CN118234751A - 免疫反应性分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY‑BR‑1)的免疫反应性分子，并且具体地涉及对其他的人含锚蛋白重复结构域的蛋白质没有显示出交叉反应性的免疫反应性分子。本发明还涉及此类免疫反应性分子在癌症治疗以及伴随诊断方法中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1)的免疫反应性分子，并且具体地涉及与其他的人含锚蛋白重复结构域的蛋白质没有显示出交叉反应性的免疫反应性分子。本发明还涉及此类免疫反应性分子在癌症治疗以及伴随诊断方法中的用途，并且将在下文中参考这些应用进行描述。然而，应当理解，本发明不限于该具体使用领域。
背景技术
整个说明书中对背景技术的任何讨论决不应被视为承认此类技术是广泛已知的或构成本领域公知常识的一部分。
在癌症疗法的背景下，免疫疗法通常旨在引发针对肿瘤细胞的免疫应答。免疫反应性分子，即特异性识别并结合肿瘤细胞抗原的靶序列或表位的分子，是启动免疫应答所必需的，因此构成癌症治疗中免疫治疗方法的不可或缺的工具。免疫反应性分子，如针对肿瘤特异性抗原(即“癌症抗原”；下文也称为“肿瘤相关抗原”或“癌症相关抗原”)的单克隆抗体，已成为许多癌症治疗方案的一部分。例如，单克隆抗体曲妥珠单抗被批准用于治疗乳腺癌和胃癌，因为它专门针对HER2受体的表位。然而，除了针对癌症抗原的“常规”抗体之外，几种不同形式的免疫反应性分子已被基因工程化，这允许利用其靶标特异性来引发免疫应答。例如，嵌合抗原受体(CAR)分子构成了这种替代形式，因为它们是融合蛋白，该蛋白将抗体衍生的抗原识别结构域至少与T细胞激活结构域以及通常的跨膜结构域相结合。这允许离体生产源自患者但基因工程化的T细胞，其携带CAR，该CAR的抗原识别结构域位于细胞外空间，而T细胞激活结构域位于细胞内，该细胞再次充当患者特异性、肿瘤-特异性且基因工程化细胞抗癌剂。使用此类细胞抗癌药物的细胞免疫疗法通过将工程化T细胞回输到患者体内，为癌症患者(尤其是白血病患者)的治疗提供了新的选择。
自20世纪90年代首次描述这种方法以来，特别是自2011年取得临床成功以来，这种类型的免疫疗法已经明显优于标准治疗方法。全球范围内已登记了超过600项评估CAR T细胞的活跃I期和II期临床试验。几项已完成的研究报告称，儿童和成人急性淋巴母细胞白血病(ALL)的平均响应比率为80％。其中大多数包括持久的完全缓解。然而，就实体瘤治疗概念的应用而言，仅报道了少量的临床结果，并且可用的临床数据也相对较少。然而，在胶质母细胞瘤患者中已报道了初步成功。这种差异的主要原因可能是实体组织中肿瘤相关抗原的异质表达模式和/或健康组织上的最小靶抗原表达，导致肿瘤与健康组织之间的交叉反应性。如将理解的，CAR T细胞与健康组织的交叉反应性可能在临床环境中产生有害后果，因为CAR T细胞不区分健康细胞和肿瘤细胞。因此，健康细胞——即使仅微弱表达肿瘤相关抗原——也将同样成为目标。
NY-BR-1属于癌症睾丸抗原组，由于其天然限制的表达模式(即仅在睾丸中)，被认为特别适合作为NY-BR-1特异性CAR T细胞的靶标。然而，NY-BR-1也被鉴定为与乳腺癌相关(Theurillat等人，，NY-BR-1protein expression in breast carcinoma:a mammarygland differentiation antigen as target for cancer immunotherapy“CancerImmunol Immunother 2007Nov；56(11):1723-31)并鉴定为乳腺癌的基于抗体的疗法的潜在靶标(Seil等人“The differentiation antigen NY-BR-1is a potential target forantibody-based therapies in breast cancer“Int J Cancer 2007Jun 15；120(12):2635-42)。Seil等人2007年还发表了许多抗NY-BR-1抗体，其中表明“Clone2”特别有前途。Clone2是唯一市售的抗NY-BR-1抗体，并且常规用于已发表的研发工作。例如，Das等人2019中将Clone2描述为用于蛋白质印迹分析中检测NY-BR-1的一抗(Das等人“Atransplantable tumour model allowing investigation of NY-BR-1-specific T cellresponses in HLA-DRB1*0401transgenic mice”BMC Cancer 2019Sep 13；19(1):914)。通过表位分析，本发明人发现由Clone2抗体识别的特异性结合序列与NY-BR1.1及其同工型2——两个密切相关的蛋白质——的氨基酸序列几乎相同(仅单个氨基酸不同)。数据库和文献研究揭示，NY-BR1.1在健康脑组织中也有显著表达。因此，使用源自Clone2抗体的CAR构建体也存在在健康组织中识别NY-BR1.1及其同工型2的巨大风险，因此通常使此类构建体无法用于治疗乳腺癌患者。
本领域需要改进的靶向NY-BR-1的免疫反应性分子，例如用以增加癌症、特别是睾丸癌和乳腺癌治疗中的治疗选择。
本发明的一个目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或者提供一种有用的替代方案。具体地，本发明的一个目的是提供改进的靶向NY-BR-1的免疫反应性分子。
发明内容
如上所述，本发明旨在提供免疫反应性分子，其对人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKBQ 9BXX3)具有高度特异性，但重要的是，其与其他的人含锚蛋白重复结构域的蛋白质如人含锚蛋白重复结构域的蛋白30B(NY-BR-1.1；UniProtKB Q9BXX2)或其同工型2(NY-BR-1.1同工型2；UniProtKB Q9BXX2-2)没有显示出交叉反应性。
本发明的免疫反应性分子特别适用于新的癌症治疗方案以及NY-BR-1检测方法，如在患者癌症治疗期间作为伴随诊断(CDx)方法应用的NY-BR-1检测方法。
广义上，本公开涉及免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3；SEQ ID NO:42)，其特征在于该免疫反应性分子与人含锚蛋白重复结构域的蛋白30B(NY-BR-1.1；UniProtKBQ9BXX2；SEQ ID NO:43)或其同工型2(NY-BR-1.1同工型2；UniProtKB Q9BXX2-2；SEQ IDNO:44)没有显示出交叉反应性。优选地，免疫反应性分子特异性识别并结合至包含抗原肽序列AEPPEKPSA(SEQ ID NO:1)的NY-BR-1的表位。
具体地，在第一方面，本发明涉及一种免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3)，其特征在于该免疫反应性分子特异性识别并结合至包含SEQ ID NO:1的抗原肽序列的NY-BR-1的表位，并且其中所述免疫反应性分子具有包含SEQ ID NO:2至4的VL互补决定区(CDR)1至3和SEQ ID NO:5至7的VH CDR 1至3的抗原结合区。
在第二方面，本发明涉及第一方面的免疫反应性分子用于治疗癌症。
因此，本发明的该第二方面还涵盖治疗癌症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者施用第一方面的免疫反应性分子和/或第一方面的免疫反应性分子在制造用于治疗癌症的药物的用途。
类似地，该第二方面还涵盖第一方面的免疫反应性分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
通常，癌症的特征在于癌症相关抗原NY-BR-1的表达，诸如但不限于睾丸癌或乳腺癌。
在第三方面，本发明涉及第一方面的免疫反应性分子在检测样品中的NY-BR-1的方法中的用途，其中任选地，该样品是先前获得的并且/或者衍生自癌症患者，并且该方法是伴随诊断(CDx)方法。
优选地，该方法选自：免疫组织化学染色法；膜介导的蛋白质印迹法；和基于流式细胞术的方法，并且/或者其中该样品是组织样品、原代细胞样品或细胞系样品。
因此，在另一实施方案中，该第三方面也涵盖检测样品中的NY-BR-1的此类方法，其包括使用第一方面的免疫反应性分子。
附图说明
