CN110785495A - 腺相关病毒载体的生产方法 - Google Patents
腺相关病毒载体的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110785495A CN110785495A CN201880040553.6A CN201880040553A CN110785495A CN 110785495 A CN110785495 A CN 110785495A CN 201880040553 A CN201880040553 A CN 201880040553A CN 110785495 A CN110785495 A CN 110785495A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aav
- nucleic acid
- vector
- cell
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及腺相关病毒(AAV)生产细胞,其包含编码以下的核酸序列:rep/cap基因;辅助病毒基因;和AAV载体颗粒的RNA基因组,其中所述核酸序列全部一起整合于AAV生产细胞基因组内的单一基因座处。本发明还涉及包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体,其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列:rep/cap基因,和辅助病毒基因。本发明还涉及使用所述核酸载体以产生稳定的AAV包装和生产细胞系的用途和方法。
Description
发明领域
本发明涉及包含腺相关病毒(AAV)载体产生所需的基因的核酸载体及其用途。还提供了制备包含如本文所述的核酸载体的AAV包装和生产细胞系的方法。
发明背景
在基因疗法中,将遗传物质递送至需要治疗的受试者中的内源性细胞。遗传物质可将新基因引入受试者,或引入预先存在的基因的额外拷贝,或引入在受试者中缺陷的基因的野生型变体。已经提出病毒载体系统作为用于基因疗法的有效基因递送方法(Verma和Somia (1997) Nature 389: 239-242)。
腺相关病毒(AAV)在1965年被发现,作为腺病毒制备物的污染物。AAV具有近似4.7千碱基(kb)的线性单链DNA(ssDNA)基因组,其在末端具有两个145核苷酸长的反向末端重复(ITR)。ITR侧接两个病毒基因 - rep(复制)和cap(衣壳),其分别编码非结构蛋白和结构蛋白,并且对于将AAV基因组包装至衣壳中以及在感染后起始第二链DNA合成至关重要。AAV已经被归为依赖细小病毒属(细小病毒科的属),因为其需要与辅助病毒(诸如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或牛痘病毒)共同感染用于在细胞培养中的生产性感染(Atchison等人(1965) Science 149:754; Buller等人 (1981) J. Virol. 40: 241)。
AAV载体已经证明转导和长期基因表达,并且具有感染分裂中细胞和静止细胞两者的能力。此外,目前不知道AAV引起疾病,且因此在体内几乎不引起毒性和炎症。这些特性已导致AAV成为基因疗法应用的期望载体。
通常使用几种在细胞系中生产AAV载体的方法。一种方法利用稳定地携带AAVrep/cap基因以及侧接AAV ITR的目标基因的细胞系。重组AAV颗粒的产生通过用野生型腺病毒感染细胞而起始。腺病毒提供需要表达以用于AAV复制和病毒粒子产生的基因:E1A、E1B、E2A、E4和VA RNA。尽管已显示该方法容易在培养物中按比例放大并以高滴度产生AAV载体,但从AAV产品完全去除腺病毒是非常有挑战性的。鉴于载体安全性和特异性,非常不期望野生型腺病毒的污染。
AAV载体生产的一种替代方法不涉及用辅助病毒感染宿主细胞。反而,宿主HEK293细胞用3种质粒瞬时共转染:(1)携带侧接AAV ITR的目标基因的AAV转移载体;(2)携带AAVrep/cap基因的质粒;和(3)提供从腺病毒克隆的辅助基因的质粒。尽管这种瞬时转染方法生成高滴度的不含腺病毒的AAV载体,但该方法非常费力且昂贵。
用于制造AAV载体的所有细胞系,诸如AAV包装和生产细胞系,必须遵守权威机构(例如,欧洲的欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA))所阐述的质量要求。AAV包装和生产细胞系的关键质量要求是它们不产生野生型AAV或能够复制的AAV (参见“Reflection paper on quality, non-clinical and clinical issues related to thedevelopment of recombinant adeno-associated viral vectors”, EMA, 2010年6月24日)。另外关键的质量要求是细胞基质稳定性。也就是说,对于待在细胞系中制备的给定生产,有必要证明在预期使用范围的开始和结束时,可以用细胞获得一致产量(参见欧洲药典7.0;第5.2.3节)。
因此,本发明的一个目的是提供产生AAV载体和制备稳定的AAV包装和生产细胞系的方法,其克服了与现有方法相关的一个或多个缺点。
发明概述
本发明人已开发了制备包装和生产细胞系的新方式,其涉及使用包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体,诸如携带AAV载体生产所必需的所有腺相关病毒(AAV)基因的细菌人工染色体。这允许将产生重组AAV载体颗粒所需的所有AAV基因和选择抗生素抗性基因整合至生产细胞基因组中,缓解了与瞬时转染方法相关的问题。
包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25kb DNA(即,大型构建体DNA)的核酸载体的使用具有几个优点。首先,可以首先在非哺乳动物细胞(例如,微生物细胞,诸如细菌细胞)而不是哺乳动物宿主细胞中操作载体,使得它们更易于用以发挥作用(例如,可以首先在大肠杆菌中操作细菌人工染色体)。一旦已制备核酸载体,就可以将其引入哺乳动物宿主细胞中,并且可以选择其中核酸载体已整合至内源染色体中的一个或几个中的任何细胞以分离稳定的细胞系。
将AAV构建体引入哺乳动物宿主细胞也可以在单个步骤中发生,有助于减少选择压力和沉默时间范围。这允许更快速筛选潜在的包装细胞并降低材料成本,因为仅使用了单一载体,而不是像先前方法那样使用多个质粒载体。具体而言,该系统的使用减少质粒制造的成本,降低转染试剂(例如聚乙烯亚胺[PEI])的需求,减少所需的BenzonaseTM处理量(在病毒收获物中DNA的量减少,因此需要较少的BenzonaseTM以在下游处理中除去过量物)并降低测试成本(不需要测试病毒产物中的残留质粒)。
此外,因为将AAV产生(有或没有含有待包装的转基因的转移载体)必不可少的所有病毒基因连续克隆在同一核酸载体内,所以当将该载体引入哺乳动物宿主细胞时,载体中并入的所有基因将整合在内源哺乳动物宿主细胞基因组内的一个基因座处。这使得更容易选择稳定的克隆,其中AAV生产所需的基因无一已经整合至可引起基因沉默的基因组区域中。当在几种质粒上提供所需AAV基因(其可以在宿主细胞基因组内的不同基因座处随机整合)时,对于一种或多种基因可能发生这种情况。
因此,使用本发明的核酸载体在生成AAV包装和生产细胞系方面提供了优势。
因此,根据本发明的第一个方面,提供了腺相关病毒(AAV)生产细胞,其包含编码以下的核酸序列:
AAV rep/cap基因;
辅助病毒基因;和
AAV载体颗粒的DNA基因组,
其中所述核酸序列全部一起整合于AAV生产细胞基因组内的单一基因座处。
根据本发明的一个进一步方面,提供了包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体,其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列:
腺相关病毒(AAV) rep/cap基因,和
辅助病毒基因,
其中编码AAV rep/cap基因和每种辅助病毒基因的核酸序列在核酸载体内作为单独的表达盒排列。
根据本发明的一个进一步方面,提供了产生稳定的AAV包装细胞系的方法,其包括:
(a) 将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中;和
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
根据本发明的一个进一步方面,提供了通过如本文所定义的方法获得的AAV包装细胞。
根据本发明的一个进一步方面,提供了产生复制缺陷型AAV载体颗粒的方法,其包括:
(a) 将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中;
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞;和
(c) 在产生复制缺陷型AAV载体颗粒的条件下进一步培养选择的哺乳动物宿主细胞。
根据本发明的一个进一步方面,提供了通过如本文所定义的方法获得的复制缺陷型AAV载体颗粒。
附图简述
图1:本发明的示例性核酸载体的概图。该图显示细菌人工染色体(BAC)构建体,其含有通过绝缘子(cHS4)分开的AAV病毒基因(rep/cap)和辅助病毒基因(来自腺病毒2 [Ad2]的E2A、E4和VA)。该构建体还含有抗生素抗性标记(ZeoR)和翻译起始位点(IRES)。
图2:本发明的示例性核酸载体的示意图。该图显示线性细菌人工染色体(BAC)构建体,其含有AAV病毒基因(rep/cap)、辅助病毒基因(来自腺病毒2 [Ad2]的E2A、E4和VA)、rep shRNA、E1A shRNA和侧接ITR的转基因,其全部通过绝缘子(cHS4)彼此分开。该构建体还含有抗生素抗性标记(ZeoR)和翻译起始位点(IRES)。
图3:显示设计为靶向rep mRNA分子的shRNA的核酸序列的示意图。
图4:显示将每个表达盒克隆至含有2xcHS4的供体质粒中且然后将表达盒和2xcHS4两者克隆至BAC中的方法的示意图。
图5:BAC8a-GFP的质粒图。
图6:BAC9a-GFP的质粒图。
图7:转染后72 h的AdVec RS-D01细胞的显微镜图像和GFP阳性细胞的分析。
图8:通过qPCR对从用BAC9A-GFP或三重质粒系统对照转染的裂解的AdVec RS-D01细胞提取的DNA进行产生的载体的分析。
图9:转染后72 h的转导的LentiX 293T细胞的显微镜图像和GFP阳性细胞的分析。
图10:转染BAC9A-GFP后的细胞数/ml的分析。
图11:在用BAC9A-GFP转染后通过针对博莱霉素选择下的AdVec RS-D01悬浮细胞的流式细胞术对GFP阳性细胞的分析。
图12:从多克隆博莱霉素选择的合并物产生的载体的qPCR分析。
图13:用BAC9A-GFP转染和博莱霉素选择的LentiX293T细胞的GFP阳性细胞的流式细胞术分析。
图14:来自AdVec贴壁细胞稳定合并物的载体产生的qPCR分析。
发明详述
定义
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有专利和出版物都通过引用以其整体并入。
术语“包含(comprising)”涵盖“包括(including)”或“由…组成(consisting)”,例如,“包含(comprising)”X的组合物可以仅由X组成或可以包括额外的某物,例如X+Y。
术语“基本上由...组成”将特征的范围限制为具体的材料或步骤以及不实质影响所请求保护的特征的基本特性的那些。
术语“由...组成”排除任何额外组分的存在。
关于数值x的术语“约”是指例如x±10%、5%、2%或1%。
术语“载体”或“核酸载体”是指能够将外来(即外源)遗传物质人工携带至另一个细胞中的媒介物,其可以在所述另一细胞中复制和/或表达。载体的实例包括非哺乳动物核酸载体,诸如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、粘粒或F粘粒(fosmid)。
术语“非哺乳动物复制起点”是指其中引发复制并源自非哺乳动物来源的核酸序列。这使得本发明的核酸载体能够在合适的宿主细胞(例如,微生物细胞,诸如细菌或酵母细胞)中与内源染色体一起稳定复制和分离,使得其可传递给宿主细胞后代(除了当宿主细胞是哺乳动物宿主细胞时)。在哺乳动物宿主细胞中,具有非哺乳动物复制起点的核酸载体将整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。例如,具有非哺乳动物复制起点的核酸载体诸如细菌人工染色体(BAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、粘粒或F粘粒能够在细菌细胞(诸如大肠杆菌)中与内源染色体一起稳定复制和分离,然而,如果将它们引入哺乳动物宿主细胞,BAC、PAC、粘粒或F粘粒将整合或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。酵母人工染色体(YAC)能够在酵母细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离,然而,如果它们被引入哺乳动物宿主细胞,YAC将整合或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。因此,在本上下文中,本发明的核酸载体充当DNA的储库(即,对于产生AAV载体所必需的基因),其可容易地转移至哺乳动物细胞中以产生用于产生AAV载体的稳定细胞系。非哺乳动物复制起点的实例包括细菌的复制起点,诸如oriC、oriV或oriS,或酵母的复制起点,也称为自主复制序列(ARS元件)。
本发明的核酸载体包含非哺乳动物的复制起点并且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA。在一个实施方案中,核酸载体能够容纳至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340或350kb的DNA。应理解的是,提及“容纳能力”具有其通常的含义,并且暗示核酸载体的插入片段大小的上限不小于请求保护的大小(即不小于25kb的DNA)。
本发明的目的是在单一构建体(即核酸载体)中包括AAV包装所必需的基因。因此,本发明的核酸载体必须能够容纳大的DNA插入片段。为避免疑义,应理解的是,提及“核酸载体”或“人工染色体”不是指天然细菌质粒(例如,诸如目前在瞬时转染方法中使用的质粒),因为这些不能够容纳至少25kb的DNA。质粒可含有的最大大小插入片段为约15kb。此类核酸载体也不是指通常仅容纳5-11kb的最大插入片段的噬菌体。因此,在一个实施方案中,本发明的核酸载体不是质粒、噬菌体或附加体。
在一个实施方案中,本发明的核酸载体不是噬菌体。
术语“内源染色体”是指在产生或引入外源核酸载体诸如细菌人工染色体之前在宿主细胞中发现的基因组染色体。
如本文所用的术语“转染(transfection)”、“转化(transformation)”和“转导(transduction)”可用于描述将非哺乳动物或病毒的载体插入靶细胞。插入载体通常称为细菌细胞的转化和真核细胞的转染,尽管插入病毒载体也可称为转导。本领域技术人员将意识到通常使用的不同的非病毒转染方法,其包括但不限于使用物理方法(例如,电穿孔、细胞挤压(cell squeezing)、声致穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如,磷酸钙、高度支化的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如,脂质转染)。许多转染方法需要使质粒DNA溶液与细胞接触,然后使其生长并针对标记基因表达进行选择。
术语“启动子”是指驱动基因表达的序列。为了驱动高水平表达,使用高效启动子可以是有益的。合适的启动子的实例可以包括启动子诸如人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或人延伸因子1-α(pEF)启动子。
术语“可选择标记”是指将有助于选择活跃地表达核酸序列的细胞的基因。合适的选择标记的实例包括编码对抗生素的抗性的酶(即抗生素抗性基因),例如卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素或博莱霉素。合适的选择标记的另一个实例是荧光蛋白,例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。
“基因扩增”是指这样的过程,通过该过程,基因组的特定DNA序列(即基因)相对于基因组中的其他序列不成比例地复制,使得扩增的DNA序列变得以比这种不成比例的复制前基因组中最初存在的拷贝数更高的拷贝数存在。如本文关于基因或核酸序列所用的“扩增的”或“扩增”是指凭借基因扩增以两个或更多个拷贝存在于宿主细胞系中的基因或核酸序列。
提及如本文所用的“可扩增选择标记基因”是指允许在适当的生长条件下扩增该基因的基因。所述可扩增选择标记基因能够通过扩增以增加表达产物(即,由可扩增选择标记基因编码的蛋白的表达)而响应抑制剂或必需代谢产物的缺乏。在一个实施方案中,所述可扩增选择标记基因可以被表征为能够与营养缺陷型宿主互补。
术语“polyA信号”是指聚腺苷酸化信号序列,例如置于转基因的3',其使得宿主因子能够在转录期间将聚腺苷(polyA)尾部添加至新生mRNA的末端。polyA尾部是一段最多达300个腺苷核糖核苷酸的序列,其保护mRNA免于酶促降解并且还有助于翻译。因此,本发明的核酸载体可以包括polyA信号序列,诸如人β球蛋白或兔β球蛋白polyA信号、猿病毒40(SV40)早期或晚期polyA信号、人胰岛素polyA信号或牛生长激素polyA信号。在一个实施方案中,polyA信号序列是人β球蛋白polyA信号。
术语“内含子序列”是指通过RNA剪接从最终基因产物除去的核苷酸序列。已经显示在增强子/启动子区域的下游和cDNA插入片段的上游使用内含子增加基因表达的水平。表达的增加依赖于特定的cDNA插入片段。因此,本发明的核酸载体可以包括内含子,诸如人β球蛋白内含子、兔β球蛋白内含子II或嵌合人β球蛋白-免疫球蛋白内含子。在一个实施方案中,内含子是人β球蛋白内含子和/或兔β球蛋白内含子II。
术语“包装细胞系”是指具有稳定插入的AAV包装基因、即rep和cap基因以及所需的辅助病毒基因的细胞系。或者,术语“生产细胞系”是指具有稳定插入的AAV基因组(例如含有侧接两个AAV反向末端重复(ITR)的目标转基因)的包装细胞系。本领域技术人员应理解,本文所述的核酸载体可用于生成包装细胞系(即当至少rep、cap和辅助病毒基因存在于核酸载体上且并入宿主细胞时)或生产细胞系(即当核酸载体另外包含待与rep和cap基因一起并入宿主细胞中的AAV基因组时)。应进一步理解,本文描述的包装和/或生产细胞不是指其中已经整合天然AAV原病毒的细胞。
如本文所用的术语“表达构建体”或“表达盒”是指能够驱动一种或多种并入的多核苷酸的表达的功能性表达单元。此类盒通常包括该多核苷酸和该多核苷酸的转录和翻译所必需的组分。例如,所述盒可以包括包含启动子、翻译起始信号、转录终止子(例如polyA序列)和/或自切割肽序列(例如P2A序列)的核酸序列(即重组DNA)。在一个实施方案中,所述单独表达盒包含启动子和/或转录终止子。在一个实施方案中,所述单独表达盒包含被IRES分隔的两个基因,两者均从单一启动子转录。为了避免疑问,提及此类盒包括rep/cap基因,其从3种不同启动子产生几种转录物,然后将其剪接成7种不同蛋白,但是由于AAV基因组的紧密性质而不能彼此分离。因此,表达盒可以包含多于一个启动子。
在一个实施方案中,排列核酸载体中的所有表达盒,使得它们以相同方向转录。先前已显示这改进构建体中表达盒的总体表达(Throm等人, (2009) Blood 113: 5104-5110)。
术语“稳定转染的”是指能够将引入的AAV基因传递给它们的后代(即子细胞)的细胞系,这是因为转染的DNA已经并入内源染色体或经由外源染色体的稳定遗传。
核酸载体
根据本发明的一个方面,提供了包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体,其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列:
腺相关病毒(AAV) rep/cap基因;和
辅助病毒基因,
其中编码AAV rep/cap基因和每种辅助病毒基因的核酸序列在核酸载体内作为单独的表达盒排列。
目前用于生成AAV载体的方法涉及将病毒基因瞬时转染至宿主细胞中。然而,许多缺点与该方法相关,因为其成本高且费力。一种解决方案是工程改造稳定并入AAV包装基因的包装细胞系,以避免与瞬时转染相关的问题。
通过将AAV载体生产所需的所有基因包括在核酸载体中,可以在单一步骤中将AAV包装所需的所有基因插入哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。因此,如本文所提出,使用核酸载体将减少选择压力,减少沉默时间范围并且允许更快速筛选潜在的包装细胞。此外,核酸载体上包括的AAV载体产生所需的基因将全部在单一基因座处被整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。这将降低单独病毒基因变得沉默的风险并确保均匀表达所有病毒基因。
