CN112639110A - 用于基因递送以在细胞内持续存在的载体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于将核酸序列递送进靶细胞的载体。所述载体是非病毒DNA构建体。所述载体具有至少一个DD‑ITR以及与促进表达的调节元件可操作地连接的核酸序列的互补的拷贝。所述构建体具有带发夹结构的共价封闭末端，并随着受体细胞分裂在受体细胞中持续存在。向靶细胞递送所述载体引起核酸序列在靶细胞中的持续表达。还公开了具有至少一个合成的ITR的DNA载体构建体，其中，所述DNA构建体形成具有发夹共价封闭末端的线性DNA。还公开了生产所述构建体和引入靶细胞从而促进其中所含的核酸序列的持续表达的方法。进一步公开了含有所述载体的细胞及其群。

Description

用于基因递送以在细胞内持续存在的载体
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年6月22日提交的美国临时申请No.62/688,982、2018年6月25日提交的美国临时申请No.62/689,453、2018年7月13日提交的美国临时申请No.62/697,750以及2018年8月10日提交的美国临时申请No.62/717,310的权益，以引用的方式将它们的内容各自整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于核酸序列的无细胞生产、核酸序列向哺乳动物细胞中的引入和表达(例如用于基因疗法)的载体和方法的领域。
背景技术
期望以提供外源DNA编码的蛋白质的长期表达的方式引入外源DNA。已经开发了基于病毒的方案，其中使用病毒载体将外源DNA引入细胞，随后可使所引入的DNA整合到靶细胞的基因组中或保持游离。发现使用的基于病毒的载体包括逆转录病毒载体，例如基于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia viral)的载体、衍生自腺病毒的载体、衍生自腺相关病毒(AAV)的载体、衍生自HSV的载体、衍生自辛德毕斯(sindbis)的载体等。大量的兴趣集中在使用AAV载体上。最常见的血清型有12种。用于生产AAV载体的典型方法是使用表达AAV rep基因(需要rep来启动AAV的复制)和cap基因(需要cap来生产AAV)的细胞(例如昆虫细胞(如SF-9)或哺乳动物细胞)以用于形成病毒粒子，并将带有AAV反向末端重复(ITR)的质粒引入到这些细胞中，该AAV反向末端重复的侧翼具有含有与感兴趣的基因可操纵地连接的启动子的盒。还需要具有例如衍生自腺病毒或单纯疱疹病毒的病毒辅助基因的额外质粒来复制并获得用于转导的包装的AAV衣壳。然而，很难从AAV产物中完全消除辅助病毒，例如腺病毒。另外，使用病毒蛋白可能引起不需要的免疫应答。
因此，对以下方面持续关注：开发生产载体的其它方法，以及用外源核酸转染细胞，以提供编码的蛋白质或核酸(如治疗性蛋白质或核酸)的持续、长期表达。
发明内容
本发明的方面涉及体外无细胞环境以产生用于基因递送的载体，而无需辅助病毒。此种无细胞合成在用于载体生产方面更为容易和安全。然而，技术人员将理解的是，虽然本文所述的无细胞方法可优选用于治疗用途，但本文所述的载体也可在细胞(例如细菌细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞)内生产。
本发明的方面还涉及用于将核酸构建体引入靶细胞以进行持续表达的方法和载体构建体。一方面，该方法包括向靶细胞给予包含至少一个DD-ITR的共价封闭的线性非病毒DNA构建体(a covalently closed linear non-viral DNA construct)，所述至少一个DD-ITR包含：i)反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；ii)D’区域；iii)其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’的位置与所述A和A’区域邻近。在一个实施方式中，所述区域对应于细小病毒ITR(parvoviral ITR)，例如AAV A、A’、B、B’、C、C’和D区域。在一个实施方式中，ITR对应于细小病毒ITR，所述细小病毒ITR是野生型ITR、突变的ITR或合成的ITR。DNA载体构建体进一步包含含有盒的核酸构建体的互补链，所述盒包含与预定的DNA序列(其可退火成可表达的dsDNA)可操作地连接的启动子，其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA，并且其中，所述DNA构建体可在靶细胞中表达预定的DNA序列。在一个实施方式中，共价封闭的非病毒线性DNA构建体包含至少两个DD-ITR，例如如图1所示。
本发明的方面进一步涉及用于将预定的核酸序列(例如异源基因)递送至靶细胞中以进行持续表达的DNA载体。该DNA载体是共价封闭的非病毒线性DNA载体，以用于将预定的核酸递送至靶细胞中以进行持续表达，该DNA载体包含：a)至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含i)反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域，ii)D’区域，iii)其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’的位置与所述A和A’区域邻近；b)核酸构建体的互补链，所述互补链包含可退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；c)其中，所述DNA载体构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及d)其中，所述DNA载体构建体可在靶细胞中表达预定的DNA序列。在一个实施方式中，所述区域对应于细小病毒ITR，例如AAV A、A’、B、B’、C、C’和D区域。在一个实施方式中，ITR对应于野生型ITR、突变的ITR或合成的ITR。DNA载体构建体进一步包含含有盒的核酸构建体的互补链，所述盒包含与预定的DNA序列(其可退火成可表达的dsDNA)可操作地连接的启动子，其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA，并且其中，所述DNA构建体可在靶细胞中表达预定的DNA序列。在一个实施方式中，在表达预定的异源转基因(例如蛋白质或核酸)的共价封闭的非病毒线性DNA的情况下，所述载体包含至少两个DD-ITR，所述至少两个DD-ITR位于所述核酸的侧翼。图1的底部示出了此种载体的一个实施方式。载体是具有共价封闭的发夹末端的基本上互补的DNA。在一个实施方式中，D区域的长度为约20nt。D和D’区域可具有置换、插入和/或缺失，并保留有所述区域的至少5个核酸。在一个实施方式中，所保留的核酸可包含A和A’区域以及D和D’区域的切口产生位点(nicking site)和/或接合点(junction)。
本发明的方面进一步涉及用于将预定的核酸序列递送至靶细胞以进行持续表达的DNA载体。载体包含两个DD-ITR，所述DD-ITR各自包含：i)反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；ii)D’区域；iii)其中，所述D和D’区域是互补回文序列，且位置与所述A和A’区域邻近。载体进一步包含预定的核酸序列。在共价封闭的非病毒DNA(例如微环DNA，mini-circle DNA)的情况下(其中载体的大部分是非细菌序列)，两个DD-ITR位于核酸的侧翼。
本发明的方面涉及用于将核酸引入靶细胞以进行持续表达的方法，所述方法包括向靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体。DNA构建体包含选自于由图5所示的ITR所组成的组中的至少一个ITR序列、核酸构建体的互补链，其中所述核酸构建体包含预定的DNA序列，其中所述互补链可退火成可表达的dsDNA；并且其中，所述DNA构建体形成具有发夹共价封闭末端的线性DNA。
本发明进一步的方面涉及共价封闭的非病毒线性DNA(有时是封闭的线性DNA)用于生产包含构建体DNA的重组病毒颗粒的用途。这涉及将包含至少两个DD-ITR(例如参见图1)的封闭线性DNA构建体与载体或质粒一起添加到宿主细胞中，所述载体或质粒能够(1)表达使DD-ITR中的至少一个产生切口所必需的AAV Rep蛋白以及(2)表达形成能够将ITR和间插DNA序列(intervening DNA sequence)以壳体包裹的病毒粒子(病毒颗粒)所必需的细小病毒病毒衣壳蛋白(例如诸如AAV的依赖病毒)。在宿主细胞中，在Rep的存在下由自引发的ITR(self-primed ITR)启动DD-ITR的分解和复制，以产生可包装的载体基因组。优选地，间插DNA序列包含转基因序列，例如治疗性基因序列。产生切口的具体Rep蛋白(例如AAV ITR)通常来自相同的血清型(例如，AAV2 ITR与AAV2Rep78)，但可使用任何血清型，只要它们与当AAV ITR和AAV Rep蛋白来自同一血清型时的情况相比保留至少25％...35％...50％...65％...75％...85％...90％...95％...98％...100％或任何介于中间的百分比或更大百分比的切口产生效率。人们可使用这种方法来制备大量的含有ITR及其间插DNA序列(例如转基因)的病毒颗粒。使用含有DD-ITR的封闭线性载体更为有效，即，与不具有双D的封闭线性载体相比，它提供了包装基因组、感染性病毒颗粒的更高的产率，并且病毒颗粒不具有任何污染的质粒DNA。
人们可以用这种方法生产任何已知的AAV颗粒，例如包含合成的ITR或自互补二聚AAV序列(sc二聚体)等的AAV颗粒。技术人员知晓典型的AAV颗粒包装单链DNA基因组，但无法包装超过约5,000nt，因此在设计初始非病毒封闭线性DNA构建体时要注意可包装大小。在一个实施方式中，当需要自互补包装时，用作rAAV载体模板的初始非病毒封闭线性DNA构建体例如可具有Rep切口产生缺陷型ITR或发夹序列。参见例如美国专利7,465,583、7,790,154、8,361,457、8784799，以引用的方式将它们的内容整体并入本文。在一个实施方式中，模板为约1/2大小的模板，并且DD-ITR中的一个是不具备Rep切口产生能力(Rep-nickincompetent)的ITR。在一个实施方式中，切口产生缺陷型ITR或发夹序列位于两个具备Rep切口产生能力的DD-ITR之间，并且切口产生缺陷型ITR或发夹序列进一步位于转基因的有义序列和反义序列之间。无论哪种情况，在模板复制后，有义序列和反义序列都位于ITR之间的DNA的单链上，并且可对该载体基因组进行包装。
宿主细胞可能已经表达了Rep和病毒衣壳蛋白，或者人们可通过标准手段同时或大约同时对细胞进行共转染。本领域中使用的任何已知细胞类型均可用于该方法。例如，人们可使用哺乳动物细胞或昆虫细胞，例如杆状病毒。
还提供了包含本文所述载体的药物组合物。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，ITR序列在任一侧有互补序列D和D’作为侧翼。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D区域包含切口产生位点。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D区域的长度为约20nt。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述细小病毒是依赖病毒(dependovirus)。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述依赖病毒是AAV。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，预定的DNA/核酸序列与启动子可操作地连接。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，ITR充当启动子。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，启动子与ITR是分开的。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，DD-ITR驱动预定DNA/核酸序列的表达。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，同时保留所述区域的至少5个核酸。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，预定的DNA序列/核酸序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述功能性RNA选自于由用于CrisperCas 9重组的向导RNA、微小RNA(micro RNA)、RNAi、和shRNA所组成的组。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列/核酸之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，至少一个DD-ITR由AAV ITR、细小病毒ITR或合成的ITR生成。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述DNA构建体包含两个以上DD-ITR。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D区域来自与ITR不同的构造型。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，存在多个DD-ITR，并且所述DD-ITR中的一个或多个衍生自与另一个或其它DD-ITR不同的病毒血清型。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换和/或插入。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换和/或插入。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述DNA构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点(protelomerase binding site)，并且其中，共价封闭的末端由体外的原核端粒酶活性形成。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述DNA构建体在靶细胞内持续存在，并引起预定序列的持续表达(例如作为复制或重组的结果)。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述DNA构建体可在细胞中转化成多联体结构(concatemeric structure)。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述预定的DNA序列在靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述多联体结构在靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达(例如作为复制或重组的结果)。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述多联体结构在靶细胞染色体外(extra-chromosomally)持续存在。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述多联体结构整合到靶细胞染色体中。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述核酸是治疗性核酸。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述靶细胞在体外。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述靶细胞在体内。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，将所述构建体离体给予至靶细胞。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述靶细胞是遗传缺陷型细胞和/或患病细胞。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞(keratinocyte)、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
本发明的另一方面涉及通过本文所述的方法生产的细胞或其群。
定义
除非上下文另外明确指出，单数形式“一个/一种(a/an)”也旨在包括复数形式。
如本文所使用的，当提及可测量的值(例如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等的量)时，术语“约”意在涵盖所指定的量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或者甚至0.1％的变化。
如本文所使用的，“和/或”是指并涵盖相关所列项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时则没有组合。
如本文所使用的，术语“细小病毒(parvovirus)”涵盖细小病毒科(Parvoviridae)，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主性细小病毒包括细小病毒属、嗜红细胞病毒属(Erythrovirus)、浓核病毒属(Densovirus)、重复病毒属(Iteravirus)和康特拉病毒属(Contravirus)。示例性的自主性细小病毒包括但不限于：小鼠微小病毒(minute virus)、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒(felinepanlcukopenia virus)、猫细小病毒、鹅细小病毒、HI细小病毒、番鸭(muscovy duck)细小病毒、蛇细小病毒和B19病毒。其它自主性细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69章(第四版，Lippincott-Raven Publishers)。
依赖病毒属包括腺相关病毒(AAV)，包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、山羊AAV、蛇AAV、马AAV和绵羊AAV。参见例如图8至图19；FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69章(第四版，Lippincott-RavenPublishers)。
如本文所使用的，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV和任何现在已知或以后发现的其它AAV。参见例如FIELDS等，VIROLOGY，第2卷，第69章(第四版，Lippincott-Raven Publishers)。已经鉴定出许多相对新的AAV血清型和分支(参见例如，Gao等(2004)，J.Virol.78:6381；Moris等，(2004)Virol.33-:375)。
术语“反向末端重复”或“ITR”包括形成发夹结构并作为反向末端重复起作用(即介导所需功能，例如复制、整合和/或前病毒复苏(provirus rescue)等)的任何病毒末端重复或合成序列。ITR可为AAV ITR或非AAV ITR。例如，可将非AAV ITR序列(例如其它细小病毒(如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)的非AAV ITR序列)或SV40发夹(充当SV40复制起点)用作ITR，可进一步通过截短、置换、删除、插入和/或添加对ITR进行修改。此外，例如图5所示出的以及在美国专利No.9,169,494中所述的(以引用的方式将其内容整体并入本文)，ITR可为部分或全部合成的。通常，ITR为145个核苷酸。末端125个核苷酸形成回文双链T形发夹结构。在该结构中，A-A’回文形成茎，并且两个较小的回文B-B’和C-C’形成T的横臂(cross-arms)。D序列中的其它20个核苷酸保持单链。在AAV基因组的情况下，可存在两个ITR，在基因组的每个末端各一个，并且每个ITR均可有单个D序列(D或D’)。
DD-ITR与其所衍生自的ITR具有相同的序列，但DD-ITR包含与A序列邻近的第二D序列，因此存在D和D’。D和D’可退火(例如，如美国专利No.5,478,745中所述，以引用的方式将其内容并入本文)。每个D的长度通常为约20nt，但可小至5个核苷酸。较短的D区域保留了A-D接合点(例如，通过在保留A-D接合点的3’末端的删除而产生)。优选地，D区域保留切口产生位点和/或A-D接合点。DD-ITR通常为约165个核苷酸。DD-ITR具有提供顺式信息以复制DNA构建体的能力。因此，DD-ITR具有反向的回文序列，其以D和D’元件作为侧翼，例如5’至3’的的(+)链序列5’-DABB’CC’A’D’-3’、以及与5’至3’序列为5’-DACC’BB’A’D’-3’的(+)链互补的(-)链，所述链可形成霍利迪(Holliday)结构(例如如图1所示)。在某些实施方式中，DD-ITR在其组件(例如A-C)中可能有缺失，然而仍保留D和D’元件。在某些实施方式中，ITR包含缺失，然而仍保留形成霍利迪结构的能力并保留D元件的两个拷贝(D和D’)。DD-ITR可由天然AAV ITR生成或从合成的ITR生成。在某些实施方式中，在B区域元件中存在缺失。在某些实施方式中，在C区域元件中存在缺失。在某些实施方式中，在ITR的B和C元件中均存在缺失。在一个实施方式中，将整个B和/或C元件删除，例如用单个发夹元件替换。
“AAV反向末端重复”或“AAV ITR”可来自任何AAV，包括但不限于血清型1、血清型2、血清型3a、血清型3b、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、或血清型13、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、或者任何现在已知或以后发现的其它AAV(参见例如表1)。只要末端重复介导所期望的功能(例如复制或整合)，AAV ITR不必具有天然末端重复序列(例如可通过插入、删除、截短和/或错义突变对天然AAV ITR序列进行改变)。
如本文所使用的，术语“合成的ITR”是指归因于一种或多种删除、添加、置换或它们的任何组合而在核苷酸序列方面与野生型ITR(例如AAV血清型2ITR(ITR2)序列)不同的非天然存在的ITR。合成的ITR和野生型ITR(例如ITR2)序列之间的差异可能只为单核苷酸变化，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、60、70、80、90或100个或更多个核苷酸或其中的任意范围的变化。在一些实施方式中，合成的ITR和野生型ITR(例如ITR2)序列之间的差异可不超过约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸或其中的任意范围。
在本发明的一些实施方式中，D区域衍生自与A、B和C区域不同的血清型。
术语“核苷酸序列”和“核酸”、DNA序列在本文中可互换使用，并且是指将被递送到靶细胞中的序列。通常，核酸包含编码感兴趣的多肽或非翻译RNA(例如用于递送至细胞或受试者)的开放阅读框。核酸序列可进一步包含调节序列，其组合可称为转基因或表达构建体。优选地，核酸是异源的，即不是与ITR一起天然存在的(例如在ITR从其中衍生而来的病毒中不是天然存在的)。将此类核酸称作异源的。
“启动子”是启动和调节多核苷酸转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达可由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、阻遏型启动子(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等阻遏)、以及组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”旨在包括全长启动子区域以及这些区域的功能性(例如控制转录或翻译)区段。
“可操作地连接”是指元件的排列，其中，如此描述的组件被配置为执行其通常的功能。因此，当存在恰当的酶时，与核酸序列可操作地连接的给定启动子能够实现该序列的表达。启动子不必与序列邻接，只要它起到指导其表达的功能即可。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可存在未翻译但被转录的间插序列，并且仍然可认为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。因此，术语“可操作地连接”旨在涵盖在转录复合物识别启动子元件时允许启动感兴趣的DNA序列的转录的、启动子元件和感兴趣的DNA序列的任何间隔或方向。
原核端粒酶(protelomerase)靶序列是如下的任何DNA序列：其在DNA模板中的存在允许通过原核端粒酶的酶促活性将该序列转化为封闭线性DNA的任何DNA序列。换句话说，原核端粒酶靶序列是双链DNA通过原核端粒酶进行切割和重新连接以形成共价封闭的线性DNA所必需的。
通常，原核端粒酶靶序列包含任何完美回文序列(即具有双重旋转对称性的任何双链DNA序列)，本文也将其描述为完美反向重复。如美国专利No.9,109,250中所示(以引用的方式将其内容整体并入本文)，来自各种嗜温噬菌体(mesophilic bacteriophages)的原核端粒酶靶序列和细菌质粒均共享包含完美反向重复的共同特征。完美反向重复的长度取决于具体的生物体而不同。在伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)中，完美反向重复的长度为14个碱基对。在各种嗜温噬菌体中，完美反向重复的长度为22个碱基对或更长。另外，在一些情况(例如大肠杆菌N15)中，中央完美反向回文序列以反向重复序列作为侧翼，即形成较大的不完美反向回文序列的一部分。
本文使用术语“链置换(strand displacement)”来描述在DNA合成过程中遇到双链DNA区域时，DNA聚合酶替换互补链的能力。
如本文所使用的，与将核酸(例如模板、DNA)递送至宿主系统(例如无细胞或细胞)有关的术语“接触”广义上是指将核酸(例如DNA模板或质粒模板)放置进宿主系统中以使其存在于宿主系统中。不太广义地，接触是指将模板或质粒模板放置在本文所述的宿主系统中的任何合适的方式。可通过将模板适当地运输到细胞内部以便使得例如由宿主细胞机构产生环状核酸的此种方式来进行接触。此种接触可包括例如转化、转染、电穿孔或脂质转染。
附图说明
图1是对通过原核端粒酶活性产生本发明的共价封闭线性DNA载体构建体的实施方式的说明。原核端粒酶与原核端粒酶结合位点结合，切割并连接两条链以产生共价封闭末端，在连接部分留下部分原核端粒酶结合位点。在这一实施方式中，部分原核端粒酶结合位点位于两个DD-ITR的侧翼，两个DD-ITR位于预定序列(例如编码蛋白质或核酸序列的转基因)的侧翼。载体是在其自然状态下(退火的)具有发夹末端的共价封闭线性双链载体，并且能够在靶细胞中表达转基因。如果载体完全变性，它将形成单链共价封闭环，该环在一条邻接的共价封闭单链DNA上具有互补的转基因序列；在复性后，互补序列将重新退火。这与可表达转基因的共价封闭环状双链DNA分子(例如质粒DNA，其中变性时，表达转基因的互补序列位于单独的单链共价封闭分子上)相反。
图2是对可在体内发生的本发明的DNA载体构建体的一个实施方式的重组的说明，产生了在细胞内持续存在的多联体结构，并引起持续的基因表达。
图3是对本发明的DNA载体构建体的实施方式的说明，示出了在不存在AAV Rep蛋白的情况下体内的DD-ITR分解，以产生在分解后可在体内连接或在体内自我复制的结构，例如形成单体和多联体结构，从而引起持续的基因表达。
图4是对通过原核端粒酶活性产生本发明的共价封闭DNA载体构建体的另一实施方式的说明。原核端粒酶与原核端粒酶结合位点结合，切割并连接两条链以产生共价封闭末端，在连接部分留下部分原核端粒酶结合位点。此类构建体也可在细胞中重组。
图5列出了用于本发明的嵌合ITR。ITR2、ITR5、ITR5+2SNS、ITR2+5SNS、ITR5+2NS、ITR2+5NS、ITR2-TA、ITR5+TA、ITR2-GC、ITR5+GC、ITR2-2nt、ITR2 5nt、ITR2+7、ITR2 9nt、ITR2 10nt、ITR2 11nt、ITR2 15nt、ITR5 3nt、ITR5 Ent、ITR5 9bp NS、ITR5 21nt、ITR530nt、ITR5 GAGY、ITR5无GAGY、ITR2+8nt GAGY、ITR5间隔区RBE、ITR2+8-8间隔区RBE、具有ITR2发夹的ITR5、无发夹的ITR2、ITR2 T1、ITR2 T2、ITR2 T2#2、ITR2 T3、ITR2 T4、ITR5+3nt间隔区&ITR5 NS、以及ITR2 pHpa8。这些ITR最初在美国专利9,169,494中被公开，以引用的方式将其内容整体并入本文。
图6是对将PCR扩增的和EcoRI剪切的双D克隆到质粒pGEM-3'Z的EcoRI位点中的说明。
图7为病毒颗粒的制备示意图。
图8示出了原核端粒酶靶位点telRL。感染后噬菌体N15的DNA由环状DNA组成，其包含端粒分解位点telRL。该位点是回文，以telR和telL作为左右臂。箭头标示出了回文中的反向重复(每个28bp)和中断点(dots interruption)。中央的22-bp回文telO是通过原核端粒酶TelN进行识别和切割所必需的。它切割telO内的DNA，并连接所产生的末端，以在任一末端形成两个共价封闭的发夹。28-bp的telR和telL序列也指定了线性N15原噬菌体DNA的末端(“狗骨头”)。
图9A-图9C示出了从微型lc-DNA表达EGFP所预期的结果。(图9A)在质粒pDD3(左)中，两个telRL位点位于EGFP的转录单元的侧翼。pDD3与原核端粒酶的反应产生两个线性封闭线性DNA片段，表达EGFP的微型lc-DNA(右)和载体骨架(未示出)。将原核端粒酶靶位点内的两个MunI识别位点用于产生相同大小的微型lo-DNA作为对照。(图9B)使微型lc-DNA(lc)和微型lo-DNA(lo)制品的等分试样(各0.2μg)经受1.2％琼脂糖凝胶电泳。用TelN(lc)或MunI(lo)将亲本质粒(ccc)剪切成两个相同长度的片段(级分I)。然后，使用HaeII消化载体骨架(级分II)，并纯化微型DNA(级分III)。可通过用HaeII处理来验证载体DNA的缺失，以测试载体衍生的消化产物。在微型DNA消化后将PstI用于测试残留的载体片段(级分III)。为了证明PstI仅剪切亲本ccc-DNA一次，将亲本质粒(ccc)涵盖在内。(图9C)分别用含有微型lc-DNA(lc)、微型lo-DNA(lo)或亲本DNA(ccc)(各6nmol)的DNA(总共0.7μg)，对HEK293细胞进行瞬时转染。作为对照，使用载体(c)。通过用EGFP-CNK.CT表达质粒(pEGFPc2-CNK.CT，0.35μg)共转染来控制转染效率。用载体DNA来调节DNA的总量。转染后48h，通过Western印迹分析确定EGFP和EGFP-CNK.CT的存在。标示出了代表EGFP和EGFP-CNK.CT的预期带。
图10示出了当发生含有至少一个DD-ITR的亲本质粒DNA载体的条件加工时的预期结果，所述DD-ITR进一步包含与预定DNA序列可操作地连接的启动子(图10A)。R细胞将亲本质粒条件加工成微型DNA载体。在诱导条件下，R细胞引起微型lcc(Tel细胞)和微型ccc(Cre细胞)DNA的产生(图10B)。将亲本质粒构建体加工成微型lcc和微型cc载体。在诱导(42℃)条件下从R细胞中提取质粒后，将质粒加工成1cc微型载体(Tel)和ccc微型载体(Cre)的效率。与各代表性带相邻的示意图示出了它们代表的预期质粒和预期构象(图10C)。相对于TelN/telRL的体内Tel/pal重组效率。在Tel+R细胞与TelN+R细胞中将pDD4质粒加工成lcc微型载体的效率。
图11呈现了用于制造环状核酸的示例性示意图，所述环状核酸在5’至3’方向上具有BAMHI限制位点、F1 ORI、DD-ITR(突变型)、与转基因连接的启动子(以红色星号标示出)、DD-ITR(突变型)、与转基因连接的启动子(以红色星号标示出)、DD-ITR(突变型)和HINDIII限制性位点，并具有通过限制性位点在每个末端连接的衔接子序列。通过用BAMHI和HINDIII限制性酶剪切从质粒切除质粒片段。衔接子序列与质粒片段连接，形成模板。模板可在体外或体内复制，例如在大肠杆菌细胞、细胞提取物(例如大肠杆菌细胞提取物)或细菌包装细胞中。本文所示的从5’至3’的元件(例如切割位点、ORI、ITR或与转基因连接的启动子)的示例性顺序并不意味着是限制性的，应理解的是所述元件可处于从5’至3’的任何顺序。
图12呈现了用于制造环状核酸的示例性示意图，所述环状核酸在5’至3’方向上具有BAMHI限制性位点、F1 ORI、DD-ITR(突变型)、与转基因连接的启动子(以星号标示出)、DD-ITR(突变型)和HINDIII限制性位点，并具有通过限制性位点在每个末端连接的衔接子序列。通过用BAMHI和HINDIII限制性酶剪切从质粒切除质粒片段。衔接子序列与质粒片段连接，形成模板。模板可在体外或体内复制，例如在大肠杆菌细胞、细胞提取物(例如大肠杆菌细胞提取物)或细菌包装细胞中。本文所示的从5’至3’的元件(例如切割位点、ORI、ITR或与转基因连接的启动子)的示例性顺序并不意味着是限制性的，应理解的是所述元件可处于从5’至3’的任何顺序。
图13呈现了用于制造环状核酸的示例性示意图，所述环状核酸在5’至3’方向上具有BAMHI限制性位点、F1 ORI、PVUII限制性位点、DD-ITR(突变型)、与转基因连接的启动子(以星号标示出)、DD-ITR(突变型)和HINDIII限制性位点，并具有通过限制性位点在每个末端连接的衔接子序列。通过用BAMHI和HINDIII限制性酶剪切从质粒切除质粒片段。衔接子序列与质粒片段连接，形成模板。模板可在体外或体内复制，例如在大肠杆菌细胞、细胞提取物(例如大肠杆菌细胞提取物)或细菌包装细胞中。复制后，用PVUII限制性酶进一步剪切环状核酸，除去衔接子序列和ORI，得到一个开放末端和一个封闭末端。本文所示的从5’至3’的元件(例如切割位点、ORI、ITR或与转基因连接的启动子)的示例性顺序并不意味着是限制性的，应理解的是所述元件可处于从5’至3’的任何顺序。
图14呈现了制造自互补单链DNA载体的示例性示意图，所述单链DNA载体在5’至3’方向上具有F1 ORI、DD-ITR(突变型)、与转基因连接的启动子(以星号标示出)、DD-ITR(突变型)、与转基因连接的启动子(以星号标示出)、DD-ITR(突变型)、发夹序列、互补的DD-ITR(突变型)、与转基因连接的互补启动子(以星号标示出)、互补的DD-ITR(突变型)、与转基因连接的互补启动子(以星号标示出)、互补的DD-ITR(突变型)和ORIΔ29。这一方法使用细菌包装细胞和辅助噬菌体。星号标示出了互补序列，例如互补TR或转基因序列。本文所示的从5’至3’的元件(例如切割位点、ORI、ITR或与转基因连接的启动子)的示例性顺序并不意味着是限制性的，应理解的是所述元件可处于从5’至3’的任何顺序。
具体实施方式
本发明的方面涉及用于将预定的核酸序列递送至靶细胞以进行持续表达的DNA载体。DNA载体包含至少一个DD-ITR和预定的核酸序列/构建体(例如调节序列，如与预定的DNA序列(例如异源核酸)可操作地连接的启动子，所述预定的DNA序列可退火成可表达的dsDNA)。DNA载体是共价封闭的线性非病毒DNA构建体。DNA载体可在靶细胞中进一步自我复制和/或重组(例如当靶细胞分裂时)。用于将核酸递送至细胞的具有至少一个DD-ITR的DNA载体构建体是具有共价封闭的发夹末端的线性DNA，而非质粒DNA(即不是DD-ITR质粒)。在一个优选的实施方式中，共价封闭的线性DNA载体包含两个DD-ITR(例如，如图1所示)。
ITR(反向末端重复)通常具有互补回文序列的区域(其可退火)，以及间插间隔区序列，允许形成T或Y结构。此类区域在本领域中是已知的，并在本文中成为A、A’、B、B’、C、C’和D区域(例如，如美国专利No.5,478,745中所述)。在AAV ITR的情况中，D区域为基因组的单链部分。DD-ITR具有与ITR的D区域互补的额外的D’区域(另外参见Xiao等，J.Virologyvo.71(2).1997:p941-948，以引用的方式将其整体并入本文)。
在一些实施方式中，存在两个DD-ITR，其位置使得它们位于预定的核酸序列/构建体的侧翼(例如观察时如图1底部所示)。在一些实施方式中，DD-ITR中的至少一个是AAVITR。
在一些实施方式中，DNA构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点(例如，诸如在体外通过原核端粒酶活性产生共价封闭末端后留下的)。
在一个优选的实施方式中，共价封闭的非病毒DNA构建体包含两个DD-ITR，例如如图1的底部所示。虽然图1示出了原核端粒酶结合位点的一半，但是包含两个DD-ITR的共价封闭的非病毒DNA构建体不必包含原核端粒酶结合位点。
在本发明的实施方式中，位于启动子(+链)的5’末端和DD-ITR之间有至少2个核苷酸作为间隔区。这些间隔区防止DD-ITR抑制启动子功能。间隔区可大于2个核苷酸，例如5个以上核苷酸。在一个实施方式中，间隔区为至少10个核苷酸，在一个实施方式中，间隔区为20个核苷酸或更多，或25个核苷酸或更多。在一个实施方式中，间隔区为5个-50个核苷酸。在优选的实施方式中，间隔区为20个核苷酸。
在本发明的实施方式中，载体中没有启动子，并且DD-ITR充当启动子，以驱动预定的DNA核酸的表达。在一些实施方式中，位于预定的核酸(+链)的5’末端和DD-ITR(D区域)之间有至少2个核苷酸作为间隔区。间隔区可大于2个核苷酸，例如5个以上核苷酸。在一个实施方式中，间隔区为至少10个核苷酸，在一个实施方式中，间隔区为20个核苷酸或更多，或25个核苷酸或更多。在一个实施方式中，间隔区为5个-50个核苷酸。
在本发明的实施方式中，DNA构建体/载体缺乏编码AAV Rep蛋白(例如，对应于DD-ITR从中衍生而来的AAV的Rep蛋白)的序列。
在一些实施方式中，DNA构建体/载体的序列的大部分是哺乳动物DNA而不是细菌DNA。构建体是表达异源核酸的封闭线性双链DNA，而不是可表达异源基因的封闭环状双链质粒DNA。
ITR可来自任何细小病毒，例如诸如AAV的依赖病毒。已知许多AAV血清型。参见例如以下表1。
Figure BDA0002947054230000181
Figure BDA0002947054230000191
Figure BDA0002947054230000201
Figure BDA0002947054230000211
Figure BDA0002947054230000221
在实施方式中，DNA构建体/载体(例如通过复制或重组和/或多联体形成)在靶细胞中持续存在(例如延长的时间段)。这可通过靶细胞分裂时的自我复制和/或多联体形成或两者相组合发生。在本发明的实施方式中，将DNA构建体/载体转化为靶细胞内的多联体结构。在实施方式中，多联体结构(例如通过复制或重组)在靶细胞中持续存在(例如延长的时间段)。多联体结构的持续存在可以是染色体外的(例如作为微型染色体(mini-chromosome))或通过整合进入到靶细胞染色体中。
本发明的另一方面涉及用于将核酸构建体引入靶细胞中以进行持续表达的方法。所述方法包括向靶细胞给予本文所述的共价封闭的非病毒DNA构建体。向靶细胞的给予可以是体外、体内或离体的。将DNA构建体成功引入靶细胞促进核酸构建体的表达。在某些实施方式中，DNA构建体复制或整合到靶细胞基因组中的能力使得表达得以持续。
本发明的另一方面涉及用于通过给予共价封闭的非病毒DNA构建体将核酸引入靶细胞中以进行持续表达的方法，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含至少一个ITR序列和核酸构建体的互补链，所述互补链退火成可表达的线性的dsDNA。该DNA构建体与上述构建体相似，这是因为它形成具有发夹共价封闭末端的线性DNA。它可进一步包含部分原核端粒酶识别序列(反映出它是通过原核端粒酶活性产生的)。ITR是合成的ITR，例如图5所示的合成的ITR。ITR序列可进一步包含位于发夹结构任一侧的D和D’序列两者，如本文所述。
本发明的另一方面涉及细胞或其群，所述细胞或其群通过引入本文所述的DNA构建体产生。所述群的很大一部分接受DNA构建体并表达编码的核酸。在实施方式中，所述群的至少10％的细胞表达引入的核酸。在实施方式中，至少20％、30％、40％、50％或更多表达引入的核酸。在实施方式中，所述群中的至少60％、70％、80％或更多的细胞表达引入的核酸。
本文所述的方法和DNA构建体/载体促进预定的核酸在靶细胞或其群中的持续表达。持续表达是指给予本发明的载体后，编码的产物(例如蛋白质或核酸)的表达处于持续延长的时间段(如果不是无限期)的可检测的水平。延长的时间段是指1周-5周、2周-5周、3周-5周、4周-5周、至少5周、至少6周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月、1-12个月、1-10年、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年或更长。可检测的水平是指编码产物的表达处于下述的水平：该水平使得人们可在靶细胞或包含靶细胞的哺乳动物中(例如在哺乳动物的血清中)检测到治疗浓度的编码产物。与使用pBluescript质粒载体(Stratagene Corporation，La Jolla，Calif.)的对照相比，按照本发明的方法，蛋白质表达以可检测的水平持续与对照相比至少约2倍(通常至少约5倍、更通常至少约10倍)的更长的时间段。如果可使用本领域技术人员容易获得和公知的技术和方案检测到编码产物，则认为该编码产物处于可检测的水平。
在一些实施方式中，上述持续表达不仅处于可检测的水平，而且处于高水平。在其给予后的一段时间(例如至少约28天)后，如果由载体表达盒编码的蛋白质或核酸以高水平在宿主中(例如在靶细胞中、在宿主的血清中等)存在，则认为最小载体提供了高水平表达。出于本发明的目的，如果编码产物的水平以使其在宿主中表现出可检测的活性(例如对表型有影响，如治疗活性)的量存在，则认为该编码产物的水平是“高”的。特定产物的表达水平是否高必然会根据特定产物的性质而变化，但可例如通过评估产物的表达是否足以表现出对宿主表型的期望作用(例如改善疾病症状)而由本领域技术人员容易地确定。
共价封闭末端的产生
本文所述的DNA构建体的共价封闭末端可通过包括体外无细胞合成在内的多种已知方法产生。产生共价封闭末端的一种方法是在前体分子中引入原核端粒酶结合位点，并使该分子暴露于原核端粒酶，从而在该位点切割和连接DNA。无细胞体外合成的非限制性实例例如在如下中进行了描述：US 9,109,250；US 6,451,563；Nucleic Acids Res.2015 Oct15；43(18):e120；US 9499847；15/508,766；PCT/GB2017/052413；以及Antisense&nucleicacid drug development 11:149–153(2001)；通过引用的方式将它们整体并入本文。
人们可以设计重组AAV DNA模板，所述模板具有在包含原核端粒酶位点(例如telRL，参见图8)的不完美回文结构中一起具有野生型ITR、合成的ITR、或DD ITR序列、或它们的组合。将该模板用于生产封闭线性载体。
在一个实施方式中，病毒载体模板包含野生型ITR，例如其可具有缺失、插入或置换。在一个实施方式中，载体模板包含至少一个合成的ITR(例如，非限制性实例是图5中描述的合成的ITR)、表达盒，以及端粒酶靶位点位于ITR每一侧的侧翼，其可通过端粒酶进行切割，从而共价地封闭末端。在一个实施方式中，该载体包含两个DD ITR、表达盒，并且端粒酶靶位点位于DD ITR每一侧的侧翼，其可通过端粒酶进行切割并共价地封闭末端。
本文可使用原核系统。在溶原性细菌中，噬菌体N15以具有共价封闭末端的线性染色体外DNA存在(参见Rybchin VN，Svarchevsky AN(1999)The plasmid prophage N15:alinear DNA with covalently closed ends.Mol Micro-biol 33:895–903)。该DNA通过切割-连接(cleaving-joining)反应产生，该反应通过单个酶原核端粒酶(例如TelN(原核生物的端粒酶))发挥作用[Deneke J，Ziegelin G，Lurz R，Lanka E(2000)Theprotelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joiningactivity.Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721–7726]。原核端粒酶(如TelN)识别双链DNA中的靶序列。靶位点是称为telRL的不完美回文结构(参见图8)，该结构由telR和telL两部分组成，对应于线性原噬菌体(prophage)的共价封闭末端。该酶切割两条DNA链，并连接所得末端以形成共价封闭的发夹结构。所得DNA分子具有两个发夹环(图8)。TelN能够使带有telRL位点的重组质粒线性化[Deneke J，Ziegelin G，Lurz R，Lanka E(2000)Theprotelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joiningactivity.Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721–7726]。因此，可在质粒DNA上使用此种酶，以用于在高等生物中表达。
在一个实施方式中，本文提供了在可用于制备rAAV病毒的体内细胞系统中有效生产rAAV封闭线性DNA的方法。所述方法包括使用表达原核端粒酶(如TelN)或其它原核端粒酶的细胞，其中，原核端粒酶基因处于可调节的启动子的控制之下。例如，诱导型启动子(例如小分子调节的启动子)或温度敏感型启动子(例如热激启动子)。在充分产生AAV模板DNA后，可允许对原核端粒酶进行表达，其将从模板(例如含有双D、合成的或AAV ITR)中切除封闭线性AAV基因组。在替代的实施方式中，可通过已知方式将原核端粒酶添加到细胞中。然后，在转染方案中可使用包含ITR的封闭线性AAV基因组代替质粒DNA，以制造rAAV病毒。封闭线性基因组在每个末端包含1/2的原核端粒酶结合位点。
在某些实施方式中，将体内细胞系统用于生产用于将预定的核酸序列递送至靶细胞中来进行持续表达的非病毒DNA载体构建体。所述非病毒DNA载体包含：两个DD-ITR，所述DD-ITR各自包含反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；D’区域；以及，其中，所述D和D’区域是长度为约5nt-20nt的互补回文序列，且位置与所述A和A’区域邻近；预定的核酸序列(例如用于表达的异源基因)；其中，在共价封闭的非病毒DNA的情况下，两个DD-ITR位于所述核酸的侧翼，并且其中封闭的线性载体在每个末端包含1/2的原核端粒酶结合位点。
通过使含有一个telRL位点的亲本质粒线性化或通过切除rAAV DNA片段或非病毒载体片段，本文所述的TelN/telRL系统可用于产生封闭线性DNA片段，所述封闭线性DNA片段包含启动子、感兴趣的基因、来自亲本质粒的多聚腺苷酸化信号以及两个侧翼ITR，还具有两个位于各自区段侧翼的telRL位点。在一个实施方式中，存在至少一个双“D”ITR。所得的线性共价封闭的DNA分子在体内是功能性的。
所述系统包含重组宿主细胞。用于本生产系统的合适的宿主细胞包括微生物细胞(例如细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞)和酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))。也可使用哺乳动物宿主细胞，包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如K1谱系(ATCC CCL 61)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括Pro5变体(ATCC CRL 1281)；衍生自SV40转化的的非洲绿猴肾的成纤维细胞样细胞，CV-1谱系(ATCC CCL 70)、COS-1谱系(ATCC CRL 1650)和COS-7谱系(ATCC CRL 1651)；鼠L-细胞；鼠3T3细胞(ATCC CRL 1658)；鼠C127细胞；293谱系(ATCCCRL 1573)的人胚肾细胞；人癌细胞，包括HeLa谱系(ATCC CCL 2)的人癌细胞；以及IMR-32系(ATCC CCL 127)、SK-N-MC系(ATCC HTB 10)和SK-N-SH系(ATCC HTB 11)的神经母细胞瘤细胞。
将宿主细胞设计为编码至少一种重组酶。还可将宿主细胞设计为编码两种或多种重组酶。术语“重组酶”是指通过切除/插入、倒置、易位和交换而在特定靶位点(例如回文序列)处催化DNA交换的酶。用于本系统的合适的重组酶的实例包括但不限于TelN、Tel、Tel(gp26 K02噬菌体)Cre、Flp、phiC31、Int和其它λ形(1ambdoid)噬菌体整合酶(例如phi 80、HK022和HP1重组酶)。这些重组酶各自的靶序列分别为：
telRL位点
(SEO ID NO：31)
Figure BDA0002947054230000261
pal位点
(SEQ ID NO：32)
Figure BDA0002947054230000262
Figure BDA0002947054230000263
telRL位点
(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0002947054230000264
loxP位点
(SEQ ID NO：33)
Figure BDA0002947054230000265
FRT位点
(SEQ ID NO：34)
Figure BDA0002947054230000266
phiC31 attP位点
(SEQ ID NO：35)
Figure BDA0002947054230000271
λattP位点
(SEQ ID NO：36)
Figure BDA0002947054230000272
重组酶的表达受任何调节型或诱导型启动子(即在特定物理或化学条件或刺激物下被激活的启动子)的控制。合适的启动子的实例包括热调节的启动子(例如λpL启动子)、IPTG调节的lac启动子、葡萄糖调节的ara启动子、T7聚合酶调节的启动子、冷激诱导型cspA启动子、pH诱导型启动子，或它们的组合(例如tac(T7和lac)双重调节的启动子)。
重组细胞还引入至少一个DD-ITR和适于表达感兴趣的核酸的表达盒。含有DD-ITR的表达载体包含调节表达序列(例如启动子、起始序列和终止序列)以及感兴趣的核酸序列，所述感兴趣的核酸序列处于相对于调节序列的适当的位置以便使该感兴趣的核酸的表达得以发生，即，将感兴趣的核酸可表达地包含在表达载体以及至少一个侧翼DD-ITR，优选在两端均以DD-ITR作为侧翼。在一个实施方式中，DD-ITR中的一个可作为启动子。调节表达序列和感兴趣的核酸序列(即表达盒)在任一侧以至少第一重组酶的靶序列(例如靶核酸序列)作为侧翼。
产生共价封闭末端的替代方法在本领域中是已知的，例如通过从质粒形成微环DNA(mini-circle DNA)(例如，如美国专利8,828,726和美国专利7,897,380中所述，以引用的方式将它们的内容各自整体并入)。例如，一种DD载体的无细胞合成方法将Phi29 DNA聚合酶和原核端粒酶这两种酶联合使用，并生成高保真性的共价封闭线性DNA构建体。该构建体不含抗生素抗性标记，因此消除了这些序列的包装。该方法可在两周的过程内以商业规模扩增DD-AAV构建体，并使病毒产生所需的ITR序列得以保持。
通过滚环扩增，使用Phi29 DNA聚合酶来扩增双链DNA，并使用原核端粒酶来产生共价封闭线性DNA，其与流线化的纯化方法相结合，产生仅含有感兴趣的序列的纯DNA产物。
Phi29 DNA聚合酶具有高的保真性(1/106–1/107)和高的持续合成能力(约70kbp)。这些特征使该聚合酶特别适合大规模生产GMP DNA。原核端粒酶(也称为端粒解离酶)催化线性DNA上的共价封闭的发夹末端的形成，并已在一些噬菌体、细菌质粒和细菌染色体中得到确定。一对原核端粒酶识别反向回文DNA识别序列，并催化链断裂、链交换和DNA连接以产生封闭的线性发夹末端。这些末端封闭结构的形成使得DNA对核酸外切酶活性具有抗性，允许简单纯化并且可改善表达的稳定性和持续时间。
在合成的一个实施方式中，DD构建体的生产取决于位于感兴趣的区域的侧翼的原核端粒酶识别序列的引入。这些位点是对特定的原核端粒酶具有高度特异性的回文序列(例如56bp)。原核端粒酶蛋白与这些位点结合以进行切割-连接反应，产生单体的双链、线性、共价封闭的DNA构建体。也通过该酶对感兴趣的基因以外的DNA(例如原始的载体骨架)进行类似地加工，可通过限制性酶在载体骨架特有的限制性位点的剪切以及所释放的片段的核酸外切酶消化的相继作用来除去这些区域，仅留下含有DD区域的期望的共价封闭的线性DNA。
变性时，DD构建体包含环状DNA分子，其可用作进一步扩增反应的起始材料。
原核端粒酶结合位点
在一个实施方式中，DNA构建体包含原核端粒酶结合位点，并且共价封闭末端由原核端粒酶酶活性(例如体外)形成。在美国专利No.9,499,847和美国专利No.9,190,250中提供了用于本发明的原核端粒酶结合位点和相应的原核端粒酶，通过引用的方式将它们的内容各自整体并入本文。优选地，本发明所使用的原核端粒酶靶序列包含长度为至少14个碱基对的双链回文(完美反向重复)序列。优选的完美反向重复序列包括序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6以及它们的变体。SEQ ID NO:1(NCATNNTANNCGNNTANNATGN)是嗜温噬菌体完美反向重复的22个碱基的共有序列。完美反向重复的碱基对在不同噬菌体之间的某些位置上是保守的，而在其它位置上可能具有序列灵活性。因此，在本发明的方法中，SEQ ID NO：1是与噬菌体原核端粒酶一起使用的完美反向重复序列的最小共有序列。
在由SEQ ID NO：1定义的共有区中，SEQ ID NO：2(CCATTATACGCGCGTATAATGG)是与大肠杆菌噬菌体N15和克雷伯氏菌噬菌体Phi KO2(Klebsiella phage Phi KO2)原核端粒酶一起使用的特别优选的完美反向重复序列。同样，在由SEQ ID NO：1定义的共有区中，SEQID NO：3至SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：3(GCATACTACGCGCGTAGTATGC)、SEQ ID NO：4(CCATACTATACGTATAGTATGG)、SEQ ID NO：5(GCATACTATACGTATAGTATGC))是分别与来自耶尔森氏菌噬菌体PY54(Yersinia phage PY54)、盐单胞菌噬菌体phiHAP-1和弧菌噬菌体VP882的原核端粒酶一起使用的特别优选的完美反向重复序列。SEQ ID NO：6(ATTATATATATAAT)是与伯氏疏螺旋体原核端粒酶一起使用的特别优选的完美反向重复序列。该完美反向重复序列来自包含在伯氏疏螺旋体中的线性共价封闭的质粒lpB31.16。该14个碱基序列比噬菌体的22bp共有完美反向重复(SEQ ID NO：1)短，表明细菌原核端粒酶在特定靶序列要求方面可能不同于噬菌体原核端粒酶。然而，所有原核端粒酶靶序列均享有完美反向重复的共同结构基序。
取决于本发明方法中使用的特定原核端粒酶的要求，完美反向重复序列的长度可大于22bp。因此，在一些实施方式中，完美反向重复的长度可为至少30、至少40、至少60、至少80或至少100个碱基对。此种完美反向重复序列的实例包括SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9以及它们的变体。SEQ ID NO：7(GGCATAC TATACGTATAGTATGCC)；SEQ ID NO：8(ACCTATTTCAGCATACTACGCGCG-TAGTATGCTGAAATAGGT)；SEQ ID NO：9(CCTATATTGGGCCACCTATGTATG-CACAGTTCGCCCATACTATACGTATAGTATGGGCGAACTGTGCATACATAGGTGGCC CAATATAGG)。SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9以及它们的变体特别优选分别与来自弧菌噬菌体VP882、耶尔森氏菌噬菌体PY54和盐单胞菌噬菌体phi HAP-1的原核端粒酶一起使用。
完美反向重复可以以额外的反向重复序列作为侧翼。侧翼反向重复可以是完美或不完美的重复，即可为完全对称或部分对称。侧翼反向重复可与中央回文邻接或不邻接。原核端粒酶靶序列可包含不完美反向重复序列，所述不完美反向重复序列包含长度为至少14个碱基对的完美反向重复序列。实例为SEQ ID NO：14。不完美反向重复序列可包含长度为至少22个碱基对的完美反向重复序列。实例为SEQ ID NO：10。
特别优选的原核端粒酶靶序列包括序列SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：14或它们的变体。SEQ ID NO：10：
Figure BDA0002947054230000301
序列SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：14包含如上所述的完美反向重复序列，并另外包含来自相关生物体的侧翼序列。优选将包含序列SEQ ID NO：10或其变体的原核端粒酶靶序列与大肠杆菌N15 TelN原核端粒酶及其变体组合使用。优选将包含序列SEQ ID NO：11或其变体的原核端粒酶靶序列与克雷伯氏菌噬菌体Phi K02原核端粒酶及其变体组合使用。优选将包含序列SEQ ID NO：12或其变体的原核端粒酶靶序列与耶尔森氏菌噬菌体PY54原核端粒酶及其变体组合使用。优选将包含序列SEQ ID NO：13或其变体的原核端粒酶靶序列与弧菌噬菌体VP882原核端粒酶及其变体组合使用。优选将包含序列SEQ ID NO：14或其变体的原核端粒酶靶序列与伯氏疏螺旋体原核端粒酶组合使用。
上述任何回文或原核端粒酶靶序列的变体包括其同源物或突变体。突变体包括相对于天然序列的截短、置换或删除。变体序列是其在DNA模板中的存在允许其通过原核端粒酶的酶促活性转化成封闭线性DNA的任何序列。这可通过使用用于封闭线性DNA形成的适当测定法容易地确定。可使用本领域中描述的任何合适的测定法。合适的测定法的实例在Deneke等，PNAS(2000)97，7721-7726中有所描述。优选地，所述变体允许原核端粒酶结合并具有与用天然序列所观察到的活性相当的活性。本文所述的回文序列的优选变体的实例包括保留完美重复结构并仍然能形成封闭线性DNA的截短的回文序列。然而，可对变体原核端粒酶靶序列进行修饰，以便使它们不再保留完美回文，前提是它们能够充当原核端粒酶活性的底物。
应理解的是，基于以上概述的结构原理，技术人员将能够容易地鉴别用于本发明的合适的原核端粒酶靶序列。可使用上述所述的测定法对候选原核端粒酶靶序列促进封闭线性DNA形成的能力进行筛选。
共价封闭线性DNA构建体的产生
本文所述的共价封闭载体可在体外或体内产生。载体是能够在靶细胞中表达转基因的共价封闭线性双链载体。用于生产封闭线性表达盒DNA(例如含有本文所述的ITR)的体外方法的一个实例包括：a)在一种或多种引物的存在下，使包含至少一个表达盒的DNA模板在促进所述模板扩增的条件下与至少一种DNA聚合酶接触，所述表达盒在任一侧以原核端粒酶靶序作为侧翼；以及b)在促进封闭线性表达盒DNA形成的条件下，使a)中产生的扩增的DNA与至少一种原核端粒酶接触。封闭线性表达盒DNA产物可包含与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和任选的真核转录终止序列，由与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和任选的真核转录终止序列组成，或基本上由与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和任选的真核转录终止序列组成。封闭线性表达盒DNA产物可额外地不含通常选自于由如下所组成的组中的一种或多种细菌序列或载体序列：(i)细菌复制起始位点；(ii)细菌选择标记(通常是抗生素抗性基因)；以及(iii)未甲基化的CpG基序。
如上所概述的，可根据本发明的方法扩增包含至少一个原核端粒酶靶序列的任何DNA模板。因此，尽管治疗性DNA分子(例如用于DNA疫苗)或其它治疗性蛋白质和核酸的生产是优选的，本发明的方法可用于生产任何类型的封闭线性DNA。DNA模板可为双链(ds)或单链(ss)DNA。双链DNA模板可为开环双链DNA(open circular double stranded DNA)、闭环双链DNA(closed circular double stranded DNA)、开放线性双链DNA(open lineardouble stranded DNA)或封闭线性双链DNA。优选地，模板是闭环双链DNA。闭环dsDNA模板特别优选与RCA(滚环扩增)DNA聚合酶一起使用。环状dsDNA模板可处于用于细菌繁殖的质粒或其它载体(通常用于容纳基因)的形式。因此，本发明的方法可用于扩增任何商业上可获得的质粒或其它载体(例如商业上可获得的DNA药物)，然后将扩增的载体DNA转化为封闭线性DNA。
可使用开环dsDNA作为模板，其中DNA聚合酶是可从有切口的DNA链启动扩增的链置换聚合酶。在这一实施方式中，可预先将模板与一种或多种酶一起孵育，所述酶在模板中DNA链的一个或多个位点形成切口。也可使用封闭线性dsDNA作为模板。封闭线性dsDNA模板(起始材料)可与封闭线性DNA产物相同。在使用封闭线性DNA作为模板的情况下，在促进模板DNA扩增的条件之前或期间，可在变性条件下对封闭线性DNA进行孵育以形成单链环状DNA。
如上所概述的，DNA模板通常包含如上所述的表达盒，即包含与编码感兴趣的蛋白质的序列可操作地连接的真核启动子和任选的真核转录终止序列、由与编码感兴趣的蛋白质的序列可操作地连接的真核启动子和任选的真核转录终止序列组成、或基本上由与编码感兴趣的蛋白质的序列可操作地连接的真核启动子和任选的真核转录终止序列组成。任选地，表达盒可为如上所定义的最小表达盒，即不含通常选自于由如下所组成的组中的一种或多种细菌序列或载体序列：(i)细菌复制起始位点；(ii)细菌选择标记(通常是抗生素抗性基因)；以及(iii)未甲基化的CpG基序。
可通过本领域已知的任何方法，以足以用于本方法的量提供DNA模板。例如，DNA模板可通过聚合酶链式反应(PCR)产生。当DNA模板是dsDNA时，其可通过在至少94摄氏度的温度下预先孵育而作为变性单链来提供，以用于扩增步骤。因此，本发明的方法优选地包括使dsDNA模板变性以提供单链DNA的步骤。可替代地，dsDNA模板可以以双链形式提供。可在反应中扩增DNA模板的全部或选定部分。
使DNA模板在促进所述模板扩增的条件下与至少一种DNA聚合酶接触。可使用任何DNA聚合酶。任何商业上可获得的DNA聚合酶均适用于本发明的方法。可使用两种、三种、四种、五种或更多种不同的DNA聚合酶，例如提供校对功能的一种DNA聚合酶，以及不提供该功能的一种或多种其它DNA聚合酶。可使用具有不同机制的DNA聚合酶，例如链置换型聚合酶和通过其它方法复制DNA的DNA聚合酶。不具有链置换活性的DNA聚合酶的合适实例是T4DNA聚合酶。