现在将参考附图仅通过示例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1根据实施例1中描述的实验，示出了使用浓度为5μg/mL的Clone2抗体或包含含有SEQ ID NO:12和14的鼠全长Clone3抗体的鼠Clone3杂交瘤上清液(ud＝未稀释，1:10-1:500稀释)、随后与次级藻红蛋白(PE)-缀合的抗小鼠FcγI亚类特异性抗体温育，对NY-BR-1和NY-BR-1.1转染的Bosc23细胞的流式细胞术分析的结果。
图2根据实施例2中描述的实验，示出了SEQ ID NO:46的单克隆杂交瘤上清液衍生的Clone3在用NY-BR-1的重叠13aa肽一式两份点样的微阵列上的1型作图结果。使用多克隆山羊抗小鼠IgG(H+L)缀合DyLight680抗体进行已结合的SEQ ID NO:46的上清液衍生的Clone3抗体的检测。
图3根据实施例3中描述的实验，示出了使用SEQ ID NO:18的Clone3衍生的scFv-人IgG1-Fc融合蛋白或相应的Clone2衍生的scFv-人IgG1-Fc融合蛋白、随后与次级藻红蛋白(PE)-缀合的抗人Fcγ片段特异性抗体一起温育，对NY-BR-1和NY-BR-1.1转染的Bosc23细胞的流式细胞术分析的结果。
图4根据实施例4中描述的实验，示出了对SEQ ID NO:28的Clone3 CAR呈阳性的T细胞和对Clone2 CAR呈阳性的T细胞在NY-BR-1和NY-BR-1.1涂覆板中培养24小时的细胞培养上清液的人IFNγELISA结果。实验一式三份进行，误差线显示SEM。
图5根据实施例5中描述的实验，示出了表达CAR的Jurkat细胞的脱颗粒测定的结果。将稳定表达Clone3 CAR(SEQ ID NO:28)或相应的Clone2衍生的CAR的Jurkat细胞与NY-BR-1和NY-BR-1.1转染的Bosc23细胞以1:1的比例共培养24小时。通过细胞内流式细胞术分析测定脱粒标志物CD107a的表达。给出了平均荧光强度。
图6根据实施例6中描述的实验，示出了在同种异体设定中由NY-BR-1特异性CAR+T细胞对表达NY-BR-1的胸腔积液细胞的基于xCELLigence的杀伤测定的结果。原代T细胞分离自健康供体，用编码Clone3 CAR表达盒(SEQ ID NO:29)或相应的Clone2衍生的CAR表达盒的DNA质粒载体进行电穿孔，并与原代胸腔积液细胞以1:1的比例共培养。未转染的(模拟)T细胞作为对照。通过测量细胞阻抗(xCELLigence，ACEA Biosystems Inc.)实时监测靶细胞活力。实验一式三份进行，误差线显示SEM。
图7根据实施例6中描述的实验，示出了与同种异体胸腔积液细胞共培养的NY-BR-1特异性CAR+T细胞的人IFNγELISA结果。使用IFNγELISA检测试剂盒对xCELLigence杀伤测定的细胞培养上清液进行的终点分析如图6所示。实验一式三份进行(平均值±s.e.m.；*，p<0.05；配对单尾学生t检验)。
图8根据实施例7中描述的实验，示出了同种异体移植小鼠模型中鼠CAR+T细胞的抗肿瘤效率。用未转染的(模拟)T细胞或CAR+T细胞治疗移植有NY-BR-1+Bosc23衍生的皮下肿瘤的NOD.CB17-Prkdcscid小鼠。除对照(n＝9)外，每组由七只小鼠组成。每三到四天测量一次肿瘤大小。显示了平均肿瘤体积(平均值±s.e.m.；*，p<0.05；***，p<0.001；使用Bonferroni后检验进行双向方差分析，用于与模拟组进行比较)。相应的存活率以卡普兰-迈耶生存曲线表示。通过使用Log-rank(Mantel-Cox)检验将存活率与对照组进行比较(*，p<0.05；**，p<0.01；***≤0.001)。
图9根据实施例8中描述的实验，示出了人CAR+T细胞在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效率。用未转染的(模拟)T细胞或CAR+T细胞治疗移植有NY-BR-1+EO771衍生的皮下肿瘤的NSG小鼠。每组由七只小鼠组成。每三到四天测量一次肿瘤大小。给出了平均肿瘤体积(平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；使用Bonferroni后检验进行双向方差分析，用于与模拟组进行比较)。相应的存活率以卡普兰-迈耶生存曲线表示。
图10示意性地示出了实施例9中使用的(scFv-Fc-scFv)2形式的双特异性单克隆抗体(BiMAb)的架构。
图11是根据实施例9中描述的实验，表达NY-BR-1的胸腔积液肿瘤细胞的肿瘤球体与纯化的未刺激的自体外周血单核细胞(PBMC)和根据本发明的双特异性分子组合共培养。具体来说，使用10nMαTAA-αCD3+/-αTAA-αCD28 BiMAb的组合。肿瘤相关抗原(TAA)反应性包括NY-BR-1(Clone3)、HER2、EGFR和CEA。温育48小时后通过流式细胞术分析(A)表达CD25+/OX40+的CD4+T细胞频率和(B)表达CD25+/4-1BB+的CD8+T细胞频率。(C)共培养48小时后收集上清液，并通过LDH释放测定评估肿瘤细胞裂解。(D)将CellTraceTM紫罗兰(CTV)标记的PBMC用于共培养，并在温育5天后，通过基于CTV稀释的流式细胞术测量CD4+和CD8+T细胞增殖。显示的图形≤2个；数据为平均值±s.e.m.(A-C)或±s.d.(D)。
具体实施方式
为了提供对说明书和权利要求书以及这些术语的范围的清晰一致的理解，提供以下定义。
在本申请的上下文中，术语“免疫反应性分子”是指特异性识别并结合抗原的靶序列或表位的多肽分子，即依靠常规免疫球蛋白(Ig)形式分子(即IgG、IgD、IgE、IgA和/或IgM)中已知的靶标/表位识别的Ig概念，通过特异性识别并结合至该靶序列或表位而与抗原的靶序列或表位反应的分子。因此，在具体实施方案中，免疫反应性分子可以至少包含足以赋予靶标/表位特异性的Ig的互补决定区(CDR)，并且在一些情况下，免疫反应性分子可以包含Ig的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列两者以赋予靶标/表位特异性。在一些实施方案中，免疫反应性分子可以是Ig本身，如IgG。
然而，这并不意味着本发明的免疫反应性分子必须仍然是该Ig形式。相反，免疫反应性分子可以是Ig片段或其衍生物，例如单链可变片段(scFv)或抗原结合片段(Fab-通过木瓜蛋白酶裂解IgG获得；F(ab’)-通过胃蛋白酶裂解IgG获得；和/或F(ab’)2-获得IgG的胃蛋白酶裂解和随后的β-巯基乙醇处理；等)。同样，本发明的免疫反应性分子可以是新的抗体形式，例如但不限于双特异性或三特异性抗体构建体、双抗体、骆驼抗体、域抗体、纳米抗体、具有两条由scFv组成的链的二价同二聚体、鲨鱼抗体、由新世界灵长类框架加非新世界灵长类CDR组成的抗体、包含CH3+VL+VH的二聚化构建体，或抗体缀合物(例如，以及与毒素、细胞因子、放射性同位素或标记连接的抗体或其片段或衍生物)。
本发明的免疫反应性分子的另一种形式是嵌合抗原受体(CAR)形式。在这种形式中，本发明的免疫反应性分子是包含抗体衍生的抗原识别结构域和至少T细胞激活结构域的融合多肽。通常，在这种形式中，嵌合抗原受体还包含跨膜结构域，使得当排列在转导的T细胞表面上时，CAR的抗原识别结构域位于细胞外空间，而其T细胞激活结构域位于细胞内。
本发明的免疫反应性分子的另一种形式是双特异性分子的形式。双特异性分子，如双特异性单克隆抗体(BiMAb)，不仅包含识别并结合至第一抗原的特定表位的抗原结合序列，而且还包含识别并结合至不同的第二抗原的特定表位的抗原结合序列。在本发明的实施方案中，当免疫反应性分子是双特异性分子时，第一抗原通常是癌抗原并且第二抗原是“免疫效应细胞表面抗原”，即存在于免疫效应细胞如自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面上的抗原。不想受理论束缚，通过其对第一抗原(即，癌抗原)的表位的特异性，双特异性分子赋予针对通过其对第二抗原(即，免疫效应细胞表面抗原)的表位的特异性来靶向的免疫效应细胞的人工特异性。即，本发明的双特异性分子能够将免疫效应细胞特异性募集至表达癌抗原的肿瘤细胞。如将理解的，本发明的双特异性分子一方面与肿瘤细胞的结合和另一方面与待募集的免疫效应细胞的结合可以以任何顺序发生或也可以同时发生。