应理解的是,核酸载体构建体可以在宿主细胞基因组中在不同染色体上的多个不同位置处整合多于一次(尽管所有编码的核酸序列都存在于单一基因座中)。这对于增加转基因的表达水平可能是有益的,并且可潜在地提高AAV滴度。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含编码AAV载体颗粒的DNA基因组的核酸序列。当转录该核酸序列时,其将被壳体化于细胞产生的AAV载体颗粒内,并且,因此,充当AAV载体颗粒的“基因组”。应理解的是,AAV载体颗粒的DNA基因组通常被包括在用于瞬时转染方法的“转移质粒”上。所述转移质粒通常在两个AAV ITR之间含有可操作连接至转基因的启动子(例如CMV)(和任选聚腺苷酸化[polyA]信号)。因此,提及如本文所用的“AAV载体颗粒的DNA基因组”是指侧接AAV ITR的核酸序列(通常编码目标转基因)。因此,在一个实施方案中,所述AAV载体颗粒的DNA基因组包含在两个AAV LTR之间编码的一个或多个转基因。
在一个实施方案中,在核酸载体中包括AAV载体颗粒(即转移质粒)的DNA基因组的多个拷贝。预期转移质粒的多个拷贝导致更高的病毒载体滴度。例如,核酸载体可以包括AAV载体颗粒的DNA基因组(即转移质粒)的两个或更多个,诸如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个拷贝。
在一个实施方案中,核酸载体含有一个或多个重组位点。这允许靶序列在重组酶的存在下以位点特异性方式整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。重组酶在两个重组位点之间催化重组反应。
许多类型的位点特异性重组系统是本领域已知的,并且可以在本发明中使用任何合适的重组系统。例如,在一个实施方案中,重组位点选自或源自λ噬菌体的int/att系统、噬菌体P1的Cre/lox系统、酵母的FLP/FRT系统、噬菌体Mu的Gin/gix重组酶系统、Cin重组酶系统、大肠杆菌的Pin重组酶系统和pSR1质粒的R/RS系统或其任何组合。在一个进一步实施方案中,重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体),其中att位点允许在λ整合酶存在下的定点整合。应理解的是,提及“λ整合酶”包括提及仍与int/att系统相容的突变体整合酶,例如在WO 2002/097059中描述的修饰的λ整合酶。
在一个实施方案中,核酸载体选自:细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生人工染色体(PAC)、F粘粒或粘粒。在另一个实施方案中,核酸载体是细菌人工染色体(BAC)。
细菌人工染色体
术语“细菌人工染色体”或“BAC”是指源自细菌质粒的DNA构建体,其能够容纳大型的外源DNA插入片段。它们通常可以容纳近似350kb的最大DNA插入片段。BAC开发自充分表征的细菌功能性育性质粒(F-质粒),起含有促进质粒在细菌细胞分裂后均匀分布的分配基因。这允许BAC与内源细菌基因组(诸如大肠杆菌)一起被稳定复制和分离。BAC通常含有至少一个拷贝的复制起点(诸如oriS或oriV基因)、repE基因(用于质粒复制和拷贝数调节)和分配基因(诸如sopA、sopB、parA、parB和/或parC),其确保BAC在细菌细胞中的稳定维持。BAC是天然环状的和超螺旋的,其使得它们比线性人工染色体诸如YAC更容易恢复。它们也可以使用简单的方法诸如电穿孔相对容易地引入细菌宿主细胞。
在一个实施方案中,细菌人工染色体包含oriS基因。在一个实施方案中,细菌人工染色体包含repE基因。在一个实施方案中,细菌人工染色体包含分配基因。在一个进一步实施方案中,分配基因选自sopA、sopB、parA、parB和/或parC。在一个又进一步实施方案中,细菌人工染色体包含sopA和sopB基因。
用于本发明中的BAC可以从商业来源获得,例如来自LUCIGEN™的pSMART BAC (对于完整骨架序列,参见Genome登录号EU101022.1)。该BAC含有L-阿拉伯糖“拷贝”系统,其也含有oriV中等拷贝复制起点,其仅在TrfA复制蛋白存在下才有活性。TrfA的基因可以在L-阿拉伯糖诱导型启动子araC-P BAD 的控制下并入细菌宿主细胞的基因组中(参见Wild等人,(2002) Genome Res. 12(9): 1434–1444)。L-阿拉伯糖的添加诱导TrfA的表达,TrfA活化oriV,引起质粒复制至最多达50个拷贝/细胞。
酵母人工染色体
术语“酵母人工染色体”或“YAC”是指其中酵母DNA并入细菌质粒中的染色体。它们含有自主复制序列(ARS)(即复制起点)、着丝粒和端粒。与BAC不同,YAC是线性的,且因此在染色体的每个末端含有酵母端粒,以在其传递至宿主细胞后代上时保护末端免于降解。YAC可以容纳一定范围的DNA插入片段大小;从100-2000kb的任何大小。
P1-衍生的人工染色体
术语“P1-衍生的人工染色体”或“PAC”是指源自P1-噬菌体和细菌F-质粒的DNA的DNA构建体。它们通常可以容纳近似100-300kb的最大DNA插入片段,并用作大肠杆菌中的克隆载体。PAC具有与BAC类似的优点,例如易于纯化并引入细菌宿主细胞。
粘粒和F粘粒
术语“粘粒”是指源自细菌质粒的DNA构建体,其另外含有源自噬菌体λ的cos位点。粘粒通常含有细菌复制起点(诸如oriV)、选择标记、克隆位点和至少一个cos位点。粘粒通常可以接受40-45kb的最大DNA插入片段。已显示粘粒在感染大肠杆菌细胞方面比标准细菌质粒更有效。术语“F粘粒”是指与粘粒类似的非哺乳动物核酸载体,除了其基于细菌F-质粒。具体而言,它们使用F-质粒的复制起点和分配机制来允许克隆大的DNA片段。F粘粒通常可以接受40kb的最大DNA插入片段。
应理解的是,编码复制缺陷型AAV载体颗粒的核酸序列可以与野生型基因相同或源自野生型基因,即,序列可以是包含在野生型病毒中的遗传上或其他方式改变版本的序列。因此,引入核酸载体或宿主细胞基因组中的病毒基因也可以指野生型基因的密码子优化版本。
腺相关病毒
腺相关病毒(AAV)是依赖细小病毒属(genus Dependoparvovirus)的一部分,其属于细小病毒科。AAV是一种小的、无包膜的、二十面体病毒,其具有近似4.7千碱基(kb)至6 kb长的单链DNA (ssDNA)基因组。已经发现了几种血清型,其中AAV血清型2 (AAV2)是迄今为止检查最广泛的血清型。
AAV基因组由侧接两个145碱基的反向末端重复(ITR)的两个开放阅读框rep和cap组成。这些ITR碱基对允许合成互补DNA链。翻译rep和cap基因(其也可以统称为rep/cap基因)以产生多种不同的蛋白:rep基因编码AAV生命周期所需的蛋白Rep78、Rep68、Rep52、Rep40;cap基因编码作为衣壳蛋白的VP1、VP2、VP3。当构建AAV转移质粒时,将转基因置于两个ITR之间,并且rep和cap以反式提供。这是为了确保宿主细胞产生的AAV是复制缺陷的。
AAV rep编码序列至少编码病毒基因组复制和包装成新病毒粒子所必需的那些复制蛋白。rep基因通常将编码至少一个大rep蛋白(即Rep78/68)和一个小rep蛋白(即Rep52/40),然而,在本文所述的实施方案中,rep基因不需要编码所有AAV rep蛋白。因此,在一个实施方案中,rep蛋白包含Rep78蛋白和Rep52和/或Rep40蛋白。在一个替代实施方案中,rep蛋白包含Rep68和Rep52和/或Rep40蛋白。在一个进一步实施方案中,rep蛋白包含Rep68和Rep52蛋白,Rep68和Rep40蛋白,Rep78和Rep52蛋白或Rep78和Rep40蛋白。在又一个进一步实施方案中,rep蛋白包含Rep78、Rep68、Rep52和Rep40蛋白。
AAV cap编码序列编码形成功能性AAV衣壳(即可以包装DNA并感染靶细胞)的结构蛋白。通常,所述cap编码序列将编码所有AAV衣壳亚基,但只要产生功能性衣壳,就可以编码少于所有衣壳亚基。在一个实施方案中,cap蛋白包含VP1、VP2和/或VP3。
AAV ITR序列各自包含145个碱基,并且是AAV基因组复制和包装成衣壳所必需的唯一顺式作用元件。通常,ITR将在载体基因组的5'和3'末端,并且侧接异源核酸(转基因),但不需要与其邻接。ITR可以彼此相同或不同。
AAV ITR可以来自任何AAV,包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13,蛇AAV,禽AAV,牛AAV,犬AAV,马AAV,绵羊AAV,山羊AAV,虾AAV或现在已知或以后发现的任何其他AAV。AAV ITR不需要具有天然末端重复序列(例如,天然AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变进行改变),只要末端重复介导期望的功能,例如复制、病毒包装和/或整合等。
提及如本文所用的AAV包括,但不限于,AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(包括血清型3A和3B)(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV和现在已知或以后发现的任何其他AAV。参见例如Fields等人,Virology,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)。
提及AAV可以包括人工AAV血清型,其包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。可以通过任何合适的技术,使用一种AAV血清型序列(例如VP1衣壳蛋白的片段)与异源序列的组合,生成这种人工衣壳,所述异源序列可以获得自另一种AAV血清型(已知或新型的)、相同AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源。人工AAV血清型可以是,但不限于,嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。
在一个实施方案中,编码AAV载体颗粒的rep/cap基因和/或DNA基因组的核酸序列(即AAV核酸序列)衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其组合。在一个进一步实施方案中,编码AAV载体颗粒的rep/cap基因和/或DNA基因组的核酸序列衍生自AAV2、AAV5和/或AAV9。
或者,在一个实施方案中,rep序列来自AAV血清型,其不同于提供cap序列的AAV血清型。因此,在一个实施方案中,将rep序列与不同AAV血清型的cap序列框内融合以形成嵌合AAV载体。例如,在一个实施方案中,rep基因衍生自AAV2,且cap基因衍生自AAV2或AAV5,以分别产生AAV2-样和AAV5-样颗粒。这些可以被命名为rep2cap2和rep2cap5。
AAV的各种血清型的基因组序列以及天然ITR、rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域中已知的。此类序列可见于文献中或公共数据库诸如GenBank中。参见,例如,GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852和AY530579;将其公开内容通过引用并入本文用于教导AAV核酸和氨基酸序列。
组织特异性被认为由衣壳血清型决定,且因此AAV载体的假型化可用于改变其向性范围。这使AAV成为优先转导特定细胞类型的有用系统。表1概述用于转导特定组织的最佳血清型:
表1:用于转导给定器官的最佳AAV血清型
组织 | 最佳血清型 |
CNS | AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9 |
心脏 | AAV1、AAV8、AAV9 |
肾 | AAV2 |
肝 | AAV2、AAV3、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 |
肺 | AAV4、AAV5、AAV6、AAV9 |
胰腺 | AAV8 |
感光细胞 | AAV2、AAV5、AAV8 |
RPE(视网膜色素上皮) | AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8 |
骨骼肌 | AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 |
脑 | AAV4、AAV9、AAV10 |
提及“假型化”是指来自不同病毒血清型的衣壳和基因组的混合。这些血清型用斜杠表示,例如,AAV2/5表示一种病毒,其包含包装在来自AAV血清型5的衣壳中的AAV血清型2的基因组。这些假型化病毒的使用可以提高转导效率并改变向性。例如,AAV2/5靶向未由AAV2/2有效转导的神经元,并且在脑中更广泛分布,表明提高的转导效率。这些杂合病毒中的许多已经在本领域中被很好地表征。
术语AAV载体、AAV颗粒、AAV载体颗粒、重组AAV颗粒、重组AAV载体颗粒和rAAV可互换使用,并且如本文所用,是指分别由生产细胞或包装细胞产生的有或没有包含ITR的DNA基因组的AAV衣壳。
辅助病毒基因
除了rep和cap蛋白以外,AAV还需要辅助病毒或含有AAV复制所必需的基因的质粒,因为AAV不具有自身复制的能力。在辅助病毒不存在的情况下,AAV可以并入宿主细胞基因组中,尤其是在染色体19的特定位点处。AAV复制所必需的辅助病毒序列是本领域中已知的,例如,参见 。通常,这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。所述辅助病毒基因编码蛋白和非编码RNA。
在一个实施方案中,所述辅助病毒基因衍生自腺病毒。在一个进一步实施方案中,所述腺病毒选自腺病毒2和腺病毒5。
在一个实施方案中,所述辅助病毒基因包含衍生自腺病毒、尤其是腺病毒2的E4、E2a和VA基因的全部或部分。已经发现AAV复制不需要所有天然腺病毒基因,例如,AAV复制仅需要由E4基因的开放阅读框6(ORF 6)编码的E4 34 kD蛋白。因此,在一个进一步实施方案中,所述辅助病毒基因包含E4ORF6编码区、腺病毒E2a 72kD编码区(编码E2a 72kD DNA-结合蛋白)和VA基因。在又一个进一步实施方案中,所述辅助病毒基因还包含腺病毒E1a和E1b基因。
在一个替代实施方案中,所述辅助病毒基因衍生自疱疹病毒。在一个进一步实施方案中,所述疱疹病毒选自:单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)。
每个辅助病毒基因可以由各自的原始启动子或异源启动子控制。
通过将AAV载体产生所需的辅助病毒基因整合至核酸载体/宿主细胞中,应理解该方法可以被认为是无辅助病毒的方法,因为其不需要与野生型辅助病毒共感染。因此,这避免野生型辅助病毒(例如腺病毒)的污染,鉴于载体安全性和特异性,这是非常不期望的。
额外组分
本发明的核酸载体可以包含另外的额外组分。可以使用这些额外特征例如来帮助稳定转录物用于翻译,增加基因表达水平并打开/关闭基因转录。
本发明产生的AAV载体颗粒可用于基因疗法的方法中。因此,在一个实施方案中,所述核酸载体另外包含一种或多种转基因(其也可以称为异源核酸)。该转基因可以是治疗活性基因,其编码可用于治疗或改善靶疾病的基因产物。这可以包括,例如,当靶基因在宿主细胞中没有正确表达时,因此引入靶基因的修正版本作为转基因。因此,所述转基因可能是具有潜在治疗意义的基因。转基因可已经从另一种细胞类型或另一种物种获得,或合成制备。或者,转基因可已从宿主细胞获得,但可操作地连接至与天然基因中存在的那些不同的调节区。或者,转基因可以是存在于宿主细胞中的基因的不同等位基因或变体。
转基因可编码例如反义RNA、核酶、蛋白(例如肿瘤抑制蛋白)、毒素、抗原(其可用于诱导抗体或辅助性T细胞或细胞毒性T细胞)或抗体(诸如单链抗体)。侧接ITR的任何基因都可以有效地包装至AAV衣壳中,只要基因组大小小于5千碱基(kb)。因此,在一个实施方案中,所述转基因小于5 kb长,诸如小于4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1 kb长。
预期含有转基因的转移质粒的多个拷贝导致更高的转基因产量,因此在一个实施方案中,核酸载体包含转基因的多个拷贝,诸如转基因的两个或更多个,特别是三个或更多个拷贝。
在一些情况下,需要多于一种的基因产物来治疗疾病,因此在一个进一步实施方案中,核酸载体另外包含两种或更多种,诸如三种或更多种或四种或更多种不同的转基因。
基因疗法的目的是为了治疗目的而修饰活细胞的遗传物质,并且其涉及将功能基因插入细胞中以实现治疗效果。使用本文所述的核酸载体和宿主细胞产生的AAV载体可以用于转导靶细胞并诱导具有潜在治疗意义的基因的表达。因此AAV载体可用于治疗患有病况(包括但不限于遗传性疾病、癌症和某些病毒感染)的哺乳动物受试者,诸如人受试者。
所述转基因可以编码期望在体外、离体或体内在细胞中产生的任何多肽或RNA。例如,可以将AAV载体引入培养的细胞中,并从中分离表达的基因产物。
本领域技术人员应理解,核酸序列可以与适当的控制序列可操作地结合。例如,所述核酸序列可以与表达控制元件可操作地结合,诸如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等。
在一个实施方案中,核酸载体额外包含转录调节元件。例如,本文描述的任何元件可以可操作地连接至启动子,使得可以控制表达。在一个实施方案中,所述启动子是病毒启动子。在一个实施方案中,所述启动子是高效启动子,诸如CMV启动子。该启动子具有促进在非哺乳动物核酸载体上编码的元件的高水平表达的优点。在另一个实施方案中,CMV启动子包含源自人巨细胞病毒毒株AD169的序列。该序列可得自Genome登录号X17403,例如碱基对173731至174404。在一个替代实施方案中,所述启动子是来自猿猴病毒40的SV40晚期启动子。本文提及的启动子可以包括已知的启动子(完整的或一部分),其可以是组成型起作用的或可诱导的,例如,在调节蛋白存在的情况下。
诱导型表达控制元件在期望其提供对核酸序列表达调控的那些应用中通常是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性,诸如肌肉特异性(包括心脏、骨骼和/或平滑肌特异性),神经组织特异性(包括脑特异性),眼睛特异性(包括视网膜特异性和角膜特异性),肝特异性,骨髓特异性,胰腺特异性,脾特异性或优选以及肺特异性启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件,RU486诱导型启动子,蜕皮激素诱导型启动子,雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在一个实施方案中,启动子另外包含至少一个Tet操纵子。Tet操纵子(四环素控制的转录活化)可用于可诱导基因表达的方法中,其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素)存在下可逆地启动或关闭转录。在自然界中,Ptet启动子表达TetR(阻遏蛋白)和TetA(将四环素抗生素泵出细胞的蛋白)。在本发明中,Tet操纵子可以存在或不存在,例如,在一个实施方案中,Tet操纵子可以存在于启动子中。
Tet操纵子系统可用于控制核酸载体内所含病毒序列的表达。简言之,Tet阻遏蛋白通过结合引入启动子的Tet操纵子位点来阻断表达。因此,当Tet阻遏蛋白与Tet操纵子结合时,没有基因表达。在添加四环素或多西环素后,Tet阻遏蛋白被隔绝以允许启动子活性,因此开启基因表达。Tet操纵子系统是广泛可用的,诸如可得自Invitrogen的pcDNATM4/TO哺乳动物表达载体中使用的Tet操纵子。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含四环素抗性操纵子阻遏蛋白(“Tet阻遏蛋白”或“TetR”)。在一个进一步实施方案中,Tet阻遏蛋白是密码子优化的。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含绝缘子,诸如染色质绝缘子。术语“绝缘子”是指阻断启动子和增强子之间相互作用的基因序列。在一个进一步实施方案中,所述绝缘子(诸如染色质绝缘子)存在于每个病毒核酸序列之间(即,在编码:(i) AAV rep/cap基因;(ii)辅助病毒基因;和(iii) AAV载体颗粒的DNA基因组的核酸序列之间)。在一个进一步实施方案中,绝缘子可以存在于每个辅助病毒基因(例如E1A、E1B,E2A、E4和/或VA)之间。这有助于防止相邻病毒核酸序列之间的启动子干扰(即,来自一个转录单元的启动子损害相邻转录单元的表达)。这也被认为有助于使病毒序列之间重组以生成能够复制的病毒的风险最小化。此外,还认为当它们稳定整合至细胞基因组中时,其有助于减少附近的表达盒的沉默(Moriarity等人, (2013) Nucleic Acids Res. 41: e92; Yahata等人, (2007) J. Mol. Biol. 374: 580–590)。
应理解的是,如果绝缘子存在于核酸载体中在每个核酸序列之间,则它们可以作为核酸载体内的单独表达盒排列。例如,每种核酸序列(即编码AAV载体颗粒)都具有其自身的启动子和/或内含子和/或polyA信号。
在一个实施方案中,染色质绝缘子与原鸡(Gallus gallus)HS4 (cHS4)绝缘子序列(例如参见Genome登录号U78775.2,碱基对1至1205)具有至少90%的序列同一性,例如至少95%的序列同一性。在一个进一步实施方案中,所述绝缘子包含两个串联的cHS4绝缘子序列(近似2.4千碱基),即2x cHS4。
在一个实施方案中,所述核酸载体包含编码shRNA的核酸序列,所述shRNA靶向rep转录物(rep mRNA分子)。以此方式,可以控制Rep蛋白的表达。shRNA本身的表达可以在诱导型启动子的控制下。在转录物水平上控制Rep蛋白的表达的优势在于,可以维持rep和cap基因的所有天然启动子(P5、P19和P40),以便维持有效AAV载体生产所需的各种rep和cap转录物的正确化学计量。其也意味着rep和cap基因的完整性不受影响,因为不需要对其进行修饰。
