CN116606834A - 多种具有切割连接活性的原端酶及其应用 - Google Patents
多种具有切割连接活性的原端酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116606834A CN116606834A CN202310373205.3A CN202310373205A CN116606834A CN 116606834 A CN116606834 A CN 116606834A CN 202310373205 A CN202310373205 A CN 202310373205A CN 116606834 A CN116606834 A CN 116606834A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- double
- enzyme
- dna
- seq
- stranded dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 30
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 52
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 241000196250 Prototheca Species 0.000 claims 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005065 mining Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 11
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 8
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000016559 DNA Primase Human genes 0.000 description 1
- 108010092681 DNA Primase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012019 product validation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及多种具有切割连接活性的原端酶及其应用。本发明所提供的具有切割连接活性的原端酶，其中，所述的原端酶包含Domain 1和Domain 2序列，其中:Domain 1序列为SEQ ID NO：1所示；Domain 2序列为SEQ ID NO：2所示。本发明通过对不同应用场景下的微生物宏基因组信息进行深度挖掘，获得多种具有切割连接活性的原端酶，所述原端酶可实现恒温条件下切割特定序列，且能够在不使用高能辅助因子的情况下共价重新连接切割DNA链。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及多种具有切割连接活性的原端酶及其应用。
背景技术
原端酶与特异性重组酶的λ-整合酶家族以及IB拓扑异构酶类型共享有限的序列，原端酶是一种调节保守位点特异性重组的酶类酪氨酸重组酶也通过识别并结合短DNA序列(靶位点)，再识别序列切割DNA骨架，以相同的方式进行DNA重排。之后两个DNA螺旋发生交换并重新连接DNA链。
相比于传统的双链线性未封闭的DNA，这种具有切割连接作用的原端酶可以产生共价闭合末端的双链DNA，极大地稳定了在体内体外被降解的这一技术难题，形成的DNA内部序列可以编码一些较为长的、复杂的或者不稳定的序列，通过导入细胞可以观察到并具有很强的表达效果，所以形成的闭合双链产物可以以稳定的形式导入细胞内作靶向药物治疗的有效手段，具有无需复杂的升降温程序，不受精密仪器需求的局限，并且具有特异性好、灵敏度高等优点。因此具有切割连接功能的原端酶在不断深入研究和改进发展中。
CN102301010B公开了一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外方法，包括：(a)在一种或多种引物存在下，使包含至少一个原核端粒酶(protelomerase，一种噬菌体编码的酶)靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在促进所述模板扩增的条件下接触；和(b)使(a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。该方法在于提供双链扩增以及酶切的方法，而对于具有切割连接活性的原端酶并没有相关的报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供多种具有切割连接活性的原端酶及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述的原端酶包含Domain 1和Domain 2序列，其中:
Domain 1的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示；
Domain 2的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述的原端酶为与双序列Domain 1和Domain 2具有80％以上同源性的蛋白序列。