具体地，本发明的BiMAb可以以众所周知的(scFv-Fc-scFv)2形式构建，例如如图10所示，诸如以原位形成功能性免疫突触。此类功能性(scFv-Fc-scFv)2BiMAb可包含SEQID NO:46的抗NY-BR-1Clone3抗体的单链可变片段(scFv)，其特异性识别并结合至NY-BR-1的表位，该NY-BR-1包含抗原肽序列AEPPEKPSA(SEQ ID NO:1)，该单链可变片段通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头(GSL)连接至含有aglycan突变N297Q以消除FcgRIII受体结合的人IgG1的铰链和CH2-CH3结构域。IgG1 CH3结构域通常跟随着用于亲和纯化的双II和识别人CD3ε或人CD28的scFv抗体。SEQ ID NO:38公开了在下述实施例9的实验中使用的抗NY-BR-1Clone3和抗人CD3εBiMAb的完整氨基酸序列(由SEQ ID NO:39编码)。类似地，SEQ ID NO:40公开了在下述实施例9的实验中使用的抗NY-BR-1Clone3和抗人CD28 BiMAb的完整氨基酸序列(由SEQ ID NO:41编码)。
在本说明书的上下文中，免疫反应性分子是包含抗原结合序列的所有多肽分子，使得免疫反应性分子至少识别并结合至包含抗原肽序列AEPPEKPSA(SEQ ID NO:1)的NY-BR-1的表位。
技术人员知道如何翻译给定的抗体，该抗体仍然是常规的Ig形式并且已证明其对给定的靶标具有特异性，如SEQ ID NO:46的抗NY-BR-1Clone3抗体，其特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3；SEQ ID NO:42)，翻译成其片段或衍生物(如上文描述的那些)或翻译成新抗体或嵌合抗原受体形式(如上文也描述的那些)以获得本发明的免疫反应性分子。
具体地，本发明的免疫反应性分子是包含针对人NY-BR-1的表位的免疫球蛋白抗原结合序列的多肽分子，使得免疫反应性分子特异性识别并结合至人NY-BR-1。
在本文中，短语“特异性识别并结合至”是指免疫反应性分子不表现出与其他抗原的表位的交叉反应性。
具体地，特异性识别并结合至人NY-BR-1的本发明的免疫反应性分子不表现出与NY-BR-1的人同工型如人含锚蛋白重复结构域的蛋白30B(NY-BR-1.1；UniProtKB Q9BXX2；SEQ ID NO:43)或其同工型2(NY-BR-1.1同工型2；UniProtKB Q9BXX2-2；SEQ ID NO:44)的交叉反应性。这要求免疫反应性分子所针对的表位在序列和/或构象上是独特的。优选地，免疫反应性分子特异性识别并结合至包含抗原肽序列AEPPEKPSA(SEQ ID NO:1)的NY-BR-1的表位。如果本发明的免疫反应性分子是双特异性分子，则其不仅能够特异性识别并结合至单一抗原的表位，而且还能够特异性识别和结合至第二抗原的表位。例如，本发明的双特异性分子可以特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKBQ9BXX3)和免疫效应细胞表面抗原，诸如选自CD3、CD28、4-1BB、OX40、CD16、NKG2D、NKp46/NCR1和NKp30/NCR3的抗原的那些。
除非另外具体指出，在本说明书的上下文中，特异性识别并结合至NY-BR-1的免疫反应性分子，特别是本发明的免疫反应性分子，可以包含在较大的结构中，例如，可以共价或非共价连接至载体分子、阻滞剂和其他赋形剂。例如，本发明的免疫反应性分子可以连接至可用于纯化人NY-BR-1的亲和层析方法的层析材料/树脂。替代地或另外地，免疫反应性分子可以是如上所述的多肽，其包含在与一种或多种其他肽的融合多肽中，单独地或组合地用作例如用于检测和/或纯化的标签、接头或间隔子、跨膜结构域、胞质内结构域、信号和/或转运序列或用于延长免疫反应性分子的体内半衰期。
术语“可检测标签”是指添加到或引入到此类融合多肽中的一段氨基酸。优选地，可检测标签被添加至免疫反应性分子或包含其的融合多肽的C-或N-末端。该氨基酸段优选地允许通过特异性识别并结合至标签的抗体检测免疫反应性分子或包含其的融合多肽，或者该氨基酸段优选地允许可视化，例如，在荧光标签的情况下。如果本发明的免疫反应性分子用于伴随诊断(CDx)，则可检测标签特别有用，因为检测、鉴定和/或可视化特别重要。优选的标签是Myc标签、FLAG标签、His标签、HA标签、GST标签、Strep标签或荧光蛋白标签，例如EGFP或EYFP标签。这些标签是本领域公知的并且被技术人员常规使用。其他融合多肽可包含与氨基酸或其他修饰融合或相融的免疫反应性分子，其充当分泌介质、血脑屏障通过的介质、作为细胞穿透肽和/或免疫刺激剂。
“人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1)”——指在www.uniprot.org上可免费访问的数据库UniProt中被指定标识符“UniProtKB Q9BXX3”的SEQ ID NO:42的人蛋白。
“交叉反应性”——指针对一种特定抗原靶向的免疫反应性分子至少识别具有相似结构区域的第二种抗原，如靶向抗原的同工型或与靶向抗原共享相似结构域的蛋白质。因此，短语“不显示交叉反应性”指免疫反应性分子不识别任何其他抗原。通常，只有当免疫反应性分子对靶向抗原的独特表位具有特异性时，这才可以实现。
“人含锚蛋白重复结构域的蛋白30B(NY-BR-1.1)”——指在www.uniprot.org上可免费访问的数据库UniProt中被指定标识符“UniProtKB Q9BXX2”的SEQ ID NO:43的人蛋白。
“人含锚蛋白重复结构域的蛋白30B同工型2(NY-BR-1.1同工型2)”——指在www.uniprot.org上可免费访问的数据库UniProt中被指定标识符“UniProtKB Q9BXX2-2”的SEQ ID NO:44的人蛋白。
短语“特征在于表达癌症相关抗原NY-BR-1的癌症”指以异常细胞发展为特征的恶性疾病，该异常细胞不受控制地分裂并具有浸润和破坏正常身体组织的能力(癌症)，其中大多数癌细胞表达人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1)。此类表达可以例如通过对癌细胞进行逆转录酶-聚合酶链式反应分析或通过使用特异性识别NY-BR-1的免疫反应性分子进行检测来证明。
术语“伴随诊断(CDx)方法”指适合提供对于安全有效使用相应药物或生物治疗产品所必需的信息的方法。
CDx方法帮助医疗保健专业人员确定相应药物或治疗产品对患者的特殊益处是否会超过任何潜在的严重副作用或风险。因此，CDx方法可以：
·确定最有可能从特定药物或治疗产品受益的患者；
·确定因接受特定药物或治疗产品治疗而可能面临严重副作用风险增加的患者；或者
·监测对用特定药物或治疗产品治疗的应答，以便调整治疗以提高安全性或有效性。
除了上述定义之外，并且除非上下文另有明确要求，在整个说明书和权利要求书中，本文所使用的术语将被赋予其普通的简单英语含义。如本文所使用的，词语“包括”、“包含”、“具有”等应被解释为包含性含义，而不是排他性或穷举性含义；也就是说，“包括但不限于”。
此外，在整个说明书中提及术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“最特别地”、“具体地”、“更具体地”、“典型地”、“通常”、“一般”或类似术语与任选特征结合使用，而不限制其他和/或进一步的特征。因此，由这些或类似术语引入的特征并不旨在限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以使用替代特征来执行。
类似地，整个说明书中对“一个实施方案”、“一些实施方案”或“一实施方案”的提及指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”、“在一些实施方案中”或“在一实施方案中”不一定都指代相同的实施方案，而是可以指代相同的实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，如本领域普通技术人员根据本公开将显而易见的，可以以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。
如本文所使用的，除非另外指定，否则使用序数形容词“第一”、“第二”、“第三”等是来描述共同对象仅指示所指的是相似对象的不同实例，而不是指代相似对象的不同实例，并且不旨在暗示如此描述的对象必须处于给定的顺序，无论是时间上的、空间上的、排序的还是任何其他方式的。
如本文所使用的，术语“示例性”在提供示例的意义上使用，而不是指示质量。即，“示例性实施方案”是作为示例提供的实施方案，而不是必须是示例性质量的实施方案。
