JP2021528959A - 細胞内で存続する遺伝子送達のためのベクター - Google Patents

細胞内で存続する遺伝子送達のためのベクター Download PDF

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Abstract

標的細胞への核酸配列の送達のためのベクターが本明細書に開示される。ベクターは、非ウイルスＤＮＡ構築物である。ベクターは、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲと、発現を促進する調節性エレメントに作動的に連結した核酸配列の相補的コピーとを有する。構築物は、ヘアピン構造を有する共有結合性閉鎖末端を有し、分裂する際にレシピエント細胞内で存続する。標的細胞へのベクターの送達は、標的細胞における核酸配列の持続した発現をもたらす。少なくとも１個の合成ＩＴＲを有するＤＮＡベクター構築物であって、ヘアピン共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成する、ＤＮＡ構築物も開示される。構築物を生成し、標的細胞に導入し、これにより、その中に含有される核酸配列の持続した発現を促進する方法も開示される。ベクターを含有する細胞およびその集団がさらに開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年６月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／６８８，９８２号；２０１８年６月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／６８９，４５３号；２０１８年７月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／６９７，７５０号；および２０１８年８月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／７１７，３１０号の利益を主張し、これらの内容全体はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、遺伝子療法のため等の、核酸配列の無細胞産生、哺乳動物細胞への導入および発現のためのベクターおよび方法の分野に関する。
外因性ＤＮＡによってコードされるタンパク質の長期発現をもたらすような様式で、外因性ＤＮＡを導入することが望ましい。ウイルスに基づくプロトコールが開発されたが、それによると、ウイルスベクターは、細胞への外因性ＤＮＡの導入に用いられ、その後、導入されたＤＮＡを標的細胞のゲノムに組み込むことができる、またはエピソームに残すことができる。用途が見出されるウイルスに基づくベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクター、アデノウイルス由来ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクター、ＨＳＶ由来ベクター、シンドビス由来ベクター等を含む。ＡＡＶベクターの使用に大きな関心が集中した。最も一般的な１２種の血清型が存在する。ＡＡＶベクターの産生のための典型的な方法は、ビリオンの形成のためにＡＡＶ ｒｅｐ（ｒｅｐは、ＡＡＶの複製の開始に要求される）およびｃａｐ（ｃａｐは、ＡＡＶの産生に必要とされる）遺伝子を発現する、昆虫細胞、例えば、ＳＦ−９または哺乳動物細胞等の細胞を使用し、これらの細胞に、目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含有するカセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を有するプラスミドを導入している。例えば、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスに由来する、ウイルスヘルパー遺伝子を有する追加的なプラスミドも、形質導入に使用されるパッケージングされたＡＡＶカプシドを複製して得るために必要とされる。しかし、ＡＡＶ産物からヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルスを完全に排除することは困難である。加えて、ウイルスタンパク質の使用は、望まれない免疫応答を誘発し得る。
したがって、コードされるタンパク質または核酸、例えば、治療用タンパク質または核酸の存続性長期発現をもたらすために、ベクターの産生のさらなる方法、および外因性核酸を細胞にトランスフェクトするためのさらなる方法の開発への継続した関心がある。
本発明の態様は、ヘルパーウイルスの必要がない遺伝子送達のためのベクターを生成するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞環境に関する。この無細胞合成は、ベクター産生のための使用に対し、より容易でかつより安全である。しかし、当業者であれば、本明細書に記載される無細胞方法が、治療的使用に好まれ得るが、本明細書に記載されるベクターは、細胞、例えば、細菌、哺乳動物または昆虫細胞内で産生することもできることを理解するであろう。
本発明の態様は、また、持続した発現のために、核酸構築物を標的細胞に導入するための方法およびベクター構築物に関する。一態様では、本方法は、ｉ）Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列；ｉｉ）Ｄ’領域を含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲであって；ｉｉｉ）ＤおよびＤ’領域が、相補的パリンドローム配列であり、ＤおよびＤ’が、ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを含む共有結合性閉鎖（covalently closed）直鎖状非ウイルスＤＮＡ構築物を標的細胞に投与するステップを含む。一実施形態では、領域は、パルボウイルスＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域に対応する。一実施形態では、ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ、突然変異体ＩＴＲまたは合成ＩＴＲであるパルボウイルスＩＴＲに対応する。ＤＮＡベクター構築物は、発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列に作動可能に連結したプロモーターを含有するカセットを含む核酸構築物の相補鎖をさらに含み、ＤＮＡ構築物は、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し、ＤＮＡ構築物は、標的細胞において所定のＤＮＡ配列を発現することができる。一実施形態では、共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡ構築物は、例えば、図１に説明されている通り、少なくとも２個のＤＤ−ＩＴＲを含む。
本発明の態様は、さらに、持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸配列（例えば、異種遺伝子）の送達のためのＤＮＡベクターに関する。ＤＮＡベクターは、ａ）ｉ）Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列；ｉｉ）Ｄ’領域を含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲであって；ｉｉｉ）ＤおよびＤ’領域が、相補的パリンドローム配列であり、ＤおよびＤ’が、ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲ；ｂ）発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列を含む核酸構築物の相補鎖を含む、持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸の送達のための共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡベクターであり；ｃ）ＤＮＡベクター構築物は、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し；ｄ）ＤＮＡベクター構築物は、標的細胞において所定のＤＮＡ配列を発現することができる。一実施形態では、領域は、パルボウイルスＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域に対応する。一実施形態では、ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ、突然変異体ＩＴＲまたは合成ＩＴＲに対応する。ＤＮＡベクター構築物は、発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列に作動可能に連結したプロモーターを含有するカセットを含む核酸構築物の相補鎖をさらに含み、ＤＮＡ構築物は、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し、ＤＮＡ構築物は、標的細胞において所定のＤＮＡ配列を発現することができる。一実施形態では、ベクターは、所定の異種導入遺伝子、例えば、タンパク質または核酸を発現する共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡの場面において、核酸に隣接する少なくとも２個のＤＤ−ＩＴＲを含む。本ベクターの一実施形態は、図１の下部に説明されている。ベクターは、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する、実質的に相補的（complimentary）なＤＮＡである。一実施形態では、Ｄ領域は、約２０ｎｔの長さである。ＤおよびＤ’領域は、領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有することができる。一実施形態では、保持された核酸は、ニッキング部位、ならびに／またはＡおよびＡ’領域とＤおよびＤ’領域との接合部を含むことができる。
本発明の態様は、さらに、持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸配列の送達のためのＤＮＡベクターに関する。ベクターは、２個のＤＤ−ＩＴＲを含み、２個のＤＤ−ＩＴＲはそれぞれ、ｉ）Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列；
ｉｉ）Ｄ’領域を含み；ｉｉｉ）ＤおよびＤ’領域は、相補的パリンドローム配列であり、ＡおよびＡ’領域に近接して位置する。ベクターは、所定の核酸配列をさらに含む。２個のＤＤ−ＩＴＲは、共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ、例えば、ミニサークルＤＮＡの場面において、核酸に隣接し、ベクターの大部分は、非細菌配列である。
本発明の態様は、持続した発現のために核酸を標的細胞に導入するための方法であって、共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を標的細胞に投与するステップを含む方法に関する。ＤＮＡ構築物は、図５に示すＩＴＲからなる群から選択される少なくとも１個のＩＴＲ配列、核酸構築物の相補鎖を含み、核酸構築物は、所定のＤＮＡ配列を含み、相補鎖は、発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができ；ＤＮＡ構築物は、ヘアピン共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成する。
本発明のさらなる態様は、構築物ＤＮＡを含む組換えウイルス粒子を産生するための、共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡ（時に、閉鎖直鎖状ＤＮＡ）の使用に関する。これは、少なくとも２個のＤＤ−ＩＴＲを含む閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物（例えば、図１を参照）を、（１）ＤＤ−ＩＴＲの少なくとも１個にニックを入れるのに必要なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現することができ、（２）ＩＴＲおよび介在ＤＮＡ配列をカプシドで包むことができる、ビリオン（ウイルス粒子）の形成に必要なパルボウイルスウイルスカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ等のディペンドウイルスを発現することができるベクターまたはプラスミドと共に、宿主細胞に添加することが関与する。宿主細胞において、ＤＤ−ＩＴＲが分解し、複製が、Ｒｅｐの存在下、自己プライムしたＩＴＲから開始されて、パッケージングすることができるベクターゲノムを産生する。好ましくは、介在ＤＮＡ配列は、治療用遺伝子配列等の導入遺伝子配列を含有する。例えば、ＡＡＶ ＩＴＲにニックを入れる特定のＲｅｐタンパク質は、典型的に、同じ血清型に由来する（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲとＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８）が、ＡＡＶ ＩＴＲおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が同じ血清型に由来する状況と比較して、少なくとも２５％．．．３５％．．．５０％．．．６５％．．．７５％．．．８５％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．１００％またはいずれか介在するパーセントもしくはより大きいパーセントのニッキング有効性を保持する限りにおいて、いかなる血清型を使用してもよい。この方法を使用して、ＩＴＲおよびその介在ＤＮＡ配列、例えば、導入遺伝子を含有する大量のウイルス粒子を調製することができる。ＤＤ−ＩＴＲを含有する閉鎖直鎖状ベクターの使用は、より効率的である、すなわち、二重Ｄを持たない閉鎖直鎖状ベクターと比較して、より高い収率のパッケージングされたゲノム、感染性ウイルス粒子をもたらし、ウイルス粒子は、いかなる混入プラスミドＤＮＡも持たない。
この方法を用いて、合成ＩＴＲまたは自己相補的二量体ＡＡＶ配列（ｓｃ二量体）等を含有するＡＡＶ粒子等、いずれか公知のＡＡＶ粒子を産生することができる。当業者は、典型的なＡＡＶ粒子が、一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングし、約５，０００ｎｔを超えてパッケージングすることができないことが分かっており、よって、パッケージング可能なサイズとなるように、初期非ウイルス閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物の設計には注意を払う。一実施形態では、パッケージングされた自己相補的配列が所望される場合、ｒＡＡＶベクター鋳型として使用される初期非ウイルス閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物は、例えば、Ｒｅｐニック欠陥ＩＴＲまたはヘアピン配列を有することができる。例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４６５，５８３号、同第７，７９０，１５４号、同第８，３６１，４５７号、同第８７８４７９９号を参照されたい。一実施形態では、鋳型は、およそ１／２サイズの鋳型であり、ＤＤ−ＩＴＲの１個は、Ｒｅｐニック受容能力がないＩＴＲである。一実施形態では、ニック欠陥ＩＴＲまたはヘアピン配列は、２個のＲｅｐニック受容能力があるＤＤ−ＩＴＲの間に配置され、ニック欠陥ＩＴＲまたはヘアピン配列は、さらに、導入遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列の間に存在する。いずれの場合でも、鋳型の複製後に、センスおよびアンチセンス配列は、ＩＴＲの間のＤＮＡの一本鎖に存在し、このベクターゲノムをパッケージングすることができる。
宿主細胞は、Ｒｅｐおよびウイルスカプシドタンパク質を既に発現していてよい、または細胞を、標準手段によって同時にもしくはほぼ同時にコトランスフェクトすることができる。当技術分野で使用される公知の細胞型のいずれかを、このプロセスにおいて使用することができる。例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞、例えば、バキュロウイルスを使用することができる。
本明細書に記載されるベクターを含む医薬組成物も提供される。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＩＴＲ配列は、いずれかの側において相補配列ＤおよびＤ’に隣接する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、Ｄ領域は、ニッキング部位を含有する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、Ｄ領域は、少なくとも５ヌクレオチドの長さである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、Ｄ領域は、約２０ｎｔの長さである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、Ｄ領域は、パルボウイルスＩＴＲのパルボウイルスＤ領域に対応する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ディペンドウイルスは、ＡＡＶである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、所定のＤＮＡ／核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＩＴＲは、プロモーターとして作用している。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、プロモーターは、ＩＴＲから離れている。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤＤ−ＩＴＲは、所定のＤＮＡ／核酸配列の発現を駆動する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤおよびＤ’領域は、領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、保持された核酸は、ニッキング部位、ならびに／またはＡおよびＡ’領域とＤおよびＤ’領域との接合部を含む。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、所定のＤＮＡ配列／核酸配列は、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、機能的ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤおよびＤ’領域と所定のＤＮＡ配列／核酸との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤおよびＤ’領域とプロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、スペーサーは、少なくとも５ヌクレオチドである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、スペーサーは、少なくとも２０ヌクレオチドである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、スペーサーは、少なくとも２５ヌクレオチドである。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、２個またはそれよりも多いＤＤ−ＩＴＲを含む。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、Ｄ領域は、ＩＴＲとは異なる血清型（stereotype）に由来する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、複数のＤＤ−ＩＴＲが存在し、ＤＤ−ＩＴＲの１種または複数は、その他（複数可）とは異なるウイルス血清型に由来する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＡおよびＡ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、部分的プロテロメラーゼ（protelomerase）結合部位をさらに含み、共有結合性閉鎖末端は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、標的細胞内で存続し、所定の配列の持続した発現をもたらす（例えば、複製または組換えのいずれかの結果として）。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、標的細胞における所定のＤＮＡ配列の持続した発現は、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、コンカテマー構造は、標的細胞において存続し、所定の配列の持続した発現をもたらす（例えば、複製または組換えのいずれかの結果として）。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、コンカテマー構造は、標的細胞において染色体外で存続する。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、コンカテマー構造は、標的細胞染色体中に組み込まれる。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、核酸は、治療用核酸である。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、標的細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、標的細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにある。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、構築物は、ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞に投与される。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、標的細胞は、遺伝的に欠損した細胞および／または罹患した細胞である。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、標的細胞は、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される。
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法によって産生された、細胞またはその集団に関する。
定義
単数形形態の「１つの（a）」および「１つの（an）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、複数形形態も同様に含むことを意図する。
用語「約」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、用量、時間、温度およびその他等の測定可能な値を指すのであれば、指定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する収載された物品のうち１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せと共に、二者択一（alternative）（「または」）で解釈される場合は組合せの欠如を指し、これを包含する。
用語「パルボウイルス」は、本明細書で使用される場合、自律的複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科を包含する。自律的パルボウイルスは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ、ＩｔｅｒａｖｉｒｕｓおよびＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスとして、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎血球減少症（panlcukopenia）ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、ＨＩパルボウイルス、ノバリケン（muscovy duck）パルボウイルス、ヘビパルボウイルスおよびＢ１９ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。他の自律的パルボウイルスが、当業者にとって公知である。例えば、FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属は、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶおよびヒツジＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含有する。例えば、図８〜図１９；FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）として、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型（３Ａおよび３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される他のいずれかのＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。いくつかの比較的に新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定された（例えば、Gao et al. (2004) J. Virol. 78:6381；Moris et al. (2004) Virol. 33-:375を参照）。
用語「逆位末端反復配列」または「ＩＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、逆位末端反復配列として機能する（すなわち、複製、組み込みおよび／またはプロウイルスレスキューおよびその他等、所望の機能を媒介する）、いずれかのウイルス末端反復または合成配列を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＩＴＲとなることができる。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のもの等の非ＡＡＶ ＩＴＲ配列、またはＳＶ４０複製の起点として機能するＳＶ４０ヘアピンを、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変することができるＩＴＲとして使用することができる。さらに、ＩＴＲは、図５に示し、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１６９，４９４号に記載されている通り、部分的にまたは完全に合成となることができる。典型的には、ＩＴＲは、１４５ヌクレオチドである。末端１２５ヌクレオチドは、パリンドローム二本鎖Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。構造において、Ａ−Ａ’パリンドロームは、ステムを形成し、２個の小さい方のパリンドロームＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’は、Ｔの交差アーム（cross-arm）を形成する。Ｄ配列における他の２０ヌクレオチドは、一本鎖のままである。ＡＡＶゲノムの場面において、ゲノムの各末端に１個存在する、２個のＩＴＲが存在し、ＩＴＲ毎に単一のＤ配列、ＤまたはＤ’が存在するであろう。
ＤＤ−ＩＴＲは、それが由来する配列と同じ配列のＩＴＲを有するが、Ａ配列に近接する第２のＤ配列を含み、よって、ＤおよびＤ’が存在する。ＤおよびＤ’は、アニールすることができる（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている通り）。各Ｄは典型的に、約２０ｎｔの長さであるが、５ヌクレオチドもの小ささとなることができる。より短いＤ領域は、Ａ−Ｄ接合部を保存する（例えば、Ａ−Ｄ接合部を保存する、３’末端における欠失によって生成される）。好ましくは、Ｄ領域は、ニッキング部位および／またはＡ−Ｄ接合部を保持する。ＤＤ−ＩＴＲは典型的に、約１６５ヌクレオチドである。ＤＤ−ＩＴＲは、シスで、ＤＮＡ構築物の複製のための情報を提供する能力を有する。よって、ＤＤ−ＩＴＲは、ＤおよびＤ’エレメントに隣接する反転したパリンドローム配列、例えば、図１に説明される通り、ホリデイ（Holiday）構造を形成することができる、例えば、５’−ＤＡＢＢ’ＣＣ’Ａ’Ｄ’−３’の５’から３’配列の（＋）鎖および５’−ＤＡＣＣ’ＢＢ’Ａ’Ｄ’−３’の５’から３’配列を有する（＋）鎖と相補的（complimentary）な（−）鎖を有する。ある特定の実施形態では、ＤＤ−ＩＴＲは、ＤおよびＤ’エレメントを依然として保持しつつ、その構成成分（例えば、Ａ〜Ｃ）に欠失を有することができる。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ホリデイ構造を形成する能力を依然として保持し、２コピーのＤエレメント（ＤおよびＤ’）を保持しつつ、欠失を含む。ＤＤ−ＩＴＲは、ネイティブＡＡＶ ＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成することができる。ある特定の実施形態では、欠失は、Ｂ領域エレメントに存在する。ある特定の実施形態では、欠失は、Ｃ領域エレメントに存在する。ある特定の実施形態では、欠失は、ＩＴＲのＢおよびＣエレメントの両方の内に存在する。一実施形態では、Ｂおよび／またはＣエレメント全体が欠失され、例えば、単一のヘアピンエレメントに置き換えられる。
「ＡＡＶ逆位末端反復配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または現在公知のもしくは後に発見される他のいずれかのＡＡＶ（例えば、表１を参照）が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのＡＡＶに由来することができる。末端反復が、所望の機能、例えば、複製または組み込みを媒介する限りにおいて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ネイティブ末端反復配列を有する必要がない（例えば、ネイティブＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。
本明細書で使用される場合、用語「合成ＩＴＲ」は、野生型ＩＴＲとはヌクレオチド配列が異なる、天然に存在しないＩＴＲ、例えば、１個または複数の欠失、付加、置換またはこれらのいずれかの組合せによるＡＡＶ血清型２ ＩＴＲ（ＩＴＲ２）配列を指す。合成および野生型ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲ２）配列の間の差は、単一のヌクレオチド変化、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個またはそれよりも多いヌクレオチド、またはその中のいずれかの範囲の変化もの少なさとなることができる。一部の実施形態では、合成および野生型ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲ２）配列の間の差は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１ヌクレオチド以下またはその中のいずれかの範囲となることができる。
本発明の一部の実施形態では、Ｄ領域は、Ａ、ＢおよびＣ領域とは異なる血清型に由来する。
用語「ヌクレオチド配列」および「核酸」、ＤＮＡ配列は、本明細書で互換的に使用され、標的細胞へと送達されるべき配列を指す。一般に、核酸は、目的のポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞または対象への送達のための）。核酸配列は、調節性配列をさらに含むことができ、それらの組合せは、導入遺伝子または発現構築物と称することができる。好ましくは、核酸は、ＩＴＲと共に天然に存在しない異種である（例えば、ＩＴＲが由来するウイルスには天然に存在しない）。かかる核酸は、異種と称される。
「プロモーター」は、ポリヌクレオチドの転写を開始および調節するヌクレオチド配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質等によって誘導される場合）、抑圧性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質等によって抑圧される場合）および構成的プロモーターを含むことができる。用語「プロモーター」または「制御エレメント」は、全長プロモーター領域およびこのような領域の機能的（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。
「作動可能に連結した」は、そのように記載された構成成分が、その通常機能を果たすことができるように構成された、エレメントの配置を指す。よって、核酸配列に作動可能に連結した所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、当該配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現を方向付けるように機能する限りにおいて、配列と近接している必要ない。よって、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列および核酸配列の間に存在することができ、プロモーター配列は依然として、コード配列に「作動可能に連結した」と考えることができる。よって、用語「作動可能に連結した」は、転写複合体によるプロモーターエレメントの認識後に、目的のＤＮＡ配列の転写開始を可能にする、プロモーターエレメントおよび目的のＤＮＡ配列のいずれかのスペーシングまたは配向を包含することを意図する。
プロテロメラーゼ標的配列は、いずれかのＤＮＡ配列であり、ＤＮＡ鋳型におけるその存在は、プロテロメラーゼの酵素活性による、それから閉鎖直鎖状ＤＮＡへの変換を可能にする。換言すると、プロテロメラーゼ標的配列は、共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡを形成するための、プロテロメラーゼによる二本鎖ＤＮＡの切断および再ライゲーションに要求される。
典型的には、プロテロメラーゼ標的配列は、完全反転反復としても本明細書に記載される、いずれかの完全パリンドローム配列、すなわち、２回回転対称を有するいずれかの二本鎖ＤＮＡ配列を含む。それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１０９，２５０号に示す通り、様々な中温性バクテリオファージおよび細菌プラスミド由来のプロテロメラーゼ標的配列は全て、完全反転反復を含むという共通の特色を共有する。完全反転反復の長さは、特定の生物に応じて異なる。Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにおいて、完全反転反復は、１４塩基対の長さである。様々な中温性バクテリオファージにおいて、完全反転反復は、２２塩基対またはそれよりも長い長さである。また、一部の事例では、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ１５において、中央完全反転パリンドロームは、反転反復配列に隣接する、すなわち、より大きい不完全反転パリンドロームの一部分を形成する。
用語「鎖置換」は、ＤＮＡ合成中の二本鎖ＤＮＡの領域の遭遇の際に、相補鎖を置換するＤＮＡポリメラーゼの能力を表すように本明細書で使用される。
用語「接触」は、宿主系（例えば、無細胞または細胞）への核酸（例えば、鋳型、ＤＮＡ）の送達に関連して本明細書で使用される場合、宿主系中に存在するように、核酸（例えば、ＤＮＡ鋳型またはプラスミド鋳型）を宿主系へと配置することを広範に指す。より狭い意味では、接触は、本明細書に記載される、宿主系に鋳型またはプラスミド鋳型を配置するいずれか適切な手段を指す。接触は、例えば、環状核酸が、宿主細胞機構によって産生されるような、細胞の内部に鋳型が適切に輸送されるような手段によって為すことができる。かかる接触は、例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔またはリポフェクションが関与し得る。
図１は、プロテロメラーゼの活性を介した、本発明の共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡベクター構築物の実施形態の生成の説明である。プロテロメラーゼは、プロテロメラーゼ結合部位に結合し、２本の鎖を切断しライゲーションして、共有結合性閉鎖末端を生成し、ライゲーションされた部分に部分的プロテロメラーゼ結合部位を残す。本実施形態では、部分的プロテロメラーゼ結合部位は、所定の配列（例えば、タンパク質または核酸配列をコードする導入遺伝子）に隣接する２個のＤＤ−ＩＴＲに隣接する。ベクターは、その天然状態（アニールされた）でヘアピン末端を有する共有結合性閉鎖直鎖状二本鎖ベクターであり、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる。ベクターは、完全に変性された場合、ＤＮＡの１つの近接共有結合性閉鎖一本鎖において相補的（complimentary）導入遺伝子配列を有する一本鎖共有結合性閉鎖環を形成するであろう；復元後に、相補的（complimentary）配列が再アニールするであろう。これは、導入遺伝子の発現のための相補的（complimentary）配列が、変性されたときに別々の一本鎖共有結合性閉鎖分子に存在する、導入遺伝子を発現することができる共有結合性閉鎖環状二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、プラスミドＤＮＡとは対照的である。
図２は、細胞内で存続して持続した遺伝子発現をもたらすコンカテマー構造をもたらす、ｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る、本発明のＤＮＡベクター構築物の一実施形態の組換えの説明である。
図３は、分解後にｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションすることができる、またはｉｎ ｖｉｖｏで自己複製して、例えば、単量体およびコンカテマー構造を形成し、これにより持続した遺伝子発現をもたらすことができる、構造を生成するための、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の非存在下、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＤ−ＩＴＲ分解を示す、本発明のＤＮＡベクター構築物の実施形態の説明である。
図４は、プロテロメラーゼの活性を介した、本発明の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター構築物の別の実施形態の生成の説明である。プロテロメラーゼは、プロテロメラーゼ結合部位に結合し、２本の鎖を切断しライゲーションして、共有結合性閉鎖末端を生成し、ライゲーションされた部分に部分的プロテロメラーゼ結合部位を残す。このような構築物は、細胞において組換えることもできる。
図５は、本発明における使用のためのキメラＩＴＲを収載する。ＩＴＲ２、ＩＴＲ５、ＩＴＲ５＋２ＳＮＳ、ＩＴＲ２＋５ＳＮＳ、ＩＴＲ５＋２ＮＳ、ＩＴＲ２＋５ＮＳ、ＩＴＲ２−ＴＡ、ＩＴＲ５＋ＴＡ、ＩＴＲ２−ＧＣ、ＩＴＲ５＋ＧＣ、ＩＴＲ２−２ｎｔ、ＩＴＲ２ ５ｎｔ、ＩＴＲ２＋７、ＩＴＲ２ ９ｎｔ、ＩＴＲ２ １０ｎｔ、ＩＴＲ２ １１ｎｔ、ＩＴＲ２ １５ｎｔ、ＩＴＲ５ ３ｎｔ、ＩＴＲ５ Ｅｎｔ、ＩＴＲ５ ９ ｂｐ ＮＳ、ＩＴＲ５ ２１ｎｔ、ＩＴＲ５ ３０ｎｔ、ＩＴＲ５ ＧＡＧＹ、ＩＴＲ５ ＧＡＧＹなし、ＩＴＲ２＋８ｎｔ ＧＡＧＹ、ＩＴＲ５スペーサーＲＢＥ、ＩＴＲ２＋８−８スペーサーＲＢＥ、ＩＴＲ５とＩＴＲ２ヘアピン、ＩＴＲ２ヘアピンなし、ＩＴＲ２ Ｔ１、ＩＴＲ２ Ｔ２、ＩＴＲ２ Ｔ２ ＃２、ＩＴＲ２ Ｔ３、ＩＴＲ２ Ｔ４、ＩＴＲ５＋３ｎｔスペーサー＆ＩＴＲ５ ＮＳ、およびＩＴＲ２ ｐＨｐａ８。これらのＩＴＲは本来、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１６９，４９４号に開示された。 同上。 同上。 同上。
図６は、ＰＣＲ増幅されＥｃｏＲＩカットされた二重Ｄの、プラスミドｐＧＥＭ−３’ＺのＥｃｏＲＩ部位へのクローニングの説明である。
図７は、ウイルス粒子の調製の概略図である。
図８は、プロテロメラーゼ標的部位ｔｅｌＲＬを示す。感染後のファージＮ１５のＤＮＡは、テロメア分解部位ｔｅｌＲＬを含有する環状ＤＮＡからなる。この部位は、右および左アームとしてｔｅｌＲおよびｔｅｌＬを有するパリンドロームである。矢印は、パリンドロームにおける反転反復（各２８ｂｐ）およびドットの中断を示す。中央の２２ｂｐパリンドロームｔｅｌＯは、プロテロメラーゼＴｅｌＮによる認識および切断に要求される。ＴｅｌＮは、ｔｅｌＯ内でＤＮＡを切断し、その結果得られる末端を連接して、どちらの末端にも２個の共有結合性閉鎖ヘアピンを形成する。２８ｂｐ配列ｔｅｌＲおよびｔｅｌＬは、直鎖状Ｎ１５プロファージＤＮＡ（「ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ」）の末端も命名する。
図９Ａ〜図９Ｃは、ミニｌｃ−ＤＮＡからのＥＧＦＰの発現から予想される結果を示す。（図９Ａ）プラスミドｐＤＤ３（左）において、２個のｔｅｌＲＬ部位は、ＥＧＦＰの転写単位に隣接する。プロテロメラーゼとｐＤＤ３との反応は、２個の直鎖状閉鎖直鎖状ＤＮＡ断片である、ＥＧＦＰ発現ミニｌｃ−ＤＮＡ（右）およびベクター骨格（図示せず）をもたらす。プロテロメラーゼ標的部位内の２個のＭｕｎＩ認識部位が使用されて、対照と同じサイズのミニｌｏ−ＤＮＡを生成する。（図９Ｂ）ミニｌｃ−ＤＮＡ（ｌｃ）およびミニｌｏ−ＤＮＡ（ｌｏ）の調製物のアリコート（各０．２μｇ）は、１．２％アガロースゲル電気泳動に付されるであろう。親プラスミド（ｃｃｃ）は、ＴｅｌＮ（ｌｃ）またはＭｕｎＩ（ｌｏ）のいずれかでカットされて、同一の長さの２個の断片となるであろう（画分Ｉ）。次に、ベクター骨格は、ＨａｅＩＩを使用して消化され（画分ＩＩ）、ミニＤＮＡが精製される（画分ＩＩＩ）。ベクターＤＮＡの非存在は、ＨａｅＩＩによる処置によって検証されて、ベクター由来の消化産物について検査するであろう。ＰｓｔＩを使用して、ミニＤＮＡの消化後に残っているベクター断片について検査するであろう（画分ＩＩＩ）。ＰｓｔＩが、親ｃｃｃ−ＤＮＡを１回のみカットすることを実証するために、親プラスミド（ｃｃｃ）が含まれるであろう。（図９Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞は、それぞれミニｌｃ−ＤＮＡ（ｌｃ）、ミニｌｏ−ＤＮＡ（ｌｏ）または親ＤＮＡ（ｃｃｃ）（各６ｎｍｏｌ）を含有するＤＮＡ（総計０．７μｇ）を一過的にトランスフェクトされるであろう。対照として、ベクター（ｃ）が使用されるであろう。トランスフェクション効率は、ＥＧＦＰ−ＣＮＫ．ＣＴ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰｃ２−ＣＮＫ．ＣＴ、０．３５μｇ）によるコトランスフェクションによって制御されるであろう。ＤＮＡの総量は、ベクターＤＮＡにより調整されるであろう。ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＣＮＫ．ＣＴの存在は、ウエスタンブロット解析によってトランスフェクション後４８時間で決定されるであろう。ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＣＮＫ．ＣＴを表す予想されるバンドが示される。 同上。