优选DNA聚合酶是高度稳定的，以便使其活性不会因在工艺条件下的长时间孵育而大幅降低。因此，在一系列工艺条件(包括但不限于温度和pH)下，该酶优选具有长的半衰期。还优选DNA聚合酶具有适于制造工艺的一种或多种特征。优选地，DNA聚合酶例如通过具有校对活性而具有高保真性。此外，优选DNA聚合酶对dNTP和DNA显示出高的持续合成能力、高的链置换活性和低的Km。DNA聚合酶可能能够使用环状和/或线性DNA作为模板。DNA聚合酶可能能够使用dsDNA或ssDNA作为模板。优选DNA聚合酶不显示出非特异性核酸外切酶活性。链置换型聚合酶是优选的。
为了允许根据本发明的扩增，优选还使DNA模板与一个或多个引物接触。所述引物对于DNA模板中包含的一个或多个序列而言可以是特异性的或者可以是非特异性的(即序列是随机的)。优选引物具有随机序列，以便允许在DNA模板上任何位点的非特异性起始。这允许通过来自每个模板链的多个起始反应的高效扩增。随机引物的实例是六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或长度更长的序列，例如长度为12个、15个、18个、20个或30个核苷酸的序列。随机引物的长度可以是6个至30个、8个至30个或12个至30个核苷酸。随机引物通常作为寡核苷酸混合物提供，所述寡核苷酸代表DNA模板中的例如六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的所有可能的组合。
在其它实施方式中，引物是特异性的。这意味着它们具有与DNA模板中期望从其启动扩增的序列互补的序列。在这种实施方式中，可使用一对引物对两个引物结合位点内部的DNA模板的一部分进行特异性扩增。引物可以是未标记的，或可以包含一种或多种标记(例如放射性核素或荧光染料)。引物也可包含化学修饰的核苷酸。引物长度/序列通常可基于温度的考虑来选择，即在扩增步骤中使用的温度下能够结合至模板。
DNA模板与DNA聚合酶和一个或多个引物的接触在促进引物退火至DNA模板的条件下进行。所述条件包括存在允许引物杂交的单链DNA。所述条件还包括允许将引物退火至模板的温度和缓冲液。
在DNA模板与DNA聚合酶和一个或多个引物接触后，存在在促进所述模板扩增的条件下进行孵育的步骤。
除了扩增步骤之外，本发明的方法还包括用于生产封闭线性DNA的加工步骤。在促进封闭线性DNA生产的条件下，使扩增的DNA与至少一种原核端粒酶接触。基于原核端粒酶的这一简单的加工步骤优于用于生产封闭线性DNA分子的其它方法。扩增和加工步骤可同时或并行进行。然而，优选地，扩增和加工步骤相继进行，加工步骤在扩增步骤之后进行(即在扩增的DNA上)。
本发明的方法在体外无细胞环境中进行。因此，该方法在不存在宿主细胞的情况下进行，并且通常包括使用纯化的酶组分。因此，模板DNA的扩增和用原核端粒酶进行的加工通常通过使溶液中反应组分在合适的容器中接触来进行。任选地，能够以固定化的形式提供特定的组分，例如附着在固体支持物上。
在某些实施方式中，模板是具有平端或突出端(overhangs)的扩增的线性开放末端DNA，并将合成的发夹分子连接至一个或两个末端以形成包含至少一个DD-ITR(或例如来自图5中的ITR)的末端封闭的线性DNA。模板可以是例如合成的或PCR扩增的。使用本领域技术人员公知的方式纯化除去未连接的发夹。
在一个实施方式中，非病毒线性DNA是在细胞内制备的。
应理解的是，本发明的方法能够以任何规模进行。然而，优选以商业化或工业规模进行该方法以扩增DNA(即以毫克或更大的量产生扩增的DNA)。优选该方法产生至少1毫克、至少10毫克、至少20毫克、至少50毫克或至少100毫克的扩增的DNA。衍生自扩增的DNA的最终的封闭线性DNA产物还可优选地以毫克或更大的量产生。优选该方法产生至少1毫克、至少2毫克、至少5毫克、至少10毫克、至少20毫克、至少50毫克或至少100毫克的封闭线性DNA。
微环DNA(mini-circle DNA)的形成
产生DNA构建体的DD-ITR的共价封闭末端的替代方法是通过由质粒形成微环DNA。作为非限制性实例，在足以使单向位点特异性重组酶(unidirectional site specificrecombinase)介导从亲本核酸产生微环载体的重组事件的条件下，使亲本核酸与识别侧翼attB和attP位点的单向位点特异性重组酶接触，所述亲本核酸包含以单向位点特异性重组酶的attB和attP位点作为侧翼的感兴趣的DNA(例如处于表达盒形式的预定核酸序列和DD-ITR)。“以…作为侧翼(flanked)”是指待在产物微环载体中存在的表达盒和其它感兴趣的序列在任一端具有att位点(例如attB和attP)，从而使得亲本核酸由如下公式所描述：
-------att(P或B)-表达盒-att(P或B)-------
att位点的顺序通常并不重要。att位点是单向位点特异性重组酶的底物位点，并且本领域技术人员通常将其称为attB或attP位点。感兴趣的位点包括但不限于由上述特异性整合酶重组酶所识别的att位点及其突变体。
亲本核酸能够以多种不同形式存在，这至少部分取决于生产方法是体外方法还是体内方法。因此，亲本核酸可以是线性双链核酸、闭环核酸(例如适用于复制的细菌质粒)、整合到基因组DNA中等。
可在体外或体内(例如细胞内)对所述方法进行实践。在体外对所述方法进行实践的情况下，将所有必需的试剂(例如亲本核酸、位点特异性整合酶等)合并到反应混合物中，并在足够的条件下保持一段足够的时间，以发生位点特异性重组酶介导的期望产物微环载体的产生。通常，对于体外反应，将反应混合物保持在约20℃至40℃之间的温度下。
在某些实施方式中，所述方法是体外方法，其中重组酶介导的期望产物微环载体的产生发生在培养的细胞内。此类实施方式的实例包括其中亲本核酸是如下质粒的那些实施方式：所述质粒在重组酶介导的载体产生步骤之前在细菌宿主中复制以产生大量拷贝数的亲本核酸。
在上述体内实施方式中，第一步骤通常可以是首先制备包括大量亲本核酸的宿主细胞。这可方便地通过用将作为亲本核酸的质粒对宿主细胞(例如大肠杆菌)进行转化来完成。如上所述，然后将所得的转化的宿主细胞保持在足以使宿主细胞产生大量拷贝数的亲本核酸的条件下。
在提供具有足够拷贝数的亲本核酸(例如质粒)的宿主细胞后，然后在宿主细胞中产生单向位点特异性重组酶活性(即介导从亲本核酸产生期望的载体)。可使用任何方便的方案在细胞中产生期望的重组酶活性。在某些实施方式中，例如如上所述，可将重组酶或其核酸编码序列引入宿主细胞。可替代地，重组酶的编码序列可能已经存在于宿主细胞中而未被表达，例如因为重组酶的编码序列处于诱导型启动子的控制下。在这些实施方式中，可诱导的编码序列可存在于亲本核酸上，存在于另一游离核酸上，或者甚至整合到宿主的基因组DNA中。可与重组酶编码序列可操作地连接的感兴趣的代表性诱导型启动子包括但不限于：aracBAD启动子、λpL启动子等。在这些实施方式中，在宿主细胞中提供期望的重组酶活性的步骤包括对诱导型启动子进行诱导以引起期望的重组酶的表达。
在宿主细胞中产生期望的重组酶活性之后，然后将所得的宿主细胞保持于足以使重组酶活性介导从亲本核酸产生期望的微环载体的条件和时间段。通常，将宿主细胞保持在约20至40℃之间的温度。
如上所述，在重组酶介导从亲本核酸产生微环载体之后，然后可以根据需要将产物微环与它们的“合成”环境的其余部分(例如反应混合物、宿主细胞等)分离。可采用任何方便的方案来分离产物微环。美国专利8,828,726和美国专利7,897,380中描述了代表性的方案。
环状核酸的制造
如本文所述的用于制造环状核酸的方法在例如美国临时申请号62/864,689中进一步描述，以引用的方式将其内容整体并入本文。
本文所述的本发明的一个方面提供了制造包含转基因的环状核酸载体的方法，所述方法包括：(a)使宿主系统与模板接触，其中，所述模板包含至少一个侧翼切割位点，以及(i)至少一个噬菌体复制起点(ORI)，(ii)至少一个末端重复(TR)，和(iii)与转基因可操作地连接的启动子序列，其中至少一个TR是腺相关病毒(AAV)双D ITR(DD-ITR)；(b)将宿主系统孵育足以发生复制的时间，从而引起环状核酸产生；以及(c)回收环状核酸产品，其中环状核酸自退火。
本文所述的本发明的另一方面提供了制造包含转基因的环状核酸载体的方法，所述方法包括：(a)用质粒模板转化宿主系统，其中所述质粒模板包含(i)噬菌体复制起始位点(ORI)、(ii)截短的噬菌体ORI(例如ORID29)、(iii)至少一个末端重复(TR)以及(iv)与转基因可操作地连接的启动子序列，其中质粒模板在5’至3’方向上包含有义序列和反义序列，所述有义序列和反义序列由发夹序列分隔开以允许有义链和反义链的退火，并且其中至少一个TR是AAV双D ITR(DD-ITR)；(b)将宿主系统孵育足以发生复制的时间，从而引起环状核酸产生；(c)回收环状核酸产品，其中环状核酸自退火。
在一个实施方式中，通过用特异性靶向质粒上存在的切割位点的核酸酶(例如限制性酶)对包含模板组件(例如参见图11-图13)的双链质粒DNA进行剪切，来生成用于产生环状核酸的模板。在替代的实施方式中，双链质粒模板可用于产生环状核酸(例如图14)。可使用本领域已知的标准克隆技术来生成包含模板组件的质粒或本文所述的质粒模板。切割位点的剪切将质粒片段(即存在于两个切割位点之间的单链线性DNA)切除。在一个实施方式中，然后使质粒片段在剪切末端处退火至衔接子蛋白。使用本领域已知的标准技术(例如通过连接)，能够将具有例如与切割位点互补的序列的衔接子序列退火至切割位点。将衔接子序列退火至质粒片段的末端使DNA环化，产生封闭末端DNA结构，在本文中称为模板。
模板可在宿主系统中在体内或在体外复制。例如，使用标准方法在大肠杆菌细胞中，例如如Shepherd等，Scientific Reports 9,Article number:6121(2019)中所述；细胞提取物，例如大肠杆菌细胞提取物，如Wang,G.等，Cell Research 7,1–12(1997)中所述；或在本领域已知的细菌包装细胞系中(通过引用的方式将这些引用文献的内容整体并入本文)。细菌包装细胞系可表达基于M13的辅助质粒，例如如Chastenn,L.等，Nucleic AcidsRes.2006Dec；34(21):e145中所述，通过引用的方式将其内容整体并入本文。可替代地，本文所述的模板不需要经历复制，并可用于直接接触宿主系统，例如体外细胞系。
本文所述的噬菌体ORI的使用是有利的，这是因为它不是必须需要辅助噬菌体的存在来启动复制，从而消除了复制物中辅助噬菌体污染的可能性。本文所述的噬菌体ORI独立地启动单链环(即环状核酸)的复制。位于模板上的噬菌体ORI启动了单链互补环DNA(本文称为环状核酸)的复制。在一个实施方式中，将模板在宿主系统中孵育足以复制环状核酸的时间。在一个实施方式中，噬菌体ORI启动复制而无需任何额外的组件，例如辅助噬菌体。在替代的实施方式中，噬菌体ORI启动的复制在额外组件(例如辅助噬菌体)的存在下发生。当使用噬菌体载体时，辅助噬菌体颗粒(例如M13K07)为颗粒形成提供了必要的基因产物。辅助噬菌体颗粒进一步综述于例如(2005)Helper Phage.In:Encyclopedic Reference ofGenomics and Proteomics in Molecular Medicine.Springer,Berlin,Heidelberg中，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
在一个实施方式中，模板是单链的，并且模板的体外或体内复制产生单链环状核酸。单链环状DNA可例如在转基因序列处自退火，并成为双链。
当ORI存在于质粒模板(例如具有位于模板的其它元件侧翼的F1ORI和ORIΔ29的质粒模板)的两侧时(参见例如图14)，单链环状核酸包含自互补转基因，例如治疗性转基因。在一个实施方式中，单链环状核酸在一条链上包含转基因的有义序列和转基因的反义序列。在一个实施方式中，有义序列和反义序列由接头(例如Holliday接头)或缺陷型ITR分隔开，这允许链弯曲并发生有义序列和反义序列的结合。本文特别考虑的是，接头可以是允许链弯曲以有助于转基因的有义序列和反义序列的结合的任何序列。在一个实施方式中，单链环状核酸进一步包含位于ORI侧翼的互补区和自互补区(参见例如图14)。
对于特定的宿主系统，使用已知的标准技术(例如机械介导的释放(超声处理)或化学介导的释放(洗涤剂))从宿主系统释放(即使其游离)环状核酸。释放后，使用标准方法，例如通过使用柱色谱法纯化来回收环状核酸。
本文产生的环状核酸可以是末端封闭的、末端开放的，或既有末端开放的又有末端封闭的。在一个实施方式中，环状核酸是末端封闭的。末端封闭的DNA载体可具有任何构造型，例如狗骨头形、哑铃形、环状、末端封闭的线性双链体等。
可将使用本文所述方法产生的环状核酸复制物用于递送其表达的转基因，或例如通过额外的体外或体内复制产生更多环状核酸。可将使用本文所述方法制造的环状核酸用于生产重组载体，例如重组病毒载体。
本文所述的各种额外的方面提供了使用本文所述的任何方法制造的载体。
用于复制环状核酸的宿主系统可为例如体外或体内宿主系统。在一个实施方式中，宿主系统可为宿主细胞，例如昆虫细胞、哺乳动物细胞、病毒、细菌包装细胞或无细胞系统。例如，如果宿主系统是昆虫细胞(例如Sf9、Sf21、Hi-5和S2昆虫细胞系)，则用于制造AAV载体的宿主系统可进一步包含杆状病毒表达系统。杆状病毒表达系统进一步描述于例如美国专利号US6919085B2、US6225060B1、US5194376A中，通过引用的方式将它们的内容各自整体并入本文。在无细胞系统中，可在体外系统中合成和组装载体。在一个实施方式中，无细胞系统包含辅助噬菌体颗粒。
对于位于环状核酸或模板或从中产生所述模版的质粒模板上的元件，不对它们在环状核酸或模板或质粒模板上从5’至3’的位置进行限制。例如，ORI可位于dd-ITR的上游或dd-ITR的下游，或者位于dd-ITR的上游和下游。在另一实例中，ORI以dd-ITR作为侧翼，并且在与转基因可操作地连接的启动子序列的上游。
在一个实施方式中，模板包含F1 ORI并且具有SEQ ID NO:37的序列。
Figure BDA0002947054230000401
在另一实施方式中，ORI衍生自M13并且促进模板的M13辅助子依赖性复制。M13ORI具有SEQ ID NO:38的核苷酸序列。
Figure BDA0002947054230000402
在一个实施方式中，至少一个ORI包括与野生型ORI相比发生突变的第二ORI。突变的ORI可包括单核苷酸突变(例如核苷酸缺失、插入或置换)，或可被截短以不含野生型ORI序列的至少部分(例如至少五个核苷酸)。在一个实施方式中，ORI突变体是F1 ORI突变体F1-ORIΔ29。突变体ORIΔ29是不具启动复制能力的截短的F1 ORI。ORIΔ29进一步综述于例如Specthrie,L等，Journal of Mol Biol.V.228(3),1992中。在一个实施方式中，ORIΔ29具有SEQ ID NO:39的核苷酸序列。
Figure BDA0002947054230000403
在一个实施方式中，ORI突变体是M13 ORI突变体M13-ORIΔ29。ORIΔ29突变体是不具启动复制能力的截短的M13 ORI。在一个实施方式中，ORIΔ29具有SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
Figure BDA0002947054230000411
本文所述的环状核酸不含其它类型或种类的ORI，例如载体不含细菌或哺乳动物ORI。
切割位点是在其中选择性断裂磷酸二酯骨架的核苷酸序列。例如，由核酸酶识别的核苷酸序列是切割位点，这是因为该酶将在序列内的选择性位点剪切磷酸二酯骨架。取决于核酸内切酶，此类切割位点可以是单链或双链的。还包括化学切割位点，例如在Maxam和Gilbert测序中进行的嘧啶和嘌呤切割反应，或通过化学方法(例如氧化)进行的切割，如美国专利No.4,795,700所述(通过引用的方式将其并入本文)。
在一个实施方式中，模板进一步包括至少第二切割，并且所述位点内是模板上包含的额外元件，例如至少一个ORI，至少一个TR(其中至少一个是DD-ITR)和启动子，所述启动子与治疗性转基因可操作地连接，以使至少两个切割位点位于这些元件的侧翼。在一个实施方式中，第三独特切割位点的位置紧邻ORI的下游。
在一个实施方式中，切割位点由核酸酶剪切。如本文所使用的，术语“核酸酶”是指具有DNA切割活性的分子。在一个实施方式中，核酸酶是原核端粒酶，切割位点是原核端粒酶靶序列，例如TelN识别位点。在一个实施方式中，核酸酶是限制性核酸内切酶，切割位点是核酸内切酶的识别位点(即限制性位点)。限制性核酸内切酶是能够催化DNA分子的位点特异性切割的水解酶。限制性核酸内切酶作用的位点由特定核苷酸序列的存在而决定。将此类序列称为限制性核酸内切酶的识别位点。当存在至少两个切割位点时，至少两个位点可以是相同的切割位点或不同的切割位点。
在一个实施方式中，模板中的限制性位点是不常见的限制性位点，即其通常不在转基因序列中出现。示例性的不常见的限制性位点包括镜面状回文限制性位点或8个碱基对的限制性位点。在一个实施方式中，在本发明的转基因(即治疗性转基因)中不存在模板中使用的限制性位点。
衔接子序列是短的、合成的单链或双链寡核苷酸，其可连接到其它DNA或RNA分子的末端。在一个实施方式中，本文所述的衔接子序列是单链的，并且封闭其所连接的DNA末端，例如通过发夹环。作为环化DNA的手段，衔接子序列被添加到剪切的质粒片段的一端或两端。在一个实施方式中，将衔接子序列与质粒片段连接，并在其所连接至的剪切的DNA的末端指导封闭(参见例如图11-图13)。可用于封闭DNA末端的示例性衔接子蛋白包括发夹环，所述发夹环进一步描述于例如美国专利No.2009/0098612以及美国专利No.6,369,038、6,451,563、6,849,725中，通过引用的方式将其内容整体并入本文。设想当添加到从质粒切除的质粒片段的剪切末端时，能环化DNA的任何序列都可以是衔接子序列。
以举例的方式，具有序列SEQ ID NO.41(CCATTCTGTTCCGCATGATTCCTCTGCGGAACAGAATGG(SEQ ID NO：41))的发夹环衔接子序列可进一步包含Sfi1限制性位点序列(例如GGCCNNNNNGGCC；SEQ ID NO：42)。具有Sfi1限制性位点序列的衔接子序列可用限制性酶Sfi1消化足以剪切限制性位点的时间。这将在衔接子序列上产生“粘性末端”，其可用于使衔接子蛋白与通过Sfi1限制性酶切除的质粒片段杂交。
治疗性核酸
本发明的DNA构建体对于在体外、离体和体内向细胞递送核酸而言是有用的。特别是，可有利地将DNA构建体用于将核酸递送或转移至包括哺乳动物在内的动物细胞。
可在本发明的DNA构建体中递送任何感兴趣的核酸序列。感兴趣的核酸包括编码多肽的核酸，包括治疗性多肽(例如用于医学或兽医用途)、免疫原性多肽(例如用于疫苗)或诊断性多肽。
治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养不良蛋白(dystrophin，包括小肌营养不良蛋白(mini-dystrophins)和微肌营养不良蛋白(micro-dystrophins)，参见例如Vincent等，(1993)Nature Genetics 5:130；美国专利公开No.2003/017131；国际公开WO/2008/088895，Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13714-13719(2000)；以及Gregorevic等，Mol.Ther.16:657-64(2008))、肌肉生长抑制素前肽(myostatin propeptide)、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽(如IκB显性突变体)、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)(Tinsley等，(1996)Nature 384:349)、小抗肌萎缩蛋白相关蛋白(mini-utrophin)、凝血因子(例如VIII因子、IX因子、X因子等)、红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受体、脂蛋白脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β珠蛋白、α珠蛋白、血影蛋白、α1抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶A、支链酮酸脱氢酶、RP65蛋白、细胞因子(例如，α干扰素、β干扰素、干扰素γ、白介素2、白介素4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子3和神经营养因子4、脑源性神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括RANKL和VEGF]、胶质源性生长因子、转化生长因子α和β等)、溶酶体酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、受体(例如肿瘤坏死生长因子可溶性受体)、S100A1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、实施G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(例如截短的组成型活性bARKet)、抗炎因子(例如TRAP)、抗肌肉生长抑制素蛋白、天冬氨酸酰酶、以及单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性Mab是Herceptin.RTM.Mab)。其它说明性的异源核酸序列编码自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、赋予对癌症治疗使用的药物抗性的蛋白质、肿瘤抑制基因产物(例如，p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、FAS配体、以及在有需要的受试者中具有疗效的任何其它多肽。还可将细小病毒载体用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如，针对肌肉生长抑制素的抗体或抗体片段(参见例如，Fang等，Nature Biotechnol.23:584-590(2005))。
编码多肽的核酸序列包括编码报告多肽(例如酶)的核酸序列。报告多肽是本领域已知的，并且包括但不限于绿色荧光蛋白、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。
可替代地，在本发明的具体实施方式中，核酸分子可编码反义核酸、核酶(例如如美国专利No.5,877,022中所述)、实现剪接体介导的反式剪接的RNA(参见Puttaraju等，(1999)Nature Biotech 17:246；美国专利No.6,013,487；美国专利No.6,083,702)、干扰RNA(RNAi)(包括介导基因沉默的miRNA、siRNA或shRNA，参见Sharp等，(2000)Science287:2431)，以及其它非翻译RNA，例如“向导”RNA(Gorman等，(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:4929；Yuan等的美国专利No.5,869,248)等。示例性的非翻译RNA包括针对多药抗性(MDR)基因产物的RNAi(例如以治疗和/或预防肿瘤和/或用于向心脏给予以预防由化疗而来的损伤)；针对肌肉生长抑制素的RNAi(例如用于杜氏肌营养不良)；针对VEGF的RNAi(例如以治疗和/或预防肿瘤)；针对受磷蛋白(phospholamban)的RNAi(例如以治疗心血管疾病，参见例如，Andino等，J.Gene Med.10:132-142(2008)以及Li等，Acta PharmacolSin.26:51-55(2005))；受磷蛋白抑制性或显性失活分子如受磷蛋白S16E(例如以治疗心血管疾病，参见例如，Hoshijima等，Nat.Med.8:864-871(2002))；针对腺苷激酶的RNAi(例如用于癫痫)；针对肌聚糖(如α、β、γ)的RNAi；针对肌肉生长抑制素、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素或激活素II型可溶性受体的RNAi；针对抗炎多肽(例如IκB显性突变体)的RNAi；以及针对病原生物体和病毒(例如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、CMV、单纯疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)的RNAi。
可替代地，在本发明的具体实施方式中，核酸可编码蛋白磷酸酶抑制剂I(I-1)、serca2a、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、β2肾上腺素能受体、β2肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇3激酶(PI3激酶)、实施G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(例如截短的组成型活性bARKct)、calsarcin、针对受磷蛋白的RNAi、受磷蛋白抑制性或显性失活分子(例如受磷蛋白S16E)、enos、inos、或骨形态发生蛋白(包括BNP 2、7等，RANKL和/或VEGF)。
DNA构建体还可包含与宿主染色体上的基因座具有同源性并与所述基因座重组的核酸。例如，可利用该方法来修正宿主细胞中的遗传缺陷。
作为进一步的替代方式，核酸可编码期望在体外、离体或体内在细胞中产生的任何多肽。例如，可将DNA构建体引入培养的细胞以及从中分离表达的基因产物。
调节元件
核酸可以在表达盒的环境中。本领域技术人员将理解的是，感兴趣的核酸可与适当的控制序列可操作地结合。例如，核酸可与表达控制元件(例如转录/翻译控制信号、复制起始位点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等)可操作地结合。在本发明的优选实施方式中，表达盒包含与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子、以及任选的真核转录终止序列。本领域技术人员将理解的是，取决于期望的水平和组织特异性表达，可使用多种启动子/增强子元件。取决于期望的表达模式，启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的。启动子/增强子可以是天然的或外来的，并且可以是天然的或合成的序列。关于外来的，表示转录起始区域不存在于其中引入该转录起始区域的野生型宿主/靶细胞中。
在具体的实施方式中，启动子/增强子元件可以是靶细胞或待处理的受试者天然的。在代表性的实施方式中，启动子/增强子元件可以是核酸序列天然的。通常对启动子/增强子元件进行选择，以使其在感兴趣的靶细胞中发挥作用。此外，在具体的实施方式中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型的或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常在期望对异源核酸序列的表达提供调节的那些应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌特异性或优选的)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性或优选的)、眼特异性或优选的(包括视网膜特异性和角膜特异性)、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的、以及肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其它诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型元件和金属诱导型元素。示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet on/off元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在核酸序列在靶细胞中转录然后翻译的实施方式中，通常包括特异性起始信号用于高效翻译插入的蛋白编码序列。这些外源翻译控制序列(可能包括ATG起始密码子和邻近的序列)可以来自各种天然和合成来源。
病毒颗粒的制备
本发明的方面涉及共价封闭的非病毒线性DNA构建体(有时是封闭线性DNA)，以产生重组病毒颗粒，用于递送作为单链重组病毒基因组的构建体DNA。这涉及将包含至少两个DD-ITR(例如参见图1)的封闭线性DNA构建体与载体或质粒一起添加到宿主细胞中，所述载体或质粒(1)能够表达AAV Rep蛋白，该蛋白是使DD-ITR中的至少一个产生切口所必需的，并且(2)能够表达细小病毒病毒衣壳蛋白(例如诸如AAV的依赖病毒)，该蛋白是形成能够将ITR和间插DNA序列以壳体包裹的病毒粒子(病毒颗粒)所必需的。在宿主细胞中，在Rep的存在下由自引发的ITR启动DD-ITR的分解和复制，以产生可包装的载体基因组。优选地，间插DNA序列包含转基因序列，例如治疗性基因序列。产生切口的特定Rep蛋白(例如AAV ITR)通常来自相同的血清型(例如，AAV2 ITR与AAV2Rep78)，但可使用任何血清型，只要它们与当AAV ITR和AAV Rep蛋白来自同一血清型时的情况相比保留至少25％...35％...50％...65％...75％...85％...90％...95％...98％...100％或任何介于中间的百分比或更大百分比的切口产生效率。人们可使用这种方法来制备大量的含有ITR及其间插DNA序列(例如转基因)的病毒颗粒。使用含有DD-ITR的封闭线性载体更为有效，即与不含双D的封闭线性载体相比，它提供了包装基因组的、感染性病毒颗粒的更高的产率，并且病毒颗粒不具有任何污染的质粒DNA。
可以用这种方法生产任何已知的AAV颗粒，例如包含合成的ITR或自互补二聚AAV序列(sc二聚体)等的AAV颗粒。技术人员知晓典型的AAV颗粒不能包装超过约5,000nt，因此在设计初始非病毒封闭线性DNA构建体时要注意可包装大小。在一个实施方式中，当需要包装的自互补时，初始非病毒封闭线性DNA构建体rAAV基因组载体模板例如可具有Rep切口产生缺陷型ITR或发夹序列。参见例如美国专利7465583、7790154、8361457、8784799，通过引用的方式将它们整体并入。例如，在一个实施方式中，载体模板可为约1/2大小的基因组模板(例如约1/2大小的野生型AAV基因组)，并且DD-ITR中的一个是不具备Rep切口产生能力的ITR。然后，经复苏和复制的rAAV基因组将是全长的基因组大小并且是可包装的。在替代的实施方式中，封闭线性DNA构建体rAAV基因组载体模板包括切口产生缺陷型ITR或如发夹序列，所述切口产生缺陷型ITR或发夹序列位于两个具备Rep切口产生能力的DD-ITR之间，并且切口产生缺陷型ITR或发夹序列进一步位于转基因的有义序列和反义序列之间，基因组模板约为全长大小，例如约5,000nt或wtAAV大小，例如少于5000nt…4800nt…4500nt…。无论哪种情况，在封闭线性rAAV载体基因组模板的复制后，有义序列和反义序列位于ITR之间的DNA单链上，并且可将这一载体基因组包装在rAAV病毒体中。
宿主细胞可能已经表达Rep和病毒衣壳蛋白，或者可通过标准方式在同时或大约同时对细胞进行共转染。本领域中使用的任何已知细胞类型均可用于该方法。例如，人们可使用昆虫细胞，例如杆状病毒。例如US 9,411,206中描述了使用哺乳动物悬浮细胞的生产方法，通过引用的方式将其整体并入本文。
还提供了包含本文所述载体的药物组合物。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，ITR序列在任一侧以互补序列D和D’作为侧翼(例如，为DD-ITR)。
在本文所述的方法和载体的实施方式中，所述D区域包含切口产生位点。