两个生物序列优选DNA、RNA或氨基酸序列之间的“同一性程度”(例如，表示为“％同一性”)可以通过本领域公知的算法来确定。优选地，通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定同一性程度，其中与用于获得最佳对齐的序列相比，比较窗口中的序列片段可以包含添加和/或缺失(例如缺口、插入和/或突出端)。百分比通过以下方式计算：(a)优选在多核苷酸或多肽序列的全长上确定两个序列中出现相同残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，(b)将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数，并且(c)将结果乘以100以获得序列同一性的百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过本领域技术人员已知的可接受的方法进行，如通过Smith和Waterman(1981)的局部同源算法、通过Needleman和Wunsch(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现方式(例如GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、TFASTA等)或通过目视检查。鉴于已确定出两个序列用于比较，优选地采用GAP和BESTFIT来确定它们的最佳比对，从而确定它们的同一性程度。优选地，使用空位权重的默认值5.00和空位权重长度的默认值0.30。
在本文提及的生物序列的上下文中，术语“基本上相同”表示至少80％、优选至少90％、更优选至少98％、最优选99％的％同一性。如将理解的，术语“基本上相同”包括100％序列同一性。上述内容比照适用于术语“基本上互补”。
整个说明书中所使用的术语生物大分子、优选多核苷酸或多肽的“片段”应在广义上理解，即涉及包括指定的序列、结构和/或功能的各个大分子的任何子部分、优选子结构域。因此，该术语包括由生物大分子的实际断裂产生的子部分，而且还包括以抽象方式衍生自相应大分子的子部分，例如，在计算机中。因此，免疫反应性分子如免疫球蛋白的片段包括Fc或Fab片段以及例如单链抗体、双特异性抗体和纳米抗体。
本发明的免疫反应性分子
如上所述，在第一方面，本发明涉及免疫反应性分子，其特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3；SEQ ID NO:42)。然而，除了先前已知的NY-BR-1免疫反应性抗体之外，本发明的免疫反应性分子对人含锚蛋白重复结构域的蛋白30B(NY-BR-1.1；UniProtKB Q9BXX2；SEQ ID NO:43)或其同工型2(NY-BR-1.1同工型2；UniProtKB Q9BXX2-2；SEQ ID NO:44)没有显示出交叉反应性。高度的靶特异性以及缺少交叉反应性使得本发明的免疫反应性分子特别适合用于治疗NY-BR-1阳性癌症，原因在于对表达NY-BR-1或其同工型2的健康组织的不期望的靶向得以避免。
最有前途的先前已知的NY-BR-1抗体，即“Clone2”(Seil等人，2007)，不仅识别并结合至NY-BR-1，而且意外地还识别并结合至密切相关的NY-BR-1.1和NY-BR-1.1同工型2。具体地，Clone2的表位特异性的回顾性分析揭示了Clone2识别并结合至包含SEQ ID NO:45的抗原肽序列的NY-BR-1的表位。然而，NY-BR-1.1和NY-BR-1.1同工型2中也存在几乎相同的序列(仅具有单个氨基酸差异)。相反，本发明的免疫反应性分子特异性识别并结合至包含SEQ ID NO:1的抗原肽序列的NY-BR-1的表位，其中在NY-BR-1.1和NY-BR-1.1同工型2中不存在相同或接近相同的序列。重要的是，另一个显著特征是，虽然为NY-BR-1所特有，但SEQ ID NO:1的9个氨基酸长的抗原结合序列在NY-BR-1的核心区域中出现不仅一次，而且可出现两次。不想受理论束缚，这可以允许本发明的两种免疫反应性分子同时或甚至顺序地识别并结合至NY-BR-1，并且增加发挥所需效果的可能性。此外，NY-BR-1内表位的重复增加了肿瘤细胞所呈递的NY-BR-1的剪接变体或以其他方式修饰或截短的变体仍然含有至少一个表位的可能性，使得这些细胞仍然是对于本发明的免疫反应性分子的靶标。
在优选的实施方案中，免疫反应性分子具有包含小鼠可变轻链(VL)序列和小鼠可变重链(VH)序列的抗原结合区，该小鼠可变轻链序列分别包括SEQ ID NO:2至4的互补决定区(CDR)1至3，该小鼠可变重链序列分别包括SEQ ID NO:5至7的相应CDR 1至3。例如，VL和VH序列是SEQ ID NO:8(由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码)和SEQ ID NO:10(由SEQ ID NO:11的核苷酸序列编码)。
如图和实施例所示，包含这些特定VL和VH序列的免疫反应性分子不与NY-BR-1.1或NY-BR-1.1同工型2交叉反应。
如上所述，即使当包含小鼠VL和VH序列时，免疫反应性分子也不限于小鼠抗体本身，但是——虽然它可以是单克隆小鼠抗体——但它也可以是包含此类小鼠VL和VH序列的单链可变片段-片段可结晶区(scFv-Fc)融合蛋白、嵌合抗原受体(CAR)或双特异性分子。
在特定实施方案中，免疫反应性分子仍然可以是全长单克隆小鼠IgG，优选全长单克隆小鼠IgG1，其中所述全长单克隆小鼠IgG1优选包含SEQ ID NO:12(由SEQ ID NO:13的核苷酸序列编码)和SEQ ID NO:14(由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码)。在一些实施方案中，免疫反应性分子可以是SEQ ID NO:46的全长单克隆小鼠IgG。
替代地，免疫反应性分子可以是单链可变片段-片段可结晶区(scFv-Fc)融合蛋白，其包含小鼠或人IgG1 Fc结构域、SEQ ID NO:16(由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO:18(由SEQ ID NO:19的核苷酸序列编码)。
在免疫反应性分子是嵌合抗原受体(CAR)的实施方案中，CAR具有抗原识别结构域，其包含SEQ ID NO:20(由SEQ ID NO:21的核苷酸序列编码)。SEQ ID NO:20本身包含分别为SEQ ID NO:8和10的可变轻链序列和可变重链序列。此外，CAR还可以在其T细胞激活结构域中包含CD28衍生的序列，优选SEQ ID NO:22(由SEQ ID NO:23的核苷酸序列编码)。替代地或另外地，CAR还可以在其跨膜结构域中包含CD3ζ衍生的序列，优选SEQ ID NO:24(由SEQ ID NO:25的核苷酸序列编码)。更进一步——或者再次替代地——CAR可以在其T细胞激活结构域中包含OX40衍生的序列，优选SEQ ID NO:26(由SEQ ID NO:27的核苷酸序列编码)。
在本发明的免疫反应性分子是CAR的实施方案中，其可以包含所有前述要素以及短氨基酸序列，充当免疫反应性分子的各个要素之间的前导序列、接头序列或铰链序列。具体地，CAR可以包含SEQ ID NO.28或基本上由SEQ ID NO.28(由SEQ ID NO:29的核苷酸序列编码)组成。
在本发明的免疫反应性分子是双特异性分子的实施方案中，其特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3)和免疫效应细胞表面抗原。优选地，免疫效应细胞表面抗原是CD3、CD28、4-1BB、OX40、CD16、NKG2D、NKp46/NCR1或NKp30/NCR3的抗原。
CD3代表CD3ε链，它是CD3-T细胞受体复合物的一部分。(Borst,J.等人,Thedelta-and epsilon-chains of the human T3/T-cell receptor complex are distinctpolypeptides.Nature.1984.312:455-458)。CD28是主要的T细胞共刺激受体。(Lesslauer,W.等人,T90/44(9.3antigen).A cell surface molecule with a function in human Tcell activation.Eur.J.Immunol.1986.16:1289-1296)。4-1BB(CD137)是活化T细胞和NK细胞的共刺激受体。(Kwon,B.S.等人,cDNA sequences of two inducible T-cell genes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1989.86:.1963-1967)。OX40(CD134)是次级共刺激受体。(Arch,R.H.等人,Mol.Cell.Biol.1998.18:558-565)。4-1BB和OX40是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，其结合TNF受体相关配体并激活核因子κB。CD16(FcγRIIIa)是低亲和力Fc受体，由NK细胞(激活的细胞毒性T细胞的子集)以及来自骨髓单核细胞谱系的细胞类型表达，与IgG分子的Fc结构域结合。(Lanier,L.L.等人,Functional properties of aunique subset of cytotoxic CD3+T lymphocytes that express Fc receptors forIgG(CD16/Leu-11antigen).J.Exp.Med.1985.162:2089-2106)。NKG2D是NK细胞表达的激活受体(Houchins,J.等人,DNAsequence analysis of NKG2,a family of related cDNAclones encoding type II integral membrane proteins on human natural killercells.1991.J.Exp.Med.173:1017-1020)。NKp46(NCR1)和NKp30(NCR3)是NK细胞表达的激活受体(Pessino,A.等人,Molecular Cloning of NKp46:A novel member of theimmunoglobulin superfamily involved in triggering of naturalcytotoxicity.1998.J.Exp.Med.188:953-960；Pende,D.等人,Identification andmolecular characterization of NKp30,a novel triggering receptor involved innatural cytotoxicity mediated by human natural killercells.2000.J.Exp.Med.192:337-346)。
所提及的表面抗原由本领域既有的名称来指定(还参见Kenneth Murphy,Janeway's Immunobiology,7th edition,Garland Science；William E.Paul,Fundamental Immunology,7th edition,Lippincott Williams&Wilkins)。
CD16、NKG2D、NKp46/NCR1、NKp30/NCR3和4-1BB存在于NK细胞表面。预期双特异性分子与这些表面抗原中的任何一种的结合需要刺激或共刺激NK细胞。对于人NK细胞，优选CD16、NKG2D和NKp46。
CD3、CD28、4-1BB和OX40存在于CTL表面。预期本发明的双特异性分子与这些表面抗原中任一种的结合需要刺激或共刺激CTL。
关于将人CTL募集至表达NY-BR-1的肿瘤细胞，待由双特异性分子靶向的免疫效应细胞表面抗原优选是包含CD3ε抗原或CD28抗原的表位的抗原。
具体地，(a)当免疫效应细胞表面抗原是包含CD3ε抗原的表位的抗原时，则本发明的免疫反应性分子包含SEQ ID NO:30和32(分别由SEQ ID NO:31和33的核苷酸序列编码)；和(b)当免疫效应细胞表面抗原是包含CD28抗原的表位的抗原时，则本发明的免疫反应性分子包含SEQ ID NO:34和36(分别由SEQ ID NO:35和37的核苷酸序列编码)。
甚至更具体地，在一些实施方案中，(a)当免疫效应细胞表面抗原是包含CD3ε抗原的表位的抗原时，则免疫反应性分子包含SEQ ID NO:38，并且(b)当免疫效应细胞表面抗原是包含CD28抗原的表位的抗原，则免疫反应性分子包含SEQ ID NO:40。
如上所述，本发明的免疫反应性分子为医生提供了对抗癌症的另一种工具。因此，应当理解，本发明的免疫反应性分子用于治疗癌症。因此，本发明还涵盖治疗癌症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者施用根据本文所公开的第一方面的免疫反应性分子。类似地，根据本文公开的第一方面的免疫反应性分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途构成本发明的一部分。
如将理解的，本发明的免疫反应性分子和方法特别适合于靶向表达癌症相关抗原NY-BR-1的癌细胞。由于NY-BR-1在实体瘤中既有的表达模式，但不限于此，该癌症通常是睾丸癌或乳腺癌。
此外，本发明涉及根据本文所公开的第一方面的免疫反应性分子在检测样品中的NY-BR-1的方法中的用途，其中任选地，该样品是先前从癌症患者获得和/或衍生的样品，并且该方法是伴随诊断(CDx)方法。
通常，可以在样品中检测NY-BR-1的方法选自：免疫组织化学染色方法；膜介导的蛋白质印迹方法；和基于流式细胞术的方法。
样品通常是组织样品、原代细胞样品或细胞系样品。例如，在抗癌治疗方案过程中的不同阶段，可以采集患有NY-BR-1阳性癌症的患者的组织样品来评估所选择的抗癌治疗方案是否有效治疗特定患者的癌症。具体地，本发明的免疫反应性分子可以用于上述方法中以检测和/或定量是否可以实现患者样品内NY-BR-1阳性细胞的相对减少。
如果所选的抗癌治疗方案有效，与治疗过程中早期采集的样品相比，可以观察到NY-BR-1阳性细胞的减少。相反，如果在连续采集的患者样品中NY-BR-1阳性细胞的量保持不变或仅非常缓慢地下降，医生可能会调整治疗方案，以便为特定患者实现更有效的治疗。
替代地或另外地，本发明的免疫反应性分子可用于从患者的组织样品分离NY-BR-1阳性细胞以用于进一步表征。例如，可以建立来自组织样品的原代细胞培养物(仅分离的NY-BR-1阳性细胞或代表样品内不同细胞类型的培养物)，以评估患者细胞对可用于治疗患者的化疗药物的特异敏感性。
在本文中，本发明的方法还可用于检测所选抗癌治疗方案对最能代表待治疗患者的肿瘤类型的先前既有的(即非原代)细胞系的功效，例如用以评估所选抗癌治疗方案的功效的可能性。本领域技术人员将理解，抗癌治疗方案包括几个变量，这些变量最终可以基于CDx方法中获得的结果进行调整。具体地，响应于通过使用本文公开的第一方面的免疫反应性分子在检测样品中NY-BR-1的此类方法获得的功效评估，医师可以考虑调整或改变特定抗癌剂的剂量、抗癌剂的组合和相对量、施用条件、施用之间的间隔等。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1：通过全长鼠抗体Clone3和Clone2检测NY-BR-1和NY-BR-1.1转染的Bosc23细胞
为了评估Clone3抗体对NY-BR-1蛋白的特异性和结合能力以及与同源物NY-BR-1.1可能的交叉反应性，用全长蛋白NY-BR-1和NY-BR-1.1瞬时转染Bosc23细胞，随后通过FACS Clone3杂交瘤上清液进行检查。将结果与全长鼠Clone2抗体的结合和交叉反应特性进行比较，该抗体对NY-BR-1具有已知的特异性。
简而言之，每孔(6孔板)使用600μl Opti-MEM中的4μg DNA和12μlLipofectamine(Lipofectamine 2000，ThermoFisher)转染Bosc23细胞。转染后24小时，使用不断稀释的Clone3杂交瘤上清液(未稀释、1:10、1:50、1:200、1:500)或Clone2抗体(5μg/mL)对细胞进行染色。在4℃温育1小时后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并与第二PE缀合的抗小鼠Fcγ亚类I特异性抗体(Jackson Immuno Research)在4℃下温育30分钟。用FACS缓冲液进行两次洗涤步骤后，在FACS Canto II装置(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析。
与同种型对照相比，尽管抗体浓度增加，流式细胞术分析揭示纯化的Clone3抗体与NY-BR-1.1没有结合(平均荧光强度-MFI没有显著变化；NY-BR-1.1：同种型对照MFI＝90；1:500稀释下的Clone3 MFI＝49、1:200稀释下的Clone3 MFI＝50、1:50稀释下的Clone3MFI＝52、1:10稀释下的Clone3 MFI＝58、未稀释的(ud)Clone3 MFI＝87)，而观察到对NY-BR-1的剂量依赖性敏感性(NY-BR-1：同种型对照MFI＝74；1:500稀释下的Clone3 MFI＝126、1:200稀释下的Clone3 MFI＝293、1:50稀释下的Clone3MFI＝619、1:10稀释下的Clone3 MFI＝922、未稀释的(ud)Clone3 MFI＝642)。
相比之下，纯化的Clone2抗体明显地结合至NY-BR-1和NY-BR-1.1二者(NY-BR-1：5μg/mL时的Clone2 MFI＝672；NY-BR-1.1：5μg/mL时的Clone2 MFI＝541)。结果如图1所示。
实施例2：Clone3抗体的NY-BR-1表位发现
为了确定被SEQ ID NO:46的全长鼠Clone3抗体特异性识别和结合的NY-BR-1表位，使用了海德堡PEPperPRINT GmbH的专有技术
简言之，将NY-BR-1(即SEQ ID NO:42)的氨基酸850-928的肽点样到微阵列芯片上。抗原的C末端和N末端通过中性GS接头延长，以避免截短的肽。然后将蛋白质序列翻译成具有12个氨基酸的肽-肽重叠的13mer肽。产生了两个阵列，其中80个肽印在双斑点中(总共160个肽斑点)。每个阵列均由Flag(DYKDDDDKGG，72个斑点)和HA(YPYDVPDYAG，72个斑点)对照肽构架。在标准缓冲液中预溶胀10分钟并在封闭缓冲液中预溶胀60分钟后，肽阵列最初与二抗以1:5000稀释度在室温下温育60分钟，以避免与抗原衍生肽发生背景相互作用。清洗2x1分钟并在标准缓冲液中溶胀30分钟后，将1型映射阵列与杂交瘤上清液Clone3在4℃下温育过夜。在标准缓冲液中重复洗涤(2x1分钟)，然后与二抗以1:5000稀释度在室温下温育30分钟。在标准缓冲液中清洗2x1分钟后，用水冲洗微阵列并在空气流中干燥。用Odyssey成像系统以分辨率21μm和扫描强度7进行读数。
绘制读数的中值强度，并揭示出5个重叠肽的簇显示出最高强度。结果如图2所示。这些肽的共有序列被鉴定为被SEQ ID NO:1的Clone3抗体特异性识别和结合的NY-BR-1表位。
实施例3：通过Clone3和Clone2衍生的scFv-Fc融合蛋白检测NY-BR-1和NY-BR-1.1转染的Bosc23细胞
除了SEQ ID NO:46的Clone3抗体之外，还研究了由Clone3scFv和人Fc结构域(SEQID NO:18)组成的相应融合蛋白针对全长蛋白NY-BR-1和NY-BR-1.1的结合和交叉反应特性。将结果与Clone2衍生的融合蛋白(Clone2scFv-Fc)的结合能力进行比较。因此，如实施例1中所述，产生NY-BR-1和NY-BR-1.1瞬时转染的Bosc23细胞并通过流式细胞术进行分析。使用次级PE缀合的抗人Fcγ片段特异性抗体(Jackson Immuno Research)检测Clone3scFv-hFc(SEQ ID NO:18)和Clone2scFv-hFc融合蛋白的结合。
与同种型对照相比，所有融合构建体均表现出与NY-BR-1的强大结合能力(NY-BR-1：同种型对照MFI＝58；Clone3scFv-hFc MFI＝730；Clone2-scFv-hFc MFI＝466)，此外，Clone2衍生的融合蛋白还显示出与NY-BR-1.1蛋白清晰可检测的结合(NY-BR-1.1：同种型对照MFI＝60；Clone2scFv-hFc MFI＝489)。相反，Clone3衍生的融合蛋白不与NY-BR-1.1结合(NY-BR-1.1：同种型对照MFI＝60；Clone3scFv-hFc MFI＝62)，这与实施例1中的Clone3杂交瘤上清液获得的结果一致。结果显示于图3。
实施例4：与NY-BR-1和NY-BR-1.1全长肽共培养后表达Clone3 CAR的T细胞的激活分析
为了研究CAR形式中可能的交叉反应性的影响，从健康供体分离原代T细胞，并用编码包含SEQ ID NO:29的Clone3 CAR基因表达盒或相应的Clone2 CAR基因表达盒的慢病毒载体转导。为了分离原代T细胞，将血液样品放入EDTA收集管中，并彻底移液到50mLFalconTM管中的Ficoll(FicollPaque，GE Healthcare；密度：1.077)上。在2200rpm下不间断离心20分钟后，将形成的淋巴细胞环转移至新的50mL FalconTM管中，并用20mL PBS洗涤两次(1500rpm下离心10分钟)。然后，根据制造商的说明，用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi)确定细胞数，以便随后分离人T细胞。在补充有T细胞TransActTM(1:100，Miltenyi)、IL-7(5ng/mL)和IL-15(5ng/mL)的TexMACS GMP培养基(Miltenyi)中培养48小时后，将T细胞用Clone3或Clone2 CAR盒在添加Polybrene(8μg/mL)的情况下以MOI 5进行慢病毒转导，并在补充有IL-7(5ng/mL)和IL-15(5ng/mL)的TexMACS GMP培养基(Miltenyi)中培养。转导后48小时，通过流式细胞术分析测定SEQ ID NO:28的Clone3 CAR和相应的Clone2 CAR的表达水平。此处，T细胞用APC缀合的抗人CD3抗体(BD Biosciences，克隆：UCHT1)和PE缀合的抗人Fcγ片段特异性抗体(Jackson Immuno Research)在4℃下染色30分钟，然后进行两次使用FACS缓冲液的洗涤步骤(以1500rpm离心5分钟)并在FACS Canto II装置(BD Biosciences)上进行最终分析。为了随后与NY-BR-1和NY-BR-1.1蛋白共培养，96孔板用谷胱甘肽酪蛋白(100ng/孔)在4℃下包覆过夜，随后用含有GST标记的NY-BR-1和NY-BR-1.1蛋白的细胞裂解物包覆，该裂解物源自转染的HEK 293T细胞。表达Clone2和Clone3 CAR的T细胞以及非转导(模拟)T细胞在NY-BR-1/NY-BR-1.1包覆的96孔板中培养(每孔5x105个CAR+或模拟T细胞在200μlTexMACS GMP培养基+IL-7/IL-15中)24小时。根据制造商的说明，使用BD OptEIA人IFNγELISA套件(BD Biosciences)通过细胞培养上清液中IFNγ的浓度来确定CAR+T细胞活化水平。
当在NY-BR-1包覆板中培养时，Clone3 CAR+T细胞分泌的IFNγ量增加，但在NY-BR-1.1包覆板中培养时则不然，而Clone2 CAR+T细胞在两种包覆变体中都产生IFNγ(参见图4)。这些结果证实，所有测试的Clone3形式(抗体、融合蛋白、CAR)与NY-BR-1.1蛋白不存在交叉反应性。此外，这些实施例证明了SEQ ID NO:28的Clone3CAR对于NY-BR-1蛋白的特异性。
实施例5：与表达NY-BR-1和NY-BR-1.1的Bosc23细胞共培养后表达Clone3 CAR的Jurkat细胞的激活分析
为了重现所观察到的分离的NY-BR-1和NY-BR-1.1蛋白对膜结合靶变体的影响，如实施例1中所述用NY-BR-1和NY-BR-1.1蛋白转染Bosc23细胞，以及另外通过慢病毒转导产生稳定的表达Clone3和Clone2 CAR的Jurkat细胞系。为此目的，将1x105个Jurkat细胞培养在24孔板中的1mL RPMI培养基(含有10％ FCS)中，并用包括包含SEQ ID NO:29的Clone3CAR表达盒的载体或用包括相应Clone2 CAR基因表达盒的载体与嘌呤霉素抗性基因一起在MOI为10的条件下进行慢病毒转导。转导后24小时用新鲜DMEM更换培养基。又在两天后，转导的Jurkat细胞经洗涤，转移至96孔板格式并在补充有嘌呤霉素(最终浓度：2μg/mL)的DMEM培养基中培养，以便在2至3周的时间段内选择CAR+Jurkat细胞。使用流式细胞术分析确定所得克隆的CAR表达水平。将细胞用APC缀合的抗人Fcγ片段特异性抗体(JacksonImmuno Research)在4℃下染色30分钟。用FACS缓冲液进行两次洗涤步骤(1500rpm下离心5分钟)后，在FACS Canto II装置(BD Biosciences)上分析细胞。此后，效应细胞(Clone2或Clone3 CAR+Jurkat)与靶细胞(NY-BR-1、NY-BR-1.1转染的Bosc23)以1:1的比例在96孔格式中共温育24小时。使用CD107a脱颗粒测定确定表达CAR的Jurkat细胞的激活水平。为此，用200μL Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)在4℃下固定细胞15分钟。此后，用400μL Perm/Wash溶液(BD Biosciences)洗涤细胞两次，并用PE-Cy7缀合的抗人CD107a抗体(BDBiosciences克隆H4A3，5μl在Perm/Wash溶液中)在4℃下染色30分钟。用Perm/Wash溶液进行两次额外的洗涤步骤后，将细胞重悬于FACS缓冲液中并在FACS Canto II装置(BDBiosciences)上进行分析。图5中给定的平均荧光强度(MFI)证明表达SEQ ID NO:28的Clone3 CAR的Jurkat细胞通过膜结合的NY-BR-1蛋白特异性激活，而无法被NY-BR-1.1蛋白特异性激活。正如预期的那样，Clone2 CAR+Jurkat细胞被NY-BR-1和NY-BR-1.1转染的Bosc23细胞激活，证实了之前的结果。