进一步地，所述的原端酶为克雷伯杆菌属K5原端酶、柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶或大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶，其蛋白序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：5所示。
本发明通过对不同应用场景下的微生物宏基因组信息进行深度挖掘，获得多种具有切割连接活性的原端酶，本发明所提供的原端酶可以识别特定DNA序列并行使切割功能，且具有连接切割后单链DNA的功能。
本发明还提供所述的原端酶在DNA合成、RNA合成或生物医药领域的应用。
本发明还提供一种具有共价闭合末端的双链DNA，其中，所述的具有共价闭合末端的双链DNA是由一种或多种所述的原端酶反应得到的。
本发明还提供所述的具有共价闭合末端的双链DNA的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)制备反应体系：所述反应体系包含作为模板的双链DNA、一种或多种所述的原端酶、盐离子缓冲液；
2)催化反应：步骤1)所述反应体系在特定温度下孵育，所得产物即为具有共价闭合末端的双链DNA。
上述制备方法中，步骤1)中，作为模板的双链DNA为双链环状DNA或双链线性DNA。
进一步地，步骤1)中，双链DNA模板的底物浓度为0.01pmol-100pmol，优选0.1pmol-8pmol，更优选0.1pmol-5pmol。
进一步地，步骤2)中，所述的特定温度为20-60℃，优选25-40℃，更优选30℃。
本发明还提供所述的具有共价闭合末端的双链DNA在制备基因产品或靶向药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过对不同应用场景下的微生物宏基因组信息进行深度挖掘，获得多种具有切割连接的原端酶，所述原端酶可实现恒温条件下切割特定序列，且能够在不使用高能辅助因子的情况下共价重新连接切割DNA链；
(2)本发明所提供的原端酶可广泛应用于DNA合成、RNA合成或生物医药等领域；而且采用本发明所提供的原端酶反应得到的具有共价闭合末端的双链DNA可以稳定的形式导入细胞内用于制备基因产品或靶向药物，为靶向药物治疗提供更为有效的手段。
附图说明
图1为本发明DNA聚合酶纯化浓缩前和浓缩后的蛋白胶图；
图2为本发明切割连接反应方法的原理示意图；
图3为本发明具有切割连接的原端酶反应核酸电泳图；
图4为本发明采用T7核酸外切酶对形成共价闭合末端反应产物验证的核酸电泳图；
图5为本发明采用等温扩增对形成共价闭合末端反应产物验证的核酸电泳图。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
实施例1、具有切割连接活性的原端酶蛋白的筛选
(1)对具有双链识别功能的单链切割酶及连接酶进行机理解析，分析出同时具有两种切割连接功能的蛋白核心骨架，为Domain 1和Domain 2，其中，domain 1和domain 2的序列如下：
Domain 1序列如SEQ ID NO：1所示；
Domain 2序列如SEQ ID NO：2所示。
(2)依据双domain序列进行blast序列挖掘，获得52种候选序列；
(3)对80％以上同源性的蛋白采用AlphaFold2同源建模，利用rosetta进行分子动力学模拟，选择与蛋白核心骨架相比最类似的3种候选酶进行功能验证，这三种候选酶的活性口袋中257-378位残基符合Domain1区域，416-425位残基符合Domain2区域，其中424Y具有潜在催化切割连接的作用。这3种候选酶如下：
克雷伯杆菌属K5原端酶，其蛋白序列如SEQ ID NO：3所示；
柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶，其蛋白序列如SEQ ID NO：4所示；
大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶，其蛋白序列如SEQ ID NO：5所示。
上述3种候选酶中：
雷伯杆菌属K5原端酶蛋白序列的domain区域为：
TRRGMAPLAFALAALSGRRMIEIMLQGEFSVAGKYTVTFLGQAKKRSEDKGVSRKIYTLCDADLFVSLVNQLRSC PAAADFDEVVKGYGENDTRSENGRINAILATAFNPWVKTFLGDDRRILGHDDENTQLH(SEQ ID NO：6)
柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶蛋白序列的domain区域为：
TRRGMAPLAFALAALSGRRMIEIMLQGEFSVSGRYTVNFIGQAKKRSEDKGTSRNIYTLCDAKLFVDLVYELRSC PAAADFSEVIKGYGENDTRSENARINAILATAFNPWVKSFLGDDRRVYK(SEQ ID NO：7)
大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶蛋白序列的domain区域为：
TRSGMAPLAFALAALSGRRMIEIMYQGTFTVSGKYTVDFLGQAKKRTSDDITRKIYTLCEAKTFVYLINVLRSCP AASDFDDVVKGYGDNDTRSENGRINAILAKAFNPWVKSFFKDDRRVILGHDDENTQLH(SEQ ID NO：8)
通过双序列比对，结果表明：Domain1和Domain2双序列与雷伯杆菌属K5原端酶蛋白序列的domain区域的相似度为87.09％，与柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶蛋白序列的domain区域的相似度为81.2％，与大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶蛋白序列的domain区域的相似度为82.63％。
实施例2、具有切割连接的原端酶的表达及纯化
以具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶为例，对其表达和纯化过程进行详细描述：
(1)将具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶蛋白(SEQ ID NO：3)构建到PET28a载体上，转化BL21(DE3)感受态，均匀涂抹至含有kan(终浓度10mg/L)的抗生素平板中，得到重组菌；
(2)将重组菌接种到4mL含有kan抗性的2YT培养基中(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl)，37℃过夜培养；
(3)完成步骤(2)后，按照1/200体积将培养后的菌液转至含有kan(终浓度10mg/L)抗性的2YT培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD＝0.6，得到含有具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶(SEQ ID NO：3)的菌液；
(4)向步骤(3)得到的含有具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶(SEQID NO：3)的菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，16℃220rpm振荡培养13小时；
(5)完成步骤(4)后，收集菌体，4℃5500rpm离心8min；
(6)完成步骤(5)后，采用Buffer A(Buffer A：20mM Tris–HCl，150mM NaCl，pH：6.8)振荡混匀后置于冰上，用高压破碎仪将菌体破碎，然后4℃，10000rpm，40min离心并收取上清液；
(7)将步骤(6)得到的上清液采用镍柱亲和层析进行纯化。具体步骤：先用20个柱体积纯水润洗两次，再用10个柱体积的Buffer A进行润洗，然后上样，重复倒一次，然后用15个柱体积的Buffer B洗脱液进行洗脱并收集具有目的蛋白的过柱后液体(Buffer B：20mM Tris–HCl，500mM NaCl，1000mM lmidazole，pH：6.8)，洗脱液由Buffer A和Buffer B组成，洗脱过程中Buffer B的体积份数由0％上升至100％，相应的Buffer A的体积份数由100％下降至0％；
(8)使用超滤管超滤。将溶液置换为Buffer A，将蛋白稀释至1mg/ml，得到纯化的来自克雷伯杆菌属K5原端酶目的蛋白(SEQ ID NO：13)。
蛋白纯化浓缩前和浓缩后的蛋白胶图如图1所示。从图1可以看出：浓缩前通过梯度咪唑洗脱下目的蛋白，浓缩后的蛋白符合原蛋白73kd大小。
上述步骤(3)中，OD值在0.4-0.8范围内均可。
上述步骤(4)中，振荡培养的时间在12-14小时范围内均可。
同样，按照上述方法将来自柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶蛋白(SEQ ID NO：4)构建到PET28a载体上，完成步骤(1)--步骤(8)的操作，得到纯化的来自柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶目的蛋白(SEQ ID NO：14)。
进一步地，按照上述方法将来自大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶蛋白(SEQ IDNO：5)构建到PET28a载体上，完成步骤(1)--步骤(8)的操作，得到纯化的来自大肠杆菌噬菌体YDC107_1目的蛋白(SEQ ID NO：15)。
实施例3、具有切割连接活性的原端酶的切割连接反应
准备反应体系原料：作为模板的双链环状DNA或线性DNA；一种或多种具有切割连接活性的原端酶；盐离子缓冲液：10x反应Buffer(200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mMKCl，20mM MgSO4，1％X-100，pH6.8)，DNase-free Water。
(1)制备反应体系：将的双链环状DNA或线性DNA作为模板，加入盐离子缓冲液10x反应Buffer后进行吹打混合均匀，置于掌上离心机瞬时离心3s，加入具有切割连接活性的原端酶，用DNase-free Water补至反应总体积，吹打均匀，即得所述的反应体系；
(2)催化反应：将步骤(1)所得反应体系放置PCR仪中、在特定温度下孵育，所得产物即为具有共价闭合末端的片段核酸产物。
其中，步骤(1)中，双链DNA模板的底物浓度为0.01pmol-100pmol，优选0.1pmol-8pmol，更优选0.1pmol-5pmol。
在某些方案中，可以大于0.1pmol，比如0.1pmol、0.2pmol、0.3pmol、0.4pmol、0.5pmol、0.6pmol、0.7pmol、0.8pmol、0.9pmol、1pmol。本实施例中，为0.5pmol。
在步骤(2)中，特定温度为20-60℃，优选25-40℃，更优选30℃。对于孵育时间没有特殊的限定。本实施例中，为在特定温度30℃下孵育30min。
本发明中，在特定温度下进行孵育的过程中发生切割连接反应，切割连接反应的原理示意图如图2所示。下面结合图2对切割连接反应的原理进行说明：
(1)首先，具有切割连接活性的原端酶在具有特定酶切位点的双链DNA序列上识别酶切序列，如图2的A所示；
(2)识别到酶切序列的特定位点后酶切序列，进行酶切反应，如图2的B所示；
(3)酶切反应后产生磷酸酪氨酸DNA中间体，并快速连接序列，如图2的C所示；
(4)快速连接序列后，共价重新连接切割DNA链，形成具有共价闭合末端的线性DNA，如图2的D所示。
图2中，带有阴影的圆圈为本发明的具有切割连接活性的原端酶。
下面以具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶(SEQ ID NO：3)为例，对其切割连接反应的过程进行详细的描述：
(1)制备反应体系：将0.1pmol的具有特定酶切位点序列的双链环状DNA(碱基序列SEQ ID NO：9)作为模板，加入盐离子缓冲液10x反应Buffer后进行吹打混合均匀，置于掌上离心机瞬时离心3s，加入具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶(SEQ ID NO：3)，用DNase-free Water补至反应总体积，吹打均匀，即得反应体系；
特定酶切位点序列为：
TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA(SEQ ID NO：12)
(2)催化反应：将步骤(1)所得反应体系放置PCR仪中、在特定温度30℃下孵育30min，得到具有共价闭合末端的线性片段核酸产物。
上述步骤(2)中，在特定温度下进行孵育的过程中发生切割连接反应，具体包括如下过程：
(2.1)具有切割连接活性的来自克雷伯杆菌属K5原端酶在双链DNA序列上识别酶切序列；
(2.2)识别到酶切序列的特定位点后酶切序列，进行酶切反应；
(2.3)酶切反应后产生磷酸酪氨酸DNA中间体，并快速连接序列；
(2.4)快速连接序列后，共价重新连接切割DNA链，得到共价线性闭合末端片段核酸产物。
同样，按照上述方法分别将具有特定酶切位点的双链DNA为模板，对具有切割连接活性的来自柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶(SEQ ID NO：4)和来自大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶(SEQ ID NO：5)进行酶切反应得到相应的具有共价闭合末端的线性片段核酸产物。其中：
对具有切割连接活性的来自柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶(SEQ ID NO：4)进行切割反应时，作为模板的具有特定酶切位点序列的双链环状DNA的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；特定酶切位点序列为：
TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA(SEQ ID NO：12)
对具体切割连接活性的来自大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶(SEQ ID NO：5)进行切割连接反应时，作为模板的具有特定酶切位点序列的双链环状DNA的碱基序列如SEQ IDNO：11所示；特定酶切位点序列为：
TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA(SEQ ID NO：12)
凝胶电泳对产物进行分析，电压130V，电泳时间30min，电泳结果根据条带亮度，对产物进行分析。结果如图3所示，图中，泳道1：1kb Marker条带大小参照；泳道2、3：来自克雷伯杆菌属K5原端酶酶切效果图；泳道4：来自柠檬酸杆菌属RHBSTW原端酶酶切效果图；泳道5：来自大肠杆菌噬菌体YDC107_1原端酶酶切效果图；泳道6：阴性对照；泳道7：阴性对照。从图3可以看出，阴性对照是一条大于12kb的DNA条带，在酶切后形成了分别为5500bp和1300bp大小的DNA条带，并通过实施例4验证其产生的DNA末端是共价线性闭合末端状态，因此在具有切割连接活性的原端酶作用下，形成大量共价线性闭合末端片段核酸产物。
实施例4、共价闭合产物验证
方法一：将产物加入T7核酸外切酶后，30℃反应30min，形成共价闭合的产物将不会被切割降解掉。
结果如图4所示，图中，泳道1：空白对照；泳道2：1kb Marker条带大小参照；泳道3：双链线性未闭合产物；泳道4：T7核酸外切酶对双链线性未闭合产物反应产物；泳道5：dbDNA双链闭合线性产物；泳道6/7：T7核酸外切酶对dbDNA样品反应产物。
从图4可以看出：在T7核酸外切酶的作用下，两端未闭合的线性DNA会被其降解，图中泳道3-4所示，而两端形成共价闭合的产物将不会被切割降解掉，图中泳道5-7所示。
方法二：对产物进行纯化后98℃变性，随后对产物进行等温滚环扩增，形成共价闭合的产物将会变成单链环状模板进行扩增，产物则为线性双链长链DNA大片段。
结果如图5所示，图中，泳道1：空白对照；泳道2：1kb Marker条带大小参照；泳道3：未闭合双链DNA；泳道4：未闭合双链DNA加入T7核酸外切酶后反应结果；泳道5：变性后等温扩增产物，泳道6、7：变性后等温扩增产物加入T7核酸外切酶后反应结果。
从图5可以看出：具有共价闭合的产物在变性后形成单链环状，可以成为等温滚环扩增的模板，图中泳道5-7所示。
Claims (10)
1.具有切割连接活性的原端酶，其特征在于，所述的原端酶包含Domain 1和Domain 2序列，其中:
Domain 1的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示；
Domain 2的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的原端酶，其特征在于，所述的原端酶为与双序列Domain 1和Domain 2具有80％以上同源性的蛋白序列。
3.根据权利要求2所述的原端酶，其特征在于，所述的原端酶蛋白序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：5所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的原端酶在DNA合成、RNA合成或生物医药领域的应用。
5.一种具有共价闭合末端的双链DNA，其特征在于，所述的具有共价闭合末端的双链DNA是由一种或多种权利要求1-3任意一项所述的原端酶反应得到的。
6.一种权利要求5所述的具有共价闭合末端的双链DNA的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
1)制备反应体系：所述反应体系包含作为模板的双链DNA、一种或多种权利要求1-3任意一项所述的原端酶、盐离子缓冲液；
2)催化反应：将步骤1)所得反应体系在特定温度下孵育，所得产物即为具有共价闭合末端的双链DNA。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，作为模板的双链DNA为双链环状DNA或双链线性DNA。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，双链DNA模板的底物浓度为0.01pmol-100pmol。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的特定温度为20-60℃。
10.一种权利要求5所述的具有共价闭合末端的双链DNA在制备基因产品或靶向药物方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310373205.3A CN116606834A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 多种具有切割连接活性的原端酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310373205.3A CN116606834A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 多种具有切割连接活性的原端酶及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116606834A true CN116606834A (zh) | 2023-08-18 |
Family
ID=87675378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310373205.3A Withdrawn CN116606834A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 多种具有切割连接活性的原端酶及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116606834A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103080337A (zh) * | 2010-08-04 | 2013-05-01 | 触光基因学有限公司 | 利用回文序列生产闭合线性dna |
| CN104911177A (zh) * | 2009-01-30 | 2015-09-16 | 触光基因学有限公司 | 用于制备闭合线状dna的体外无细胞方法的试剂盒 |
| CN107532210A (zh) * | 2015-02-17 | 2018-01-02 | 塔驰莱特Ip有限公司 | Dna合成的方法 |
| CN109844134A (zh) * | 2016-08-16 | 2019-06-04 | 塔驰莱特Ip有限公司 | 闭合线性dna的生产 |
| CN112639110A (zh) * | 2018-06-22 | 2021-04-09 | 阿斯克肋匹奥生物制药公司 | 用于基因递送以在细胞内持续存在的载体 |
| CN115023503A (zh) * | 2020-01-31 | 2022-09-06 | 泰瑞斯疗法公司 | 生产闭合线性dna的方法 |
-
2023
- 2023-04-10 CN CN202310373205.3A patent/CN116606834A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104911177A (zh) * | 2009-01-30 | 2015-09-16 | 触光基因学有限公司 | 用于制备闭合线状dna的体外无细胞方法的试剂盒 |
| CN103080337A (zh) * | 2010-08-04 | 2013-05-01 | 触光基因学有限公司 | 利用回文序列生产闭合线性dna |
| CN107532210A (zh) * | 2015-02-17 | 2018-01-02 | 塔驰莱特Ip有限公司 | Dna合成的方法 |
| CN109844134A (zh) * | 2016-08-16 | 2019-06-04 | 塔驰莱特Ip有限公司 | 闭合线性dna的生产 |
| CN112639110A (zh) * | 2018-06-22 | 2021-04-09 | 阿斯克肋匹奥生物制药公司 | 用于基因递送以在细胞内持续存在的载体 |
| CN115023503A (zh) * | 2020-01-31 | 2022-09-06 | 泰瑞斯疗法公司 | 生产闭合线性dna的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "GenBank: EHJ4142174.1", GENBANK, 9 April 2021 (2021-04-09) * |
| "GenBank: MBD0794279.1", GENBANK, 15 September 2020 (2020-09-15) * |
| "GenBank: QLW43905.1", GENBANK, 16 May 2022 (2022-05-16) * |
| 蒋澄宇主编: "《中华医学百科全书 基础医学 生物化学与分子生物学》", 30 November 2022, 中国协和医科大学出版社, pages: 101 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2527438B1 (en) | Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases | |
| US11274333B2 (en) | Compositions and methods for preparing sequencing libraries | |
| JP2023519953A (ja) | クラス２のｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステム | |
| US20030152984A1 (en) | Method for the manufacture of DNA | |
| Kondo et al. | cDNA TRAP display for rapid and stable in vitro selection of antibody-like proteins | |
| JP2022522397A (ja) | 環状及び線状ｄｎａ分子を規則正しく構築する方法 | |
| US9695417B2 (en) | Method for large-scale synthesis of long-chain nucleic acid molecule | |
| CN116606834A (zh) | 多种具有切割连接活性的原端酶及其应用 | |
| CN102703400A (zh) | 热启动dna聚合酶及其应用 | |
| CN114990080B (zh) | 一种赖氨酸突变的热稳定核酸连接酶 | |
| US20240011000A1 (en) | Recombinant proteins with increased solubility and stability | |
| KR102152142B1 (ko) | Cas10/Csm4를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트 제조방법 | |
| CN111434771A (zh) | 一种线性化载体自重组的质粒构建方法 | |
| CN109371007A (zh) | 一种快速简便的基因合成方法 | |
| CN111117978B (zh) | 一种单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其使用方法 | |
| CN111088235B (zh) | 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseI及其使用方法 | |
| CN111088234B (zh) | 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法 | |
| KR102379659B1 (ko) | 핵산 또는 펩타이드 합성 시스템 | |
| WO2023189403A1 (ja) | Ｒｎａ／ｄｎａキメラプライマーを用いたｐｃｒ及びその増幅断片連結方法 | |
| CN115011578B (zh) | 一种强化型m-mlv逆转录酶突变体及其应用 | |
| CN113930405B (zh) | 一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用 | |
| KR102200330B1 (ko) | Cas10/Csm4 서브 복합체를 이용한 사이클릭 뉴클레오타이드 제조방법 | |
| CN116574710A (zh) | 具有链置换功能的dna聚合酶及其应用 | |
| CN111088236A (zh) | 一种单链RNA肽连接酶sRPlaseI及其使用方法 | |
| CN117965487A (zh) | 一种工程酶组合物及其制备方法、编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20230818 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |