JP2018533949A - ファージミドベクター - Google Patents
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Abstract
Description
ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTT
[配列番号1]
TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA
[配列番号2]
ACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCC
[配列番号3]
CCCGGGGGCCCAACGTGAGGGGAGGACCTGGACGGTTACCGGCGGAAACGGTTTCCAGGTGAGAGGTCACCCGAGGGACAGGCAGCTGCTCAACCAATAGGACCAGCTCTCAGGGCGGATGCTGCCTCTCATTGGCGGCCGTTAAGAATGACCAGTAGCCAATGAGTCGGCTGGGGGGCGCGTACCAGTGACGTGAGTTGCGGAGGAGGCCGCTTCGAATCGGCAGCGGCCAGCTTGGTGGCATGAACCAACCAGCGGCCTCCAACGAGTAGCGAGTTCACCAATCGGAGGCCTCCACGACGGGGCTGCGGGGAGGATATATAAGCCGAGTCGGCGACCGGCGCGCTCGATACTGGCTGTGACTACACTGACTTGGAC
[配列番号8]
ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTT
[配列番号4]
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[配列番号5]
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
[配列番号6]
(i)原核宿主内で存続するように構成された第1のベクターであって、少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、及びベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターと、
(ii)一本鎖DNAをパッケージングし、原核宿主からの組換えファージミド粒子の形成及び排出をもたらすために必要とされる構造タンパク質をコードする核酸を含む第2のベクターと、を含む、系を提供する。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC−−−導入遺伝子−−−AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
[配列番号9]
AACGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTTGTGATTGTAGGGGGGATTGTTTTTGTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGTTCAATTCCTTCCATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCACCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTCTACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCG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[配列番号10]
AACGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGTTCAATTCCTTCCATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCACCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTCTACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGCTATCAGTTCGCGCAT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[配列番号11]
(i)原核宿主内で存続するように構成された第1ベクターであって、少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、及びベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1ベクターを原核宿主細胞に導入する工程と、
(ii)バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを宿主に導入する工程と、
(iii)構造タンパク質によってパッケージングされている一本鎖DNAが原核宿主から組換えファージミド粒子を形成し、排出することになる条件下で、宿主を培養する工程と、を含む、方法を提供する。
(i)原核宿主細胞に、(a)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、及びベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む第1のベクターと、(b)一本鎖DNAをパッケージングするために必要とされる構造タンパク質をコードする核酸を含む第2のベクターとを導入する工程と、
(ii)構造タンパク質によってパッケージングされている一本鎖DNAが原核宿主から組換えファージミド粒子を形成し、排出することになる条件下で、宿主を培養する工程と、を含む、方法を提供する。
好ましくは、アミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも85%の同一性、より好ましくは本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも92%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98%の同一性、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
遺伝子送達技術の開発は、基礎研究の社会への成功を収める転換に有益である。過去10年間に、多数のウイルス及び非ウイルスベクターが、産業及び治療用途の潜在的な送達ベクターとして出現した。ベクターの重要な特性は、遺伝子を送達するのに有効であることに加えて、容易に産生され、商業的に実行可能でなければならないということである。2006年に、Hajitouらは、アデノ随伴ウイルス/ファージ(AAVP)と呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)と糸状バクテリオファージ(ファージ)との間のハイブリッドを作成することによってそのようなベクターの必要性を満たすことを試みた(Nature protocols 2,523−531(2007);Cell 125、385−398(2006))。得られるAAVPベクターは、哺乳動物及び原核生物ウイルスの好ましい特性を有するが、それらの個々のベクターが通常保有する欠点を受けない。しかしながら、有意な改善の余地をまだ残しているAAVPベクターの特定の局面が存在する。とりわけ、これには、その生産及び治療特性に影響を及ぼすベクターの遺伝子設計が含まれる。最終的に、これは、哺乳動物ウイルスと比較した場合、AAVPの比較的低い遺伝子導入効率をもたらす。
1.ハイブリッドファージミド−AAVベクター(PAAV)粒子発現系を設計し構築し、
2.ファージミド/AAVベクター(PAAV)が、以下を含むがこれに限定されない様々な段階で、既知のAAVP系よりも遺伝子導入においてより効率的であるかどうかを特徴付け、決定し、
a.細胞表面への結合、
b.細胞表面からのベクターの内在化、
c.ベクターゲノムの宿主核への転位、及び
d.組換え導入遺伝子発現、
3.ハイブリッドファージミドPAAVベクター系が、哺乳動物プロデューサー細胞株からrAAVを産生することができるかどうかを決定した。
図2を参照すると、本発明のヘルパーファージゲノム及びファージミドゲノム(PAAV DNA)の実施形態が示されており、これらは図1にも示されているように、原核生物における発現に際して共に一緒にしてファージミド−AAV(PAAV)粒子を産生する。構造遺伝子は、ウイルス粒子へのDNAのパッケージングに不可欠であり、以下に詳述する複製欠損ヘルパーファージによって供給される。ファージミドゲノムは、ヘルパーファージに対して極めて寄生的であり、複製及びパッケージングの両方において、それが複製欠損ヘルパーファージを打ち負かすことを意味する。
ここで図3を参照すると、2つの複製起点及び2つの他の遺伝子要素を含むプラスミドであるファージミドゲノムの1つの実施形態が示されている。ファージミドゲノムは、原核生物(例えば、細菌)宿主内でのその複製及びヘルパーウイルスによってレスキューされたときのファージミド粒子へのパッケージングの両方を促進するために、2つの複製起点を必要とする。
図7を参照すると、ヘルパーファージ(本明細書においてM13KO7と呼ぶ)は、図3に示すファージミドゲノムを保有及び/または含有する原核宿主からファージミド粒子(すなわちPAAV)をレスキューするために特別に設計されたバクテリオファージである。へルパーファージは、破壊された複製起点(p15a、中程度のコピー数)及び、ファージ粒子にそれ自身のパッケージングする能力を著しく低下させるパッケージングシグナルを含む。その結果、ファージミドゲノムは、複製及びパッケージングの両方において、ヘルパーファージを打ち負かすであろう。
本発明者らは、ファージミド−AAVベクター(PAAV)粒子を製造するための2つの異なる方法(方法1及び2)を発明し、これらを図9及び10に示す。
−TG1:繁殖因子(F’線毛)を保有するE.coli株。
−2xYT:TG1 E.coliを培養するために使用される液体ブロス。
−カナマイシン:ヘルパーファージ上に存在する抗生物質耐性選択マーカー。
−アンピシリン:ファージミドベクター上に存在する抗生物質耐性選択マーカー。
−TYEトップアガー:TG1 E.coliを培養するために使用される固体培地で、1.25%細菌用寒天の添加により2xTYから適合させた。
図9を参照すると、
1.1%グルコースを補充した2xYT(100μg/mLアンピシリン)60mlに4〜5mlの前培養(一晩)のPAAVゲノムを保有するTG1 E.coliを加える。
2.シェーカー(250 RPM)中37°で培養物をインキュベートする。
3.OD600が0.5〜0.8(対数期)の範囲になってすぐに、少なくとも1×1010のヘルパーファージ(M13KO7)の形質導入単位を培養物に添加する。
4.混合のため反転させる。37°で30分間インキュベートする。
5.ステップ3からの感染したスターター培養物を、1%グルコースを補充した2xYT(100μg/mLアンピシリン+25μg/mLカナマイシン)を含む2Lフラスコに最終容量400〜450mLまで注ぐ。
6.オービタルシェーカーで37°、250rpmで16〜20時間一晩インキュベートする。
7.培養上清からのファージミド(PAAV)粒子を精製する。
図10を参照すると、
パート1:コンピテントプロデューサー細胞株の産生
1.ヘルパーヘッジM13KO7由来のssDNAゲノムでTG1コンピテントE.coli(Zymo Research、USA)を形質転換し、TYEトップアガー(50μg/mLカナマイシン)に蒔き、
1.個々のコロニーを選択し、1%グルコースを補充した5mL 2xYT培地(50μg/mLカナマイシン)に接種する。
2.オービタルシェーカーで37°、250rpmで16〜20時間一晩インキュベートする。
3.市販の抽出キット(QIAGEN、オランダ)を使用して5mLの一晩培養物からDNAを抽出し、DNAラダーに対して1%アガロースゲル(100ボルト、2.5mA)で泳動させることにより、真の陽性形質転換体を確認する。
4.公表されたプロトコル(Krantz et al.,UC Berkeleyにより出版されたものに適合)を用いて、工程4で同定された正確な形質転換体から化学的にコンピテントな細胞を調製する。
1.パート1で作成したコンピテント細胞株をファージミド/AAVゲノムで形質転換し、TYEトップアガー(100μg/mLアンピシリン+50μg/mLカナマイシン)に蒔く。
2.コロニーを選択し、1%グルコースを補充した5mL 2xYT(100μg/mLアンピシリン+50μg/mLカナマイシン)に接種する。
3.オービタルシェーカーで37°、250rpmで4時間インキュベートする。
4.ステップ3の感染したスターター培養物を、1%グルコースを補充した2xYT(100μg/mLアンピシリン+25μg/mLカナマイシン)を含む2Lフラスコに、400〜450mLの最終容量まで注ぐ
5.オービタルシェーカーで37°、250rpmで一晩16〜20時間インキュベートする。
6.培養上清からのファージミド粒子を精製する。
1温かい一夜培養物を遠心分離ボトルに移し、3300G、4°で30分間遠心分離することによって細菌をペレット化する。
2.ペレットを捨て、上清を清潔な遠心分離ボトルに移す。
3.各ボトルに上清の30%容量を氷冷20%PEG−8000/2.5M NaClと共に加え、混合のため渦状撹拌する。
4.氷上で4〜24時間インキュベートする。
5.10000G、4°で30分間の遠心分離によりファージミド粒子を沈殿させる。上清を捨てる。
6.ファージミド粒子ペレットを10000G、4°で1分間遠心分離して乾燥させる。
7.PEG/NaClで残りの上清を除去する。
8.ファージミド粒子ペレットを0.5−2mLのPBSに再懸濁する。
9.再懸濁したファージミド粒子調製物を0.45ミクロンのフィルターを用いてろ過する。
10.調製物を4°に保つ。この調製物は4°で2年まで安定である。25%グリセロールストックは無期限に−80°で保存することができる。
実施例1及び2は、ファージミド−AAVベクター(PAAV)粒子及び2つの産生方法を産生するために必要とされる本発明の構成要素(すなわち、図3に示すファージミドゲノム及び図7に示すヘルパーファージ)を記載する。一旦製造され、精製されると、PAAV粒子は、遺伝子治療などの使用範囲を有することができる。
遺伝子治療に加えて、本明細書に記載のPAAVP粒子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を産生するための新規な方法に使用することができる。ファージ誘導AAV産生は、大量のdsDNAをパッケージングするファージミド粒子の能力を利用する。典型的なAAV産生系は、組換えAAV粒子の産生に一緒に機能するrAAV、rep−cap及びアデノヘルパー遺伝子の3つの主要な要素からなる。本発明者らは、2つの異なる戦略を考案した。
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地。
FBS:胎児ウシ血清、成長補助剤。
完全培地:DMEM+10%FBS。
EDTA:エチル−ジアミン四酢酸、タイトジャンクション形成に必要なカルシウムイオンを隔離することによって細胞を解離するために使用されるイオンキレーター。
GlutaMax:成長補助剤、L−グルタミンの類似体。
1.15cm組織培養プレート中の完全培地(10%FBS、20mM GlutaMax、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を補充したDMEM)に、HEK293細胞を播種し、80%コンフルエンスに達するまで、最低48時間、増殖させる。
2.ファージミド/AAV、rep−capファージミド及びアデノヘルパーファージミドを混合して全体積5mL未満で1:1:1の形質導入単位比を達成するか、または、1細胞あたり百万個の形質導入単位を達成するために統合されたベクター(単一粒子中に3つの要素をすべて含む単一ベクター)を分取する。
3.ステップ3で作製した形質導入混合物に、等容量の無血清DMEM(20mM GlutaMaxで補充)を添加する。
4.混合のため反転させる。室温で15分間インキュベートする。
5.ステップ1で蒔いたHEK293細胞をPBSで洗浄し、3回繰り返す。
6.形質導入混合物を加え、穏やかに渦状撹拌して混合物を均一に分散させる。
7.細胞培養インキュベーター中、37°、5%CO2で72時間インキュベートする。
a.形質導入混合物との6時間のインキュベーションの後、等体積の完全培地(10%FBS、20mM GlutaMax、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を補充したDMEM)を補充する。
b.24時間後、培地を完全培地(10%FBS、20mM GlutaMax、ペニシリン/ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸が補充されたDMEM)と交換する。
1.0.5M EDTA溶液を組織培養プレート中の培地に0.010Mの最終濃度まで添加し、室温で5分間インキュベートする。
2.細胞と培地を吸引し、粉砕し、50mL遠心分離管に移す。
3.1500RPM、5分間、室温で遠心分離することにより細胞をペレット化する。
a.オプション:さらなるAAV精製のために上清を回収する。
4.2〜5mLの無血清DMEMに細胞ペレットを再懸濁する。
5.エタノール−ドライアイスバス及び37°に設定された水浴中で4回の凍結−解凍サイクルを行うことによって、懸濁液中の細胞を溶解する。
6.室温で10分間、10000Gで細胞ライセートを遠心分離する。
a.定量/さらなる精製/濃縮のための上清を分取する。
b.ペレット(破片)を捨てる。
図16を参照すると、本発明者らは、PAAVを用いたAAV粒子のインサイチュ生産のための方法を発明した。
透過型電子顕微鏡法
粒子を特徴付ける際に、本発明者らはファージミドベースのベクター系を使用する場合、ベクターサイズが実質的に減少することを示すためにPAAV粒子を画像化した。透過型電子顕微鏡法を用いて、本発明者らは、ウラニルアセテートでネガティブ染色した後、メッシュ銅TEMグリッド上の本発明のPAAV及び既知のAAVP粒子の長さを画像化し、測定した(図17参照)。平均AAVP粒子は長さが1455.02nmであり(図17A)、本発明による典型的なPAAV粒子は長さがわずか729.96nmであり(図17B)、これは粒子サイズの約50%の減少に相当することが分かった。PAAV粒子(典型的には1186.03nm、図17B)を産生するために使用されるヘルパーファージと比較して、相対ベクターサイズはヘルパーウイルスよりも約38%短い。
結合後、ベクターは標的細胞による受容体介在性エンドサイトーシスを受ける。ベクター内在化の潜在的な差異を調べるために、本発明者らは、フローサイトメトリー(図18参照)を用いて、2つの時点(2時間、2H;4時間、4H)における標的細胞の内在化ベクターの数をアッセイした。両方の細胞株でAAVPと比較した場合、PAAVベクターは2時間でより効果的に内在化され(中央値蛍光強度(MFI)=1031.7、AAVPよりも335高い、p<0.05)、そして4時間で全体的な程度がより大きく内在化することが見出された。PAAVの2時間でのMFIは、AAVPより293AAVで335及びU87細胞で207(p<0.05)有意に高かった。形質導入の4時間後、この差は293AAV(829MFI、p<0.05)では有意に大きかったが、U87(157MFI、有意ではない)ではそれほど少なかった。全体として、MFIはPAAV1処理細胞について2092(293AAV、p<0.05、図18A)及び1137(U87、図18B)でピークに達し、AAVPよりも有意に高く、それぞれ1063(293AAV)及び980(U87)でピークに達した。このデータは、PAAVが両方の細胞株における両方の時点について内在化の速度及び程度においてAAVPより一貫して良好に実施されたことを実証する。
ベクター内在化の差異が遺伝子発現の増加につながるかどうかを調べるために、本発明者らは、RGD及びNT PAAV.GFP及びAAVP.GFPベクターを用いてGFP発現アッセイを行った(図19参照)。この実験において、それらをまた、WO2014/184529に記載されているように、カチオン性ポリマーDEAE.DEXTRAN(Dex)の添加がPAAVベクターのバイオアベイラビリティー及びエンドソームエスケープを増加させることにより遺伝子導入を増強できるかどうかを試験した。形質導入の9日後、細胞をトリプシン処理し、計数し、フローサイトメーターを用いて分析した。ベクター形質導入を補助するためにDexを使用したかどうかに関わらず、導入遺伝子の発現は一般にU87よりも293AAV細胞で高かった。ベクターのみを使用する場合、標的RGD.PAAV.GFPベクターは、AAVPと比較して、より高い有効性(それぞれ293AAV及びU87細胞におけるGFP+ve細胞で7.7%、p<0.01及び1.4%、p<0.05)で標的細胞に形質導入し、これは293AAV及びU87細胞でそれぞれ2.44倍及び1.56倍の増加となる(図19A、C)。
本発明者らは、PAAV及びファージミド由来のベクターが市販のプロデューサー細胞株においてrAAVを産生するために使用できるかどうかを評価するために、通常、遺伝子導入のためのトランスフェクションを必要とする3つの標的化ベクターで293AAV細胞を形質導入した。彼らは、細胞溶解物からrAAV粒子を採取し、ファージミド誘導形質導入後の3つの時点(図20A)にわたってmL当たりrAAV遺伝子コピー数(GC)を定量化することができた。FuGene6(トランスフェクション試薬、3.99e11 GC/mL、図20B)による従来のトランスフェクションと比較すると、ファージミド誘導rAAV産生は、rAAV収量において168時間(7.69e11 GC/mL、図21A)で1.9倍以上の増加をもたらす。ファージミド誘導遺伝子導入は、(トランスフェクションとは異なり)広範囲の細胞内プロセシングを必要とするため、ウイルス遺伝子を発現させて機能性粒子にパッケージングするのにより長い時間を必要とする。しかしながら、同じ72時間の時点で収率を比較すると、トランスフェクションはファージ誘導rAAV産生より1.76e11 GC/mL高い値を示した。すべての時点でのトランスフェクションまたはファージミド誘導産生皿からの1mLの培養上清あたりのrAAV収率は、観察可能な傾向はなくおよそ8〜9e10 GC/mLであった(データは示さず)。
トリペプチドRGDは、フィブロネクチンを含む細胞外マトリックスのタンパク質に見出される。インテグリンは、αVβ3インテグリンへの細胞接着部位においてフィブロネクチンに位置するRGDモチーフに結合することによりフィブロネクチンの受容体として働き、組換えファージミド粒子のpIII少数コートタンパク質に9アミノ酸変異を順に誘導したその特異性をαVβ3及びαVβ5インテグリンを発現する腫瘍細胞及び血管新生腫瘍関連内皮細胞に付与する。したがって、第2のベクターのゲノムは、RGD4C標的ペプチド(CDCRGDCFC−配列番号7)を含む。
プロトコル:
HEK細胞を、完全培地(DMEM、10%FCS、1%グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)中48ウェルプレートに蒔き、70〜80%コンフルエンスに達するまで少なくとも48時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、無血清培地(DMEM)に懸濁したハイブリッドファージ/ファージミドベクターで12時間形質導入した後、培地に完全培地を補充した。ルシフェラーゼ発現は、調製したQuanti−luc(InvivoGen、USA)試薬50μLに10μLの培地を加えることによって測定した。ルミノメーター(promega、USA)を備えたプレートリーダーを用いて光の放出を測定した。
プロトコル:
293AAV細胞を、完全培地(DMEM+10%FCS、1%グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)中24ウェルプレートに蒔き、最低48時間、70〜90%コンフルエンスに到達させた。細胞を500μLのPBSで2回洗浄し、氷上に置き、200μLの無血清DMEMに懸濁した200000TU/細胞(形質導入単位/細胞)のPAAVベクターで形質導入した。氷上で1時間インキュベートした後、培地をウェルから回収し、ファージミド粒子の量をTG1 E.coliで滴定し、コロニー計数によって定量化した。
標的PAAVベクターは、商業的及び疾患細胞株の両方における遺伝子導入において、AAVPベクターよりも効率的であることを示唆する強力な証拠がある。内在化と遺伝子発現の両方のデータは、PAAVがAAVPよりも効率的であることを一致して示している。遺伝子導入において、それについてのAAVPを上回るDexとPAAVベクターとの間に強い相乗効果があることを示唆する証拠も提供される。これらのデータは、PAAVがAAVPよりも優れていることを示唆しているが、PAAVベクター試料がヘルパーファージ汚染を含むとも考えなければならない。ベクター産生中の実験条件を最適化する努力にもかかわらず、ヘルパーファージの混入は(この場合、約1/10)避けられず、その小さなコートタンパク質上にRGDターゲティング配列をもディスプレイするので、形質導入を競合的に阻害する。これを考慮すると、内在化と遺伝子発現データは、RGD.PAAVの「真の」効能を非常に過小評価している可能性がある。さらに、内在化アッセイはシグナル検出のための細胞内ファージカプシドの染色を利用するため、PAAVの全体的なサイズ(及び粒子当たりの利用可能なカプシドタンパク質)が小さいことは、内在化粒子の比例数が、TEMを用いてPAAV粒子と比較して2倍の長さであることを示しているAAVPの比例数と直接比較できないことを意味する。したがって、本発明の方法は、ヘルパーファージを除去するための精製工程(例えばFPLC)を含む。
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の大規模生産は、遺伝子治療の研究、開発及び商業化にとって大きな障害となっている。十分に研究されているにもかかわらず、rAAVの生産は、スケーラビリティの限界のために実験室規模に限定されていた。これまでに、「プロデューサー」細胞の一過性トランスフェクションは、非常に高価であるにもかかわらず、感染性汚染物質のない高純度のrAAVベクターを得る最も一般的な技術であった。したがって、rAAV生産系における遺伝子導入のための替わりの方法は大いに正当である。
Claims (68)
- 組換えファージミド粒子が形質導入された標的細胞中に導入遺伝子を発現させるための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子は、前記標的細胞に生物学的効果を及ぼす作用因子をコードする少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットを含み、前記ファージミド粒子が、そのバクテリオファージゲノムの少なくとも50%を欠くゲノムを含むことを特徴とする、組換えファージミド粒子。
- 前記組換えファージミド粒子のゲノムは、前記ファージミドゲノムの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含み、続いて前記一本鎖DNAが原核宿主内の前記ファージミド粒子にパッケージングされ得る、請求項1に記載の粒子。
- 前記パッケージングシグナルは、複製起点、随意にF1 oriを含む、請求項2に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子のゲノムは、原核宿主内の二本鎖ベクターの複製を可能にするための複製起点、随意にpUC oriを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子のゲノムは、宿主ゲノムへの標的化した組込みに有利な1つ以上のDNA配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットは、ウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットは、哺乳動物ウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットは、レンチウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットは、アデノ随伴ウイルス(AAV)導入遺伝子発現カセットを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記導入遺伝子発現カセットは、前記標的細胞または組織において治療的または工業的有用性を有する作用因子をコードする核酸を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記核酸は、DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、アンチセンスRNA、またはshRNAである、請求項10に記載の粒子。
- 前記核酸によってコードされる前記作用因子は、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項10または請求項11に記載の粒子。
- 前記導入遺伝子発現カセットは、プロモーター、前記発現される作用因子に付着可能なポリAテールをコードする核酸、左及び/または右末端逆位反復配列(ITR)からなる群から選択される前記標的細胞における前記核酸の発現に必要とされる1つ以上の機能的要素を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子は、1つ以上のカプシド少数コートタンパク質を含み、随意に、前記組換えファージミド粒子は、前記粒子の前記標的細胞への送達を可能にする細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されたpIIIカプシド少数コートタンパク質を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子は、1つ以上のカプシド主要コートタンパク質を含み、随意に、前記組換えファージミド粒子は、上に外来ペプチドをディスプレイするように構成された少なくとも1つのpVIIIカプシド主要コートタンパク質を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子は、カチオン性ポリマーと組み合わされて正味の正電荷を有する複合体を形成し、随意に前記カチオン性ポリマーは、キトサン、ポリ−D−リジン(PDL)、ジエチルアミノエチル(DEAE)、ジエチルアミノエチル−デキストラン(DEAE.DEX)、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリブレン、硫酸プロタミン、及びカチオン性脂質からなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子のゲノムは、それが由来するバクテリオファージゲノムの少なくとも60%、70%、または少なくとも80%を欠く、請求項1〜16のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記組換えファージミド粒子のゲノムは、それが由来するバクテリオファージゲノムの少なくとも90%、95%、または少なくとも99%を欠く、請求項1〜17のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記ファージミド粒子が、原核宿主、好ましくはカプシドタンパク質をコードする構造遺伝子からの粒子の形成、パッケージングまたは排出に必要とされるそのゲノム中のバクテリオファージ構造遺伝子を欠く、請求項1〜18のいずれか一項に記載の粒子。
- 原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための系であって、前記系は、
(i)原核宿主内で存続するように構成された第1のベクターであって、少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、及び前記ベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターと、
(ii)前記一本鎖DNAをパッケージングし、前記原核宿主からの組換えファージミド粒子の形成及び排出をもたらすために必要とされる構造タンパク質をコードする核酸を含む、第2のベクターと、を含む、系。 - 前記系は、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子を産生するために使用される、請求項20に記載の系。
- 前記第1のベクターは、前記組換えファージミド粒子のゲノムを含む、請求項20または請求項21に記載の系。
- 前記第2のベクターは、原核宿主から前記第1のベクターを保有するファージミド粒子をレスキューするために特別に操作されたバクテリオファージである、請求項20〜22のいずれか一項に記載の系。
- 前記第2のベクターは、複製欠損である、請求項20〜23のいずれか一項に記載の系。
- 前記第2のベクターは、それ自体をファージ粒子にパッケージングする能力を顕著に阻止する、破壊されたパッケージングシグナルを含む、請求項20〜24のいずれか一項に記載の系。
- 前記第2のベクターは、破壊された複製起点を含む、請求項20〜25のいずれか一項に記載の系。
- 前記破壊された複製起点は、中コピー数起点、随意にp15a、または低コピー数起点、随意にpMB1である、請求項26に記載の系。
- 前記第2のベクターは、前記組換えファージミド粒子の標的細胞への送達を可能にするための細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されたpIIIカプシド少数コートタンパク質をコードする第1の核酸配列を含む、請求項20〜27のいずれか一項に記載の系。
- 前記第2のベクターのゲノムは、RGD4C標的化ペプチド(CDCRGDCFC−配列番号7)を含む、請求項20〜28のいずれか一項に記載の系。
- 前記第2のベクターは、その上に外来ペプチドをディスプレイするように構成された少なくとも1つのpVIIIカプシド主要コートタンパク質をコードする第2の核酸配列を含む、請求項20〜29のいずれか一項に記載の系。
- 前記第1のベクターは、レトロウイルス科またはオルソレトロウイルス亜科のメンバーである、請求項20〜30のいずれか一項に記載の系。
- 前記第1のベクターは、レンチウイルス属のメンバーである、請求項20〜31のいずれか一項に記載の系。
- 前記第1のベクターは、パルボウイルス科または亜科、好ましくはアデノ随伴ウイルス種のメンバーである、請求項20〜32のいずれか一項に記載の系。
- 原核宿主から組換えファージミド粒子を産生する方法であって、前記方法は、
(i)原核宿主内で存続するように構成された第1のベクターであって、少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、及び前記ベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターを原核宿主細胞に導入することと、
(ii)バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを前記宿主に導入することと、
(iii)前記構造タンパク質によってパッケージングされている前記一本鎖DNAが前記原核宿主から組換えファージミド粒子を形成し、排出することになる条件下で、前記宿主を培養することと、を含む、方法。 - 原核宿主から組換えファージミド粒子を産生する方法であって、前記方法は、
(i)原核宿主細胞に、(a)前記原核宿主内で存続するように構成された第1のベクターであって、少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、及び前記ベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む第1のベクターと、(b)前記一本鎖DNAをパッケージングするために必要とされる構造タンパク質をコードする核酸を含む第2のベクターとを導入することと、
(ii)前記構造タンパク質によってパッケージングされている前記一本鎖DNAが前記原核宿主から組換えファージミド粒子を形成し、排出することになる条件下で、前記宿主を培養することと、を含む、方法。 - 原核宿主から請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子を産生するためのウイルスベクター構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージの使用。
- 前記ファージミド粒子のゲノム内のウイルスゲノムを含むか、またはそれに由来する組換えウイルスベクターを産生するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系の使用。
- 組換えウイルスベクターを産生する方法であって、前記方法は、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系を真核宿主細胞に導入し、前記宿主細胞に組換えウイルスベクターを産生させることを含む、方法。
- 前記組換えウイルス産生物は、組換え哺乳動物ウイルスである、請求項37に記載の使用または請求項38に記載の方法。
- 前記組換えウイルス産生物は、rAAVである、請求項37〜39のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記組換えウイルス産生物は、組換えレンチウイルスである、請求項37〜40のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記ファージミド粒子または前記系は、前記真核宿主細胞内部の前記ファージミド粒子のゲノムによって決定される、哺乳動物ウイルスの産生に必要な他の遺伝子要素の送達及び/または存在と共に、シス及び/またはトランスで使用される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記真核宿主細胞は哺乳動物であり、随意に、前記宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞(HEK293)、スポドプテラ・フルギペルダ蛹卵巣組織(Sf9)、昆虫細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)を含むか、またはこれらに由来する、請求項38〜42のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記宿主細胞は、rAAV、レンチウイルス、カプシド、複製、ヘルパータンパク質をコードする遺伝子、及び前記哺乳動物ウイルスの発現及びパッケージングに必要な任意の他の遺伝子からなる群から選択される遺伝子を保有する1つ以上のファージミド粒子ゲノムで形質転換される、請求項38〜43のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記rAAV遺伝子は、前記組換えファージミドウイルス粒子によって保有され、前記アデノヘルパー及びrep−cap遺伝子は、別々のベクター上に保有されるかまたは前記真核生物宿主ゲノムに組込まれる、請求項38〜44のいずれか一項に記載の使用または方法。
- rAAV、rep−cap及びアデノヘルパー遺伝子が単一のベクター上に保有される、請求項38〜45のいずれか一項に記載の使用または方法。
- rAAV、rep−cap及びアデノヘルパー遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項47に記載のベクターを含む組換えファージミド粒子。
- 前記ファージミド粒子のウイルスゲノムを含むか、またはそれに由来する組換えAAVウイルスベクターを産生するための、請求項47に記載のベクターまたは請求項48に記載の粒子の使用。
- 組換えAAVウイルスベクターを産生する方法であって、前記方法は、真核宿主細胞に請求項47に記載のベクターまたは請求項48に記載の粒子を導入し、前記宿主細胞に組換えウイルスベクターを産生させることを含む、方法。
- 同じ真核宿主細胞に導入された場合、ベクター上のrep−cap遺伝子及びアデノヘルパー遺伝子は、rAAV産生の状況下において、トランス作用もしくはシス作用として、またはAAVウイルスカプシドにおけるrAAVゲノムのパッケージングを促進する両方の要素の組み合わせとして挙動する、請求項49に記載の使用または請求項50に記載の方法。
- 前記方法は、インビボで、インビトロで、エキソビボで、またはインサイチュで実施される、請求項49〜51のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記組換えファージミド粒子は、指定された真核宿主である標的真核細胞のための標的部分を含む、請求項49〜52のいずれか一項に記載の使用または方法。
- 前記指定された真核宿主細胞型が疾患細胞である、請求項53に記載の使用または方法。
- 前記疾患細胞が悪性または良性の腫瘍である、請求項54に記載の使用または方法。
- 請求項20〜33のいずれか一項で定義した第1及び/または第2のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核生物であり、より好ましくは細菌細胞である、請求項56に記載の宿主細胞。
- 実験的研究ツールとしての使用のため、随意にエクスビボまたはインビトロでの使用ための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系。
- 治療または診断に用いるための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子、または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系。
- 遺伝子治療技術における使用のための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子、または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系。
- 前記遺伝子治療技術を、癌を治療、予防、または寛解させるために使用する、請求項59または請求項60に記載の組換えファージミド粒子または系。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系を含むワクチン。
- 対象へのワクチン送達に使用するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子、または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系。
- 前記ワクチンがペプチドワクチンまたはDNAワクチンである、請求項62に記載のワクチンまたは請求項63に記載の使用。
- ワクチン接種された対象の腫瘍に外来抗原を送達し、標的化するために使用するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系。
- 遺伝子分子画像化技術における、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系の使用。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子、または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む、薬学的組成物。
- 請求項67に記載の薬学的組成物の製造方法であって、前記方法は、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換えファージミド粒子または請求項20〜33のいずれか一項に記載の系と、薬学的に許容されるビヒクルとの治療有効量を接触させることを含む、方法。
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