CN111132993A - 合理设计的用于调节嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法的病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经修饰的病毒结构蛋白(VSP)，其作为特异性靶向免疫系统细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)的工具。经修饰的VSP可以组装成病毒样颗粒(VLP)。修饰VSP的暴露区域，以在位于更高级结构例如位壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面处的区域中包含与CAR特异性结合的配体(LCAR)。因此，本发明提供了经修饰的VSP。本发明还涉及编码所述VSP的核酸。此外，本发明涉及包含至少一种VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。此外，本发明涉及一种药物组合物，其包含VSP，核酸，包含至少一种VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。此外，本发明涉及VSP、壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其用于医药，特别是用于减少或限制免疫应答，治疗或预防肿瘤溶解综合征或用于治疗患者的免疫疾病。

Description

合理设计的用于调节嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法的病毒 样颗粒

本发明涉及经修饰的病毒结构蛋白(VSP)，其作为特异性靶向免疫系统细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)的工具。经修饰的VSP可以组装成病毒样颗粒(VLP)。修饰VSP的暴露区域，以在位于更高级结构例如壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面处的区域中该更高级结构包含与CAR特异性结合的配体(LCAR)。因此，本发明提供了经修饰的VSP。本发明还涉及编码所述VSP的核酸。此外，本发明涉及包含至少一种VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。此外，本发明涉及一种药物组合物，其包含VSP、核酸、包含至少一种VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。此外，本发明涉及经修饰的VSP或包含此类经修饰的VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其用于医药中，特别是用于预防、减少或限制免疫应答，特别是用于预防、减少或治疗患者的肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征、神经毒性、“靶向/非靶向肿瘤”识别、移植物抗宿主病(GVHD)和/或过敏反应。

发明背景

在癌症的治疗中，诸如嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法之类的方法很有希望，但同时也伴随着一些缺点，例如严重的不良反应，包括细胞因子释放综合征、神经毒性、“靶向/非靶向肿瘤”识别、移植物抗宿主病(GVHD)和过敏反应。CAR-T细胞疗法是一种治疗方法，其中患者的T细胞在实验室中经过修饰，因此它们会攻击癌细胞。T细胞取自患者的血液。然后，将编码与患者癌细胞上某种蛋白结合的特殊受体的基因离体导入细胞。这种特殊受体称为嵌合抗原受体(CAR)。大量的CAR T细胞在实验室中生长，并通过输注施用于患者。采用CAR T细胞的首次临床试验集中于B细胞白血病或淋巴瘤。这些疾病的特征是表达CD19分子(等)的肿瘤细胞的出现。在这些试验中，CAR特异性结合CD19蛋白的基序，其称为肿瘤特异性表位或LCAR。结合对LCAR/CAR的建立导致针对肿瘤细胞的T细胞的特异性激活并随后杀伤肿瘤细胞。激活的T细胞在识别并杀伤靶细胞以吸引其他具有免疫活性的细胞后，将多种信号分子(细胞因子)释放到环境中。当大量CAR T细胞注入患者体内时，它们会面对大量靶细胞，尤其是在晚期患者中的靶细胞。然后成功消除这些肿瘤细胞，同时将大量细胞因子释放到血流中。这种副作用称为细胞因子释放综合征或肿瘤溶解综合征(TLS)，这对患者可能是严重的，甚至可能危及生命。不管LCAR/CAR配对如何，在针对癌症的任何CAR治疗中均观察到TLS。本发明集中于干扰LCAR/CAR结合轴的形成。这通过将LCAR引入VLP中来实现，而VLP转而优先与CAR结合而不激活CAR。本发明首次提供了用于CAR T细胞的可逆体内控制系统，其使CAR T细胞保持完整，因此可以防止TLS和相关作用。因此，本发明允许微调CAR T细胞应答。

发明内容

在第一方面，本发明涉及VSP，其中：(i)VSP能够任选地与一种或多于一种其他VSP和任选地磷脂一起形成壳粒结构、衣壳、病毒样颗粒(VLP)、病毒载体或病毒，(ii)VSP在位于所述壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面上的区域中，包含至少一种特异性结合嵌合抗原受体的配体(LCAR)，其中LCAR是多肽。

在第二方面，本发明还涉及编码第一方面的VSP的核酸。

在第三方面，本发明还涉及包含至少一种根据本发明第一方面的VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。

在第四方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明第一方面的VSP、根据本发明第二方面的核酸、根据本发明第三方面的包含至少一种VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。

本发明的第五方面涉及根据第一、第二和第三方面的VSP、核酸、壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其用于医药。

本发明的第六方面涉及根据第一、第二或第三方面的VSP、核酸、壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其用于减少或限制免疫应答，预防、减少或限制免疫应答，该免疫应答优选由过继免疫疗法引起，更优选由CAR细胞疗法引起。

在第七方面，本发明涉及试剂套装，其包括含有至少一种根据本发明第一方面的VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，和表达CAR的经修饰的细胞，其中所述病毒载体或病毒是非感染性的，所述经修饰的细胞与壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒特异性结合。

附图说明

在下文中，描述了本说明书中包括的附图的内容。在此上下文中，还请参考上文和/或下文的本发明的详细描述。

图1：重组AAV颗粒的ELISA。每孔涂覆1x10⁸个wt AAV和NY-BR1 AAV的病毒颗粒，与2倍连续稀释的AAV特异性A20小鼠杂交瘤上清液一起孵育，然后用抗小鼠IgG-HRP抗体进行检测。用DAB作为底物，并测量OD450。实验一式三份进行。

图2：重组AAV颗粒的ELISA。以2倍连续稀释每孔涂覆1x10⁸个wt AAV和NY-BR1 AAV的病毒颗粒，与NY-BR1特异性小鼠抗体Morab2(1μg/ml)一起孵育，然后用抗小鼠IgG-HRP抗体进行检测。用DAB作为底物，并测量OD450。实验一式三份进行。

图3：重组AAV颗粒的ELISA。每孔涂覆1x10⁸个NY-BR1 AAV的病毒颗粒，分别与2倍连续稀释的AAV特异性A20小鼠杂交瘤上清液或NY-BR1特异性scFv-Fc融合蛋白一起孵育，然后分别用抗小鼠或抗人IgG-HRP抗体进行检测。用DAB作为底物，并测量OD450。实验一式三份进行。

图4：细胞系中CAR下调的实施例。将稳定表达NY-BR1特异性CAR的Jurkat细胞与带有GFP表达盒的wt AAV或NY-BR1 AAV以MOI 5000一起孵育24h。除了GFP转基因表达外，还使用抗人IgG APC抗体通过FACS检测CAR表达。

图5：关于转基因和CAR表达的图4所示实验的时相分析。随着时间的推移，相应的AAV颗粒存在于培养基中。实验一式三份进行，误差棒显示SEM。

图6：如图4和图5所示，随时间进行CAR表达的FACS分析，但转导后4h从培养基中去除AAV颗粒。实验一式三份进行，误差棒显示SEM。

图7：表达NY-BR1 CAR的Jurkat细胞的激活测定。与未转导的细胞和PMA-洛诺霉素(Ionomycin)刺激的细胞相比，以MOI 5000分别用AAV颗粒转导24h后，通过FACS测量激活标志物CD69的表达水平。

图8：通过FACS(实验条件如图4所示)评估原代人CD3+细胞(供体3)中CAR下调的实施例，以及通过使用IFNγELISA试剂盒测量三种不同供体的T细胞激活。

图9：独立于AAV血清型的CAR下调的实施例。在AAV2中588位以及AAV9和AAV5中类似位置以及AAV8中类似位置的附近位置显示出插入NY-BR1。将稳定表达NY-BR1-特异性CAR的Jurkat细胞与带有GFP表达盒的wt AAV2或NY-BR1 AAV以MOI 5000一起孵育24h。还使用抗人IgG APC抗体通过FACS检测CAR表达。实验一式三份进行，误差棒显示SEM。

图10：评估NY-BR1 LCAR长度变化。将链霉抗生物素蛋白包被的免疫磁珠(Dynabead)与A20生物素偶联，然后与显示各种长度NY-BR1 LCAR的AAV的粗裂解物一起孵育。使用NY-BR1特异性scFv-Fc融合蛋白和二抗抗人IgG-PE的FACS对与可溶性CAR的结合进行定量；完整AAV颗粒的ELISA。涂覆AAV特异性A20小鼠杂交瘤上清液，然后与AAV粗裂解物一起孵育。然后，添加生物素缀合的A20，然后添加STAV-HRP缀合物。用DAB作为底物，并测量OD450。

<u>AAV#</u>	<u>序列</u>
		150	插入NYBR1
285	插入NYBR1_1-4
		286	插入NYBR1_3-6
287	插入NYBR1_5-8
		288	插入NYBR1_7-10
289	插入NYBR1_9-12
		290	插入NYBR1_11-14
309	插入NYBR1_1-8
		310	插入NYBR1_4-11
311	插入NYBR1_7-14
		345	插入NYBR1_20

图11：加入CAR T细胞后10h至20h，特异性抑制CAR介导的杀伤。将表达NY-BR1的原代乳腺癌细胞与NY-BR1特异性CAR T细胞按效应细胞与靶标的比例为1∶1进行共培养，并添加或不添加NY-BR1-LCAR AAV颗粒(MOI 5000)。在实时阻抗测量设备(xCelligence，ACEABiosystems Inc.)上记录靶细胞的生存力，并显示为SEM的平均生存力。

图12：显示了常见AAV血清型的VP1序列的比对。多序列比对由Clustal Omega执行，并由MView 1.63显示。AAV2中的优选插入点M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716以粗体和下划线突出显示。所有比对的血清型显示出彼此之间高达约100％的序列同源性的区段和较低同源性的区段。在比对中也存在空位，结果显示具有高序列相似性的氨基酸区段的绝对氨基酸位置，或该区段内具有特定氨基酸的绝对氨基酸位置在不同血清型之间是不同的。因此，在类似位置处的AAV的氨基酸，例如AAV2的绝对位置588处的精氨酸，即R588(从AAV2 VP1的第一个N端氨基酸开始计数)对应于AAV5中的绝对氨基酸位置T578、AAV8中的位置T591和AAV9中的位置A589。在实施例6中测试的LCAR NY-BR1的实际插入点(见图9)用灰色下划线突出显示。比对指示了编号1至761位的氨基酸，其在本发明的上下文中基于全部十七个比对的AAV序列被称为腺相关病毒同源位置(AAHP)。例如，AAV2的R588的AAHP为614位。用灰色矩形指示在VP1的氨基酸之后将NY-BR1 LCAR分别插入AAV2、AAV5、AAV8和AAV9的C端。因此，参照AAHP，将NY-BR1 LCAR插入AAV2、AAV5和AAV9的AAHP614的C端和AAV8中的AAHP 613的C端。

图13：在存在或不存在肝素的情况下，具有和不具有NY-BR1 CAR的wt AAV2和NY-BR1 AAV2与Jurkat细胞结合的实施例。将1E5衣壳/细胞的AAV与肝素预孵育，然后加入Jurkat细胞，并将混合物在冰上孵育1h。通过用生物素偶联的抗衣壳抗体A20和STAV-Alexa488染色来定量所结合的AAV。通过FACS分析检测Alexa488阳性活细胞。实验一式三份进行，误差棒显示SEM。

序列表

SEQ ID NO：1 AAV血清型2的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：2 AAV血清型2的VP2病毒外壳蛋白2