实施例6：在同种异体设定中表达NY-BR-1的胸腔积液细胞被Clone3 CAR+T细胞消除
在源自乳腺癌患者的原代胸腔积液细胞的实时杀伤测定中评估表达SEQ ID NO:28的Clone3 CAR的T细胞的功能性。首先，使用初级Clone2(3μg/mL)和次级APC-缀合的抗小鼠Fcγ亚类I特异性抗体(Jackson Immuno Research)通过流式细胞术分析初级胸腔积液细胞HD-A-213的NY-BR-1表达，如实施例1中所述，并且表现出约15％至20％的目标表达水平。此外，如实施例4中所述，从健康供体分离原代T细胞，并用编码Clone3或Clone2 CAR表达盒以及基于S/MAR的基序的DNA质粒载体进行电穿孔，以进行附加型维持。使用Neon转染系统[ThermoFisher(每次电击5x106个T细胞和10μg DNA)]进行电穿孔。电穿孔的T细胞在补充有IL-7(5ng/mL)和IL-15(5ng/mL)的TexMACS GMP培养基(Miltenyi)中进一步培养。转染后24小时，使用APC-缀合的抗人CD3(BD Biosciences，克隆：UCHT1)和PE-缀合的抗人Fcγ片段特异性抗体(Jackson Immuno Research)通过流式细胞术测定电穿孔T细胞的CAR表达水平，如实施例4中所述。为了分析Clone3和Clone2 CAR+T细胞(效应细胞)的裂解能力，将胸腔积液细胞(靶细胞)接种在E-Plate 96中(30000个细胞/孔，一式三份)。通过xCELLigence RTCA仪器(ACEABiosciences Inc.)实时监测细胞阻抗。一旦靶细胞贴壁，就以效靶之比1:1添加效应细胞。未转染的(模拟)T细胞作为对照。每5分钟实时测量细胞阻抗，持续另外80小时。实验结束时，根据制造商的说明，使用BD OptEIA人IFNγELISA套件(BD Biosciences)通过检测细胞培养上清液中的IFNγ来确定T细胞活化水平。结果显示，SEQ ID NO:28的Clone3 CAR呈阳性的T细胞特异性地裂解表达NY-BR-1的胸腔积液细胞，并且该裂解能力与Clone2 CAR+T细胞的能力相似或甚至更高(参见图6)。pS/MARter电穿孔CAR+T细胞的强烈激活还体现在IFNγ分泌与模拟T细胞相比显著增加(参见图7)。
实施例7：表达鼠Clone3 CAR的T细胞在同种异体移植小鼠模型中诱导肿瘤进展延迟并延长存活率
为了评估鼠Clone3和Clone2 CAR的体内抗肿瘤效率，使用NY-BR-1稳定表达的鼠乳腺癌细胞系(EO771)验证了同种异体移植肿瘤小鼠模型。因此，将EO771细胞接种在12孔板中(1x105个细胞/孔)并在DMEM(10％ FSC、1％青霉素/链霉素)中培养。第二天，在添加Polybrene(8μg/mL)的情况下，用编码全长NY-BR-1蛋白和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体以MOI 5转导细胞。转导后48小时，用新鲜DMEM更换培养基。为了选择NY-BR-1+EO771细胞，将细胞转移至96孔板形式并在补充有嘌呤霉素(最终浓度：5μg/mL)的DMEM培养基中培养两到三周。使用初级Clone2(3μg/mL)和次级APC-缀合的抗小鼠Fcγ亚类I特异性抗体(Jackson Immuno Research)借助流式细胞术分析来测定NY-BR-1表达率，如实施例1中所述。
为了产生所需的表达CAR的鼠T细胞，从C57BL/6小鼠中取出脾脏，通过100μm细胞过滤器(Greiner)挤压，用PBS洗涤(1500rpm，5分钟)，并使用泛-T细胞分离试剂盒II(Miltenyi)进行T细胞分离。此后，将鼠T细胞在12孔板(5x106个细胞/孔)中用RPMI-1640培养基培养，该培养基补充有10％ FCS、1％青霉素/链霉素、抗CD3ε抗体(Miltenyi，克隆：145-2C11，2μg/mL)、抗CD28抗体(Miltenyi，克隆：37.51，1μg/mL)、IL-2(100IU/mL)、L-谷氨酰胺(Gibco，2mM)、β-巯基乙醇(PAN Biotech，50μM)和非必需氨基酸(Gibco，2x)。分离后24小时，使用Neon转染系统[ThermoFisher(每次电击5x106个T细胞和10μg DNA)]，用包括包含SEQ ID NO:29的Clone3 CAR表达盒的DNA质粒载体或用包括相应Clone2 CAR基因表达盒以及基于S/MAR的基序的DNA质粒载体电穿孔鼠T细胞，以用于附加型维持。最后，将转染的细胞转移至装有预热的RPMI-1640培养基(5x106个T细胞/孔)的24孔板中，该培养基补充有20％ FCS、IL-2(100IU/mL)和L-谷氨酰胺(Gibco，2mM)。如实施例4中针对人CAR+T细胞所述，使用PE-或APC-缀合的抗小鼠Fcγ亚类I特异性抗体(Jackson Immuno Research)通过流式细胞术分析来测定转染效率。
由于免疫功能正常的C57BL/6小鼠对NY-BR-1+EO771肿瘤有排斥作用(数据未显示)，因此将2x106个NY-BR-1+EO771细胞皮下注射到免疫缺陷的NOD.CB17-Prkdcscid小鼠中。肿瘤移植后八天，通过静脉注射未转染的(模拟)T细胞、Clone2或Clone3 CAR+T细胞(5x105个CAR+T细胞/小鼠)处理小鼠。除对照(n＝9)外，每组由七只小鼠组成。每三到四天测量肿瘤体积并用椭圆公式(1/6xπx高度x宽度x深度)计算。当肿瘤直径为15mm或肿瘤体积为400mm3时(以先发生者为准)处死移植肿瘤的小鼠。与模拟处理和未处理的小鼠相比，用Clone3或Clone2 CAR+T细胞的处理导致肿瘤进展显著延迟。此外，与未经处理的小鼠相比，CAR+T细胞治疗可显著延长中位存活率和总体存活率。事实上，与用Clone2 CAR+T细胞处理的那些小鼠相比，Clone3 CAR+T细胞处理的小鼠甚至显示出增加的总体存活率。结果如图8所示。
实施例8：NY-BR-1+荷瘤小鼠通过用人Clone3 CAR+T细胞治疗显示出延迟的肿瘤生长并显著提升了总体存活率
在异种移植小鼠模型中进一步研究了人Clone3和Clone2 CAR的抗肿瘤效率。首先，在添加Polybrene(8μg/mL)的情况下，通过编码NY-BR-1全长蛋白和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体转导，产生表达NY-BR-1的稳定Bosc23细胞系，如实施例7中针对NY-BR-1+EO771细胞系所述。在嘌呤霉素选择后，通过流式细胞术用初级Clone2(3μg/mL)和次级APC-缀合抗小鼠Fcγ亚类I特异性抗体(Jackson Immuno Research)来测试剩余克隆的NY-BR-1表达，如实施例1中所述。通过用DNA质粒载体(先前描述于：WO2019/057774中，至少在第15、16、20和21页；WO2019/060253中，至少在第4页第15行至第5页第3行；以及“A nonviral,nonintegrating DNA nanovector platform for the safe,rapid,and persistentmanufacture of recombinant T cells”(2021；Science Advances,Vol 7,Issue 16)中，具体是在第8到9页标题为“DNA Vectors”的章节以及图1A中，它们的相关公开内容通过引用并入本说明书)电穿孔产生所需的表达CAR的人T细胞，该质粒载体包括包含SEQ ID NO:29的Clone3 CAR表达盒或具有相应的Clone2CAR基因表达盒以及S/MAR基序，如实施例6中所述。
由于NOD/SCID/IL2rγnull(NSG)小鼠缺乏T细胞、B细胞及NK细胞，因此与NOD.CB17-Prkdcscid小鼠相比，它们可以更好地保留人淋巴细胞和肿瘤细胞。因此，通过皮下注射将2x106个NY-BR-1+Bosc23细胞移植到NSG小鼠中。肿瘤移植后八天，静脉内注射未转染(模拟)T细胞以及Clone3和Clone2 CAR+T细胞(1x106个CAR+T细胞/小鼠)。未处理的小鼠作为对照。每组由七只小鼠组成。每三到四天测量肿瘤体积并用椭圆公式(1/6xπx高度x宽度x深度)计算。当肿瘤直径为15mm或肿瘤体积为400mm3时(以先出现者为准)处死移植肿瘤的小鼠。事实上，用对SEQ ID NO:28的Clone3 CAR呈阳性的T细胞处理的小鼠表现出显著延迟的肿瘤生长，与模拟和未处理的小鼠相比，其导致总体存活率显著提升。此外，值得注意的是，Clone2和Clone3 CAR+T细胞的抗肿瘤效率没有差异。结果如图9所示。
总体而言，与体外实验一致，本发明的SEQ ID NO:28的基于Clone3 scFv的CAR在有效性和毒性方面与Clone2衍生的CAR没有表现出任何偏差。
实施例9：靶向NY-BR-1的BiMAb激活自体T细胞并消除衍生自胸腔积液细胞的NY-BR-1球体
为了评估根据本发明的双特异性分子的抗肿瘤潜力，将癌症抗原(下文也称为肿瘤相关抗原)和靶向免疫效应细胞表面抗原的双特异性抗体(BiMAb)用于离体的患者衍生的球体模型来确认人类癌症的免疫应答。因此，从获自乳腺癌患者的胸腔积液纯化肿瘤细胞。新鲜分离的人乳腺癌细胞在补充有B-27TM补充剂和1％基质胶的DMEM中生长。单个多细胞肿瘤球体通过将5x104个细胞/孔接种到低粘96孔圆底板(Thermo Fisher Scientific,Dreieich,Germany)中产生，在100x g下离心5分钟，并在37℃、5％ CO2的加湿培养箱中保持。接种后观察到球体过夜形成，并在功能实验前温育2天。以2:1E/T比例(1x105个细胞/孔)添加从每位患者获得的自体外周血单核细胞(PBCM)。将10nMαCD3+/-αCD28的组合设置添加到共培养物，并温育48小时进行T细胞活化测定或温育5天进行T细胞增殖测量。肿瘤相关抗原(TAA)反应性包括NY-BR-1(clone3/本发明)以及可比双特异性分子中的HER2、EGFR和CEA。在球体产生之前，通过流式细胞术表征患者来源的乳腺癌细胞的基线TAA表面表达，如实施例6中所述。
据显示，αTAA-αCD3 BiMAb单一处理诱导T细胞活化(图10A，B)。SEQ ID NO:38的靶向NY-BR-1的αCD3 BiMab以及靶向HER2的αCD3 BiMAb表现出相当的CD4+和CD8+T细胞活化程度，与SEQ ID NO:40的靶向NY-BR-1的αCD28 BiMAb组合时进一步增强激活。这也转化为增强的细胞毒性，因为αTAA-αCD3 BiMAb与SEQ ID NO:40的αNY-BR-1-αCD28双特异性分子的组合设置增加了胸腔积液细胞的裂解(图10C)。在T细胞增殖方面，用αCD3 BiMAb处理显示出微弱的增加，特别是在增殖的CD4+T细胞中，而添加SEQ ID NO:40的αNY-BR-1-αCD28BiMAb促进了CD4+和CD8+T细胞增殖的显著增强(图10D)。
受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，本发明所属领域的技术人员将想到本文阐述的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，并且那些修改和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语，但它们仅用于一般和描述性的含义，而不是出于限制的目的。
Claims (15)
1.一种免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3)，其特征在于所述免疫反应性分子特异性识别并结合至包含SEQ ID NO:1的抗原肽序列的NY-BR-1的表位，并且其中所述免疫反应性分子具有包含SEQ ID NO:2至4的VL互补决定区(CDR)1至3和SEQ ID NO:5至7的VH CDR 1至3的抗原结合区。
2.如权利要求1所述的免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子具有包含SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:10的抗原结合区。
3.如权利要求1或权利要求2所述的免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子是单克隆小鼠抗体、单链可变片段-片段可结晶区(scFv-Fc)融合蛋白、嵌合抗原受体(CAR)或双特异性分子。
4.如前述权利要求中任一项的免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子是全长单克隆小鼠IgG，优选全长单克隆小鼠IgG1，其中所述全长单克隆小鼠IgG1优选包含SEQ ID NO:12和14。
5.如权利要求4所述的免疫反应性分子，其中所述全长单克隆小鼠IgG1包含SEQ IDNO:46。
6.如权利要求1至3中任一项所述的免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子是单链可变片段-片段可结晶区(scFv-Fc)融合蛋白，其包含优选地分别包含SEQ ID NO:16或SEQID NO:18的小鼠IgG1 Fc结构域或人IgG1 Fc结构域。
7.如权利要求1至3中任一项所述的免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子是包含SEQ ID NO:20的嵌合抗原受体(CAR)。
8.如权利要求7所述的免疫反应性分子，其包含：
-CD28衍生的序列，优选SEQ ID NO:22；和/或
-CD3ζ衍生的序列，优选SEQ ID NO:24；和/或
-OX40衍生的序列，优选SEQ ID NO:26。
9.如权利要求7或权利要求8所述的免疫反应性分子，其包含SEQ ID NO:28。
10.如权利要求1至3中任一项所述的免疫反应性分子，其中所述免疫反应性分子是特异性识别并结合至人含锚蛋白重复结构域的蛋白30A(NY-BR-1；UniProtKB Q9BXX3)和免疫效应细胞表面抗原的双特异性分子，优选地，所述免疫效应细胞表面抗原选自CD3、CD28、4-1BB、OX40、CD16、NKG2D、NKp46/NCR1和NKp30/NCR3的抗原。
11.如权利要求10所述的免疫反应性分子，其中：
(a)当所述免疫效应细胞表面抗原是包含CD3ε抗原的表位的抗原时，所述免疫反应性分子包含SEQ ID NO:30和32；以及
(b)当所述免疫效应细胞表面抗原是包含所述CD28抗原的表位的抗原时，所述免疫反应性分子包含SEQ ID NO:34和36。
12.如权利要求10或权利要求11所述的免疫反应性分子，其中：
(a)当所述免疫效应细胞表面抗原是包含所述CD3ε抗原的表位的抗原时，所述免疫反应性分子包含SEQ ID NO:38；以及
(b)当所述免疫效应细胞表面抗原是包含所述CD28抗原的表位的抗原时，所述免疫反应性分子包含SEQ ID NO:40。
13.如权利要求1至12中任一项所述的免疫反应性分子用于治疗癌症，优选用于治疗特征在于表达癌症相关抗原NY-BR-1的癌症，其中所述癌症任选地是睾丸癌或乳腺癌。
14.如权利要求1至12中任一项所述的免疫反应性分子在检测样品中的NY-BR-1的方法中的用途，其中任选地，所述样品是先前获得的并且/或者源自癌症患者的样品，并且所述方法是伴随诊断(CDx)方法。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述方法选自免疫组织化学染色法；膜介导的蛋白质印迹法；和基于流式细胞术的方法，并且/或者其中所述样品是组织样品、原代细胞样品或细胞系样品。
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