在一个进一步实施方案中,所述核酸载体包含编码shRNA的核酸序列,所述shRNA靶向E1A转录物。靶向E1A转录物的shRNA提供了额外水平的Rep表达的控制,其通过控制E1A表达间接发挥作用。这在组成性表达腺病毒E1A辅助病毒基因的细胞系中特别有利。腺病毒E1A辅助基因产物活化其他腺病毒辅助基因(诸如E1B、E2和E4)的启动子,以及与宿主蛋白YY1的结合,以使得能够活化用于表达Rep蛋白的AAV P5启动子(Qiao等人(2002) J.Virol. 76:1904)。
控制E1A表达的一个进一步优势是间接控制E4表达,由于其诱导凋亡的能力,已知其对宿主细胞有毒性(Lavoie等人(1998) JCB 140:637; Shtrichman和Kleinberger(1998) J. Virol. 72:2975)。在AAV载体颗粒生产期间,抗E1A shRNA的表达可以被阻断,使得其调节的E1A和E4两者能够表达,活化有效AAV载体生产所需的辅助功能。
在一个实施方案中,编码靶向AAV rep mRNA分子或E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列是微-RNA适应的,例如使得能够通过RNA聚合酶II转录。“微-RNA适应的”意味着将微-RNA序列添加至shRNA的有义链的上游和/或引导链的下游。
在一个实施方案中,靶向AAV rep mRNA的shRNA结合编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40蛋白的AAV rep mRNA分子中的一种或多种。在一个实施方案中,靶向AAV rep mRNA的shRNA结合编码Rep78和Rep68蛋白的AAV rep mRNA分子。在一个进一步实施方案中,shRNA结合编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40蛋白的所有rep mRNA分子。
在一个实施方案中,编码靶向AAV rep mRNA分子的shRNA的核酸序列包含5'-TTTGACGTAGAATTCATGCTC-3'。该序列是靶向链(也称为引导链)序列。技术人员将知道作为发夹的shRNA也需要互补的有义链序列和它们之间的环序列。所述靶向链在有义链的3',以确保靶向链是加载至RISC中的链。
AAV2 rep基因的区域(野生型AAV2的核苷酸190-540)被鉴定为顺式作用的Rep依赖性元件(CARE)。当顺式存在时,显示CARE加强AAV DNA基因组的复制和衣壳化。这可以通过产生更多的rep和cap基因的DNA拷贝来实现。还显示CARE在腺病毒和Rep蛋白存在的情况下参与整合序列的扩增(Nony等人(2001) J. Virol. 75:9991; Tessier等人 (2001) J.Virol. 75:375)。CARE被Rep蛋白结合,并且已显示是病毒复制和包装期间AAV基因组扩增的起始位点。产生AAV基因组的双链染色体外拷贝,在实验模型中将基因组扩增约100倍。将该元件置于靶向rep的shRNA(或微-RNA适应的shRNA)旁边,将意味着该元件也将与AAV基因组一起扩增。因此,当表达Rep时,还将产生编码靶向AAV rep mRNA分子的shRNA的DNA序列的额外拷贝,由此产生Rep抑制的自我调节反馈环。
因此,在一个实施方案中,编码靶向AAV rep mRNA分子和/或E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列与编码顺式作用的Rep依赖性元件(CARE)的核酸序列(即野生型AAV2的核苷酸190-540)相邻或紧邻定位。紧邻意指足够接近以引起编码shRNA的核酸序列的扩增。在一个进一步实施方案中,编码CARE的核酸序列以相反方向位于编码shRNA的核酸序列的3'。通过将CARE序列添加在编码shRNA的核酸序列的3',可以确保在由CARE扩增的编码shRNA的核酸序列的区段中,仅将转录包含全长shRNA和启动子的那些序列。这将帮助防止部分shRNA序列对内源性Drosha蛋白的超载。
技术人员将意识到本领域可用于设计针对特定靶序列(诸如由AAV rep和cap基因编码的mRNA分子)的有效shRNA的方法。例如,有效shRNA设计的标准概述于Dow等人(Dow等人(2012) Nat. Protoc. 7:374)。此外,发现并排序符合如Dow等人中所概述的有效shRNA的标准的shRNA靶序列的在线工具是可得的,如Adams等人(Adams等人 (2017),Biomaterials 139:102)中所提及。
一旦已制备shRNA质粒并将其引入细胞,就可以使用本领域中众所周知的方法,例如通过如Moore等人中所述的定量PCR分析或Western印迹,证实Rep蛋白的有效敲低。
在一个实施方案中,靶向rep转录物的shRNA和/或靶向E1A转录物的shRNA的表达在Ptet启动子的控制下。例如,“tet-off”系统可用于表达AAV载体生产所需的基因。tet-应答性反式活化蛋白,tTA,将从构建体组成型表达。在正常细胞培养条件下,tTA蛋白会结合含有tet-操纵子的启动子并活化靶向rep的shRNA的转录,敲低Rep在细胞中的表达。当细胞达到用于进行AAV载体颗粒生产的正确密度时,向细胞中添加多西环素(DOX)将使tTA反式活化蛋白不稳定,使得靶向rep转录物的shRNA的转录会停止,允许细胞表达Rep。
当在“关闭”状态时具有低背景表达、而在“打开”状态时保留高转录活化水平的Ptet启动子是由Loew等人(Loew等人, (2010) BMC Biotechnology 10: 81)描述的Ptet-T6启动子。像原始的tet-应答性启动子Ptet-1及其改进的市售衍生物Ptet-14 (也称为Ptight)一样,Ptet-T6含有最小CMV立即早期启动子上游串联的7个tet操纵子结合序列以及来自芜菁黄花叶病毒的修饰的5'非翻译序列。在一个实施方案中,Ptet启动子是Ptet-T6。
在一个实施方案中,所述核酸载体另外包含可选择标记。这允许选择已经并入编码复制缺陷型AAV载体颗粒的核酸序列的细胞。在一个进一步实施方案中,可选择标记是药物抗性基因,诸如抗生素抗性基因,例如博莱霉素、卡那霉素或嘌呤霉素抗性基因,特别是博莱霉素(ZeoR)抗性基因。在又一个进一步实施方案中,所述博莱霉素抗性基因源自印度异壁链霉菌(Streptoalloteichus hindustans) ble基因,例如参见GenBank登录号X52869.1,从碱基对3至377。
基因扩增的自然现象已经在生物制药工业中被开发为增加细胞系产生的重组产物的滴度的方式。在重组基因已整合至宿主细胞的基因组中的情况下,则可以通过选择其中整合至宿主细胞基因组中后已扩增重组基因的细胞系来增加重组基因的拷贝数和伴随表达的重组蛋白的量。因此,在一个实施方案中,所述可选择标记是可扩增选择标记。
可以通过用可扩增选择标记基因稳定转染宿主细胞来诱导基因扩增。稳定转染的宿主细胞经受渐增浓度的毒性药物,已知所述毒性药物抑制可扩增选择标记。例如,可以在含有毒性药物的培养基中培养转染的细胞,所述毒性药物的浓度实现在将亲本细胞(即未转染的细胞)铺板于含有毒性药物的培养基中后的3-5天内的大于98%的细胞的杀死。通过这种抑制,可以选择细胞群体,其具有增加的可扩增选择标记的表达水平,和因此对所用浓度的药物的抗性。
本发明的核酸载体允许其中含有的所有表达盒(即核酸载体DNA)在宿主细胞基因组内的单一基因座处一起整合。由于基因扩增的过程引起可扩增选择标记基因和周围DNA序列的扩增,因此也将扩增整合的核酸载体DNA中的剩余DNA序列。以此方式,通过使用本发明的核酸载体,可以提供用于稳定整合至宿主细胞基因组中的病毒载体基因的基因扩增的方法。
每种可扩增选择标记具有相关的选择剂(即毒性药物),其在扩增和选择方案期间被添加至细胞培养基中。合适的可扩增选择标记/选择剂组合包括腺苷脱氨酶/脱氧助间型霉素、天冬氨酸转氨甲酰酶/ N(磷酸乙酰基)-L-天冬氨酸、二氢叶酸还原酶/甲氨蝶呤、谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亚砜亚胺、金属硫蛋白-l/重金属。
在一个实施方案中,在表达盒中提供了可扩增选择标记基因和/或可选择标记。
在一个实施方案中,所述可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)。DHFR选择方法涉及将dhfr基因(可扩增选择标记基因)并入核酸载体,由此诱导对核酸载体内的其他表达盒的DHFR选择压力。宿主细胞用核酸载体转染,并在渐增浓度的DHFR抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的存在下生长,以选择已扩增整合至宿主基因组中的dhfr基因和伴随剩余的整合核酸载体DNA的细胞。
在一个实施方案中,所述dhfr基因包含与Genome登录号NM_010049.3至少60%序列同一性,诸如至少70%、80%、90%或100%序列同一性。
在另一个实施方案中,所述可扩增选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)。GS选择方法涉及将gs基因并入核酸载体,由此对核酸载体内的其他表达盒诱导GS选择压力。宿主细胞用核酸载体转染,并在渐增浓度的GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的存在下生长,以选择已扩增整合至宿主基因组中的gs基因和伴随剩余的整合核酸载DNA的细胞。
包含gs基因的核酸序列的表达构建体可以含有本领域中已知的编码gs基因的表达构建体的核酸序列(例如WO874462,其中含有的序列通过引用并入本文)。
通过以这种方式使用可扩增选择标记和相关的选择剂,随后为培养期以允许选择在新的(增加的)浓度的相关试剂中生长的细胞,可以扩增携带选择压力的基因组的区域,由此增加可扩增选择标记的拷贝数。因此,当将包含病毒基因的核酸载体的表达盒与包含可扩增选择标记基因的表达盒一起整合至宿主基因组中的单一基因座处时,这些表达盒也被扩增。因此,然后,针对滴度/产率筛选通过此类轮次的扩增和选择而生长的细胞系,并选择最佳克隆用于AAV病毒载体颗粒的随后产生。
在一个优选实施方案中,所述宿主细胞对于可扩增选择标记是阴性的。也就是说,所述宿主细胞的内源基因组不包含内源的可扩增选择标记基因。例如,当使用DHFR作为可扩增选择标记时,优选采用DHFR阴性的宿主株,诸如CHO DG44或CHO DUX-B11。
然而,本发明不受限于特定宿主细胞系的选择。可以在本发明的方法中使用任何细胞系,其具有快速生长速率(即,倍增时间为12小时或更短)并且能够以合理的速率扩增可扩增选择标记基因而不以相似或更高的速率扩增内源可扩增选择标记基因。
通过确定细胞在渐增浓度的选择剂中生长的能力与可扩增选择标记的拷贝数增加(这可以通过经由Southern印迹证明可扩增标记的拷贝数的增加直接测量或通过经由Northern印迹或qPCR证明由可扩增标记产生的mRNA的量的增加间接测量)相关,鉴定用显性标记(即外源可扩增选择标记)转导的细胞系。
在宿主细胞包含内源可扩增选择标记基因的情况下,除了可扩增选择标记以外,核酸载体可以进一步包含编码可选择标记的核酸序列。这避免了在用相关选择剂进行选择期间扩增内源可扩增选择标记基因的问题。所述宿主细胞用包含可扩增选择标记以及可选择标记的核酸载体转染。首先针对在可选择标记的抗生素诸如博莱霉素或潮霉素p中生长的能力选择转染的宿主细胞。然后针对在渐增浓度的选择剂诸如MTX中生长的能力选择细胞。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含polyA信号。polyA信号的使用具有保护mRNA免于酶促降解并帮助翻译的优点。在一个进一步实施方案中,polyA信号获得自或源自SV40、牛生长激素和/或人β球蛋白。在一个实施方案中,polyA信号源自SV40早期polyA信号(例如参见Genome登录号EF579804.1,来自负链的碱基对2668至2538)。在一个实施方案中,polyA信号源自人β球蛋白polyA信号(例如,参见Genome登录号GU324922.1,碱基对3394至4162)。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含内含子序列。已知在增强子/启动子区下游和cDNA插入片段(即转基因)上游使用内含子增加插入片段的表达水平。在一个进一步实施方案中,内含子序列是人β球蛋白内含子或兔β球蛋白内含子II序列。在一个实施方案中,人β球蛋白内含子源自在Genome登录号KM504957.1可得的序列(例如来自碱基对476至1393)。在一个实施方案中,兔β球蛋白内含子II源自在Genome登录号V00882.1可得的序列(例如,碱基对718至1290)。
在一个实施方案中,所述核酸载体包含插入腺病毒rep/cap基因中的内含子。在一个优选实施方案中,所述内含子是填充有λ噬菌体DNA的片段的β-球蛋白内含子。
当表达AAV Rep和Cap的细胞中存在侧接AAV ITR的转基因(即重组DNA基因组)时,Rep蛋白结合侧接转基因的ITR,起始复制并产生侧接ITR的转基因的单链拷贝。然后,Rep指导将该ssDNA包装至细胞核中的组装AAV衣壳中。
在一个实施方案中,所述核酸载体包含编码单链结合(SSB)蛋白的核酸序列。在一个实施方案中,SSB蛋白是大肠杆菌SSB蛋白。
尽管在侧接ITR的基因疗法转基因和AAV rep/cap基因之间没有重叠序列,但仍然存在生成野生型的能够复制的AAV(其中rep和cap通过非同源重组插入ITR之间)的可能性(Allen等人, (1997) Journal of Virology 71: 6816-6822)。因此,rAAV载体颗粒的产生也可以导致不可能与基因疗法载体颗粒分离的野生型AAV载体颗粒的产生。尽管AAV尚未与人类中的任何疾病相关并且具有低免疫原性,但这仍然造成安全担忧。
在文献中已经测试了尝试和防止rep/cap与ITR重组的几种方法,例如将rep和cap分成分开的质粒或去除AAV ITR的D-序列的远端10个核苷酸,以及使用缺乏任何ITR的腺病毒辅助基因。然而,这些方法通常导致rAAV包装效率降低,且因此导致载体产量降低。Cao等人(Cao等人, (2000) Journal of Virology 74: 11456-11463)测试了通过将大的填充的内含子插入rep/cap质粒的rep基因中来阻断能够复制的AAV的产生的方法。该额外内含子在mRNA加工期间被剪接出来,使得仍然可以产生Rep蛋白,但其也将AAV基因的长度增加至这样的大小,如果它们与侧接转基因的ITR重组,则将不再有效包装至AAV衣壳中。它们使用的内含子是850 bp人β-球蛋白内含子,其在Rep78/68起始密码子下游的位置333 bp处的rep中P5启动子的下游插入。在测试具有额外内含子的rep/cap质粒的实验中,与当使用没有额外内含子的rep/cap时相比,他们看到携带GFP转基因的rAAV产量没有差异,如当细胞用载体转导时每个视场的GFP阳性细胞的平均数目所示。为了进一步扩增β-球蛋白内含子,他们产生这样的质粒,其中通过将EcoRI + HindIII消化的λ噬菌体基因组的各个片段插入内含子的MfeI位点来填充内含子。当使用具有填充的内含子的这些质粒产生的rAAV用于转导受体细胞时,转染后36小时,通过PCR无法在细胞中检测到能够复制的AAV。此外,他们发现含有填充有λ噬菌体DNA的1.5 kb片段的β-球蛋白内含子(产生2.35 kb内含子)的rep/cap质粒,当与使用没有任何额外内含子的rep/cap质粒产生的载体相比时,rAAV的产量增加5-10倍。当使用该2.35 kb内含子质粒时,用抗Rep抗体探测的生产细胞裂解物的Western印迹显示Rep52和Rep40变体的比率增加。Rep变体的化学计量的这种改变可以对重组GFP转基因的包装具有积极影响。由于显示这种填充的内含子既显著降低产生能够复制的AAV的可能性,又增加重组载体产量。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。WPRE的存在已经显示增强表达,且因此可能有利于获得高水平的表达。在一个进一步实施方案中,WPRE源自在Genome登录号J04514.1可得的序列(例如,碱基对1093至1684)。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES允许以独立于末端的方式起始翻译。IRES是结构化的RNA元件,其通常见于病毒的5'-非翻译区(UTR)中,在5'-帽的下游(其是装配起始复合物所需的)。IRES被翻译起始因子所识别,并允许不依赖于帽的翻译。在一个进一步实施方案中,IRES源自脑心肌炎病毒(EMCV)基因组(例如,参见Genome登录号KF836387.1,碱基对151至724)。
在一个实施方案中,核酸载体另外包含多克隆位点(MCS)。MCS是含有多个限制性位点(例如10、15或20个位点)的核酸载体内的DNA短片段。这些位点通常在核酸载体内仅出现一次,以确保核酸内切酶仅在一个位点处切割。这允许使用合适的核酸内切酶(即限制酶)容易地插入病毒基因。
本领域技术人员应理解,所述盒可以在核酸载体内以任何顺序排列。在一个示例性实施方案中,核酸载体包含以下插入片段:编码辅助病毒基因(诸如腺病毒)的核酸序列,编码AAV rep/cap基因、四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)、内部核糖体进入位点和可选择标记(诸如博来霉素抗性选择标记)的核酸序列(即Rep-Cap-辅助病毒-Tet阻遏子-IRES-抗生素抗性标记-剩余的BAC序列(“BAC骨架”,例如pSMARTBAC))。所述核酸载体可以进一步包含AAV载体颗粒的DNA基因组,例如在两个AAV ITR之间编码的转基因,任选地包括启动子和/或polyA信号。可以将此插入可选择标记之后(即Rep-Cap-辅助病毒-Tet阻遏子-IRES-抗生素抗性标记-AAV基因组-剩余的BAC序列(“BAC骨架”,例如pSMARTBAC))。
在一个进一步实施方案中,绝缘子(诸如染色质绝缘子)存在于编码以下的核酸序列之间:(i) AAV rep/cap基因;(ii)辅助病毒基因;(iii)AAV载体颗粒的DNA基因组(例如,两个AAV ITR之间的转基因)。在一个进一步实施方案中,启动子存在于编码以下的核酸序列之前:(i) AAV rep/cap基因;(ii)辅助病毒基因;(iii)AAV载体颗粒的DNA基因组。
在一个实施方案中,所述核酸载体包含以下插入片段:可操作连接至启动子的腺病毒辅助基因E2A,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的腺病毒辅助基因E4,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的腺病毒辅助基因VA,绝缘子(诸如染色质绝缘子),编码AAV rep/cap基因的核酸序列,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可选择标记(诸如博来霉素抗性选择标记),绝缘子(诸如染色质绝缘子),包含可操作连接至两个AAVITR之间的启动子的转基因的核酸序列和多克隆位点。
在如图2中的示意图所代表的一个进一步实施方案中,所述核酸载体包含以下插入片段:可操作连接至包含IRES的选择标记的tTA基因,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的腺病毒辅助基因E2A,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的腺病毒辅助基因E4,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的腺病毒辅助基因VA,绝缘子(诸如染色质绝缘子),编码AAV rep和cap基因的核酸序列,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的编码靶向由AAV rep基因编码的AAV rep mRNA分子的shRNA的核酸序列,绝缘子(诸如染色质绝缘子),可操作连接至启动子的编码靶向由腺病毒E1A基因编码的腺病毒E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列,绝缘子(诸如染色质绝缘子),包含可操作连接至两个AAV ITR之间的启动子的转基因的核酸序列,和多克隆位点。
可以将核酸序列依次引入核酸载体中。这允许在每次整合后进行选择,以确保所有需要的核酸序列均成功整合至核酸载体中。或者,将至少两个或更多个核酸序列同时引入核酸载体中。
应理解的是,可以通过本领域已知的标准分子克隆技术,例如使用限制性核酸内切酶和连接技术,将本文所述的额外基因引入核酸载体中。此外,可以通过标准技术(诸如,电穿孔)将核酸载体,尤其是BAC、PAC、F粘粒和/或粘粒引入细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞,特别是大肠杆菌菌株DH10B)。
用途
根据本发明的一个进一步方面,提供了用于产生AAV包装或生产细胞系的如本文所定义的核酸载体。
本文描述的核酸载体可用于产生AAV包装细胞系,其将大大简化AAV载体的生产。应理解的是,如果在核酸载体上包括转基因,则这将用于产生生产细胞系。
如本文所述,开发稳定的AAV包装(或生产)细胞系以克服与瞬时转染相关的困难将是有用的。本文所述的核酸载体可以用于制备所述包装细胞系,因为它们能够容纳含有AAV包装所需的必需基因的大的DNA插入片段,然后可以在一个步骤中将其整合至哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。
宿主细胞
根据本发明的一个进一步方面,提供了用于产生AAV载体颗粒的AAV包装细胞,其包含编码以下的核酸序列:
AAV rep/cap基因;和
辅助病毒基因;
其中所述核酸序列全部一起整合于AAV包装细胞基因组内的单一基因座处。应理解的是,这些核酸序列作为单独的表达盒存在,其防止重组以形成能够复制的病毒的任何风险。
将AAV载体产生所必需的所有病毒基因包括在大型核酸载体上的优点在于,它们可以首先在微生物细胞(诸如细菌或酵母细胞)中制备,其更易于操作和操纵,然后在单一步骤中整合至哺乳动物细胞中。一旦病毒基因被整合至哺乳动物宿主细胞中,这就减轻选择压力并减少沉默时间段。该方法的特征性特征在于,创建AAV包装细胞系所需的所有基因都存在于内源基因组的单一基因座中,而不是随机分散在整个内源基因组中。这具有产生以同一水平表达所有病毒基因的AAV包装细胞的优点,因为它们都位于同一基因座,相比之下,在先前的方法中,病毒基因随机整合至整个内源基因组中,这可导致不均匀水平的表达。
应理解的是,核酸载体构建体可以在宿主细胞基因组中在不同染色体上的多个不同位置处整合多于一次(尽管所有编码的核酸序列都存在于单一基因座中)。因此,提及“单一基因座”不排除核酸序列在AAV包装细胞基因组内的多个基因座处全部定位在一起的可能性。这对于增加转基因的表达水平可能是有益的,并且可能潜在地提高AAV滴度。可以通过qPCR比较源自单独克隆的细胞群体之间的构建体插入的拷贝数。
在一个实施方案中,AAV包装细胞另外包含编码AAV载体颗粒的DNA基因组的核酸序列。这也可以与编码AAV rep/cap基因和辅助病毒基因的核酸序列位于单个基因座处。当宿主细胞中存在AAV载体颗粒的DNA时,应理解该细胞可被称为AAV生产细胞。
因此,根据本发明的一个进一步方面,提供了用于产生AAV载体颗粒的AAV生产细胞,其包含编码以下的核酸序列:
AAV rep/cap基因;
辅助病毒基因;和
AAV载体颗粒的DNA基因组,
其中所述核酸序列全部一起整合于AAV生产细胞基因组内的单一基因座处(即,作为单独的表达盒)。
在一个实施方案中,所述AAV包装细胞是哺乳动物细胞。在一个进一步实施方案中,所述哺乳动物细胞选自HEK 293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在又一个进一步实施方案中,所述哺乳动物宿主细胞是HEK293细胞,或源自HEK 293细胞。此类细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个进一步实施方案中,所述HEK 293细胞是HEK 293T细胞。术语“HEK 293细胞”是指通常用于生物技术中的人胚肾293细胞系。具体而言,HEK 293细胞通常用于产生AAV载体,因为它们已经含有E1A和E1B辅助病毒基因,因此仅需要提供E2A、E4ORF6和VA辅助因子。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX™ (Life Technologies)细胞系。
在一个实施方案中,与宿主细胞的相同物种的野生型株相比,宿主细胞过表达单链结合(SSB)蛋白。在一个实施方案中,所述宿主细胞包含编码单链结合(SSB)蛋白的外源核酸序列。
应理解的是,上文针对核酸载体描述的所有实施方案也可以应用于本发明的AAV包装/生产细胞。
方法
根据本发明的一个进一步方面,提供了产生稳定的AAV包装细胞系的方法,其包括:
(a) 将如本文所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中;和
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
应当理解,本文定义的方法适合于产生AAV的所有血清型和嵌合体,例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其任何嵌合体。
在一个实施方案中,所述哺乳动物宿主细胞选自HEK 293细胞、HEK 6E细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在一个进一步实施方案中,所述哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞,或源自HEK 293细胞。此类细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个进一步实施方案中,所述HEK 293细胞是HEK 293T细胞或HEK 6E细胞。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX™ (Life Technologies)细胞系。
技术人员将意识到,可以使用本领域已知的合适方法,例如脂质介导的转染、显微注射、细胞(诸如微细胞)融合、电穿孔或微粒轰击,以将核酸载体引入宿主细胞。在一个实施方案中,通过电穿孔将核酸载体引入宿主细胞。应理解的是,用于引入核酸载体的方法的选择可以根据使用的哺乳动物宿主细胞的类型来选择。
一旦在哺乳动物宿主细胞内,核酸载体将被随机整合至哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。因此,该方法还包括选择其中已经整合在核酸载体上编码的核酸的哺乳动物宿主细胞(例如,使用抗生素抗性选择标记,诸如博莱霉素抗性标记)。
本领域技术人员将意识到促进核酸载体整合的方法,例如,如果核酸载体是天然环状的(例如,BAC、PAC、粘粒或F粘粒),则将其线性化。核酸载体可以另外包含与哺乳动物宿主细胞的内源染色体共有同源性的区域,以引导整合至内源基因组内的选定位点。此外,如果重组位点存在于核酸载体上,则这些可用于靶向重组。例如,核酸载体可含有loxP位点,其与Cre重组酶(即,使用来源自P1噬菌体的Cre/lox系统)组合时允许靶向整合。或者(或另外),重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体),其中att位点允许在λ整合酶存在下进行定点整合。这将允许病毒基因靶向至内源基因组中的基因座,其允许高表达和/或稳定表达。
其他靶向整合方法是本领域众所周知的。例如,可以使用诱导基因组DNA的靶向切割的方法来促进选择的染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程改造的切割系统来诱导内源基因组中的双链断裂(DSB)或切口以通过天然过程(诸如非同源性末端接合(NHEJ))修复断裂或使用修复模板修复(即,同源性定向修复或HDR)。
通过使用特定的核酸酶诸如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、使用CRISPR/Cas9系统与工程改造的crRNA/tracr RNA('单引导RNA')指导特异性切割和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如来自嗜热栖热菌(T. thermophilus),称为'TtAgo',参见Swarts等人,(2014) Nature 507(7491): 258-261),可发生切割。使用这些核酸酶系统之一的靶向切割可以用于使用HDR或NHEJ介导的过程将核酸插入特定的靶位置。因此,在一个实施方案中,该方法另外包括使用至少一种核酸酶将在核酸载体上编码的核酸序列整合至哺乳动物宿主细胞的基因组(即内源染色体)中,其中所述至少一种核酸酶切割哺乳动物宿主细胞的基因组,使得核酸序列整合至细胞的基因组中。在一个进一步实施方案中,所述核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN),TALE核酸酶(TALEN),CRISPR/Cas核酸酶系统及其组合。
根据本发明的一个进一步方面,提供了通过本文定义的方法获得的AAV包装或生产细胞。
使用本文定义的方法获得的细胞系可用于产生高滴度的AAV载体。病毒滴度可通过定量PCR(qPCR)(其提供AAV颗粒的基因组拷贝数)和通过ELISA(其提供传染性病毒滴度的TCID50量度)进行测量。通过比较两个测量值,可以测定AAV批次的转导效率。
本文中提及术语“高滴度”是指能够转导靶细胞诸如患者细胞的有效量的AAV载体颗粒。在一个实施方案中,高滴度为,超过106 TU/ml而没有浓缩(TU=转导单位)。
在一个实施方案中,本文定义的方法是可扩展的,因此它们可以在任何期望体积的培养基中进行,例如,10 ml(例如在摇瓶中)至10 L、50 L、100 L或更大(例如在生物反应器诸如波浪式生物反应器系统和搅拌釜中)。
根据本发明的一个进一步方面,提供了产生复制缺陷型AAV载体颗粒的方法,其包括:
(a) 将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中;
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞;和
(c) 在产生复制缺陷型AAV载体颗粒的条件下进一步培养选择的哺乳动物宿主细胞。
如前文所述,在一个实施方案中,所述哺乳动物宿主细胞选自HEK 293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在一个进一步实施方案中,所述哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞,或源自HEK 293细胞。此类细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个进一步实施方案中,所述HEK 293细胞是HEK 293T细胞。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX™ (Life Technologies)细胞系。
本领域技术人员应理解,本文描述的方法中使用的条件将取决于所使用的宿主细胞。典型的条件,例如待使用的培养基或温度,是本领域众所周知的。在一个实施方案中,培养通过在湿润条件下孵育哺乳动物宿主细胞来进行。在一个进一步实施方案中,湿润条件包括在37℃、5% CO2下孵育转染的细胞。在一个实施方案中,使用选自以下的培养基进行培养:含有10% (vol/vol)胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM),无血清UltraCULTURETM培养基(Lonza,目录号12-725F)或FreeStyleTM表达培养基(ThermoFisher,目录号12338-018)。
适当的培养方法是本领域技术人员众所周知的。例如,可以在悬浮液和/或无动物组分的条件下培养细胞。在一个实施方案中,所述细胞适合于在任何体积的培养基、从10ml(例如在摇瓶中)至10 L、50 L、100 L或更多(例如在生物反应器中)中培养。
如本文所述,使用请求保护的发明降低质粒制造的成本,降低对转染试剂(例如,聚乙烯亚胺[PEI])的需求,降低所需的BenzonaseTM处理量(病毒收获物中DNA的量减少,因此需要更少的BenzonaseTM以去除下游处理中的过量)并降低测试的成本(无需测试病毒产品中的残留质粒)。所有这些优点可以被认为是本发明的方面。
在一个实施方案中,该方法另外包括分离复制缺陷型AAV载体颗粒。例如,在一个实施方案中,通过使用过滤器来进行分离。在一个进一步实施方案中,过滤器是低蛋白结合膜(例如,0.22μm低蛋白结合膜或0.45μm低蛋白结合膜),诸如聚偏氟乙烯(PVDF)或聚醚砜(PES)人工膜。
一旦在哺乳动物宿主细胞内,存在于核酸载体上的核酸序列可被整合至内源基因组内的随机、单一基因座中(或多次且因此在多于一个基因座处)。整合步骤可以如上文所述促进,例如使用线性化和/或共享同源性的区域。重组位点也可用于靶向重组。
如果靶基因被整合至具有选择标记(诸如抗生素抗性基因)的内源染色体中,则该方法可以还包括选择其中病毒核酸已成功整合的哺乳动物宿主细胞。
一旦分离,AAV载体颗粒可以浓缩用于体内应用。浓缩方法包括例如超速离心、沉淀或阴离子交换色谱。超速离心作为小规模AAV载体浓缩的快速方法是有用的。或者,阴离子交换色谱(例如使用Mustang Q阴离子交换膜盒)或沉淀(例如使用PEG 6000)对于处理大体积的AAV载体上清液特别有用。
根据本发明的一个进一步方面,提供了通过本文定义的方法获得的复制缺陷型AAV载体颗粒。
现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例
实施例1:AAV细菌人工染色体的设计
可以使用本领域中已知的方法设计本发明的核酸载体。本文提供了一种详细的示例性方法:
设计Gibson克隆引物以扩增构建体中的四环素控制的反式激活因子(tTA)基因,所述构建体包括PCMV启动子、IRES和博莱霉素抗性基因(顺序为PCMV-内含子-tTA-ZeoR-polyA)。所述引物允许通过Gibson组装法克隆至pSMART BAC骨架(Lucigen Corp.)中。在polyA和质粒之间包括用于顺次iBrick克隆(Liu等人(2014) PLoS One 9(10):e110852,其通过引用并入本文)的PI-PspI的限制性位点。
如下将串联的两个鸡HS4 (cHS4)绝缘子在ZeoR polyA的3'克隆至PI-PspI位点中。使用I-SceI正向引物和PI-PspI反向引物扩增来自pMA-BACmod-GSKCOTR-IR-Zeo的2xcHS4片段。在I-SceI位点和2xcHS4绝缘子之间的是MluI和NheI的限制性位点。将该片段亚克隆至pCR-Blunt II TOPO (Thermo Fisher)中。将此用作BAC供体载体。
用I-SceI和PI-PspI消化pCR-Blunt II TOPO中的2xcHS4片段。将pSMART BAC用PI-PspI消化并脱磷酸。然后,将I-SceI和PI-PspI消化的2xcHS4克隆至PI-PspI位点中。这将消除5' PI-PspI位点,并在2xcHS4的下游留下完整的PI-PspI位点。
将待通过iBrick克隆插入pSMART BAC的所有其他盒克隆至BAC供体载体中的2xcHS4上游的MluI和NheI位点。然后,这些可以用I-SceI和PI-PspI消化掉,并且每次在3'末端包括2xcHS4。使用MluI正向引物和XbaI反向引物或在基因合成中包括这些位点,将消除除了插入ZeoR下游的第一个cHS4以外所有2xcHS4上游的NheI。该方法例外的基因盒是E2A,其含有MluI位点,且因此使用与2xcHS4分开的iBrick克隆插入BAC中;以及VA,其含有NheI和XbaI位点,且因此反向引物应当包括AvrII错配位点(与供体质粒中NheI相容的末端)。
将AAV rep/cap基因克隆至BAC供体载体中的2xcHS4绝缘子的上游。然后将此iBrick克隆至BAC中。
接下来,将每种腺病毒辅助基因克隆至2xcHS4绝缘子上游的BAC供体载体中。也将这些iBrick克隆至BAC中。
将完整BAC构建体稳定转染至宿主细胞中以制备稳定细胞系。然后测试细胞系的AAV滴度。
实施例2:具有额外组分的AAV BAC的设计和合成
产生BAC,其含有克隆至其中的rAAV颗粒生产所需的每个遗传元件(即表达盒):AAVrep/cap基因;辅助病毒基因和AAV载体颗粒的重组DNA基因组。此外,还包括额外组分,如下所概述。
为了控制在转染的哺乳动物细胞中表达的AAV Rep的水平,决定在构建体中包括在条件启动子(Ptet-T6)的控制下的靶向Rep和E1A的shRNA。
BAC还包括四环素敏感的转录激活因子tTA。在正常生长条件下,其中构建体被稳定整合至基因组中的悬浮适应的HEK293细胞将表达shRNA,并且敲低Rep和E1A表达。当细胞达到适合于rAAV颗粒生产的密度时,可以将多西环素(DOX)添加至生长培养基中。这将使tTA反式激活因子不稳定并关闭shRNA的转录,允许产生Rep和E1A,并继续rAAV颗粒产生。
还将填充的(padded)内含子插入rep基因中,以减少能够复制的AAV(rcAAV)形成的可能性,并且具有增加生产细胞中的rAAV颗粒的产量的额外益处(Cao等人, (2000)Journal of Virology 74: 11456-11463)。
2.1: 填充的人β-球蛋白内含子序列的设计和合成
Cao等人(Cao等人, (2000) Journal of Virology 74: 11456-11463)已经通过经由PCR扩增人β-球蛋白内含子B而产生填充的内含子,并且将该片段克隆至质粒中。将λ噬菌体DNA用EcoRI + HindIII消化,并将1.5 kb片段克隆至β-球蛋白基因的MfeI位点中。
为了在计算机上重现该工作,将智人β-球蛋白基因(登录号AH001475)和肠杆菌噬菌体λ完整基因组序列(登录号J02459)输入来自GenBank的SnapGene软件(GSL BiotechLLC)。β-球蛋白内含子B在GenBank序列中注释为核苷酸2057-2906之间的850 bp。用EcoRI+ HindIII消化的λ噬菌体基因组序列的模拟琼脂糖凝胶揭示1.375和1.709 kb片段,而不是预期的1.5 kb片段。1.375 kb EcoRI/HindIII片段含有在5'末端的EcoRI位点和在3'末端的HindIII位点。将该序列拷贝并粘贴至β-球蛋白内含子B序列的核苷酸位置174处的MfeI位点中。所得的填充的内含子序列长2225 bp。为了用与待插入的rep2基因的区域具有序列同源性的引物扩增该片段,将序列添加至与侧接rep2中的插入位点的序列同源的序列的5' (TGGACGTTTCCTGAGTCAG; SEQ ID NO:1)和3' (ATTCGCGAAAAACTGATTCAG; SEQ IDNO:2)末端。然后合成该序列并将其连接至pG.AAV2.R2C2和pG.AAV2.R2C5中以分别形成pG.AAV2.R2C2-内含子和pG.AAV2.R2C5-内含子。
2.2: 靶向AAV rep mRNA分子的shRNA的设计和合成
设计靶向P19启动子下游的AAV2 rep基因转录物的shRNA。仅靶向P19下游的序列,而不包括rep内含子中存在的序列,意味着靶向所有4种rep mRNA变体用于敲低。
设计21-核苷酸shRNA序列,其与来自AAV2的rep和cap基因以及来自AAV5的cap的区域具有同源性,其符合如Dow等人(Dow等人, (2012) Nature Protocols 7:347-393)所概述的有效shRNA的标准。这些标准如下:
- 在位置1处的A或T
- 40-80% A/T含量
- 在位置1-14的>50% A/T含量
- (位置1-14的A/T %)/(位置15-21的A/T %) = >1
- 在位置20处无A
- 在位置13处的A或T或在位置14处的T
- 无‘AAAAAA’、‘TTTTT’、‘CCCC’或‘GGGG’。
将这些标准应用于AAV 2 rep基因的反向互补链。发现AAV 2 cap基因和AAV 5cap基因之间的同源性区域(AAV2 GenBank序列AF043303的核苷酸3086-3106)符合这些标准。靶向此序列的shRNA潜在地可用于敲低AAV2和AAV5中的Rep和Cap表达。除了手动搜索序列以寻找符合标准的序列以外,还将P19启动子下游的AAV 2 rep基因序列的拷贝粘贴至如Adams等人(Adams等人 (2017), Biomaterials 139:102)中所提及的微-RNA适应的shRNA设计工具(找到和排序符合有效shRNA的标准的shRNA靶序列的在线工具)的自定义序列框中。
该工具将这些标准应用于反向链中的21核苷酸长的序列,并提供有义链中的靶标的序列。将miRNA评分设置为>10,该网站发现许多可能的shRNA靶标。该网站将几种靶标排序为具有最高的miRNA评分,表示它们从RNA聚合酶II启动子良好表达的可能性。这些在AAV2 rep内含子中包括两个靶序列,且因此这些序列针对rep68或rep40转录物是无效的。然而,使用3种最高排序的没有内含子的靶标,rep2 shRNA 11 (16.4)、shRNA 13 (14.4)和shRNA 14 (13.7)。得到这些序列的反向互补物。这些靶向链(也称为引导链)将在微-RNA适应的shRNA中形成短发夹环的3'末端。反向互补物序列显示于下表中:
如Dow等人(Dow等人, (2012) Nature Protocols 7:347-393)的图2中所概述,将C核苷酸添加至以A或T开始的那些有义链序列的5'末端,并将A核苷酸添加至以G或C开始的那些有义链序列的5'末端。
然后,将miR-30a环序列添加至每个有义链序列的3'末端(5'-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3' (SEQ ID NO:10))。
为了形成发夹,将靶向链序列添加至环的3'。在该序列(也称为引导链)的3'末端,如果分别在有义链的5'添加C或A,则添加A或C核苷酸。
为了从具有RNA聚合酶II启动子(PCMV)的质粒表达shRNA序列,将shRNA序列进行微-RNA适应。这意指添加有义链上游的微-RNA序列5'- AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG-3'(SEQ ID NO:11)和引导链下游的5'- TGCCTACTGCCTCGGACT-3' (SEQ ID NO:12)。为了将微-RNA适应的shRNA克隆至质粒pG3的多个克隆位点中,分别将NheI和XhoI的限制性位点添加至5'和3'末端。微-RNA适应的shRNA的序列显示于图3中。
2.3: 靶向E1A mRNA分子的shRNA的设计和合成
将Ad5 E1A基因(GenBank登录号AC_000008的核苷酸560-1545)的有义链拷贝粘贴至Adams等人中提及的微-RNA适应的shRNA设计工具的自定义序列盒中,如2.2中所述。
将miRNA评分设置为>10,该网站发现5种可能的shRNA靶标,其具有范围为10.1至10.9的评分。得到这些序列的反向互补物。这些靶向链在微-RNA适应的shRNA中形成短发夹环的3'末端。反向互补物序列显示于下表中:
如2.2中所进行,将C核苷酸或A核苷酸适当地添加至有义链序列的5'末端,且然后将miR-30a环序列添加至每个有义链序列的3'末端。为了形成发夹,将靶向链序列添加至环的3'末端,并适当地添加A或C核苷酸,如2.2中所进行。
为了从具有RNA聚合酶II启动子(Ptet-T6)的质粒表达shRNA序列,将序列进行微-RNA适应,如2.2中所进行。为了在Ptet-T6启动子和polyA序列之间克隆微-RNA适应的shRNA,分别将XbaI和XhoI的限制性位点添加至5'和3'末端。
2.4: 含有RNA Pol II启动子Ptet-T6的tet-操纵子的的设计和合成
具有7个tet-操纵子串联序列的Ptet-T6启动子的序列取自Loew等人 (Loew等人,(2010) BMC Biotechnology 10: 81)。在5'末端,添加与来自pMA-BACmod.GSKCOTR-IR-ZeoR的poly-A的3'末端同源的20 bp序列,并且向Ptet-T6的下游添加与pG3_cPPT.PGK-EGFP.WPRE中的EGFP基因的5'末端同源的20 bp序列。合成完整序列。
2.5: AAV供体质粒的设计和合成
构建供体质粒,其在通过iBrick克隆将表达盒克隆至BAC中之前充当中间体(如Liu等人(2014) PLoS One 9: e110852中所概述)。供体质粒pDonor含有MluI和NheI限制性位点,其用于定向克隆来自鸡β-样球蛋白基因簇的cHS4元件的两个串联拷贝(2xcHS4)上游的表达盒。2xcHS4充当绝缘子,其减轻在大构建体(诸如本发明的核酸载体)中靠近克隆的表达盒之间的启动子干扰,并且还有助于维持开放的染色质状态。pDonor还含有MluI位点上游的I-SceI位点和2xcHS4下游的PI-PspI位点。这些大范围核酸酶位点允许克隆至pDonor中的任何片段用这2种酶消化,并且与3'末端的2xcHS4一起定向克隆至大遗传构建体(诸如BAC)中的单一PI-PspI位点中。这意味着,克隆至pDonor中、然后转移至BAC的每个表达盒都将在3'末端通过2xcHS4填充。
将每个表达盒克隆至含有2xcHS4的供体质粒中且然后将表达盒和2xcHS4两者克隆至BAC中的方法图示显示于图4中。在图中,“元件”表示表达盒。
2.5.1: 2xcHS4供体质粒的制备
为了制备供体质粒,设置PCR,以扩增来自pMA.BACmod.GSKCOTR-IR-ZeoR的2xcHS4,其具有5'末端的I-SceI位点和3'末端的PI-PspI。PCR (25 μl的总体积含有以下组分):
引物序列
所述引物获得自ThermoFisher Scientific。加下划线的核苷酸表示引物中包括以插入I-SceI或PI-PspI的限制性位点的5'突出端。
使用Bio-Rad C1000 Touch热循环仪进行PCR热循环。使用pMA.BACmod.GSKCOTR-IR-ZeoR作为模板,反应条件如下:
热循环后,将PCR反应物在含有1 x TAE和1 x SYBR Safe的1%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳1小时。从凝胶切下PCR产物,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,目录号28706)纯化DNA。
设置连接,其含有0.5 μl pCR-Blunt II-TOPO (Thermo Fisher,目录号K280002)、1 μl盐溶液和4.5μl凝胶纯化的PCR产物。将连接物在室温下孵育5分钟,且然后将2 μl连接物用于转化一小瓶的OneShot TOP10化学感受态的大肠杆菌(Thermo Fisher,目录号C404003)。将转化的细胞铺展在含有50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。
从转化板挑取菌落,并在含有50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上传代培养。将传代培养的菌落在37℃下在轻轻搅拌下在3 ml含有50 μg/ml卡那霉素的 LB液体培养物中生长过夜。第二天,使用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen,目录号27106)从液体培养物提取质粒DNA。使用Nanodrop计算每种小量制备物中的DNA的浓度,并用EcoRI消化1 ug每种质粒制备物以释放克隆的2xcHS4。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后在含有1 x TAE和1 xSYBR Safe的0.8%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳1小时。将小量制备物使用M13正向引物和反向引物进行Sanger测序。测序比对显示,具有5' I-SceI和3' PI-PspI位点的2xcHS4PCR片段已被克隆至pCR-Blunt II-TOPO中。
2.5.2: 表达盒克隆至2xcHS4供体质粒中
引物序列
2.5.2.1: 腺病毒2 E4和VA的PCR
设置PCR以扩增来自pG3.Ad2辅助GSK的腺病毒2 E4和VA区域,其具有5'末端处的MluI位点和3'末端处的与NheI相容的酶。用于扩增E4的反向引物含有XbaI位点,而VA含有NheI和XbaI的内部限制性位点,所以VA反向引物含有AvrII位点,其也与NheI相容。PCR反应含有与上述2.5.1中相同的组分。
使用Bio-Rad C1000 Touch热循环仪进行PCR热循环。使用pMA.BACmod.GSKCOTR-IR-ZeoR作为模板,反应条件如下:
如2.5.1中对PCR反应物进行凝胶电泳。凝胶证实正确的3.21 kb E4和0.76 kb VA片段已被扩增。将PCR产物使用Qiaquick凝胶提取试剂盒进行DNA纯化。
2.5.2.2: AAV rep2/cap2和rep2/cap5的PCR,其中rep2中具有填充的内含子
设置PCR以扩增来自pG.AAV2.R2C2-内含子和pG2.AAV5.R2C5-内含子的AAV rep/cap,其具有5'末端的MluI位点和3'末端的XbaI位点。PCR利用25 µl的总体积中的Q5 DNA聚合酶2x Master混合物。热循环条件与2.5.2.1中使用的那些相同。
热循环后,如前所述将PCR反应进行凝胶电泳。凝胶证实正确的6.62 kb R2C2-内含子和6.59 kb R2C5-内含子片段已被扩增。将PCR产物进行DNA纯化。
2.5.2.3: PCR片段克隆至PCR-Blunt II-TOPO中
设置连接,其含有0.5 μl pCR-Blunt II-TOPO、1 μl盐溶液和4.5 μl每种凝胶纯化的PCR产物(E4、VA、R2C2-内含子和R2C5-内含子)。将连接物在室温下孵育5分钟,且然后将2 μl每种连接物用于转化数小瓶的OneShot TOP10化学感受态的大肠杆菌。将转化的细胞铺展在含有50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。
将菌落在LB琼脂板上传代培养,且然后生长过夜,如2.5.1中所进行。从液体培养物提取质粒DNA,计算DNA的浓度,如2.5.1中所进行。将1 ug pCR-Blunt质粒制备物中的E4、R2C2-内含子和R2C5-内含子各自用MluI + XbaI消化,而将pCR-Blunt质粒制备物中的VA用MluI + AvrII消化。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后进行凝胶电泳。
pCR-Blunt骨架长度为近似3.47 kb。凝胶证实正确的3.2 kb E4、0.74 kb VA、6.60 kb R2C2-内含子和6.57kb R2C5-内含子片段已从pCR-Blunt消化掉。使用解剖刀从凝胶切下PCR产物,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化DNA。
将pCR-Blunt.E4和pCR-Blunt.VA用M13 F和M13 R引物进行Sanger测序,并证实是正确的。
2.5.2.4: 亚克隆的PCR片段克隆至pDonor中
将pDonor质粒用MluI + NheI消化,并在含有1 x TAE和1 x SYBR Safe的0.8%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳1小时。
使用解剖刀从凝胶切下6.05 kb片段,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化DNA。然后,通过将1 µl FastAP脱磷酸酶(Thermo Fisher,目录号EF0651)添加至消化物,并将其在37℃下孵育10分钟,随后在75℃下孵育5分钟,将凝胶纯化的片段脱磷酸。然后设置连接反应,其含有2μl消化的pDonor,6μl凝胶纯化的E4、VA、R2C2-内含子和R2C5-内含子消化物,1μl连接缓冲液和1μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
将体积为2 μl的每种连接物用于转化数小瓶的Stbl3化学感受态的大肠杆菌(Thermo Fisher,目录号C737303)。将转化的细胞铺展在含有50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。
将菌落在LB琼脂板上传代培养,将传代培养的菌落在液体培养物中生长,并提取质粒DNA,如2.5.1中所述。使用Nanodrop计算每种小量制备物中的DNA的浓度,并消化1 ug每种质粒制备物。pDonor.E4克隆用KpnI消化,pDonor.VA克隆用XbaI消化,且pDonor.R2C2-内含子和pDonor.R2C5-内含子用SpeI消化。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后进行凝胶电泳,如2.5.1中所述。
这些凝胶显示,pDonor.E4、pDonor.VA、pDonor.R2C2-内含子和pDonor.R2C5-内含子克隆具有正确的限制性概况。将pDonor.R2C2-内含子和pDonor.R2C5-内含子进行Sanger测序。测序显示,正确的R2C2-内含子和R2C5-内含子片段已被克隆至pDonor中。
2.6 rep2 shRNA克隆至pG3.Ptet-T6-MCS-polyA中
在Ptet-T6启动子的下游克隆Rep2 shRNA。
将质粒pG3.AAV rep2 shRNA11和pG3.Ptet-T6-MCS-polyA用NheI + XhoI消化,并在含有1 x TAE和1 x SYBR Safe的0.8%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳70分钟。
从凝胶切下114 bp rep2 shRNA 11片段和2.31 kb pG3.Ptet-T6-MCS-polyA片段,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2 μl凝胶纯化的pG3.Ptet-T6-MCS-polyA、6 μl凝胶纯化的rep2 shRNA 11、1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
将体积为2 μl的连接物用于转化一小瓶的Stbl3化学感受态的大肠杆菌。将转化的细胞铺展在含有50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。
将菌落传代培养,生长并提取DNA,如2.5.1中所述,且然后用MluI + XbaI消化。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后进行凝胶电泳。
凝胶显示消化物释放正确大小的639 bp片段。向该质粒给予名称pG3.Ptet-T6-rep2 shRNA 11。使用解剖刀从凝胶切下DNA片段,并纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2μl MluI + NheI消化的pDonor,6 μl凝胶纯化的Ptet-T6-rep2 shRNA 11片段,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
将体积为2 μl的连接物用于转化一小瓶的Stbl3化学感受态的大肠杆菌。将转化的细胞铺展在含有50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。第二天,检查板,并且许多菌落已经在板上生长。
将菌落传代培养,生长并提取DNA,如2.5.1中所述,且然后用XhoI消化。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后在含有1 x TAE和1 x SYBR Safe的0.8%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳70分钟。凝胶显示所有克隆均具有4.03 kb和2.67 kb片段的正确的限制性模式。向该质粒给予名称pDonor.Ptet-T6-rep2 shRNA 11。
2.7 来自pDonor的表达盒依次克隆至BAC中
随着每个依次克隆步骤,BAC构建体将变得更大,由于构建体中每种酶的多个切割位点,使用标准限制性酶来切割和克隆每个额外表达盒将很快变得困难。进一步,在每个表达盒之间包括2xcHS4绝缘子将意味着该构建体将含有许多重复,使Gibson组装受抑制。由于这些原因,使用iBrick克隆来克隆每个表达盒(Liu等人, (2014) PLoS One 9: e110852)。这种克隆方法利用大范围核酸酶限制性位点PI-PspI和I-SceI,其识别的位点足够长而不会出现在意欲克隆至BAC中的任何表达盒中。这些酶的切割位点也是不对称的,并产生相容的突出端。这意味着可以从该质粒消化掉2xcHS4上游供体质粒(pDonor)中的每个表达盒,所述质粒具有位于5'末端的I-SceI和位于3'末端的2xcHS4下游的PI-PspI。然后将该片段定向克隆至BAC中的单个PI-PspI位点中,其将消除片段的5'末端的PI-PspI位点,并在表达盒的下游产生新的PI-PspI位点,允许将下一表达盒克隆至该位点中。
引物序列
所有引物均获得自ThermoFisher Scientific。加下划线的核苷酸表示引物中包括的5'突出端,以提供PCR产物中与Gibson克隆反应中与之相邻组装的序列重叠的区域。
2.7.1: 用于Gibson组装的pSMARTBAC2和GSKCOtTA-IR-ZeoR的PCR
选择市售的BAC pSMART BAC 2作为稳定的rAAV构建体的骨架。该BAC赋予大肠杆菌对氯霉素的抗性,并且以1个拷贝/细胞维持,直至其复制起点(OriV)被TrfA结合,所述TrfA在BAC优化的复制细胞中可由阿拉伯糖诱导。待克隆至骨架中的第一表达盒是GSKCOtTA-IR-ZeoR。通过Gibson组装法将其克隆至pSMARTBAC2中。设计重叠引物以扩增作为2个分开片段(其缺乏含有几种标准限制性酶的切割位点的多克隆位点)(片段1:pSMARTBAC Gib F A &pSMARTBAC-tTA Gib R A和2:pSMARTBAC-tTA Gib F B & pSMARTBAC Gib R B)的pSMARTBAC2以及作为单个片段(片段3:tTA-pSMARTBAC Gib F C & tTA-pSMARTBAC Gib RC)的GSKCOtTA-IR-ZeoR。GSKCOtTA-IR-ZeoR的3’末端和pSMARTBAC2之间的引物中的重叠含有PI-PspI的识别序列,使得可以通过iBrick克隆将每个后续遗传元件克隆至该位点中。
每个PCR反应具有25 μl的总体积,且组分描述于2.5.1中。
使用Bio-Rad C1000 Touch热循环仪进行PCR热循环。所有3个反应的条件如下:
然后对PCR反应物进行凝胶电泳。凝胶证实在每个反应中已扩增正确大小的片段。切下片段并纯化DNA。
将等体积的3.3μl的三种纯化的PCR片段各自合并于0.2 ml PCR管中,并且添加10μl of NEBuilder HiFi DNA Assembly Mastermix (NEB,目录号E2621)并通过上下抽吸进行混合。将管在热循环仪中在50℃下孵育1小时。
组装反应后,将体积为2 μl的每种反应物用于转化数小瓶的10-β感受态大肠杆菌。将转化的细胞铺展在含有34 μg/ml氯霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。
从板挑取菌落,并在含有34 μg/ml氯霉素的LB琼脂板上传代培养。将传代培养的菌落在轻轻搅拌下在3 ml含有12.5 μg/ml氯霉素的 LB液体培养物中生长过夜。使用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒从液体培养物提取质粒DNA。使用Nanodrop计算每种小量制备物中的DNA的浓度。用NdeI消化BAC制备物,产生6977 bp和3732 bp的片段。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后进行凝胶电泳,其证实正确的限制性概况。
2.7.2: 2xcHS4和腺病毒2 E2A的克隆
接下来,将2xcHS4克隆在GSKCOtTA-IR-ZeoR的下游,且然后克隆腺病毒E2A区域。由于其含有MluI的内部限制性位点,所以无法将E2A亚克隆至pDonor中2xcHS4的上游。因此,E2A需要单独克隆,而不是作为与3'末端的2xcHS4的组合片段克隆。
使用引物E2A I-SceI F和E2A PI-PspI R以及Q5 DNA聚合酶(NEB,目录号M0491S)从pG3.Ad2辅助GSK PCR扩增腺病毒2 E2A区域。Bio-Rad C1000 Touch热循环仪上使用的条件如下。
对E2A PCR进行凝胶电泳,所述E2A PCR含有5'末端的I-SceI位点和3'末端的PI-PspI位点。存在正确大小的5.39 kb片段,并从凝胶切下,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化DNA。将纯化的DNA连接至pCR-Blunt II TOPO中,并且该连接用于转化一小瓶的OneShot TOP10化学感受态的大肠杆菌,将其铺展在含有50 µg/ml卡那霉素的LB琼脂板上,并在37℃下孵育过夜。将菌落传代培养过夜,并使传代培养的菌落生长,如2.5.1中所述。第二天,使用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒从液体培养物提取质粒DNA。计算DNA的浓度,并将1 μg每种质粒在37℃下在30 μl的体积中用I-SceI消化2小时。由于PI-PspI在任何与其他酶相容的缓冲液中均不起作用,所以通过添加22.4 µl额外无菌H2O来增加体积,然后添加6 µl缓冲液、0.6 µl 100 x BSA溶液和1 µl PI-PspI,所以消化物的体积现在是60 µl。另外,为了获得分别在5'和3'末端具有I-SceI和PI-PspI的2xcHS4片段,pDonor用这些酶以相同的方式进行消化。将这些消化物在65℃下孵育2小时,且然后进行凝胶电泳。
凝胶证实从pCR-Blunt.E2A克隆的消化物释放出正确的5.36 kb片段,并且从pDonor释放正确的2.76 kb片段。从凝胶切下这些片段,并纯化DNA。将pCR-Blunt菌落用M13F和M13 R进行Sanger测序。测序证实E2A已被克隆。
将pSMARTBAC.GSKCOtTA-IR-ZeoR克隆1的小量制备物稀释于无菌蒸馏水中,并用于转化电感受态BAC复制细胞,然后使其在含有34μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长过夜。使用来自该板的菌落来感染含有12.5μg/ml氯霉素和1x阿拉伯糖诱导溶液的LB液体培养物,并在37℃下在轻轻搅拌下生长过夜。第二天,使用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒从液体培养物提取质粒DNA。使用Nanodrop计算小量制备物中的DNA的浓度,并将1 µg DNA在热循环仪中在30 µl的体积中在65℃下用PI-PspI消化2小时。此后,将反应物冷却至室温,并添加1单位的FastAP脱磷酸酶。然后将反应物在37℃下孵育10分钟,且然后在75℃下孵育5分钟以使FastAP热敏碱性磷酸酶(Fast AP)(Thermo Fisher,目录号EF0651)失活。
然后设置连接反应,其含有2 μl消化的pSMARTBAC2.GSKCOtTA-IR-ZeoR,6 μl纯化的2xcHS4消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶,并将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的连接反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,使菌落在培养物中生长并如上所述提取DNA。将1 µg每种质粒在NEB缓冲液3.1中在37℃下用SwaI和MluI消化2小时,且然后进行凝胶电泳。
凝胶证实,在所有克隆中都存在10,690 bp和2784 bp片段的正确的限制性概况。永久性甘油储备物由克隆1制成,并向构建体给予简称BAC2。
为了将E2A克隆至BAC2 PI-PspI位点中,将BAC2克隆的克隆1用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC2克隆1,6 μl纯化的E2A I-SceI + PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的该反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,使菌落在培养物中生长并如上所述提取DNA。将1 µg每种质粒用EcoRI + XbaI消化。对消化物进行凝胶电泳。凝胶证实,当用这两种酶消化时,所有克隆均具有正确的9.3、7.8和1.74 kb片段。
将菌落在37℃下在轻轻搅拌下在80 ml含有12.5 µg/ml氯霉素和1 x阿拉伯糖诱导溶液的LB液体培养物中生长过夜。第二天,使用Qiagen Midiprep试剂盒从液体培养物提取质粒DNA。将这些制备物进行Sanger测序。序列数据证实E2A已成功克隆至BAC中的2xcHS4下游。向该构建体给予简称BAC3。
接下来,将另一2xcHS4克隆在E2A的下游。将BAC3克隆1的中量制备物用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC3克隆1,6 μl纯化的2xcHS4 I-SceI + PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的该反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,然后在含有34μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长过夜。第二天,2个菌落已经在板上生长,并挑取并传代培养过夜。这些传代培养的菌落用于感染3 ml含有12.5 µg/ml氯霉素的LB液体培养物,将其在30℃下在轻轻搅拌下孵育过夜。第二天,添加1x阿拉伯糖诱导溶液,并使培养物再生长3小时。使用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒从液体培养物提取质粒DNA。使用Nanodrop计算每种小量制备物中的DNA的浓度,并将1 µg每种质粒用SwaI + XhoI消化。将消化物在含有1 x TAE和1x SYBR Safe的0.8%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳70分钟。这些消化物显示,当用这2种酶消化时,两个克隆均具有正确的17,083和4519 bp片段。向该构建体给予简称BAC4。
2.7.3: 腺病毒2 E4.2xcHS4的克隆
将BAC4用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。将质粒pDonor.E4在30 µl的总反应体积中在37℃下用I-SceI消化3小时。此后,通过添加22.4 µl无菌H2O、6 µl 10x PI-PspI反应缓冲液、0.6 µl 100 x BSA溶液和1 µl PI-PspI,将反应体积增加至60 µl。然后将反应物在65℃下再孵育3小时,且然后进行凝胶电泳。
从凝胶切下5.7 kb E4.2xcHS4片段,并纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC4,6 μl纯化的E4.2xcHS4 I-SceI + PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的该反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,使其生长过夜,传代培养过夜,在30℃下在LB液体培养基中生长过夜,且然后提取DNA,如上述BAC4一样。将1 µg每种质粒用HpaI消化。将消化物在0.8%琼脂糖上进行凝胶电泳。该凝胶显示,当用HpaI消化时,所有克隆都具有20.69 kb和6.61 kb片段的正确的限制性概况。向该构建体给予简称BAC5。
2.7.4: 腺病毒2 VA.2xcHS4的克隆
将BAC5用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。将质粒pDonor.VA在30 µl的总反应体积中在37℃下用I-SceI + SfiI消化3小时。SfiI用于切割质粒的骨架,因为否则其将产生无法与VA.2xcHS4分离的片段。此后,通过添加22.4 µl无菌H2O、6 µl 10x PI-PspI反应缓冲液、0.6 µl 100 x BSA溶液和1 µl PI-PspI,将反应体积增加至60 µl。然后将反应物在65℃下再孵育3小时,且然后在含有1 x TAE和1 x SYBR Safe的0.8%琼脂糖凝胶上在80V下进行凝胶电泳70分钟。
用解剖刀从凝胶切下3.25 kb VA.2xcHS4片段,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC5,6 μl纯化的VA.2xcHS4 I-SceI +PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的该反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,使其生长过夜,传代培养过夜,在30℃下在LB液体培养基中生长过夜,且然后提取DNA,如上所述。将1 µg每种质粒用HpaI + SwaI消化。将消化物在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。该凝胶显示克隆2-4具有正确的20.69 kb、8.46 kb和1.4 kb片段。向该构建体给予BAC6的简称。
2.7.5: rep2cap2-内含子.2xcHS4和rep2cap5-内含子.2xcHS4的克隆
当制备构建体BAC用于稳定产生AAV2 (R2C2)和AAV5 (R2C5)时,此阶段后BAC中存在分歧。
将BAC6用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。将质粒pDonor.R2C2-内含子和pDonor.R2C5-内含子在30 µl的总反应体积中在37℃下用I-SceI消化3小时。此后,通过添加22.4 µl无菌H2O、6 µl 10x PI-PspI反应缓冲液、0.6 µl 100 x BSA溶液和1 µlPI-PspI,将反应体积增加至60 µl。然后将反应物在65℃下再孵育3小时,且然后在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。
从凝胶切下9.10 kb和9.07 kb R2C2-内含子.2xcHS4和R2C5-内含子.2xcHS4片段,并纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC6,6 μl纯化的R2C2-内含子.2xcHS4或R2C5-内含子.2xcHS4 I-SceI + PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的这些反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,使其生长过夜,传代培养过夜,在30℃下在LB液体培养基中生长过夜,且然后提取DNA,如上所述。将1 µg每种质粒用ClaI + SwaI消化。将消化物在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。凝胶显示消化物具有正确的20.59 kb、10.15 kb、4.84 kb和3.08 kb片段。向该构建体给予BAC7a的简称。
R2C5-内含子BAC连接未能转化BAC复制子电感受态细胞,且因此该连接用于转化化学感受态Stbl3细胞,且随后如上所述用电感受态BAC复制细胞进行处理。将1 µg每种质粒用ClaI + SwaI消化。将消化物在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。消化物显示将R2C5-内含子.2xcHS4插入BAC6的正确限制性概况(21.59、10.15、4.82和3.08 kb片段)。向该构建体给予简称BAC7b。
2.7.6: rep2和E1A靶向shRNA的克隆
将rep2 shRNA 11克隆至BAC中。将BAC7a和BAC7b用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。将质粒pDonor.Ptet-T6-rep2 shRNA 11在30 µl的总反应体积中在37℃下用I- SceI消化3小时。此后,通过添加22.4 µl无菌H2O、6 µl 10x PI-PspI反应缓冲液、0.6 µl100 x BSA溶液和1 µl PI-PspI,将反应体积增加至60 µl。然后将反应物在65℃下再孵育3小时,且然后在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。
从凝胶切下更小的3.15 kb片段,并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC7a或BAC7b,6 μl纯化的Ptet-T6-rep2 shRNA11.2xcHS4 I-SceI + PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的这些反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,然后使其在含有34μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长过夜。挑选来自Ptet-T6-rep2 shRNA 11.2xcHS4进入BAC7a连接板的菌落和Ptet-T6-rep2 shRNA 11.2xcHS4进入BAC7b连接板的菌落并传代培养过夜,且然后随后处理,如前所述。将1 µg每种质粒用NdeI + SwaI消化。将消化物在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。
凝胶显示克隆至BAC7a中的Ptet-T6-rep2 shRNA 11.2xcHS4和克隆至BAC7b中的Ptet-T6-rep2 shRNA 11.2xcHS4的正确限制性概况。分别向这些构建体名称BAC8a和BAC8b。将BAC8a进行Sanger测序。结果显示,GSKCOtTA-IR-Zeo、E2A、E4、VA、R2C2-内含子和Ptet-T6-rep2 shRNA 11在该构建体中都存在且存在。
接下来,将E1A shRNA 5克隆至BAC中。将BAC8a用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。I-SceI + PI-PspI消化的Ptet-T6-E1A shRNA 5.2xcHS4片段与该BAC消化物用于连接中。连接含有4 µl消化的BAC,4 µl消化的Ptet-T6-E1A shRNA 5.2xcHS4,1 µl10x连接酶缓冲液和1 µl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。
体积为0.6 µl的该反应物用于转化电感受态的BAC复制细胞,然后使其在含有34μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长过夜。第二天,没有菌落在板上生长。连接用于转化一小瓶的Stbl3大肠杆菌,并进行处理,如上所述。将1 µg每种质粒用EcoRI消化。将消化物在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。该凝胶显示Ptet-T6-E1A shRNA 5.2xcHS4插入BAC8a的正确限制性概况,其与BAC8a的EcoRI消化物相比含有额外3.0 kb片段。向构建体给予名称BAC9a。
2.7.7 GFP转移载体克隆至BAC中
在将GFP转移载体(pDonor.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6)克隆至BAC中之前,对转移载体进行修饰,以并入具有其天然启动子的大肠杆菌ssb基因(GenBank (J01704))。
EGFP转移载体质粒pG.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6在侧接ITR的转移载体序列之外具有独特的EcoRI限制性位点。用EcoRI消化质粒。将消化物在37℃下孵育2小时,且然后在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。从凝胶切下线性化的质粒,并纯化DNA。将纯化的片段用FastAP脱磷酸。然后将此与EcoRI消化的ssb + 天然启动子片段用于连接中。连接反应含有2 µl消化的转移载体,6 µl消化的ssb + 天然启动子片段,1 µl 10 x连接酶缓冲液和1 µlT4 DNA连接酶。将连接物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。将该构建体命名为pDonor.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb。
为了将GFP转移载体克隆至含有rep/cap基因和腺病毒辅助基因的BAC中,将BAC8a和BAC9a用PI-PspI消化并用FastAP脱磷酸,如先前所述。将转移载体质粒pDonor.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb在30 µl的总反应体积中在37℃下用I-SceI消化3小时。此后,通过添加22.4 µl无菌H2O、6 µl 10x PI-PspI反应缓冲液、0.6 µl 100 x BSA溶液和1 µl PI-PspI,将反应体积增加至60 µl。然后将反应物在65℃下再孵育3小时,且然后在0.8%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。
对于每个反应,从凝胶切下更小片段,并纯化DNA。然后设置连接反应,其含有2 μl消化的BAC8a或BAC9a,6 μl纯化的AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb I-SceI + PI-PspI消化物,1 μl连接缓冲液和1 μl T4 DNA连接酶。将反应物在热循环仪中在16℃下孵育过夜。分别向含有GFP转移载体的构建体给予名称BAC8a-GFP或BAC9a-GFP。BAC8a-GFP和BAC9a-GFP的质粒图分别显示于图5和6中。
实施例3:AAV稳定生产细胞系(悬浮细胞)的生成
通过用BAC9a-GFP转染AdVec 293悬浮细胞来建立稳定的细胞系。作为瞬时转染对照,AdVec 293细胞也用rep/cap质粒、辅助质粒(携带来自腺病毒的辅助基因)和pG.AAV.CMV.GFP.P2A.fluc.W6(具有侧接GFP转基因的ITR的转移载体)以1:1:1比率(基于摩尔比)共转染。
3.1 AdVec 293 RS-D01悬浮细胞
将AdVec悬浮细胞以0.4 x 106个细胞/ml维持于BalanCD培养基(具有2% GlutaMAX和1% Pluronic F-68)中,并每2-3天分开。将细胞在37℃、5 % CO2、110 rpm下孵育。小规模培养物在较高旋转(140 rpm)下维持以帮助通气。
3.2 AdVec 293 RS-D01悬浮细胞的转染
转染前,将细胞在4℃下以500 rpm离心10分钟,除去上清液,并将细胞沉淀重悬浮于新鲜的预热BalanCD培养基中,计数并以1 x 106个细胞/ml接种于具有通风帽的125 mlErlenmeyer烧瓶中。
对于每ml待转染的细胞,使用1 µg质粒和1.3 µl PEIpro。
为了使用gSK辅助质粒和rep/cap质粒与pG.AAV.CMV.GFP.P2A.fluc.W6的对照rAAV转染,以1:1:1比率(基于摩尔比)转染质粒。
3.2.1转染混合物的制备
1) 标记两种精选方案(bijoux)
a) DNA & OptiMEM
b) B- PEIpro & OptiMEM
2) 组成转染混合物:-
a) 将质粒DNA添加至精选方案A中的预热的OptiMEM中
b) 将PEIpro添加至精选方案B中的预热的OptiMEM中
c) 在室温下孵育5 min
d) 将DNA/OptiMEM添加至PEIpro/OptiMEM
e) 在室温下孵育30 min
f) 将转染混合物逐滴添加至细胞悬浮液中。
g) 将转染物在振荡培养箱中在37℃、5 % CO 2 , 140 rpm下孵育72h。
转染后72 h,通过以2000 x g离心5分钟收获对照rAAV转染物。除去上清液,并将细胞在AAV裂解缓冲液中裂解。
3.2.2通过流式细胞术和显微镜检查测定转染效率
转染后72 h,将100 µl培养物添加至96孔黑色平底板中。
将细胞使用Olympia显微镜和Pixar InStudio软件成像。
成像之后,每孔添加100 µl 4% PFA溶液。使用FlowJo软件在MACS Quant 10上分析细胞的GFP表达。
图7(A)显示转染后72 h的AdVec RS-D01细胞的显微镜图像。图7(B)显示转染后通过MACS Quant分析仪和FlowJo软件对GFP阳性细胞的分析。
图7的图像和流式细胞术数据显示,在转染至AdVec RS-D01悬浮细胞之后,BAC9A-GFP表达。转染效率低于三重质粒系统,但这是预期的,因为BAC9A-GFP是更大构建体。
3.2.3细胞数目和细胞活力的测定
将100 µl转染培养物添加至ViCell杯中的900 µl BalanCD中,并使用ViCell Xr进行分析。
3.3使用多西环素从转染细胞小规模诱导rAAV
转染后72 h,将1 ml培养物添加至24深孔悬浮培养板的2个孔中。在一个孔中,添加1ml BalanCD培养基(未诱导)。在另一个中是1 ml BalanCD培养基,其具有4 µg/ml多西环素(2 µg/ml最终浓度,诱导的)。将细胞在37℃、5 % CO2、140 rpm下孵育48 h。
诱导后48 h,通过以2000 x g离心5 min收获细胞。除去上清液,并将细胞在AAV裂解缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 8.5)(100 µl/ml细胞)中在室温下裂解5 min,涡旋,然后冷冻在-80℃。细胞裂解经历三轮的在-80℃和37℃下的冷冻、解冻。将裂解物用BenzonaseTM (50 U/ml)在37℃下处理30 min,然后通过以4000 x g离心20min进行澄清。将裂解液移取至新的预冷管中,并等分–– 2 x 5 µl用于DNA提取以用于qPCR分析,4 x 10 µl用于转导和50 µl。
3.4 来自细胞裂解物的产生的rAAV的qPCR测定
使用Roche高纯病毒核酸试剂盒从完整颗粒分离DNAseI-抗性的AAV基因组,并通过ITR2 qPCR进行定量。
3.4.1使用Roche高纯病毒核酸试剂盒进行DNA分离
将5 µl病毒裂解物在冰上除霜,并且每个样品添加195 µl 1 x D-PBS。遵循制造商的方案,使用Roche高纯病毒核酸试剂盒提取病毒DNA。
3.4.2 ITR2 qPCR
qPCR滴定方法基于AAV ITR序列的定量,如Aurnhammer等人(Aurnhammer等人, (2012)Human gene therapy methods 23, 18-28)中所述。
样品稀释
将来自6.4.1的纯化的AAV基因组使用DEPC处理的水稀释至96孔板中。
ITR2 qPCR的样品稀释方案
样品稀释 | 水 | 样品 | 最终稀释度 |
S1-0 | 95 uL | 5 uL未稀释的处理的样品 | 1:20 |
S1-1 | 45 uL | 5 uL S1-0 | 1:200 |
标准品
线性化的转移载体质粒(pG.AAV.CMV.GFP.P2A furin.fLuc.W6)充当参考标准品。初始标准等分试样D0含有1.30 x 109个质粒拷贝/µl。如下制备ITR标准品D0的系列稀释液。
用于定量AAV基因组拷贝数的标准稀释曲线
gc/µL | 稀释度 | 标准样品(μL) | 无DNAse的水(µL) |
D1 = 1.30 x 10<sup>8</sup> | 1:10 | 30 µL D0 | 270 µL |
D2 = 1.30 x 10<sup>7</sup> | 1:10 | 100 µL D1 | 900 µL |
D3 = 1.30 x 10<sup>6</sup> | 1:10 | 100 µL D2 | 900 µL |
D4 = 1.30 x 10<sup>5</sup> | 1:10 | 100 µL D3 | 900 µL |
D5 = 1.30 x 10<sup>4</sup> | 1:10 | 100 µL D4 | 900 µL |
D6 = 1.30 x 10<sup>3</sup> | 1:10 | 100 µL D5 | 900 µL |
D7 = 1.30 x 10<sup>2</sup> | 1:10 | 100 µL D6 | 900 µL |
根据以下方程计算基因组滴度。
必须应用2的校正倍数,由于质粒DNA是双链的,而AAV基因组是单链的。
根据以下制剂制备ITR qPCR Mastermix。
ITR qPCR mastermix的制备
试剂 | 最终浓度 | 体积/孔(μL) | 96孔的体积(μL) |
ITR.P (10 µM) | 0.2 | 0.8 | 76.8 |
ITR2.P (10 µM) | 0.2 | 0.4 | 38.4 |
ITR2.R (10 µM) | 0.68 | 1.36 | 130.56 |
TaqMan Fast Advanced Master Mix (2x) | 1x | 10 | 960 |
模板 | 可变 | - | - |
总体积/孔 | 1x | 12 |
每孔添加12 µl Mastermix,并且添加8 µl的各样品稀释液Sx-0至-1。另外,将8 µl标准曲线D1至D7添加至板。一式两份分析标准曲线。
使用StepOnePlus实时PCR机分析最终的PCR板。下面描述循环条件。
ITR qPCR循环条件
图8显示通过qPCR对从用BAC9A-GFP (pSMART.BAC.AAV.R2C2.9A-GFP.ssb)或使用pG.AAV.CMV.GFP.P2A.fluc.W6作为转移载体的三重质粒系统对照转染的裂解的AdVec RS-D01细胞提取的DNA进行产生的载体的分析。将转染的细胞收获,裂解并进行BenzonaseTM处理。提取DNA,并用于使用ITR引物进行qPCR。
3.4.3用rAAV裂解物转导LentiX 293T细胞
将LentiX 293T细胞在37℃、5% CO2下维持于LentiX培养基中,并且每3-4天分开。
转导前24 h,将细胞以8000个细胞/孔接种至96孔黑色平底板中的LentiX培养基中,并孵育过夜。
在转导当天,将10 µl rAAV裂解物稀释于96孔平底板中的90 µl LentiX培养基中。将1.5 x 1013 vg/ml的对照裂解物–rAAV2 1:10稀释(-1),然后再次稀释(-2),且然后再次稀释(-3)。
移取细胞上的接种培养基,并将稀释的裂解物添加至细胞中,并在37℃、5% CO2下孵育72 h。转导后72 h,使用InStudio软件和Olympia显微镜针对GFP表达对细胞进行成像。除去转导培养基,并每孔添加100 µl具有0.5% EDTA的D-PBS,并用于从孔中洗涤细胞。每孔添加100 µl 4% PFA,并使用MACS Quant 10和FlowJo软件分析细胞的GFP表达。
图9(A)显示转导后72 h转导的LentiX 293T细胞的显微镜图像。图9(B)显示转导后通过MACS Quant分析仪和FlowJo软件对GFP阳性细胞的分析。
将来自转染的AdVec RS-D01悬浮细胞的裂解物应用于LentiX 293T细胞。用BAC9A-GFP (pSMART.BAC.AAV.R2C2.9A-GFP.ssb)或使用pG.AAV.CMV.GFP.P2A.fluc.W6的三重质粒系统对照转染AdVec RS-D01细胞。将转染的细胞收获,裂解并进行BenzonaseTM处理。
转染的细胞裂解物的qPCR显示,用使用BAC9A-GFP的瞬时转染和三重质粒系统转染,已产生载体(图8)。当这些裂解物用于转导LentiX 293T细胞时,在72 h后,对于两种系统均看到GFP阳性细胞(图9)。通过流式细胞术分析的GFP阳性细胞的数目低于用AAV2.CMV.GFP.P2A.fluc.W6对照裂解物所见,但令人鼓舞,并且显示从BAC9A-GFP产生的载体是有功能的。
3.5使用博莱霉素选择具有稳定整合的pSMART.BAC.AAV质粒的细胞
3.5.1高剂量选择
转染后72 h,将AdVec RS-D01细胞培养物在4℃下以500 rpm离心10 min,除去培养基,并将细胞沉淀重悬浮于具有500 µg/ml 博莱霉素的悬浮细胞培养基中。将培养物在高剂量选择下孵育6天,每2天更换选择培养基。
当更换培养基时,使用上述方法评价细胞计数和活力,并如上(3.2.2)所述通过成像和/或流式细胞术评价细胞的GFP表达。
3.5.2低剂量选择
在较高剂量的博莱霉素下6天后,将培养基换为具有300 µg/ml博莱霉素的悬浮细胞培养基中,并且每2天更换培养基。从该点起,将培养物连续维持于含有300 µg/ml博莱霉素的培养基中。
图10是转染BAC9A-GFP后的细胞数/ml的分析。使用ViCell Xr对选择下的转染培养物进行分析以测定每个时间点的活细胞数目,显示使用博莱霉素的选择是起作用的。在博莱霉素选择下的模拟细胞数目减少,并且在3周后已完全死亡,而无选择下的模拟物仍然是活的。BAC9A-GFP (SMART.BAC.AAV.R2C2.9A-GFP.ssb)细胞培养物数目逐渐减少,但在3周后维持稳定的群体,显示BAC9A-GFP已整合至这些细胞内。
图11是在用pSMART.BAC.AAV.R2C2.9A-GFP.ssb转染后通过针对博莱霉素选择下的AdVec RS-D01悬浮细胞的流式细胞术对GFP阳性细胞的分析。在每周时间点分析细胞。
通过流式细胞术每周对转染的细胞合并物的图11中的分析显示,在高浓度的博莱霉素中1周后,两种培养物均具有超过35%的GFP阳性的细胞。2周后,培养物1已丢失大多数的GFP阳性细胞,表明尽管BAC已被转染于其中,但其并未整合至高比例的细胞中,而在培养物2中,BAC已整合于其中且GFP阳性细胞的百分比从第2周增加至第3周,因为选择后剩余的群体开始反映整合的细胞系。用培养物2的选择仍然在进行中。培养物1中GFP阳性细胞的丢失可解释用该培养物所见的载体的缺乏(图12)。
3.5.3使用多西环素从选择细胞的多克隆群体诱导rAAV
将1 ml细胞系添加至24深孔悬浮培养板的2个孔中。
在一个孔中,添加1 ml BalanCD培养基(未诱导)。在另一个中是1 ml BalanCD培养基,其具有4 µg/ml多西环素(2 µg/ml最终浓度,诱导的)。将细胞在37℃、5 % CO2、140rpm下孵育48 h。
诱导后48 h,通过以2000 x g离心5 min收获细胞。除去上清液,并将细胞在AAV裂解缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2,)(50 µl/ml细胞)中在室温下裂解5min,涡旋,然后冷冻在-80℃。细胞裂解经历三轮的在-80℃和37℃下的冷冻、解冻。将裂解物用BenzonaseTM (50 U/ml)在37℃下处理30 min,然后通过以4000 x g离心20 min进行澄清。将裂解液移取至新的预冷管中,并等分–– 2 x 5 µl用于DNA提取以用于qPCR分析,4 x10 µl用于转导。
图12显示从多克隆选择的合并物产生的载体的qPCR分析。对于使用博莱霉素稳定转染1个月的细胞,选择用BAC9A-GFP转染的AdVec RS-D01细胞。将这些细胞用2μg/ml多西环素诱导48 h。将细胞收获,裂解并进行BenzonaseTM处理。提取DNA,并用于使用ITR引物使用与3.4相同的方案进行qPCR。
来自稳定的合并物培养物的载体产生的分析显示,病毒载体颗粒仍在合并物之一(培养物2)中制备,但在培养物1中却没有。这显示BAC9A-GFP (SMART.BAC.AAV.R2C2.9A-GFP.ssb)系统正在发挥功能,并且可用于产生稳定细胞系,其产生AAV载体。
尽管向生长培养基中添加多西环素似乎并未增加从BAC9A-GFP细胞系产生的载体的滴度,但诱导仅持续48小时,这可能时间太短,不能看到来自shRNA产生减少和Rep表达增加的效果。或者,系统可能是渗漏的,并且甚至在没有多西环素抑制Rep shRNA的情况下,也产生Rep。
图13显示在选择1个月的情况下,用来自AdVec RS-D01细胞的裂解物对LentiX293T细胞的转导。用BAC9A-GFP转染AdVec RS-D01细胞,然后使用博莱霉素选择1个月。然后这些细胞合并物使用2μg/ml多西环素诱导48 h。将细胞收获,裂解并进行BenzonaseTM处理。将裂解物应用于LentiX 293T细胞,并且在转导后72 h通过流式细胞术评价GFP阳性细胞。
用来自BAC9A-GFP合并物的裂解物转导LentiX 293T细胞显示,尽管产生的载体数目可能很少,但其具有生物学功能。在qPCR数据中看到的每µl低的基因组拷贝反映于通过流式细胞术分析的GFP阳性细胞的百分比中,但其显示甚至在此早期阶段仍制备某种载体。
实施例4:AAV稳定生产细胞系(贴壁细胞)的生成
通过用BAC8A-GFP和BAC9A-GFP构建体转染HEK293贴壁细胞来生成稳定的细胞系。
图14显示来自AdVec贴壁细胞稳定合并物的载体产生的qPCR分析。用BAC8A-GFP(pSMART.BAC.AAV.R2C2.8A-GFP.ssb)或BAC9A-GFP (pSMART.BAC.AAV.R2C2.9A-GFP.ssb)转染细胞。将BAC8A-GFP和BAC9A-GFP转染的细胞分别置于博莱霉素选择下2周和4周。
这显示BAC8A-GFP和BAC9A-GFP系统两者正在发挥功能,并且可用于产生稳定细胞系,其产生AAV载体颗粒。
试剂和化学品
培养基和溶液
仪器和软件
应理解的是,本文描述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外,在本说明书中引用的所有出版物,包括但不限于专利和专利申请,通过引用并入本文,如同完全阐述一样。
序列表
<110> GlaxoSmithKline Intellectual Propety Development Limited
<120> 腺相关病毒载体的生产方法
<130> PB66337
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与Rep2具有同源性的5'引物
<400> 1
tggacgtttc ctgagtcag 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与Rep2具有同源性的3'引物
<400> 2
attcgcgaaa aactgattca g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV cap2/5 shRNA
<400> 3
tgttgatgag tctttgccag t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV rep2 shRNA 5
<400> 4
tctttcccgc attgtccaag g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV rep2 shRNA 7
<400> 5
tttataaatc cgattgctgg a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV rep2 shRNA 9
<400> 6
aaggtcgttg agttcccgtc a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV rep2 shRNA 11
<400> 7
tttgacgtag aattcatgct c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV rep2 shRNA 13
<400> 8
tcaaatttga acatccggtc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV rep2 shRNA 14
<400> 9
ttgaagggaa agttctcatt g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-30a环序列
<400> 10
tagtgaagcc acagatgta 19
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游微-RNA序列
<400> 11
aaggtatatt gctgttgaca gtgagcg 27
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游微-RNA序列
<400> 12
tgcctactgc ctcggact 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A shRNA 1
<400> 13
tggcaggtaa gatcgatcac c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A shRNA 2
<400> 14
ttactgtaga caaacatgcc a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A shRNA 3
<400> 15
tctaaatcat acagttcgtg a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A shRNA 4
<400> 16
tccgtactac tattgcattc t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A shRNA 5
<400> 17
tctaacacaa actcctcacc c 21
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xcHS4供体I-SceI F
<400> 18
attaccctgt tatccctatt atacgaagtt atattacgcg 40
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xcHS4供体PI-PspI R
<400> 19
acccataata cccataatag ctgtttgcca taactagtca ataatcaatg tc 52
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E4 MluI F
<400> 20
gtcgcacgcg ttttagggcg gagtaac 27
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E4 XbaI R
<400> 21
aacattctag aactagtgaa tccac 25
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VA MluI F
<400> 22
atgagacgcg tgatatccgt agatgtacc 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VA AvrII R
<400> 23
gattccctag gccgcggatg ttgcccctc 29
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rep2 MluI F
<400> 24
cctcgcgaat gcaacgcgtg gaggggtgga gtcgtg 36
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cap XbaI R
<400> 25
gattatctag acatgctact tatctacgta gcc 33
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSMARTBAC Gib F A
<400> 26
gtggatcggt gggcagttta c 21
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSMARTBAC-tTA Gib R A
<400> 27
actagtcaat aatcaatgtc tctatagtgt cacctaaata c 41
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSMARTBAC-tTA Gib F B
<400> 28
tggcaaacag ctattatggg tattatgggt actgacccta tagtgagtcg 50
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pSMARTBAC Gib R B
<400> 29
ggctctgcac cgtattgaaa c 21
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tTA-pSMARTBAC Gib F C
<400> 30
tatttaggtg acactataga gacattgatt attgactagt 40
<210> 31
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tTA-pSMARTBAC Gib R C
<400> 31
acccataata cccataatag ctgtttgcca taagatacat tgatgagttt gg 52
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A I-SceI F
<400> 32
attaccctgt tatccctagc ccgggcgacc gcaccctgtg 40
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A PI-PspI R
<400> 33
acccataata cccataatag ctgtttgcca gtacccaact ccatgcttaa cagtcc 56
Claims (34)
1.腺相关病毒(AAV)生产细胞,其包含编码以下的核酸序列:
AAV rep/cap基因;
辅助病毒基因;和
AAV载体颗粒的DNA基因组,
其中所述核酸序列全部一起整合于AAV生产细胞基因组内的单一基因座处。
2.权利要求1的AAV生产细胞,其中所述AAV核酸序列衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其组合。
3.权利要求2的AAV生产细胞,其中所述AAV核酸序列衍生自AAV2、AAV5和/或AAV9。
4.权利要求1至3中任一项的AAV生产细胞,其中所述辅助病毒基因衍生自腺病毒。
5.权利要求4的AAV生产细胞,其中所述辅助病毒基因包含衍生自腺病毒的E4、E2a和VA基因的全部或部分。
6.权利要求1至5中任一项的AAV生产细胞,其额外包含转录调控元件。
7.权利要求6的AAV生产细胞,其中所述转录调控元件是CMV启动子。
8.权利要求6或权利要求7的AAV生产细胞,其中所述转录调控元件额外包含至少一个Tet操纵子。
9.权利要求1至8中任一项的AAV生产细胞,其额外包含四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)。
10.权利要求1至9中任一项的AAV生产细胞,其额外包含绝缘子。
11.权利要求10的AAV生产细胞,其中在所述核酸序列各自之间存在绝缘子。
12.权利要求1至11中任一项的AAV生产细胞,其额外包含可选择标记。
13.权利要求12的AAV生产细胞,其中所述可选择标记是可扩增选择标记。
14.权利要求1至13中任一项的AAV生产细胞,其额外包含一种或多种转基因。
15.权利要求1至14中任一项的AAV生产细胞,其中所述AAV载体颗粒的DNA基因组包含在两个AAV ITR之间编码的一个或多个转基因。
16.权利要求1至15中任一项的AAV生产细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
17.权利要求1至16中任一项的AAV生产细胞,其中所述细胞进一步包含编码短发夹RNA(shRNA)的核酸序列和与编码所述shRNA的核酸序列可操作连接的诱导型启动子,所述shRNA靶向由AAV rep基因编码的AAV rep mRNA分子。
18.权利要求1至17中任一项的AAV生产细胞,其中所述细胞进一步包含编码以下的核酸序列:
腺病毒E1A基因;
靶向由所述腺病毒E1A基因编码的腺病毒E1A mRNA分子的shRNA;和
与编码靶向所述腺病毒E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列可操作连接的诱导型启动子。
19.权利要求1至18中任一项的AAV生产细胞,其中靶向AAV rep mRNA分子或E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列经微-RNA适应,用于通过RNA聚合酶II转录。
20.权利要求17至19中任一项的AAV生产细胞,其中所述诱导型启动子是Tet-响应性启动子,任选地,其中所述Tet-响应性启动子是Ptet-T6启动子。
21.包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体,其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列:
腺相关病毒(AAV) rep/cap基因,和
辅助病毒基因,
其中编码AAV rep/cap基因和每种辅助病毒基因的核酸序列在核酸载体内作为单独的表达盒排列。
22.权利要求21的核酸载体,其额外包含编码所述AAV载体颗粒的DNA基因组的核酸序列。
23.权利要求21或权利要求22的核酸载体,其中所述载体选自:细菌人工染色体、酵母人工染色体、P1-衍生的人工染色体、F粘粒或粘粒。
24.权利要求23的核酸载体,其中所述载体是细菌人工染色体。
25.权利要求21至24中任一项的核酸载体,其中所述核酸载体进一步包含编码短发夹RNA(shRNA)的核酸序列和与编码所述shRNA的核酸序列可操作连接的诱导型启动子,所述shRNA靶向由AAV rep基因编码的AAV rep mRNA分子。
26.权利要求21至25中任一项的核酸载体,其中所述核酸载体进一步包含编码以下的核酸序列:
腺病毒E1A基因;
靶向由所述腺病毒E1A基因编码的腺病毒E1A mRNA分子的shRNA;和
与编码靶向所述腺病毒E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列可操作连接的诱导型启动子。
27.权利要求21至26中任一项的核酸载体,其中靶向AAV rep mRNA分子或E1A mRNA分子的shRNA的核酸序列经微-RNA适应,用于通过RNA聚合酶II转录。
28.权利要求25至27中任一项的核酸载体,其中所述诱导型启动子是Tet-响应性启动子,任选地,其中所述Tet-响应性启动子是Ptet-T6启动子。
29.产生稳定的AAV包装细胞系的方法,其包括:
(a) 将权利要求21至28中任一项的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中;和
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
30.权利要求29的方法,其中所述哺乳动物细胞是HEK 293细胞。
31.通过权利要求29或权利要求30的方法获得的AAV包装细胞。
32.产生复制缺陷型AAV载体颗粒的方法,其包括:
(a) 将权利要求21至28中任一项的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中;
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞;和
(c) 在产生复制缺陷型AAV载体颗粒的条件下进一步培养选择的哺乳动物宿主细胞。
33.权利要求32的方法,其额外包括分离复制缺陷型AAV载体颗粒。
34.通过权利要求32或权利要求33的方法获得的复制缺陷型AAV载体颗粒。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1706090.6A GB201706090D0 (en) | 2017-04-18 | 2017-04-18 | Methods for adeno-associated viral vector production |
GB1706090.6 | 2017-04-18 | ||
GBGB1718179.3A GB201718179D0 (en) | 2017-11-02 | 2017-11-02 | Adeno-associated viral vector packaging and producer cell lines |
GB1718179.3 | 2017-11-02 | ||
PCT/EP2018/059918 WO2018192982A2 (en) | 2017-04-18 | 2018-04-18 | Methods for adeno-associated viral vector production |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110785495A true CN110785495A (zh) | 2020-02-11 |
Family
ID=63855618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880040553.6A Pending CN110785495A (zh) | 2017-04-18 | 2018-04-18 | 腺相关病毒载体的生产方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10858631B2 (zh) |
EP (1) | EP3612635A2 (zh) |
JP (2) | JP2020517238A (zh) |
CN (1) | CN110785495A (zh) |
BR (1) | BR112019021595A2 (zh) |
CA (1) | CA3058970A1 (zh) |
WO (1) | WO2018192982A2 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117660532A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-03-08 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的辅助质粒及应用 |
CN117660534A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-03-08 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201800903D0 (en) * | 2018-01-19 | 2018-03-07 | Oxford Genetics Ltd | Vectors |
GB201806333D0 (en) * | 2018-04-18 | 2018-05-30 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Parvovirus vector production |
GB201816919D0 (en) * | 2018-10-17 | 2018-11-28 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Adeno-associated viral vector producer cell lines |
JP2022514761A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-15 | ロンザ ウォーカーズヴィル,インコーポレーテッド | ウイルスベクターの自動産生方法 |
KR20210108423A (ko) | 2018-12-21 | 2021-09-02 | 론자 워커스빌 아이엔씨. | 아데노 관련 바이러스 (aav) 생산자 세포주 및 관련 방법 |
JP2020188763A (ja) * | 2019-05-20 | 2020-11-26 | Jcrファーマ株式会社 | 組換えaavビリオンの製造に用いる核酸分子 |
GB202001484D0 (en) * | 2020-02-04 | 2020-03-18 | Oxford Genetics Ltd | DNA amplification method |
WO2021188740A1 (en) * | 2020-03-17 | 2021-09-23 | Biogen Ma, Inc. | Methods and compositions for production of recombinant adeno-associated viruses |
GB202013060D0 (en) * | 2020-08-21 | 2020-10-07 | Oxford Genetics Ltd | Cell line |
JPWO2022172986A1 (zh) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | ||
WO2022209987A1 (ja) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 株式会社カネカ | ベクター、及びそれを用いた直鎖状共有結合閉鎖dnaの作製方法、並びにパルボウイルスベクターの作製方法、及びパルボウイルスベクター産生細胞 |
WO2022261475A1 (en) * | 2021-06-11 | 2022-12-15 | Spark Therapeutics, Inc. | Methods of regulating adeno-associated virus production |
WO2023249963A1 (en) * | 2022-06-20 | 2023-12-28 | Brammer Bio, Llc | Improved recombinant adeno-associated virus production |
CN117343927B (zh) * | 2023-12-06 | 2024-03-12 | 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 | 一种工程化细胞的核酸提取方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999020778A1 (en) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Gene delivery vectors and their uses |
WO2001092551A2 (en) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Duplexed parvovirus vectors |
WO2003104413A2 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-18 | University Of Florida | Production of pseudotyped recombinant aav virions |
WO2007084773A2 (en) * | 2006-01-20 | 2007-07-26 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7732129B1 (en) * | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
AU728220B2 (en) | 1997-04-14 | 2001-01-04 | Cell Genesys, Inc. | Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product |
US6037177A (en) * | 1997-08-08 | 2000-03-14 | Cell Genesys, Inc. | Method for increasing the efficiency of recombinant AAV production |
US6793926B1 (en) | 1999-05-27 | 2004-09-21 | Genovo, Inc. | Methods for production of a recombinant adeno-associated virus |
DE10137283A1 (de) | 2001-08-01 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | AAV-Vektor-Verpackungsplasmide zur Helfervirus-freien Herstellung pseudotypisierter AAV-Partikel über Einzeltransfektion |
WO2003087294A2 (de) * | 2002-04-15 | 2003-10-23 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Rekombinante virale vektoren zur tetracyclinregulierbaren genexpression |
US20050130184A1 (en) * | 2003-07-18 | 2005-06-16 | University Of Massachusetts | Enhanced promoters for synthesis of small hairpin RNA |
CA2579677A1 (en) * | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
US7943379B2 (en) * | 2008-04-30 | 2011-05-17 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Production of rAAV in vero cells using particular adenovirus helpers |
WO2010010107A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Novel regulatory elements |
EP2352833B1 (en) * | 2008-10-01 | 2013-03-06 | TET Systems GmbH & Co. KG | Tetracycline inducible transcription control sequence |
WO2011005793A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cell-based bioprocessing |
US9441206B2 (en) * | 2011-10-28 | 2016-09-13 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Cell line for production of adeno-associated virus |
US9783805B2 (en) * | 2013-02-28 | 2017-10-10 | City Of Hope | Replication capable rAAV vectors encoding inhibitory siRNA and methods of their use |
DE102013220859B4 (de) | 2013-10-15 | 2016-09-08 | Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg | Minicircles mit viralen Expressionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen zur Erzeugung rekombinanter Viren oder viraler Genvektoren |
GB201519303D0 (en) | 2015-11-02 | 2015-12-16 | Imp Innovations Ltd | Phagemid vector |
-
2018
- 2018-04-18 CN CN201880040553.6A patent/CN110785495A/zh active Pending
- 2018-04-18 WO PCT/EP2018/059918 patent/WO2018192982A2/en unknown
- 2018-04-18 US US15/955,992 patent/US10858631B2/en active Active
- 2018-04-18 BR BR112019021595-6A patent/BR112019021595A2/pt unknown
- 2018-04-18 EP EP18724467.8A patent/EP3612635A2/en active Pending
- 2018-04-18 JP JP2019556592A patent/JP2020517238A/ja active Pending
- 2018-04-18 CA CA3058970A patent/CA3058970A1/en active Pending
-
2020
- 2020-11-13 US US17/097,111 patent/US20210062161A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-03-08 JP JP2023035225A patent/JP2023081975A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999020778A1 (en) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Gene delivery vectors and their uses |
WO2001092551A2 (en) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Duplexed parvovirus vectors |
WO2003104413A2 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-18 | University Of Florida | Production of pseudotyped recombinant aav virions |
WO2007084773A2 (en) * | 2006-01-20 | 2007-07-26 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117660532A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-03-08 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的辅助质粒及应用 |
CN117660534A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-03-08 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用 |
CN117660534B (zh) * | 2023-12-13 | 2024-05-07 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018192982A3 (en) | 2019-03-21 |
US20210062161A1 (en) | 2021-03-04 |
JP2023081975A (ja) | 2023-06-13 |
WO2018192982A2 (en) | 2018-10-25 |
JP2020517238A (ja) | 2020-06-18 |
CA3058970A1 (en) | 2018-10-25 |
BR112019021595A2 (pt) | 2020-05-12 |
US20180327722A1 (en) | 2018-11-15 |
EP3612635A2 (en) | 2020-02-26 |
US10858631B2 (en) | 2020-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210062161A1 (en) | Methods for Adeno-Associated Viral Vector Production | |
JP7463358B2 (ja) | アデノ随伴ウイルスベクタープロデューサー細胞株 | |
JP2021528959A (ja) | 細胞内で存続する遺伝子送達のためのベクター | |
CN106884014B (zh) | 腺相关病毒反向末端重复序列突变体及其应用 | |
US20220411819A1 (en) | Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof | |
Gonçalves et al. | Efficient generation and amplification of high-capacity adeno-associated virus/adenovirus hybrid vectors | |
US20210032657A1 (en) | Synthetic genetic elements for biomanufacture | |
GB2566572A (en) | Methods for adeno-associated viral vector production | |
US20220154223A1 (en) | Nucleic acid constructs for simultaneous gene activation | |
US20230212590A1 (en) | Nucleic acid constructs for protein manufacture | |
Kligman | Establishing a stable cell-line for producing Adeno-Associated Virus using CRISPR-Cas9 | |
JP2023546116A (ja) | Va rna転写のための核酸構築物 | |
WO2023249963A1 (en) | Improved recombinant adeno-associated virus production | |
Chen | Engineering Synthetic Promoters to Optimize Therapeutic Gene Expression for AAV Gene Therapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |