하게는, 어댑터 CAR T 세포는 태그된-어댑터 분자, 예를 들어 비오틴화된 항체 또는 FLAG-태그된 Fab 분자를 인식한다. 추가적으로, 어댑터 CAR은 활성화 신호 전달 도메인, 예를 들어 CD3zeta, 및 하나 이상의 공동-자극 도메인, 예를 들어 CD28 또는 4-1BB를 손상시킨다. 비오틴을 인식하는 어댑터 CAR T 세포가 CD326에 대해 유도되는 비오틴화된 항체에 결합하고 CD326을 발현하는 암 세포에 가교되는 경우, 어댑터 CAR T 세포는 활성화되고 CD326을 발현하는 종양 세포를 용해한다. 어댑터 CAR T 세포 활성화 및 표적 세포 용해는 존재하는 어댑터 분자의 용량에 좌우된다. 따라서, 어댑터 CAR T 세포의 활성은 용량-의존적이고 활성은 어댑터 분자 적정과 상관된다 (도 4). 어댑터 CAR T 세포는 완전한 활성화 및 세포용해 활성에 도달되기 위해 활성화 임계값을 극복하여야 한다. 표현 활성화 매트릭스 개념에서 두 원칙 (용량-의존적 및 활성화 임계값)이 조합된다. 암 세포 상의 상이한 마커를 표적화하는 2개 이상의 어댑터 분자는 - 그 자체로 - 최적 이하인 용량으로 사용되며, CAR T 세포의 활성화 임계값을 극복할 수 없다 (도 5). 그러나, 최적 이하의 용량으로의 다수의 어댑터 분자의 조합은 추가적인 효과를 갖고, 활성화 임계값을 극복하여 완전한 CAR T 세포 기능을 야기하고, 즉, 사이토카인을 분비하고, 증식하고, 각 마커를 발현하는 암 세포를 용해할 수 있다.
결과적으로, CD326 항원 및 CD90 항원의 동시적인 표적화와 조합하여 상술한 메커니즘 중 하나 이상을 이용하는 이중-표적화 CAR T 세포는 CAR T 세포의 특이성을 개선하고, 표적/종양 외 독성(on target/off-tumor toxicity)을 감소시킨다. 차별적인 CD90 및 CD326 발현을 갖는 표적 세포를 이용하는 경우 (도 6), 이 방법의 특이성이 평가되어 검증될 수 있다. 어댑터 CAR T 세포의 존재 하에 2개의 어댑터 분자와 함께 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 공동-표적화하는 상술한 상승작용 효과 (도 5)는 표적 세포가 표적 중 하나 단독 (CD90 발현의 결여: 도 7; CD326 발현의 결여: 도 8)만을 발현하거나 표적 중 어느 것도 발현하지 못할 때 상실된다 (도 9).
실시예 3: 조합이 난소암 (OvCa) 세포와 비-OvCa 세포 간을 구별할 수 있게 하는 형광 모이어티 및 항원 인식 모이어티를 포함하는 접합체의 조합의 식별 및 검증
건강한 조직에서의 CD90 및 CD326의 발현을 검증하기 위해, 순환 면역형광 현미경을 수행하였다. 신선하게-동결된 건강한 조직 (유방, 소뇌, 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 수질(medulla), 연수(oblongata), 난소, 췌장, 뇌하수체, 골격근, 피부, 평활근, 고환, 및 갑상선)뿐만 아니라 고-등급 장액성 난소 암종을 절편하고 아세톤으로 고정하였다.
개개의 생물학적 샘플의 완전하게 자동화된 순환 형광 이미징을 가능하게 하는 새로운 고 컨텐츠 영상화 플랫폼을 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 형광 모이어티에 접합된 다수의 항원 인식 모이어티로의 건강한 조직 및 OvCa 시편의 순차적 염색은 CD90와 조합하여 인간 상피 조직 및 암종에 대한 잘 알려진 마커인 EpCAM (CD326)의 공동-발현을 나타내었고, 환자의 하위세트에서 검증되었다 (도 10).
CAR T 세포 요법의 종양 표적 외 세포독성, 즉, CAR T 세포가 생리학적 조건하에 CAR 표적을 발현하는 비-종양 세포에 결합하고 이를 용해하는 것은 여러 CAR T 세포 생성물에 대해 기재되었기 때문에 표적 발현은 건강한 조직에서 분석되어야 한다. 이미지는 세포 분할을 기반으로 분할되었으며 CD90 및 CD326의 발현이 정량화되었다 (도 11). CD90 및 CD326의 발현은 건강한 조직을 분석하였고 (도 11a), CD90 및 CD326의 상승된 발현은 난소암 샘플에서만 검출되었다 (도 11b).
따라서, CD326 및 CD90의 조합은 OvCa의 이중-표적화 CAR T 세포 치료의 가능성을 열어준다. CD326 및 CD90은 OvCa 세포의 하위세트에서 공동 발현되지만 건강한 조직에서는 그렇지 않거나 덜하다. 따라서, CD326 및 CD90의 공동-검출에 의해 활성화되지만 2개의 마커 중 하나의 부재 하에 활성화되지 않는 CAR T 세포를 사용하는 것은 영향을 미치지 않는 건강한 세포를 남겨두는 OvCa 세포의 효율적인 사멸을 야기하고, 그 이유는 CD326 또는 CD90이 발현되지 않고, 즉, CD90 및 CD326은 동일한 (건강한) 세포에 대해 공동-발현되지 않기 때문이다.
실시예 4: 조합이 난소암 (OvCa) 세포와 비-OvCa 세포 간을 구별할 수 있게 하는 항원 인식 모이어티의 조합의 사용
CAR T 세포 요법의 종양 표적 외 독성을 방지하기 위해, 여러 기술적 해법을 이용하여 CAR T 세포 특이성을 증가시킬 수 있다. 하나의 선택사항은 이중-표적화 CAR의 사용이고, 즉, T 세포 활성화는 CAR T 세포에 의해 복수의 마커를 인식하여 결정되는 임계값을 극복함으로써 달성된다. AND CAR에서 CAR T 세포는 항원 결합 모이어티, 힌지, 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인으로 구성된 2개의 독립적인 CAR 작제물을 공동-발현한다. 별개의 에피토프를 인식하는 하나의 CAR은 활성화 신호 (신호1)를 전달하고, 이는 - 그 자체로는 - CAR T 세포의 활성화 임계값을 극복하는 데 불충분하다. 추가적으로, 다른 에피토프를 인식하는 제2 CAR은 - 제1 CAR과의 조합에서만 - T 세포를 완전하게 활성화하기 위해 활성화 임계값을 극복하도록 제1 CAR과 상승작용되는 공동자극 도메인 (신호2)를 운반한다.
AND CAR T 세포는 하나의 종양-관련 항원 A를 인식하는 제1 CAR로 구성된다. 제1 CAR은 활성화 세포내 도메인, 예를 들어 CD3zeta를 사용한다. 세포 상의 항원 A에 대한 CAR T 세포의 결합시 CAR T 세포는 활성화 임계값을 극복할 수 없다. 활성화 임계값을 극복하기 위해, 제2 CAR은 항원 A-발현 종양 세포에서 공동-발현되는 항원 B에 결합하는 T 세포에 의해 공동-발현된다. 항원 B를 인식하는 CAR은 하나 이상의 공동-자극 도메인, 예를 들어 CD28 또는 4-1BB를 함유한다. 동일한 세포에서의 항원 A 및 B를 인식하는 것에 의해서만 CAR T 세포는 활성화 임계값을 극복하고 완전하게 활성화되고, 즉, 사이토카인을 분비하고, 증식하고, 항원 A 및 B를 발현하는 세포를 용해한다.
대안적으로, 종양 세포의 이중-표적화를 위한 다른 기술은 하나 초과의 어댑터 특이성 (즉, 표면 활성화 매트릭스, SAM)을 사용하는 어댑터 CAR T 세포에 기초할 수 있다. 여기서, 그 자체 상의 각각의 단일 어댑터 분자는 어댑터 CAR T 세포 활성화를 야기하지 않고, 하나 초과의 항체의 조합 사용만이 어댑터 CAR T 세포 활성화를 야기할 수 있다. 상세하게는, 어댑터 CAR T 세포는 태그된-어댑터 분자, 예를 들어 비오틴화된 항체 또는 FLAG-태그된 Fab 분자를 인식한다. 추가적으로, 어댑터 CAR은 활성화 신호 전달 도메인, 예를 들어 CD3zeta, 및 하나 이상의 공동-자극 도메인, 예를 들어 CD28 또는 4-1BB를 손상시킨다. 비오틴을 인식하는 어댑터 CAR T 세포가 CD326에 대해 유도되는 비오틴화된 항체에 결합하고 CD326을 발현하는 암 세포에 가교되는 경우, 어댑터 CAR T 세포는 활성화되고 CD326을 발현하는 종양 세포를 용해한다. 어댑터 CAR T 세포 활성화 및 표적 세포 용해는 존재하는 어댑터 분자의 용량에 좌우된다.
따라서, 어댑터 CAR T 세포의 활성은 용량-의존적이고, 활성은 어댑터 분자 적정, 즉, 모노-비오틴화된 Fab 분자와 상관된다 (도 12-20). 어댑터 CAR T 세포는 완전한 활성화 및 세포용해 활성에 도달하기 위해 활성화 임계값을 극복하여야 한다. 표면 활성화 매트릭스 개념에서 두 원칙 (용량-의존성 및 활성화 임계값)이 조합된다. 암 세포 상의 상이한 마커를 표적화하는 2개 이상의 어댑터 분자는 - 그 자체로 - 최적 이하인 용량으로 사용되며, CAR T 세포의 활성화 임계값을 극복할 수 없다 (도 12-20). 그러나, 최적 이하의 용량으로의 다수의 어댑터의 조합은 추가적인 효과를 갖고, 활성화 임계값을 극복하여 완전한 CAR T 세포 기능을 야기하고, 즉, 사이토카인을 분비하고, 증식하고, 각 마커를 발현하는 암 세포를 용해할 수 있다.
결과적으로, CD326 항원 및 CD90 항원의 동시적인 표적화와 조합하여 상술한 메커니즘 중 하나 이상을 이용하는 이중-표적화 CAR T 세포는 CAR T 세포의 특이성을 개선하고, 표적/종양 외 독성을 감소시킨다.
차별적인 CD90 및 CD326 발현을 갖는 표적 세포에 대해 모노비오틴화된 항-CD90 Fab, 항-CD326 Fab 및 두 Fab의 조합의 농도 (5 ng/ml (도 12), 1 ng/ml (도 13), 0,75 ng/ml (도 14), 0,5 ng/ml (도 15), 0,25 ng/ml (도 16), 0,1 ng/ml (도 17), 0,05 ng/ml (도 18), 0,025 ng/ml (도 19), 0,01 ng/ml (도 20))를 적정할 때, 이 방법의 표적 특이성뿐만 아니라 활성화 임계값을 평가하여 검증할 수 있다. 암 세포 사멸에 대한 상승작용 효과는 0,25 ng/ml (도 16) 내지 0,025 ng/ml (도 19) 범위 내의 농도로 검출된다.
어댑터 CAR T 세포의 존재 하에 2개의 어댑터 분자와 함께 CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 공동-표적화하는 상술한 상승작용 효과는 표적 세포가 표적 중 하나 단독만이 발현되는 경우에 상실된다 (도 12-20).
암 세포 사멸에 대한 상승작용 효과는 사이토카인 분비 (GM-CSF, IFN-감마; 도 14, 도 15)뿐만 아니라 CAR T 세포에 의해 발현되는 활성화 (CD25, PD-1) 및 소진 (CD223) 마커에 의해 보충된다 (도 17, 도 18).
또한, 항-CD90 Fab의 일정 농도에 대한 항-CD326 Fab의 적정 (도 21) 또는 항-CD326 Fab의 일정 농도에 대한 항-CD90 Fab의 적정 (도 22)은 전체 암 세포 사멸 효능에 대한 항-CD90 Fab 농도의 영향을 보여준다. 항-CD90 Fab의 이러한 효과는 사이토카인 분비 (도 25)뿐만 아니라 CAR T 세포에 의해 발현되는 활성화 (도 28, 도 30 I-P) 및 소진 (도 29, 도 30 A-H) 마커에 의해 확인되었다.
참조문헌
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<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD90 VL
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Gly Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Lys
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Arg
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<210> 2
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<213> Artificial sequence
<220>
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Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
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Ser Arg Gly Ile Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
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115
Claims (9)
- CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 인간 암의 치료에 사용하기 위한,
a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인,
b) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인
을 포함하는 조합. - 제1항에 있어서, CD90 및 CD326을 공동-발현하는 암 세포를 포함하는 상기 인간 암은 인간 난소암인 조합.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합은
a) CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제1 폴리펩티드,
b) CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 태그된 제2 폴리펩티드,
c) CAR을 포함하는 면역 세포로서, CAR은
i) 제1 및 제2 폴리펩티드의 상기 태그에 대해 특이적인 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 1차 신호전달 도메인 및 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 면역 세포
를 포함하고,
제1 폴리펩티드의 태그와 제2 폴리펩티드의 태그는 동일한 것인 조합. - 제3항에 있어서, 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 여기서 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 낮고, 여기서 태그된 제1 폴리펩티드 및 태그된 제2 폴리펩티드의 조합된 농도는 상기 면역 세포에서 발현되는 상기 CAR의 활성화 임계값보다 높은 것인 조합.
- 제4항에 있어서, 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 농도는 CAR이 유일하게 상기 태그된 제1 폴리펩티드에 의해서만, 즉, 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 존재 없이 활성화되는 경우에 필요로 되는 농도보다 적어도 10% 낮고, 여기서 상기 태그된 제2 폴리펩티드의 농도는 CAR이 유일하게 상기 태그된 제2 폴리펩티드에 의해서만, 즉, 상기 태그된 제1 폴리펩티드의 존재 없이 활성화되는 경우에 필요로 되는 농도보다 적어도 10% 낮은 것인 조합.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD326에 대해 특이적인 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 CD90 및 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 되는 것인 조합. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 상기 태그된 폴리펩티드가 CD90에 특이적으로 결합하는 경우에 CD326에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인, 또는 상기 태그된 폴리펩티드가 CD326에 특이적으로 결합하는 경우에 CD90에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 되고,
상기 조합은 상기 태그된 폴리펩티드를 포함하는 조합. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 태그된 폴리펩티드의 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD90에 대해 특이적인 경우에 상기 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 제1 CAR의 제1 항원 결합 도메인이 CD326에 대해 특이적인 경우에 상기 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인이 상기 CD90 또는 CD326에 의해 활성화되고 상기 제2 신호전달 도메인이 상기 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 되고,
상기 조합은 상기 태그된 폴리펩티드를 포함하는 조합. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합은 제1 CAR 및 제2 CAR을 포함하는 면역 세포를 포함하고,
제1 CAR은
i) 제1 태그된 폴리펩티드의 제1 태그에 대해 특이적인 제1 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 CD90 또는 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제1 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제1 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 1차 신호전달 도메인이고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함하지 않는 것인 제1 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
제2 CAR은
i) 제2 태그된 폴리펩티드의 제2 태그에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 여기서 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD90에 특이적으로 결합하는 경우에 상기 제2 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인, 또는 제2 태그된 폴리펩티드에 대해 특이적인 제2 항원 결합 도메인으로서, 상기 상기 제1 태그된 폴리펩티드가 CD326에 대해 특이적으로 결합하는 경우에 제2 폴리펩티드가 CD90에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 제2 항원 결합 도메인,
ii) 막횡단 도메인,
iii) 제2 세포내 신호전달 도메인으로서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인
을 포함하고,
여기서 상기 면역 세포는 상기 제1 신호전달 도메인 및 상기 제2 신호전달 도메인이 둘 모두 각각 상기 제1 태그 및 상기 제2 태그에 의해 활성화되는 경우에만 최대로 세포독성이게 되고,
상기 조합은 상기 제1 태그된 폴리펩티드 및 상기 제2 태그된 폴리펩티드를 포함하는 조합.
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