SEQ ID NO：3 AAV血清型2的VP3病毒外壳蛋白3

SEQ ID NO：4 AAV2-NY-BR1的VP1的序列

SEQ ID NO：5 AAV5-NY-BR1的VP1的序列

SEQ ID NO：6 AAV8-NY-BR1的VP1的序列

SEQ ID NO：7 AAV9-NY-BR1的VP1的序列

SEQ ID NO：8 插入NYBR1_20的序列

SEQ ID NO：9 插入NYBR1的序列

SEQ ID NO：10 插入NYBR1_1-4的序列

SEQ ID NO：11 插入NYBR1_3-6的序列

SEQ ID NO：12 插入NYBR1_5-8的序列

SEQ ID NO：13 插入NYBR1_7-10的序列

SEQ ID NO：14 插入NYBR1_9-12的序列

SEQ ID NO：15 插入NYBR1_11-14的序列

SEQ ID NO：16 插入NYBR1_1-8的序列

SEQ ID NO：17 插入NYBR1_4-11的序列

SEQ ID NO：18 插入NYBR1_7-14的序列

SEQ ID NO：19 AAV血清型1的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：20 AAV血清型3a的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：21 AAV血清型3b的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：22 AAV血清型4的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：23 AAV血清型5的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：24 AAV血清型6的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：25 AAV血清型6.2的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：26 AAV血清型7的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：27 AAV血清型8的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：28 AAV血清型9的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：29 AAV血清型10的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：30 AAV血清型11的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：31 AAV血清型12的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：32 AAV血清型13的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：33 AAV血清型.rh10的VP1病毒外壳蛋白1

SEQ ID NO：34 AAV血清型.rh32.33的VP1病毒外壳蛋白1

发明详述

在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们是可以变化的。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

在本说明书的全文中引用了一些文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公开。本文引用的一些文件的特征在于“通过引用并入”。在这种并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间发生冲突的情况下，以本说明书的文本为准。

在下文中，将描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，但是，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建附加的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。本描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实例与任何数量的所公开和/或优选元素相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所有所描述元素的任何排列和组合。

定义

为了实施本发明，除非另有说明，否则使用化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中进行了解释(参见例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，J.Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor 1989)。

在下文中，提供了本说明书中经常使用的术语的一些定义。在说明书的其余部分中，这些术语在其使用的每种情况下将分别具有定义的含义和优选的含义。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，要素前面不使用数量词包括复数指示物，除非内容另外明确指出。

在本发明的上下文中使用的术语“病毒外壳蛋白”(VCP)是指病毒的结构性病毒衣壳蛋白。优选地，病毒是双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒、单链RNA病毒、反义单链RNA病毒、单链RNA逆转录病毒、双链RNA逆转录病毒。VCP可以包含单独的或组合的腺相关病毒(AAV)的主要衣壳蛋白，例如VP1、VP2或VP3。VP1、VP2和VP3可以相互作用以形成具有二十面体对称性的更高级结构。

在本发明的上下文中，术语“病毒结构蛋白”(VSP)是指病毒外壳蛋白或病毒包膜糖蛋白。

在本发明的上下文中，术语“病毒包膜糖蛋白”(VEG)是指作为病毒包膜的一部分的病毒蛋白。病毒包膜通常衍生自宿主细胞膜的部分，例如包含磷脂，还包含病毒糖蛋白，例如帮助病毒逃避免疫系统的病毒糖蛋白。包膜病毒包括DNA病毒，特别是疱疹病毒、痘病毒和嗜肝DNA病毒；RNA病毒，特别是黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、丁型肝炎病毒、正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、线状病毒和逆转录病毒。因此，病毒包膜糖蛋白优选衍生自这些病毒中的任何一种。

在本发明的上下文中使用的术语“衣壳”是指仅一种类型或两种、三种或多于三种不同类型的VCP非共价连接的多聚体的单或双蛋白壳的三维结构。VCP自组装以形成衣壳。通常，病毒衣壳的自组装遵循两种基本模式：其中蛋白亚基和核酸排列成螺旋状的螺旋对称，和其中蛋白亚基组装成覆盖包含核酸的核的对称壳的二十面体对称。

如本文所用，术语“壳粒结构”是指仅由一种类型或两种、三种或多于三种不同类型的VCP形成的结构，其取决于VCP所源自的特定病毒。例如，腺病毒的外壳包含三种外壳蛋白，六邻体、五邻体和纤维。但是，如果独立地表达，单独的五邻体便能够形成壳粒结构。例如，AAV的外壳包含三种外壳蛋白VP1、VP2和VP3。但是，如果独立地表达，单独的VP3便能够形成壳粒结构。然而，壳粒结构可以结合到细胞表面，并可以被它们所结合的细胞内化。壳粒结构可以天然存在或可以是人造的。通常，壳粒结构不包含病毒核酸，因此是非传染性的。

在本发明的上下文中，术语“载体”用于指多核苷酸或一种或多于一种蛋白或它们的混合物，其可用于将包含一种或多于一种基因的多核苷酸转运到合适的宿主或靶细胞中，所述基因编码例如目的基因产物或RNA，特别是miRNA或siRNA，或目的蛋白。载体的实例包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、病毒或人工染色体。载体可以包含“复制子”多核苷酸序列，其促进载体在宿主细胞中的自主复制。外源DNA被定义为异源DNA，其是宿主细胞中不天然存在的DNA，其例如复制载体分子、编码选择或筛选标记或编码转基因。进入宿主细胞后，载体就可以独立于宿主染色体DNA进行复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以生成载体及其插入的DNA的多个拷贝。另外，载体还可包含必要的元件，该元件允许插入的DNA转录成mRNA分子或以其他方式引起插入的DNA复制成RNA的多个拷贝。载体还可以包含调节目的基因表达的“表达控制序列”。通常，表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻遏物。在包含多于一种编码一种或多于一种目的基因产物的多核苷酸的载体中，表达可被一种或多于一种表达控制序列共同或分别控制。更具体地，可以通过分开的表达控制序列来控制载体中包含的每个多核苷酸，或者可以通过单个表达控制序列来控制载体中包含的所有多核苷酸。由单个表达控制序列控制的单个载体中包含的多核苷酸可以形成开放阅读框。一些表达载体还包含与插入的DNA相邻的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期和/或允许mRNA翻译成蛋白分子。因此，可以快速合成许多由插入的DNA编码的mRNA和多肽分子。

在本发明的上下文中使用的术语“病毒载体”是指经修饰以将病毒载体中包含的多核苷酸或给定蛋白转移到靶细胞中的病毒。在本发明的上下文中，优选使用病毒载体。

病毒样颗粒(VLP)是VSP的多聚体，优选地是VCP和/或VEP的多聚体，其不包含多核苷酸，但其具有病毒的特性，例如结合细胞表面受体、被受体内化、在血液中稳定存在、和/或包含糖蛋白等。VLP通常由VCP和/或VEP的多聚体，特别是VCP的多聚体组装而成。VLP在本领域中是众所周知的，并且已经由许多病毒产生，包括细小病毒科(例如，腺相关病毒)、逆转录病毒科(例如，HIV)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)和噬菌体(例如，Q如、AP205)。

在本发明的上下文中使用的术语“VP1”、“VP2”和“VP3”是指VCP VP1、VP2和VP3。VP1、VP2和VP3是病毒衣壳蛋白，优选AAV的病毒衣壳蛋白，其可以自组装形成具有T＝1对称性、约22nm直径的二十面体衣壳。优选地，如此组装的衣壳由60个拷贝的三种尺寸的变体VP1、VP2和VP3以1∶1∶10的比例组成，该变体例如来自腺相关病毒血清型2。衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的三种尺寸的变体区别在于N端，即VP2和VP3是VP1的截短形式。衣壳根据病毒将单链或双链的基因组DNA或RNA包封起来。在天然存在的AAV中，衣壳包封单链DNA。

AAV衣壳蛋白与宿主细胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合，并使用宿主共受体例如α壳蛋白整联蛋白提供病毒体与靶细胞的附着。这种附着主要通过网格蛋白依赖性胞吞作用诱导病毒体内化。与宿主受体的结合还诱导衣壳重排，从而导致VP1的N端的表面暴露，特别是其磷脂酶A2样区域和假定的核定位信号的表面暴露。VP1的N端可作为脂肪分解酶，在进入宿主细胞期间破坏核内体膜，并可有助于病毒向核的转运。

如本文所用，术语“病毒”是指小的专性细胞内寄生生物，其定义为包含被保护性蛋白外壳即衣壳包围的RNA或DNA基因组。病毒的基因组可以由DNA或RNA组成，其可以是线性或环状的单链(ss)或双链(ds)。整个基因组可以占据一个核酸分子(单基因组)或几个核酸片段(多基因组)。病毒可包括双链DNA病毒，优选肌病毒科、长尾病毒科、短尾病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、杆状病毒科、乳头瘤病毒科、多分体DNA病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科；单链DNA病毒，优选环病毒科、丝杆状病毒科、细小病毒科；双链RNA病毒，优选呼肠孤病毒科；单链RNA病毒，优选冠状病毒科、小RNA病毒、杯状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、星状病毒科、动脉炎病毒科、戊型肝炎病毒科；反义单链RNA病毒，优选沙粒病毒科、丝状病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、正黏病毒科、博尔纳病毒科；单链RNA逆转录病毒，优选逆转录病毒科；双链RNA逆转录病毒，优选花椰菜花叶病毒科、嗜肝DNA病毒科。

术语“腺相关病毒”(AAV)是指属于细小病毒科的病毒，细小病毒科包含可细分到细小病毒亚科的几个属，包括细小病毒属、红病毒属、依赖病毒属、阿留申病毒属(Amdovirus)和博卡病毒属，细小病毒科还包含浓核病毒亚科，浓核病毒亚科包含浓核病毒属、重复病毒属、短浓核病毒属、环星黑烟浓核病毒属和康特拉病毒属。AAV的独特生命周期及其以持续表达感染非分裂和分裂细胞的能力使其成为有吸引力的载体。野生型病毒的另一个吸引人的特点是缺乏明显的致病性。

在本发明的上下文中使用的术语“特异性结合”是指配体与其各自靶标的结合亲和力高于与任何其他靶标的亲和力。配体与其靶标具有一定亲和力，并且配体与其相应靶标例如受体蛋白的结合通常产生生物学效应。优选地，配体与其靶标的结合是特异性的，并且以高亲和力发生，优选地，K_d小于10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M或小于10^-10M。优选在37℃下测量这种亲和力。合适的测定方法包括表面等离振子共振测量(例如Biacore)、石英晶体微量天平测量(例如Attana)和竞争测定。

术语“嵌合抗原受体”(CAR；也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体、人工T细胞受体)是指工程改造的受体，其将任意特异性引入免疫效应细胞，优选T细胞上。细胞在遗传上配备有CAR，其是一种复合膜受体分子，可同时提供靶向特异性和T细胞激活。CAR的最常见形式是衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与CD3跨膜域和胞内域融合的融合物。通过细胞外部分中的抗体衍生的结合结构域，CAR使T细胞靶向期望的细胞靶标，当遇到靶标时，通过细胞内部分信号传导结构域发生T细胞激活。通常通过逆转录病毒载体或慢病毒载体促进这些受体的编码序列向合适的细胞，特别是T细胞的转移。受体之所以称为嵌合体，是因为它们由不同来源的部分组成。