本文所述的核酸或核酸载体的ITR序列可衍生自任何细小病毒或任何AAV血清型(例如1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型)，或者可衍生自多于一种血清型。在本文提供的核酸或核酸载体的一些实施方式中，ITR序列衍生自AAV2。在本文提供的核酸或核酸载体的一些实施方式中，ITR序列衍生自自主性细小病毒。ITR序列和含有ITR序列的质粒在本领域中是已知的并且是商业上可获得的(参见，例如可从Vector Biolabs,Philadelphia,PA；Cellbiolabs,San Diego,CA；Agilent Technologies,Santa Clara,Ca；以及Addgene,Cambridge,MA获得的产品和服务；以及Gene delivery to skeletal muscleresults in sustained expression and systemic delivery of a therapeuticprotein，Kessler PD,Podsakoff GM,Chen X,McQuiston SA,Colosi PC,Matelis LA,Kurtzman GJ,Byrne BJ.Proc Natl Acad Sci U S A.1996Nov 26；93(24):14082-7；以及Curtis A.Machida.Methods in Molecular MedicineTM，Viral Vectors for GeneTherapy Methods and Protocols，10.1385/1-59259-304-6:201
Figure BDA0002947054230000481
Humana PressInc.2003.第10章；Targeted Integration by Adeno-Associated Virus，MatthewD.Weitzman,Samuel M.Young Jr.,Toni Cathomen和Richard Jude Samulski；美国专利No.5,139,941以及5,962,313，通过引用的方式将它们全部并入本文)。在一些实施方式中，表达构建体的大小不超过5千碱基、不超过4千碱基、或不超过3千碱基。在一些实施方式中，表达构建体的大小为4千碱基到7千碱基之间。在一个实施方式中，将从rAAV基因组(来自本文所述的封闭线性DNA载体)的复苏和复制获得的复制基因组在细小病毒颗粒(例如依赖病毒颗粒)中以壳体包裹。例如AAV颗粒。rAAV颗粒可具有任意AAV血清型(例如1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型或10型)，包括任何衍生物(包括血清型的非天然存在的变体)或嵌合体或假型(pseudotype)。复制的基因组是可包装的大小。
衍生物和嵌合体的非限制性实例包括AAV2-AAV3、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV克隆32/83、AAVShHIO、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41以及AAVr3.45(参见例如Mol Ther.2012Apr；20(4):699-708.doi:10.1038/mt.2011.287.Epub 2012Jan 24.TheAAV vector toolkit:poised at the clinical crossroads.Asokan Al,Schaffer DV,Samulski RJ.)。
在一些实施方式中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有修饰的衣壳蛋白(例如含有修饰的VP3、VP1或VP2的衣壳蛋白)。生产修饰的衣壳蛋白的方法是本领域已知的(参见例如美国专利公开号US20130310443，通过引用的方式将其整体并入本文)。在一些实施方式中，rAAV颗粒包含修饰的衣壳蛋白，所述修饰的衣壳蛋白在与野生型衣壳蛋白(例如野生型AAV2衣壳蛋白，如SEQ ID NO:15，或其它野生型AAV衣壳蛋白)中的表面暴露的氨基酸相对应的位置处包含至少一个非天然氨基酸置换。在一些实施方式中，rAAV颗粒包含修饰的衣壳蛋白，所述修饰的衣壳蛋白在与野生型衣壳蛋白中的表面暴露的酪氨酸氨基酸相对应的位置处包含非酪氨酸氨基酸(例如苯丙氨酸)，在与野生型衣壳蛋白中的表面暴露的苏氨酸氨基酸相对应的位置处包含非苏氨酸氨基酸(例如缬氨酸)，在与野生型衣壳蛋白中的表面暴露的赖氨酸氨基酸相对应的位置处包含非赖氨酸氨基酸(例如谷氨酸)，在与野生型衣壳蛋白中的表面暴露的丝氨酸氨基酸相对应的位置处包含非丝氨酸氨基酸(例如缬氨酸)，或它们的组合。
下文提供了示例性的非限制性野生型AAV2衣壳蛋白序列(SEQ ID NO:15)。
Figure BDA0002947054230000501
生产rAAV颗粒和核酸载体的方法也是本领域已知的并且是商业上可获得的(参见例如，Zolotukhin等，Production and purification of serotype 1,2,and5recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167；以及美国专利公开号US20070015238和US20120322861，通过引用的方式将其并入本文；质粒和试剂盒可从ATCC和Cell Biolabs,Inc获得)。例如，可将核酸载体(例如包含DD-ITR和异源基因的封闭线性载体)与一种或多种辅助质粒(例如包含rep基因(例如编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和VP3)的辅助质粒)组合，并转染到生产细胞系中，以便使得可对rAAV载体基因组进行复制、包装以及随后的纯化。
可采用本领域已知的任何合适的细胞。在具体的实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。作为另一选择，细胞可以是反式互补包装细胞系，该细胞系提供从复制缺陷型辅助病毒中删除的功能，例如293细胞或其它Ela反式互补细胞。
可通过本领域已知的任何方法提供AAV复制和衣壳序列。目前的方案通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。不需要一起提供AAV复制和包装序列，尽管这样做可能是方便的。可由任何病毒或非病毒载体提供AAV rep和/或cap序列。例如，rep/cap序列可由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺陷型的腺病毒载体的Ela或E3区域中)。也可将EBV载体用于表达AAV cap和rep基因。此方法的一个优势是EBV载体是游离型的，但在连续的细胞分裂过程中仍保持高拷贝数(即作为染色体外元件(称为“基于EBV的核游离体(episome)”)稳定地整合到细胞中，参见Margolski,(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67)。
修饰的衣壳：
可通过修饰现在已知或以后发现的任何AAV的衣壳蛋白来生产本发明的修饰的衣壳蛋白。此外，待修饰的AAV衣壳蛋白可以是天然存在的AAV衣壳蛋白(例如AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白，或表1所示的任何AAV)，但不限于此。本领域技术人员将理解的是，对AAV衣壳蛋白的多种操作是本领域已知的，并且本发明不限于天然存在的AAV衣壳蛋白的修饰。例如，与天然存在的AAV相比，待修饰的衣壳蛋白可能已具有诸如插入、缺失或置换的改变(例如衍生自天然存在的AAV衣壳蛋白，例如AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和/或AAV11，或现在已知或以后发现的任何其它AAV)。此类AAV衣壳蛋白也在本发明的范围内。
在一个实施方式中，可对衣壳蛋白进行修饰，以便使其与未修饰的衣壳蛋白相比具有降低的肝转导和/或下降的聚糖结合亲和力的表型。本领域技术人员将公知的是，何为其它AAV血清型中的等效氨基酸，并且本发明涵盖此种其它AAV血清型，所述其它AAV血清型在此种等效氨基酸位置上包含本发明的突变、基本上由本发明的突变组成或由本发明的突变组成，其中与对照相比，所述突变引起下降的肝转导和/或下降的聚糖结合亲和力的表型。
在具体的实施方式中，与天然AAV衣壳蛋白序列相比，衣壳蛋白包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个、小于20个、小于30个、小于40个、小于50个、小于60个或小于70个氨基酸的改变。参见美国专利号9,409,953，通过引用的方式将其并入本文。
为了提高病毒滴度，可向细胞提供促进生产性AAV感染的辅助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。可替代地，如Ferrari等，(1997)Nature Med.3:1295以及美国专利No.6,040,183和6,093,570所述，腺病毒或疱疹病毒序列可由另一非病毒载体或病毒载体提供，例如作为携带促进高效AAV产生的所有辅助基因的非感染性腺病毒极微质粒(miniplasmid)提供。
此外，辅助病毒功能可由包装细胞提供，该包装细胞具有嵌入染色体中或保持为稳定的染色体外元件的辅助序列。通常，不能将辅助病毒序列包装到AAV病毒体中，例如不以TR作为侧翼。
在一些实施方式中，一个或多个辅助质粒包括：第一辅助质粒，所述第一辅助质粒包含rep基因和cap基因；以及第二辅助质粒，所述第二辅助质粒包含辅助AAV生产的其它基因，例如Ela基因、Elb基因、E4基因、E2a基因和VA基因。在一些实施方式中，rep基因是衍生自AAV2的rep基因，cap基因衍生自AAV5。辅助质粒和制备此类质粒的方法是本领域已知的并且是商业上可获得的(参见例如，来自PlasmidFactory,Bielefeld,Germany的pDM、pDG、pDPlrs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)和pDP8.ape质粒；其它产品和服务可获得自Vector Biolabs,Philadelphia,PA；Cellbiolabs,San Diego,CA；Agilent Technologies,Santa Clara,Ca；以及Addgene,Cambridge,MA；pxx6；Grimm等，(1998),Novel Tools for Production and Purification of RecombinantAdenoassociated Virus Vectors,Human Gene Therapy,Vol.9,2745-2760；Kern,A.等，(2003),Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated VirusType 2 Capsids,Journal of Virology,Vol.77,11072-11081.；Grimm等，(2003),HelperVirus-Free,Optically Controllable,and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6,Molecular Therapy,Vol.7,839-850；Kronenberg等，(2005),A Conformational Change in the Adeno-Associated VirusType 2Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini,Journal ofVirology,Vol.79,5296-5303；以及Moullier,P.和Snyder,R.O.(2008),Internationalefforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards,Molecular Therapy,Vol.16,1185-1188)。
接下来对示例性的非限制性rAAV颗粒生产方法进行描述。一种或多种辅助质粒在其天然启动子的转录控制下生产或获得，所述辅助质粒包含期望的AAV血清型的rep和capORF以及腺病毒VA、E2A(DBP)和E4基因。通过CaP04介导的转染、脂质或聚合物分子(如聚乙烯亚胺(PEI))，用辅助质粒和含有本文所述的核酸载体的质粒对HEK293细胞(可从
Figure BDA0002947054230000531
获得)进行转染。可替代地，在另一实例中，用包含核酸载体的单个重组杆状病毒对基于Sf9的生产稳定细胞系进行感染。然后，可使用本领域已知或本文描述的任何方法(例如通过碘克沙醇台阶梯度法、CsCl梯度法、色谱法或聚乙二醇(PEG)沉淀法)，对rAAV颗粒进行纯化。
重组AAV生产的各种方式是本领域技术人员公知的，并且这些方法中的任何一种都可与用本文所述的包含至少两个DD-ITR的共价封闭非病毒线性DNA构建体置换本文所述的载体模板的修饰一起使用。
本公开还将包含至少一种所公开的rAAV颗粒、表达构建体或核酸载体的宿主细胞考虑在内。此种宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞，优选人宿主细胞，并且可在细胞或组织培养物中分离。在遗传修饰的动物模型(例如小鼠)的情况下，转化的宿主细胞可包含在非人动物自身的体内。
在一个实施方式中，在诸如Pro10细胞系的细胞系中生产使用封闭线性或微环DNA(例如包含DD ITR)的rAAV，如美国专利9,44,1206中所述(通过引用的方式将其整体并入本文)。
DNA构建体向靶细胞的递送
可通过本领域中的各种可获得的方式向靶细胞递送本发明的DNA载体构建体(病毒颗粒或裸DNA)。核酸的递送方法包括但不限于：通过颗粒感染、脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA和试剂增强DNA的吸收。在例如美国专利No.5,049,386、4,946,787和4,897,355中对脂质转染进行了描述，并且脂转染试剂在市场上有售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。可向细胞(例如体外或离体给予)或靶组织(例如体内给予)进行递送。
在一个实施方式中，通过转染向细胞给予本文所述的DNA构建体。可用于本文所述方法的转染方法包括但不限于，脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。适用于本发明的转染试剂包括有助于将RNA、DNA和蛋白质引入细胞的转染试剂。示例性的转染试剂包括TurboFect转染试剂(Thermo Fisher Scientific)、Pro-Ject试剂(ThermoFisher Scientific)、TRANSPASSTM P蛋白转染试剂(New England Biolabs)、CHARIOTTM蛋白递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD Millipore)、293fectin、LIPOFECTAMINETM 2000、LIPOFECTAMINETM 3000(Thermo Fisher Scientific)、LIPOFECTAMINETM(Thermo Fisher Scientific)、LIPOFECTINTM(Thermo FisherScientific)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(Thermo Fisher Scientific)、OLIGOFECTAMINETM(Thermo Fisher Scientific)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(Roche,Basel,Switzerland)、FUGENETM HD(Roche)、TRANSFECTAMTM(Transfectam,Promega,Madison,Wis.)、TFX-10TM(Promega)、TFX-20TM(Promega)、TFX-50TM(Promega)、TRANSFECTINTM(BioRad,Hercules,Calif.)、SILENTFECTTM(Bio-Rad)、EffecteneTM(Qiagen,Valencia,Calif.)、DC-chol(Avanti Polar Lipids)、GENEPORTERTM(Gene Therapy Systems,San Diego,Calif.)、DHARMAFECT 1TM(Dharmacon,Lafayette,Colo.)、DHARMAFECT 2TM(Dharmacon)、DHARMAFECT3TM(Dharmacon)、DHARMAFECT 4TM(Dharmacon)、ESCORTTM III(Sigma,St.Louis,Mo.)以及ESCORTTM IV(Sigma Chemical Co.)。
在另一实施方式中，通过电穿孔(例如核转染)向细胞给予本文所述的DNA构建体。在一些实施方式中，通过本领域技术人员已知的微流控方法向细胞给予本文所述的核酸。
脂质体介导的递送
在实施方式中，将DNA构建体添加至脂质体以用于向细胞递送。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药开发的背景下，通常将脂质体用作药物/治疗剂递送的载体。脂质体通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来发挥作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂、特别是具有磷脂酰胆碱基团的化合物组成，但是这些组合物还可包含其它脂质。
在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，其可降低化合物的免疫原性/抗原性，向化合物提供亲水性和疏水性，并减少给药频率。或者，脂质体制剂仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此方面，PEG或PEG官能团的分子量可为62Da至约5,000Da。
在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂将在数小时至数周的时段内以缓释或控释特性递送API。在一些相关方面，脂质体制剂可包含由脂质双层界定的水性腔室。在其它相关方面，脂质体制剂将API与在高温下经历物理转变的组分封装在一起，其在数小时至数周的时段内释放API。
在一些方面，脂质体制剂包含鞘磷脂和本文公开的一种或多种脂质。在一些方面，脂质体制剂包含optisomes。
在一些方面，本公开提供了包含一种或多种脂质的脂质体制剂，所述一种或多种脂质选自：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、MPEG(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)、PEG(聚乙二醇)、DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)、DPPG(二棕榈酰磷脂酰甘油)、EPC(卵磷脂酰胆碱)、DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)、POPC(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱)、SM(鞘磷脂)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、DMPG(二肉豆蔻酰磷脂酰甘油)、DSPG(二硬脂酰磷脂酰甘油)、DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱，dierucoylphosphatidylcholine)、DOPE(二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、胆固醇硫酸盐/酯(CS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn甘油-磷脂酰胆碱)或它们的任意组合。
在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂以56:38:5的摩尔比包含磷脂、胆固醇和PEG化的脂质。在一些方面，脂质体制剂的总脂质含量为2mg/mL-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化的脂质。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂以3:0.015:2的摩尔比分别包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化的脂质。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化的脂质。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化的脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了包含DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇的脂质体制剂。
在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、以及一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和甾醇(例如胆固醇)。在一些方面，脂质体制剂包含DOPC/DEPC、和DOPE。
在一些方面，本公开提供了进一步包含一种或多种药物赋形剂(例如蔗糖和/或甘氨酸)的脂质体制剂。
在一些方面，本公开提供了结构上为单层或多层的脂质体制剂。在一些方面，本公开提供了包含多囊泡颗粒和/或基于泡沫的颗粒的脂质体制剂。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，相对于普通纳米颗粒，所述脂质体制剂的相对大小更大，大小为约150nm至250nm。在一些方面，脂质体制剂是冻干粉末。
在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，通过向在脂质体外部具有分离的DNA构建体的混合物中添加弱碱来制备所述脂质体制剂，并使其负载有通过实施例1的方法获得的或本文其它部分公开的DNA构建体。这一添加使脂质体外部的pH提高至约7.3，并驱使API进入脂质体。在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂在脂质体内部具有酸性的pH。在这种情况下，脂质体的内部可为pH 4-6.9、更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了通过使用脂质体内药物稳定技术制备的脂质体制剂。在这种情况下，使用聚合或非聚合的高电荷阴离子和脂质体内捕获剂，例如多磷酸盐/酯或蔗糖八硫酸盐/酯。
在其它方面，本发明提供了脂质体制剂，所述脂质体制剂包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。
在一些方面，本公开提供了在递送DNA构建体方面有用的脂质制剂，例如脂质纳米颗粒制剂。例如，考虑将WO2017/173054(通过引用的方式将其内容整体并入本文)中描述的脂质纳米颗粒制剂与本文所述的方法和组合物一起使用。
药物组合物
可将本文公开的DNA载体构建体掺入适于向受试者给予的药物组合物中，以用于在体内向受试者的细胞、组织或器官递送。通常，药物组合物包含本文公开的DNA构建体和药学上可接受的载体。例如，可将DNA构建体掺入适于治疗给药的期望途径(例如肠胃外给药)的药物组合物中。还考虑了通过高压静脉内或动脉内输注以及细胞内注射(例如核内显微注射或胞质内注射)的被动组织转导。可将用于治疗目的的药物组合物配制成适于高DNA构建体浓度的溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其它有序结构。无菌可注射溶液可通过以下来制备：将所需量的DNA构建体化合物掺入适当的缓冲液(根据需要具有以上列举的成分的一种或组合)中，接着进行过滤灭菌，包括可对DNA构建体进行配制以将核酸中的转基因递送至受体的细胞，引起其中核酸的治疗性表达。组合物还可包含药学上可接受的载体。
出于各种目的，本文提供的组合物和载体可用于递送预定的DNA序列(例如转基因或供体序列)。在一些实施方式中，DNA序列编码旨在用于研究目的的RNA或蛋白质，例如用以创建带有转基因的体细胞转基因动物模型，例如来研究与所表达的蛋白质或RNA相互作用的蛋白质的功能。在另一实例中，转基因编码旨在用于创建疾病的动物模型的物质。在一些实施方式中，转基因编码一种或多种肽、多肽或蛋白质，其对于治疗或预防哺乳动物受试者中的疾病状态有用。
在制造和储存条件下，用于治疗目的的药物组合物通常必须是无菌和稳定的。可将组合物配制成适于高DNA构建体或病毒颗粒浓度的溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其它有序结构。无菌可注射溶液可通过将所需量的DNA构建体化合物掺入适当的缓冲液(根据需要具有以上列举的成分的一种或组合)中，接着进行过滤灭菌而制备。
剂量、给予和功效
所述方法包括向受试者给予有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的编码治疗性蛋白质或RNA或病毒颗粒的DNA构建体。如熟练的技术从业者将理解的，术语“有效量”是指所给予的DNA构建体组合物的量，该量引起编码的蛋白质或RNA以“治疗有效量”表达以用于治疗疾病。
包含DNA构建体的组合物的剂量范围取决于效力(例如启动子的效率)，并且包括大到足以产生期望效果(例如期望的蛋白质或RNA的表达)以用于治疗疾病(例如癌症)的量。剂量不应太大而引起不可接受的不良副作用。通常，剂量将随DNA构建体的具体特征、表达效率以及患者的年龄、状况和性别而变化。剂量可由本领域技术人员确定。例如在小鼠中，在盐水中静脉内给予非病毒DNA载体的情况下，在一个实施方式中，向靶细胞给予的载体的量的范围可为约1μg至200μg或约10μg至50μg。本领域技术人员相应地调整剂量以给予人或较大动物。在某些实施方式中，载体的大小的范围为约0.5kb至100kb，或约2kb至15kb。
如本文所使用的，术语“治疗有效量”是所表达的治疗性蛋白质或RNA的量，该量足以在疾病生物标志物的表达或给定疾病症状的减轻方面产生统计学上显著的、可测量的变化(参见下文的“功效测量”)。对于给定的DNA构建体或病毒颗粒组合物，可在临床试验以及动物研究中评估此类有效量。
在本文所述的方法和组合物中有用的试剂可通过局部、静脉内(通过推注或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、吸入、腹膜内、肌内、皮下、腔内进行给予，可通过蠕动方式(如果需要)或通过本领域技术人员已知的其它方式进行递送。如果需要如此，试剂可全身给予。
对于给定的疾病(例如癌症，包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤等)，可由熟练的临床医生确定给定治疗的功效。然而，在用编码治疗性蛋白质或RNA的DNA构建体治疗后，如果疾病或紊乱的任何一个或全部征象或症状以有益的方式改变、或疾病的其它临床认可的症状或标志物改善或减轻例如至少10％，则将所述治疗认为是本文所使用的术语“有效治疗”。功效也可通过个体不再恶化(通过疾病的稳定化评估)，或不再需要医疗干预(即，疾病进展停止或至少减缓)来测量。测量这些指标的方法对本领域技术人员而言是已知的和/或在本文中进行了描述。治疗包括在个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)中对疾病进行的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓疾病(例如癌症)的进展；或(2)减轻疾病，例如引起症状消退；以及(3)预防或降低疾病发展的可能性，或预防与疾病相关的继发性疾病/紊乱，例如癌症(例如癌症转移)。
治疗疾病的有效量是指当向有需要的哺乳动物给予时足以对该疾病引起有效治疗(如本文对该术语所定义的)的量。可通过评估对给定疾病特定的物理指标来确定试剂的功效。例如，癌症的物理指标包括但不限于疼痛、肿瘤大小、肿瘤生长速率、血细胞计数等。
靶细胞
根据本发明的DNA构建体提供了用于将核酸递送至广泛的细胞的手段，所述细胞包括分裂细胞和非分裂细胞。在一个实施方式中，细胞是遗传缺陷型的。在一个实施方式中，细胞是患病的。
DNA构建体可用于在体外向细胞递送感兴趣的核酸，例如以在体外产生多肽或用于离体基因治疗。在向有需要的受试者递送核酸的方法中DNA构建体也是有用的，例如用以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA。以这种方式，多肽或功能性RNA可在受试者体内产生。由于受试者缺乏该多肽，该受试者可能需要所述多肽。此外，由于在受试者中多肽或功能性RNA的产生可赋予一些有益效果，可实践该方法。
DNA构建体还可用于在培养的细胞或受试者中产生感兴趣的多肽或功能性RNA(例如使用受试者作为生物反应器以产生多肽或观测功能性RNA对受试者的作用，例如与筛选方法有关)。
引入DNA载体构建体的细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是大脑的细胞，例如神经元和少突胶质细胞)、肺细胞、眼的细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞)、血管细胞(例如内皮细胞、内膜细胞)、上皮细胞(例如肠和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞(例如骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或隔肌细胞)、树突细胞、胰细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。在代表性的实施方式中，细胞可以是任何祖细胞。作为进一步的可能性，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为另一进一步的替代方式，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，细胞可来自任何物种来源。
疾病和紊乱
基因转移对于理解疾病状态和为疾病状态提供治疗而言具有重要的潜在用途。存在许多遗传性疾病，其中缺陷型基因是已知的并已经被克隆。通常，疾病状态分为两类：缺陷型状态，经常为酶，其通常以隐性方式遗传；以及不平衡状态，其可涉及调节或结构蛋白，并且其通常以显性方式遗传。对于缺陷型状态的疾病，基因转移可用于将正常基因带入累及的组织中用于替代治疗，以及使用反义突变创建疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可用于在模型系统中创建疾病状态，然后可用于努力对抗疾病状态。因此，根据本发明的DNA构建体允许治疗和/或预防遗传疾病。
根据本发明的DNA载体/构建体也可用于在体外或体内向细胞提供功能性RNA。例如，细胞中的功能性RNA的表达可减少细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可给予功能性RNA以在有需要的受试者中减少特定蛋白的表达。也可在体外向细胞给予功能性RNA以调节基因表达和/或细胞生理，例如优化细胞或组织培养系统或在筛选方法中。在某些实施方式中，治疗剂靶向用于修正疾病状态的失调的细胞途径的蛋白质。
通常，本发明的DNA载体/构建体可用于递送编码多肽或功能性RNA的核酸，以治疗和/或预防对其而言递送治疗性多肽或功能性RNA是有利的任何疾病状态。说明性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和肺的其它疾病；血友病A(VIII因子)；血友病B(IX因子)；地中海贫血(β珠蛋白)；贫血(红细胞生成素)和其它血液紊乱；阿尔茨海默氏病(GDF；脑啡肽酶)；多发性硬化(β干扰素)；帕金森氏病(胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF))；亨廷顿氏病(RNAi以去除重复)；肌萎缩性侧索硬化；癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其它神经紊乱；癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配体、细胞因子(包括干扰素)、RNAi(包括针对VEGF或多药抗性基因产物的RNAi))；糖尿病(胰岛素)；肌营养不良，包括杜氏肌营养不良(肌营养不良蛋白、小肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖(sarcoglycan，例如α、β、γ)、针对肌肉生长抑制素的RNAi、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、抗炎多肽(例如IκB显性突变体)、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、小抗肌萎缩蛋白相关蛋白、针对肌营养不良蛋白基因中的剪接点以诱导外显子跳跃的RNAi(参见例如WO/2003/095647)、针对U7 snRNA以诱导外显子跳跃的反义(参见例如WO/2006/021724)、和针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)以及贝克尔肌营养不良；戈谢病(葡糖脑苷脂酶)；Hurler病(α-L-艾杜糖醛酸酶)；腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)；糖原贮积病(例如法布里病(α-半乳糖苷酶)和庞贝氏症(溶酶体酸性α-葡糖苷酶))及其它代谢缺陷；先天性肺气肿(α1抗胰蛋白酶)；莱施-奈恩(Lesch-Nyhan)综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)；Niemann-Pick病(鞘磷脂酶)；泰萨克斯(TaysSachs)病(溶酶体氨基己糖苷酶A)；枫糖尿病(支链酮酸脱氢酶)；视网膜变性疾病(以及眼和视网膜的其它疾病；例如黄斑变性的PDGF)；实体器官的疾病，例如脑的疾病(包括帕金森氏病(GDNF)、星形细胞瘤(内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi)、成胶质细胞瘤(内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi)，肝、肾、心脏的疾病，包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD)(例如通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I(I-1)、serca2a、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、β2肾上腺素能受体、β2肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、实施G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(例如截短的组成型活性bARKct)；calsarcin、针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，例如受磷蛋白S16E等)；关节炎(胰岛素样生长因子)；关节紊乱(胰岛素样生长因子1和/或2)；内膜增生(例如通过递送enos、inos)；改善心脏移植的存活(超氧化物歧化酶)；AIDS(可溶性CD4)；肌萎缩(胰岛素样生长因子I)；肾功能不足(红细胞生成素)；贫血(红细胞生成素)；关节炎(抗炎因子，如IRAP和TNFα可溶性受体)；肝炎(α干扰素)；LDL受体缺陷(LDL受体)；高氨血症(鸟氨酸转氨甲酰酶)；克拉伯病(半乳糖脑苷脂酶)；巴滕病；脊髓脑性共济失调，包括SCA1、SCA2和SCA3；苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)；自身免疫疾病等。本发明可进一步在器官移植后用于增加移植物的成功和/或减少器官移植或辅助疗法(例如通过给予免疫抑制剂或抑制性核酸以阻断细胞因子生产)的不良副作用。作为另一实例，骨形态发生蛋白(包括BNP2、BNP7等，RANKL和/或VEGF)可与骨同种异体移植物一起给予，例如在骨折或癌症患者的手术切除后。
在一个实施方式中，异源核酸进一步编码报告多肽(例如酶)。报告多肽是本领域已知的，包括但不限于绿色荧光蛋白、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。
在一个实施方式中，异源核酸编码分泌多肽(例如，在其天然状态下是分泌多肽的多肽，或已被工程化以进行分泌的多肽，例如通过与本领域已知的分泌信号序列可操作地结合)。
在一个实施方式中，异源核酸可操作地连接至控制元件，例如转录/翻译控制信号、复制起始位点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等。
可替代地，在本发明的具体实施方式中，异源核酸可编码反义核酸、核酶(例如如美国专利No.5,877,022中所述)、实施剪接体介导的反式剪接的RNA(参见Puttaraju等，(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利No.6,013,487；美国专利No.6,083,702)、干扰RNA(RNAi)(包括介导基因沉默的miRNA、siRNA或shRNA，参见Sharp等，(2000)Science 287:2431)、以及其它非翻译RNA(例如“向导”RNA，Gorman等，(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:4929；Yuan等的美国专利No.5,869,248)等。示例性的非翻译RNA包括针对多药抗性(MDR)基因产物的RNAi(例如以治疗和/或预防肿瘤和/或用于向心脏给予以预防化疗的损伤)；针对肌肉生长抑制素的RNAi(例如用于杜氏肌营养不良)；针对VEGF的RNAi(例如以治疗和/或预防肿瘤)；针对受磷蛋白的RNAi(例如以治疗心血管疾病，参见例如，Andino等，J.Gene Med.10:132-142(2008)以及Li等，Acta Pharmacol Sin.26:51-55(2005))；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，如受磷蛋白S16E(例如以治疗心血管疾病，参见例如，Hoshijima等，Nat.Med.8:864-871(2002))；针对腺苷激酶的RNAi(例如用于癫痫)；以及针对病原生物体和病毒(例如乙型和/或丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、CMV、单纯疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)的RNAi。
在一个实施方式中，DNA载体表达免疫原性多肽，例如用于免疫接种。免疫原性多肽可以是适于引发免疫应答和/或保护受试者免于感染和/或疾病的任何多肽，包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒感染和疾病。例如，免疫原性多肽可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白、或马流感病毒免疫原)、或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原、或人免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，例如HIV或SIV包膜GP160蛋白，HIV或SIV基质/衣壳蛋白，和HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原性多肽还可以是沙粒病毒免疫原(例如拉沙热病毒(Lassa fever virus)免疫原，例如拉沙热病毒核衣壳蛋白和/或拉沙热包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如牛痘病毒免疫原，例如牛痘L1或L8基因产物)、黄病毒免疫原(例如黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒(Marburg virus)免疫原，例如NP和GP基因产物)、布尼亚病毒(bunyavirus)免疫原(例如RVFV、CCHF和/或SFS病毒免疫原)、或冠状病毒(coronavirus)免疫原(例如感染性人冠状病毒免疫原，如人冠状病毒包膜糖蛋白、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽感染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽可以进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹病毒免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎病毒免疫原、麻疹病毒免疫原、风疹病毒免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原、和/或本领域目前已知或以后鉴定为免疫原的任何其它疫苗免疫原。
可替代地，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原在癌细胞的表面上表达。示例性的癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A.Rosenberg(Immunity 10:281(1991))中。其它说明性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β连环蛋白、MUM-1、半胱天冬酶-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑色素瘤肿瘤抗原(Kawakami等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515；Kawakami等(1994)J.Exp.Med.，180:347；Kawakami等(1994)Cancer Res.54:3124)、MART-1、gp100 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪氨酸酶(Brichard等(1993)J.Exp.Med.178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利No.4,968,603)、CA125、LK26、FB5(内皮唾液酸蛋白)、TAG 72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN(唾液酸Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受体、乳脂珠蛋白、p53肿瘤抑制蛋白(Levine,(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)；粘蛋白抗原(PCT公开No.WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；和/或目前已知或以后发现的与下述癌症相关的抗原：黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌和目前已知或以后鉴定的任何其它癌症或恶性病症(参见例如Rosenberg,(1996)Ann.Rev.Med.47:481-91)。
本发明的DNA载体可用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸，以治疗和/或预防对其而言递送治疗性多肽或功能性RNA是有利的任何疾病状态。说明性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和肺的其它疾病；血友病A(VIII因子)；血友病B(IX因子)；地中海贫血(β珠蛋白)；贫血(红细胞生成素)和其它血液紊乱；阿尔茨海默氏病(GDF；脑啡肽酶)；多发性硬化(β干扰素)；帕金森氏病(胶质细胞系源性神经营养因子[GDNF])；亨廷顿氏病(RNAi以去除重复)；肌萎缩性侧索硬化；癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其它神经紊乱；癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配体、细胞因子(包括干扰素)、RNAi(包括针对VEGF或多药抗性基因产物的RNAi)、mir-26a[例如用于肝细胞癌])；糖尿病(胰岛素)；肌营养不良，包括杜氏肌营养不良(肌营养不良蛋白、小肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖[例如α、β、γ]、针对肌肉生长抑制素的RNAi、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、抗炎多肽(例如IκB显性突变体)、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、小抗肌萎缩蛋白相关蛋白、针对肌营养不良蛋白基因中的剪接点以诱导外显子跳跃的反义或RNAi[参见例如PCT公开No.WO/2003/095647]、针对U7 snRNA以诱导外显子跳跃的反义[参见例如PCT公开No.WO/2006/021724]、和针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)和贝克尔肌营养不良；戈谢病(葡糖脑苷脂酶)；Hurler病(α-L-艾杜糖醛酸酶)；腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)；糖原贮积病(例如法布里病[α-半乳糖苷酶]和庞贝氏症[溶酶体酸性α-葡糖苷酶])及其它代谢紊乱；先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)；莱施-奈恩综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)；Niemann-Pick病(鞘磷脂酶)；泰萨克斯病(溶酶体氨基己糖苷酶A)；枫糖尿病(支链酮酸脱氢酶)；视网膜变性疾病(以及眼和视网膜的其它疾病；例如黄斑变性和/或vasohibin的PDGF，或VEGF的其它抑制剂或其它血管发生抑制剂以治疗/预防视网膜紊乱，例如在I型糖尿病中)；实体器官的疾病，例如脑的疾病(包括帕金森氏病[GDNF]、星形细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi]、成胶质细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi])，肝、肾、心脏的疾病，包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD)(例如通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I(I-1)及其片段(例如I1C)、serca2a、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、β2肾上腺素能受体、β2肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、实施G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(例如截短的组成型活性bARKct)；calsarcin，针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，例如受磷蛋白S16E等)；关节炎(胰岛素样生长因子)；关节紊乱(胰岛素样生长因子1和/或2)；内膜增生(例如通过递送enos、inos)；改善心脏移植的存活(超氧化物歧化酶)；AIDS(可溶性CD4)；肌萎缩(胰岛素样生长因子I)；肾功能不足(红细胞生成素)；贫血(红细胞生成素)；关节炎(抗炎因子，如IRAP和TNFα可溶性受体)；肝炎(α干扰素)；LDL受体缺陷(LDL受体)；高氨血症(鸟氨酸转氨甲酰酶)；克拉伯病(半乳糖脑苷脂酶)；巴滕病；脊髓脑性共济失调，包括SCA1、SCA2和SCA3；苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)；自身免疫疾病等。本发明可以进一步在器官移植后用于增加移植物的成功和/或减少器官移植或辅助疗法(例如通过给予免疫抑制剂或抑制性核酸以阻断细胞因子生产)的不良副作用。作为另一实例，骨形态发生蛋白(包括BNP2、BNP7等，RANKL和/或VEGF)可与骨同种异体移植物一起给予，例如在骨折或癌症患者的手术切除后。
还可以实施本发明以治疗和/或预防代谢紊乱，例如，糖尿病(例如胰岛素)，血友病(例如IX因子或VIII因子)，溶酶体贮积病(例如粘多糖贮积症，例如斯莱(Sly)综合征(β-葡糖醛酸糖苷酶)、Hurler综合征(α-L-艾杜糖醛酸酶)、Scheie综合征(α-L-艾杜糖醛酸酶)、Hurler-Scheie综合征(α-L-艾杜糖醛酸酶)、亨特氏综合征(艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、Sanfilippo综合征A(肝素磺酰胺酶)、Sanfilippo综合征B(N-乙酰氨基葡糖苷酶)、Sanfilippo综合征C(乙酰-CoA:α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶)、Sanfilippo综合征D(N-乙酰氨基葡糖-6-硫酸酯酶)、Morquio综合征A(半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶)、Morquio综合征B(β-半乳糖苷酶)、Maroteaux-Lamy综合征(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)等)，法布里病(α-半乳糖苷酶)，戈谢病(葡糖脑苷脂酶)，或糖原贮积病(例如庞贝氏症；溶酶体酸性α-葡糖苷酶)。
如本文所述，还可实践本发明以治疗和/或预防溶酶体贮积病，例如粘多糖贮积症(例如斯莱综合征(β-葡糖醛酸糖苷酶)、Hurler综合征(α-L-艾杜糖醛酸酶)、Scheie综合征(α-L-艾杜糖醛酸酶)、Hurler-Scheie综合征(α-L-艾杜糖醛酸酶)、亨特氏综合征(艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、Sanfilippo综合征A(肝素磺酰胺酶)、Sanfilippo综合征B(N-乙酰氨基葡糖苷酶)、Sanfilippo综合征C(乙酰-CoA:α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶)、Sanfilippo综合征D(N-乙酰氨基葡糖-6-硫酸酯酶)、Morquio综合征A(半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶)、Morquio综合征B(β-半乳糖苷酶)、Maroteaux-Lamy综合征(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)等)、法布里病(α-半乳糖苷酶)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)、或糖原贮积病(例如庞贝氏症；溶酶体酸性α-葡糖苷酶)。
进一步，本发明还可用于生产诱导多能干细胞(iPS)。例如，本发明的DNA载体可用于将干细胞相关核酸递送到非多能细胞中，例如成体成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等。编码与干细胞相关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多能性(pluripotency)相关的此类因子的非限制性实例包括Oct-3/4、SOX家族(例如SOX1、SOX2、SOX3和/或SOX15)、Klf家族(例如Klf1、Klf2、Klf4和/或Klf5)、Myc家族(例如C-myc、L-myc和/或N-myc)、NANOG和/或LIN28。
除非本文另有定义，与本申请结合使用的科学术语和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。
应当理解的是，本发明并不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂等，因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
除了在操作实施例中或者另有说明之处，本文使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。
在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法和其各自的组分，它们对于本发明是必需的，但还对包含必需或非必需的未指明的元素来说是开放的(“包含”)。在一些实施方式中，待包括在组合物、方法或其各自组分的描述中的其它元素限于那些不实质上影响本发明的基本特征和新颖特征的元素(“基本上由...组成”)。这同样适用于所述方法中的步骤以及其中的组合物和组分。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法和其各自的组分旨在排除不被认为是对组分、组合物或方法而言必要的元素的任何元素(“由...组成”)。
出于描述和公开的目的，以引用的方式将涉及的所有专利、专利申请和出版物明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本发明关联使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这方面任何内容不应被视为承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此公开提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成任何关于这些文件的日期或内容的正确性的承认。
通过以下实施例对本发明进行进一步说明，这些实施例不应解释为进一步的限制。
可在以下两组编号的段落中对本文所述发明的各种实施方式进行进一步描述。
1.一种用于将核酸构建体引入靶细胞中以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：
a.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：
i.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；
ii.D’区域；
iii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’区域的位置与所述A和A’区域邻近；
b.核酸构建体的互补链，所述互补链包含可退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；
c.其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及
d.其中，所述DNA构建体可在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。
2.如段落1所述的方法，其中，所述D区域包含切口产生位点。
3.如段落1所述的方法，其中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。
4.如段落1所述的方法，其中，所述D区域的长度为约20nt。
5.如段落1所述的方法，其中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。
6.如段落1所述的方法，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
7.如段落1所述的方法，其中，所述依赖病毒是AAV。
8.如段落1的方法，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
9.如段落8所述的方法，其中，所述ITR充当启动子。
10.如段落8所述的方法，其中，所述启动子与所述ITR是分开的。
11.如段落1-10所述的方法，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
12.如段落4所述的方法，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
13.如段落12所述的方法，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
14.如段落1所述的方法，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
15.如段落14所述的方法，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
16.如段落1-15中任一段所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
17.如段落14所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
18.如段落16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
19.如段落16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
20.如段落16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
21.如段落1-20中任一段所述的方法，其中，所述至少一个DD-ITR由AAV ITR、细小病毒ITR或合成的ITR产生。
22.如段落1-21中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体包含两个DD-ITR。
23.如段落1-22中任一段所述的方法，其中，所述D区域来自与所述ITR不同的构造型。
24.如段落22所述的方法，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
25.如段落22所述的方法，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
26.如段落1-25中任一段所述的方法，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换和/或插入。
27.如段落1-26中任一段所述的方法，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换和/或插入。
28.如段落1-27中任一段所述的方法，其中，在宿主细胞中由原核端粒酶活性形成的共价封闭末端处，所述DNA构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点。
29.如段落28所述的方法，其中，在诱导型启动子的控制下，所述宿主细胞表达所述原核端粒酶。
30.如段落1-27中任一段所述的方法，其中，在体外由原核端粒酶活性形成的共价封闭末端处，所述DNA构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点。
31.如段落1-30中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
32.如段落1-31中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体可在所述细胞中转化成多联体结构。
33.如段落1-32中任一段所述的方法，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
34.如段落32-33中任一段所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
35.如段落32-34中任一段所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
36.如段落32-34中任一段所述的方法，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
37.如段落1-36中任一段所述的方法，其中，所述核酸是治疗性核酸。
38.如段落1-37中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞在体外。
39.如段落1-37中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞在体内。
40.如段落1-37中任一段所述的方法，其中，将所述构建体离体给予所述靶细胞。
41.如段落1-40中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞是遗传缺陷型细胞和/或患病细胞。
42.如段落1-41中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞是患病细胞。
43.如段落1-42中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
44.一种用于将预定核酸序列递送至靶细胞中以进行持续表达的DNA载体，所述DNA载体包含：
a.两个DD-ITR，所述DD-ITR各自包含：
i.具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域的反向末端重复；
ii.D’区域；以及
iii.其中，所述D和D’区域是长度为约5nt-20nt的互补回文序列，且位置与所述A和A’区域邻近；
d.所述预定核酸序列(例如用于表达的异源基因)；以及
其中，在共价封闭的非病毒DNA的情况下，所述两个DD-ITR位于所述核酸的侧翼。
45.如段落44所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸序列与启动子可操作地连接。
46.如段落44所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的核酸序列的表达。
47.如段落46所述的DNA载体，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
48.如段落47所述的DNA载体，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
49.如段落44所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
50.如段落49所述的DNA载体，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
51.如段落45所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述预定的核酸序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
52.如段落46所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
53.如段落51或52所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
54.如段落53所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
55.如段落53所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
56.如段落44-55中任一段所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR由选自于由细小病毒ITR和合成的ITR所组成的组中的ITR产生。
57.如段落56所述的DNA载体，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
58.如段落57所述的DNA载体，其中，所述依赖病毒是AAV。
59.如段落44-58中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA构建体包含多于两个的DD-ITR。
60.如段落59所述的DNA载体，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
61.如段落60所述的DNA载体，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
62.如段落44-61中任一段所述的DNA载体，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换或插入。
63.如段落44-61中任一段所述的DNA载体，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换或插入。
64.如段落44-63中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端通过体外原核端粒酶活性形成。
65.如段落44-64中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
66.如段落44-65中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体可在所述细胞中转化成多联体结构。
67.如段落44-66中任一段所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
68.如段落66-67中任一段所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
69.如段落66-68中任一段所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
70.如段落66-68中任一段所述的DNA载体，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
71.如段落44-70中任一段所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸是治疗性核酸。
72.如段落44-71所述的DNA载体，其中，至少一个DD-ITR是AAV ITR。
73.如段落44-72中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体进一步包含位于两个DD-ITR的侧翼的部分原核端粒酶结合位点。
74.如段落73所述的DNA载体，其中，所述位于两个DD-ITR的侧翼的部分原核端粒酶结合位点通过体外原核端粒酶活性或通过体内原核端粒酶活性形成。
75.如段落44-74中任一段所述的DNA载体，其中，所述共价封闭的非病毒DNA构建体在所述靶细胞内作为多联体结构持续存在。
76.如段落75所述的DNA载体，其中，所述DNA载体促进所述核酸持续表达2周-5周、1个月-12个月、1年-10年或更长的时间段。
77.一种用于将核酸引入靶细胞以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：
a.至少一个ITR序列，所述ITR序列选自于由图5所示的ITR所组成的组；
b.核酸构建体的互补链，其中，所述核酸构建体包含预定的DNA序列，其中，所述互补链可退火成可表达的dsDNA；并且
c.其中，所述DNA构建体形成具有发夹共价封闭末端的线性DNA。
78.如段落77所述的方法，其中，所述ITR序列在任一侧以互补序列D和D’作为侧翼，从而产生DD-ITR。
79.如段落77所述的方法，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
80.如段落77所述的方法，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
81.如段落77所述的方法，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
82.如段落81所述的方法，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
83.如段落77所述的方法，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
84.如段落83所述的方法，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
85.如段落77-84所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
86.如段落77-85所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
87.如段落85或86所述的方法，其中，所述间隔区是至少5个核苷酸。
88.如段落87所述的方法，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
89.如段落87所述的方法，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
90.如段落77-89中任一段所述的方法，其中，所述至少一个DD-ITR从细小病毒ITR或合成的ITR产生。
91.如段落90所述的方法，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
92.如段落91所述的方法，其中，所述依赖病毒是AAV。
93.如段落65-78中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体包含两个DD-ITR。
94.如段落93所述的方法，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
95.如段落93所述的方法，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
96.如段落77-95中任一段所述的方法，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换或插入。
97.如段落77-95中任一段所述的方法，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换或插入。
98.如段落77-97中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端通过体外原核端粒酶活性形成。
99.如段落77-98中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
100.如段落77-99中任一段所述的方法，其中，所述DNA构建体可在所述细胞中转化成多联体结构。
101.如段落77-100中任一段所述的方法，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少1周-5周、至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
102.如段落100-101中任一段所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
103.如段落100-102中任一段所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
104.如段落100-102中任一段所述的方法，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
105.如段落77-104中任一段所述的方法，其中，所述核酸是治疗性核酸。
106.如段落77-105中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞在体外。
107.如段落77-105中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞在体内。
108.如段落77-105中任一段所述的方法，其中，将所述构建体离体给予所述靶细胞。
109.如段落77-108中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞是遗传缺陷型细胞。
110.如段落77-108中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞是患病细胞。
111.如段落77-110中任一段所述的方法，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
112.一种细胞或其群，所述细胞或其群通过段落1-43或77-111中任一段所述的方法产生。
113.一种共价封闭的非病毒线性DNA载体，所述共价封闭的非病毒线性DNA载体用于将预定的核酸递送到靶细胞中以进行持续表达，所述载体包含：
a.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：
i.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；
ii.D’区域；
iii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’区域的位置与所述A和A’区域邻近；
b.核酸构建体的互补链，所述互补链包含可退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；
c.其中，所述DNA载体构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及
d.其中，所述DNA载体构建体可在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。
114.如段落113所述的DNA载体，其中，所述D区域包含切口产生位点。
115.如段落113所述的DNA载体，其中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。
116.如段落113所述的DNA载体，其中，所述D区域的长度为约20nt。
117.如段落113所述的DNA载体，其中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。
118.如段落113所述的DNA载体，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
119.如段落113所述的DNA载体，其中，所述依赖病毒是AAV。
120.如段落113所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
121.如段落120所述的DNA载体，其中，所述ITR充当启动子。
122.如段落120所述的DNA载体，其中，所述启动子与所述ITR是分开的。
123.如段落113-122所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
124.如段落113所述的DNA载体，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
125.如段落124所述的DNA载体，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
126.如段落113所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
127.如段落126所述的DNA载体，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
128.如段落1-127中任一段所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
129.如段落126所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
130.如段落128或129所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
131.如段落128或129所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
132.如段落128或129所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
133.如段落113-132中任一段所述的DNA载体，其中，所述至少一个DD-ITR由AAVITR、细小病毒ITR或合成的ITR产生。
134.如段落113-133中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体包含两个DD-ITR。
135.如段落113-134中任一段所述的DNA载体，其中，所述D区域来自与所述ITR不同的构造型。
136.如段落134所述的DNA载体，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
137.如段落134所述的DNA载体，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
138.如段落113-137中任一段所述的DNA载体，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换和/或插入。
139.如段落113-138中任一段所述的DNA载体，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换和/或插入。
140.如段落113-139中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端通过体外原核端粒酶活性形成。
141.如段落113-140中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
142.如段落113-141中任一段所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体可在所述细胞中转化成多联体结构。
143.如段落113-142中任一段所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
144.如段落142-143中任一段所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
145.如段落142-143中任一段所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
146.如段落142-143中任一段所述的DNA载体，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
147.如段落113-146中任一段所述的DNA载体，其中，所述核酸是治疗性核酸。
148.一种用于将核酸递送至靶细胞的药物组合物，所述药物组合物包含段落44-76和113-147中任一段所述的DNA载体和药学上可接受的载体，以用于递送至靶细胞，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
149.如段落148所述的药物组合物，其中，向所述靶细胞体内给予所述组合物以用于治疗疾病或紊乱。
150.如段落28所述的方法，其中，将所述宿主细胞设计为在诱导型启动子的控制下至少编码第一Tel重组酶，其中，所述细胞包含适于产生无细菌序列的载体的表达载体，所述载体含有表达盒，并且感兴趣的核酸以至少一个DD-ITR作为侧翼，并且在任一侧以Tel重组酶的靶序列作为侧翼。
151.如段落150所述的方法，其中，整合在Tel靶序列的非结合区域内的是一种或多种额外的重组酶的靶结合序列。
152.如段落151所述的方法，其中，所述一种或多种额外的重组酶选自于由pK02telRL位点、telRL位点、pal位点、loxP位点、FRT位点、phiC31、attP位点和XattP位点所组成的组。
153.一种产生包含至少一个DD-ITR的线性共价封闭载体的方法，所述方法包括在适于允许第一重组酶表达的条件下对段落150所述的宿主细胞进行孵育，以产生线性共价封闭载体。
154.一种产生包含至少一个DD-ITR的环状共价封闭载体的方法，所述方法包括在适于允许第二重组酶表达的条件下对段落151-152所述的宿主细胞进行孵育，以产生环状共价封闭载体。
155.如段落150所述的方法，其中，所述Tel重组酶靶位点是噬菌体PY54 Tel 142碱基对靶位点。
156.如段落150-155所述的方法，其中，所述感兴趣的核酸在两侧均以DD-ITR作为侧翼。
第二组编号的段落：
1.一种制造包含转基因的环状核酸载体的方法，所述方法包括：
(a)使宿主系统与模板接触，其中，所述模板包含至少一个侧翼切割位点，和：
i.至少一个噬菌体复制起始位点(ORI)，
ii.至少一个末端重复(TR)，以及
iii.与转基因可操作地连接的启动子序列，
其中，至少一个TR是腺相关病毒(AAV)双D ITR(DD-ITR)；
b.将所述宿主系统孵育足以发生复制的时间，以产生环状核酸；以及
c.回收所产生的环状核酸，其中，所述环状核酸自退火。
2.如段落1所述的方法，其中，所述模板进一步包含第二侧翼切割位点，并且在两个位点内是(i)-(iii)。
3.如段落1和2所述的方法，其中，所述模板进一步包含紧邻所述至少一个ORI的下游的至少一个额外的切割位点。
4.如段落1-3中任一段所述的方法，所述方法进一步包括对所回收的环状核酸的至少一个切割位点进行剪切的步骤。
5.如段落1中任一段所述的方法，所述方法进一步包括在回收之后，在体外复制所述环状核酸的步骤。
6.如段落1所述的方法，其中，所述模板进一步包含至少一个衔接子序列。
7.如段落1所述的方法，其中，所述模板进一步包含至少两个衔接子序列。
8.如段落6或7所述的方法，其中，所述衔接子序列诱导切割的DNA的封闭。
9.如段落6或7所述的方法，其中，所述衔接子序列进一步包含切割位点。
10.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，将所回收的环状核酸用于所述转基因的递送。
11.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，将所回收的环状核酸用于重组病毒载体的生产。
12.如段落1所述的方法，其中，所述环状核酸是自退火的和双链的。
13.如段落1所述的方法，其中，所述载体是单链的。
14.如段落1所述的方法，其中，存在第二TR，并且与转基因可操作地连接的启动子序列在两侧均以TR作为侧翼。
15.如段落1所述的方法，其中，所述ORI在左TR的上游。
16.如段落1所述的方法，其中，所述ORI以TR作为侧翼并且在与转基因可操作地连接的所述启动子序列的上游。
17.如段落1所述的方法，其中，所述宿主系统是细菌包装细胞。
18.如段落1所述的方法，其中，所述宿主系统是无细胞系统。
19.如段落1所述的方法，其中，所述宿主系统是无细胞系统并且包含辅助噬菌体颗粒。
20.如段落1所述的方法，其中，所述宿主系统是宿主细胞。
21.如段落20所述的方法，其中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞或昆虫细胞。
22.如段落11所述的方法，其中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)、单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒(AV)或痘病毒(PV)。
23.如段落11和22所述的方法，其中，所述病毒载体是DNA或RNA病毒。
24.如段落22所述的方法，其中，所述病毒是AAV并且具有突变的ITR，其中，所述突变的ITR是双D突变的ITR。
25.如段落1所述的方法，其中，所述至少一个TR是突变的ITR、合成的ITR、野生型ITR或非功能性ITR。
26.如段落1所述的方法，其中，所述载体具有侧翼DD-ITR，并且在所述侧翼DD-ITR之间是与所述转基因的有义链可操作地连接的启动子、复制缺陷型ITR和所述转基因的反义互补序列。
27.如段落25-26所述的方法，其中，所述ITR是AAV ITR。
28.如段落1所述的方法，其中，所述ORI位于所述ITR的上游，并且紧邻上游ITR的下游。
29.如段落1所述的方法，其中，至少一个噬菌体ORI选自于由如下所组成的组：M13衍生的ORI、F1衍生的ORI或Fd衍生的ORI。
30.如段落1所述的方法，其中，所述模板进一步包含第二ORI，所述第二ORI是不启动复制的截短的ORI。
31.如段落30所述的方法，其中，所述截短的ORI是ORIΔ29。
32.如段落1所述的方法，其中，所述至少两个切割位点是限制性位点。
33.如段落32所述的方法，其中，所述至少两个限制性位点相同或不同。
34.如段落32所述的方法，其中，在转基因序列内不存在所述限制性位点。
35.如段落1所述的方法，其中，通过核酸酶切割所述切割位点。
36.如段落1所述的方法，其中，所述启动子选自于由如下所组成的组：组成型启动子、阻遏型启动子、泛在启动子(ubiquitous promoter)、诱导型启动子、病毒启动子、组织特异性启动子和合成的启动子。
37.如段落1所述的方法，其中，所述转基因是治疗性基因。
38.一种制造包含转基因的环状核酸载体的方法，所述方法包括：
a.用质粒模板转化宿主系统，其中，所述质粒模板包含：
i.噬菌体复制起始位点(ORI)；
ii.截短的噬菌体ORI(例如ORIΔ29)；
iii.至少一个末端重复(TR)；以及
iv.与转基因可操作地连接的启动子序列，
其中，所述质粒模板在5’至3’方向上包含由发夹序列分隔开的有义序列和反义序列，以允许有义链和反义链的退火，
并且其中至少一个TR是AAV双D ITR(DD-ITR)；
b.将所述宿主系统孵育足以发生复制的时间，以产生环状核酸；以及
c.回收所产生的环状核酸，
其中所述环状核酸自退火。
39.如段落38所述的方法，所述方法进一步包括位于所述ORI的侧翼的自互补接头和接头。
40.如段落38所述的方法，其中，所述转基因包含由接头序列分隔开的有义序列及其反义互补序列，以允许有义链和反义链结合为双链。
41.如段落38所述的方法，其中，所述截短的ORI是ORIΔ29。
42.一种环状核酸载体，所述环状核酸载体通过段落1-41中任一段所述的方法制造。
43.一种环状核酸载体，所述环状核酸载体包含：
至少一个侧翼切割位点，以及：
i.至少一个噬菌体复制起始位点(ORI)；
ii.至少一个末端重复(TR)；以及
iii.与转基因可操作地连接的启动子序列，
其中，至少一个TR是AAV双D ITR(DD-ITR)。
44.如段落43所述的载体，其中，所述模板进一步包含第二侧翼切割位点，并且在两个位点内是(i)-(iii)。
45.如段落43和44所述的载体，其中，所述载体进一步包含紧邻所述至少一个ORI下游的至少一个额外的切割位点。
46.如段落43所述的载体，其中，所述载体进一步包含至少一个衔接子序列。
47.如段落43所述的载体，其中，所述载体进一步包含至少两个衔接子序列。
48.如段落46和47所述的载体，其中，所述衔接子序列诱导切割的DNA的封闭。
49.如段落46和47所述的载体，其中，所述衔接子序列进一步包含切割位点。
50.如段落43-49中任一段所述的载体，其中，所述载体用于递送所述转基因。
51.如段落43-49中任一段所述的载体，其中，所述载体用于重组病毒载体的生产。
52.如段落43所述的载体，其中，所述载体是自退火的和双链的。
53.如段落43所述的载体，其中，所述载体是单链的。
54.如段落43所述的载体，其中，存在第二TR，并且与转基因可操作地连接的启动子序列在两侧均以TR作为侧翼。
55.如段落43所述的载体，其中，所述ORI在左TR的上游。
56.如段落43所述的载体，其中，所述ORI以TR作为侧翼并且在与转基因可操作地连接的启动子序列的上游。
57.如段落43所述的载体，其中，所述至少一个TR是突变的ITR、合成的ITR、野生型ITR或非功能性ITR。
58.如段落43所述的载体，其中，所述载体具有侧翼DD-ITR，并且在所述侧翼之间是与所述转基因的有义链可操作地连接的启动子、复制缺陷型ITR和所述转基因的反义互补序列。
59.如段落57和58所述的载体，其中，所述ITR是AAV ITR。
60.如段落43所述的载体，其中，所述ORI位于所述ITR的上游，并且紧邻上游ITR的下游。
61.如段落43所述的载体，其中，所述噬菌体ORI选自于由如下所组成的组：M13衍生的ORI、F1衍生的ORI或Fd衍生的ORI。
62.如段落43所述的载体，其中，所述模板进一步包含第二ORI，所述第二ORI是不启动复制的截短的ORI。
63.如段落43所述的载体，其中，所述截短的ORI是ORIΔ29。
64.如段落43所述的载体，其中，所述至少两个切割位点是限制性位点。
65.如段落64所述的载体，其中，所述至少两个限制性位点相同或不同。
66.如段落64所述的载体，其中，在转基因序列内不存在所述限制性位点。
67.如段落43所述的载体，其中，通过核酸酶切割所述切割位点。
68.如段落43所述的载体，其中，所述启动子选自于由如下所组成的组：组成型启动子、阻遏型启动子、泛在启动子、诱导型启动子、病毒启动子、组织特异性启动子和合成的启动子。
69.如段落43所述的载体，其中，所述转基因是治疗性基因。
70.一种环状核酸载体，所述环状核酸载体包含：
i.噬菌体复制起始位点(ORI)；
ii.截短的噬菌体ORI(例如ORIΔ29)；
iii.至少一个末端重复(TR)；以及
iv.与转基因可操作地连接的启动子序列，
其中，所述载体在5’至3’方向上包含由发夹序列分隔开的有义序列和反义序列，以允许有义链和反义链的退火，并且
其中，所述至少一个TR是AAV双D ITR(DD-ITR)。
71.如段落70所述的载体，所述载体进一步包含位于所述ORI的侧翼的自互补接头和接头。
72.如段落70所述的载体，其中，所述转基因包含由接头序列分隔开的有义序列及其反义互补序列，以允许有义链和反义链结合为双链。
73.如段落70所述的载体，其中，所述截短的ORI是ORIΔ29。
74.如段落35所述的方法，其中，所述核酸酶是原核端粒酶。
75.如段落67所述的载体，其中，所述核酸酶是原核端粒酶。
实施例
实施例1：共价封闭线性载体的生产
A.双D ITR序列的合成
使用聚合酶链式反应(PCR)构建在另一端添加D’序列的反向末端重复。基本原理是基于ITR的T形结构。在第一轮PCR反应中，AAV病毒IRT自引发延伸以在茎上产生包含D和D’的长T形发夹结构。变性后，该DNA可作为单引物PCR的模板。
由于ITR区域中的高GC含量和强回文结构，可采用几种策略(例如7-deazo-dGTP、2.5％甲酰胺和高浓度的引物)来解决PCR问题并产生足够的期望PCR产物。为了方便克隆，将EcoRI识别序列连接到引物的5’，以使PCR产物可被EcoRI剪切，并容易地克隆到pGEM 3Z的多接头中。由于ITR在细菌宿主中的不稳定性，将重组质粒转化到大肠杆菌SURE菌株(Stratagene，在其中ITR是相当稳定的)中。通过使用上述策略，可获得许多阳性克隆。一些克隆的特征在于限制性消化和测序。使用显示在pGEM3Z的EcoRI位点中带有D’ABB’CC’A’D插入物的克隆中的一种。这种产生的名为pDD-2的质粒(图6)是DD-ITR的示例性来源。
材料和方法
B.PCR和ITR质粒的构建。使用来自AAV和Ad5感染细胞的低分子量DNA作为模板用于PCR反应，所述PCR反应用衍生自AAV的D序列的单引物进行。PCR在如下条件中进行：在含有20mM Tris-HCl(pH8.8)、1.5mM MgCl、50mM KCl、2.5％甲酰胺、100μM dATP、dCTP和dTTP、75μM 7-deazo-dGTP、25μM dGTP、1.5U AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus)、1ng AAV DNA和100pmole引物TR-1(5’-GGAATTCAGGAACCCCTAGTGATGG3·-3’)的50μl的反应溶液中，94℃1min，45℃30秒，72℃1分钟，35个循环。通过琼脂糖凝胶电泳将PCR产物纯化，用EcoRI剪切，并与经EcoRI剪切和去磷酸化的pGEM 3Z质粒(Promega)连接。将连接的质粒转化到大肠杆菌Sure菌株(Stratagene)中。筛选存在双D末端重复的阳性克隆，并通过用7-deazo-dGTP取代dGTP的双脱氧测序进行确认(Sanger，F.等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463-5467)。随后，将新基因(neogene)克隆到pDD的SalI位点，得到质粒pDD-neo。将pDD-neo用作DD-ITR的来源。
C.从双链环状DNA模板生产封闭线性DNA
使用双链环状DNA作为DNA模板，所述双链环状DNA包含处于可表达形式的萤光素酶报告基因、DD-ITR和原核端粒酶TelN结合序列。将与包含原核端粒酶TelN结合位点的半个回文序列的一段互补的单个回文寡核苷酸用于特异性地引发两条链。合适的引物实例包括：
Figure BDA0002947054230000891
其中，Y为T或C，W为A或T，R为A或G。在含有例如30mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、2.5mM MgCl2的退火/变性缓冲液中进行双链环状模板的变性和单引物的退火。变性通过加热至95℃并在该温度下保持1至10分钟进行，随后仔细控制冷却方式，以优化对特异性引物与模板的最大结合。然后将温度降低至由合适的DNA聚合酶进行DNA扩增的最适温度。合适的酶是分离自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体phi29的phi29，该酶在30℃工作最佳。
然后，将包含酶phi29和PPi(酵母无机焦磷酸酶)的适量反应缓冲液添加到退火的DNA/引物反应中。将反应混合物在约30℃下孵育5小时至20小时或更长。合适的反应缓冲液通常包含35mM Tris-HCl、50mM KCl、2.5mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、1mM dNTP。
然后，在30℃下在合适的缓冲液(例如10mM Tris HCl pH 7.6、5mM CaCl2、50mM谷氨酸钾、0.1mM EDTA、1mM DTT)中，将由RCA扩增的多联体DNA与原核端粒酶TelN一起孵育直至反应完成。可根据待纯化的量例如通过凝胶电泳或合适的色谱法，对所得的封闭线性DNA产物进行纯化。
D.从封闭线性DNA模板生产封闭线性DNA
使用封闭线性DNA作为DNA模板，所述封闭线性DNA包含处于可表达形式的萤光素酶报告基因、DD-ITR和含有原核端粒酶TelN的结合序列的端粒末端。生成了在DD-ITR和萤光素酶报告基因的启动子之间具有间隔区但在其它方面相同的构建体。生成了不具有间隔区的构建体，以及具有2个、5个、10个、20个和25个核苷酸的间隔区的构建体。使用与包含模板端粒末端的半个回文序列的一段互补的单个回文寡核苷酸作为特异性引物。引物与DNA模板上的两个相同位点结合。合适的引物的实例包括以上实例中所示的引物。
在含有例如30mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、2.5mM MgCl2的退火/变性缓冲液中进行封闭线性DNA模板的变性和单引物的退火。变性通过加热至95℃1分钟并在此温度下保持1至10分钟进行，随后仔细控制冷却方式，以优化特异性引物与模板的最大结合。然后，将温度降低至由合适的DNA聚合酶进行DNA扩增的最适温度。一种此类合适的酶是分离自枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的phi29，该酶在30℃工作最佳。
然后，将包含酶phi29和PPi(酵母无机焦磷酸酶)的适量反应缓冲液添加到退火的DNA/引物反应中。将反应混合物在约30℃下孵育5小时至20小时或更长。合适的反应缓冲液通常包含35mM Tris-HCl、50mM KCl、2.5mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、1mM dNTP。
然后，在30℃下在合适的缓冲液(例如10mM Tris HCl pH 7.6、5mM CaCl2、50mM谷氨酸钾、0.1mM EDTA、1mM DTT)中，将由RCA扩增的多联体DNA与原核端粒酶TelN一起孵育直至反应完成。可根据待纯化的量例如通过凝胶电泳或合适的色谱法，对所得的封闭线性DNA产物进行纯化。
这些方法提供了循环反应，其中产物与模板相同。通过进行该方法步骤的额外循环，该反应容易从非常少量的模板规模化放大。
实施例2：通过含有诱导型重组酶的细胞系构建共价封闭线性载体
菌株和质粒
将大肠杆菌K-12菌株用于所有重组细胞构建体的产生，特别地，将DH5α和JM109用作质粒构建和扩增的宿主。
重组细胞(R细胞)的构建
按照如下，将W3110(recA+)大肠杆菌用于染色体工程研究和体内重组酶表达。使用如下引物从噬菌体PY54裂解物对原核端粒酶编码基因tel进行扩增：Tel-F 5’-GCGGATCCTGGGTTACTTTAATTTGTGTGTT-3’(SEQ ID NO：22)和Tel-R5’-CGCTCGAGTTACTCCATATTTTCAGTCCATGCTTGT-3’(SEQ ID NO：23)(退火Tm 64℃)。使用以下引物从噬菌体N15裂解物对原核端粒酶编码基因telN进行扩增：TelN-F 5′-ATCGGATCCCGATATCCAGAGACTTAGAAACGGG-3′((SEQ ID NO：24)和TelN-R 5′-ATATAAAGCTTCTTTTAGCTGTAGTACGTTTCCCATGCG-3′(SEQ ID NO：25)(退火Tm 62℃)。作为用于体内产生修饰的pDNA载体的阳性对照，使用如下引物从噬菌体P1rev6裂解物对重组酶编码基因cre进行扩增：Cre-F 5′-GGAAATTCCGGTCGCTGGCGTTTCTATGAC-3′(SEQ ID NO：26)和Cre-R 5′-CGCTCGAGTGAATATTAGTGCTTACAGACAG-3′(SEQ ID NO：27)(退火Tm 66℃)。斜体区域表示BamHI、XhoI、HindIII和EcoRI的限制性位点。使用Phusion Flash高保真PCR Master Mix(New England Biolab)在如下条件下进行PCR扩增：在98℃下初始变性30秒；98℃下5秒、退火Tm下10秒、72℃下45秒，30个循环；并在72℃下最终延伸2分钟以生成cre(1.3kb)、tel(2.1kb)和telN(2.3kb)片段。通过菌落PCR和分析消化测试并确认构建体。从0.8％琼脂糖凝胶(Qiagen凝胶提取试剂盒)中纯化PCR产物，并用列出的酶(New England Biolabs)消化。将重组酶基因克隆到诱导型原核表达载体pPL451(登录#AB248919)的MCS中，以产生pNN1、pNN2和pNN3载体。通过CI[Ts]857介导的λPL强启动子阻遏，pPL451(4.2kb)赋予克隆的基因温度调节的表达。所有引物均使用Gene Runner 3.01(Hastings Software，Inc)进行设计并进行商业合成(Sigma-Aldrich，Inc)。通过使用pBRINT-Cm整合质粒将重组酶基因插入大肠杆菌W3110染色体来构建R细胞，这有助于将感兴趣的克隆序列同源重组并染色体整合到大肠杆菌的lacZ基因中。对于在pPL451中编码克隆重组酶的可诱导表达的各质粒构建体，通过分别具有SacII、SpeI和XbaI位点的cI857X-F5’-TCCCCGCGGAGCTATGACCATGATTACGAATTGC-3′(SEQ ID NO：28)、cI857telN/cre-R 5′-GGACTAGTCCCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3′(SEQ ID NO：29)和cI857tel-R5′-GCTCTAGAGCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAG-3′(SEQ IDNO：30)引物，将cI857-PL-X-tL盒(其中X＝cre、tel或telN)从pNN1扩增到3个构建体。将扩增的盒克隆到pBRINT(CmR)质粒的MCS中，以产生pNN4、pNN5和pNN6整合载体构建体。通过Phusion Flash高保真PCR Master Mix(New England Biolab)在如下条件下进行扩增：在98℃下初始变性10秒；98℃下、68℃下5秒、72℃下120秒，30个循环；以及在72℃下最终延伸1分钟，以生成cI857-cre(2.8kb)、cI857-tel(3.2kb)和cI857-telN(3.5kb)片段。通过菌落PCR和分析消化测试并确认构建体。
将称为Supersequenee(SS)的多用途重组酶靶位点设计为分别携带Cre、Flp和TelN最小靶位点(10xP-FRT-telRL)，它们均位于Tel 142bp pal序列内，这提供了PY54衍生的Tel靶位点。SS还携带78bp的SV40增强子序列，该序列位于pal序列每侧的侧翼，以促进核易位并提高转染效率。SS片段由GeneScript合成，并通过EcoRI和HindIII克隆到pUC57中。
通过用来自pGFP(clontech)的egfp(790bp)替换luc基因(1.65kb)以形成pDDEGFR，来修饰上述实施例1A和B中所述的质粒(5.8kb)(Promega)。接下来，将SS克隆到紧邻pDDEFGR的SV40启动子+内含子位点的上游以形成pDD3。然后，将SS片段克隆到pDD3的poly A位点的下游以形成pDD4。该质粒携带2个位于EGFP基因盒侧翼的SS位点。
可使多拷贝质粒与微型环状(ccc)载体(由Cre-loxP介导；Flp/FRT)或微型线性共价封闭(1ee)载体(由TelN-telRL介导；Tel/pal)相符合。在30℃、通气下，在LB+Ap(50μg/ml)上通过1μg的pNN7-pNN9 DNA构建体对R细胞进行转化，A600＝0.6。为了诱导重组酶表达和质粒构象转化，在细菌生长的对数中期，在42℃下对转化的R细胞进行热激30分钟以诱导重组酶表达，然后转移至30℃过夜。然后，收获细胞并提取质粒(Omega mini质粒提取试剂盒，VWR)。通过琼脂糖凝胶电泳和消化分析质粒拓扑结构(Plasmid topology)。如Sambrook等(1989)所述，进行标准的重组DNA技术。
R细胞表现出温度调节的重组酶表达
构建重组细胞以将tel或telN重组酶基因置于噬菌体λ强启动子pL的控制下，该启动子由温度敏感型λ阻遏物CI[Ts]857调节(图10)。类似地制备阳性cre表达对照细胞。检查在阻遏和充分诱导(42℃)条件下tel和telN R细胞中的总细胞蛋白。两种R细胞均表现出最小的重组酶蛋白水平(对于TelN和Tel均在30℃下在72KDa处鉴定)，其中CI[Ts]有效结合OL操纵子并阻遏下游重组酶基因的转录。将细胞转移至42℃后，其中阻遏物活性被完全消除并且pL启动子活性的阻断得到缓解，观测到了显著的重组酶表达。这些结果证实对于重组酶生产，所构建的Tel细胞和Tel-N细胞是温度诱导型的。
为了确定在将大肠杆菌染色体线性化/破坏后的细胞的命运，在不提供重组酶表达、直至提供非常低的重组酶表达(30℃)或重组酶的完全表达(42℃)的条件下，对λ位点特异性SS-和SS+整合剂(integrants)进行孵育，然后测量细胞生存力。在阻遏的条件下(30℃)，所有重组细胞都保持接近完全的生存力，而不管在染色体中整合的SS的存在或不存在。然而，当将温度转变为42℃并诱导Tel或TelN的表达后，携带SS+的重组体显示出显著降低的生存力。而且，在两种系统中，与TelN细胞中观察到的相比，Tel细胞产生约高5倍的杀死。
实施例3-由原核切割-连接酶TelN生成的线性共价封闭DNA在哺乳动物细胞中具 有功能性。
材料和方法
小鼠和细胞系
使用6-8周龄的C57BL/6小鼠。在补充有10％胎牛血清、100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素的Dulbecco改良Eagles培养基中使HEK293细胞生长。使用lipofectamin(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，USA)或磷酸钙沉淀，用携带telRL的表达构建体的混合物(具有或不具有pEGFPc2-CNK-CT作为转染效率的内部对照)，对HEK293细胞进行瞬时转染。
重组质粒的构建
含有双D ITR序列和报告基因的质粒可如实施例1A和1B中所述进行制备，或使用通过插入SalI/NotI增强的绿色荧光蛋白(EGFP)而修饰的双D ITR质粒进行制备[HartikkaJ,Sawdey M,Cornefert-Jensen F,Margalith M,Barnhart K,Nolasco M,Vahlsing HL,Meek J,Marquet M,Hobart P,Norman J,Manthorpe M(1996)An improved plasmid DNAexpression vector for direct injection into skeletal muscle.Hum Gene Ther 7:1205–1217，参见实施例2]。可将衍生自pJD105的telRL位点[Deneke J,Ziegelin G,LurzR,Lanka E(2000)The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 hascleaving-joining activity.Proc Natl Acad Sci U S A 97:7721–7726]作为带有56-bptelRL位点的222-bp PvuII/DpnI片段插入CMV启动子上游的pVR1012.EGFP和pIRES.mu-IL12的填入(filled-in)的NdeI位点中[Schultz J,Pavlovic J,Strack B,Nawrath M,Moelling K(1999)Long-lasting anti-metastatic efficiency of interleukin 12-encoding plasmid DNA.Hum Gene Ther 10:407–417]。将第二telRL位点插入位于polyA信号下游的质粒的填入的BstXI位点中。
具有共价封闭末端的线性DNA的制备
如[Deneke J,Ziegelin G,Lurz R,Lanka E(2000)The protelomerase oftemperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity.Proc NatlAcad Sci U S A 97:7721–7726]所述，使用纯化的原核端粒酶TelN将质粒的环状共价封闭的卷曲螺旋质粒DNA(ccc-DNA)转化为具有共价封闭末端的线性DNA(lc-DNA)。将lc-DNA用苯酚/氯仿提取，用氯仿洗涤，并用乙醇沉淀两次。将相同的程序用于通过限制性酶和ccc-DNA线性化的DNA。在这些质粒的情况下，在1.2％琼脂糖凝胶上从骨架片段中分离出微型lc-DNA和lo-DNA，并使用Elutip柱(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)纯化。
EGFP的测定
如先前所述，使用单克隆抗GFP抗体(Clontech)和ECL检测系统(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，USA)，通过Western印迹分析测定转染后48h EGFP在瞬时转染的HEK293细胞中的表达[Zimmermann S,Rommel C,Ziogas A,Lovric J,Moelling K,Radziwill G(1997)MEK1 mediates a positive feedback on Raf-1activityindependently of Ras and Src.Oncogene 15:1503–1511]。
结果
由TelN/telRL系统衍生的线性封闭质粒DNA。
为了从DNA表达治疗性分子，由启动子、内含子A、感兴趣的基因和多聚腺苷酸化信号组成的转录单元是足够的。当使用限制性核酸内切酶产生含有转录单元的DNA片段时，所得的DNA分子对通过核酸外切酶的降解敏感。为了稳定，大多数天然存在的DNA分子具有共价封闭末端。实现这一点的机制是环化、整合到宿主基因组中或形成共价封闭的发夹结构。后一种机制产生线性DNA分子。证实噬菌体N15的原核的端粒酶(原核端粒酶TelN)在体外发挥这种功能[Deneke J,Ziegelin G,Lurz R,Lanka E(2000)The protelomerase oftemperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity.Proc NatlAcad Sci U S A 97:7721–7726]。该反应需要在DNA分子上存在原核端粒酶靶位点telRL。该端粒分解位点是由telR和telL两部分组成的56bp不完美回文，并包含结合原核端粒酶的中央完美回文telO。将该原核端粒酶用于产生具有共价封闭末端的DNA片段。可使用编码EGFP的基因。它存在于环状质粒DNA上，该质粒DNA在CMV启动子的上游也具有telRL位点。原核端粒酶靶位点的存在允许通过暴露于纯化的TelN将环状共价封闭的卷曲螺旋质粒DNA(ccc-DNA)转化为线性共价封闭的DNA分子。可指定线性共价封闭的DNA分子lc-DNA和由限制性核酸内切酶线性化的分子线性开放(lo)DNA。线性共价封闭的DNA作为用于哺乳动物细胞中的转录的模板起作用。通过琼脂糖凝胶电泳对TelN和XhoI使质粒DNA线性化进行证明。作为对照，使用了ccc-DNA，使ccc-DNA经过相同程序，但不使用DNA修饰酶。通过使用lipofectamine的瞬时转染，将等量的如上所述或通过实施例2形成的ccc-DNA和lc-DNA以及lo-DNA引入HEK293细胞。线性共价封闭的DNA可产生与亲本ccc-DNA相当的EGFP表达水平，而线性共价封闭的DNA表达显著较少的EGFP。通过瞬时磷酸钙转染获得相似的结果。也可通过荧光显微镜观察GFP活性。由于该方法不易量化，因此可使用Western印迹分析。预期这证明了TelN衍生的线性DNA分子是功能性模板。
由使用两个telRL位点的TelN/telRL系统衍生的线性封闭微型DNA。
可将第二telRL位点插入含有DD-ITR的表达质粒中的多聚腺苷酸化信号的下游。在这些构建体中，转录单元在两个位点处均以telRL作为侧翼。将通过TelN从亲本质粒中切除的线性封闭DNA分子称为微型共价封闭DNA(mini covalently closed DNA)。它包含病毒CMV启动子、内含子A序列、感兴趣的基因和多聚腺苷酸化位点以及侧翼DD-ITR，并且缺少复制起始位点和抗生素抗性基因(图9A)。将微型lc-DNA与其等效的线性开放形式(微型lo-DNA)进行比较。通过分别用TelN和MunI进行消化，可从表达EGFP的质粒衍生出微型lc-DNA和lo-DNA。使用lipofectamine，将等摩尔量的微型DNA和ccc-DNA用于瞬时转染HEK293细胞(图9B)。空载体DNA可用作对照。将第二质粒共转染以控制等同转染效率，所述第二质粒编码融合至EGFP的Ras激酶抑制因子连接增强子(CNK)的C端片段。来自微型lc-DNA的EGFP的表达与ccc-DNA相似，但显著高于来自微型lo-DNA的表达(图9B)。
本文所述的生产DNA载体(由原核切割-连接酶TelN产生)的方法可进一步综述于例如Heinrich,J.等，J Mol Med.(2002)80:648-654和美国专利No.9,290,778，通过引用的方式将它们的内容整体并入本文。
实施例4：AAV颗粒的生产和纯化方案
通过Mizukami等(1998)，A Protocol for AAV vector production andpurification(博士论文，Division of Genetic Therapeutics，Center for MolecularMedicine，Jichi Medical School)中所述的技术，将实施例1、实施例2和实施例3的共价封闭线性DNA载体用作rAAV载体基因组模板，用于生产rAAV颗粒。参见图7。
与实施例1的封闭DNA(载体质粒)以及rep和cap基因(AAV辅助质粒)一起，将编码E2A、E4和VA区域的辅助质粒(Ad辅助质粒)用于转染编码Ad5基因组的E1区域的人胚肾细胞的293细胞。
试剂
辅助质粒DNA(pHLP，pAdeno)
封闭线性DNA，含有以DD-ITR作为侧翼的转基因
293细胞(人胚肾细胞)
DMEM/F12培养基
胎牛血清
2x HBS缓冲液，含有290mM NaCl、50mM HEPES缓冲液和1.5mM Na2HPO4，pH 7.1
300mM CaCl2
磷酸盐缓冲盐水(PBS)
1M HEPES缓冲液，pH 7.4
100mM Tris-HCl(pH 8.0)，加有150mM NaCl(TBS)
0.5M EDTA(pH 8.0)
处于TBS中的40％蔗糖，加有0.01％BSA
DNase缓冲液，含有50mM Hepes(pH 7.6)、0.15M NaCl和10mM MgCl2
HNE缓冲液，含有50mM Hepes(pH 7.4)、0.15M NaCl和25mM EDTA处于HNE中的CsCl的HNE溶液(1.25g/ml)
处于HNE中的CsCl的HNE溶液(1.50g/ml)
质粒
先前已将带有rep和cap的AAV辅助质粒pHLP描述为pHLP19。Ad辅助质粒pAdeno与pVAE2AE4-5相同，编码整个E2A和E4区域加VA RNA I基因和VA RNA II基因。
转染和提取
当细胞最初附着至烧瓶表面时，使用胰蛋白酶处理的293细胞(每225cm2烧瓶中5x106个细胞)产生20％至40％的汇合的单层。每个烧瓶使用40ml的培养基。将板置于处于5％CO2的空气中的培养箱中，使细胞生长至80％汇合(24h至48h)。
转染前一小时，将烧瓶中的一半培养基替换为新鲜培养基。将23μg的含有DD-ITR的封闭线性DNA载体和各辅助质粒加入到4ml的300mM CaCl2中。将此溶液缓慢地加入到4ml的2x HBS中，并通过轻轻颠倒3次立即进行混合。将该混合物立即移液到处于40ml的DMEM/F12培养基(添加有10％FCS)中的293细胞的225cm2烧瓶中，然后使其涡旋以产生均匀溶液。将该板立即返回到培养箱中，并在37℃下孵育4小时至6小时。在此期间勿打扰该板。孵育结束时，将培养基替换为预温热的DMEM/F12培养物(含有2％FCS)。转染后三天，将1ml的0.5MEDTA加入烧瓶中，并在室温下孵育3min。收集细胞悬浮液，并以300xg离心10min。除去上清液，并将沉淀中的细胞重悬于2ml的TBS中。
通过如下使悬浮在TBS中的细胞冷冻和解冻3次：将它们交替放置在干冰/乙醇浴中直到悬浮液完全冷冻，然后在37℃的水浴中直至其完全解冻。样品完全解冻后，立即使其返回至冰浴。通过以10,000xg离心10min去除组织碎片，并收集上清液。
AAV载体的纯化
如上所述，从24个烧瓶制备上清液。将处于TBS中的11ml 40％蔗糖溶液(添加有0.01％BSA)置于无菌超速离心管中(Ultrabottle#3430-3870；Nalge Nunc,Rochester,NY)。小心地使48ml合并的上清液浮于该溶液上。通过在4℃下以100,000xg离心16小时来使粗病毒颗粒沉淀。通过在5ml DNase缓冲液中剧烈搅拌来对沉淀进行重悬。加入1,000单位的DNase I，并在37℃下孵育1小时。加入250μL的0.5M EDTA，然后通过以10,000xg离心2min去除碎片。然后，通过低蛋白结合的5μm注射器过滤器(Sterile Acrodisc SyringeFilter；Pall Gelman Laboratory,Ann Arbor,MI)过滤上清液。将过滤后的物质加载到制备于HNE缓冲液中的两级CsCl梯度溶液中(1.25g/ml和1.50g/ml)。在SW40转子(BeckmanInstruments,Palo Alto,CA)中，在16℃下以35,000rpm使该梯度溶液旋转2h。收集病毒颗粒带，并将其加载到制备于HNE缓冲液中的第二两级CsCl梯度溶液(1.25g/ml和1.50g/ml)中。在VTi65.2转子(Beckman Instruments)中，在16℃下以65,000rpm使该梯度溶液旋转2h。收集0.5ml的各级分，通过半定量PCR分析、使用抗Cap抗体的Western印迹或定量DNA斑点印迹杂交，对富含病毒的级分进行选择。使用透析盒(Slide-A-Lyzer；Pierce,Rockford,IL)通过用300ml HNE缓冲液稀释三个循环来使富含病毒的级分脱盐。根据制造商的说明，用Ultrafree-4(Millipore,Bedford,MA)将物质浓缩至50μL。通过定量DNA斑点印迹杂交或Southern印迹确定，最终效价范围通常为5x108个293细胞1x1013个至5x1013个颗粒。
除了封闭线性DNA不具有双D且用作比较剂之外，重复上述方法。包含封闭线性环的双DD有望更有效率-它具有更高的包装基因组感染性病毒颗粒产率。
实施例5：载体向靶细胞的递送
通过转染将所得的包含萤光素酶报告基因的实施例1的封闭末端载体递送至靶细胞。使用实施例1中生成的无间隔区的构建体、以及具有2个、5个、10个、20个和25个核苷酸间隔区的构建体递送至HeLa细胞，来验证载体的递送，以及来自实施例1中生产的共价封闭线性DNA的表达构建体(萤光素酶报告基因)的表达。通过萤光素酶测定，对转染有无间隔区的构建体以及具有2个、5个、10个、20个和25个核苷酸间隔区的构建体的细胞的萤光素酶表达进行了定量检测。使用如下物质作为对照：质粒DNA和共价封闭环状DNA(例如含有相同的表达构建体)、以及相同类型的开放线性DNA，例如通过切割独特限制性位点以切割发夹末端而合成生产。按照制造商的说明，使用TransfectamTM(Promega)，在直径为20mm的孔中于RPMI中以60％汇合进行转染。每次转染使用400ng的构建体DNA。通过将内部对照包括在内，将实验内和实验间的转染频率归一化，在每个转染中使用40ng的表达海肾萤光素酶的质粒pGL4.73(含有来自海肾(Renilla reniformis)的hRluc基因)。使用Dual-LuciferaseTMReporter(DLRTM)测定系统(Promega)依次测量萤火虫萤光素酶(来自Photinus pyralis的发光)和海肾萤光素酶活性。使用GloMax多光度计(Promega)测量相对光单位，结果表示为萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶的比率。所有实验均重复三次进行。
预期结果表明，相比开放线性PCR构建体和缺少DD-ITR的开放线性PCR构建体，包含DD-ITR的颗粒或封闭线性DNA(包括通过RCA扩增的那些)随时间以较高的水平表达萤光素酶。这将证明，当引入哺乳动物细胞中时，根据本发明产生的封闭线性DNA可用于成功表达萤光素酶。另外，与对照相比，预期封闭线性DNA载体在细胞内持续存在更长的时间。此外，与无间隔区而其它均相同的构建体相比，预期在DD-ITR和启动子之间具有间隔区的DNA产生更高的萤光素酶表达。预期间隔区的大小与表达水平相关，更大的间隔区(例如20-25个核苷酸间隔区)引起更高的表达。
另外，预期封闭线性DNA载体可在体内形成多联体。这些可形成为染色体外DNA或整合到细胞基因组中。例如，它们可头对头、尾对尾、头对尾随机存在。通过本领域已知的方法进行多联体的测定(Chen等，(2001)Molecular Therapy 3:403-410；Wilson等，(1982)Mol.Cell.Biol.2:1258-1269；Folger等，(1982)Mol.Cell.Biol.2:1372-1387；Critchlow等，(1998)Trends Biochem.Sci.23:394-398；Wu等，(1999)PNAS USA 96:1303-1308)。
实施例6-具有表达盒的载体持续存在于受体组织细胞中
为了证明临床相关性，使用不同的载体(本发明的包含DD-ITR和端粒末端的封闭线性DNA、相应的线性DNA和相应的质粒DNA)，将由ApoE增强子/HCR和α1-抗胰蛋白酶启动子驱动的、包含人IX因子微基因(minigene)的表达盒(Miao等，(2000)in vitro.Mol.Ther.1:522-532)递送至血友病B小鼠的肝中。通过在注射后的不同时间(3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、3个月、5个月、10个月、一年等)分析血清人IX因子的浓度，来分析小鼠的载体存在和IX因子的基因表达。
预期与ss线性DNA和质粒DNA对照的受体相比，含有IX因子表达盒的DD-ITR构建体的受体随时间具有较高量的存在的载体，并且具有较高浓度的IX因子。预期存在的载体的量和人IX因子的浓度在DD-ITR构建体的受体中随时间持续存在，而在对照的受体中随时间减少。另外，与IX因子在对照的受体中的表达相比，预期IX因子在受体小鼠的DD-ITR构建体中的表达将随时间以显著较高的水平和显著较长的时间段持续存在。这一点通过如下来进行确定：通过ELISA分析对血清中人IX因子进行量化、对其的出血素质修正进行鉴定、以及在给予载体后的不同时间通过Southern印迹分析对经处理的小鼠的肝中的载体进行量化。另外，通过肝切片的原位杂交，对经处理的小鼠中包含载体的肝细胞核数量进行确定，以验证包含载体的肝细胞核的相对数量是相似的。
体内递送的DNA的分子结构
预期载体在受体组织细胞中形成多联体，其随时间持续存在。多联体在染色体外持续存在，或整合到宿主细胞基因组中。为了证明这一点，通过Southern印迹分析对受体小鼠的肝组织中载体DNA的分子结构进行了分析。将DNA分离，然后用限制性核酸内切酶消化，该限制性核酸内切酶不在载体内进行剪切或者在表达盒中剪切一次。对剪切的DNA进行分析，以确定DNA在小鼠基因组中的整合或染色体外保留。在所有样品中，用无法在载体DNA内剪切的核酸内切酶的消化产生的高分子量带与DNA载体整合进小鼠基因组中或多联体在体内的快速形成是一致的。这两种可能性的区别在于，用限制性核酸内切酶对肝DNA样品进行消化，其在整个表达盒中剪切一次。通过此种消化将高分子DNA信号转化为DNA梯带将表明体内的多联化(concatemerization)。
我们预期DNA片段的连接以头对头、尾对尾和头对尾的取向随机发生。这可通过用限制性酶适当消化DNA样品并分析/探测所得的片段来验证。
大部分的高分子量DNA可能来源于多联体。然而，为了确定这是染色体外的还是整合到基因组中的，向小鼠注射DD-ITR载体DNA或整合IX因子转座子(Yant等，Nat.Genet.25:35-41)以进行2/3肝部分切除术。在转座子组中，转座酶(由一个质粒表达)介导以转座子ITR作为侧翼的人IX因子表达盒从第二质粒释放以及所释放的转基因表达盒向小鼠基因组中的插入。在相同时间段进行肝部分切除术后，如果肝部分切除术引起一轮或两轮肝细胞细胞分裂以及染色体外DNA大量损失，则表明与注入整合质粒的小鼠(其转基因表达通过诱导肝细胞增殖会保持不变)相比，经载体DNA处理的小鼠的基因表达显示下降10倍。这些数据表明，转录活性DD-ITR载体在肝中主要保持在染色体外。另外的结果表明活性DD-ITR载体整合到肝细胞染色体中。
方法
动物研究。八至十周龄的雌性C57BL/6小鼠获得自Taconic Farms,Inc.(Germantown,NY)。所有动物程序均在斯坦福大学和美国国立卫生研究院规定的指导下进行。如先前所述，将处于2ml 0.85％盐水中的40毫克DNA注射到小鼠尾静脉中(Liu等，(1999)Gene Ther.6:1258-1266；Zhang等，(1999)Human Gene Therapy 10:1735-1737)。对于每次注射，DNA的质量是相同的，而摩尔比可以变化(例如变化两倍)。在其它研究中，预计摩尔比的微小变化不会显著影响基因表达。通过眶后(retro-orbital)技术定期对小鼠采血。在一些情况下，如先前所述，对小鼠进行2/3肝部分切除外科手术(Park等，Nat.Genet.24:49-52(2000))。如先前所述，通过测量来自2mm-3mm的尾剪断物(tail snip)的血液的凝固所需的时间来确定小鼠的出血时间(Yant等，(2000)Nat.Genet.25:35-41)。
原位杂交。根据先前所述方案，对通过尾静脉输注接受40μg相应的构建体DNA后2周到3周的小鼠的石蜡包埋的5微米肝切片进行处理以用于原位杂交(Miao等，(2000)J.Virol.74:3793-3803)。在脱石蜡、再水合、变性和用蛋白酶消化后，将切片与变性的DNA探针一起孵育，该变性的DNA探针对标记有异羟基洋地黄毒苷的载体(使用DIG标记试剂盒，来自Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis,IN)具有特异性。杂交后，将切片与缀合有碱性磷酸酶的山羊抗异羟基洋地黄毒苷抗体一起孵育，并通过硝基蓝氯化四氮唑-5-4-氯-3-吲哚基磷酸(Roche Molecular Biochemicals)对结合碱性磷酸酶的载体DNA进行可视化。
ELISA定量。DNA递送后，定期收集小鼠血液，并通过ELISA对人IX因子(hFIX)(Walter等，(1996)PNAS USA 93:3056-3061)进行定量。
Southern印迹分析。DNA注射后的一段时间内处死小鼠，并通过盐析法制备总肝DNA。将20微克的肝DNA用限制性酶消化，通过凝胶电泳分离，并使用cDNA作为探针通过Southern印迹杂交进行分析。通过磷光影相分析仪(phosphoimager analyses)对放射性DNA带进行量化。
本发明的范围不受本文公开的示例性实施方式的限制，所述示例性实施方式旨在对本发明的单个方面进行说明，在功能上等效的任何克隆、DNA或氨基酸序列均在本发明的范围内。实际上，除了本文示出和描述的那些之外，根据前面的描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。此种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例7-制备产生环状核酸的模板。
本文例举了制备对于产生用于在受试者中表达囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)的载体有用的模板的方法。将质粒在37℃下用BAMHI和HINDIII限制性酶消化24小时，该质粒从5’至3’具有BAMHI限制性位点、F1 ORI、PvuII限制性位点、ITR-L、与CFTR的编码区可操作地连接的启动子、双D-ITR(DD-ITR)、与CFTR的编码区可操作地连接的启动子、ITR-R和HINDIII限制性位点。将消化物在电泳凝胶上进行电泳以观察并分离质粒片段。从凝胶上切出质粒片段并纯化。另外，以相同的方式对在发夹环末端具有BAMHI限制性位点序列的衔接子序列以及在发夹环末端具有HINDIII限制性位点序列的衔接子序列进行消化和纯化。
为了形成环状核酸模板，将衔接子序列退火至质粒片段的剪切末端。将纯化的质粒片段和衔接子序列在连接酶(例如T4连接酶)和ATP的存在下在室温下连接至少1小时。然后使连接反应在65℃下热灭活10分钟，以使连接酶灭活。
将环状核酸模板酸转化到大肠杆菌细胞中，并在37℃振荡下生长14-16小时以诱导环状核酸的复制。使用引起细胞裂解的细菌裂解剂从大肠杆菌细胞中释放编码CFTR转基因的环状核酸。释放后，使用标准方法(例如使用柱色谱法纯化)回收CFTR环状核酸。可将环状核酸回收并直接用于体内转基因的递送，或用于病毒生产(参见实施例8)。
进一步用PvuII限制性酶将回收的CFTR环状核酸在25℃下消化24小时，以剪切PvuII切割位点。剪切PvuII除去ORI，并在CFTR核酸构建体上产生开放末端。可将该开放末端环状核酸用于转基因体内递送或用于重组病毒DNA生产。环状核酸无需用PvuII消化即用于重组病毒生产或转基因体内传递。
实施例8：使用环状核酸制造病毒载体。
使用开放末端和封闭末端CFTR核酸构建体在Pro10/HEK293细胞中制造病毒载体。如美国专利号9,441,206中所述，对于AAV载体的可规模化生产而言，Pro10/HEK293细胞是理想的。使该细胞系与CFTR核酸构建体接触以通过转染表达环状核酸。使用对质粒具有特异性的引物，通过基于PCR的测定，来证实CFTR核酸构建体的表达。
转染。将Pro10/HEK293细胞用CFTR环状核酸转染，并且还用编码Rep2和血清型特异性Cap2:AAV-Rep/Cap的包装质粒和Ad辅助质粒(XX680：编码腺病毒辅助序列)转染。
在转染当天，使用ViCell XR生存力分析仪(Beckman Coulter)对细胞进行计数，并稀释以进行转染。为了混合转染混合物，按以下顺序将以下试剂添加到锥形管中：质粒DNA、
Figure BDA0002947054230001041
I(Gibco)或OptiPro SFM(Gibco)或其它无血清的兼容转染培养基、以及然后的与质粒DNA具有特定比例的转染试剂。将混合物倒置以混合，然后在室温下孵育。将转染混合物移液到烧瓶中，然后放回振荡器/培养箱中。所有优化研究均在30mL培养体积下进行，然后在更大培养体积下进行验证。转染后48小时收获细胞。
使用Wave生物反应器系统生产rAAV。在转染前2天对wave袋进行接种。接种wave袋后两天，进行细胞培养物计数，然后在此种转染之前对细胞培养物进行扩增/稀释。然后对wave生物反应器细胞培养物进行转染。转染后至少48小时从wave生物反应器袋中收获细胞培养物。
滴度：DNase消化之后，使用针对标准曲线(AAV ITR特异性)和对CFTR环状核酸具有特异性的引物的qPCR对AAV滴度进行计算。
从振荡烧瓶和60Wave生物反应器袋中收获悬浮细胞。转染后48小时，通过从振荡烧瓶中倒出或从Wave生物反应器袋中泵送出，将细胞培养物收集到500mL聚丙烯锥形管(Corning)中。然后使用Sorvall RC3C plus离心机和H6000A转子将细胞培养物以655xg离心10min。弃去上清液，将细胞重悬于1xPBS中，转移至50mL锥形管中，并以655xg离心10min。此时，沉淀可存储在NLT-60℃或继续纯化。
使用qPCR对来自细胞裂解物的rAAV进行滴度测定。取出10mL细胞培养物，使用Sorvall RC3C plus离心机和H6000A转子以655xg离心10min。从细胞沉淀中倒出上清液。然后将细胞沉淀重悬于5mL的DNase缓冲液(5mM CaCl2、5mM MgCl2、50mM Tris-HCl pH 8.0)中，然后进行超声处理以有效裂解细胞。然后取出300μL，放入1.5mL微量离心管(microfugetube)中。然后将140单位的DNase I添加到各样品中，并在37℃下孵育1小时。为了确定DNase消化的有效性，将4mg-5mg的TReGFP质粒加入(spiked)到未转染的细胞裂解液(加入有DNase或未加入有DNase)中。将50μL的EDTA/Sarkosyl溶液(6.3％sarkosyl、62.5mM EDTApH 8.0)加入各管中，并在70℃下孵育20分钟。然后加入50μL的蛋白酶K(10mg/mL)，并在55℃下孵育至少2小时。将样品煮沸15分钟以使蛋白酶K灭活。从各样品取出等分试样以通过qPCR进行分析。为了有效确定每个细胞产生了多少rAAV载体，进行了两个qPCR反应。一个qPCR反应使用一组引物2s建立，所述引物2s被设计为与质粒XX680、pXR2和TReGFP的骨架上的同源序列结合。第二qPCR反应使用一组引物建立，以结合和扩增eGFP基因内的区域。使用Sybr green试剂和30Roche的Light Cycler 480进行qPCR。在95℃下使样品变性10分钟，然后进行45个循环(90℃10秒、62℃10秒和72℃10秒)和熔解曲线(1个循环99℃30秒、65℃1分钟，持续进行)。
从粗裂解物中纯化rAAV。将各细胞沉淀调节至10mL的最终体积。将沉淀进行短暂地涡旋处理，并在一秒开、一秒关的脉冲下超声处理4分钟，产率为30％。超声处理后，添加550U的DNase并在37℃下孵育45分钟。然后使用Sorvall RCSB离心机和HS-4转子将沉淀以9400xg离心，以使细胞碎片沉淀，然后将澄清的裂解物转移到Type70Ti离心管(Beckman361625)中。关于收获和裂解悬浮HEK293细胞以分离rAAV，本领域技术人员可使用机械方法(例如微流化)或化学方法(例如洗涤剂)等，随后使用深度过滤或切向流过滤(TFF)进行澄清步骤。
AAV载体纯化。如本领域技术人员所知晓的并在以下稿件中所描述的(Allay等、Davidoff等、Kaludov等、Zolotukhin等、Zolotukin等等，通过引用的方式将其整体并入本文)，通过柱色谱法对澄清的AAV裂解物进行纯化。

Claims (156)

1.一种用于将核酸构建体引入靶细胞中以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：
a.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：
i.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域，
ii.D’区域，
iii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’的位置与所述A和A’区域邻近；
b.核酸构建体的互补链，包含能够退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；
c.其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及
d.其中，所述DNA构建体能够在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域包含切口产生位点。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域的长度为约20nt。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述依赖病毒是AAV。
8.如权利要求1的方法，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述ITR充当启动子。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述启动子与所述ITR是分开的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
12.如权利要求4所述的方法，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
17.如权利要求14所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
20.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述至少一个DD-ITR由AAVITR、细小病毒ITR或合成的ITR产生。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体包含两个DD-ITR。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述D区域来自与所述ITR不同的构造型。
24.如权利要求22所述的方法，其中，DD-ITR各自衍生自不同的病毒血清型。
25.如权利要求22所述的方法，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换和/或插入。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换和/或插入。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体进一步在共价封闭末端处包含部分原核端粒酶结合位点，所述共价封闭末端在宿主细胞中由原核端粒酶活性形成。
29.如权利要求28所述的方法，其中，在诱导型启动子的控制下，所述宿主细胞表达所述原核端粒酶。
30.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体进一步在共价封闭末端处包含部分原核端粒酶结合位点，所述共价封闭末端由体外原核端粒酶活性形成。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体能够在所述细胞中转化成多联体结构。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
34.如权利要求32-33中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
36.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，核酸是治疗性核酸。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞在体外。
39.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞在体内。
40.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，将所述构建体离体给予所述靶细胞。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是遗传缺陷型细胞和/或患病细胞。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是患病细胞。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
44.一种用于将预定的核酸序列递送至靶细胞中以进行持续表达的DNA载体，所述DNA载体包含：
c.两个DD-ITR，所述DD-ITR各自包含：
i.具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域的反向末端重复；
ii.D’区域；以及
iii.其中，所述D和D’区域是长度约为5nt-20nt的互补回文序列，且位置与所述A和A’区域邻近；
d.所述预定的核酸序列(例如用于表达的异源基因)；以及
其中，在共价封闭的非病毒DNA的情况下，所述两个DD-ITR位于所述核酸的侧翼。
45.如权利要求44所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸序列与启动子可操作地连接。
46.如权利要求44所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的核酸序列的表达。
47.如权利要求46所述的DNA载体，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
48.如权利要求47所述的DNA载体，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
49.如权利要求44所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
50.如权利要求49所述的DNA载体，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
51.如权利要求45所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述预定的核酸序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
52.如权利要求46所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
53.如权利要求51或52所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
54.如权利要求53所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
55.如权利要求53所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
56.如权利要求44-55中任一项所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR由ITR产生，所述ITR选自于由细小病毒ITR和合成的ITR所组成的组。
57.如权利要求56所述的DNA载体，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
58.如权利要求57所述的DNA载体，其中，所述依赖病毒是AAV。
59.如权利要求44-58中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA构建体包含多于两个的DD-ITR。
60.如权利要求59所述的DNA载体，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
61.如权利要求60所述的DNA载体，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
62.如权利要求44-61中任一项所述的DNA载体，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换或插入。
63.如权利要求44-61中任一项所述的DNA载体，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换或插入。
64.如权利要求44-63中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端由体外原核端粒酶活性形成。
65.如权利要求44-64中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
66.如权利要求44-65中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体能够在所述细胞中转化成多联体结构。
67.如权利要求44-66中任一项所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
68.如权利要求66-67中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
69.如权利要求66-68中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
70.如权利要求66-68中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
71.如权利要求44-70中任一项所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸是治疗性核酸。
72.如权利要求44-71中任一项所述的DNA载体，其中，至少一个DD-ITR是AAVITR。
73.如权利要求44-72中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体进一步包含位于两个DD-ITR的侧翼的部分原核端粒酶结合位点。
74.如权利要求73所述的DNA载体，其中，所述位于两个DD-ITR的侧翼的部分原核端粒酶结合位点由体外原核端粒酶活性或由体内原核端粒酶活性形成。
75.如权利要求44-74中任一项所述的DNA载体，其中，所述共价封闭的非病毒DNA构建体在所述靶细胞内作为多联体结构持续存在。
76.如权利要求75所述的DNA载体，其中，所述DNA载体促进所述核酸持续表达2周-5周、1个月-12个月、1年-10年或更长的时间段。
77.一种用于将核酸引入靶细胞以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：
a.至少一个ITR序列，所述ITR序列选自于由图5所示的ITR所组成的组；
b.核酸构建体的互补链，其中，所述核酸构建体包含预定的DNA序列，其中，所述互补链能够退火成可表达的dsDNA；并且
c.其中，所述DNA构建体形成具有发夹共价封闭末端的线性DNA。
78.如权利要求77所述的方法，其中，所述ITR序列在任一侧以互补序列D和D’作为侧翼，从而产生DD-ITR。
79.如权利要求77所述的方法，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
80.如权利要求77所述的方法，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
81.如权利要求77所述的方法，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
82.如权利要求81所述的方法，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
83.如权利要求77所述的方法，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
84.如权利要求83所述的方法，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
85.如权利要求77-84中任一项所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
86.如权利要求77-85中任一项所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
88.如权利要求87所述的方法，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
89.如权利要求87所述的方法，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
90.如权利要求77-89中任一项所述的方法，其中，所述至少一个DD-ITR由细小病毒ITR或合成的ITR产生。
91.如权利要求90所述的方法，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
92.如权利要求91所述的方法，其中，所述依赖病毒是AAV。
93.如权利要求65-78中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体包含两个DD-ITR。
94.如权利要求93所述的方法，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
95.如权利要求93所述的方法，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
96.如权利要求77-95中任一项所述的方法，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换或插入。
97.如权利要求77-95中任一项所述的方法，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换或插入。
98.如权利要求77-97中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端由体外原核端粒酶活性形成。
99.如权利要求77-98中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
100.如权利要求77-99中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体能够在所述细胞中转化成多联体结构。
101.如权利要求77-100中任一项所述的方法，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少1周-5周、至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
102.如权利要求100-101中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
103.如权利要求100-102中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
104.如权利要求100-102中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
105.如权利要求77-104中任一项所述的方法，其中，所述核酸为治疗性核酸。
106.如权利要求77-105中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞在体外。
107.如权利要求77-105中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞在体内。
108.如权利要求77-105中任一项所述的方法，其中，将所述构建体离体给予所述靶细胞。
109.如权利要求77-108中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是遗传缺陷型细胞。
110.如权利要求77-108中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是患病细胞。
111.如权利要求77-110中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
112.一种细胞或其群，所述细胞或其群通过如权利要求1-43或77-111中任一项所述的方法产生。
113.一种共价封闭的非病毒线性DNA载体，所述共价封闭的非病毒线性DNA载体用于将预定的核酸递送到靶细胞中以进行持续表达，所述载体包含：
a.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：
i.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；
ii.D’区域；
iii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’区域的位置与所述A和A’区域邻近；
b.核酸构建体的互补链，所述互补链包含能够退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；
c.其中，所述DNA载体构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及
d.其中，所述DNA载体构建体能够在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。
114.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述D区域包含切口产生位点。
115.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。
116.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述D区域的长度为约20nt。
117.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。
118.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
119.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述依赖病毒是AAV。
120.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
121.如权利要求120所述的DNA载体，其中，所述ITR充当启动子。
122.如权利要求120所述的DNA载体，其中，所述启动子与所述ITR是分开的。
123.如权利要求113-122中任一项所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
124.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
125.如权利要求124所述的DNA载体，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
126.如权利要求113所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
127.如权利要求126所述的DNA载体，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。
128.如权利要求113-127中任一项所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
129.如权利要求126所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
130.如权利要求128或129所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
131.如权利要求128或129所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
132.如权利要求128或129所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
133.如权利要求113-132中任一项所述的DNA载体，其中，所述至少一个DD-ITR由AAVITR、细小病毒ITR或合成的ITR产生。
134.如权利要求113-133中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体包含两个DD-ITR。
135.如权利要求113-134中任一项所述的DNA载体，其中，所述D区域来自与所述ITR不同的构造型。
136.如权利要求134所述的DNA载体，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
137.如权利要求134所述的DNA载体，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2 ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5 ITR。
138.如权利要求113-137中任一项所述的DNA载体，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换和/或插入。
139.如权利要求113-138中任一项所述的DNA载体，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换和/或插入。
140.如权利要求113-139中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端由体外原核端粒酶活性形成。
141.如权利要求113-140中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
142.如权利要求113-141中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体构建体能够在所述细胞中转化成多联体结构。
143.如权利要求113-142中任一项所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
144.如权利要求142-143中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
145.如权利要求142-143中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
146.如权利要求142-143中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
147.如权利要求113-146中任一项所述的DNA载体，其中，所述核酸为治疗性核酸。
148.一种用于将核酸递送至靶细胞的药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求44-76和113-147中任一项所述的DNA载体和药学上可接受的载体，以用于递送至靶细胞，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
149.如权利要求148所述的药物组合物，其中，向所述靶细胞体内给予所述组合物以用于治疗疾病或紊乱。
150.如权利要求28所述的方法，其中，将所述宿主细胞设计为在诱导型启动子的控制下至少编码第一Tel重组酶，其中，所述细胞包含适于产生无细菌序列的载体的表达载体，所述载体含有表达盒，并且感兴趣的核酸以至少一个DD-ITR作为侧翼，并且在任一侧以Tel重组酶的靶序列作为侧翼。
151.如权利要求150所述的方法，其中，整合在Tel靶序列的非结合区域内的是一种或多种额外的重组酶的靶结合序列。
152.如权利要求151所述的方法，其中，所述一种或多种额外的重组酶选自于由pK02telRL位点、telRL位点、pal位点、loxP位点、FRT位点、phiC31、attP位点和XattP位点所组成的组。
153.一种产生包含至少一个DD-ITR的线性共价封闭载体的方法，所述方法包括在适于允许第一重组酶表达的条件下对如权利要求150所述的宿主细胞进行孵育，从而产生线性共价封闭载体。
154.一种产生包含至少一个DD-ITR的环状共价封闭载体的方法，所述方法包括在适于允许第二重组酶表达的条件下对如权利要求151或152所述的宿主细胞进行孵育，从而产生环状共价封闭载体。
155.如权利要求150所述的方法，其中，所述Tel重组酶靶位点是噬菌体PY54 Tel 142碱基对靶位点。
156.如权利要求150-155中任一项所述的方法，其中，所述感兴趣的核酸在两侧均以DD-ITR作为侧翼。
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