図１０は、所定のＤＮＡ配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを含有する親プラスミドＤＮＡベクターのコンディショナルプロセシングが起こる場合に予想される結果を示す（図１０Ａ）。ミニＤＮＡベクターへの親プラスミドのＲ−細胞コンディショナルプロセシング。誘導条件下で、Ｒ−細胞は、ミニｌｃｃ（Ｔｅｌ−細胞）およびミニｃｃｃ（Ｃｒｅ−細胞）ＤＮＡの産生をもたらす（図１０Ｂ）。ミニｌｃｃおよびミニｃｃベクターへの親プラスミド構築物のプロセシング。誘導（４２℃）条件下でのＲ−細胞からのプラスミド抽出後のｌｃｃミニベクター（Ｔｅｌ）およびｃｃｃミニベクター（Ｃｒｅ）へのプラスミドのプロセシングの効率。各代表的バンドに近接する概略図は、それらが表す予想されるプラスミドおよび予想される高次構造を示す（図１０Ｃ）。Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔｅｌ／ｐａｌ組換え効率、対、ＴｅｌＮ／ｔｅｌＲＬ。Ｔｅｌ＋対ＴｅｌＮ＋Ｒ−細胞における、ｌｃｃミニベクターへのｐＤＤ４プラスミドのプロセシングの効率。
図１１は、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結されるプロモーター（赤色の星で示す）、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結されるプロモーター（赤色の星で示す）、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を５’から３’方向で有し、制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する、環状核酸を製造するための例示的な概略図を提示する。プラスミド断片は、ＢＡＭＨＩおよびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素でカットすることにより、プラスミドから切り出される。アダプター配列が、プラスミド断片にライゲーションされて、鋳型を形成する。鋳型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）または細菌パッケージング細胞において複製することができる。本明細書に５’から３’で示すエレメント（例えば、切断部位、ＯＲＩ、ＩＴＲ、または導入遺伝子に連結されるプロモーター）の例証される順序は、限定を意味するものではなく、エレメントが、５’から３’でいずれかの順序となることができることを理解されたい。
図１２は、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結されるプロモーター（星で示す）、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を５’から３’方向で有し、制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する、環状核酸を製造するための例示的な概略図を提示する。プラスミド断片は、ＢＡＭＨＩおよびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素でカットすることにより、プラスミドから切り出される。アダプター配列が、プラスミド断片にライゲーションされて、鋳型を形成する。鋳型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）または細菌パッケージング細胞において複製することができる。本明細書に５’から３’で示すエレメント（例えば、切断部位、ＯＲＩ、ＩＴＲ、または導入遺伝子に連結されるプロモーター）の例証される順序は、限定を意味するものではなく、エレメントが、５’から３’でいずれかの順序となることができることを理解されたい。
図１３は、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＰＶＵＩＩ制限部位、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結されるプロモーター（星で示す）、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を５’から３’方向で有し、制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する、環状核酸を製造するための例示的な概略図を提示する。プラスミド断片は、ＢＡＭＨＩおよびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素でカットすることにより、プラスミドから切り出される。アダプター配列が、プラスミド断片にライゲーションされて、鋳型を形成する。鋳型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）または細菌パッケージング細胞において複製することができる。複製後に、環状核酸は、ＰＶＵＩＩ制限酵素でさらにカットされ、アダプター配列およびＯＲＩを除去し、１個の開放末端（open end）および１個の閉鎖末端（closed end）をもたらす。本明細書に５’から３’で示すエレメント（例えば、切断部位、ＯＲＩ、ＩＴＲ、または導入遺伝子に連結されるプロモーター）の例証される順序は、限定を意味するものではなく、エレメントが、５’から３’でいずれかの順序となることができることを理解されたい。
図１４は、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結されるプロモーター（星で示す）、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結されるプロモーター（星で示す）、ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、ヘアピン配列、相補的ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結される相補的プロモーター（星で示す）、相補的ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）、導入遺伝子に連結される相補的プロモーター（星で示す）、相補的ＤＤ−ＩＴＲ（突然変異体）およびＯＲＩΔ２９を５’から３’方向で有する自己相補的一本鎖ＤＮＡベクターを製造する例示的な概略図を提示する。この方法は、細菌パッケージング細胞およびヘルパーファージを使用する。アステリスクは、相補配列、例えば、相補的ＴＲまたは導入遺伝子配列を示す。本明細書に５’から３’で示すエレメント（例えば、切断部位、ＯＲＩ、ＩＴＲ、または導入遺伝子に連結されるプロモーター）の例証される順序は、限定を意味するものではなく、エレメントが、５’から３’でいずれかの順序となることができることを理解されたい。
本発明の態様は、持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸配列の送達のためのＤＮＡベクターに関する。ＤＮＡベクターは、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲおよび所定の核酸配列／構築物（例えば、発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列（例えば、異種核酸）に作動可能に連結したプロモーター等の調節性配列）を含む。ＤＮＡベクターは、共有結合性閉鎖直鎖状非ウイルスＤＮＡ構築物である。ＤＮＡベクターは、標的細胞においてさらに自己複製するおよび／または組換えることができる（例えば、標的細胞が分裂するときに）。細胞への核酸の送達のための、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを有するＤＮＡベクター構築物は、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡであり、プラスミドＤＮＡではない、すなわち、ＤＤ−ＩＴＲプラスミドではない。好まれる一実施形態では、共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡベクターは、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む（例えば、図１に示す通り）。
ＩＴＲ（逆位末端反復配列）は典型的に、ＴまたはＹ構造の形成を可能にする、介在するスペーサー配列とアニールすることができる相補的パリンドローム配列の領域を有する。かかる領域は、当技術分野で公知であり、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と本明細書で称される（例えば、米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている通り）。ＡＡＶ ＩＴＲの場面において、Ｄ領域は、ゲノムの一本鎖部分である。ＤＤ−ＩＴＲは、ＩＴＲのＤ領域と相補的な追加的なＤ’領域を有する（その全体が参照により本明細書に組み込まれるXiao et al. J. Virology vo. 71 (2). 1997: p941-948も参照）。
一部の実施形態では、所定の核酸配列／構築物に隣接するように設置された２個のＤＤ−ＩＴＲが存在する（例えば、図１の下部に示す通り考慮する場合）。一部の実施形態では、ＤＤ−ＩＴＲの少なくとも１個は、ＡＡＶ ＩＴＲである。
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性により共有結合性閉鎖末端の生成後に残るような等）。
好まれる一実施形態では、共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物は、例えば、図１の下部に示す通り、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む。図１は、プロテロメラーゼ結合部位の半分を示すが、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物は、プロテロメラーゼ結合部位を含む必要がない。
本発明の実施形態では、スペーサーとして機能するための、プロモーターの５’末端（＋鎖）およびＤＤ−ＩＴＲの間に設置された少なくとも２ヌクレオチドが存在する。このようなスペーサーは、ＤＤ−ＩＴＲが、プロモーター機能を阻害することを防止する。スペーサーは、２ヌクレオチドよりも大きくなることができ、例えば、５またはそれよりも多いヌクレオチドとなることができる。一実施形態では、スペーサーは、少なくとも１０ヌクレオチドであり、一実施形態では、スペーサーは、２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多い、または２５ヌクレオチドもしくはそれよりも多い。一実施形態では、スペーサーは、５〜５０ヌクレオチドである。好まれる実施形態では、スペーサーは、２０ヌクレオチドである。
本発明の実施形態では、ベクターにはプロモーターが存在せず、ＤＤ−ＩＴＲは、プロモーターとして作用して、所定のＤＮＡ核酸の発現を駆動する。一部の実施形態では、スペーサーとして機能するための、所定の核酸の５’末端（＋鎖）およびＤＤ−ＩＴＲ（Ｄ領域）の間に設置された少なくとも２ヌクレオチドが存在する。スペーサーは、２ヌクレオチドよりも大きくなることができる、例えば、５またはそれよりも多いヌクレオチドとなることができる。一実施形態では、スペーサーは、少なくとも１０ヌクレオチドであり、一実施形態では、スペーサーは、２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多い、または２５ヌクレオチドもしくはそれよりも多い。一実施形態では、スペーサーは、５〜５０ヌクレオチドである。
本発明の実施形態では、ＤＮＡ構築物／ベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＤＤ−ＩＴＲが由来するＡＡＶに対応するＲｅｐタンパク質）をコードする配列を欠如する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物／ベクターの配列の大部分は、細菌ＤＮＡの代わりに哺乳動物ＤＮＡである。構築物は、異種核酸を発現する閉鎖直鎖状二本鎖ＤＮＡであり、異種遺伝子を発現することができる閉鎖環状二本鎖プラスミドＤＮＡではない。
ＩＴＲは、いずれかのパルボウイルス、例えば、ＡＡＶ等のディペンドウイルスに由来することができる。ＡＡＶの多数の血清型が公知である。例えば、下の表１を参照されたい。
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実施形態では、ＤＮＡ構築物／ベクターは、標的細胞において存続する（例えば、延長された期間）（例えば、複製または組換えおよび／またはコンカテマー形成により）。これは、標的細胞が分裂するときの自己複製および／またはコンカテマー形成、またはこれら両方の組合せを介して起こり得る。本発明の実施形態では、ＤＮＡ構築物／ベクターは、標的細胞内でコンカテマー構造へと変換される。実施形態では、コンカテマー構造は、標的細胞において存続する（例えば、延長された期間）（例えば、複製または組換えにより）。コンカテマー構造の存続は、染色体外となることも（例えば、ミニ染色体として）、または標的細胞染色体への組み込みによることもできる。
本発明の別の態様は、持続した発現のために核酸構築物を標的細胞に導入するための方法に関する。本方法は、本明細書に記載される共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を標的細胞に投与するステップを含む。標的細胞への投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏとなることができる。標的細胞へのＤＮＡ構築物の導入成功は、核酸構築物の発現を促進する。ある特定の実施形態では、標的細胞ゲノムを複製するまたは標的細胞ゲノムに組み込むＤＮＡ構築物の能力は、持続される発現をもたらす。
本発明の別の態様は、少なくとも１個のＩＴＲ配列および発現可能な直鎖状ｄｓＤＮＡ中にアニールする核酸構築物の相補鎖を含む共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を投与することによる、持続した発現のために核酸を標的細胞に導入するための方法に関する。ＤＮＡ構築物は、ヘアピン共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成するという点において、上に記載されているものと同様である。これは、部分的プロテロメラーゼ認識配列をさらに含むことができる（これが、プロテロメラーゼ活性により生成されることを反映する）。ＩＴＲは、図５に示すもの等、合成ＩＴＲである。ＩＴＲ配列は、本明細書に記載される通り、ヘアピン構造のいずれかの側に設置されたＤおよびＤ’配列の両方をさらに含むことができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＤＮＡ構築物の導入から生成された、細胞またはその集団に関する。集団の相当な部分が、ＤＮＡ構築物を受け、コードされる核酸を発現する。実施形態では、集団の細胞の少なくとも１０％が、導入された核酸を発現する。実施形態では、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれよりも多くが、導入された核酸を発現する。実施形態では、集団中の細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％またはそれよりも多くが、導入された核酸を発現する。
本明細書に記載される方法およびＤＮＡ構築物／ベクターは、標的細胞またはその集団における所定の核酸の持続した発現を促進する。持続した発現とは、コードされる産物、例えば、タンパク質または核酸の発現が、対象ベクターの投与後、無期限でないとしても延長された期間存続する検出可能レベルであることを意味する。延長された期間とは、１〜５週間、２〜５週間、３〜５週間、４〜５週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月間、１〜１２ヶ月間、１〜１０年間、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年間またはそれよりも長いことを意味する。検出可能レベルとは、コードされる産物の発現が、治療的濃度で、標的細胞、またはこれを含む哺乳動物、例えば、哺乳動物の血清においてコードされる産物を検出することができるようなレベルであることを意味する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）が用いられる対照と比較して、タンパク質発現は、対照と比較して、対象方法の後、少なくとも約２倍、通常少なくとも約５倍、さらに通常少なくとも約１０倍長く、検出可能レベルで、ある期間存続する。コードされる産物は、容易に利用でき、当業者にとって周知である技術およびプロトコールを使用して検出できる場合、検出可能レベルであると考えられる。
一部の実施形態では、上述の持続した発現は、検出可能レベルであるのみならず、高レベルである。その投与後のある期間の後に、例えば、少なくとも約２８日後に、ベクターの発現カセットによってコードされるタンパク質または核酸が、宿主、例えば、宿主の標的細胞、血清等において高レベルで存在する場合、最小のベクターが、高レベルの発現をもたらすと考えられる。コードされる産物のレベルは、宿主において検出可能な活性（例えば、表現型に影響を有する）、例えば、治療活性を示すような量で存在する場合、本発明の目的のため「高い」と考えられる。特定の産物の発現レベルが高いか否かは、特定の産物の性質に応じて必然的に変動するであろうが、当業者であれば、例えば、疾患症状の寛解等、産物の発現が、宿主の表現型における所望の効果を示すのに十分であるかに関する評価によって容易に決定することができる。
共有結合性閉鎖末端の生成
本明細書に記載されるＤＮＡ構築物の共有結合性閉鎖末端は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞合成を含む種々の公知方法によって生成することができる。共有結合性閉鎖末端を生成する一方法は、前駆体分子におけるプロテロメラーゼ結合部位の取込みと、プロテロメラーゼへの当該分子の曝露と、これによる当該部位におけるＤＮＡの切断およびライゲーションによるものである。無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の非限定的な例は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ９，１０９，２５０；ＵＳ６，４５１，５６３；Nucleic Acids Res. 2015 Oct 15; 43(18): e120；ＵＳ９４９９８４７；１５／５０８，７６６；ＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５２４１３；およびAntisense & nucleic acid drug development 11:149-153 (2001)に記載されている。
ｔｅｌＲＬ等のプロテロメラーゼ部位を含有する不完全パリンドローム構造と共に、野生型ＩＴＲ、合成ＩＴＲもしくはＤＤ ＩＴＲ配列またはこれらの組合せを有する組換えＡＡＶ ＤＮＡ鋳型を設計することができる（図８を参照）。鋳型は、閉鎖直鎖状ベクターの産生に使用される。
一実施形態では、ウイルスベクター鋳型は、例えば、欠失、挿入または置換を有し得る、野生型ＩＴＲを含む。一実施形態では、ベクター鋳型は、少なくとも１個の合成ＩＴＲ（例えば、非限定的な例が、図５に記載されている）、発現カセット、およびＩＴＲのそれぞれの側に隣接する、末端を共有結合により閉鎖するテロメラーゼによって切断することができるテロメラーゼ標的部位を含む。一実施形態では、ベクターは、２個のＤＤ ＩＴＲ、発現カセット、およびＤＤ ＩＴＲのそれぞれの側に隣接する、末端を共有結合により閉鎖するテロメラーゼによって切断することができるテロメラーゼ標的部位を含む。
原核生物系を本明細書で使用することができる。溶原性細菌において、バクテリオファージＮ１５は、共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状染色体外ＤＮＡとして存在する（Rybchin VN, Svarchevsky AN (1999) The plasmid prophage N15: a linear DNA with covalently closed ends. Mol Micro-biol 33:895-903を参照）。このＤＮＡは、単一の酵素であるプロテロメラーゼ、例えば、ＴｅｌＮ（原核生物テロメラーゼ）によって発揮される切断連接反応によって生じる［Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E (2000) The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721-7726］。ＴｅｌＮ等のプロテロメラーゼは、二本鎖ＤＮＡにおける標的配列を認識する。標的部位は、ｔｅｌＲＬと名付けられた不完全パリンドローム構造であり（図８を参照）、これは、直鎖状プロファージの共有結合性閉鎖末端に対応する２等部分ｔｅｌＲおよびｔｅｌＬによって形成される。酵素は、両方のＤＮＡ鎖を切断し、その結果得られる末端を連接して、共有結合性閉鎖ヘアピン構造を形成する。結果として生じるＤＮＡ分子は、２個のヘアピンループを有する（図８）。ＴｅｌＮは、ｔｅｌＲＬ部位を有する組換えプラスミドを直鎖化することができる［Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E (2000) The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721-7726］。したがって、高等生物における発現のためにプラスミドＤＮＡにおいてこの酵素を用いることができる。
一実施形態では、ｒＡＡＶウイルスの作製に使用することができるｉｎ ｖｉｖｏ細胞系においてｒＡＡＶ閉鎖直鎖状ＤＮＡを効率的に産生する方法が本明細書に提供される。本方法は、ＴｅｌＮ等のプロテロメラーゼまたは他のプロテロメラーゼを発現する細胞を使用するステップを含み、プロテロメラーゼ遺伝子は、調節可能プロモーターの制御下におかれる。例えば、小分子調節性プロモーターまたは温度感受性プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター等の誘導性プロモーターが挙げられる。ＡＡＶ鋳型ＤＮＡの十分な産生の後に、例えば、二重Ｄ、合成またはＡＡＶ ＩＴＲを含有する鋳型から閉鎖直鎖状ＡＡＶゲノムを切り出すであろうプロテロメラーゼが発現されることを可能にすることができる。代替の実施形態では、公知の手段によってプロテロメラーゼを細胞に添加することができる。次に、ｒＡＡＶウイルスを作製するためのトランスフェクションプロトコールにおいて、プラスミドＤＮＡの代わりにＩＴＲを含有する閉鎖直鎖状ＡＡＶゲノムを使用することができる。閉鎖直鎖状ゲノムは、各末端に１／２プロテロメラーゼ結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、ｉｎ−ｖｉｖｏ細胞系が使用されて、持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸配列の送達のための非ウイルスＤＮＡベクター構築物を産生する。非ウイルスＤＮＡベクターは、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列；Ｄ’領域をそれぞれ含む２個のＤＤ−ＩＴＲ；ならびに所定の核酸配列（例えば、発現のための異種遺伝子）を含み、ＤおよびＤ’領域が、約５〜２０ｎｔの長さの相補的パリンドローム配列であり、ＡおよびＡ’領域に近接して位置し、２個のＤＤ−ＩＴＲは、共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡの場面において当該核酸に隣接し、閉鎖直鎖状ベクターは、各末端に１／２プロテロメラーゼ結合部位を含む。
本明細書に記載されるＴｅｌＮ／ｔｅｌＲＬ系を使用して、１個のｔｅｌＲＬ部位を含有する親プラスミドを直鎖化すること、または２個の隣接ＩＴＲを有し、それぞれのセグメントに隣接する２個のｔｅｌＲＬ部位をさらに有する親プラスミドから、プロモーター、目的の遺伝子、ポリアデニル化シグナルを含むｒＡＡＶ ＤＮＡ断片または非ウイルスベクター断片を切り出すことのいずれかにより、閉鎖直鎖状ＤＮＡ断片を産生することができる。一実施形態では、少なくとも１個の二重「Ｄ」ＩＴＲが存在する。結果として生じる直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで機能的である。
系は、組換え宿主細胞を含む。本産生系における使用に適した宿主細胞は、微生物細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等の細菌細胞、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞を含む。例えば、Ｐｒｏ５バリアント（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２８１）を含むＫ１系列（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ＣＶ−１系列（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１系列（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）およびＣＯＳ−７系列（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）のＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル腎臓に由来する線維芽細胞様細胞；マウスＬ−細胞、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、マウスＣ１２７細胞、２９３系列（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）のヒト胎児由来腎臓細胞、ＨｅＬａ系列（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）のものを含むヒト癌腫細胞、ならびに系統ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０）およびＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １１）の神経芽細胞腫細胞を含む、哺乳動物宿主細胞を使用することもできる。
宿主細胞は、少なくとも１種のリコンビナーゼをコードするように設計される。宿主細胞は、２種または複数種のリコンビナーゼをコードするように設計することもできる。用語「リコンビナーゼ」は、切り出し／挿入、反転、転座および交換により、特異的標的部位、例えば、パリンドローム配列におけるＤＮＡ交換を触媒する酵素を指す。本系における使用に適したリコンビナーゼの例として、ＴｅｌＮ、Ｔｅｌ、Ｔｅｌ（ｇｐ２６ Ｋ０２ファージ）Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ｐｈｉＣ３１、Ｉｎｔ、ならびに他のラムダ形の（lambdoid）ファージインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ ８０、ＨＫ０２２およびＨＰ１リコンビナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。これらのリコンビナーゼのそれぞれのための標的配列をそれぞれ次に示す：
Figure 2021528959
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リコンビナーゼの発現は、いずれかの調節性または誘導性プロモーター、すなわち、特定の物理的もしくは化学的条件下または刺激により活性化されるプロモーターの制御下におかれる。適したプロモーターの例として、λｐＬプロモーター等の熱的調節性プロモーター、ＩＰＴＧ調節性ｌａｃプロモーター、グルコース調節性ａｒａプロモーター、Ｔ７ポリメラーゼ調節性プロモーター、寒冷ショック誘導性ｃｓｐＡプロモーター、ｐＨ誘導性プロモーター、またはｔａｃ（Ｔ７およびｌａｃ）デュアル調節性プロモーター等のこれらの組合せが挙げられる。
組換え細胞は、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲ、および目的の核酸を発現するように適合された発現カセットも取り込む。ＤＤ−ＩＴＲ含有発現ベクターは、調節性発現配列、例えば、プロモーター、開始および終結配列、ならびに目的の核酸の発現が起こることができるように調節性配列と比べて適切に位置する目的の核酸配列を含む、すなわち、目的の核酸は、少なくとも１個の隣接ＤＤ−ＩＴＲと共に発現ベクター内に発現可能に取り込まれ、好ましくは、両末端においてＤＤ−ＩＴＲに隣接する。一実施形態では、ＤＤ−ＩＴＲの１個は、プロモーターとして機能することができる。調節性発現配列および目的の核酸配列、すなわち、発現カセットは、少なくとも第１のリコンビナーゼのための標的配列（例えば、標的核酸配列）によっていずれかの側に隣接する。
共有結合性閉鎖末端を生成する代用方法は、当技術分野で公知であり、例えば、プラスミドからのミニサークルＤＮＡの形成によって為される（例えば、これらそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８２８，７２６号および米国特許第７，８９７，３８０号に記載）。例えば、ＤＤ−ベクターの無細胞合成の一方法は、２種の酵素 − Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよびプロテロメラーゼの使用を組み合わせ、高忠実度共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物を生成する。構築物は、抗生物質抵抗性マーカーを含有せず、したがって、これらの配列のパッケージングを排除する。プロセスは、商業的規模で２週間プロセスにおいてＤＤ−ＡＡＶ構築物を増幅し、ウイルス産生に要求されるＩＴＲ配列を維持することができる。
合理化された精製プロセスが伴う、ローリングサークル増幅により二本鎖ＤＮＡを増幅するためのＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよび共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡを生成するためのプロテロメラーゼが使用され、目的の配列のみを含有する純粋ＤＮＡ産物をもたらす。
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、高忠実度（１／１０６〜１／１０７）および高処理能力（およそ７０ｋｂｐ）を有する。このような特色は、このポリメラーゼを、ＧＭＰ ＤＮＡの大規模産生に特に適したものにする。プロテロメラーゼ（テロメアリゾルバーゼとしても公知）は、直鎖状ＤＮＡにおける共有結合性閉鎖ヘアピン末端の形成を触媒し、いくつかのファージ、細菌プラスミドおよび細菌染色体において同定された。一対のプロテロメラーゼは、反転したパリンドロームＤＮＡ認識配列を認識し、鎖切断、鎖交換およびＤＮＡライゲーションを触媒して、閉鎖直鎖状ヘアピン末端を生成する。このような閉鎖末端構造の形成は、ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性に対し抵抗性にし、単純な精製を可能にし、発現の安定性および持続時間を改善することができる。
合成の一実施形態では、ＤＤ−構築物の産生は、目的の領域に隣接するプロテロメラーゼ認識配列の導入に依存する。このような部位は、特定のプロテロメラーゼ酵素に高度に特異的なパリンドローム配列（例えば、５６ｂｐ）である。プロテロメラーゼタンパク質は、このような部位に結合して、単量体二本鎖直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡ構築物をもたらす切断連接反応を行う。目的の遺伝子の外側のＤＮＡ（例えば、本来のベクター骨格）は、この酵素によって同様に処理されることになり、このような領域は、ベクター骨格に特有の制限部位でカットする制限酵素の逐次作用および放出された断片のエキソヌクレアーゼ消化によって除去し、ＤＤ領域を含有する所望の共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡのみを残すことができる。
変性されると、ＤＤ−構築物は、さらなる増幅反応のための出発材料として使用することができる環状ＤＮＡ分子を含む。
プロテロメラーゼ結合部位
一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プロテロメラーゼ結合部位を含み、共有結合性閉鎖末端は、プロテロメラーゼ（protelomorase）酵素活性によって形成される（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで）。本発明における使用のためのプロテロメラーゼ結合部位および対応するプロテロメラーゼは、これらそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４９９，８４７号および米国特許第９，１９０，２５０号に提供される。本発明において使用されるプロテロメラーゼ標的配列は、好ましくは、少なくとも１４塩基対の長さの二本鎖パリンドローム（完全反転反復）配列を含む。好まれる完全反転反復配列は、配列番号１〜６およびそれらのバリアントの配列を含む。配列番号１（ＮＣＡＴＮＮＴＡＮＮＣＧＮＮＴＡＮＮＡＴＧＮ）は、中温性バクテリオファージ完全反転反復の２２塩基コンセンサス配列である。完全反転反復の塩基対は、異なるバクテリオファージの間である特定の位置において保存されているが、他の位置において配列の柔軟性が可能である。よって、配列番号１は、本発明のプロセスにおけるバクテリオファージプロテロメラーゼによる使用のための完全反転反復配列の最小コンセンサス配列である。
配列番号１によって定義されるコンセンサス内では、配列番号２（ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ）が、Ｅ．ｃｏｌｉファージＮ１５およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａファージＰｈｉ ＫＯ２プロテロメラーゼによる使用のための特に好まれる完全反転反復配列である。また、配列番号１によって定義されるコンセンサス内では、配列番号３〜５：配列番号３（ＧＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＣ）、配列番号４（ＣＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＧ）、配列番号５（ＧＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＧＣ）が、それぞれ、ＹｅｒｓｉｎｉａファージＰＹ５４、ＨａｌｏｍｏｎａｓファージｐｈｉＨＡＰ−１およびＶｉｂｒｉｏファージＶＰ８８２由来のプロテロメラーゼによる使用のための特に好まれる完全反転反復配列である。配列番号６（ＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴ）は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉプロテロメラーゼによる使用のための特に好まれる完全反転反復配列である。この完全反転反復配列は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに含まれる直鎖状共有結合性閉鎖プラスミド、ｌｐＢ３１．１６に由来する。この１４塩基配列は、バクテリオファージの２２ｂｐコンセンサス完全反転反復（配列番号１）よりも短く、細菌プロテロメラーゼが、特異的標的配列要件において、バクテリオファージプロテロメラーゼと異なる場合があることを示す。しかし、全てのプロテロメラーゼ標的配列は、完全反転反復の共通構造モチーフを共有する。
完全反転反復配列は、本発明のプロセスにおいて使用される特異的プロテロメラーゼの要件に応じて、２２ｂｐの長さよりも大きくなることができる。よって、一部の実施形態では、完全反転反復は、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０または少なくとも１００塩基対の長さとなることができる。かかる完全反転反復配列の例として、配列番号７〜９およびそれらのバリアントが挙げられる。
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 配列番号７〜９およびそれらのバリアントは、それぞれ、ＶｉｂｒｉｏファージＶＰ８８２、ＹｅｒｓｉｎｉａファージＰＹ５４およびＨａｌｏｍｏｎａｓファージｐｈｉ ＨＡＰ−１由来のプロテロメラーゼによる使用に特に好まれる。
完全反転反復は、追加的な反転反復配列に隣接され得る。隣接反転反復は、完全または不完全反復となることができる、すなわち、完全に対称的または部分的に対称的となることができる。隣接反転反復は、中央パリンドロームと近接していても近接していなくてもよい。プロテロメラーゼ標的配列は、少なくとも１４塩基対の長さの完全反転反復配列を含む不完全反転反復配列を含むことができる。例は、配列番号１４である。不完全反転反復配列は、少なくとも２２塩基対の長さの完全反転反復配列を含むことができる。例は、配列番号１０である。
特に好まれるプロテロメラーゼ標的配列は、配列番号１０〜１４またはそれらのバリアントの配列を含む。
Figure 2021528959
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配列番号１０〜１４の配列は、上に記載されている完全反転反復配列を含み、関連する生物由来の隣接配列をその上含む。配列番号１０またはそのバリアントの配列を含むプロテロメラーゼ標的配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ１５ ＴｅｌＮプロテロメラーゼおよびそのバリアントと組み合わせた使用に好まれる。配列番号１１またはそのバリアントの配列を含むプロテロメラーゼ標的配列は、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａファージＰｈｉ Ｋ０２プロテロメラーゼおよびそのバリアントと組み合わせた使用に好まれる。配列番号１２またはそのバリアントの配列を含むプロテロメラーゼ標的配列は、ＹｅｒｓｉｎｉａファージＰＹ５４プロテロメラーゼおよびそのバリアントと組み合わせた使用に好まれる。配列番号１３またはそのバリアントの配列を含むプロテロメラーゼ標的配列は、ＶｉｂｒｉｏファージＶＰ８８２プロテロメラーゼおよびそのバリアントと組み合わせた使用に好まれる。配列番号１４またはそのバリアントの配列を含むプロテロメラーゼ標的配列は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉプロテロメラーゼと組み合わせた使用に好まれる。
上に記載されているパリンドロームまたはプロテロメラーゼ標的配列のいずれかのバリアントは、そのホモログまたは突然変異体を含む。突然変異体は、ネイティブ配列に関するトランケーション、置換または欠失を含む。バリアント配列は、ＤＮＡ鋳型におけるその存在が、プロテロメラーゼの酵素活性によるそれから閉鎖直鎖状ＤＮＡへの変換を可能にする、いずれかの配列である。これは、閉鎖直鎖状ＤＮＡの形成に適切なアッセイの使用によって容易に決定することができる。当技術分野で記載されるいずれか適したアッセイを使用することができる。適したアッセイの例は、Deneke et al, PNAS (2000) 97, 7721-7726に記載されている。好ましくは、バリアントは、ネイティブ配列により観察されるものと匹敵するプロテロメラーゼ結合および活性を可能にする。本明細書に記載されるパリンドローム配列の好まれるバリアントの例として、完全反復構造を保存し、依然として、閉鎖直鎖状ＤＮＡの形成を可能にすることができる、トランケートされたパリンドローム配列が挙げられる。しかし、バリアントプロテロメラーゼ標的配列は、完全パリンドロームをもはや保存することができなくなるように改変することができるが、ただし、これがプロテロメラーゼ活性の基質として作用することができることを条件とする。
当業者が、上に概要を述べる構造原理に基づいて、本発明における使用のための適したプロテロメラーゼ標的配列を容易に同定することができるであろうことを理解するべきである。候補プロテロメラーゼ標的配列は、上に記載されているアッセイを使用して、閉鎖直鎖状ＤＮＡの形成を促進するその能力に関してスクリーニングすることができる。
共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物の生成
本明細書に記載される共有結合性閉鎖ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生成することができる。ベクターは、標的細胞において導入遺伝子を発現することができる共有結合性閉鎖直鎖状二本鎖ベクターである。例えば本明細書に記載されるＩＴＲを含有する、閉鎖直鎖状発現カセットＤＮＡの産生のためのｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスの一例は、ａ）いずれかの側においてプロテロメラーゼ標的配列に隣接した少なくとも１個の発現カセットを含むＤＮＡ鋳型を、１種または複数のプライマーの存在下、前記鋳型の増幅を促進する条件下で、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップと、ｂ）ａ）において産生された増幅されたＤＮＡを、閉鎖直鎖状発現カセットＤＮＡの形成を促進する条件下、少なくとも１種のプロテロメラーゼと接触させるステップとを含む。閉鎖直鎖状発現カセットＤＮＡ産物は、目的のコード配列に作動可能に連結した真核生物プロモーター、および必要に応じて、真核生物転写終結配列を含む、これからなるまたはこれから本質的になることができる。閉鎖直鎖状発現カセットＤＮＡ産物は、その上、（ｉ） 細菌複製起点；（ｉｉ）細菌選択マーカー（典型的には、抗生物質抵抗性遺伝子）および（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧモチーフからなる群から典型的に選択される、１種または複数の細菌またはベクター配列を欠如することができる。
上に概要を述べる通り、少なくとも１個のプロテロメラーゼ標的配列を含むいずれかのＤＮＡ鋳型は、本発明のプロセスに従って増幅することができる。よって、例えばＤＮＡワクチンまたは他の治療用タンパク質および核酸のための、治療用ＤＮＡ分子の産生が好まれるが、本発明のプロセスを使用して、いかなる種類の閉鎖直鎖状ＤＮＡを産生することもできる。ＤＮＡ鋳型は、二本鎖（ｄｓ）または一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡとなることができる。二本鎖ＤＮＡ鋳型は、開放環状二本鎖ＤＮＡ、閉鎖環状二本鎖ＤＮＡ、開放直鎖状二本鎖ＤＮＡまたは閉鎖直鎖状二本鎖ＤＮＡとなることができる。好ましくは、鋳型は、閉鎖環状二本鎖ＤＮＡである。閉鎖環状ｄｓＤＮＡ鋳型は、ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）ＤＮＡポリメラーゼによる使用に特に好まれる。環状ｄｓＤＮＡ鋳型は、細菌繁殖のための遺伝子の収容に典型的に使用される、プラスミドまたは他のベクターの形態となることができる。よって、本発明のプロセスを使用して、市販のＤＮＡ薬等、いずれか市販のプラスミドまたは他のベクターを増幅し、次いで、増幅されたベクターＤＮＡを閉鎖直鎖状ＤＮＡへと変換することができる。
開放環状ｄｓＤＮＡを鋳型として使用することができ、この場合、ＤＮＡポリメラーゼは、ニックを入れられたＤＮＡ鎖から増幅を開始することができる鎖置換ポリメラーゼである。本実施形態では、鋳型は、鋳型におけるＤＮＡ鎖に１個または複数の部位でニックを入れる１種または複数の酵素と共に以前にインキュベートされてよい。閉鎖直鎖状ｄｓＤＮＡを鋳型として使用することもできる。閉鎖直鎖状ｄｓＤＮＡ鋳型（出発材料）は、閉鎖直鎖状ＤＮＡ産物と同一となることができる。閉鎖直鎖状ＤＮＡは、鋳型として使用される場合、鋳型ＤＮＡの増幅を促進する条件の前にまたはその間に、変性条件下でインキュベートして、一本鎖環状ＤＮＡを形成することができる。
上に概要を述べる通り、ＤＮＡ鋳型は典型的に、上に記載されている、すなわち、目的のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結した真核生物プロモーター、および必要に応じて真核生物転写終結配列を含む、これからなるまたはこれから本質的になる発現カセットを含む。必要に応じて、発現カセットは、上に定義される、すなわち、（ｉ）細菌複製起点；（ｉｉ）細菌選択マーカー（典型的には、抗生物質抵抗性遺伝子）および（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧモチーフからなる群から典型的に選択される１種または複数の細菌またはベクター配列を欠如する、最小の発現カセットとなることができる。
ＤＮＡ鋳型は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって、プロセスにおける使用に十分な量で提供することができる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生することができる。ＤＮＡ鋳型は、ｄｓＤＮＡである場合、増幅ステップのために、少なくともセ氏９４度の温度における事前のインキュベーションによって、変性した一本鎖として提供することができる。よって、本発明のプロセスは、好ましくは、ｄｓＤＮＡ鋳型を変性して、一本鎖ＤＮＡを提供するステップを含む。あるいは、ｄｓＤＮＡ鋳型は、二本鎖形態で提供することができる。ＤＮＡ鋳型の全体または選択された部分を反応において増幅することができる。
ＤＮＡ鋳型は、前記鋳型の増幅を促進する条件下で、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼと接触させられる。いずれのＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。いずれの市販のＤＮＡポリメラーゼも、本発明のプロセスにおける使用に適する。２、３、４、５種またはそれよりも多い異なるＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、例えば、プルーフリーディング機能を提供する１種と、それを提供しない１種または複数のその他を使用することができる。異なる機構を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、例えば、鎖置換型ポリメラーゼと、他の方法によってＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。鎖置換活性がないＤＮＡポリメラーゼの適した例は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである。
ＤＮＡポリメラーゼは、その活性がプロセス条件下の延長したインキュベーションによって実質的に低減されないように、高度に安定していることが好まれる。したがって、酵素は、好ましくは、温度およびｐＨが挙げられるがこれらに限定されない、ある範囲のプロセス条件下で長い半減期を有する。ＤＮＡポリメラーゼが、製造プロセスに適した１種または複数の特徴を有することも好まれる。ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、例えば、プルーフリーディング活性を有することにより、高忠実度を有する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼが、高い処理能力、高い鎖置換活性、ならびにｄＮＴＰおよびＤＮＡに対し低いＫｍを呈することが好まれる。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型として環状および／または直鎖状ＤＮＡを使用することができる場合がある。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型としてｄｓＤＮＡまたはｓｓｄＮＡを使用することができる場合がある。ＤＮＡポリメラーゼが、非特異的エキソヌクレアーゼ活性を呈さないことが好まれる。鎖置換型ポリメラーゼが好まれる。
本発明に従った増幅を可能にするため、ＤＮＡ鋳型が、１種または複数のプライマーとも接触させられることが好まれる。プライマーは、非特異的（すなわち、配列がランダム）となることができる、またはＤＮＡ鋳型内に含まれる１種もしくは複数の配列に特異的となることができる。ＤＮＡ鋳型の任意の部位での非特異的開始を可能にすることができるように、プライマーは、ランダムな配列のものとなることが好まれる。このことは、各鋳型鎖からの複数の開始反応による高い増幅効率を可能にする。ランダムプライマーの例は、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、またはそれを超える長さの配列、例えば、１２、１５、１８、２０もしくは３０ヌクレオチドの長さの配列である。ランダムプライマーは、６〜３０、８〜３０または１２〜３０ヌクレオチドの長さである。ランダムプライマーは、典型的に、例えば、ＤＮＡ鋳型におけるヘキサマー、ヘプタマー、オクタマーまたはノナマーのあらゆる潜在的な組合せを代表するオリゴヌクレオチドのミックスとして提供される。
他の実施形態では、プライマーは、特異的である。このことは、そこから増幅が開始されることが所望されるＤＮＡ鋳型における配列に相補的な配列を有することを意味する。本実施形態では、一対のプライマーを使用して、２個のプライマー結合部位の内部にあるＤＮＡ鋳型の部分を特異的に増幅することができる。プライマーは、非標識となることができる、または１種もしくは複数の標識、例えば、放射性核種もしくは蛍光色素を含むことができる。プライマーは、化学改変ヌクレオチドを含むこともできる。プライマーの長さ／配列は、典型的に、温度の考慮に基づき、すなわち、増幅ステップにおいて使用される温度で鋳型に結合することができるとして選択することができる。
ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または複数のプライマーとＤＮＡ鋳型との接触は、ＤＮＡ鋳型へのプライマーのアニーリングを促進する条件下で行われる。条件は、プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする一本鎖ＤＮＡの存在を含む。条件は、鋳型へのプライマーのアニーリングを可能にする温度および緩衝剤も含む。
ＤＮＡ鋳型が、ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または複数のプライマーと接触させられた後に、次いで、前記鋳型の増幅を促進する条件下でのインキュベーションのステップが行われる。
増幅ステップに加えて、本発明のプロセスは、閉鎖直鎖状ＤＮＡの産生のためのプロセシングステップも含む。増幅されたＤＮＡは、閉鎖直鎖状ＤＮＡの産生を促進する条件下で少なくとも１種のプロテロメラーゼと接触させられる。プロテロメラーゼに基づくこの単純なプロセシングステップは、閉鎖直鎖状ＤＮＡ分子の産生に使用される他の方法よりも有利である。増幅およびプロセシングステップは、同時にまたは同時発生的に実行することができる。しかし、好ましくは、増幅およびプロセシングステップは、増幅ステップの後に実行される（すなわち、増幅されたＤＮＡにおいて）プロセシングステップと逐次に実行される。
本発明のプロセスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞環境において実行される。よって、プロセスは、宿主細胞の非存在下で実行され、典型的に、精製された酵素構成成分の使用を含む。したがって、鋳型ＤＮＡの増幅およびプロテロメラーゼによるプロセシングは、典型的に、適した容器内の溶液中で反応構成成分を接触させることにより実行される。必要に応じて、特定の構成成分は、固体支持体への取り付け等、固定化された形態で提供することができる。
ある特定の実施形態では、鋳型は、平滑末端またはオーバーハングを有する増幅された直鎖状開放末端のＤＮＡであり、合成されたヘアピン分子が、一末端または両末端にライゲーションされて、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲまたは例えば、図５のＩＴＲを含む閉鎖末端の直鎖状ＤＮＡを形成する。鋳型は、例えば、合成またはＰＣＲ増幅することができる。ライゲーションされていないヘアピンは、当業者にとって周知の手段を使用して精製除去される。
一実施形態では、非ウイルス直鎖状ＤＮＡは、細胞内で作製される。
本発明のプロセスをいかなる規模で実行することもできることを理解するべきである。しかし、商業的または工業的規模で、プロセスが実行されてＤＮＡを増幅すること、すなわち、ミリグラム単位またはそれよりも大きい含量で、増幅されたＤＮＡを生成することが好まれる。プロセスが、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも２０ミリグラム、少なくとも５０ミリグラムまたは少なくとも１００ミリグラムの増幅されたＤＮＡを生成することが好まれる。増幅されたＤＮＡに由来する最終閉鎖直鎖状ＤＮＡ産物は、好ましくは、ミリグラム単位またはそれよりも大きい含量で生成することもできる。プロセスが、少なくとも１ミリグラム、少なくとも２ミリグラム、少なくとも５ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも２０ミリグラム、少なくとも５０ミリグラムまたは少なくとも１００ミリグラムの閉鎖直鎖状ＤＮＡを生成することが好まれる。
ミニサークルＤＮＡの形成
ＤＮＡ構築物のＤＤ−ＩＴＲの共有結合性閉鎖末端を生成する代替方法は、プラスミドからのミニサークルＤＮＡの形成によって為される。非限定的な例として、一方向性部位特異的リコンビナーゼのａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位に隣接した目的のＤＮＡ（例えば、ＤＤ−ＩＴＲ、および発現カセットの形態の所定の核酸配列）を含む親核酸（nucleic）は、一方向性部位特異的リコンビナーゼが、親核酸からミニサークルベクターを産生する組換え事象を媒介するのに十分な条件下で、隣接ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位を認識する一方向性部位特異的リコンビナーゼと接触させられる。「隣接する」とは、親核酸が次式によって表されるように、産物ミニサークルベクターに存在するべき発現カセットおよび他の目的の配列が、いずれかの末端にａｔｔ部位、例えば、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを有することを意味する：
−−−−−−ａｔｔ（ＰまたはＢ）−発現カセット−ａｔｔ（ＰまたはＢ）−−−−−−
ａｔｔ部位の順序は一般に問題とならない。ａｔｔ部位は、一方向性部位特異的リコンビナーゼの基質部位であり、典型的に、当業者によってａｔｔＢまたはａｔｔＰ部位と称される。目的の部位として、上述の特異的インテグラーゼリコンビナーゼによって認識されるａｔｔ部位と共に、その突然変異体が挙げられるがこれらに限定されない。
親核酸は、少なくとも一部には、産生方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であるかｉｎ ｖｉｖｏ方法であるかに応じて、種々の異なる形態として存在することができる。したがって、親核酸は、ゲノムＤＮＡに組み込まれる、直鎖状二本鎖核酸、閉鎖環状核酸（複製における使用に適した細菌プラスミド等）およびその他となることができる。
方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、細胞の内側で実施することができる。方法がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合、あらゆる必要な試薬、例えば、親核酸、部位特異的インテグラーゼ等が、反応混合物へと組み合わされ、所望の産物ミニサークルベクターの部位特異的リコンビナーゼ媒介性産生が起こるのに十分な条件下、十分な期間、維持される。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応のため、反応混合物は、約２０〜４０℃の間の温度で維持される。
ある特定の実施形態では、方法は、所望の産物ミニサークルベクターのリコンビナーゼ媒介性産生が、培養中の細胞の内側で起こるという点において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である。かかる実施形態の例として、親核酸が、リコンビナーゼ媒介性ベクター産生ステップに先立ち、細菌宿主において複製されて、大きいコピー数の親核酸を産生するプラスミドである実施形態が挙げられる。
上述のｉｎ ｖｉｖｏ実施形態において、最初のステップは、一般に、多数の親核酸を含む宿主細胞を先ず調製することとなり得る。このステップは、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに、親核酸として機能するであろうプラスミドを形質転換することにより簡便に行うことができる。その結果得られる形質転換された宿主細胞は次いで、上に記載されている通り、宿主細胞が、大きいコピー数の親核酸を産生するのに十分な条件下で維持される。
十分なコピー数の親核酸（例えば、プラスミド）を有する宿主細胞の提供後に、一方向性部位特異的リコンビナーゼ活性（すなわち、親核酸からの所望のベクターの産生を媒介する）が次いで、宿主細胞において産生される。いずれか簡便なプロトコールを使用して、細胞において所望のリコンビナーゼ活性を産生することができる。ある特定の実施形態では、したがって、リコンビナーゼまたは核酸コード配列は、例えば、上に記載されている通りに、宿主細胞に導入することができる。あるいは、リコンビナーゼのコード配列は、宿主細胞に既に存在していてよいが、例えば誘導性プロモーターの制御下に置かれているため、発現されていない。これらの実施形態では、誘導性コード配列は、親核酸に存在することができる、別のエピソーム核酸に存在することができる、またはさらには、宿主のゲノムＤＮＡに組み込むことができる。リコンビナーゼコード配列に操作可能に連結することができる、代表的な目的の誘導性プロモーターとして、ａｒａｃＢＡＤプロモーター、ラムダｐＬプロモーターおよびその他が挙げられるがこれらに限定されない。これらの実施形態では、宿主細胞において所望のリコンビナーゼ活性を提供するステップは、誘導性プロモーターを誘導して、所望のリコンビナーゼの発現を引き起こすステップを含む。
宿主細胞における所望のリコンビナーゼ活性の産生後に、その結果得られる宿主細胞は次いで、リコンビナーゼ活性が、親核酸からの所望のミニサークルベクターの産生を媒介するのに十分な条件下および期間、維持される。典型的には、宿主細胞は、約２０〜４０℃の間の温度で維持される。
上に記載されている親核酸からのミニサークルベクターのリコンビナーゼ媒介性産生後に、産物ミニサークルは次いで、所望の通りに、その「合成」環境の残り（例えば、反応混合物、宿主細胞等）から分離することができる。産物ミニサークルを分離するためのいずれか簡便なプロトコールを用いることができる。代表的なプロトコールは、米国特許第８，８２８，７２６号および米国特許第７，８９７，３８０号に記載されている。
環状核酸の製造
本明細書に記載される環状核酸を製造するための方法は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第６２／８６４，６８９号にさらに記載されている。
本明細書に記載される本発明の一態様は、導入遺伝子を含有する環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系を鋳型と接触させるステップであって、鋳型が、少なくとも１個の隣接切断部位ならびに（ｉ）少なくとも１個のファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１個の末端反復（ＴＲ）および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動的に連結したプロモーター配列を含み、少なくとも１個のＴＲが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）二重Ｄ ＩＴＲ（ＤＤ−ＩＴＲ）である、ステップと、（ｂ）複製が起こるのに十分な時間、宿主系をインキュベートして、環状核酸産生をもたらすステップと、（ｃ）環状核酸産生を回収するステップであって、環状核酸が自己アニールするステップとを含む方法を提供する。
本明細書に記載される本発明の別の態様は、導入遺伝子を含有する環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をプラスミド鋳型で形質転換するステップであって、プラスミド鋳型が、（ｉ）ファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）トランケートされたファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；（ｉｉｉ）少なくとも１個の末端反復（ＴＲ）および；（ｉｖ）導入遺伝子に作動的に連結したプロモーター配列を含み、プラスミド鋳型が、５’から３’方向で、センスおよびアンチセンス鎖のアニーリングを可能にするヘアピン配列によって離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含み、少なくとも１個のＴＲが、ＡＡＶ二重Ｄ ＩＴＲ（ＤＤ−ＩＴＲ）である、ステップと、（ｂ）複製が起こるのに十分な時間、宿主系をインキュベートして、環状核酸産生をもたらすステップと、（ｃ）環状核酸産生を回収するステップであって、環状核酸が自己アニールするステップとを含む方法を提供する。
一実施形態では、環状核酸の産生に使用される鋳型は、鋳型の構成成分を含む二本鎖プラスミドＤＮＡ（例えば、図１１〜図１３を参照）を、プラスミドに存在する切断部位を特異的に標的とするヌクレアーゼ、例えば、制限酵素でカットすることにより生成される。代替の実施形態では、二本鎖プラスミド鋳型を使用して、環状核酸を産生することができる（例えば、図１４）。鋳型の構成成分を含むプラスミド、または本明細書に記載されるプラスミド鋳型は、当技術分野で公知の標準クローニング技法を使用して生成することができる。切断部位のカットは、プラスミド断片、すなわち、２個の切断部位の間に見出される一本鎖直鎖状ＤＮＡを切り出す。一実施形態では、プラスミド断片は次いで（than）、カットされた末端においてアダプタータンパク質にアニールされる。例えば切断部位に対する相補配列を有するアダプター配列は、当技術分野で公知の標準技法を使用して、例えば、ライゲーションにより、切断部位にアニーリングすることができるであろう。プラスミド断片の末端へのアダプター配列のアニーリングは、ＤＮＡを環状化し、鋳型と本明細書で称される、閉鎖末端ＤＮＡ構造を作製する。
鋳型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで宿主系において複製することができる。例えば、Shepherd, et al. Scientific Reports 9, Article number: 6121 (2019)に記載されている通り、例えば、標準方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞において；Wang, G., et al. Cell Research 7, 1-12(1997)に記載されている通り、細胞抽出物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物において；または当技術分野で公知の細菌パッケージング細胞系において（これらの引用の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。細菌パッケージング細胞系は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるChastenn, L., et al. Nucleic Acids Res. 2006 Dec; 34(21): e145に記載されている通り、Ｍ１３に基づくヘルパープラスミドを発現することができる。あるいは、本明細書に記載される鋳型は、複製を起こす必要がなく、宿主系、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系の直接的接触に使用することができる。
本明細書に記載されるファージＯＲＩの使用は、複製を開始するためにヘルパーファージの存在を必ずしも要求しないため有利であり、複製物におけるヘルパーファージ混入の見込みを排除する。本明細書に記載されるファージＯＲＩは、独立して、一本鎖環、すなわち、環状核酸の複製を開始する。鋳型に設置されたファージＯＲＩは、環状核酸と本明細書で称される、一本鎖相補的環ＤＮＡの複製を開始する。一実施形態では、鋳型は、環状核酸を複製するのに十分な時間、宿主系においてインキュベートされる。一実施形態では、ファージＯＲＩは、いかなる追加的な構成成分、例えば、ヘルパーファージを要求することもなく複製を開始する。代替の実施形態では、ファージＯＲＩ開始の複製は、追加的な構成成分、例えば、ヘルパーファージの存在下で起こる。ヘルパーファージ粒子、例えば、Ｍ１３Ｋ０７は、ファージベクターを使用する場合に、粒子形成に必要な遺伝子産物を提供する。ヘルパーファージ粒子は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、(2005) Helper Phage. In: Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. Springer, Berlin, Heidelbergにさらに概説されている。
一実施形態では、鋳型は、一本鎖であり、鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ複製は、一本鎖環状核酸を生成する。一本鎖環状ＤＮＡは、例えば、導入遺伝子配列において自己アニールし、二本鎖になることができる。
ＯＲＩが、プラスミド鋳型の両側に存在する場合、例えば、鋳型の他のエレメントに隣接するＦ１ ＯＲＩおよびＯＲＩΔ２９を有するプラスミド鋳型（例えば、図１４を参照）の場合、一本鎖環状核酸は、自己相補的導入遺伝子、例えば、治療用導入遺伝子を含有する。一実施形態では、一本鎖環状核酸は、一方の鎖に、導入遺伝子のセンス配列および導入遺伝子のアンチセンス配列を含有する。一実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、鎖が屈曲し、センスおよびアンチセンス配列の結合が起こることを可能にする、リンカー、例えば、ホリデイリンカーまたは欠陥ＩＴＲによって離される。リンカーが、導入遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列の結合を容易にする鎖の屈曲を可能にするいかなる配列にもなり得ることが本明細書で特に企図される。一実施形態では、一本鎖環状核酸は、ＯＲＩに隣接する相補体領域および自己相補体領域をさらに含む。例えば、図１４を参照されたい。
環状核酸は、機械的に媒介される放出（超音波処理）または化学的に媒介される放出（洗剤）等、特異的な宿主系について公知の標準技法を使用して、宿主系から放出される（すなわち、自由になる）。放出後に、環状核酸は、標準方法を使用して、例えば、カラムクロマトグラフィーを使用した精製により回収される。
本明細書で生成される環状核酸は、閉鎖末端、開放末端、または開放末端および閉鎖末端の両方となることができる。一実施形態では、環状核酸は、閉鎖末端である。閉鎖末端のＤＮＡベクターは、いかなる立体配置、例えば、犬用の骨（doggie bone）、ダンベル、環状、閉鎖末端の直鎖状二重鎖等を有することもできる。
本明細書に記載される方法を使用して生成された環状核酸複製物は、それが発現する導入遺伝子の送達に使用することができる、または例えば、追加的なｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ複製により、より多くの環状核酸の生成に使用することができる。本明細書に記載される方法を使用して製造された環状核酸は、組換えベクター、例えば、組換えウイルスベクターの産生において使用することができる。
本明細書に記載される様々な追加的な態様は、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して製造されたベクターを提供する。
環状核酸の複製に使用される宿主系は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ宿主系となることができる。一実施形態では、宿主系は、宿主細胞、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ウイルス、細菌パッケージング細胞、または無細胞系となることができる。例えば、宿主系が、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ−５およびＳ２昆虫細胞系である場合、ＡＡＶベクターを製造するための宿主系は、バキュロウイルス発現系をさらに含むことができる。バキュロウイルス発現系は、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許番号ＵＳ６９１９０８５Ｂ２；ＵＳ６２２５０６０Ｂ１；ＵＳ５１９４３７６Ａにさらに記載されている。無細胞系において、ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において合成およびアセンブルすることができる。一実施形態では、無細胞系は、ヘルパーファージ粒子を含む。
環状核酸、またはそれが産生される鋳型もしくはプラスミド鋳型に設置されたエレメントは、５’から３’への環状核酸または鋳型もしくはプラスミド鋳型におけるそれらの設置に関して限定されない。例えば、ＯＲＩは、ｄｄ−ＩＴＲの上流に、またはｄｄ−ＩＴＲの下流に、またはｄｄ−ＩＴＲの上流および下流の両方に設置することができる。別の例では、ＯＲＩは、ｄｄ−ＩＴＲ（複数）に隣接され、導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーター配列の上流にある。
一実施形態では、鋳型は、Ｆ１ ＯＲＩを含有し、配列番号３７の配列を有する。
Figure 2021528959
Figure 2021528959
別の実施形態では、ＯＲＩは、Ｍ１３に由来し、鋳型のＭ１３ヘルパー依存性複製を容易にする。Ｍ１３ ＯＲＩは、配列番号３８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021528959
一実施形態では、少なくとも１個のＯＲＩは、野生型ＯＲＩと比較して突然変異した第２のＯＲＩを含む。突然変異したＯＲＩは、単一のヌクレオチド突然変異、例えば、ヌクレオチド欠失、挿入もしくは置換）を含むことができる、または野生型ＯＲＩ配列の少なくとも部分（例えば、少なくとも５ヌクレオチド）を欠如するようにトランケートされていてよい。一実施形態では、突然変異体ＯＲＩは、突然変異体Ｆ１ ＯＲＩ、Ｆ１−ＯＲＩΔ２９である。突然変異体ＯＲＩΔ２９は、複製を開始する能力を欠如するトランケートされたＦ１ ＯＲＩである。ＯＲＩΔ２９は、例えば、Specthrie, L, et al. Journal of Mol Biol. V. 228(3), 1992にさらに概説されている。一実施形態では、ＯＲＩΔ２９は、配列番号３９のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021528959
一実施形態では、突然変異体ＯＲＩは、突然変異体Ｍ１３ ＯＲＩ、Ｍ１３−ＯＲＩΔ２９である。突然変異体ＯＲＩΔ２９は、複製を開始する能力を欠如するトランケートされたＭ１３ ＯＲＩである。一実施形態では、ＯＲＩΔ２９は、配列番号４０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021528959
Figure 2021528959
本明細書に記載される環状核酸は、他の型または種のＯＲＩを含まず、例えば、ベクターは、細菌または哺乳動物のＯＲＩを含まない。
切断部位は、ホスホジエステル骨格が選択的に破壊されるヌクレオチド配列である。例えば、ヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列が切断部位であり、その理由として、この酵素は、配列内の選択的部位でホスホジエステル骨格をカットすることが挙げられる。かかる切断部位は、エンドヌクレアーゼに応じて一本または二本鎖となることができる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７９５，７００号に記載されている通り、マクサムおよびギルバート配列決定において行われるピリミジンおよびプリン切断反応等の化学的切断部位、または酸化等の化学的方法による切断も含まれる。
一実施形態では、鋳型は、少なくとも第２の切断をさらに含み、部位内には、鋳型に含有された追加的なエレメント、例えば、少なくとも１個の（on）ＯＲＩ、少なくとも１個のＴＲ（そのうち少なくとも１個はＤＤ−ＩＴＲである）および治療用導入遺伝子に作動的に連結したプロモーターがあり、少なくとも２個の切断部位は、これらのエレメントに隣接する。一実施形態では、ＯＲＩの直ちに下流に第３の特有の切断部位が設置される。
一実施形態では、切断部位は、ヌクレアーゼによってカットされる。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ切断の活性を保有する分子を指す。一実施形態では、ヌクレアーゼは、プロテロメラーゼであり、切断部位は、プロテロメラーゼ標的配列、例えば、ＴｅｌＮ認識部位である。一実施形態では、ヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼであり、切断部位は、エンドヌクレアーゼの認識部位（すなわち、制限部位）である。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の部位特異的切断を触媒することができる加水分解酵素である。制限エンドヌクレアーゼ作用の座位は、特異的ヌクレオチド配列の存在によって決定される。かかる配列は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位と名付けられる。少なくとも２個の切断部位が存在する場合、少なくとも２個の部位は、同じ切断部位または異なる切断部位（difference cleave site）となることができる。
一実施形態では、鋳型における制限部位は、一般的でない制限部位である、すなわち、導入遺伝子の配列において一般的に見出されない。例示的な一般的でない制限部位は、鏡様（mirror-like）パリンドローム制限部位または８塩基対制限部位を含む。一実施形態では、鋳型において使用される制限部位は、本発明の導入遺伝子、すなわち、治療用導入遺伝子において見出されない。
アダプター配列は、他のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の末端にライゲーションすることができる、短い合成した一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、本明細書に記載されるアダプター配列は、一本鎖であり、例えばヘアピンループにより、これがライゲーションされるＤＮＡ末端を閉鎖する。アダプター配列は、ＤＮＡ環状化の手段として、カットされたプラスミド断片の一末端または両末端に付加される。一実施形態では、アダプター配列は、プラスミド断片にライゲーションされ、これがライゲーションされる切断されたＤＮＡの末端における閉鎖を導く（例えば、図１１〜図１３を参照）。ＤＮＡ末端の閉鎖に使用することができる例示的なアダプタータンパク質は、例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／００９８６１２号；および米国特許第６，３６９，０３８号；同第６，４５１，５６３号；同第６，８４９，７２５号にさらに記載されているヘアピンループを含む。プラスミドから切り出されたプラスミド断片のカットされた末端に付加されるとＤＮＡを環状化することができるいかなる配列も、アダプター配列となることができると想定される。
例として、配列番号４１（ＣＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧ（配列番号４１））の配列を有するヘアピンループアダプター配列は、Ｓｆｉ１制限部位配列（例えば、ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ；配列番号４２）をさらに含むことができる。Ｓｆｉ１制限部位配列を有するアダプター配列は、制限部位のカットに十分な時間、制限酵素Ｓｆｉ１で消化することができる。この操作は、Ｓｆｉ１制限酵素により切り出されたプラスミド断片へのアダプタータンパク質のハイブリダイズに使用することができる、アダプター配列に「粘着末端」を作製するであろう。
治療用核酸
本発明のＤＮＡ構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞への核酸の送達に有用である。特に、ＤＮＡ構築物は、哺乳動物を含む動物の細胞への核酸の送達または移入に有利に用いることができる。
いずれかの目的の核酸配列（複数可）を、本発明のＤＮＡ構築物において送達することができる。目的の核酸は、治療用（例えば、医学的または獣医学的使用のための）、免疫原性（例えば、ワクチンのための）または診断用ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
治療用ポリペプチドとして、嚢胞性線維症膜コンダクタンス（cystic fibrosis transmembrane）調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニおよびマイクロジストロフィンを含む（例えば、Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130；米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号；国際公開ＷＯ／２００８／０８８８９５、Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719 (2000)；およびGregorevic et al., Mol. Ther. 16:657-64 (2008)を参照）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、ＩカッパーＢドミナント突然変異体等の抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン（sarcospan）、ユートロフィン（Tinsley et al., (1996) Nature 384:349）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、ベータ−グロビン、アルファ−グロビン、スペクトリン、アルファ１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ベータ−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、インターフェロン−ガンマ．、インターロイキン−２、インターロイキン−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンおよびその他）、ペプチド成長因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子−．アルファ．および−．ベータ．ならびにその他）、リソソーム酸．アルファ．−グルコシダーゼ、．アルファ．−ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子（factory）可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、トランケートされた構成的に活性があるｂＡＲＫｅｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、ＴＲＡＰ等の抗炎症因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、ならびにモノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例示的なＭａｂはハーセプチン．ＲＴＭ．Ｍａｂである）が挙げられるがこれらに限定されない。他の説明目的の異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素および腫瘍壊死因子）、がん治療法において使用される薬物に対する抵抗性を付与するタンパク質、腫瘍サプレッサー遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する他のいずれかのポリペプチドをコードする。パルボウイルスベクターを使用して、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対して作製された抗体または抗体断片を送達することもできる（例えば、Fang et al., Nature Biotechnol. 23:584-590 (2005)を参照）。
ポリペプチドをコードする核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする核酸配列を含む。レポーターポリペプチドは、当技術分野で公知であり、そのようなものとして、緑色蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されている通り）、スプライセオソーム媒介性トランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech 17:246；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Sharp et al., (2000) Science 287:2431を参照）、および「ガイド」ＲＮＡ等の他の非翻訳ＲＮＡ（Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；米国特許第５，８６９，２４８号、Yuan et al．）、ならびにその他をコードすることができる。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するために、および／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するために）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのために）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するために）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を処置するために、例えば、Andino et al., J. Gene Med. 10:132-142 (2008)およびLi et al., Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)を参照されたい）；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を処置するために、例えば、Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)を参照されたい）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんのために）、サルコグリカンに対するＲＮＡｉ（例えば、アルファ．、ベータ．、ガンマ）、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチンまたはアクチビンＩＩ型可溶性受容体に対するＲＮＡｉ、ＩカッパーＢドミナント突然変異体等の抗炎症性ポリペプチドに対するＲＮＡｉ、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス等）に対して作製されたＲＮＡｉを含む。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、核酸は、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、ベータ２−アドレナリン作動性受容体、ベータ２−アドレナリン作動性受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、トランケートされた構成的に活性があるｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン（calsarcin）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓ、または骨形成（morphogenie）タンパク質（ＢＮＰ２、７等、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）をコードすることができる。
ＤＮＡ構築物は、宿主染色体における座位と相同性を共有し、これと組換える核酸を含むこともできる。このアプローチを利用して、例えば、宿主細胞における遺伝的欠陥を補正することができる。
さらなる代替として、核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞において望ましく産生されるいずれかのポリペプチドをコードすることができる。例えば、ＤＮＡ構築物は、培養細胞に導入し、そこから発現された遺伝子産物を単離することができる。
調節性エレメント
核酸は、発現カセットの場面にあってもよい。当業者であれば、目的の核酸（複数可）を、適切な制御配列と作動可能に会合させることができることを理解するであろう。例えば、核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにその他等、発現制御エレメントと作動可能に会合させることができる。本発明の好まれる実施形態では、発現カセットは、目的のコード配列に作動可能に連結した真核生物プロモーター、および必要に応じて、真核生物転写終結配列を含む。当業者であれば、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、種々のプロモーター／エンハンサーエレメントを使用することができることを認めるであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性となることができる。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来性となることができ、天然または合成配列となることができる。外来性とは（bBy）、転写開始領域が、転写開始領域が導入される野生型宿主／標的細胞において見出されないことを意図する。
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、処置されるべき標的細胞または対象にとってネイティブとなることができる。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、核酸配列にとってネイティブとなることができる。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞（複数可）において機能するように選ばれる。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性となることができる。
誘導性発現制御エレメントは典型的に、異種核酸配列（複数可）の発現について調節をもたらすことが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または優先的（preferred）プロモーター／エンハンサーエレメントとなることができ、筋肉特異的または優先的（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または優先的を含む）、神経組織特異的または優先的（脳特異的または優先的を含む）、眼特異的または優先的（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または優先的、骨髄特異的または優先的、膵特異的または優先的、脾臓特異的または優先的、および肺特異的または優先的プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとして、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
標的細胞において核酸配列（複数可）が転写され、次いで翻訳される実施形態では、挿入されたタンパク質コード配列の効率的翻訳のために、特異的開始シグナルが一般に含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび近接配列を含むことができる、このような外因性翻訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものとなることができる。
ウイルス粒子の調製
本発明の態様は、一本鎖組換えウイルスゲノムとしての構築物ＤＮＡの送達のための組換えウイルス粒子を産生するための、共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡ構築物（時に、閉鎖直鎖状ＤＮＡ）に関する。これは、少なくとも２個のＤＤ−ＩＴＲを含む閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物（例えば、図１を参照）を、（１）ＤＤ−ＩＴＲの少なくとも１個にニックを入れるのに必要なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現することができ、（２）ＩＴＲおよび介在ＤＮＡ配列をカプシドで包むことができる、ビリオン（ウイルス粒子）の形成に必要なパルボウイルスウイルスカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ等のディペンドウイルスを発現することができるベクターまたはプラスミドと共に、宿主細胞へと添加することが関与する。宿主細胞において、ＤＤ−ＩＴＲが分解し、複製が、Ｒｅｐの存在下、自己プライムしたＩＴＲから開始されて、パッケージングすることができるベクターゲノムを産生する。好ましくは、介在ＤＮＡ配列は、治療用遺伝子配列等の導入遺伝子配列を含有する。例えば、ＡＡＶ ＩＴＲにニックを入れる特定のＲｅｐタンパク質は、典型的に、同じ血清型に由来する（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲとＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８）が、ＡＡＶ ＩＴＲおよびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が同じ血清型に由来する状況と比較して、少なくとも２５％．．．３５％．．．５０％．．．６５％．．．７５％．．．８５％．．．９０％．．．９５％．．．９８％．．．１００％またはいずれか介在するパーセントもしくはより大きいパーセントのニッキング有効性を保持する限りにおいて、いかなる血清型を使用してもよい。この方法を使用して、ＩＴＲおよびその介在ＤＮＡ配列、例えば、導入遺伝子を含有する大量のウイルス粒子を調製することができる。ＤＤ−ＩＴＲを含有する閉鎖直鎖状ベクターの使用は、より効率的である、すなわち、二重Ｄを持たない閉鎖直鎖状ベクターと比較して、より高い収率のパッケージングされたゲノム、感染性ウイルス粒子をもたらし、ウイルス粒子は、いかなる混入プラスミドＤＮＡも持たない。
この方法を用いて、合成ＩＴＲまたは自己相補的二量体ＡＡＶ配列（ｓｃ二量体）等を含有するＡＡＶ粒子等、いずれか公知のＡＡＶ粒子を産生することができる。当業者は、典型的ＡＡＶ粒子が、約５，０００ｎｔを超えてパッケージングすることができないことが分かっているため、パッケージング可能なサイズとなるように、初期非ウイルス閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物の設計には注意を払う。一実施形態では、パッケージングされた自己相補的配列が所望される場合、初期非ウイルス閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物ｒＡＡＶゲノムベクター鋳型は、例えば、Ｒｅｐニック欠陥ＩＴＲまたはヘアピン配列を有することができる。例えば、それらの全体が参照により組み込まれる米国特許第７４６５５８３号、同第７７９０１５４号、同第８３６１４５７号、同第８７８４７９９号を参照されたい。例えば、一実施形態では、ベクター鋳型は、およそ１／２サイズのゲノム鋳型（例えば、野生型ＡＡＶゲノムの１／２前後のサイズ）となることができ、ＤＤ−ＩＴＲの１個は、Ｒｅｐニック受容能力がないＩＴＲである。次に、レスキューされ複製されたｒＡＡＶゲノムは、全長ゲノムサイズでパッケージング可能となるであろう。代替の実施形態では、閉鎖直鎖状ＤＮＡ構築物ｒＡＡＶゲノムベクター鋳型は、ニック欠陥ＩＴＲ、または例えば、２個のＲｅｐニック受容能力があるＤＤ−ＩＴＲの間に配置されたヘアピン配列を含み、ニック欠陥ＩＴＲまたはヘアピン配列は、さらに、導入遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列の間に置かれ、ゲノム鋳型は、およそフルサイズ、例えば、５，０００ｎｔ前後またはｗｔＡＡＶサイズ、例えば、５０００ｎｔ…４８００ｎｔ…４５００ｎｔ…未満である。いずれの場合でも、閉鎖直鎖状ｒＡＡＶベクターゲノム鋳型の複製後に、センスおよびアンチセンス配列は、ＩＴＲの間のＤＮＡの一本鎖に存在し、このベクターゲノムは、ｒＡＡＶビリオン内にパッケージングすることができる。
宿主細胞は、Ｒｅｐおよびウイルスカプシドタンパク質を既に発現していてよい、または細胞を、標準手段によって同時にもしくはほぼ同時にコトランスフェクトすることができる。当技術分野で使用される公知の細胞型のいずれかを、このプロセスにおいて使用することができる。例えば、昆虫細胞、例えば、バキュロウイルスを使用することができる。哺乳動物懸濁細胞を使用した産生のための方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ９，４１１，２０６に記載されている。
本明細書に記載されるベクターを含む医薬組成物も提供される。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、ＩＴＲ配列は、いずれかの側において相補配列ＤおよびＤ’に隣接する（例えば、ＤＤ−ＩＴＲである）。
本明細書に記載される方法およびベクターの実施形態では、Ｄ領域は、ニッキング部位を含有する。
本明細書に記載される核酸または核酸ベクターのＩＴＲ配列は、いずれかのパルボウイルス（parviovirus）またはいずれかのＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）に由来することができる、または２種以上の血清型に由来することができる。本明細書に提供される核酸または核酸ベクターの一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。本明細書に提供される核酸または核酸ベクターの一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、自律的（autonomus）パルボウイルスに由来する。ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手できる製品およびサービス；ならびにこれらすべて参照により本明細書に組み込まれる、Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24): 14082-7;および Curtis A. Machida. Methods in Molecular MedicineTM. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 (c) Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および同第５，９６２，３１３号を参照）。一部の実施形態では、発現構築物は、５キロベース以下、４キロベース以下または３キロベース以下のサイズである。一部の実施形態では、発現構築物は、４〜７キロベースの間のサイズである。一実施形態では、本明細書に記載される閉鎖直鎖状ＤＮＡベクターからのｒＡＡＶゲノムのレスキューおよび複製（replicaiton）から得られる複製されたゲノムは、ディペンドウイルス粒子等のパルボウイルス粒子においてカプシドに包まれている（enccapsidated）。例えば、ＡＡＶ粒子。ｒＡＡＶ粒子は、いずれかの派生物（血清型の天然に存在しないバリアントを含む）またはキメラまたはシュードタイプを含む、いずれかのＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のものとなることができる。複製されたゲノムは、パッケージング可能なサイズである。
派生物およびキメラの非限定的な例として、ＡＡＶ２−ＡＡＶ３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５、ＡＡＶ−ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨＩＯ、ＡＡＶ２（Ｙ−＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１およびＡＡＶｒ３．４５が挙げられる（例えば、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24．The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan Al, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照）。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、改変されたカプシドタンパク質（例えば、改変されたＶＰ３、ＶＰ１またはＶＰ２を含むカプシドタンパク質）を含むカプシドを含む。改変されたカプシドタンパク質を産生する方法は、当技術分野で公知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開番号ＵＳ２０１３０３１０４４３を参照）。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、野生型カプシドタンパク質（例えば、配列番号１５等の野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質、または他の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質）における表面に露出したアミノ酸に対応する位置における少なくとも１個の非ネイティブアミノ酸置換を含む、改変されたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、野生型カプシドタンパク質における表面に露出したチロシンアミノ酸に対応する位置における非チロシンアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）、野生型カプシドタンパク質における表面に露出したスレオニンアミノ酸に対応する位置における非スレオニンアミノ酸（例えば、バリン）、野生型カプシドタンパク質における表面に露出したリシンアミノ酸に対応する位置における非リシンアミノ酸（例えば、グルタミン酸）、野生型カプシドタンパク質における表面に露出したセリンアミノ酸に対応する位置における非セリンアミノ酸（例えば、バリン）、またはこれらの組合せを含む、改変されたカプシドタンパク質を含む。
例示的で非限定的な野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列を下に提示する（配列番号１５）。
Figure 2021528959
ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを産生する方法もまた、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるZolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；ならびに米国特許公開番号ＵＳ２００７００１５２３８およびＵＳ２０１２０３２２８６１；ならびにＡＴＣＣおよびＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．から入手できるプラスミドおよびキットを参照）。例えば、ｒＡＡＶベクターゲノムが複製され、パッケージングされ、その後に精製され得るように、核酸ベクター（例えば、ＤＤ−ＩＴＲおよび異種（heterologus）遺伝子を含む閉鎖直鎖状ベクター）は、例えばｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする）を含有する１種または複数のヘルパープラスミドと組み合わせ、産生株細胞系へとトランスフェクトすることができる。
当技術分野で公知のいずれか適した細胞を用いることができる。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠陥ヘルパーウイルスから欠失された機能をもたらすトランス補完（trans-complementing）パッケージング細胞系、例えば、２９３細胞または他のＥｌａトランス補完細胞となることができる。
ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって提供することができる。現在のプロトコールは典型的に、単一のプラスミドにおいてＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させる。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、一緒に提供すれば簡便な場合がある。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、いずれかのウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供することができる。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供することができる（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥｌａまたはＥ３領域へと挿入される）。ＥＢＶベクターを用いて、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現させることもできる。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソームであるにもかかわらず、連続的な細胞分裂を通じて高いコピー数を維持するであろうことである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」として命名される染色体外エレメントとして細胞に安定して組み込まれる。Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67を参照）。
改変されたカプシド：
本発明の改変されたカプシドタンパク質は、現在公知のまたは後に発見されるいずれかのＡＡＶのカプシドタンパク質を改変することにより産生することができる。さらに、改変されるべきＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａまたは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１カプシドタンパク質、または表１に示すＡＡＶのいずれか）となることができるが、そのように限定されてはいない。当業者であれば、ＡＡＶカプシドタンパク質に対する種々の操作が、当技術分野で公知であり、本発明が、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことを理解するであろう。例えば、改変されるべきカプシドタンパク質は、既に、天然に存在するＡＡＶと比較して、挿入、欠失または置換等の変更を有することができる（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０および／またはＡＡＶ１１、または現在公知のもしくは後に発見される他のいずれかのＡＡＶに由来する）。かかるＡＡＶカプシドタンパク質もまた、本発明の範囲内である。
一実施形態では、カプシドタンパク質は、改変されていないカプシドタンパク質と比較して、減少された肝臓形質導入および／または低減されたグリカン結合親和性の表現型を有するように改変することができる。当業者には、均等なアミノ酸が、他のＡＡＶ血清型に存在し、本発明が、かかる均等なアミノ酸位置に本発明の突然変異（複数可）を含む、これから本質的になるまたはこれからなる、かかる他のＡＡＶ血清型を包含し、前記突然変異（複数可）が、対照と比較して低減された肝臓形質導入および／または低減されたグリカン結合親和性の表現型をもたらすことが（what）周知となるであろう。
特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満または７０個未満のアミノ酸変更を含む。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４０９，９５３号を参照されたい。
ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を、細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で公知である。典型的には、このような配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供されるであろう。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および同第６，０９３，５７０号に記載されている通り、効率的ＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子の全てを運ぶ非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供することができる。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体に包埋されたまたは安定した染色体外エレメントとして維持されたヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供することができる。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオンへとパッケージングすることができない、例えば、ＴＲに隣接されない。
一部の実施形態では、１種または複数のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、ならびにＥｌａ遺伝子、Ｅｌｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子およびＶＡ遺伝子等のＡＡＶ産生を支援する他の遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを含む。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ５に由来する。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は、当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙから得られるｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰｌｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手できる他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760; Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.; Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy, Vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno- Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296- 5303;および Moullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno- associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照）。
例示的で非限定的なｒＡＡＶ粒子産生方法を次に記載する。所望のＡＡＶ血清型のためのｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦ、ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子をそれらのネイティブプロモーターの転写制御下で含む、１種または複数のヘルパープラスミドが産生されるまたは得られる。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手できる）は、ＣａＰ０４媒介性トランスフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等の脂質またはポリマー分子により、ヘルパープラスミド（複数可）および本明細書に記載される核酸ベクターを含有するプラスミドをトランスフェクトされる。あるいは、別の例では、Ｓｆ９に基づく産生株安定細胞系は、核酸ベクターを含有する単一の組換えバキュロウイルスを感染させられる。次に、ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載されるいずれかの方法を使用して、例えば、イオジキサノール段階勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿により精製することができる。
組換えＡＡＶ産生の様々な手段が、当業者にとって周知であり、そのような方法のいずれかは、本明細書に記載されるベクター鋳型を、本明細書に記載される少なくとも２個のＤＤ−ＩＴＲを含む（cmprising）共有結合性（covalantly）閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡ構築物に置換する改変により使用することができる。
本開示はまた、開示されているｒＡＡＶ粒子、発現構築物または核酸ベクターのうち少なくとも１種を含む宿主細胞を企図する。かかる宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞を含み、ヒト宿主細胞が好まれ、細胞または組織培養において単離されていてよい。遺伝子改変された動物モデル（例えば、マウス）の場合、形質転換された宿主細胞は、非ヒト動物それ自体の身体内に含まれていてよい。
一実施形態では、例えばＤＤ ＩＴＲを含む、閉鎖直鎖状またはミニサークルＤＮＡを使用したｒＡＡＶは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４，１２０６号に記載されている通り、細胞系、例えば、Ｐｒｏ１０細胞系において産生される。
標的細胞へのＤＮＡ構築物の送達
本発明のウイルス粒子またはネイキッドＤＮＡのいずれかのＤＮＡベクター構築物は、当技術分野における様々な利用できる手段によって標的細胞に送達することができる。核酸の送達方法は、粒子による感染、リポフェクション、ヌクレオフェクション（nucleofection）、マイクロインジェクション、遺伝子銃、リポソーム、イムノリポソーム（immunoliposome）、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、および薬剤に増強されたＤＮＡ取り込みを限定することなく含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に売られている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）へと為すことができる。
一実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ構築物は、トランスフェクションによって細胞に投与される。本明細書に記載される方法に有用なトランスフェクション方法として、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクションまたはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるがこれらに限定されない。本発明による使用に適したトランスフェクション薬剤は、細胞へのＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の導入を容易にするトランスフェクション薬剤を含む。例示的なトランスフェクション試薬は、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ−１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ構築物は、電気穿孔（例えば、ヌクレオフェクション）によって細胞に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、当業者にとって公知のマイクロ流体方法により細胞に投与される。
リポソーム媒介性送達
実施形態では、ＤＮＡ構築物は、細胞への送達のためにリポソームに添加される。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を保有する小胞である。リポソームは典型的に、医薬品開発の場面における薬物／治療法送達のための担体として使用される。リポソームは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置して、薬物または活性医薬品成分（ＡＰＩ）を送達することにより機能する。かかる送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特に、ホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、このような組成物は、他の脂質を含むこともできる。
一部の態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に親水性および疎水性をもたらし、投薬頻度を低減し得る、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１種または複数の化合物（いわゆる「ペグ化化合物」）を含むリポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は単純に、追加的な構成成分としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含む。かかる態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａとなることができる。
一部の態様では、本開示は、数時間〜数週間の期間にわたり、延長された放出または制御された放出プロファイルでＡＰＩを送達するであろうリポソーム製剤を提供する。一部の関連する態様では、リポソーム製剤は、脂質二重層によって結合される水性チャンバー（aqueous chamber）を含むことができる。他の関連する態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたりＡＰＩを放出する、上昇した温度で物理的遷移を起こす構成成分でＡＰＩを被包する。
一部の態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１種または複数の脂質を含む。一部の態様では、リポソーム製剤は、オプチソーム（optisome）を含む。
一部の態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン（dierucoylphosphatidylcholine））；ＤＯＰＥ（ジオレオイル（dioleoly）−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン（phophoethanolamine））、コレステロール硫酸塩（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル（dioleoly）−ｓｎグリセロ−ホスファチジルコリン）、またはこれらのいずれかの組合せから選択される１種または複数の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
一部の態様では、本開示は、リン脂質、コレステロールおよびペグ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、リポソーム製剤の全体的な脂質含量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質およびペグ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質およびペグ化脂質をそれぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、コレステロールおよびペグ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、ペグ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。一部の態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質コンジュゲートおよびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
一部の態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１種または複数の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１種または複数の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールのうち１種または複数を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ；およびＤＯＰＥを含む。
一部の態様では、本開示は、１種または複数の医薬品賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
一部の態様では、本開示は、単層または多重層の構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、本開示は、多胞性粒子および／または泡に基づく粒子を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、本開示は、一般的なナノ粒子よりも大きい相対的サイズであり、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。一部の態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥した粉末である。
一部の態様では、本開示は、単離されたＤＮＡ構築物がリポソームの外側にある混合物に弱塩基を添加することにより、実施例１のプロセスまたは本明細書に開示される他の仕方によって得られたＤＮＡ構築物を用いて作製され、これをロードしたリポソーム製剤を提供する。この添加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３へと増加させ、ＡＰＩをリポソーム内に駆動する。一部の態様では、本開示は、リポソームの内側において酸性のｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。かかる事例では、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくは、ｐＨ６．５となることができる。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。かかる事例では、ポリマーまたは非ポリマー性高電荷アニオンおよびリポソーム内トラッピング剤、例えば、ポリリン酸塩またはスクロースオクタ硫酸塩（octasulfate）が利用される。
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。
一部の態様では、本開示は、ＤＮＡ構築物の送達において有用な、脂質製剤、例えば、脂質ナノ粒子製剤を提供する。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４に記載されている脂質ナノ粒子製剤が、本明細書に記載される方法および組成物による使用に企図される。
医薬組成物
本明細書に開示されるＤＮＡベクター構築物は、対象の細胞、組織または臓器へのｉｎ ｖｉｖｏ送達のための対象への投与に適した医薬組成物中に取り込むことができる。典型的には、医薬組成物は、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物および薬学的に許容される担体を含む。例えば、ＤＮＡ構築物は、治療的投与の所望の経路（例えば、非経口投与）に適した医薬組成物中に取り込むことができる。高圧静脈内または動脈内注入による受動的組織形質導入と共に、核内マイクロインジェクションまたは細胞質内注射等の細胞内注射も企図される。治療目的の医薬組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散、リポソーム、または高いＤＮＡ構築物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、要求に応じて、上に列挙されている成分のうち１種または組合せと共に、適切な緩衝剤において、要求される量のＤＮＡ構築物化合物を取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。ＤＮＡ構築物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達し、その中での核酸の治療のための発現をもたらすために製剤化することができる。組成物は、薬学的に許容される担体を含むこともできる。
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的で所定のＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子またはドナー配列）を送達することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、例えば、発現されたタンパク質またはＲＮＡが相互作用するタンパク質の機能を試験するための、例えば、導入遺伝子を有する体細胞トランスジェニック動物モデルを作製するための、研究目的の使用が意図されるＲＮＡまたはタンパク質をコードする。別の例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作製するための使用が意図されるものをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における疾患状態の処置または予防に有用な、１種または複数のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。
治療目的の医薬組成物は典型的に、製造および貯蔵の条件下で、滅菌され安定する必要がある。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散、リポソーム、または高いＤＮＡ構築物もしくはウイルス粒子濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、要求に応じて、上に列挙されている成分のうち１種または組合せと共に、適切な緩衝剤において、要求される量のＤＮＡ構築物化合物を取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。
投薬量、投与および有効性
本方法は、本明細書に記載される治療用タンパク質またはＲＮＡまたはウイルス粒子をコードするＤＮＡ構築物を含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む。熟達した開業医によって認められるであろうが、用語「有効量」は、疾患の処置のための「治療有効量」での、コードされるタンパク質またはＲＮＡの発現をもたらす、投与されるＤＮＡ構築物組成物の量を指す。
ＤＮＡ構築物を含む組成物の投薬量範囲は、効力（例えば、プロモーターの効率）に依存し、疾患、例えば、がんの処置のために、所望の効果、例えば、所望のタンパク質またはＲＮＡの発現を産生するのに十分に大きい量を含む。投薬量は、許容できない有害副作用を引き起こすほど多くなるべきではない。一般に、投薬量は、ＤＮＡ構築物の特定の特徴、発現効率に伴い、また、患者の年齢、状態および性別に伴い変動するであろう。投薬量は、当業者によって決定することができる。例えば、非ウイルスＤＮＡベクターが生理食塩水中で静脈内投与されたマウスにおいて、一実施形態では、標的細胞に投与されるベクターの量は、約１〜２００ｕｇまたは約１０〜５０ｕｇに及ぶことができる。当業者（one of skill in that）は、したがって、ヒトまたはより大型の動物への投与のために用量を調整する。ある特定の実施形態では、ベクターのサイズは、約０．５〜１００ｋｂまたは約２〜１５ｋｂに及ぶ。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患バイオマーカーの発現の統計的に有意な測定可能な変化または所与の疾患症状の低減を産生するのに十分な、発現された治療用タンパク質またはＲＮＡの量である（下の「有効性測定」を参照）。かかる有効量は、所与のＤＮＡ構築物またはウイルス粒子組成物のための臨床試験や動物試験において計測することができる。
本明細書に記載される方法および組成物において有用な薬剤は、外用に、静脈内に（ボーラスまたは継続的注入によって）、細胞内注射、組織内（intratissue）注射、経口に、吸入によって、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内（intracavity）に投与することができ、所望であれば蠕動手段によって、または当業者にとって公知の他の手段によって送達することができる。薬剤は、それを所望するのであれば、全身性に投与することができる。
がん（乳がん、黒色腫等が挙げられるがこれらに限定されない）等の所与の疾患のための所与の処置の有効性は、熟達した臨床医によって決定することができる。しかし、治療用タンパク質またはＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物による処置後に、疾患もしくは障害の徴候もしくは症状のいずれか１種もしくは全種が有益な様式で変更される場合、または疾患の他の臨床的に受け入れられる症状もしくはマーカーが、例えば、少なくとも１０％改善もしくは寛解される場合、処置は、「有効な処置」と（この用語が本明細書で使用される場合に）みなされる。有効性は、疾患の安定化または医学的介入の必要によって査定される、個体の不全が悪化しないことによって測定することもできる（すなわち、疾患の進行が停止されるまたは少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者にとって公知であるおよび／または本明細書に記載される。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例として、ヒトまたは哺乳動物が挙げられる）における疾患のいずれかの処置を含み、（１）疾患の阻害、例えば、疾患（例えば、がん）の進行の抑止もしくはこれを遅くすること；または（２）疾患の軽減、例えば、症状の退縮を引き起こすこと；および（３）疾患の発症の見込みの予防もしくは低減、またはがん（例えば、がん転移）等、疾患に伴う続発性疾患／障害の予防を含む。
疾患の処置の有効量は、当該疾患について当該用語が本明細書で定義される場合、それを必要とする哺乳動物に投与されると、有効な処置をもたらすのに十分な量ことを意味する。薬剤の有効性は、所与の疾患に特定の身体的指標を査定することにより決定することができる。例えば、がんの身体的指標として、疼痛、腫瘍サイズ、腫瘍成長速度、血液細胞計数等が挙げられるがこれらに限定されない。
標的細胞
本発明に係るＤＮＡ構築物は、分裂および非分裂細胞を含む広範囲の細胞へと核酸を送達するための手段を提供する。一実施形態では、細胞は、遺伝的に欠損している。一実施形態では、細胞は、罹患している。
ＤＮＡ構築物を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に目的の核酸を送達する、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法のためにポリペプチドを産生することができる。ＤＮＡ構築物はその上、それを必要とする対象に核酸を送達して、例えば、免疫原性もしくは治療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを発現させる方法において有用である。この様式で、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡは、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで産生することができる。対象がポリペプチドを欠損しているため、対象は、ポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能的ＲＮＡの産生が、何らかの有益な効果を付与し得るため、本方法を実施することができる。
ＤＮＡ構築物を使用して、培養細胞または対象において目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを産生することもできる（例えば、ポリペプチドを産生するためのバイオリアクターとして、または例えば、スクリーニング方法に関連して、対象における機能的ＲＮＡの効果を観察するために対象を使用する）。
ＤＮＡベクター構築物が導入される細胞（複数可）は、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト等の脳細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞を含む）、血管細胞（例えば、内皮細胞、内膜細胞）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵細胞（島細胞を含む）、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞およびその他が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの型のものとなることができる。代表的な実施形態では、細胞は、いずれかの前駆細胞となることができる。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）となることができる。さらにまた別の代替として、細胞は、がんまたは腫瘍細胞となることができる。さらに、細胞は、いずれかの起源の種に由来することができる。
疾患および障害
遺伝子移入は、疾患状態の治療法を理解および提供するための実質的な潜在的使用を有する。欠陥遺伝子が公知でかつクローニングされている、多数の遺伝性疾患が存在する。一般に、疾患状態は、２クラスに分類される：劣性様式で一般に遺伝する、通常は酵素に関する欠損状態と、調節または構造タンパク質が関与することができ、優性様式で典型的に遺伝する、不均衡状態。欠損状態疾患のため、遺伝子移入を使用して、補充療法のために罹患した組織に正常遺伝子をもたらすと共に、アンチセンス突然変異を使用して疾患のための動物モデルを作製することができる。不均衡疾患状態のため、遺伝子移入を使用して、モデル系における疾患状態を作製することができ、次いでこれを、疾患状態を相殺する試みにおいて使用することができる。よって、本発明に係るＤＮＡ構築物は、遺伝的疾患の処置および／または予防を可能にする。
本発明に係るＤＮＡベクター／構築物を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に機能的ＲＮＡを提供することもできる。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を縮小することができる。したがって、機能的ＲＮＡを投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。機能的ＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与して、遺伝子発現および／または細胞生理学を調節する、例えば、細胞もしくは組織培養系またはスクリーニング方法を最適化することもできる。ある特定の実施形態では、治療法は、疾患状態の細胞経路調節不全の補正のためにタンパク質を標的とする。
一般に、本発明のＤＮＡベクター／構築物を用いて、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする核酸を送達して、治療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達することが有益ないずれかの疾患状態を処置および／または予防することができる。説明目的の疾患状態として、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（ベータ−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（．ベータ．−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ））、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ）、真性糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン（例えば、アルファ、ベータ、ガンマ）、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩカッパーＢドミナント突然変異体等の抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィンに対するＲＮＡｉ、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子におけるスプライスジャンクションに対するＲＮＡｉ（例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照）、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス（例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照）、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（．アルファ．−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病（．アルファ．−ガラクトシダーゼ）およびポンペ病（リソソーム酸．アルファ．−グルコシダーゼ））および他の代謝性欠陥、先天性肺気腫（．アルファ．１−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ（Tays）・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症のためのＰＤＧＦ）、脳（パーキンソン病（ＧＤＮＦ）、星状細胞腫（エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ）、神経膠芽腫（エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ）を含む）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全を含む心臓等の実質臓器の疾患、または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋａ、ベータ２−アドレナリン作動性受容体、ベータ２−アドレナリン作動性受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、トランケートされた構成的に活性があるｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子等を送達することにより）、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することにより）、心臓移植（スーパーオキシドジスムターゼ）の生存を改善、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎臓欠損（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦ．アルファ．可溶性受容体等の抗炎症因子）、肝炎（アルファ−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫性疾患、ならびにその他が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はさらに、臓器移植後に使用して、移植の成功を増加させることができる、および／または臓器移植もしくは補助療法（例えば、サイトカイン産生を遮断するための免疫抑制剤または阻害性核酸を投与することによる）の否定的な副作用を低減させることができる。別の例として、骨形成タンパク質（ＢＮＰ ２、７等、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）は、例えば、がん患者における破損または外科的除去後に、同種異系移植骨と共に投与することができる。
一実施形態では、異種核酸は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をさらにコードする。レポーターポリペプチドは、当技術分野で公知であり、そのようなものとして、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。
一実施形態では、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブ状態で分泌型ポリペプチドである、または例えば、当技術分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な会合により分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。
一実施形態では、異種核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにその他等の制御エレメントに作動的に連結される。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されている通り）、スプライセオソーム媒介性トランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Puttaraju et al. (1999) Nature Biotech. 17:246；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Sharp et al. (2000) Science 287:2431を参照）および「ガイド」ＲＮＡ等の他の非翻訳ＲＮＡ（Gorman et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；米国特許第５，８６９，２４８号、Yuan et al.）、ならびにその他をコードすることができる。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するために、および／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するために）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのために）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するために）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を処置するために、例えば、Andino et al. J. Gene Med. 10:132-142 (2008)およびLi et al. Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)を参照）；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を処置するために、例えば、Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)を参照）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんのために）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス等）に対して作製されたＲＮＡｉを含む。
一実施形態では、ＤＮＡベクターは、例えば、ワクチン接種のために、免疫原性ポリペプチドを発現する。免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発すること、および／または微生物、細菌、原生生物、寄生虫、真菌および／またはウイルス感染および疾患が挙げられるがこれらに限定されない、感染および／または疾患から対象を保護することに適したいずれかのポリペプチドとなることができる。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）表面タンパク質またはインフルエンザウイルスヌクレオプロテインまたはウマインフルエンザウイルス免疫原等、インフルエンザウイルス免疫原）またはレンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物等、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）となることができる。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質および／またはラッサ熱エンベロープ糖タンパク質等、ラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物等、ワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物等、エボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原等、感染性ヒトコロナウイルス免疫原）となることもできる。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）免疫原、および／または当技術分野で現在公知のもしくは免疫原として後に同定される他のいずれかのワクチン免疫原となることができる。
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、いずれかの腫瘍またはがん細胞抗原となることができる。必要に応じて、腫瘍またはがん抗原は、がん細胞の表面に発現される。例示的ながんおよび腫瘍細胞抗原は、S. A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991))に記載されている。他の説明目的のがんおよび腫瘍抗原として、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、黒色腫腫瘍抗原（Kawakami et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515；Kawakami et al. (1994) J. Exp. Med., 180:347；Kawakami et al. (1994) Cancer Res. 54:3124）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Brichard et al. (1993) J. Exp. Med. 178:489）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン（endosialin））、ＴＡＧ ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン（globulin）、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質（Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623）；ムチン抗原（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／または次のがん：黒色腫、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸部がん、膀胱がん、腎臓がん、膵がん、脳がんおよび現在公知のもしくは後に同定される他のいずれかのがんもしくは悪性状態に関連することが現在公知のもしくは後に発見される抗原（例えば、Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のＤＮＡベクターを用いて、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を送達して、治療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達することが有益ないずれかの疾患状態を処置および／または予防することができる。説明目的の疾患状態として、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞系由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ−２６ａ［例えば、肝細胞癌のために］）、真性糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩカッパーＢドミナント突然変異体等の抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィンに対するＲＮＡｉ、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子におけるスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照］、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病［α−ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］）および他の代謝性障害、先天性肺気腫（ａｌ−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症のためのＰＤＧＦ、および／または例えば、Ｉ型糖尿病における網膜障害を処置／予防するためのバソヒビンもしくは他のＶＥＧＦ阻害剤もしくは他の血管新生阻害剤）、脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、神経膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全を含む心臓等の実質臓器の疾患、または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２−アドレナリン作動性受容体（３２−アドレナリン作動性受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ））、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、トランケートされた構成的に活性があるｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子等を送達することにより）、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することにより）、心臓移植（スーパーオキシドジスムターゼ）の生存を改善、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎臓欠損（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体等の抗炎症因子）、肝炎（α−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫性疾患、ならびにその他が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はさらに、臓器移植後に使用して、移植の成功を増加させることができる、および／または臓器移植もしくは補助療法（例えば、サイトカイン産生を遮断するための免疫抑制剤または阻害性核酸を投与することによる）の否定的な副作用を低減させることができる。別の例として、骨形成タンパク質（ＢＮＰ ２、７等、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）は、例えば、がん患者における破損または外科的除去後に、同種異系移植骨と共に投与することができる。
本発明を実施して、糖尿病（例えば、インスリン）等の代謝性障害、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、ムコ多糖症障害等のリソソーム蓄積障害（例えば、スライ症候群（β−グルクロニダーゼ）、ハーラー症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、シャイエ症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、ハーラー・シャイエ症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、ハンター症候群（イズロン酸スルファターゼ）、サンフィリポ症候群Ａ（ヘパランスルファミダーゼ（sulfamidase））、Ｂ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）、Ｃ（アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ）、Ｄ（Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ）、モルキオ症候群Ａ（ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ）、Ｂ（β−ガラクトシダーゼ）、マロトー・ラミー症候群（Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ）等）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α−グルコシダーゼ）を処置および／または予防することもできる。
本発明を実施して、本明細書に記載される通り、ムコ多糖症障害等のリソソーム蓄積障害（例えば、スライ症候群（β−グルクロニダーゼ）、ハーラー症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、シャイエ症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、ハーラー・シャイエ症候群（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、ハンター症候群（イズロン酸スルファターゼ）、サンフィリポ症候群Ａ（ヘパランスルファミダーゼ）、Ｂ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）、Ｃ（アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ）、Ｄ（Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ）、モルキオ症候群Ａ（ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ）、Ｂ（β−ガラクトシダーゼ）、マロトー・ラミー症候群（Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ）等）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α−グルコシダーゼ）を処置および／または予防することもできる。
さらに、本発明を使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を産生することもできる。例えば、本発明のＤＮＡベクターを使用して、成体線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪細胞、心細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞およびその他等、非多能性細胞へと幹細胞関連の核酸（複数可）を送達することができる。幹細胞に関連する因子をコードする核酸は、当技術分野で公知である。幹細胞および多能性に関連するかかる因子の非限定的な例として、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよび／またはＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が挙げられる。
本明細書において他に規定がなければ、本願に関連して使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によってそうでないことが要求されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
本発明が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬等に限定されず、そのようなものは変動し得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語法は、単に特定の実施形態を記載することを目的とし、特許請求の範囲のみによって定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例（operating example）中またはそれ以外のことが示されている場合を除き、本明細書で使用される成分の含量または反応条件を表すあらゆる数は、あらゆる事例において、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。
ある点において、本発明は、本発明に必須なものとして、本明細書に記載されている組成物、方法、およびこれらそれぞれの構成成分（複数可）に関するが、さらに、必須なまたは必須でない、指定されていないエレメントの包含の余地がある（「を含む（comprising）」）。一部の実施形態では、組成物、方法、またはこれらそれぞれの構成成分の記載に含まれるべき他のエレメントは、本発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えないものに限定される（「から本質的になる（consisting essentially of）」）。このことは、記載されている方法内のステップならびに組成物およびその中の構成成分に等しく適用される。本発明の他の実施形態では、本明細書に記載される組成物、方法、およびこれらそれぞれの構成成分は、構成成分、組成物または方法に必須のエレメントとは思われないいかなるエレメントも除外することを意図する（「からなる（consisting of）」）。
同定されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得る、かかる刊行物に記載されている方法論を記載および開示する目的で、明確に参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、単に、本願の出願日に先立つそれらの開示のために提示される。この点について、本発明者らが、先行発明に基づいてまたは他のいずれかの理由から、かかる開示に先行する権利がないことの承認として解釈するべきではない。これらの文書の日付に関するあらゆる記述またはその内容に関する表現は、本出願人らに利用できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
本発明は、さらなる限定として解釈するべきではない、次の実施例によってさらに説明される。
本明細書に記載される本発明の様々な実施形態は、次の２セットの番号付きの段落においてさらに記載することができる。
１．持続した発現のために核酸構築物を標的細胞に導入するための方法であって、
ａ．ｉ．Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列、
ｉｉ．Ｄ’領域
を含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲであって、
ｉｉｉ．前記ＤおよびＤ’領域が、相補的パリンドローム配列であり、ＤおよびＤ’が、前記ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲと、
ｂ．発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列を含む前記核酸構築物の相補鎖と
を含む共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を前記標的細胞に投与するステップを含み、
ｃ．前記ＤＮＡ構築物が、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し、
ｄ．前記ＤＮＡ構築物が、前記標的細胞において前記所定のＤＮＡ配列を発現することができる、方法。
２．前記Ｄ領域が、ニッキング部位を含有する、段落１に記載の方法。
３．前記Ｄ領域が、少なくとも５ヌクレオチドの長さである、段落１に記載の方法。
４．前記Ｄ領域が、約２０ｎｔの長さである、段落１に記載の方法。
５．前記Ｄ領域が、パルボウイルスＩＴＲのパルボウイルスＤ領域に対応する、段落１に記載の方法。
６．前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、段落１に記載の方法。
７．前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、段落１に記載の方法。
８．前記所定のＤＮＡ配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、段落１に記載の方法。
９．前記ＩＴＲが、プロモーターとして作用している、段落８に記載の方法。
１０．前記プロモーターが、前記ＩＴＲから離れている、段落８に記載の方法。
１１．前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定のＤＮＡ配列の発現を駆動する、段落１〜１０に記載の方法。
１２．前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、段落４に記載の方法。
１３．前記保持された核酸が、前記ニッキング部位、ならびに／または前記ＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、段落１２に記載の方法。
１４．前記所定のＤＮＡ配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、段落１に記載の方法。
１５．前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、段落１４に記載の方法。
１６．前記ＤおよびＤ’領域と前記所定のＤＮＡ配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落１４に記載の方法。
１８．前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、段落１６または１７に記載の方法。
１９．前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、段落１６または１７に記載の方法。
２０．前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、段落１６または１７に記載の方法。
２１．前記少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲ、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される、段落１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記ＤＮＡ構築物が、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む、段落１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．前記Ｄ領域が、前記ＩＴＲとは異なる血清型に由来する、段落１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、段落２２に記載の方法。
２５．１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、段落２２に記載の方法。
２６．前記ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、段落１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、段落１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．前記ＤＮＡ構築物が、宿主細胞においてプロテロメラーゼ酵素活性によって形成された前記共有結合性閉鎖末端に部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む、段落１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．前記宿主細胞が、誘導性プロモーターの制御下において前記プロテロメラーゼを発現する、段落２８に記載の方法。
３０．前記ＤＮＡ構築物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成された前記共有結合性閉鎖末端に部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む、段落１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
３１．前記ＤＮＡ構築物が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記ＤＮＡ構築物が、前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、段落１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、段落１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落３２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
３５．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、段落３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、段落３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
３７．核酸が、治療用核酸である、段落１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、段落１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにある、段落１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
４０．前記構築物が、ｅｘ ｖｉｖｏで前記標的細胞に投与される、段落１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
４１．前記標的細胞が、遺伝的に欠損した細胞および／または罹患した細胞である、段落１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．前記標的細胞が、罹患した細胞である、段落１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
４３．前記標的細胞が、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、段落１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸配列の送達のためのＤＮＡベクターであって、
ａ．ｉ．Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列、
ｉｉ．Ｄ’領域
をそれぞれ含む、２個のＤＤ−ＩＴＲであって、
ｉｉｉ．前記ＤおよびＤ’領域が、約５〜２０ｎｔの長さの相補的パリンドローム配列であり、前記ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、２個のＤＤ−ＩＴＲと、
ｂ．前記所定の核酸配列（例えば、発現のための異種遺伝子）と
を含み、前記２個のＤＤ−ＩＴＲが、共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡの場面において、前記核酸に隣接する、ＤＮＡベクター。
４５．前記所定の核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、段落４４に記載のＤＮＡベクター。
４６．前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定の核酸配列の発現を駆動する、段落４４に記載のＤＮＡベクター。
４７．前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、段落４６に記載のＤＮＡベクター。
４８．前記保持された核酸が、ニッキング部位、ならびに／または前記ＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、段落４７に記載のＤＮＡベクター。
４９．前記所定の核酸配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、段落４４に記載のＤＮＡベクター。
５０．前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、段落４９に記載のＤＮＡベクター。
５１．前記ＤおよびＤ’領域と前記所定の核酸配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落４５に記載のＤＮＡベクター。
５２．前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落４６に記載のＤＮＡベクター。
５３．前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、段落５１または５２に記載のＤＮＡベクター。
５４．前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、段落５３に記載のＤＮＡベクター。
５５．前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、段落５３に記載のＤＮＡベクター。
５６．前記ＤＤ−ＩＴＲが、パルボウイルスＩＴＲおよび合成ＩＴＲからなる群から選択されるＩＴＲから生成される、段落４４〜５５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
５７．前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、段落５６に記載のＤＮＡベクター。
５８．前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、段落５７に記載のＤＮＡベクター。
５９．ＤＮＡ構築物が、２個を超えるＤＤ−ＩＴＲを含む、段落４４〜５８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６０．各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、段落５９に記載のＤＮＡベクター。
６１．１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、段落６０に記載のＤＮＡベクター。
６２．前記ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、段落４４〜６１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６３．前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、段落４４〜６１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６４．前記ＤＮＡベクターが、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含み、共有結合性閉鎖末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、段落４４〜６３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６５．前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落４４〜６４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６６．前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、段落４４〜６５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６７．前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、段落４４〜６６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６８．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落６６〜６７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
６９．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、段落６６〜６８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
７０．前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、段落６６〜６８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
７１．所定の核酸が、治療用核酸である、段落４４〜７０のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
７２．少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲである、段落４４〜７１に記載のＤＮＡベクター。
７３．前記２個のＤＤ−ＩＴＲに隣接する部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む、段落４４〜７２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
７４．前記２個のＤＤ−ＩＴＲに隣接する前記部分的プロテロメラーゼ結合部位が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプロテロメラーゼ酵素活性またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、段落７３に記載のＤＮＡベクター。
７５．共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物が、前記標的細胞内にコンカテマー構造として存続する、段落４４〜７４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
７６．２〜５週間、１〜１２ヶ月間、１〜１０年間またはより長い期間にわたり、前記核酸の持続した発現を促進する、段落７５に記載のＤＮＡベクター。
７７．持続した発現のために核酸を標的細胞に導入するための方法であって、
ａ．図５に示すＩＴＲからなる群から選択される少なくとも１個のＩＴＲ配列と、
ｂ．核酸構築物の相補鎖であって、前記核酸構築物が、所定のＤＮＡ配列を含み、前記相補鎖が、発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる、相補鎖と
を含む共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を前記標的細胞に投与するステップを含み、
ｃ．前記ＤＮＡ構築物が、ヘアピン共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成する、方法。
７８．前記ＩＴＲ配列が、いずれかの側において相補配列ＤおよびＤ’に隣接し、これにより、ＤＤ−ＩＴＲを作製する、段落７７に記載の方法。
７９．前記所定のＤＮＡ配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、段落７７に記載の方法。
８０．前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定のＤＮＡ配列の発現を駆動する、段落７７に記載の方法。
８１．前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、段落７７に記載の方法。
８２．前記保持された核酸が、ニッキング部位、ならびに／またはＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、段落８１に記載の方法。
８３．前記所定のＤＮＡ配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、段落７７に記載の方法。
８４．前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、段落８３に記載の方法。
８５．前記ＤおよびＤ’領域と前記所定のＤＮＡ配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落７７〜８４に記載の方法。
８６．前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落７７〜８５に記載の方法。
８７．前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、段落８５または８６に記載の方法。
８８．前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、段落８７に記載の方法。
８９．前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、段落８７に記載の方法。
９０．少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される、段落７７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
９１．前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、段落９０に記載の方法。
９２．前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、段落９１に記載の方法。
９３．前記ＤＮＡ構築物が、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む、段落６５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
９４．各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、段落９３に記載の方法。
９５．１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、段落９３に記載の方法。
９６．ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、段落７７〜９５のいずれか一項に記載の方法。
９７．前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、段落７７〜９５のいずれか一項に記載の方法。
９８．前記ＤＮＡ構築物が、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含み、前記共有結合性閉鎖末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、段落７７〜９７のいずれか一項に記載の方法。
９９．前記ＤＮＡ構築物が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落７７〜９８のいずれか一項に記載の方法。
１００．前記ＤＮＡ構築物が、前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、段落７７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
１０１．前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも１〜５週間、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、段落７７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
１０２．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落１００〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
１０３．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、段落１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
１０４．前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、段落１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
１０５．核酸が、治療用核酸である、段落７７〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
１０６．前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、段落７７〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
１０７．前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにある、段落７７〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
１０８．前記構築物が、ｅｘ ｖｉｖｏで前記標的細胞に投与される、段落７７〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
１０９．前記標的細胞が、遺伝的に欠損した細胞である、段落７７〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
１１０．前記標的細胞が、罹患した細胞である、段落７７〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
１１１．前記標的細胞が、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、段落７７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
１１２．段落１〜４３または７７〜１１１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、細胞またはその集団。
１１３．持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸の送達のための共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡベクターであって、
ａ．ｉ．Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列、
ｉｉ．Ｄ’領域
を含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲであって、
ｉｉｉ．前記ＤおよびＤ’領域が、相補的パリンドローム配列であり、ＤおよびＤ’が、前記ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲと、
ｂ．発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列を含む核酸構築物の相補鎖と
を含み、
ｃ．前記ＤＮＡベクター構築物が、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し、
ｄ．前記ＤＮＡベクター構築物が、前記標的細胞において前記所定のＤＮＡ配列を発現することができる、ＤＮＡベクター。
１１４．前記Ｄ領域が、ニッキング部位を含有する、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１１５．前記Ｄ領域が、少なくとも５ヌクレオチドの長さである、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１１６．前記Ｄ領域が、約２０ｎｔの長さである、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１１７．前記Ｄ領域が、パルボウイルスＩＴＲのパルボウイルスＤ領域に対応する、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１１８．前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１１９．前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１２０．前記所定のＤＮＡ配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１２１．前記ＩＴＲが、プロモーターとして作用している、段落１２０に記載のＤＮＡベクター。
１２２．前記プロモーターが、前記ＩＴＲから離れている、段落１２０に記載のＤＮＡベクター。
１２３．前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定のＤＮＡ配列の発現を駆動する、段落１１３〜１２２に記載のＤＮＡベクター。
１２４．前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１２５．前記保持された核酸が、前記ニッキング部位、ならびに／または前記ＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、段落１２４に記載のＤＮＡベクター。
１２６．前記所定のＤＮＡ配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、段落１１３に記載のＤＮＡベクター。
１２７．前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、段落１２６に記載のＤＮＡベクター。
１２８．前記ＤおよびＤ’領域と前記所定のＤＮＡ配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落１〜１２７のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
１２９．前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、段落１２６に記載のＤＮＡベクター。
１３０．前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、段落１２８または１２９に記載のＤＮＡベクター。
１３１．前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、段落１２８または１２９に記載のＤＮＡベクター。
１３２．前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、段落１２８または１２９に記載のＤＮＡベクター。
１３３．前記少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲ、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される、段落１１３〜１３２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１３４．前記ＤＮＡベクター構築物が、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む、段落１１３〜１３３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１３５．前記Ｄ領域が、前記ＩＴＲとは異なる血清型に由来する、段落１１３〜１３４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１３６．各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、段落１３４に記載のＤＮＡベクター。
１３７．１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、段落１３４に記載のＤＮＡベクター。
１３８．前記ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、段落１１３〜１３７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１３９．前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、段落１１３〜１３８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４０．前記ＤＮＡベクター構築物が、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含み、前記共有結合性閉鎖末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、段落１１３〜１３９のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４１．前記ＤＮＡベクター構築物が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落１１３〜１４０のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４２．前記ＤＮＡベクター構築物が、前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、段落１１３〜１４１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４３．前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、段落１１３〜１４２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４４．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、段落１４２〜１４３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４５．前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、段落１４２〜１４３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４６．前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、段落１４２〜１４３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４７．核酸が、治療用核酸である、段落１１３〜１４６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
１４８．標的細胞への核酸の送達のための医薬組成物であって、標的細胞への送達のための、段落４４〜７６および１１３〜１４７のいずれかに記載のＤＮＡベクターと、薬学的に許容される担体とを含み、前記標的細胞が、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、医薬組成物。
１４９．疾患または障害の処置のためにｉｎ ｖｉｖｏで前記標的細胞に投与される、段落１４８に記載の医薬組成物。
１５０．前記宿主細胞が、誘導性プロモーターの制御下において少なくとも第１のＴｅｌリコンビナーゼをコードするように設計されており、前記細胞が、細菌配列を含まないベクターを産生するように適合された発現ベクターを含み、前記ベクターが、発現カセットを含み、目的の核酸が、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲに隣接し、いずれかの側において、前記Ｔｅｌリコンビナーゼの標的配列に隣接する、段落２８に記載の方法。
１５１．前記Ｔｅｌ標的配列の非結合領域内に組み込まれるものは、１種または複数の追加的なリコンビナーゼの標的結合配列である、段落１５０に記載の方法。
１５２．前記１種または複数の追加的なリコンビナーゼが、ｐＫ０２ ｔｅｌＲＬ部位、ｔｅｌＲＬ部位、ｐａｌ部位、ｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、ｐｈｉＣ３１、ａｔｔＰ部位およびＸａｔｔＰ部位からなる群から選択される、段落１５１に記載の方法。
１５３．少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを含有する直鎖状共有結合性閉鎖ベクターを産生する方法であって、第１のリコンビナーゼの発現を可能にするのに適した条件下で、段落１５０に記載の宿主細胞をインキュベートして、直鎖状共有結合性閉鎖ベクターをもたらすステップを含む方法。
１５４．少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを含有する環状共有結合性閉鎖ベクターを産生する方法であって、第２のリコンビナーゼの発現を可能にするのに適した条件下で、段落１５１〜１５２に記載の宿主細胞をインキュベートして、環状共有結合性閉鎖ベクターをもたらすステップを含む方法。
１５５．前記Ｔｅｌリコンビナーゼ標的部位が、ファージＰＹ５４ Ｔｅｌ １４２塩基対標的部位である、段落１５０に記載の方法。
１５６．前記目的の核酸が、両側においてＤＤ−ＩＴＲに隣接する、段落１５０〜１５５に記載の方法。
第２のセットの番号付きの段落：
１．導入遺伝子を含有する環状核酸ベクターを製造する方法であって、
ａ．宿主系を鋳型と接触させるステップであって、鋳型が、少なくとも１個の隣接切断部位、ならびに：
ｉ．少なくとも１個のファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．少なくとも１個の末端反復（ＴＲ）；および
ｉｉｉ．導入遺伝子に作動的に連結したプロモーター配列
を含み、少なくとも１個のＴＲが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）二重Ｄ ＩＴＲ（ＤＤ−ＩＴＲ）である、ステップと、
ｂ．複製が起こるのに十分な時間、宿主系をインキュベートして、環状核酸産生をもたらすステップと、
ｃ．産生された環状核酸を回収するステップと
を含み、環状核酸が自己アニールする、方法。
２．鋳型が、第２の隣接切断部位をさらに含み、２個の部位の内に、（ｉ）〜（ｉｉｉ）が存在する、段落１に記載の方法。
３．鋳型が、少なくとも１個のＯＲＩの直ちに下流にある少なくとも１個の追加的な切断部位をさらに含む、段落１および２に記載の方法。
４．回収された環状核酸の少なくとも１個の切断部位をカットするステップをさらに含む、段落１〜３のいずれかに記載の方法。
５．回収後に、環状核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製のステップをさらに含む、段落１のいずれかに記載の方法。
６．鋳型が、少なくとも１個のアダプタ配列をさらに含む、段落１に記載の方法。
７．鋳型が、少なくとも２個のアダプタ配列をさらに含む、段落１に記載の方法。
８．アダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する、段落６または７に記載の方法。
９．アダプター配列が、切断部位をさらに含む、段落６または７に記載の方法。
１０．回収された環状核酸が、導入遺伝子の送達に使用される、段落１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．回収された環状核酸が、組換えウイルスベクター産生に使用される、段落１〜９のいずれかに記載の方法。
１２．環状核酸が、自己アニールして二本鎖となる、段落１に記載の方法。
１３．ベクターが、一本鎖である、段落１に記載の方法。
１４．第２のＴＲが存在し、導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーター配列が、両側において、ＴＲに隣接する、段落１に記載の方法。
１５．ＯＲＩが、左ＴＲの上流である、段落１に記載の方法。
１６．ＯＲＩが、ＴＲに隣接し、導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーター配列の上流である、段落１に記載の方法。
１７．宿主系が、細菌パッケージング細胞である、段落１に記載の方法。
１８．宿主系が、無細胞系である、段落１に記載の方法。
１９．宿主系が、無細胞系であり、ヘルパーファージ粒子を含有する、段落１に記載の方法。
２０．宿主系が、宿主細胞である、段落１に記載の方法。
２１．宿主細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞または昆虫細胞である、段落２０に記載の方法。
２２．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）またはポックスウイルス（ＰＶ）である、段落１１に記載の方法。
２３．ウイルスベクターが、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスである、段落１１および２２に記載の方法。
２４．ウイルスが、ＡＡＶであり、突然変異体ＩＴＲを有し、突然変異体ＩＴＲが、二重Ｄ突然変異体ＩＴＲである、段落２２に記載の方法。
２５．少なくとも１個のＴＲが、突然変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲまたは非機能的ＩＴＲである、段落１に記載の方法。
２６．ベクターが、隣接ＤＤ−ＩＴＲを有し、隣接ＤＤ−ＩＴＲの間には、導入遺伝子のセンス鎖に作動的に連結したプロモーター、複製欠陥ＩＴＲ、および導入遺伝子のアンチセンス相補体がある、段落１に記載の方法。
２７．ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲである、段落２５〜２６に記載の方法。
２８．ＯＲＩが、ＩＴＲの上流、かつ上流ＩＴＲの直ちに下流に設置されている、段落１に記載の方法。
２９．少なくとも１個のファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩまたはＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、段落１に記載の方法。
３０．鋳型（temple）が、複製を開始しないトランケートされたＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、段落１に記載の方法。
３１．トランケートされたＯＲＩが、ＯＲＩΔ２９である、段落３０に記載の方法。
３２．少なくとも２個の切断部位が、制限部位である、段落１に記載の方法。
３３．少なくとも２個の制限部位が、同一であるまたは異なる、段落３２に記載の方法。
３４．制限部位が、導入遺伝子配列内に見出されない、段落３２に記載の方法。
３５．切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、段落１に記載の方法。
３６．プロモーターが、構成的プロモーター、抑圧性プロモーター、遍在性プロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーターおよび合成プロモーターからなる群から選択される、段落１に記載の方法。
３７．導入遺伝子が、治療用遺伝子である、段落１に記載の方法。
３８．導入遺伝子を含有する環状核酸ベクターを製造する方法であって、
ａ．宿主系をプラスミド鋳型で形質転換するステップであって、プラスミド鋳型が、
ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．トランケートされたファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
ｉｉｉ．少なくとも１個の末端反復（ＴＲ）；および
ｉｖ．導入遺伝子に作動的に連結したプロモーター配列
を含み、プラスミド鋳型が、５’から３’方向で、センスおよびアンチセンス鎖のアニーリングを可能にするヘアピン配列によって離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含み、
少なくとも１個のＴＲが、ＡＡＶ二重Ｄ ＩＴＲ（ＤＤ−ＩＴＲ）である、ステップと、
ｂ．複製が起こるのに十分な時間、宿主系をインキュベートして、環状核酸産生をもたらすステップと、
ｃ．産生された環状核酸を回収するステップと
を含み、環状核酸が自己アニールする、方法。
３９．ＯＲＩに隣接する、リンカーおよび自己相補体リンカーをさらに含む、段落３８に記載の方法。
４０．導入遺伝子が、センスおよびアンチセンス鎖が二本鎖として結合することを可能にするリンカー配列によって離された、センス配列およびそのアンチセンス相補体を含有する、段落３８に記載の方法。
４１．トランケートされたＯＲＩが、ＯＲＩΔ２９である、段落３８に記載の方法。
４２．段落１〜４１のいずれかに記載の方法によって製造された、環状核酸ベクター。
４３．少なくとも１個の隣接切断部位、ならびに
ｉ．少なくとも１個のファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．少なくとも１個の末端反復（ＴＲ）；および
ｉｉｉ．導入遺伝子に作動的に連結したプロモーター配列
を含む環状核酸ベクターであって、少なくとも１個のＴＲが、ＡＡＶ二重Ｄ ＩＴＲ（ＤＤ−ＩＴＲ）である、環状核酸ベクター。
４４．鋳型が、第２の隣接切断部位をさらに含み、２個の部位の内に、（ｉ）〜（ｉｉｉ）が存在する、段落４３に記載のベクター。
４５．少なくとも１個のＯＲＩの直ちに下流にある少なくとも１個の追加的な切断部位をさらに含む、段落４３および４４に記載のベクター。
４６．少なくとも１個のアダプタ配列をさらに含む、段落４３に記載のベクター。
４７．少なくとも２個のアダプタ配列をさらに含む、段落４３に記載のベクター。
４８．アダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する、段落４６および４７に記載のベクター。
４９．アダプター配列が、切断部位をさらに含む、段落４６および４７に記載のベクター。
５０．導入遺伝子の送達に使用される、段落４３〜４９のいずれかに記載のベクター。
５１．組換えウイルスベクター産生に使用される、段落４３〜４９のいずれかに記載のベクター。
５２．自己アニールして二本鎖となる、段落４３に記載のベクター。
５３．一本鎖である、段落４３に記載のベクター。
５４．第２のＴＲが存在し、導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーター配列が、両側において、ＴＲに隣接する、段落４３に記載のベクター。
５５．ＯＲＩが、左ＴＲの上流である、段落４３に記載のベクター。
５６．ＯＲＩが、ＴＲに隣接し、導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーター配列の上流である、段落４３に記載のベクター。
５７．少なくとも１個のＴＲが、突然変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲまたは非機能的ＩＴＲである、段落４３に記載のベクター。
５８．ベクターが、隣接ＤＤ−ＩＴＲを有し、隣接ＤＤ−ＩＴＲの間には、導入遺伝子のセンス鎖に作動的に連結したプロモーター、複製欠陥ＩＴＲ、および導入遺伝子のアンチセンス相補体がある、段落４３に記載のベクター。
５９．ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲである、段落５７および５８に記載のベクター。
６０．ＯＲＩが、ＩＴＲの上流、かつ上流ＩＴＲの直ちに下流に設置されている、段落４３に記載のベクター。
６１．ファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩまたはＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、段落４３に記載のベクター。
６２．鋳型が、複製を開始しないトランケートされたＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、段落４３に記載のベクター。
６３．トランケートされたＯＲＩが、ＯＲＩΔ２９である、段落４３に記載のベクター。
６４．少なくとも２個の切断部位が、制限部位である、段落４３に記載のベクター。
６５．少なくとも２個の制限部位が、同一であるまたは異なる、段落６４に記載のベクター。
６６．制限部位が、導入遺伝子配列内に見出されない、段落６４に記載のベクター。
６７．切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、段落４３に記載のベクター。
６８．プロモーターが、構成的プロモーター、抑圧性プロモーター、遍在性プロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーターおよび合成プロモーターからなる群から選択される、段落４３に記載のベクター。
６９．導入遺伝子が、治療用遺伝子である、段落４３に記載のベクター。
７０．ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．トランケートされたファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
ｉｉｉ．少なくとも１個の末端反復（ＴＲ）；および
ｉｖ．導入遺伝子に作動的に連結したプロモーター配列
を含む環状核酸ベクターであって、ベクターが、５’から３’方向で、センスおよびアンチセンス鎖のアニーリングを可能にするヘアピン配列によって離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含み、
少なくとも１個のＴＲが、ＡＡＶ二重Ｄ ＩＴＲ（ＤＤ−ＩＴＲ）である、環状核酸ベクター。
７１．ＯＲＩに隣接する、リンカーおよび自己相補体リンカーをさらに含む、段落７０に記載のベクター。
７２．導入遺伝子が、センスおよびアンチセンス鎖が二本鎖として結合することを可能にするリンカー配列によって離された、センス配列およびそのアンチセンス相補体を含有する、段落７０に記載のベクター。
７３．トランケートされたＯＲＩが、ＯＲＩΔ２９である、段落７０に記載のベクター。
７４．ヌクレアーゼが、プロテロメラーゼである、段落３５に記載の方法。
７５．ヌクレアーゼが、プロテロメラーゼである、段落６７に記載のベクター。
（実施例１）
共有結合性閉鎖直鎖状ベクターの産生
Ａ．二重Ｄ ＩＴＲ配列の合成
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、Ｄ’配列が他の末端に付加された、逆位末端反復配列を構築する。理論的根拠は、ＩＴＲのＴ字形構造に基づく。ＰＣＲ反応の第１のラウンドにおいて、ＡＡＶウイルスＩＲＴは、伸長を自己プライムして、ステム部にＤおよびＤ’を含有する長いＴ字形ヘアピン構造を産生するであろう。変性後に、このＤＮＡは、単一プライムのＰＣＲのための鋳型として機能することができる。
ＩＴＲ領域における高いＧＣ含量および強いパリンドローム構造のため、７−デアゾ（deazo）−ｄＧＴＰ、２．５％ホルムアミドおよび高濃度のプライマー等、いくつかの戦略を利用して、ＰＣＲ問題に取り組み、十分な所望のＰＣＲ産物を生じることができる。クローニングの利便性のため、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩによってカットし、ｐＧＥＭ ３Ｚのポリリンカーへと容易にクローニングすることができるように、ＥｃｏＲＩ認識配列をプライマーの５’に取り付ける。細菌宿主におけるＩＴＲの不安定性のため、組換えプラスミドを、ＩＴＲがある程度安定するＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ系統（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換する。上述の戦略を使用することにより、多数の陽性クローンを得ることができる。一部のクローンを、制限消化および配列決定によって特徴付ける。ｐＧＥＭ３ＺのＥｃｏＲＩ部位にＤ’ＡＢＢ’ＣＣ’Ａ’Ｄの挿入物を有することを示したクローンの１つを使用することになる。ｐＤＤ−２と命名された、この生成されたプラスミド（図６）は、ＤＤ−ＩＴＲの例示的な供給源である。
材料と方法
Ｂ．ＰＣＲおよびＩＴＲプラスミドの構築。ＡＡＶおよびＡｄ５感染細胞由来の低分子量ＤＮＡを、ＡＡＶのＤ−配列に由来する単一のプライマーを用いたＰＣＲ反応のための鋳型として使用する。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５％ホルムアミド、１００ｕＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、７５ｕＭ ７−デアゾ−ｄＧＴＰ、２５ｕＭ ｄＧＴＰ、１．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、１ｎｇ ＡＡＶ ＤＮＡおよび１００ｐモルプライマーＴＲ−１（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧ３−３’）を含有する５０ｕｌ反応溶液において、３５サイクルの９４℃１分間、４５℃３０秒間および７２℃１分間で、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって精製し、ＥｃｏＲＩでカットし、ＥｃｏＲＩカットされ脱リン酸化されたｐＧＥＭ ３Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）とライゲーションする。ライゲーションされたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓｕｒｅ系統（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換する。二重Ｄ末端反復の存在に関して陽性クローンをスクリーニングし、ｄＧＴＰに代えて置換された７−デアゾ−ｄＧＴＰを用いたジデオキシ配列決定によって確認する（Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467）。その後、ｎｅｏ遺伝子を、ｐＤＤのＳａｌＩ部位へとクローニングし、プラスミドｐＤＤ−ｎｅｏをもたらす。ｐＤＤ−ｎｅｏをＤＤ−ＩＴＲの供給源として使用する。
Ｃ．二本鎖環状ＤＮＡ鋳型からの閉鎖直鎖状ＤＮＡの産生
発現可能形態のルシフェラーゼレポーター遺伝子、ＤＤ−ＩＴＲ、およびプロテロメラーゼＴｅｌＮ結合配列を含有する二本鎖環状ＤＮＡを、ＤＮＡ鋳型として使用する。プロテロメラーゼＴｅｌＮ結合部位を含むパリンドローム配列の半分のセクションに相補的な単一のパリンドロームオリゴヌクレオチドを使用して、両方の鎖を特異的にプライムする。適したプライマーの例として、次のものが挙げられる：
ＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＹＷＴＡＡＣＡＣＡＣ；（配列番号１６）
ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＲＣＷＡＴＴＧＴＧＴＧ；（配列番号１７）
ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧ；（配列番号１８）
ＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣ；（配列番号１９）
ＣＡＣＡＣＡＡＴＷＧＹＣＣＡＴ；（配列番号２０）
ＡＴＧＧＲＣＷＡＴＴＧＴＧＴＧ；（配列番号２１）
（式中、ＹはＴまたはＣであり、ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである）。例えば、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するアニーリング／変性緩衝剤において、二本鎖環状鋳型の変性および単一のプライマーのアニーリングを実行する。変性は、９５℃に加熱し、この温度で１〜１０分間維持することにより実行され、続いて、特異的プライマーが鋳型に最大限に結合するように最適化された、慎重に制御された冷却プロファイルが行われる。次に、温度を、適したＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に最適な温度に低減させる。適した酵素は、３０℃で最適に働く、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージｐｈｉ２９から単離されたｐｈｉ２９である。
次に、酵素ｐｈｉ２９およびＰＰｉ（酵母無機ピロホスファターゼ）を含有する適した体積の反応緩衝剤を、アニールされたＤＮＡ／プライマー反応物に添加する。反応混合物を、３０℃前後で、５〜２０時間の間またはそれよりも長くインキュベートする。適した反応緩衝剤は典型的に、３５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰを含有する。
次に、ＲＣＡによって増幅されたコンカテマーＤＮＡを、反応が完了するまで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ等の適した緩衝剤においてプロテロメラーゼＴｅｌＮと共に３０℃でインキュベートする。結果として生じる閉鎖直鎖状ＤＮＡ産物は、例えば、精製されるべき量に応じて、ゲル電気泳動または適したクロマトグラフィー方法によって精製することができる。
Ｄ．閉鎖直鎖状ＤＮＡ鋳型からの閉鎖直鎖状ＤＮＡの産生
発現可能形態のルシフェラーゼレポーター遺伝子、ＤＤ−ＩＴＲ、およびプロテロメラーゼＴｅｌＮの結合配列を含むテロメア末端を含有する閉鎖直鎖状ＤＮＡを、ＤＮＡ鋳型として使用する。ＤＤ−ＩＴＲおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモーターの間にスペーサーを有するが他の点では同一の構築物を生成する。スペーサーがない構築物、ならびに２、５、１０、２０および２５ヌクレオチドのスペーサーを有する構築物を生成する。鋳型のテロメア末端を含むパリンドローム配列の半分のセクションに相補的な単一のパリンドロームオリゴヌクレオチドを、特異的プライマーとして使用する。プライマーは、ＤＮＡ鋳型における２個の同一部位に結合する。適したプライマーの例として、上述の例に示すプライマーが挙げられる。
例えば、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するアニーリング／変性緩衝剤において、閉鎖直鎖状ＤＮＡ鋳型の変性および単一のプライマーのアニーリングを実行する。変性は、１分間９５℃に加熱し、この温度で１〜１０分間維持することにより実行され、続いて、特異的プライマーが鋳型に最大限に結合するように最適化された、慎重に制御された冷却プロファイルが行われる。次に、温度を、適したＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に最適な温度に低減させる。かかる適した酵素の１つは、３０℃で最適に働く、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージｐｈｉ２９から単離されたｐｈｉ２９である。
次に、酵素ｐｈｉ２９およびＰＰｉ（酵母無機ピロホスファターゼ）を含有する適した体積の反応緩衝剤を、アニールされたＤＮＡ／プライマー反応物に添加する。反応混合物を３０℃前後で５〜２０時間の間またはそれよりも長くインキュベートする。適した反応緩衝剤は典型的に、３５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰを含有する。
次に、ＲＣＡによって増幅されたコンカテマー（Concatameric）ＤＮＡを、反応が完了するまで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ等の適した緩衝剤においてプロテロメラーゼＴｅｌＮと共に３０℃でインキュベートする。結果として生じる閉鎖直鎖状ＤＮＡ産物は、例えば、精製されるべき量に応じて、ゲル電気泳動または適したクロマトグラフィー方法によって精製することができる。
これらの方法は、産物が鋳型と同一であるサイクリック（cyclic）反応をもたらす。この反応は、方法ステップの追加的なサイクルを実行することにより、ごく少量の鋳型から容易にスケールアップされる。
（実施例２）
誘導性リコンビナーゼを含有する細胞系による共有結合性閉鎖直鎖状ベクターの構築
系統およびプラスミド
全ての組換え細胞構築物の生成において、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統を使用し、プラスミド構築および増幅のための宿主として、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９を特に用いる。
組換え細胞（Ｒ−細胞）の構築
次の通り、染色体操作試験およびｉｎ ｖｉｖｏリコンビナーゼ発現のために、Ｗ３１１０（ｒｅｃＡ＋）Ｅ．ｃｏｌｉを使用する。次のプライマー：Ｔｅｌ−Ｆ ５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２２）およびＴｅｌ−Ｒ ５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴ−３’（配列番号２３）（アニーリングＴｍ ６４℃）を使用して、バクテリオファージＰＹ５４ライセートからプロテロメラーゼコード遺伝子ｔｅｌを増幅する。プライマー：ＴｅｌＮ−Ｆ ５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＧＧＧ−３’（配列番号２４）およびＴｅｌＮ−Ｒ ５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＴＡＣＧＴＴＴＣＣＣＡＴＧＣＧ−３’（配列番号２５）（アニーリングＴｍ ６２℃）を使用して、バクテリオファージＮ１５ライセートからプロテロメラーゼコード遺伝子ｔｅｌＮを増幅する。改変されたｐＤＮＡベクターのｉｎ ｖｉｖｏ産生のための陽性対照として、プライマー：Ｃｒｅ−Ｆ ５’−ＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＣＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２６）およびＣｒｅ−Ｒ ５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２７）（アニーリングＴｍ ６６℃）を使用して、バクテリオファージＰ１ｒｅｖ６ライセートからリコンビナーゼコード遺伝子ｃｒｅを増幅する。イタリック体の領域は、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩのための制限部位を表示する。初期変性のための３０秒間９８℃、３０サイクルの５秒間９８℃、１０秒間アニーリングＴｍ、４５秒間７２℃、および最終伸長のための２分間７２℃で、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して、ＰＣＲ増幅を行って、ｃｒｅ（１．３ｋｂ）、ｔｅｌ（２．１ｋｂ）およびｔｅｌＮ（２．３ｋｂ）断片を生成する。構築物は、コロニーＰＣＲおよび解析的消化によって検査および確認する。０．８％アガロースゲルからＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット）、収載されている酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化する。リコンビナーゼ遺伝子は、誘導性原核生物発現ベクターｐＰＬ４５１（受託＃ＡＢ２４８９１９）のＭＣＳへとクローニングして、ｐＮＮ１、ｐＮＮ２およびｐＮＮ３ベクターを産生する。ｐＰＬ４５１（４．２ｋｂ）は、λＰＬ強プロモーターのＣＩ［Ｔｓ］８５７媒介性抑圧により、クローニングされた遺伝子の温度調節性発現を付与する。全プライマーは、Ｇｅｎｅ Ｒｕｎｎｅｒ ３．０１（Ｈａｓｔｉｎｇｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用して設計され、商業的に合成される（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子へのクローニングされた目的の配列の相同組換えおよび染色体組み込みを容易にする、ｐＢＲＩＮＴ−Ｃｍ組み込みプラスミドを使用したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０染色体へのリコンビナーゼ遺伝子の挿入により、Ｒ−細胞を構築する。ｐＰＬ４５１におけるクローニングされたリコンビナーゼの誘導性発現をコードするプラスミド構築物毎に、それぞれＳａｃＩＩ、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ部位を有するｃＩ８５７Ｘ−Ｆ ５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番号２８）、ｃＩ８５７ｔｅｌＮ／ｃｒｅ−Ｒ ５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２９）およびｃＩ８５７ｔｅｌ−Ｒ ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３０）プライマーにより、３種の構築物に対するｐＮＮ１からｃＩ８５７−ＰＬ−Ｘ−ｔＬカセット（式中、Ｘ＝ｃｒｅ、ｔｅｌまたはｔｅｌＮ）を増幅する。増幅されたカセットを、ｐＢＲＩＮＴ（ＣｍＲ）プラスミドのＭＣＳへとクローニングして、ｐＮＮ４、ｐＮＮ５およびｐＮＮ６組み込みベクター構築物を産生する。初期変性のための１０秒間９８℃、３０サイクルの９８℃、５秒間６８℃、１２０秒間７２℃、および最終伸長のための１分間７２℃で、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）により増幅を行って、ｃＩ８５７−ｃｒｅ（２．８ｋｂ）、ｃＩ８５７−ｔｅｌ（３．２ｋｂ）およびｃＩ８５７−ｔｅｌＮ（３．５ｋｂ）断片を生成する。構築物は、コロニーＰＣＲおよび解析的消化によって検査および確認する。
Ｓｕｐｅｒｓｅｑｕｅｎｅｅ（ＳＳ）と命名された多目的リコンビナーゼ標的部位は、それぞれＣｒｅ、ＦｌｐおよびＴｅｌＮ最小標的部位（ｌｏｘＰ−ＦＲＴ−ｔｅｌＲＬ）を保有し、全てＴｅｌ １４２ｂｐ ｐａｌ配列内に存在するように設計し、これにより、ＰＹ５４由来Ｔｅｌ標的部位がもたらされる。ＳＳは、ｐａｌ配列のそれぞれの側に隣接する７８ｂｐ ＳＶ４０エンハンサー配列も保有して、核転位置を容易にし、トランスフェクション効率を増強する。ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによりＳＳ断片を合成し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによりｐＵＣ５７へとクローニングする。
上の実施例１ＡおよびＢに記載されているプラスミド（５．８ｋｂ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ｐＧＦＰ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のｅｇｆｐ（７９０ｂｐ）によるｌｕｃ遺伝子（１．６５ｋｂ）の置き換えにより改変して、ｐＤＤＥＧＦＲを形成する。次に、ＳＳを、ｐＤＤＥＦＧＲのＳＶ４０プロモーター＋イントロン部位の直ちに上流にクローニングして、ｐＤＤ３を形成する。次いで、ＳＳ断片を、ｐＤＤ３のポリＡ部位の下流にクローニングして、ｐＤＤ４を形成する。このプラスミドは、ＥＧＦＰ遺伝子カセットに隣接する２個のＳＳ部位を保有する。
マルチコピープラスミドは、ミニ環状（ｃｃｃ）ベクター（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ；Ｆｌｐ／ＦＲＴによって媒介）またはミニ直鎖状共有結合性閉鎖（ｌｅｅ）ベクター（ＴｅｌＮ−ｔｅｌＲＬ；Ｔｅｌ／ｐａｌによって媒介）に適合させることができる。ＬＢ＋Ａｐ（５０ｕｇ／ｍｌ）において９種のＤＮＡ構築物に対する１ｕｇのｐＮＮ７によってＲ−細胞を形質転換して、エアレーションしつつ３０℃でＡ６００＝０．６とする。リコンビナーゼ発現およびプラスミド高次構造変換を誘導するために、形質転換したＲ−細胞に熱ショックを与えて、細菌成長の対数増殖期中期において４２℃で３０分間リコンビナーゼ発現を誘導し、その後、一晩３０℃に移す。次に、細胞を収集し、プラスミドを抽出する（Ｏｍｅｇａミニプラスミド抽出キット、ＶＷＲ）。アガロースゲル電気泳動および消化により、プラスミドトポロジーをアッセイする。Sambrook et al. (1989)により記載されている通りに、標準組換えＤＮＡ技法を行う。
Ｒ−細胞は温度調節性リコンビナーゼ発現を示す
温度感受性λリプレッサー、ＣＩ［Ｔｓ］８５７によって調節されるバクテリオファージλ強プロモーター、ｐＬの制御下にｔｅｌまたはｔｅｌＮリコンビナーゼ遺伝子を配置した組換え細胞を構築する（図１０）。陽性ｃｒｅ発現対照細胞を同様に調製する。抑圧および完全誘導（４２℃）条件下で、ｔｅｌおよびｔｅｌＮ Ｒ−細胞における総細胞タンパク質を試験する。ＣＩ［Ｔｓ］がＯＬオペレーターに活発に結合して下流リコンビナーゼ遺伝子の転写を抑圧する３０℃において、両方のＲ−細胞が、ＴｅｌＮおよびＴｅｌの両方について７２ＫＤａで同定される最小リコンビナーゼタンパク質レベルを実証する。リプレッサー活性が完全に抑止されてｐＬプロモーター活性の妨害が軽減される４２℃に細胞をシフトさせた後に、顕著なリコンビナーゼ発現が観察される。これらの結果は、構築されたＴｅｌおよびＴｅｌ−Ｎ細胞が、リコンビナーゼ産生について温度誘導性であることを確認する。
Ｅ．ｃｏｌｉ染色体の直鎖化／破壊後の細胞の運命を決定するために、λ部位特異的ＳＳ-およびＳＳ＋組み込み体を、リコンビナーゼの発現なし〜非常に低い発現（３０℃）または完全発現（４２℃）をもたらす条件下でインキュベートし、次いで、細胞生存率を測定する。抑圧条件（３０℃）下で、染色体に組み込まれたＳＳの存在または非存在に関係なく、全ての組換え細胞が、ほぼ完全な生存率を保持する。しかし、４２℃への温度のシフトおよびＴｅｌまたはＴｅｌＮの発現の誘導後に、ＳＳ＋を保有した組換え体は、劇的に低減した生存率を示す。また、両方の系において、Ｔｅｌ−細胞は、ＴｅｌＮ−細胞に見られるよりもおよそ５倍多い死滅をもたらす。
（実施例３）
原核生物切断・連接酵素ＴｅｌＮによって生成される直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡは、哺乳動物細胞において機能的である
材料と方法
マウスおよび細胞系
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用する。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍｌペニシリンを補充したダルベッコ変法イーグル培地において育成する。トランスフェクション効率のための内部対照としてのｐＥＧＦＰｃ２−ＣＮＫ−ＣＴありまたはなしで、ｔｅｌＲＬ保有発現構築物の混合物を用いたリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）またはリン酸カルシウム沈殿を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクトする。
組換えプラスミドの構築
二重Ｄ ＩＴＲ配列およびレポーター遺伝子を含有するプラスミドは、実施例１Ａおよび１Ｂに記載されている通りに、またはＳａｌＩ／ＮｏｔＩ高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の挿入によって改変された二重Ｄ ＩＴＲプラスミドを使用して、作製することができる［Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, Margalith M, Barnhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P, Norman J, Manthorpe M (1996) An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther 7:1205-1217、実施例２を参照］。ｐＪＤ１０５［Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E (2000) The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721-7726］に由来するｔｅｌＲＬ部位は、ｐＩＲＥＳ．ｍｕ−ＩＬ１２［Schultz J, Pavlovic J, Strack B, Nawrath M, Moelling K (1999) Long-lasting anti-metastatic efficiency of interleukin 12-encoding plasmid DNA. Hum Gene Ther 10:407-417］の穴埋めされた（filled-in）ＮｄｅＩ部位に５６ｂｐ ｔｅｌＲＬ部位を有する２２２ｂｐ ＰｖｕＩＩ／ＤｐｎＩ断片として挿入することができ、ｐＶＲ１０１２．ＥＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターの上流に挿入することができる。第２のｔｅｌＲＬ部位は、ポリＡシグナルの下流に設置されたプラスミドの穴埋めされたＢｓｔＸＩ部位に挿入される。
共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡの調製
プラスミドの環状共有結合性閉鎖コイルドプラスミドＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）は、［Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E (2000) The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721-7726］に記載されている通り、精製されたプロテロメラーゼＴｅｌＮを使用して、共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡ（ｌｃ−ＤＮＡ）に変換される。ｌｃ−ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムにより抽出され、クロロホルムにより洗浄され、エタノールにより２回沈殿される。同じ手順が、制限酵素によって直鎖化されたＤＮＡおよびｃｃｃ−ＤＮＡに適用される。これらのプラスミドの場合、ミニｌｃ−およびｌｏ−ＤＮＡは、１．２％アガロースゲルにおいて骨格断片から分離され、Ｅｌｕｔｉｐカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製される。
ＥＧＦＰの決定
一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＥＧＦＰの発現は、トランスフェクション後４８時間で、モノクローナル抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＥＣＬ検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）を使用して、以前に記載された通りに［Zimmermann S, Rommel C, Ziogas A, Lovric J, Moelling K, Radziwill G (1997) MEK1 mediates a positive feedback on Raf-1 activity independently of Ras and Src. Oncogene 15:1503-1511］、ウエスタンブロット解析によって決定される。
結果
ＴｅｌＮ／ｔｅｌＲＬ系によって得られる直鎖状閉鎖プラスミドＤＮＡ
ＤＮＡから治療用分子を発現させるためには、プロモーター、イントロンＡ、目的の遺伝子およびポリアデニル化シグナルからなる転写単位で十分である。転写単位を含有するＤＮＡ断片が、制限エンドヌクレアーゼを使用して生成される場合、結果として生じるＤＮＡ分子は、エキソヌクレアーゼによる分解に感受性である。大部分の天然に存在するＤＮＡ分子は、安定化のための共有結合性閉鎖末端を有する。これを達成するための機構は、環状化、宿主ゲノムへの組み込み、または共有結合性閉鎖ヘアピン構造の形成である。後者の機構は、直鎖状ＤＮＡ分子を生じる。バクテリオファージＮ１５の原核生物テロメラーゼ、プロテロメラーゼＴｅｌＮは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの機能を発揮することが示されている［Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E (2000) The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721-7726］。反応は、ＤＮＡ分子におけるプロテロメラーゼ標的部位ｔｅｌＲＬの存在を要求する。このテロメア分解部位は、２等部分ｔｅｌＲおよびｔｅｌＬからなる５６ｂｐ不完全パリンドロームであり、プロテロメラーゼに結合する中央完全パリンドロームｔｅｌＯを含有する。このプロテロメラーゼは、共有結合性閉鎖末端を有するＤＮＡ断片の産生に使用される。ＥＧＦＰをコードする遺伝子を使用することができる。これは、ＣＭＶプロモーターの上流にｔｅｌＲＬ部位も有する環状プラスミドＤＮＡに存在する。プロテロメラーゼ標的部位の存在は、精製されたＴｅｌＮへの曝露による、環状共有結合性閉鎖コイルドプラスミドＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）から直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡ分子への変換を可能にする。直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡ分子、ｌｃ−ＤＮＡと、制限エンドヌクレアーゼによって直鎖化された分子、直鎖状開放（ｌｏ）ＤＮＡを命名することができる。直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡは、哺乳動物細胞における転写のための鋳型として機能する。ＴｅｌＮおよびＸｈｏＩによるプラスミドＤＮＡの直鎖化は、アガロースゲル電気泳動によって実証される。対照として、ｃｃｃ−ＤＮＡが使用され、これは、ＤＮＡ改変酵素なしで同じ手順に付された。上に記載されている通りにまたは実施例２によって形成された、等しい量のｃｃｃ−ＤＮＡ、ｌｃ−ＤＮＡ、およびｌｏ−ＤＮＡは、リポフェクタミンを使用した一過的トランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞に導入される。直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡは、親ｃｃｃ−ＤＮＡに匹敵するＥＧＦＰ発現レベルを生じることができる一方、直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡは、有意に低いＥＧＦＰを発現した。一過的リン酸カルシウムトランスフェクションによって、同様の結果が得られる。ＧＦＰ活性は、蛍光顕微鏡によって観察することもできる。この方法は容易に定量化可能ではないため、ウエスタンブロット解析を使用することができる。これは、ＴｅｌＮ由来直鎖状ＤＮＡ分子が、機能的鋳型であることを実証することが予想される。
２個のｔｅｌＲＬ部位を使用したＴｅｌＮ／ｔｅｌＲＬ系によって得られる直鎖状閉鎖ミニＤＮＡ
第２のｔｅｌＲＬ部位は、ＤＤ−ＩＴＲ含有発現プラスミドにおけるポリアデニル化シグナルの下流に挿入することができる。これらの構築物において、転写単位は、両方の部位においてｔｅｌＲＬに隣接する。ＴｅｌＮによって親プラスミドから切り出された直鎖状閉鎖ＤＮＡ分子は、ミニ共有結合性閉鎖ＤＮＡと命名される。これは、ウイルスＣＭＶプロモーター、イントロンＡ配列、目的の遺伝子およびポリアデニル化部位および隣接ＤＤ−ＩＴＲを含有し、複製起点および抗生物質抵抗性遺伝子を欠如する（図９Ａ）。ミニｌｃ−ＤＮＡを、その均等な直鎖状開放形態（ミニｌｏ−ＤＮＡ）と比較する。ミニｌｃ−およびｌｏ−ＤＮＡは、それぞれＴｅｌＮおよびＭｕｎＩによる消化により、ＥＧＦＰ発現プラスミドから得ることができる。等モル量のミニＤＮＡおよびｃｃｃ−ＤＮＡを使用して、リポフェクタミンを使用してＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクトする（図９Ｂ）。空ベクターＤＮＡを対照として使用することができる。ＥＧＦＰに融合されたＲａｓ（ＣＮＫ）のキナーゼサプレッサーのコネクタエンハンサーのＣ末端断片をコードする第２のプラスミドを、等しいトランスフェクション効率のための対照（cotrol）としてコトランスフェクトする。ミニｌｃ−ＤＮＡからのＥＧＦＰの発現は、ｃｃｃ−ＤＮＡと同様であるが、ミニｌｏ−ＤＮＡからよりも実質的に高い（図９Ｂ）。
原核生物切断・連接酵素ＴｅｌＮによって生成された本明細書に記載されるＤＮＡベクターを産生するための方法は、例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Heinrich, J., et al. J Mol Med. (2002) 80: 648-654および米国特許第９，２９０，７７８号においてさらに概説され得る。
（実施例４）
ＡＡＶ粒子産生および精製のためのプロトコール
実施例１、２および３の共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡベクターは、Mizukami et al. (1998). A Protocol for AAV vector production and purification (Doctoral dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical School)に記載されている技法により、ｒＡＡＶ粒子の産生のためのｒＡＡＶベクターゲノム鋳型として使用される。図７を参照されたい。
Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ領域をコードするヘルパープラスミド（Ａｄ−ヘルパープラスミド）を使用して、実施例１の閉鎖ＤＮＡ（ベクタープラスミド）ならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（ＡＡＶ−ヘルパープラスミド）と共に、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域を有するヒト胎児由来腎臓細胞の２９３細胞をトランスフェクトする。
試薬
ヘルパープラスミドＤＮＡ（ｐＨＬＰ、ｐＡｄｅｎｏ）
ＤＤ−ＩＴＲに隣接した導入遺伝子を含有する閉鎖直鎖状ＤＮＡ
２９３細胞（ヒト胎児由来腎臓細胞）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地
ウシ胎仔血清
２９０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤および１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１を含有する２×ＨＢＳ緩衝剤
３００ｍＭ ＣａＣｌ２
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．４
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）プラス１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）
０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
ＴＢＳにおける４０％スクロースプラス０．０１％ＢＳＡ
５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するＤＮａｓｅ緩衝剤
５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＨＮＥ緩衝剤
ＨＮＥにおけるＣｓＣｌの溶液（１．２５ｇ／ｍｌ）、ＨＮＥ中
ＨＮＥにおけるＣｓＣｌの溶液（１．５０ｇ／ｍｌ）、ＨＮＥ中
プラスミド
ｒｅｐおよびｃａｐを有するＡＡＶヘルパープラスミドｐＨＬＰは、ｐＨＬＰ１９として以前に記載された。Ａｄ−ヘルパープラスミドｐＡｄｅｎｏは、ｐＶＡＥ２ＡＥ４−５と同一であり、全体的Ｅ２ＡおよびＥ４領域プラスＶＡ ＲＮＡ ＩおよびＩＩ遺伝子をコードする。
トランスフェクションおよび抽出
細胞が、フラスコの表面に初期に付着したときに、２２５ｃｍ２フラスコ当たり５×１０６個の細胞のトリプシン処理された２９３細胞を使用して、２０％〜４０％コンフルエンスの単層を生成する。フラスコ当たり４０ｍｌの培地を使用する。空気中５％ＣＯ２のインキュベーター内にプレートを置き、８０％コンフルエンスになるまで細胞を育成する（２４〜４８時間）。
トランスフェクション１時間前に、フラスコ内の培地の半分を、新鮮な培地に置き換える。ＤＤ−ＩＴＲを含有する閉鎖直鎖状ＤＮＡベクター２３μｇおよび各ヘルパープラスミドを、４ｍｌの３００ｍＭ ＣａＣｌ２に添加する。この溶液を、４ｍｌの２×ＨＢＳに穏やかに添加し、穏やかな３回反転により直ちに混合する。この混合物を直ちにピペッティングして、２２５ｃｍ２フラスコの、４０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地プラス１０％ＦＣＳにおける２９３細胞に入れ、回旋して、均一な溶液を産生する。プレートを直ちにインキュベーターに戻し、３７℃で４〜６時間インキュベートする。この期間はプレートを揺らさない。インキュベーションの終わりに、培地を予熱したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養（２％ＦＣＳを含有）に置き換える。トランスフェクション３日後に、フラスコに１ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、３分間室温でインキュベートする。細胞の懸濁液を採取し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットにおける細胞を２ｍｌのＴＢＳに再懸濁する。
懸濁液が完全に凍結するまでドライアイス／エタノール槽に、そして完全に解凍されるまで３７℃の水槽に交互に置くことにより、ＴＢＳに懸濁した細胞を３回凍結および解凍する。完全に解凍されたら、直ちに氷槽に試料を戻す。１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって組織デブリを除去し、上清を採取する。
ＡＡＶベクターの精製
上に記載されている通りに、２４個のフラスコから上清を調製する。滅菌超遠心分離チューブ（Ｕｌｔｒａｂｏｔｔｌｅ＃３４３０−３８７０；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）内に、ＴＢＳにおける４０％スクロースプラス０．０１％ＢＳＡの溶液を１１ｍｌ入れる。この溶液の上に、４８ｍｌのプールした上清を慎重に重層する。１００，０００×ｇ、１６時間、４℃の遠心分離によって粗ウイルス粒子をペレットにする。激しい撹拌によってペレットを、５ｍｌのＤＮａｓｅ緩衝剤に再懸濁する。１，０００ユニットのＤＮａｓｅ Ｉを添加し、１時間３７℃でインキュベートする。２５０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、次いで、１０，０００×ｇで２分間の遠心分離によってデブリを除去する。次に、低タンパク質結合５μｍシリンジフィルター（滅菌Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター；Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を通して上清を濾過する。濾過した材料を、ＨＮＥ緩衝剤において調製された２段（two-tier）ＣｓＣｌ勾配（１．２５ｇ／ｍｌおよび１．５０ｇ／ｍｌ）の上にロードする。ＳＷ４０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）において３５，０００ｒｐｍで２時間、１６℃にて勾配をスピンする。ウイルス粒子のバンドを採取し、これを、ＨＮＥ緩衝剤において調製された２回目の２段ＣｓＣｌ勾配（１．２５ｇ／ｍｌおよび１．５０ｇ／ｍｌ）上にロードする。ＶＴｉ６５．２ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において６５，０００ｒｐｍで２時間、１６℃にて勾配をスピンする。それぞれ０．５ｍｌの画分を採取し、半定量的ＰＣＲ解析、Ｃａｐに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング、または定量的ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションによって、ウイルス豊富画分を選択する。透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、３００ｍｌのＨＮＥ緩衝剤による３サイクルの希釈により、ウイルス豊富画分の脱塩を行う。製造業者の使用説明書に従ってＵｌｔｒａｆｒｅｅ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、材料を５０μＬに濃縮する。最終力価は、通常、定量的ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションまたはサザンブロッティングによって決定される場合、５×１０８個の２９３細胞から１×１０１３〜５×１０１３個の間の粒子に及ぶ。
閉鎖直鎖状ＤＮＡが二重Ｄを持たず、比較対象として使用されること以外は、上述の方法を反復する。閉鎖直鎖状環を含有する二重ＤＤは、より効率的となる（より高い収率のパッケージングされたゲノムの感染性ウイルス粒子を有する）ことが予想される。
（実施例５）
標的細胞へのベクターの送達
実施例１の、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するその結果得られる閉鎖末端ベクターを、トランスフェクションによって標的細胞に送達する。実施例１において生成された、スペーサーがない構築物、ならびに２、５、１０、２０および２５ヌクレオチドのスペーサーを有する構築物を、ＨｅＬａ細胞に送達して、ベクターの送達および実施例１において産生された共有結合性閉鎖直鎖状ＤＮＡからの発現構築物（ルシフェラーゼレポーター遺伝子）の発現を検証する。スペーサーがない構築物、ならびに２、５、１０、２０および２５ヌクレオチドのスペーサーを有する構築物をトランスフェクトした細胞からのルシフェラーゼ発現を、ルシフェラーゼアッセイによって定量的に検出する。プラスミドＤＮＡおよび共有結合性閉鎖環状ＤＮＡ（例えば、同じ発現構築物を含有）、ならびに同じ型の、例えば、ヘアピン末端を切断する特有の制限部位の切断によって合成により産生された開放直鎖状ＤＮＡは、対照として使用される。トランスフェクションは、製造業者の使用説明書に従ってＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、２０ｍｍ直径ウェル内で、ＲＰＭＩにおいて６０％コンフルエンスで実行する。各トランスフェクションは、４００ｎｇの構築物ＤＮＡを使用する。各トランスフェクションにおける４０ｎｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４．７３（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｈＲｌｕｃ遺伝子を含有）を使用した内部対照の包含により、トランスフェクション頻度は、実験内および実験間で正規化される。ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のルミネセンス）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーター（ＤＬＲ（商標））アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して逐次測定される。相対的な光の単位は、ＧｌｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定され、結果は、ホタルルシフェラーゼ／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの比として表現する。全実験を３回複製して実行する。
結果は、ＲＣＡによって増幅されたものを含む、ＤＤ−ＩＴＲを含有する閉鎖直鎖状ＤＮＡまたは粒子が、経時的に、開放直鎖状ＰＣＲ構築物、およびＤＤ−ＩＴＲを欠如する開放直鎖状ＰＣＲ構築物よりも高いレベルでルシフェラーゼを発現することを示すことが予想される。これは、哺乳動物細胞に導入された場合、本発明に従って産生された閉鎖直鎖状ＤＮＡを使用して、ルシフェラーゼの発現に成功することができることを実証するであろう。加えて、閉鎖直鎖状ＤＮＡベクターは、対照と比較して、細胞内により長く存続することが予想される。さらに、ＤＤ−ＩＴＲおよびプロモーターの間にスペーサーを有するＤＮＡは、スペーサーがない以外の面では同一の構築物よりも高いルシフェラーゼ発現を生成することが予想される。スペーサーのサイズは、発現レベルと相関することが予想され、より大きいスペーサー（例えば、２０〜２５ヌクレオチドスペーサー）は、より高い発現をもたらす。
加えて、閉鎖直鎖状ＤＮＡベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏでコンカテマーを形成することができることが予想される。これは、染色体外ＤＮＡを形成すること、または細胞ゲノムに組み込まれることができる。例えば、これは、ヘッドトゥーヘッド、テイルトゥーテイル、ヘッドトゥーテイルでランダムに存在することができる。コンカテマーのためのアッセイは、当技術分野で公知の方法によって行われる（Chen et al., (2001) Molecular Therapy 3: 403-410；Wilson et al., (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 1258-1269；Folger et al., (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 1372-1387；Critchlow et al.,(1998) Trends Biochem. Sci. 23: 394-398；Wu et al., (1999) PNAS USA 96: 1303-1308）。
（実施例６）
発現カセットを有するベクターは、レシピエント組織細胞において存続する
臨床関連性を実証するために、ＡｐｏＥエンハンサー／ＨＣＲおよびα１−アンチトリプシンプロモーターによって駆動されるヒト第ＩＸ因子ミニ遺伝子を含有する発現カセット（Miao et al., (2000) in vitro. Mol. Ther. 1:522-532）を、異なるベクター（本発明のＤＤ−ＩＴＲおよびテロメア末端を含む閉鎖直鎖状ＤＮＡ、対応する直鎖状ＤＮＡ、ならびに対応するプラスミドＤＮＡ）を使用して、血友病Ｂマウスの肝臓に送達する。注射後の様々な時点（３、４、５、６、７、８、９、１０週間目、および３ヶ月目、５ヶ月目、１０ヶ月目、１年間超等）における血清ヒト第ＩＸ因子濃度の解析により、ベクターの存在および第ＩＸ因子の遺伝子発現に関してマウスを解析する。
第ＩＸ因子発現カセットを含有するＤＤ−ＩＴＲ構築物のレシピエントは、ｓｓ直鎖状ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ対照のレシピエントよりも高い量の、経時的に存在するベクターを有し、それよりも高い濃度の第ＩＸ因子を有することが予想される。存在するベクターの量およびヒト第ＩＸ因子の濃度は、ＤＤ−ＩＴＲ構築物のレシピエントにおいて経時的に存続し、対照のレシピエントにおいて経時的に減少することが予想される。加えて、経時的に、レシピエントマウスにおけるＤＤ−ＩＴＲ構築物における第ＩＸ因子の発現は、対照のレシピエントにおける第ＩＸ因子の発現よりも実質的に高いレベルで、それよりも実質的に長い期間にわたり存続することが予想される。これは、ＥＬＩＳＡ解析による血清におけるヒト第ＩＸ因子の定量化、およびその出血性素因の補正の同定によって、また、ベクター投与後の異なる時点におけるサザンブロット解析による処置されたマウスの肝臓におけるベクターの定量化によって決定される。加えて、処置されたマウスにおけるベクターを含有する肝臓核の数は、肝臓切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって決定されて、ベクターを含有する肝臓核の相対数が同様であることを検証する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達されたＤＮＡの分子構造
ベクターは、レシピエント組織細胞において、経時的に存続するコンカテマーを形成することが予想される。コンカテマーは、染色体外に（extrachromasomally）存続する、または宿主細胞ゲノムに組み込む。これを実証するために、ベクターＤＮＡの分子構造に関するサザンブロット解析によって、レシピエントマウス肝臓組織を解析する。ＤＮＡを単離し、次いで、ベクター内でカットしない制限エンドヌクレアーゼ、または発現カセットにおいて１回カットする制限エンドヌクレアーゼのいずれかで消化する。カットされたＤＮＡの解析を行って、マウスゲノムへのＤＮＡの組み込みまたは染色体外（extrachromasomally）保持を決定する。ベクターＤＮＡ内でカットできないエンドヌクレアーゼ消化による全試料における高分子量バンドの産生は、マウスゲノムへのＤＮＡベクターの組み込みまたはｉｎ ｖｉｖｏでのコンカテマーの急速形成のいずれかと一貫する。これらの２つの可能性は、発現カセット全体を通して１回カットする制限エンドヌクレアーゼによる肝臓ＤＮＡ試料の消化によって区別される。この消化による高分子ＤＮＡシグナルからＤＮＡラダーへの変換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのコンカテマー化を示すであろう。
本出願人らは、ＤＮＡ断片の連結が、ヘッドトゥーヘッド、テイルトゥーテイルおよびヘッドトゥーテイル配向でランダムに起こることを予想する。これは、制限酵素によるＤＮＡ試料の適切な消化および結果として生じる断片の解析／探索によって検証することができる。
高分子量ＤＮＡの大部分は、コンカテマーに起源をもつことができる。しかし、これが染色体外（extrachromasomal）であるかゲノムに組み込まれているか決定するために、マウスに、ＤＤ−ＩＴＲベクターＤＮＡまたは組み込み第ＩＸ因子トランスポゾン（Yant et al., Nat. Genet. 25: 35-41）のいずれかを注射して、２／３部分肝切除する。トランスポゾン群において、１個のプラスミドから発現されたトランスポサーゼは、第２のプラスミドからのトランスポゾンＩＴＲに隣接したヒト第ＩＸ因子発現カセットの放出、およびマウスゲノムへの放出された導入遺伝子発現カセットの挿入を媒介する。部分肝切除が、１または２ラウンドの肝細胞の細胞分裂および有意な染色体外ＤＮＡ損失をもたらす場合、これは、その導入遺伝子発現が肝細胞増殖の誘導によって変化しないはずの、組み込みプラスミド注入マウスとは対照的に、ベクターＤＮＡ処置マウスは、同じ期間にわたり、部分肝切除後に遺伝子発現の１０倍下落を示すことを示すであろう。これらのデータは、転写活性があるＤＤ−ＩＴＲベクターが、肝臓において主に染色体外に残ることを示すであろう。代替結果は、活性ＤＤ−ＩＴＲベクターが、肝臓細胞染色体に組み込まれることを示すであろう。
方法
動物試験。８〜１０週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から得られる。全動物手順は、スタンフォード大学（Stanford University）および国立衛生研究所（National Institute of Health）によって表明されるガイドラインに従って行われる。２ｍｌの０．８５％生理食塩水における４０マイクログラムのＤＮＡを、以前に記載された通りに、マウス尾静脈に注射する（Liu et al., (1999) Gene Ther. 6: 1258-1266；Zhang et al., (1999) Human Gene Therapy 10: 1735-1737）。注射毎に、ＤＮＡの質量は同じであるが、モル比は変動し得る（例えば、２倍）。他の試験において、モル比の僅かな変動は、遺伝子発現に有意に影響を与えるとは予想されない。後眼窩技法によってマウスを定期的に出血させる。一部の事例では、以前に記載された通りに、マウスを外科的２／３部分肝切除に付す（Park et al., Nat. Genet. 24: 49-52 (2000)）。マウスにおける出血時間は、以前に記載された通りに、２〜３ｍｍの尾への切れ目（snip）からの血液の凝固に要求される時間を測定することにより決定される（Yant et al., (2000) Nat. Genet. 25: 35-41）。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。尾静脈注入により４０μｇのそれぞれの構築物ＤＮＡを受けてから２〜３週間後に、マウスのパラフィン包埋肝臓の５マイクロメートル切片を、以前に記載されたプロトコールに従ってｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために処理する（Miao et al. (2000) J. Virol. 74: 3793-3803）。脱パラフィン、再水分補給、変性、およびプロテイナーゼ消化後に、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）製のＤＩＧ標識キットを使用してジゴキシゲニンで標識された、ベクターに特異的な変性ＤＮＡプローブと共に、切片をインキュベートする。ハイブリダイゼーション後に、アルカリホスファターゼとコンジュゲートされたヤギ抗ジゴキシゲニン抗体と共に切片をインキュベートし、アルカリホスファターゼ結合ベクターＤＮＡは、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド−５−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって可視化される。
ＥＬＩＳＡ定量化。ＤＮＡ送達後に、マウス血液を定期的に採取し、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）（Walter et al., (1996) PNAS USA 93: 3056-3061）をＥＬＩＳＡによって定量化する。
サザンブロット解析。ＤＮＡ注射後の期間にマウスを屠殺し、総肝臓ＤＮＡを塩析手順によって調製する。２０マイクログラムの肝臓ＤＮＡを制限酵素で消化し、ゲル電気泳動によって分離し、プローブとしてｃＤＮＡを使用したサザンブロットハイブリダイゼーションによって解析する。ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ解析によって放射性ＤＮＡバンドを定量化する。
本発明は、本発明の単一の態様の説明として意図される、本明細書に開示される例証された実施形態によって、範囲が限定されるべきではなく、機能的に均等ないかなるクローン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列も、本発明の範囲内にある。実際に、本発明の様々な改変は、本明細書に示され記載されているものに加えて、当業者には前述および添付の図面から明らかになるであろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
（実施例７）
環状核酸を産生する鋳型の作製
対象において嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）を発現させるためのベクターの生成に有用な鋳型を作製するための方法が本明細書に例証される。５’から３’へと、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＰｖｕＩＩ制限部位、ＩＴＲ−Ｌ、ＣＦＴＲのコード領域に作動的に連結したプロモーター、二重Ｄ−ＩＴＲ （ＤＤ−ＩＴＲ）、ＣＦＴＲのコード領域に作動的に連結したプロモーター、ＩＴＲ−Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有するプラスミドを、ＢＡＭＨＩおよびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素で２４時間３７℃にて消化する。電気泳動ゲルにおいて消化物を泳動して、プラスミド断片を可視化（visual）および単離する。ゲルからプラスミド断片を切り出し、精製する。ヘアピンループの末端にＢＡＭＨＩ制限部位配列を有するアダプター配列と、ヘアピンループの末端にＨＩＮＤＩＩＩ制限部位配列を有するアダプター配列をその上、同じ様式で消化および精製する。
環状核酸鋳型を形成するために、アダプター配列を、プラスミド断片のカットされた末端にアニールする。精製されたプラスミド断片およびアダプタ配列を、Ｔ４リガーゼ等のリガーゼおよびＡＴＰの存在下、室温で少なくとも１時間ライゲーションする。次に、ライゲーション反応物を６５℃で１０分間熱失活させて、リガーゼ酵素を失活させる。
環状核酸鋳型（nucleic template acid）をＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転換して、振盪しつつ３７℃で１４〜１６時間育成して、環状核酸の複製を誘導する。細胞溶解を引き起こす細菌溶解試薬を使用して、ＣＦＴＲ導入遺伝子をコードする環状核酸を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から放出させる。放出後に、例えば、カラムクロマトグラフィーを使用した精製による標準方法を使用して、ＣＦＴＲ環状核酸を回収する。環状核酸を回収し、ｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子の送達に直接的に使用することができる、またはウイルス産生に使用することができる（実施例８を参照）。
回収されたＣＦＴＲ環状核酸を、ＰｖｕＩＩ制限酵素で２４時間２５℃にてさらに消化して、ＰｖｕＩＩ切断部位をカットする。ＰｖｕＩＩのカットは、ＯＲＩを除去し、ＣＦＴＲ核酸構築物に開放末端を作製する。開放末端の環状核酸は、導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達に、または組換えウイルスＤＮＡの産生に使用することができる。組換えウイルス産生にまたは導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達に使用されるために、環状核酸がＰｖｕＩＩで消化される必要はない。
（実施例８）
環状核酸を使用したウイルスベクターの製造
開放および閉鎖末端のＣＦＴＲ核酸構築物を使用して、Ｐｒｏ１０／ＨＥＫ２９３細胞においてウイルスベクターを製造する。米国特許第９，４４１，２０６号に記載されている通り、Ｐｒｏ１０／ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＡＶベクターのスケーラブル産生に理想的である。この細胞系を、トランスフェクションによりＣＦＴＲ核酸構築物と接触させて、環状核酸を発現させる。プラスミドに特異的なプライマーを使用したＰＣＲに基づくアッセイにより、ＣＦＴＲ核酸構築物の発現を確認する。
トランスフェクション。Ｐｒｏ１０／ＨＥＫ２９３細胞に、ＣＦＴＲ環状核酸をトランスフェクトし、Ｒｅｐ２および血清型特異的Ｃａｐ２をコードするパッケージングプラスミド：ＡＡＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびＡｄ−ヘルパープラスミド（ＸＸ６８０：アデノウイルスヘルパー配列をコード）もトランスフェクトする。
トランスフェクション当日に、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ生存率解析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞を計数し、トランスフェクションのために希釈する。トランスフェクションカクテルを混合するために、コニカルチューブに次の試薬をこの順序で添加する：プラスミドＤＮＡ、ＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）または他の無血清適合性トランスフェクション培地、次いで、プラスミドＤＮＡに対し特異的な比のトランスフェクション試薬。室温でインキュベートする前に、カクテルを反転して混合する。トランスフェクションカクテルをピペッティングして、フラスコに入れ、振盪機／インキュベーターに戻す。全ての最適化試験は、３０ｍＬ培養体積で実行し、続いて、より大きい培養体積で確証を行う。トランスフェクション後４８時間で、細胞を収集する。
ウェーブ（Wave）バイオリアクター系を使用したｒＡＡＶの産生。トランスフェクション２日前にウェーブバッグに播種する。ウェーブバッグ播種２日後に、細胞培養物計数を為し、次いで、そのようなトランスフェクションの前に細胞培養物を増やす／希釈する。次いで、ウェーブバイオリアクター細胞培養物にトランスフェクトする。トランスフェクション後少なくとも４８時間で、ウェーブバイオリアクターバッグから細胞培養物を収集する。
力価：標準曲線（ＡＡＶ ＩＴＲ特異的）およびＣＦＴＲ環状核酸に特異的なプライマーに対するｑＰＣＲを使用して、ＤＮａｓｅ消化後にＡＡＶ力価を計算する。
振盪機フラスコおよび６０ウェーブバイオリアクターバッグからの懸濁細胞の収集。トランスフェクション後４８時間で、細胞培養物を採取して、振盪機フラスコから注ぐことまたはウェーブバイオリアクターバッグからポンピングすることのいずれかにより、５００ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れる。次に、細胞培養物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃプラス遠心分離機およびＨ６０００Ａローターを使用して、６５５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞を１×ＰＢＳに再懸濁し、５０ｍＬコニカルチューブに移し、６５５×ｇで１０分間（mM）遠心分離する。この時点で、ペレットは、ＮＬＴ−６０℃に貯蔵することができる、または精製を続けることができる。
ｑＰＣＲを使用した細胞ライセートからのｒＡＡＶの力価測定。１０ｍＬの細胞培養物を除去し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃプラス遠心分離機およびＨ６０００Ａローターを使用して、６５５×ｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットから上清をデカントする。次に、細胞ペレットを５ｍＬのＤＮａｓｅ緩衝剤（５ｍＭ ＣａＣ１２、５ｍＭ ＭｇＣ１２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）に再懸濁し、続いて、超音波処理して細胞を効率的に溶解する。次に、３００ｕＬを除去し、１．５ｍＬ微量遠心チューブ内に置く。次に、１４０ユニットのＤＮａｓｅ Ｉを各試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ＤＮａｓｅ消化の有効性を決定するために、４〜５ｍｇのＴＲｅＧＦＰプラスミドを、ＤＮａｓｅの添加ありおよびなしで、非トランスフェクト細胞ライセートにスパイクする。５０μＬのＥＤＴＡ／サルコシル溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を各チューブに添加し、７０℃で２０分間インキュベートする。次に、５０μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、５５℃で少なくとも２時間インキュベートする。試料を１５分間煮沸して、プロテイナーゼＫを失活させる。各試料からアリコートを除去して、ｑＰＣＲによって解析させる。細胞当たりの生成されたｒＡＡＶベクターの多さを有効に決定するために、２回のｑＰＣＲ反応を実行する。１回のｑＰＣＲ反応は、プラスミドＸＸ６８０、ｐＸＲ２およびＴＲｅＧＦＰの骨格における相同配列に結合するように設計されたプライマー２ｓのセットを使用してセットアップされる。第２のｑＰＣＲ反応は、ｅＧＦＰ遺伝子内の領域に結合しこれを増幅するプライマーのセットを使用してセットアップされる。ｑＰＣＲは、３０ Ｒｏｃｈｅ製のＳｙｂｒ ｇｒｅｅｎ試薬およびＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ ４８０を使用して行われる。試料を９５℃で１０分間変性させ、続いて、４５サイクル（９０℃１０秒間、６２℃１０秒間および７２℃１０秒間）および融解曲線（１サイクル９９℃３０秒間、６５℃１分間、継続的）を行う。
粗ライセートからのｒＡＡＶの精製。１０ｍＬの最終体積となるように、各細胞ペレットを調整する。ペレットを短時間ボルテックスし、１秒間オン、１秒間オフバーストにおいて３０％収率で４分間超音波処理する。超音波処理後に、５５０ＵのＤＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートする。次に、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣＳＢ遠心分離機およびＨＳ−４ローターを使用して、ペレットを９４００×ｇで遠心分離して細胞デブリをペレットにし、清澄化されたライセートをＴｙｐｅ７０Ｔｉ遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ３６１６２５）に移す。ｒＡＡＶの単離のための懸濁ＨＥＫ２９３細胞の収集および溶解に関して、当業者は、顕微溶液化等の機械的方法または洗剤等の化学的方法等を使用し、続いて、デプス（depth）濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した清澄化ステップを行うことができる。
ＡＡＶベクター精製。当業者であれば気付き、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる次の原稿（Allay et al., Davidoff et al., Kaludov et al., Zolotukhin et al., Zolotukin et al, etc）に記載されている通り、清澄化されたＡＡＶライセートを、カラムクロマトグラフィー方法によって精製する。

Claims (156)

  1. 持続した発現のために核酸構築物を標的細胞に導入するための方法であって、
    ａ．ｉ．Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列、
    ｉｉ．Ｄ’領域
    を含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲであって、
    ｉｉｉ．前記ＤおよびＤ’領域が、相補的パリンドローム配列であり、ＤおよびＤ’が、前記ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲと、
    ｂ．発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列を含む前記核酸構築物の相補鎖と
    を含む共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を前記標的細胞に投与するステップを含み、
    ｃ．前記ＤＮＡ構築物が、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し、
    ｄ．前記ＤＮＡ構築物が、前記標的細胞において前記所定のＤＮＡ配列を発現することができる、方法。
  2. 前記Ｄ領域が、ニッキング部位を含有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｄ領域が、少なくとも５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記Ｄ領域が、約２０ｎｔの長さである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記Ｄ領域が、パルボウイルスＩＴＲのパルボウイルスＤ領域に対応する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記所定のＤＮＡ配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ＩＴＲが、プロモーターとして作用している、請求項８に記載の方法。
  10. 前記プロモーターが、前記ＩＴＲから離れている、請求項８に記載の方法。
  11. 前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定のＤＮＡ配列の発現を駆動する、請求項１〜１０に記載の方法。
  12. 前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、請求項４に記載の方法。
  13. 前記保持された核酸が、前記ニッキング部位、ならびに／または前記ＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記所定のＤＮＡ配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、請求項１に記載の方法。
  15. 前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＤおよびＤ’領域と前記所定のＤＮＡ配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、請求項１６または１７に記載の方法。
  20. 前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項１６または１７に記載の方法。
  21. 前記少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲ、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＤＮＡ構築物が、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記Ｄ領域が、前記ＩＴＲとは異なる血清型に由来する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項２２に記載の方法。
  25. １個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＤＮＡ構築物が、宿主細胞においてプロテロメラーゼ酵素活性によって形成された前記共有結合性閉鎖末端に部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記宿主細胞が、誘導性プロモーターの制御下において前記プロテロメラーゼを発現する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＤＮＡ構築物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成された前記共有結合性閉鎖末端に部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＤＮＡ構築物が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ＤＮＡ構築物が、前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項３２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 核酸が、治療用核酸である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記構築物が、ｅｘ ｖｉｖｏで前記標的細胞に投与される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記標的細胞が、遺伝的に欠損した細胞および／または罹患した細胞である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記標的細胞が、罹患した細胞である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記標的細胞が、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸配列の送達のためのＤＮＡベクターであって、
    ｃ．ｉ．Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列、
    ｉｉ．Ｄ’領域
    をそれぞれ含む、２個のＤＤ−ＩＴＲであって、
    ｉｉｉ．前記ＤおよびＤ’領域が、約５〜２０ｎｔの長さの相補的パリンドローム配列であり、前記ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、２個のＤＤ−ＩＴＲと、
    ｄ．前記所定の核酸配列（例えば、発現のための異種遺伝子）と
    を含み、前記２個のＤＤ−ＩＴＲが、共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡの場面において、前記核酸に隣接する、ＤＮＡベクター。
  45. 前記所定の核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項４４に記載のＤＮＡベクター。
  46. 前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定の核酸配列の発現を駆動する、請求項４４に記載のＤＮＡベクター。
  47. 前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、請求項４６に記載のＤＮＡベクター。
  48. 前記保持された核酸が、ニッキング部位、ならびに／または前記ＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、請求項４７に記載のＤＮＡベクター。
  49. 前記所定の核酸配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、請求項４４に記載のＤＮＡベクター。
  50. 前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、請求項４９に記載のＤＮＡベクター。
  51. 前記ＤおよびＤ’領域と前記所定の核酸配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項４５に記載のＤＮＡベクター。
  52. 前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項４６に記載のＤＮＡベクター。
  53. 前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、請求項５１または５２に記載のＤＮＡベクター。
  54. 前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、請求項５３に記載のＤＮＡベクター。
  55. 前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項５３に記載のＤＮＡベクター。
  56. 前記ＤＤ−ＩＴＲが、パルボウイルスＩＴＲおよび合成ＩＴＲからなる群から選択されるＩＴＲから生成される、請求項４４〜５５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  57. 前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、請求項５６に記載のＤＮＡベクター。
  58. 前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、請求項５７に記載のＤＮＡベクター。
  59. ＤＮＡ構築物が、２個を超えるＤＤ−ＩＴＲを含む、請求項４４〜５８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  60. 各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項５９に記載のＤＮＡベクター。
  61. １個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、請求項６０に記載のＤＮＡベクター。
  62. 前記ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、請求項４４〜６１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  63. 前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、請求項４４〜６１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  64. 前記ＤＮＡベクターが、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含み、共有結合性閉鎖末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、請求項４４〜６３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  65. 前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項４４〜６４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  66. 前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、請求項４４〜６５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  67. 前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、請求項４４〜６６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  68. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項６６〜６７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  69. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  70. 前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  71. 所定の核酸が、治療用核酸である、請求項４４〜７０のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  72. 少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項４４〜７１に記載のＤＮＡベクター。
  73. 前記２個のＤＤ−ＩＴＲに隣接する部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含む、請求項４４〜７２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  74. 前記２個のＤＤ−ＩＴＲに隣接する前記部分的プロテロメラーゼ結合部位が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプロテロメラーゼ酵素活性またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、請求項７３に記載のＤＮＡベクター。
  75. 共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物が、前記標的細胞内にコンカテマー構造として存続する、請求項４４〜７４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  76. ２〜５週間、１〜１２ヶ月間、１〜１０年間またはより長い期間にわたり、前記核酸の持続した発現を促進する、請求項７５に記載のＤＮＡベクター。
  77. 持続した発現のために核酸を標的細胞に導入するための方法であって、
    ａ．図５に示すＩＴＲからなる群から選択される少なくとも１個のＩＴＲ配列と、
    ｂ．核酸構築物の相補鎖であって、前記核酸構築物が、所定のＤＮＡ配列を含み、前記相補鎖が、発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる、相補鎖と
    を含む共有結合性閉鎖非ウイルスＤＮＡ構築物を前記標的細胞に投与するステップを含み、
    ｃ．前記ＤＮＡ構築物が、ヘアピン共有結合性閉鎖末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成する、方法。
  78. 前記ＩＴＲ配列が、いずれかの側において相補配列ＤおよびＤ’に隣接し、これにより、ＤＤ−ＩＴＲを作製する、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記所定のＤＮＡ配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定のＤＮＡ配列の発現を駆動する、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、請求項７７に記載の方法。
  82. 前記保持された核酸が、ニッキング部位、ならびに／またはＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記所定のＤＮＡ配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、請求項７７に記載の方法。
  84. 前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ＤおよびＤ’領域と前記所定のＤＮＡ配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項７７〜８４に記載の方法。
  86. 前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項７７〜８５に記載の方法。
  87. 前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、請求項８５または８６に記載の方法。
  88. 前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項８７に記載の方法。
  90. 少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される、請求項７７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ＤＮＡ構築物が、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む、請求項６５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  94. 各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項９３に記載の方法。
  95. １個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、請求項９３に記載の方法。
  96. ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、請求項７７〜９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換または挿入が存在する、請求項７７〜９５のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記ＤＮＡ構築物が、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含み、前記共有結合性閉鎖末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、請求項７７〜９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記ＤＮＡ構築物が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項７７〜９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記ＤＮＡ構築物が、前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、請求項７７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも１〜５週間、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、請求項７７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項１００〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  105. 核酸が、治療用核酸である、請求項７７〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、請求項７７〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記標的細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項７７〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記構築物が、ｅｘ ｖｉｖｏで前記標的細胞に投与される、請求項７７〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記標的細胞が、遺伝的に欠損した細胞である、請求項７７〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記標的細胞が、罹患した細胞である、請求項７７〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記標的細胞が、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項７７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 請求項１〜４３または７７〜１１１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、細胞またはその集団。
  113. 持続した発現のための、標的細胞への所定の核酸の送達のための共有結合性閉鎖非ウイルス直鎖状ＤＮＡベクターであって、
    ａ．ｉ．Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域を有する逆位末端反復配列、
    ｉｉ．Ｄ’領域
    を含む少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲであって、
    ｉｉｉ．前記ＤおよびＤ’領域が、相補的パリンドローム配列であり、ＤおよびＤ’が、前記ＡおよびＡ’領域に近接して位置する、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲと、
    ｂ．発現可能なｄｓＤＮＡ中にアニールすることができる所定のＤＮＡ配列を含む核酸構築物の相補鎖と
    を含み、
    ｃ．前記ＤＮＡベクター構築物が、共有結合性閉鎖ヘアピン末端を有する直鎖状ＤＮＡを形成し、
    ｄ．前記ＤＮＡベクター構築物が、前記標的細胞において前記所定のＤＮＡ配列を発現することができる、ＤＮＡベクター。
  114. 前記Ｄ領域が、ニッキング部位を含有する、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  115. 前記Ｄ領域が、少なくとも５ヌクレオチドの長さである、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  116. 前記Ｄ領域が、約２０ｎｔの長さである、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  117. 前記Ｄ領域が、パルボウイルスＩＴＲのパルボウイルスＤ領域に対応する、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  118. 前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  119. 前記ディペンドウイルスが、ＡＡＶである、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  120. 前記所定のＤＮＡ配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  121. 前記ＩＴＲが、プロモーターとして作用している、請求項１２０に記載のＤＮＡベクター。
  122. 前記プロモーターが、前記ＩＴＲから離れている、請求項１２０に記載のＤＮＡベクター。
  123. 前記ＤＤ−ＩＴＲが、前記所定のＤＮＡ配列の発現を駆動する、請求項１１３〜１２２に記載のＤＮＡベクター。
  124. 前記ＤおよびＤ’領域が、前記領域の少なくとも５個の核酸を保持する置換、挿入および／または欠失を有する、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  125. 前記保持された核酸が、前記ニッキング部位、ならびに／または前記ＡおよびＡ’領域と前記ＤおよびＤ’領域との接合部を含む、請求項１２４に記載のＤＮＡベクター。
  126. 前記所定のＤＮＡ配列が、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする、請求項１１３に記載のＤＮＡベクター。
  127. 前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびＣｒｉｓｐｅｒ Ｃａｓ ９組換えのためのガイドＲＮＡからなる群から選択される、請求項１２６に記載のＤＮＡベクター。
  128. 前記ＤおよびＤ’領域と前記所定のＤＮＡ配列との間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項１〜１２７のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
  129. 前記ＤおよびＤ’領域と前記プロモーターとの間にスペーサーとして少なくとも２ヌクレオチドが存在する、請求項１２６に記載のＤＮＡベクター。
  130. 前記スペーサーが、少なくとも５ヌクレオチドである、請求項１２８または１２９に記載のＤＮＡベクター。
  131. 前記スペーサーが、少なくとも２０ヌクレオチドである、請求項１２８または１２９に記載のＤＮＡベクター。
  132. 前記スペーサーが、少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項１２８または１２９に記載のＤＮＡベクター。
  133. 前記少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲ、パルボウイルスＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成される、請求項１１３〜１３２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  134. 前記ＤＮＡベクター構築物が、２個のＤＤ−ＩＴＲを含む、請求項１１３〜１３３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  135. 前記Ｄ領域が、前記ＩＴＲとは異なる血清型に由来する、請求項１１３〜１３４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  136. 各ＤＤ−ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１３４に記載のＤＮＡベクター。
  137. １個のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来し、第２のＤＤ−ＩＴＲが、ＡＡＶ５ ＩＴＲに由来する、請求項１３４に記載のＤＮＡベクター。
  138. 前記ＢおよびＢ’またはＣおよびＣ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、請求項１１３〜１３７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  139. 前記ＡおよびＡ’領域に欠失、置換および／または挿入が存在する、請求項１１３〜１３８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  140. 前記ＤＮＡベクター構築物が、部分的プロテロメラーゼ結合部位をさらに含み、前記共有結合性閉鎖末端が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテロメラーゼ酵素活性によって形成される、請求項１１３〜１３９のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  141. 前記ＤＮＡベクター構築物が、前記標的細胞内で存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項１１３〜１４０のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  142. 前記ＤＮＡベクター構築物が、前記細胞においてコンカテマー構造へと変換され得る、請求項１１３〜１４１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  143. 前記標的細胞における前記所定のＤＮＡ配列の前記持続した発現が、少なくとも２〜５週間、少なくとも１〜１２ヶ月間、少なくとも１〜１０年間の期間に及ぶ、請求項１１３〜１４２のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  144. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において存続し、前記所定の配列の持続した発現をもたらす、請求項１４２〜１４３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  145. 前記コンカテマー構造が、前記標的細胞において染色体外で存続する、請求項１４２〜１４３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  146. 前記コンカテマー構造が、標的細胞染色体中に組み込まれる、請求項１４２〜１４３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  147. 核酸が、治療用核酸である、請求項１１３〜１４６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
  148. 標的細胞への核酸の送達のための医薬組成物であって、標的細胞への送達のための、請求項４４〜７６および１１３〜１４７のいずれかに記載のＤＮＡベクターと、薬学的に許容される担体とを含み、前記標的細胞が、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋肉細胞、膵細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、医薬組成物。
  149. 疾患または障害の処置のためにｉｎ ｖｉｖｏで前記標的細胞に投与される、請求項１４８に記載の医薬組成物。
  150. 前記宿主細胞が、誘導性プロモーターの制御下において少なくとも第１のＴｅｌリコンビナーゼをコードするように設計されており、前記細胞が、細菌配列を含まないベクターを産生するように適合された発現ベクターを含み、前記ベクターが、発現カセットを含み、目的の核酸が、少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲに隣接し、いずれかの側において、前記Ｔｅｌリコンビナーゼの標的配列に隣接する、請求項２８に記載の方法。
  151. 前記Ｔｅｌ標的配列の非結合領域内に組み込まれるものは、１種または複数の追加的なリコンビナーゼの標的結合配列である、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記１種または複数の追加的なリコンビナーゼが、ｐＫ０２ ｔｅｌＲＬ部位、ｔｅｌＲＬ部位、ｐａｌ部位、ｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、ｐｈｉＣ３１、ａｔｔＰ部位およびＸａｔｔＰ部位からなる群から選択される、請求項１５１に記載の方法。
  153. 少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを含有する直鎖状共有結合性閉鎖ベクターを産生する方法であって、第１のリコンビナーゼの発現を可能にするのに適した条件下で、請求項１５０に記載の宿主細胞をインキュベートして、直鎖状共有結合性閉鎖ベクターをもたらすステップを含む方法。
  154. 少なくとも１個のＤＤ−ＩＴＲを含有する環状共有結合性閉鎖ベクターを産生する方法であって、第２のリコンビナーゼの発現を可能にするのに適した条件下で、請求項１５１〜１５２に記載の宿主細胞をインキュベートして、環状共有結合性閉鎖ベクターをもたらすステップを含む方法。
  155. 前記Ｔｅｌリコンビナーゼ標的部位が、ファージＰＹ５４ Ｔｅｌ １４２塩基対標的部位である、請求項１５０に記載の方法。
  156. 前記目的の核酸が、両側においてＤＤ−ＩＴＲに隣接する、請求項１５０〜１５５に記載の方法。
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