在本发明的上下文中，术语“嵌合抗原受体的配体”(LCAR)涉及优选地包含、基本上包含、或组成为被CAR特异性结合的至少一个、两个、三个或多于三个TSEA的表面暴露的表位的多肽，或者可与CAR特异性结合的多肽，例如CAR特异性抗体，特别是scFv、抗体样蛋白或其片段。LCAR通常是蛋白质或糖蛋白的一部分，其在CAR细胞疗法靶向的靶细胞表面上形成可接近的构象性表位或非构象性表位。由于CAR疗法主要针对肿瘤疾病，因此LCAR优选包含肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的一个或多于一个表位。可以将多肽插入VSP，特别是VCP或VEP。此外，LCAR与其CAR的结合导致细胞表面上的CAR短暂的不可接近。由于CAR通常包含scFv，因此LCAR的长度优选至少为B细胞表位的长度。在一个优选的实施方案中，LCAR不包含一个或多于一个T细胞表位，尽管T细胞表位仅在与I类或II类MHC复合时引发T细胞应答。技术人员非常了解如何在MHC I和MHC II呈递的情况下评估给定的蛋白能否引发T细胞应答。这些方法包括计算机模拟T细胞表位预测(参见例如Desai DV和Kulkarni-Kale U(2014)Methods Mol.Biol.1184：3333-364和Kosaloglu等人，(2016)Oncoimmunology)以及诸如ELISPOT分析、细胞内细胞因子染色或四聚体/五聚体染色然后进行流式细胞仪术的技术。优选地，LCAR不引发T细胞免疫应答，因为以这种方式防止了针对本发明病毒的不需要的T细胞应答。还优选地，LCAR不引起B细胞应答。尽管CAR包含特异性结合至一个或多于一个TSEA的单链抗体，但LCAR只要能够特异性结合CAR，就不能诱导B细胞应答，即具有免疫原性。因此，既不引发T细胞应答又不引发B细胞应答的LCAR是特别优选的，因为当施用于患者时，它避免了针对本发明病毒的不希望的免疫应答。

术语“肿瘤表面暴露的抗原”(TSEA)是指癌胚基因的产物，通常仅在胎儿组织和癌性体细胞中表达；癌病毒基因的产物，其由致瘤性转化病毒编码；过表达/积累基因的产物，其在正常组织和肿瘤性组织均表达，其表达水平在肿瘤形成中大幅度升高；睾丸癌基因的产物，其仅由癌细胞和例如睾丸的成年生殖组织和胎盘表达；谱系限制基因的产物，其主要由单个癌症组织型表达；突变基因的产物，其仅由遗传突变或转录改变产生的癌症表达；以及翻译后改变的产物，其包括例如肿瘤相关糖基化改变；或独特型基因的产物，其是高度多态的并且肿瘤细胞表达特定的“克隆型”，例如在由克隆异常导致的B细胞或T细胞淋巴瘤/白血病中，其包含存在于肿瘤细胞表面的表位。优选地，TSEA优先或排他地在肿瘤细胞中表达。优选的是那些作为CAR治疗靶标的肿瘤表面暴露的抗原。优选地，这样的抗原是蛋白或糖蛋白。TSEA的上述定义涵盖了肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。如果免疫系统的细胞例如T细胞、B细胞、经CAR修饰的免疫细胞，特别是CAR T细胞或抗体，例如IgA、IgG或IgE可以通过与肿瘤细胞表面上TSEA的表位结合来特异性结合TSEA，那么该表位存在于或“暴露”在肿瘤细胞的表面上。

在本发明的上下文中，“表位”也称为抗原决定簇，用于指被免疫系统，特别是抗体、B细胞或T细胞识别的大分子的区段。此类表位是能够结合抗体或其抗原结合片段的大分子的部分或区段。在上下文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失而与后者的结合未丧失。表位本身可以是免疫原性的，例如触发B细胞应答或可以是仅能特异性结合抗体。

如本文所用，“构象性表位”是指由所述大分子的三维结构形成的线性大分子(例如多肽)的表位。在本申请的上下文中，“构象性表位”是“非连续表位”，即大分子(例如多肽)上的构象性表位，其由大分子的一级序列(例如，多肽的氨基酸序列)中至少两个分开的区域形成。换句话说，在本发明的上下文中，如果表位由一级序列中的至少两个分开的区域组成，所述区域与CAR的特异性结合部分，例如抗体、单链抗体或其抗原结合片段同时结合，其中这些至少两个分开的区域被一级序列中不与CAR的特异性结合部分结合的一个或多于一个区域中断，则该表位被认为是“构象性表位”。特别地，这样的“构象性表位”存在于多肽上，并且一级序列中的两个分开的区域是CAR的特异性结合部分所结合的两个分开的氨基酸序列。

术语“特异性结合”是指结合对的成员与其结合伴侣的亲和力比与其他结合伴侣的亲和力更高的相互作用。两个结合伴侣之间的“结合亲和力”由分子(例如，CAR)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，LCAR)之间的非共价相互作用的总和的强度决定。除非另有说明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。“特异性结合”是指结合部分(例如抗体)与靶标例如其特异性表位的结合比与另一靶标的结合更强。如果结合部分与第一靶标结合的解离常数(Kd)比与第二靶标结合的解离常数低，则该结合部分与第一靶标的结合更强。结合部分特异性结合的靶标的解离常数(Kd)是结合部分未特异性结合的靶标的解离常数(Kd)的低于10分之一，优选低于20分之一，更优选低于50分之一，甚至更优选低于100分之一、200分之一、500分之一或1000分之一。

因此，术语“Kd”(以“mol/L”为单位，有时缩写为“M”)是指结合部分(例如抗体或其片段)与靶分子(例如抗原或其表位)之间的特定相互作用的解离平衡常数。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括但不限于基于表面等离振子共振的测定法(例如BIAcore测定法)；石英晶体微量天平测定法(例如Attana测定法)；酶联免疫吸附测定(ELISA)；和竞争测定(例如RIA法)。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并保持更长的结合时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。

优选地，本发明的VSP，特别是如果组装成本发明的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，则与CAR结合，特别是如果在T细胞上表达时，具有允许细胞胞吞的结合亲和力，从而降低T细胞上CAR的细胞浓度。按照实施例中的说明进行操作，可以针对本发明的每个VSP(特别是如果组装成本发明的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒)与给定的CAR，即特异性结合的CAR测试该性质。优选地，本发明的VSP(特别是如果组装成本发明的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒)与特异性结合的CAR之间的亲和力(Kd)为10μM至1pM，优选小于10μM、5μM、1μM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、50nM、10nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、或1pM。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用，并且是指任何肽键连接的氨基酸链，无论长度或翻译后修饰如何。可通过化学修饰进一步修饰可用于本发明的蛋白(包括蛋白衍生物、蛋白变体、蛋白片段、蛋白区段、蛋白表位和蛋白结构域)。这意味着这种化学修饰的多肽包含除20种天然氨基酸以外的其他化学基团。此类其他化学基团的实例包括但不限于糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。与亲本多肽相比，多肽的化学修饰可以提供有利的特性，例如增强稳定性、延长生物半衰期或增加水溶性中的一种或多于一种。

术语“氨基酸”通常是指任何单体单元，其包含经取代或未经取代的氨基、经取代或未经取代的羧基、和一个或多于一个侧链或基团、或这些基团中的任一个的类似物。示例性的侧链包括例如硫醇、硒代、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基、醚、硼酸盐、硼酸基、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性的氨基酸包括但不限于包含光活化交联剂的氨基酸、结合金属的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、含金属氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或光异构化氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其他糖类修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、化学可裂解的和/或光可裂解的氨基酸、碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或多于一个毒性部分的氨基酸。如本文所用、术语“氨基酸”包括以下二十种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。如果未定义“X”残基，则应将其定义为“任何氨基酸”。这二十种天然氨基酸的结构在例如Stryer等人，Biochemistry，第五版，Freeman and Company(2002)中示出。其他氨基酸，例如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸，也可以被遗传编码，参见(Stadtman(1996)“Selenocysteine，”Annu Rev Biochem.65：83-100和Ibba等人(2002)“Genetic code：introducing pyrrolysine，”Curr Biol.12(13)：R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、经修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物。参见，例如，Zhang等人(2004)“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophaninto proteins in mammalian cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(24)：8882-8887，Anderson等人(2004)“An expanded genetic code with a functional quadrupletcodon”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(20)：7566-7571，Ikeda等人(2003)“Synthesis ofa novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein invivo，”Protein Eng.Des.Sel.16(9)：699-706，Chin等人(2003)“An Expanded EukaryoticGenetic Code，”Science 301(5635)：964-967，James等人(2001)“Kineticcharacterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizablephenylazophenylalanine residues，”Protein Eng.Des.Sel.14(12)：983-991，Kohrer等人(2001)“Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells：Ageneral approach to site-specific insertion of amino acid analogues intoproteins，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(25)：14310-14315，Bacher等人(2001)“Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable ofGrowth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue，”J.Bacteriol.183(18)：5414-5425，Hamano-Takaku等人(2000)“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASynthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficientlythan Tyrosine，”J.Biol.Chem.275(51)：4032440328，和Budisa等人(2001)“Proteinswith{beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores andpharmaceutically active amino acids，”Protein Sci.10(7)：1281-1292。氨基酸可以合并成肽、多肽或蛋白质。

在本申请的上下文中，术语“插入位点”是指在相应的VCP中插入了LCAR多肽序列的确切氨基酸位置，例如，插入的氨基酸序列可以简单地插入结构性VCP的两个给定氨基酸之间，从而将氨基酸添加到VCP的原始氨基酸序列中。通过在两个给定的氨基酸之间插入多肽序列，可以伴随发生不同的情况，例如存在于原始VCP氨基酸序列中的氨基酸的缺失，从而导致VCP的给定氨基酸的完全置换或部分置换。

术语“变体”应理解为多肽或多核苷酸，其与衍生出它的多肽或多核苷酸相比的区别在于长度或序列的一个或多个改变。衍生多肽或多核苷酸变体的多肽或多核苷酸也称为亲本多肽或多核苷酸。术语“变体”包括亲本分子的“片段”或“衍生物”。通常，“片段”的长度或大小小于亲本分子，而“衍生物”与亲本分子相比在其序列上表现出一个或多于一个差异。还包括修饰的分子，例如但不限于翻译后修饰的蛋白(例如糖基化、生物素化、磷酸化、泛素化、棕榈酰化或蛋白水解切割的蛋白)和经修饰的核酸例如甲基化的DNA。术语“变体”也涵盖不同分子的混合物，例如但不限于RNA-DNA杂合体。通常，优选通过基因技术手段人工构建变体，而亲本蛋白质或多核苷酸是野生型蛋白或多核苷酸或其共有序列。然而，天然存在的变体也应理解为被本文所用的术语“变体”所涵盖。此外，可用于本发明的变体还可以衍生自亲本分子的同源物、直系同源物或旁系同源物或衍生自人工构建的变体，条件是该变体表现出亲本分子的至少一种生物学活性，即具有功能活性。

特别地，术语“肽变体”、“多肽变体”、“蛋白变体”应被理解为肽、多肽或蛋白质，其与衍生出它的肽、多肽或蛋白相比的区别在于一个或多于一个氨基酸序列变化。衍生肽、多肽或蛋白变体的肽、多肽或蛋白也称为亲本肽、多肽或蛋白。此外，可用于本发明的变体还可以衍生自亲本肽、多肽或蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物或衍生自人工构建的变体，条件是该变体表现出亲本肽、多肽或蛋白的至少一种生物学活性，即具有功能活性。氨基酸序列的变化可以是氨基酸交换、插入、缺失、N端截短或C端截短、或这些变化的任何组合，其可以发生在一个或几个位点。肽、多肽或蛋白变体可以呈现出总数为至多60个(至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个)氨基酸序列的变化(即交换、插入、缺失、N端截短和/或C端截短)。氨基酸交换可以是保守的和/或非保守的。可选地或另外地，本文所用的“变体”可以通过与衍生它的亲本肽、多肽或蛋白的一定程度的序列同一性来表征。更精确地，在本发明的上下文中，变体显示出与参考多肽具有至少80％的序列同一性，更优选至少85％的序列同一性，甚至更优选至少90％的序列同一性，最优选至少95％的序列同一性。优选地，本发明的变体表现出所示的序列同一性，并且优选地，该序列同一性是针对15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个或多于50个氨基酸的连续区段。最优选地，在两个氨基酸(即参考氨基酸和对其同一性进行评估的氨基酸)之间的整个比对长度上确定指示的同一性。可以用几种本领域已知的算法进行这种氨基酸序列比对，优选用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)、用hmmalign(HMMER软件包，http：//hmmer.wustl.edu/)或用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)，其例如可在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html或在http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clustalw.html上获得。使用的优选参数是默认参数，因为它们是在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上设置的。序列同一性(序列匹配)的等级可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算。优选地，序列匹配分析可以通过已建立的同源性作图技术来补充，例如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics2003b，19 Suppl 1：I54-I62)或Markov随机场。当在本申请中提及序列同一性的百分比时，如果没有另外特别说明，则相对于较长序列的全长来计算这些百分比。

通过在比较窗口比较两个最佳比对序列来确定“序列同一性百分比”，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的序列部分可以包括添加或缺失(即空位)以优化两个序列的比对。百分比通过以下方式计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100得出序列同一性百分比。

在两个或多于两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一”或“相同”是指两个或多于两个序列或亚序列相同，即包含相同的核苷酸或氨基酸序列。如果当在比较窗口或使用上述序列比较算法之一或通过人工比对和目视检查测量的指定区域进行比较和最大对齐时，序列具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如，在指定区域具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)，则这些序列彼此“基本相同”。这些定义也指测试序列的互补序列。因此，在整个说明书中关于多肽和多核苷酸序列比较使用术语“至少80％序列同一性”。该表述优选地指与相应参考多肽或相应参考多核苷酸的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

在本发明的上下文中使用的术语“VSP的类似位置”指的是，当两个蛋白通过使用序列比对算法对齐，即彼此对齐时，，处于VSP内与另一个参考VSP相同的相对位置的氨基酸或接近具有该相同的相对位置的氨基酸的氨基酸。常用的比对算法是Clustal Omega，可在EMBL-EBI网站(https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)上公开访问。相关的VSP，尤其是相同物种的病毒的VSP，例如腺相关病毒的VSP，通常表现出高和低的序列同源性。序列变异的程度通常取决于相应的序列对于蛋白质是否是必需的。因此，如果将AAV2的VP1用作参考VSP，并且一个或多于一个其他AAV VSP与AAV2的VP1对齐，则技术人员可以容易地确定其他AAV的VP1中与AAV2的VP1的给定氨基酸的类似位置。这在图12中示例性地进行了说明，其中描绘了17种不同的AAV血清型的比对并且通过粗体和下划线突出了AAV2的几种氨基酸，这些氨基酸在本发明的上下文中被教导为特别适合于LCAR的插入。与突出显示的AAV2氨基酸对齐的氨基酸处于类似位置。对于AAV VP1蛋白，腺相关病毒同源位置(AAHP)也用于指AAV VP1内的插入点。AAHP是基于总体比对长度的对齐氨基酸的编号，其中包括空位。例如，图12中AAV2的R588的AAHP为614。在该定义中优选包括的近端位置是在具有相同相对位置的氨基酸的N端的1个或2个氨基酸或C端的1个或2个氨基酸位置处的氨基酸，例如AAV8的N590的近端位置为AAV8的T591，因此在优选的实施方案中，也考虑AAV2的R588的类似位置(其与AAV8的T591、AAV5的T578和AAV9的A589对齐)。

本文使用的术语“片段”是指天然存在的片段(例如剪接变体)以及人工构建的片段，特别是指通过基因技术手段获得的片段。通常，“片段”的长度或大小小于亲本分子。“片段”是指在大小和长度上比亲本分子小的肽、多肽或蛋白的部分，但其功能仍与亲本蛋白一样，因为它仍由负责蛋白展示的特征的原始序列的一个或多于一个必需氨基酸序列组成。换句话说，该片段保留了特异性结合其靶标的能力。术语“片段”也可以理解为与亲本多肽、肽或蛋白相比，在其N端和/或C端和/或内部，优选在其N端、其N端和C端、或C端具有最多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个氨基酸缺失的片段。

在本发明的上下文中使用的术语“抗原”是指被免疫应答的分子，例如，抗体、T细胞受体(TCR)等识别的任何结构。抗原对身体而言可能是外来的或有毒的，或者可能是与特定疾病相关的细胞蛋白。抗原被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别，并可能引发体液或细胞免疫应答。引发这种应答的抗原也称为免疫原。细胞内的一部分蛋白质(不论是外来的还是细胞的)被加工成较小的肽，并由主要组织相容性复合物(MHC)呈递。如果小肽片段与T细胞受体结合，则会引发细胞免疫应答。细胞表面抗原可选自细胞因子受体、整联蛋白、细胞黏附分子、细胞类型特异性细胞表面抗原、组织特异性细胞表面抗原、细胞表面表达的肿瘤相关抗原、肿瘤抗原、分化簇抗原或糖类。

术语“单链抗体”与术语单链可变片段(scFv)可互换使用，并且是指靶标特异性结合结构域，其通常是促进与靶标特异性结合的多肽。如果靶标特异性结合结构域与给定靶标以最高亲和力结合，而与其他靶标、甚至具有相关氨基酸序列的靶标仅以较低亲和力结合，例如低至少10倍，优选低至少100倍，则认为这种靶标特异性结合结构域对于给定靶标是特异性的。scFv实际上不是抗体的片段，而是包含通过短接头肽与轻链可变结构域连接的重链可变结构域(Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883)。接头通常富含甘氨酸以提高柔韧性，并富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可以将VH的N端与VL的C端相连，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。

术语“单链抗体样蛋白”是指已被工程改造(例如通过环的诱变)以特异性结合靶分子的scFv蛋白。通常，这种抗体样蛋白包含至少一个可变肽环，该可变肽环的两端均连接至蛋白支架。这种双重结构限制极大地将抗体样蛋白的结合亲和力水平提高至与抗体的结合亲和力水平相当。可变肽环的长度通常为10个至20个氨基酸。支架蛋白可以是任何具有良好溶解性的蛋白。优选地，支架蛋白是小球状蛋白。抗体样蛋白包括但不限于亲和体、抗运载蛋白(anticalin)和设计的锚蛋白重复蛋白(综述参见：Binz H.K.等人(2005)Engineering novel binding proteins from non-immunoglobulindomains.Nat.Biotechnol.23(10)：1257-1268)。抗体样蛋白可以衍生自大的突变体文库，例如可以从大型噬菌体展示库中淘选，并且可以类似于常规抗体进行分离。而且，可以通过球状蛋白的表面暴露的残基的组合诱变获得抗体样结合蛋白。抗体样蛋白有时被称为“肽适体”。

本说明书中使用的术语“核酸”或“多核苷酸”包括对于所有已知生命形式而言必不可少的聚合或寡聚大分子或大的生物分子。包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)在内的核酸由称为核苷酸的单体构成。大多数天然存在的DNA分子由两条互相缠绕以形成双螺旋的互补生物聚合物链组成。DNA链也称为由核苷酸组成的多核苷酸。每个核苷酸均由含氮的核碱基以及称为脱氧核糖或核糖的单糖和磷酸基团组成。天然存在的核碱基包括鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。核苷酸通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸之间的共价键在链中相互连接，从而形成交替的糖磷酸骨架。如果糖是脱氧核糖，则聚合物是DNA。如果糖是核糖，则聚合物是RNA。通常，通过各个核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成多核苷酸。在本发明的上下文中，术语“核酸”包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)及其混合物，例如RNA-DNA杂合体(一条链内)、以及cDNA、基因组DNA、重组DNA、cRNA和mRNA。核酸可以由整个基因或其一部分组成，核酸也可以是miRNA、siRNA、piRNA或shRNA。MiRNA是短的核糖核酸(RNA)分子，平均长22个核苷酸，但可能更长，并且存在于所有真核细胞中，即植物、动物和一些病毒中，在基因表达的转录调控中和转录后调控中发挥作用。MiRNA是转录后调节剂，可与目标信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列结合，通常导致翻译抑制和基因沉默。小干扰RNA(siRNA)有时也称为短干扰RNA或沉默RNA，是长度为20个至25个核苷酸的短核糖核酸(RNA分子)。它们参与RNA干扰(RNAi)途径，在其中干扰特定基因的表达。短发夹RNA(shRNA)或小发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹转角的人造RNA分子，可用于通过RNA干扰(RNAi)沉默靶基因表达。在细胞中，shRNA的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来完成。PiRNA也是短RNA，通常包含26个至31个核苷酸，并根据与之结合的所谓piwi蛋白得名。核酸也可以是人工核酸。人工核酸包括聚酰胺或肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一个与天然存在的DNA或RNA的区别在于分子骨架的改变。核酸可以例如是化学合成的，例如根据磷酸三酯法合成(参见，例如，Uhlmann，E.和Peyman，A.(1990)Chemical Reviews，90，543-584)。

术语“免疫应答”是指由抗原与适应性免疫系统的分子和/或细胞的反应触发的免疫系统的反应。这样的免疫应答可以是体液免疫应答或细胞免疫应答。B细胞表位引起体液免疫应答，其中T细胞表位引起细胞免疫应答。

疾病或病症的“治疗”或“处理”、是指实现以下一项或多于一项：(a)减少疾病的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症特征性症状的发展；(c)抑制所治疗病症特征性症状的恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的个体的该病症的复发；和(e)限制或预防先前有病症的症状的个体的症状复发。因此，具有治疗作用的部分通过实现上述作用(a)至(e)中的一种或多于一种来治疗疾病的症状或病症。

如本文所用，“预防”疾病或病症是指预防患者发生这种疾病或病症或副作用。

术语“肿瘤溶解综合征”(TLS)是指因细胞快速死亡而导致的急性肿瘤代谢症。肿瘤溶解综合征可能是肿瘤靶向治疗的结果，也可能是自发的。一组代谢异常可作为癌症治疗期间的并发症出现，其中大量肿瘤细胞在治疗的同时被杀死(溶解)，从而使其内容物释放到血液中。这最常见于淋巴瘤和白血病的治疗之后。肿瘤溶解综合征的特征是高血钾(高血钾症)、高血磷(高磷酸盐血症)、低血钙(低钙血症)、高血尿酸(高尿酸血症)以及高于正常水平的血尿素氮和其他含氮化合物。这些血液电解质和代谢产物的变化是因为垂死细胞的细胞内容物因细胞分解而释放到血液中。在TLS中，分解出现在细胞毒性疗法后或来自具有高细胞周转率和肿瘤增殖率的癌症。在肿瘤溶解综合征中发现的代谢异常最终可导致恶心和呕吐，但更严重的是急性尿酸肾病、急性肾衰竭、癫痫发作、心律不齐和死亡。

实施方案

在下文中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指出相反的情况，否则如此定义的每个方面可以与一个或多于一个其他方面组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。

如背景部分所述，在最坏的情况下，CAR T细胞疗法可导致TLS，导致所谓的细胞因子风暴，这是由于CAR T细胞的特定活性引起的副作用。为了减少细胞因子释放增加所导致的后果，治疗选择包括使用抗IL-6抗体或施用皮质类固醇，这会导致无法充分治疗原发性疾病例如癌症。因此，通常期望在CAR T细胞疗法期间预防或至少降低TLS的可能性。在产生本发明的工作中，发明人出人意料地发现，AAV衍生的经修饰的VSP，特别是携带特异性结合其各自的CAR的表位(LCAR)的VCP显示出通过CAR的内化使细胞表面的CAR的瞬时不可用性。优选地，用于CAR疗法的细胞是T细胞。此外，发明人可以证明这种不可用性是时间可控的。因此，CAR的瞬时不可用性导致TLS降低或没有TLS，但是T细胞不发生凋亡，因此仍可用于癌症治疗。

这一出人意料的发现尤其可以提供相对于现有技术的以下优点：(i)减少/预防TLS；(ii)由于防止T细胞凋亡而保证患者的靶标特异性T细胞；(iii)一旦确定了结合基序，就可以针对每个目标CAR实施；(iv)通过结合本发明的VSP融合蛋白，没有额外激活CAR T细胞。

在第一方面，本发明涉及VSP，其中：

(i)VSP，优选VCP，能够任选地与一种或多于一种其他病毒外壳蛋白一起形成壳粒结构、衣壳、病毒样颗粒(VLP)、病毒载体或病毒，

(ii)VSP，优选VCP，在位于所述壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面上的区域中包含至少一种特异性结合嵌合抗原受体的配体(LCAR)，并且其中LCAR是多肽。

可以通过几种本领域已知的方法如电子显微镜、尺寸排阻色谱法或非变性凝胶电泳来评估给定的VSP，优选VCP形成多聚体结构、壳粒结构、衣壳、病毒样颗粒(VLP)、病毒载体或病毒的能力。技术人员可以容易地评估已通过插入LCAR进行修饰的VSP，优选VCP，例如天然存在的VSP，优选VCP是否仍能够与其他VSP，优选相同类型和/或其他类型VSP的VCP，优选VCP，优选在生理条件下形成非共价键。如果将LCAR插入VSP，优选VCP区域，则该插入最不可能干扰自组装，所述区域不是VSP、优选VCP的相互作用表面。一致地，壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面是蛋白复合物的一部分，该蛋白复合物在各自的结构组装后，仍可与溶液中复合物周围或在细胞表面的其他蛋白例如CAR相互作用。结构生物学领域的技术人员可以使用X射线晶体学和/或H1-NMR光谱法确定每个单独的VSP，优选VCP的三维结构，以及壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的三维结构，并确定形成位于表面的结构的VSP、优选VCP的氨基酸。这些氨基酸位置是优选的插入位点，因为它们最不可能破坏VSP，优选VCP的整体结构和/或干扰VSP，优选VCP的自组装。因此，短语“位于表面上的区域”是指如上所述暴露于表面的一种或多于一种相邻氨基酸。还优选地，该区域不位于VSP、优选VCP的螺旋和/或β折叠结构中，因为LCAR插入这样的结构中可能会破坏VSP的二级结构，从而可能干扰自组装。因此，优选地，将LCAR插入VSP、优选VCP的暴露于表面且非结构化的区域中，优选环形结构中。

在本发明的第一方面的实施方案中，VSP，优选VCP是病毒衍生的外壳蛋白，其能够与一个或多于一个其他VSP，优选VCP一起组装成壳粒结构。壳粒结构是多聚体，优选是五聚体、六聚体或可组装形成衣壳、VLP、病毒载体或病毒的这些亚基中的几个。不希望受任何理论的束缚，发明人相信本发明的令人惊讶的发现，即由CAR疗法引起的副作用的减少，至少部分基于以下事实：本发明的VSP，优选VCP，尤其是如果组装成壳粒、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，它们与各自的CAR结合，进而控制所述CAR在T细胞表面上的可用性。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，优选地，一个或多于一个VSP，优选VCP形成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，并且VSP，优选VCP在位于所述壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面上的区域中包含至少一种与CAR特异性结合的配体(LCAR)，该配体为多肽。优选地，该LCAR包含或组成为50个氨基酸，更优选地，LCAR包含或组成为5个至50个、6个至30个、7个至20个、8个至15个氨基酸。在更优选的实施方案中，LCAR包含或组成为9个至15个氨基酸，或由13个氨基酸组成。

本发明人发现，经修饰以包含LCAR的AAV2通过在T细胞上表达的CAR主要(如果不是排他的)与T细胞结合，然后经历胞吞作用。不希望受到任何理论的束缚，发明人相信与CAR的结合触发胞吞作用，并且不依赖于AAV进入T细胞的正常病毒进入途径。实际上，本发明人已经检测到经修饰的AAV与CAR几乎排他的结合。该观察结果强烈表明，VSP中存在的LCAR与CAR之间的相互作用，而非与表面蛋白的相互作用，(AAV用于进入的原本相互作用方式)是触发胞吞作用的关键。基于此观察，本发明人认为，可以将其他病毒的VSP，特别是VCP修饰为包含LCAR，并且这样修饰的VSP也将特异性地与CAR结合并触发降低CAR在T细胞表面上的浓度的相同的胞吞途径，从而触发T细胞应答。由于胞吞作用是通过CAR介导的，给定病毒的天然进入途径的重要性较低，因此可以使用VSP和包含此类VSP的相应的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，它们天然地通过胞吞或与细胞膜融合而进入细胞。然而，优选使用通过胞吞作用进入细胞的病毒。AAV是一种非包膜病毒。所有无包膜病毒均通过胞吞作用感染细胞。因此，特别优选的是，VSP来自无包膜病毒。

自组装以形成更高级结构的任何VSP，优选VCP具有表面暴露的氨基酸区域，因此可以包含LCAR。因此，在本发明的第一方面的另一个实施方案中，VSP，优选VCP衍生自选自以下的病毒：双链DNA病毒，优选为肌病毒科、长尾病毒科、短尾病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、杆状病毒科、乳头瘤病毒科、多分体DNA病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科；单链DNA病毒，优选环病毒科、丝杆状病毒科、细小病毒科；双链RNA病毒，优选呼肠孤病毒科；单链RNA病毒，优选冠状病毒科、小RNA病毒、杯状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、星状病毒科、动脉炎病毒科、戊型肝炎病毒科；反义单链RNA病毒，优选沙粒病毒科、丝状病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、正黏病毒科、博尔纳病毒科；单链RNA逆转录病毒，优选逆转录病毒科；双链RNA逆转录病毒，优选花椰菜花叶病毒科、嗜肝DNA病毒科。

优选地，VSP，优选VCP衍生自通过胞吞作用进入细胞的病毒，其中所述病毒选自肌病毒科、长尾病毒科、短尾病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、杆状病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科；环病毒科、丝杆状病毒科、细小病毒科；呼肠孤病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒、杯状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、星状病毒科、动脉炎病毒科、戊型肝炎病毒科、沙粒病毒科、丝状病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、正黏病毒科、博尔纳病毒科、花椰菜花叶病毒科、和嗜肝DNA病毒科。

优选地，VSP，优选VCP衍生自无包膜病毒，其中该病毒选自肌病毒科、长尾病毒科、短尾病毒科、腺病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、指环病毒科、丝杆状病毒科、细小病毒科、呼肠孤病毒科；小RNA病毒、杯状病毒科、星状病毒科、戊型肝炎病毒科和花椰菜花叶病毒科。

优选地，VSP，优选VCP衍生自无包膜单链DNA病毒，其中该病毒选自指环病毒科、丝杆状病毒科和细小病毒科，最优选细小病毒科。

优选地，VCP能够介导与宿主细胞表面蛋白的附着，从而促进病毒进入细胞的胞吞或吞噬作用，例如肌病毒科尾纤维蛋白，长尾噬菌体科尾纤维和尾尖蛋白，短尾病毒科尾纤维蛋白，疱疹病毒科gB、gC、gD和gH蛋白，腺病毒科衣壳蛋白纤维、六邻体、五邻体，杆状病毒科主要包膜糖蛋白，乳头瘤病毒科结构蛋白L1和L2、多瘤病毒科衣壳蛋白VP1，丝杆状病毒科：g3p蛋白，细小病毒科衣壳蛋白，呼肠孤病毒科σ1蛋白，冠状病毒科S和HE蛋白，微小RNA病毒科衣壳蛋白VP1、VP2、VP3，杯状病毒科衣壳蛋白VP1，披膜病毒科糖蛋白E1和E2，黄病毒科M和E蛋白，星状病毒科衣壳蛋白VP25、VP27、VP34，动脉炎病毒科主要糖蛋白GP5、膜蛋白M、次要糖蛋白GP2a、GP3、GP4、小疏水蛋白E和ORF5a蛋白，戊型肝炎病毒科衣壳蛋白，沙粒病毒科GP糖蛋白，线状病毒GP糖蛋白，副黏病毒科HN、H或G糖蛋白，弹状病毒科G，布尼亚病毒科糖蛋白Gn和Gc，正黏病毒科HA蛋白，博尔纳病毒科GP糖蛋白，逆转录病毒科SU糖蛋白，花椰菜花叶病毒科衣壳蛋白、病毒相关蛋白(VAP)，嗜肝DNA病毒科糖蛋白S、M和L。最优选地，VCP来自细小病毒科，优选来自腺相关病毒。甚至更优选地，AAV是人AAV、牛AAV、山羊AAV、禽AAV、犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒；小鼠微小病毒(MVM)；细小病毒B19(B19)；细小病毒H1(H1)；人博卡病毒(HBoV)；猫泛白细胞减少症病毒(FPV)；或鹅细小病毒(GPV)。在上述每种VCP的情况下，蛋白的结构是技术人员众所周知的。因此，还已知位于包含这种VCP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面上的每种VCP的氨基酸区域，因此，技术人员可以确定这些VCP中适合插入LCAR的氨基酸位置(参见例如WO 2017/167988，关于工程改造为在六邻体或纤维的表面暴露部分包括肽的腺病毒VLP)。

甚至更优选地，VCP来自特定AAV血清型，优选AAV-1、AAV-2、AAV-2-AAV-3杂合体、AAV-3a、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-6.2、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAVrh.10、AAV-11、AAV-12、AAV-13或AAVrh32.33。更优选地，VCP来自AAV-2、AAV-5、AAV-8、AAV-9或其变体，该变体具有至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，并且最优选地为至少95％的氨基酸序列同一性，并且能够组装成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，优选组装成VLP。

还优选地，VSP，优选VCP可以衍生自相同类型的两种或多于两种不同病毒，例如两种或多于两种不同血清型的AAV，或两种或多于两种不同血清型的腺病毒，即嵌合VSP，优选嵌合VCP。

这种嵌合VSP，优选VCP可以通过两种或多于两种VSP，优选VCP的对应部分的特定交换来产生。例如，AAV2和AAV3的嵌合VP1可以包含AAV2的AAHP 1至360的氨基酸序列和AAV3的AAHP 361至761的氨基酸序列(参见图12中使用的AAHP编号)。替代地，可以通过随机方法，例如使用Grimm等人(2008)J Virol.82(12)：5887-911)中所述消化的DNA，来产生两种、三种、四种、五种或多于五种VSP的嵌合VSP。为了使用这种随机方法，优选地，相同的不同菌株或血清型的氨基酸彼此同源。优选地，VSP在比对的VSP的整个长度上具有至少50％的氨基酸同一性(对于这样的示例性比对，参见图12，其中附图中包括的每个VCP彼此具有至少50％的氨基酸序列同一性)。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，优选地，VCP选自VP1、VP2或VP3。更优选地，VCP由VP1组成。更优选地，VCP包含根据SEQ ID NO：1的VP1或其变体，该变体与SEQ IDNO：1的氨基酸具有至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，并且最优选地至少95％的氨基酸序列同一性，并且能够组装成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，优选组装成VLP。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，参照根据SEQ ID NO：1的AAV衍生的VP1描述了一个或多于一个LCAR在AAV VCP内的插入位点。因此，由于氨基酸序列的开放阅读框移位，根据SEQ ID NO：1的VP1内一个或多于一个LCAR的优选插入位点在不同VP蛋白内的不同位置。优选地，将一个或多于一个LCAR插入选自以下的一个、两个或多于两个氨基酸位置(插入位点)：SEQ ID NO：1的VP1或其变体的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588，该变体与SEQ ID NO：1的氨基酸具有至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％的氨基酸序列同一性，并且能够组装成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，优选组装成VLP；或插入不同AAV血清型或其变体的VP1的类似位置；优选插入氨基酸位置R588和G453或插入不同AAV血清型的VP1的类似位置。通常，编码如上所述修饰的VP1的核酸的表达会导致生成三种不同的蛋白，即VP1、VP2和VP3，其中VP2和VP3分别是由可变剪接(VP2)或遗漏扫描(VP3)产生的VP1的N端截短变体。因此，所得到的组装的壳粒结构、病毒等包含VP1、VP2和VP3，其全部包含插入的LCAR，但是在不同位置插入。这是由于例如VP1的S261位于VP2中的位置S124和VP3中的位置S59导致的。替代地，优选的是一个或多于一个LCAR的插入位点是选自以下的一个、两个或多于两个插入位点：根据SEQID NO：2的VP2或其变体的M1、A2、K24、S124、A129、N244、R310、T311、G316、R322、R334、F397、T436、Q447、N450、R451、A454、P520、A527、T576或T579，优选R451，该变体与SEQ ID NO：2的氨基酸具有至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％、并且最优选至少95％的氨基酸序列同一性，并且能够组装成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，优选组装成VLP；或在不同AAV血清型或其变体的VP2的类似位置；优选在氨基酸位置R451和G316或在不同AAV血清型的VP2的类似位置。替代地，优选的是一个或多于一个LCAR的插入位点是选自以下的一个、两个或多于两个插入位点：根据SEQ ID NO：3的VP3或其变体的S59、A64、N179、R245、T246、G251、R257、R269、F332、T371、Q382、N385、R386、A389、P455、A462、T511或T514，优选R386，该变体与SEQ ID NO：3的氨基酸具有至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％的氨基酸序列同一性，并且能够组装成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，优选组装成VLP；或在不同AAV血清型或其变体的VP3的类似位置；优选在氨基酸位置R386和G251或在不同AAV血清型的VP3的类似位置。在本文中，术语“插入位点”是指LCAR多肽插入特别指出的氨基酸残基的C端。因此，在位点K24处插入氨基酸序列LLLL将在VCP内产生以下氨基酸序列：KLLLL。插入也可能伴随着VCP的其他氨基酸序列的缺失。

因此，在特定的实施方案中，LCAR包含在另一AAV血清型的VP1中，其氨基酸位置类似于根据SEQ ID NO：1的AA2 VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716之一。如上所述，术语类似位置是指另一种血清型的AAV的VP1中的氨基酸，其在比对时与AAV2的VP1的氨基酸之一对齐(见图12)。因此，优选地，LCAR处于与根据SEQ ID NO：19的AAV1的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ IDNO：20的AAV3a的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：21的AAV3b的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：22的AAV4的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：23的AAV5的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQID NO：24的AAV6的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：25的AAV6.2的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：26的AAV7的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：27的AAV8的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：28的AAV9的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：29的AAV10的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：30的AAV11的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：31的AAV12的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：32的AAV13的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：33的AAV.rh.10的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；LCAR处于与根据SEQ ID NO：34的AAVrh32.33的VP1的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588类似的位置；

在一个特定的实施方案中，LCAR包含在天然存在的VP1蛋白的变体中，优选根据SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34的VP1蛋白的变体中。在一个特定的实施方案中，这样的变体与SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34的VP1蛋白具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性。在每种情况下，变体能够组装成壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，优选组装成VLP。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，优选地，一个或多于一个LCAR的一个、两个或多于两个插入位点C端的VP1的一个或多于一个氨基酸被删除。通常，VP1的5个至50个、6个至30个、7个至20个或8个至15个氨基酸被删除。优选地，缺失的氨基酸的数目对应于插入的LCAR氨基酸的数目。另外地或替代地，还优选地，在插入位点的C端或N端置换一个或多于一个氨基酸。更优选地，在插入位点的十个氨基酸内，置换在C端或N端被置换的一个或多于一个氨基酸。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，插入VCP序列中的LCAR在N端和/或C端侧接接头。接头的实例是短的多肽序列，例如，5个、10个、15个、20个和25个氨基酸残基长度。优选的接头包括丙氨酸/甘氨酸/丝氨酸接头。接头增加了在N端和/或C端侧接了接头的LCAR的柔性，并因此增加了其可及性，例如以结合至CAR。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，优选的是，插入VSP，优选VCP中的LCAR包含或组成为TSEA的一个、两个、三个或多于三个表面可接近的表位。优选地，该LCAR包含、基本上包含或组成为TSEA的50个或少于50个连续氨基酸，更优选地，LCAR包含、基本上包含或组成为5个至50个、6个至30个、7个至20个、8个至15个氨基酸。在更优选的实施方案中，LCAR包含9个至15个氨基酸，或由13个氨基酸组成。

优选地，TSEA，特别是LCAR不包含B细胞表位，并且优选地也不包含T细胞表位。这是优选的，因为在该实施方案中，经修饰的VSP、优选VCP或包含此类VSP、优选VCP的壳粒、衣壳、VLP、病毒载体或病毒不会引发免疫应答。因此，只要抗原的C端和/或N端缺失的变体仍被CAR特异性结合，就可以使用它们。

优选地，TSEA选自癌睾丸抗原，优选NY-BR1、MAGE-A1、IL13Ra2、NY-ESO-1；癌胚抗原，优选CEA、EphA2、PSCA、L1-CAM；分化抗原，优选CD19、CD20、CD2，2、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD70、CD123、CD138、CD171、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FAP、GPC3、HER2、间皮素、MG7、PSMA、gp100、αFR、CAIX、NKG2D-L、BCMA Igk、ROR-1、cMet、VEGFR-II；病毒抗原或改变的糖蛋白，优选AC133、MUC-1、GD2或Lewis-Y。甚至更优选地，肿瘤相关抗原是NY-BR1。TSEA的一个或多于一个表位在肿瘤细胞的表面上是可及的，即可以被免疫细胞，优选装备有CAR的T细胞结合。这是CART细胞疗法的必要条件，因为CAR原本不能与靶细胞结合。因此，在CART细胞疗法中，优选的LCAR包含、基本上组成为或组成为能够被CAR结合的TSEA的一个或多于一个表位。优选地，这样的LCAR不包含T细胞和/或B细胞表位。

在本发明的第一方面的另一个实施方案中，将本发明的VSP中包含的LCAR修饰为在与CAR相互作用的至少一个表位中包含Cys残基。如果被LCAR特异性结合的各个CAR在LCAR的Cys残基附近天然包含Cys残基或被工程改造为包含此类Cys残基，则两者可形成共价相互作用，从而增加LCAR与CAR之间的结合亲和力。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，LCAR选自单链抗体或单链抗体样蛋白。为了在调节CAR细胞疗法中有用，抗体与表达CAR的免疫细胞上的CAR特异性结合。在该实施方案中，特别优选地，抗体结合至CAR与其靶标特异性结合的部分，例如在CAR本身包含单链抗体的情况下，由VH和VL的CDR形成的蛋白质折叠。

在第二方面，本发明还涉及编码第一方面的VCP的核酸。

在第三方面，本发明还涉及包含至少一种根据第一方面的VSP、优选VCP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒。在本发明的第三方面的优选实施方案中，VLP包含本发明的第一方面的至少一种VCP。优选使用VLP和壳粒结构，因为它们具有相对长的生物学半衰期，并且需要较低的施用频率，而且与病毒载体或病毒相比，它们具有更好的安全性，因为它们不包含核酸并且是非感染性和非复制型的。

在另一个优选的实施方案中，病毒载体或病毒是非感染性的，即作为致病生物体的病毒不易通过环境传播，因此不再导致疾病。因此，优选地，病毒载体或病毒是不传播感染或任何其他疾病的突变体。还优选地，病毒载体或病毒是非复制型的。

在第四方面，本发明涉及药物组合物，其包含第一方面的VSP、优选VCP，第二方面的核酸，第三方面的包含至少一种根据本发明第一方面的VSP、优选VCP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，并且还包含一种或多于一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、填充剂、黏结剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。

在特定的实施方案中，第四方面的组合物包含治疗有效量的活性成分，即本发明的第一或第二方面的VSP、优选VCP或核酸，第三方面的包含纯化形式的至少一种根据本发明第一方面的VSP、优选VCP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，并且包含适量的载剂和/或赋形剂，以提供用于施用给患者的适当形式。该制剂应适合于施用方式。

药物组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。药物组合物可以与常规的黏合剂和载剂例如甘油三酯一起配制成栓剂。

为了制备本发明的药物组合物，药学上可接受的载剂可以是固体或液体。固体形式的组合物包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体赋形剂可以是一种或多于一种物质，它们也可以用作稀释剂、调味剂、黏结剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。在散剂中，赋形剂优选为细碎的固体，其与本发明的细碎的抑制剂混合。在片剂中，将活性成分与具有必要结合性质的载剂以合适的比例混合，并压制成所需的形状和大小。合适的赋形剂是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。为了制备栓剂，首先熔化低熔点蜡例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，并通过搅拌将活性成分均匀分散在其中。然后将熔化的均匀混合物倒入合适尺寸的模具中，使其冷却，从而固化。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适合经口施用的固体剂型。

液体形式的组合物包括溶液、混悬剂和乳剂，例如水、盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射(例如静脉内、动脉内、骨内输注、肌内、皮下、腹膜内、皮内和鞘内注射)，可以将液体制剂配制成溶液，例如聚乙二醇水溶液。当静脉内施用药物组合物时，盐溶液是优选的载剂。

在特定的实施方案中，药物组合物为单位剂型。以这种形式，可以将组合物细分为包含适当量的活性成分的单位剂量。

调整施用剂量以实现期望的CAR疗法的不良副作用的减少。由于在患者之间副作用的强度有所不同，因此可以单独调整剂量，直到实现期望的不良副作用减少为止。

单位剂型可以是包装的组合物，该包装包含离散量的组合物，例如包装的片剂、胶囊剂和小瓶或安瓿中的散剂。同样，单位剂型可以是胶囊、注射瓶、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可以是适当数量的任何包装形式的单位剂型。

如果需要，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。

此外，此类药物组合物还可包含其他药理活性物质，例如但不限于佐剂和/或其他活性成分。在本发明的上下文中，佐剂包括但不限于无机佐剂、有机佐剂、油基佐剂、细胞因子、颗粒佐剂、病毒体、细菌佐剂、合成佐剂或合成多核苷酸佐剂。

在本发明的第五方面，提供了根据第一、第二或第三方面的VSP、优选VCP、核酸、壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒以及根据本发明第四方面的药物组合物，其用于医药。

在特定实施方案中，医药用途是用于预防、治疗或诊断病症或疾病的用途，特别是用于预防、治疗或诊断肿瘤溶解综合征的用途。

本发明的第六方面涉及根据第一方面的VSP、优选VCP、根据第二方面的核酸、根据第三方面的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒、或本发明第四方面的药物组合物，其用于预防、减少或限制免疫应答。

特别优选地，预防、降低或限制的免疫应答是通过过继免疫疗法引发的。优选的过继免疫疗法包括T细胞疗法，优选CART细胞疗法。优选的预防、减少或限制的免疫应答是肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征、神经毒性、“靶向/非靶向肿瘤”识别、移植物抗宿主病(GVHD)和/或过敏反应。特别优选的是，免疫应答是细胞应答。优选地，治疗意味着改善有需要的对象的病症。优选地，可以防止或至少减少免疫系统的过度反应，例如细胞因子产生的增加。TLS的特征是肿瘤细胞大量死亡，从而导致发展出代谢紊乱和靶器官功能障碍，并伴随着大量细胞因子的释放。与TLS相关的释放的细胞因子是例如白介素，例如IL-6。

在第七方面，本发明涉及试剂套装，其包含含有根据本发明第一方面的至少一种VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒和经修饰的表达CAR的细胞，其中所述病毒载体或病毒是非感染性的，所述细胞被壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒特异性结合。

优选地，壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒以小于10μM的亲和力结合经修饰的细胞。

优选地，试剂套装还包括说明书，该说明书指出了壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒用于预防、减少或限制免疫应答，所述免疫应答优选由过继免疫疗法引起。

实施例

实施例1：野生型AAV和NY-BR1-LCAR AAV的产生和纯化

为了产生本研究中使用的NY-BR1 AAV衣壳插入突变体，将LCAR如先前所述插入到AAV的三个折叠的刺突区域中(Michelfelder等人(2011)PLoS ONE 6(8)：e23101.)。具体地，将编码氨基酸序列LKNEQTLRADQMF的寡核苷酸插入AAV2辅助质粒pMT-187-XX2中的VP1位置588(所得核酸编码具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的经修饰的VP1)、AAV5辅助质粒pMT-rep2cap5-SfiI578中的位置T578(所得核酸编码具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的经修饰的VP1)、AAV8辅助质粒p5E18-VD2/8-Sfi590中的位置N590(所得核酸编码具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的经修饰的VP1)和AAV9辅助质粒p5E18-VD2/9-Sfi589中的位置A589(所得的核酸编码具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的经修饰的VP1)。所得质粒构建体代替野生型(wt)AAV2辅助质粒用于产生NY-BR1 AAV生。通过无腺病毒的产生方法在HEK293T细胞中产生野生型AAV2和NY-BR1 AAV衣壳插入突变体。简而言之，使用PEI和每个15cm板44μg DNA进行三重转染，其中使用等摩尔比例的编码rep和cap蛋白的AAV辅助质粒、编码GFP的AAV载体质粒和腺病毒辅助构建体。转染后72h，通过反复的冻融循环裂解细胞，用Benzonase处理，并通过碘克沙醇逐步梯度离心进一步纯化。在55000rpm和4℃下离心3h后，收集含有AAV颗粒的40％相。使用转基因特异性引物，通过实时LightCycler PCR针对质粒标准品测定基因组颗粒滴度。根据制造商的说明(Progen GmbH)，使用抗衣壳抗体A20通过ELISA分析wt AAV2和NY-BR1 AAV2衣壳滴度。

实施例2：ELISA检测NY-BR1-LCAR AAV

根据确定的基因组滴度，将纯化的NY-BR1 LCAR AAV颗粒涂覆到

孔测定板(半孔)上。在4℃下在50μl的NaHCO₃缓冲液/孔中进行涂覆过夜。起始浓度为1x10⁹病毒基因组(VG)/ml，然后分6步连续2倍稀释颗粒。孵育后，将板用PBS-T(1xPBS+0.05％吐温20)以150μl/孔洗涤六次。通过在摇动装置上使用150μl/孔的封闭缓冲液(PBS-T中的3％BSA、5％蔗糖)在室温下孵育1小时来进行平板的封闭。将小鼠一抗(NY-BR-1 No.2-ThermoFisher订货号：MA5-12645)或可溶性LCAR(Morab2scFv-内部生产)以在30μlPBS-T中的1μg/ml终浓度添加到各个孔中，然后在振荡器上于室温孵育1h。之后，用PBS-T(150μl/孔)洗涤3次。相对于一抗添加二抗，对于NY-BR-1 No.2，使用抗小鼠IgG-HRP缀合物，对于可溶性LCAR，使用抗人IgG-HRP缀合物(两者均购自Santa Cruz Biotechnology，终浓度：1μg/ml，50μl/孔中)。将抗体在振荡器上于室温孵育1h，然后用PBS-T洗涤3次。通过在室温下添加TMB底物(100μl/孔)15分钟，然后添加终止溶液(1M的H₂SO₄，50μl/孔)来进行检测。OD450的读数是在Epoch多板读板仪(BioTek Instruments)上进行的。作为内标，按照A20 ELISA试剂盒(Progen GmbH)的制造商说明，在同一平板上进行标准抗AAV A20的ELISA。结果如图1至图3所示。

实施例3：在细胞系中NY-BR1-LCAR AAV下调NY-BR1 CAR

为了建立NY-BR1-CAR细胞系，用编码NY-BR1-CAR基因表达盒和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体转导1x10⁵个Jurkat细胞。为此，将Jurkat细胞接种到24孔细胞培养板的一个孔中的1ml DMEM培养基(含10％FCS)中，并以10的感染复数(MOI)添加纯化的慢病毒颗粒。在标准条件下(5％CO₂；37℃，潮湿的环境)孵育24h。之后，通过离心(300g；4min)洗涤细胞，并加入新鲜的DMEM培养基。转导后3天，进行CAR⁺细胞的筛选。洗涤Jurkat细胞，并用20ml含嘌呤霉素的DMEM培养基(最终浓度：2μg/ml)填充，将200μl细胞接种在96孔细胞培养悬浮板的每个孔中。在接种后约2周或3周生长出抗性克隆。

将所得的克隆在嘌呤霉素条件下进一步传代培养，并通过FACS分析CAR的表达。每次分析用5x10⁴个细胞进行，其中将细胞与APC缀合的抗人IgG1-Fc片段特异性抗体(1μg/ml，100μl；Jackson Immuno Research)在FACS缓冲液(PBS；1％FCS；2mM EDTA))中于4℃下孵育30min。离心洗涤后，将400μl的PBS加入FACS管，并用DAPI(终浓度3μM)对活细胞进行复染。使用

软件在FACS

设备(BD Biosciences)上完成CAR⁺细胞的检测。在相应克隆的95％至99％的细胞中观察到CAR表达。

为了确定LCAR-AAV下调CAR的水平，将CAR⁺-Jurkat细胞与按实施例1所述纯化的NY-BR1-LCAR-AAV一起孵育。将1x10⁵个CAR⁺-Jurkat细胞接种在24孔板的一个孔中的RPMI培养基中。之后，立即将每孔5x10⁸个NY-BR1-LCAR-AAV颗粒添加到细胞中，反映出MOI为5000。然后将细胞在标准条件下培养24h。之后，如上所述进行FACS分析。CAR下调的水平描述为与野生型(wt)AAV一起孵育相比，NY-BR1-LCAR-AAV孵育的Jurkat细胞中CAR表达的平均荧光强度(MFI)的变化(图4至图6)。

实施例4：细胞系中LCAR孵育后CAR激活的测量

为了测量由NY-BR1-LCAR-AAV颗粒引起的NY-BR1-CAR⁺Jurkat细胞的激活水平，确定了标记分子CD69的表达。将CAR⁺-Jurkat细胞与NY-BR1-LCAR-AAV颗粒和wt AAV颗粒在与实施例3中所述的相同条件下进行孵育(MOI 5000，24h，37℃)。将在没有任何AAV颗粒的情况下孵育的CAR⁺-Jurkat细胞用作基线对照。由PMA(20ng/ml)和洛诺霉素(1μg/ml)诱导过度激活，作为阳性对照。培养后立即将细胞转移至FACS管中，并用FACS缓冲液洗涤两次，然后与浓度为1μg/ml的100μl的FACS缓冲液中的抗CD69-PECy7抗体缀合物(克隆：FN50，BioLegend)在冰上一起孵育30min。如实施例3所述进行活细胞染色和FACS分析。激活水平确定为CD69-MFI相对于基线对照的增加(图7)。

实施例5：原代CAR T细胞中LCAR孵育后的下调和CAR激活

为了获得原代T细胞，从健康供体采集了约50ml的血样置于EDTA收集管中。将新鲜血液完全移液到50ml Falcon^TM管中的10ml Ficoll(Ficoll Paque^TM；GE Healthcare；密度：1.077)层上，并在无阻力的情况下以750g离心30min。之后，取出形成的淋巴细胞环，并在20ml的PBS中洗涤两次(在有阻力的情况下以300g离心4分钟)。通过在Neubauer-Chamber中计数来确定细胞数，并使用从Miltenyi Biotec获得的人Pan T细胞分离试剂盒II并按照制造商的说明进行CD3⁺T细胞的分离。分选后确定T细胞的数目，并将1x10⁶个细胞接种在1cm²的1ml激活培养基中，在37℃下培养24h。激活培养基由XVIVO20(Lonza)和100ng/ml的抗CD3抗体(克隆：OKT3；Janssen-Cilag)组成，并补充了300U/ml的白介素-2(

Novartis)。激活后，将T细胞在PBS中洗涤3次，并在培养基(XVIVO20；300U/ml的IL-2)中进一步孵育。分离T细胞后48小时，使用旋转接种法进行慢病毒CAR转导。因此，将细胞接种在

包被的24孔板(16μg/ml的

1x10⁶个CD3⁺细胞/ml/cm²)上，并以10的MOI加入编码CAR基因表达盒的慢病毒颗粒。将板在2000g和32℃下离心1.5h，然后在37℃下孵育24h。此后，除去含有病毒颗粒的培养基，并换成普通培养基。初始细胞分选后72h，如实施例3中所述通过FACS测定表达CAR的CD3⁺细胞的比率，不同之处在于此处将抗CD3-APC和抗人IgG1-Fc片段-PE(各自为1μg/ml)抗体缀合物用作检测物。为了确定NY-BR1-LCAR-AAV颗粒对原代CD3⁺CAR⁺细胞的功能，将上述生成的细胞与其各自的AAV颗粒一起孵育，如实施例4所述。如实施例3中所述进行CAR下调的测量，并且将下调水平与用wt AAV颗粒孵育的下调水平进行比较(图8)。将来自该实验的共孵育的T细胞的上清液从培养物中取出并保存，以用于激活水平的分析，其也在图8中示出。在这种情况下，激活被确定为培养上清液中干扰素γ的量，并根据制造商的说明通过BD OptEIA^TM人IFNγELISA试剂盒(BDBiosciences)进行检测。

实施例6：不同LCAR-AAV血清型转导后的CAR下调

如实施例1中所述产生并纯化wt AAV2和AAV血清型2、5、8和9，这些血清型在AAV2中的位置588以及在AAV8、AAV9和AAV5中的类似位置处显示出NY-BR1 LCAR。将每孔1x10⁵个CAR⁺-Jurkat细胞接种在24孔板的RPMI培养基中。将每孔5x10⁸个NY-BR1-LCAR-AAV基因组颗粒添加到细胞中，反映出MOI为5000。然后将细胞在标准条件下培养24h。如上所述，使用抗人IgG-APC抗体通过FACS检测CAR表达。图9将CAR下调的水平显示为与未经处理的样品相比，NY-BR1-LCAR-AAV或wt AAV2孵育的Jurkat细胞中CAR表达的平均荧光强度(MFI)的变化。

实施例7：用于评估NY-BR1 LCAR长度变化的CAR结合测定法。

NY-BR1 LCAR序列LKNEQTLRADQMF分为重叠的4聚体和8聚体，并被C端和N端氨基酸延长至20聚体，以改变所展示的LCAR的长度(见图10)。将编码相应氨基酸序列的寡核苷酸插入AAV2辅助质粒pMT-187-XX2中的VP1位置588。通过无腺病毒的产生方法在HEK293T细胞中产生了粗AAV裂解物。简而言之，使用PEI和2.6μg DNA每孔的6孔板进行三重转染，其中使用等摩尔比例的编码rep和cap蛋白的AAV辅助质粒、编码GFP的AAV载体质粒和腺病毒辅助构建体。转染后72小时，通过每孔100μl PBS中的反复冻融循环来裂解细胞，并全速离心。小心地取出含有AAV颗粒的上清液(即，粗AAV裂解物)。根据制造商的说明，将链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynabeads，Invitrogen)与A20-生物素缀合物偶联，然后加入等量的粗AAV裂解物，其展示出各种长度的NY-BR1 LCAR。为了定量LCAR AAV与可溶性CAR的结合，以0.5μg/ml的浓度添加NY-BR1特异性scFv-Fc融合蛋白。与二抗抗hu-IgG-PE抗体孵育后，通过FACS分析检测PE阳性磁珠-AAV-抗体复合物。在图10中，PE阳性复合物的百分比定义为CAR结合[％]。

实施例8：粗裂解物中完整AAV颗粒的夹心ELISA

将AAV2特异性A20小鼠杂交瘤上清液涂覆到

96孔测定板(半孔)上。孵育后，将板用PBS-T(1xPBS+0.05％吐温20)以150μl/孔洗涤3次。通过在摇动装置上与150μl/孔的封闭缓冲液(PBS-T中的3％BSA、5％蔗糖)在室温下孵育1小时进行平板的封闭。洗涤并封闭后，以2倍连续稀释添加AAV粗裂解物或wt AAV2标准品，并在室温下孵育1h。如上所述洗涤后，将生物素缀合的A20以0.6μg/ml加入封闭缓冲液中。此后，如上进行洗涤，然后与链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物在室温下一起孵育1h，然后用PBS-T洗涤3次。通过在室温下添加TMB底物(100μl/孔)15分钟，然后添加终止溶液(1M的H₂SO₄，50μl/孔)来进行检测。OD450的读取是在Epoch多板读板仪(BioTek Instruments)上进行的。通过线性回归计算得出衣壳滴度，如图10所示。

实施例9：加入CAR T细胞后10h至20h的CAR介导的杀伤的特异性抑制。

从腹水中获得原代乳腺癌细胞，将其培养7天，并通过FACS分析NY-BR1的表达(还命名为靶细胞)。如实施例5所述，分离来自健康供体的原代T细胞并用含有NY-BR1 CAR表达盒的慢病毒转导(还称为效应细胞)。为了分析NY-BR1特异性CAR T细胞的裂解能力以及NY-BR1-LCAR AAV对它们的影响，将靶细胞接种在E-板96上(20000个细胞/孔，每种条件一式三份)。将E-板放入xCelligence实时阻抗测量设备(ACEA Biosciences Inc.)中，设置每5分钟进行一次读数。在设备中培养12小时后，靶细胞的数量增加了一倍，以效应细胞比靶细胞为1∶1的比例(40000个CAR阳性T细胞/孔，一式三份)添加效应细胞。此外，将共培养物分为两组，一组保持不变，另一组以每个CAR T细胞5000 MOI的基因组颗粒补充NY-BR1-LCARAAV颗粒。阻抗测量再继续进行40小时，并通过RTCA软件记录为细胞指数。在实验结束时，将细胞指数相对于效应细胞添加的时间点进行归一化，并以未处理对照的归一化细胞指数的百分比计算靶细胞的比活力。如图11所示，随时间绘制了带有或不带有NY-BR1-LCAR AAV的遇到CAR效应细胞的靶细胞的平均生存力。

实施例10：在有或没有肝素的情况下，wt AAV和NY-BR1-LCAR AAV与具有和没有NY-BR1 CAR的Jurkat细胞的结合

Wt AAV2或NY-BR1-LCAR AAV2的2E9衣壳在室温下与250μl的20IU/ml肝素预孵育30分钟。将2E5 wt Jurkat细胞或NY-BR1 CAR⁺Jurkat细胞接种到24孔板的每孔250μl冰冷的RPMI培养基中。添加具有或不具有肝素的AAV，并将混合物在冰上孵育1h。然后，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并重悬于100μl冰冷的PBS中。加入0.6μg/ml的A20生物素缀合物(Progen)，并在冰上孵育1h。然后，将细胞再次用冰冷的PBS洗涤，并重悬于100μl冰冷的PBS中。加入链霉抗生物素蛋白-Alexa488缀合物，并在冰上孵育30min。此后，再次用冰冷的PBS洗涤细胞，用DAPI对死细胞进行染色，并通过活细胞的FACS分析来定量结合的AAV(图13)。

Claims (18)

1.一种病毒结构蛋白(VSP)，其中：

(i)VSP任选地与一种或多于一种其他VSP一起能够形成壳粒结构、衣壳、病毒样颗粒(VLP)、病毒载体或病毒，

(ii)VSP在位于所述壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒的表面上的区域中包含至少一种特异性结合嵌合抗原受体的配体(LCAR)，并且其中LCAR是多肽。

2.根据权利要求1所述的VSP，其中VSP是选自以下的病毒的VSP：

(i)双链DNA病毒，

优选肌病毒科、长尾病毒科、短尾病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、杆状病毒科、乳头瘤病毒科、多分体DNA病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科；

(ii)单链DNA病毒，

优选指环病毒科、丝杆状病毒科、细小病毒科；

(iii)双链RNA病毒，

优选呼肠孤病毒科；

(iv)单链RNA病毒，

优选冠状病毒科、微小RNA病毒科、杯状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、星状病毒科、动脉炎病毒科、戊型肝炎病毒科；

(v)反义单链RNA病毒，

优选沙粒病毒科、丝状病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、正黏病毒科、博尔纳病毒科；

(vi)单链RNA逆转录病毒，

优选逆转录病毒科；

(vii)双链DNA逆转录病毒，

优选花椰菜花叶病毒科、嗜肝DNA病毒科。

3.根据权利要求1或2所述的VSP，其中VSP是细小病毒科病毒的病毒外壳蛋白(VCP)，优选地，VSP来自腺相关病毒(AAV)，优选人AAV、牛AAV(b-AAV)、犬AAV(c-AAV)、山羊AAV、或禽AAV(AAAV)；犬细小病毒(CPV)；小鼠细小病毒；小鼠微小病毒(MVM)；细小病毒B19(B19)；细小病毒H1(H1)；人博卡病毒(HBoV)；猫泛白细胞减少症病毒(FPV)；或鹅细小病毒(GPV)。

4.根据权利要求3所述的VSP，其中AAV是AAV-1、AAV-2、AAV-2-AAV-3杂合体、AAV-3a、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-6.2、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAVrh.10、AAV-11、AAV-12、AAV-13或AAVrh32.33或其嵌合体。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的VSP，其中VCP选自VP1、VP2和VP3。

6.根据权利要求5所述的VSP，其中在以下位置插入一个或多于一个LCAR：

(i)选自以下的一个、两个或多于两个氨基酸位置(插入位点)：根据SEQ ID NO：1的VP1或与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的其变体的M1、P34、T138、A139、K161、S261、A266、N381、R447、T448、G453、R459、R471、F534、T573、Q584、N587、R588、A591、P657、A664、T713或T716，优选R588；或不同AAV血清型或其变体的VP1的类似位置；优选氨基酸位置R588和G453或不同AAV血清型的VP1的类似位置，或

(ii)选自以下的的一个、两个或多于两个插入位点：根据SEQ ID NO：2的VP2或与SEQID NO：2具有至少90％序列同一性的其变体的M1、A2、K24、S124、A129、N244、R310、T311、G316、R322、R334、F397、T436、Q447、N450、R451、A454、P520、A527、T576或T579，优选R451；或不同AAV血清型或其变体的VP2的类似位置；优选氨基酸位置R451和G316或不同AAV血清型的VP2的类似位置，或

(iii)选自以下的的一个、两个或多于两个插入位点：根据SEQ ID NO：3的VP3或与SEQID NO：3具有至少90％序列同一性的其变体的S59、A64、N179、R245、T246、G251、R257、R269、F332、T371、Q382、N385、R386、A389、P455、A462、T511或T514，优选R386；或不同AAV血清型或其变体的VP3的类似位置；优选氨基酸位置R386和G251或不同AAV血清型的VP3的类似位置，

和/或

其中优选地，LCAR在C端和/或N端侧接接头序列。

7.根据权利要求6所述的VSP，其中：

(i)一个、两个或多于两个氨基酸插入位点的VP1C端或N端的一个或多于一个氨基酸被删除，和/或

(ii)在插入位点的C端或N端，优选在插入位点的十个氨基酸内置换一个或多于一个氨基酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的VSP，其中：

(i)LCAR包含或组成为肿瘤表面暴露的抗原(TSEA)的至少一种表位，和/或

(ii)LCAR选自特异性结合CAR的细胞外部分的单链抗体或单链抗体样蛋白。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的VSP，其中TSEA选自癌睾丸抗原，优选NY-BR1、MAGE-A1、IL13Ra2或NY-ESO-1；癌胚抗原，优选CEA、EphA2、PSCA或L1-CAM；分化抗原，优选CD19、CD20、CD2，2、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD70、CD123、CD138、CD171、DLL3、EGFR，优选EGFRvIII、EpCAM、FAP、GPC3、HER2、间皮素、MG7、PSMA、gp100、αFR、CAIX、NKG2D-L、BCMA Igk、ROR-1、cMet或VEGFR-II；病毒抗原或改变的糖蛋白，优选AC133、MUC-1、GD2或Lewis-Y。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的VSP，其中LCAR的长度为6个至50个氨基酸。

11.一种核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的VSP。

12.一种包含至少一种根据权利要求1至10中任一项所述的VSP的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其中所述病毒载体或病毒是非感染性的。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的VSP、根据权利要求11所述的核酸、根据权利要求12所述的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其用于医药。

14.根据权利要求1至10中任一项所述的VSP、根据权利要求11所述的核酸、根据权利要求12所述的壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其用于预防、降低或限制免疫应答，所述免疫应答优选由过继免疫疗法引起，更优选由CAR细胞疗法引起。

15.根据权利要求14之用途的VSP、核酸、壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒，其中所述免疫应答是细胞免疫应答。

16.一种试剂套装，其包括含有至少一种根据权利要求1至10中任一项所述的VSP的壳粒结构、衣壳、VIP、病毒载体或病毒，和表达CAR的经修饰的细胞，其中所述病毒载体或病毒是非感染性的，所述经修饰的细胞与壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒特异性结合。

17.根据权利要求16所述的试剂套装，其中壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒以小于10μM的亲和力与经修饰的细胞结合。

18.根据权利要求16或17所述的试剂套装，其还包括说明书，所述说明书指出了壳粒结构、衣壳、VLP、病毒载体或病毒用于预防、减少或限制免疫应答的用途，所述免疫应答优选由过继免疫疗法引起。

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