JP2022537410A - ファージ複製起点を用いたベクターの産生 - Google Patents

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Abstract

本発明は、導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、ここで、前記テンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位（単数または複数）、ならびに（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む工程；（ｂ）前記宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前記環状核酸を回収する工程であって、前記環状核酸が自己アニーリングする工程を含む、方法を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１９年６月２１日提出の米国仮出願第６２／８６４，６８９号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に基づく利益を主張する。
発明の分野
本発明は、遺伝子発現用のベクターを生成するための方法および細胞株に関する。
発明の背景
外因性ＤＮＡによってコードされたタンパク質が長期発現するような様式で、外因性ＤＮＡを細胞に導入することが望ましい。ウイルスベースのプロトコールが開発されており、このプロトコールは、外因性ＤＮＡを細胞に導入するためにウイルスベクターを使用し、その後に、導入されたＤＮＡを標的細胞のゲノムに組み込むか、エピソームに保持することができる。用途が見いだされているウイルスベースのベクターには、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベースのベクター）、アデノウイルス由来のベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のベクター、ＨＳＶ由来のベクター、シンドビス由来のベクターなどが含まれる。ＡＡＶベクターの使用に大きな関心が寄せられている。しかしながら、ＡＡＶの大規模産生に有効な方法は、まだわかっていない。
ファージミドは、ファージ由来複製起点（ＯＲＩ）を使用して組換えタンパク質をディスプレイする。ファージＯＲＩは、一本鎖環状ＤＮＡを非常に高い効率で複製する。しかしながら、ファージＯＲＩ複製には、組換えタンパク質をディスプレイするファージ粒子を作出するために、ヘルパーファージによって提供されるさらなるタンパク質が必要である。ヘルパーファージは、機能的ファージを作製するために必要な全ての他のタンパク質を供給するので、ファージミドシステムに不可欠である。ヘルパーファージは、いくらか改変された通常のＦｆファージである：このファージは、さらなる複製起点を含み、通常は抗生物質耐性遺伝子を保有し、そのパッケージングシグナルは厳格に無効化されている。
細菌にヘルパーファージが感染する場合、無効化されたパッケージングシグナルは、ファージ粒子の産生を防止しない。しかしながら、細菌にファージミドおよびヘルパーファージの両方が感染すると、ファージミドＤＮＡ（最適なパッケージングシグナルを含む）が優先してパッケージングされる。結果として、ファージミド調製物は、表現型および遺伝子型の両方が異質である：ディスプレイタンパク質は、野生型（ヘルパーファージ由来）または組換え（ファージミド由来）のいずれかであり得、パッケージングされたゲノムは、ファージまたはファージミドのいずれかであり得る。理論上、無効化されたパッケージングシグナルは、任意のファージミド調製物中のヘルパーファージ粒子数を著しく減少させるはずである。しかしながら、ヘルパーファージ数は、時折ファージミド粒子数と等しいかそれを超える場合があり、その後の選択を著しく妨害する場合がある。ヘルパーファージを必要とせずにウイルス産生で利用されるファージミドの効率的な核酸生成を利用する方法を本明細書中に記載する。
発明の要旨
本明細書中に記載の本発明の１つの態様は、導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前述のテンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位（単数または複数）およびこれらの部位（単数または複数）内に以下を含む工程：（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする工程を含む、方法を提供する。
任意の態様の１つの実施形態では、テンプレートは、少なくとも２つの切断部位を含む。任意の態様の１つの実施形態では、テンプレートは、少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）。任意の態様の１つの実施形態では、方法は、回収された環状核酸の少なくとも１つの切断部位を切断する工程（例えば、図５を参照のこと）をさらに含む。
任意の態様の１つの実施形態では、方法は、回収後に、例えば、環状核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製工程をさらに含む。
任意の態様の１つの実施形態では、テンプレートは、少なくとも１つのアダプター配列または少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む。任意の態様の１つの実施形態では、アダプター配列は、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）。任意の態様の１つの実施形態では、アダプター配列は切断部位をさらに含む。
任意の態様の１つの実施形態では、回収された環状核酸は、導入遺伝子の送達のために使用される。
任意の態様の１つの実施形態では、回収された環状核酸は、組換えウイルスベクター産生のために使用される。任意の態様の１つの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、またはポックスウイルス（ＰＶ）である。任意の態様の１つの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである。任意の態様の１つの実施形態では、ウイルスはＡＡＶであり、かつ変異体ＩＴＲを有し、ここで、変異体ＩＴＲがダブルＤ変異体ＩＴＲである。
任意の態様の１つの実施形態では、環状核酸は自己アニーリングし、かつ二本鎖である。任意の態様の１つの実施形態では、ベクターは一本鎖である。
任意の態様の１つの実施形態では、第２のＴＲが存在し、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している。
任意の態様の１つの実施形態では、ＯＲＩは左ＴＲの上流にある。任意の態様の１つの実施形態では、ＯＲＩはＴＲに隣接しており、かつ導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある。
任意の態様の１つの実施形態では、宿主系は細菌パッケージング細胞である。任意の態様の１つの実施形態では、宿主系は無細胞系である。任意の態様の１つの実施形態では、宿主系は無細胞系であり、かつヘルパーファージ粒子を含む。
任意の態様の１つの実施形態では、宿主系は宿主細胞である。例示的な宿主細胞には、哺乳動物細胞、細菌細胞、または昆虫細胞が含まれる。
任意の態様の１つの実施形態では、少なくとも１つのＴＲは、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである。
任意の態様の１つの実施形態では、ベクターは隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前述の隣接物の間に、導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および導入遺伝子のアンチセンス相補物がある。
任意の態様の１つの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。
任意の態様の１つの実施形態では、ＯＲＩは、ＩＴＲの上流、かつ上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている。
任意の態様の１つの実施形態では、少なくとも１つのＯＲＩは、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、またはＦｄ由来ＯＲＩである。
任意の態様の１つの実施形態では、テンプレートは、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む。任意の態様の１つの実施形態では、短縮ＯＲＩはＯＲＩΔ２９である。
任意の態様の１つの実施形態では、少なくとも２つの切断部位は、制限部位である。任意の態様の１つの実施形態では、少なくとも２つの制限部位は、同じであるか異なる。任意の態様の１つの実施形態では、制限部位は、前述の導入遺伝子配列内に見いだされない。
任意の態様の１つの実施形態では、切断部位は、ヌクレアーゼによって切断される。
任意の態様の１つの実施形態では、プロモーターは、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される。
任意の態様の１つの実施形態では、導入遺伝子は治療遺伝子である。
本明細書中に記載の発明の別の態様は、導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をプラスミドテンプレートで形質転換する工程であって、前述のプラスミドテンプレートが以下を含む工程：（ｉ）ファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｖ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、ここで、前述のプラスミドテンプレートが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする工程を含む、方法を提供する。
任意の態様の１つの実施形態では、プラスミドテンプレートは、ＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む。
任意の態様の１つの実施形態では、導入遺伝子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む。例えば、リンカーは、ホリデイ配列または複製欠損ＴＲである。
本明細書中に記載の発明の別の態様は、本明細書中に記載の方法のうちのいずれかによって製造された環状核酸ベクターを提供する。
本明細書中に記載の発明の別の態様は、環状核酸ベクターであって、少なくとも１つの隣接切断部位（単数または複数）ならびに、前述の部位（単数または複数）内に、（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）；および（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、環状核酸ベクターを提供する。
本明細書中に記載の発明のさらに別の態様は、環状核酸ベクターであって、（ｉ）ファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｖ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、ここで、前述のベクターが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む、環状核酸ベクターを提供する。
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語および句の意味を以下に提供する。別段の指示がない限り、あるいは文脈から理解されない限り、以下の用語および句には以下に提供した意味が含まれる。本定義は特定の実施形態の説明を補助するために提供しているが、テクノロジーの範囲が特許請求の範囲のみによって限定されるので、本定義は、特許請求の範囲に記載のテクノロジーを制限することを意図しない。別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本テクノロジーが属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。当該分野での用語の使用と本明細書中に提供した用語の定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書中に提供した定義を優先するものとする。
免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．出版，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８－０－９１１９１０－１９－３）；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．出版，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．出版，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ出版，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）；Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）（その内容全体が、本明細書中で参考として全て援用される）に見出すことができる。
本明細書中で使用される場合、用語「治療遺伝子」は、所望の治療効果を有する分子をコードする遺伝子またはその機能的断片を指す。例えば、非存在または変異によって病的な細胞成長または細胞増殖を増大させる遺伝子。本明細書中で使用される治療遺伝子は、かかる非存在または変異した遺伝子と置換されるであろう。治療遺伝子が染色体外の位置に由来する細胞によって発現されるように染色体外を維持するか、治療遺伝子が内因性遺伝子と組換えられるように細胞ゲノム内に遺伝子を組み込み得るようにすることによって、治療遺伝子はその治療効果を生じ得る。
本明細書中で使用される場合、「接触」は、広義には、テンプレートまたはプラスミドテンプレートが宿主系に存在するように前述のテンプレートを宿主系に配置することを指す。狭義には、接触は、テンプレートまたはプラスミドテンプレートを本明細書中に記載の宿主系に配置する任意の適切な手段を指す。例えば、環状核酸が宿主細胞機序によって産生されるようにテンプレートが細胞内部に適切に輸送される手段によって接触することができる。かかる接触には、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションが含まれ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「ＤＮＡ配列」は、本明細書中で互換的に使用され、標的細胞に送達されるべき核酸（例えば、環状核酸）の配列を指す。一般に、核酸は、ポリペプチドをコードする読み取り枠または目的の非翻訳ＲＮＡ（例えば、細胞または被験体への送達用）を含む。核酸配列は、制御配列をさらに含んでよく、これらの組み合わせは、導入遺伝子または発現構築物と呼ばれ得る。好ましくは、核酸は、ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲが起源とするウイルス内に天然に存在しない）と共存して天然に存在しない異種核酸である。かかる核酸は、異種核酸と呼ばれる。
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチドの転写を開始し、制御するヌクレオチド配列を指す。プロモーターには、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、制御タンパク質などによって誘導される場合）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、制御タンパク質などによって抑制される場合）、および構成性プロモーターが含まれ得る。用語「プロモーター」または「調節エレメント」には、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳を調節する）セグメントが含まれることが意図される。
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、記載の成分が通常の機能を果たすように構成されたエレメントの配置を指す。したがって、コード配列を有する核酸配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に核酸配列を発現させることができる。プロモーターは、核酸配列の発現を指示する機能がある限り、核酸配列と連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写はされる介在配列がプロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、このプロモーター配列は、コード配列を有する核酸に「作動可能に連結された」と依然として見なすことができる。したがって、用語「作動可能に連結された」は、転写複合体によってプロモーターエレメントが認識されたときに目的のコード配列の転写開始が可能である任意の間隔または方向でプロモーターエレメントおよび目的のコード配列を含むことが意図される。
本明細書中で使用される場合、用語「発現」は、ＲＮＡおよびタンパク質の産生に関与する細胞過程（必要に応じて、例えば、転写、転写物のプロセシング、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾、およびプロセシングが含まれるが、これらに限定されない）を指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。用語「遺伝子」は、適切な制御配列に作動可能に連結された場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（ＤＮＡから）ＲＮＡに転写される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域に先行する領域および続く領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレイラー」配列、ならびに個別のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン））を含んでも含まなくてもよい。
本明細書中で使用される場合、用語「相補物」は、例として挙げられたＤＮＡ（例えば、相補物が産生されるテンプレート）の塩基に相補的な塩基を有するＤＮＡ配列を指す。ＴはＡに相補的であり、ＣはＧに相補的であると理解される。
本明細書中で使用される場合、「自己相補性」は、５’末端から読み取った配列および３’末端から読み取った配列が相補的であるＤＮＡ配列を有する一本鎖ＤＮＡを指す。かかる配列は、それ自体が二本鎖ＤＮＡを形成することができる。例えば、５’－ＧＣＴＴＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣ－３’（配列番号２３４）は、自己相補性配列である。
本明細書中で使用される場合、「プラスミド断片」は、少なくとも２つの切断部位の切断によって切り出されたプラスミドの二本鎖線状ＤＮＡを指す。例えば、本発明のプラスミド断片は、少なくとも２つの切断部位内に含まれる全てのエレメント（例えば、ＯＲＩ、ＩＴＲ、および導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター）を含む一本鎖線状ＤＮＡである。プラスミド断片は、少なくとも１つのアダプターが少なくとも１つの末端にアニーリングされる場合に「テンプレート」と考えられる。
本明細書中に記載の種々の実施形態では、記載の特定のポリペプチドのうちのいずれかのバリアント（天然に存在するか存在しない）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に改変されたバリアント、および／または保存的に置換されたバリアントを包含することをさらに意図する。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸が変更された核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列の置換物、欠失物、または付加物の各々が「保存的に改変されたバリアント」（この変更によってあるアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸と置換され、かつポリペプチドの所望の活性が保持される場合）であると認識するであろう。かかる保存的に改変されたバリアントは、本開示と一致する多形バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられ、排除されない。
本明細書中で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、これらを使用する文脈に応じて、単数または複数である場合がある。例えば、「ａ ｃｅｌｌ」は、単一の細胞を意味する場合があるか、複数の細胞を意味する場合がある。
また、本明細書中で使用される場合、「および／または」は、１またはそれを超えるリスト中の関連項目のありとあらゆる可能な組み合わせを指し、かつ包含し、選択肢と解釈されるときの組み合わせが無いこと（「または」）も指し、かつ包含する。
さらに、本発明の組成物の量、用量、時間、および温度などの測定可能な値について言及する場合に本明細書中で使用される用語「約」は、指定した量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、さらに±０．１％の変動を含むことを意味する。
本明細書中で使用される用語「～を含むこと」または「～を含む」は、方法または組成物に不可欠である組成物、方法、およびその各成分（単数または複数）に関して使用されるが、不可欠であるかどうかに無関係に不特定の要素を含む可能性が開かれている。
本明細書中で使用される用語「～から本質的になる」は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。用語「～からなる」は、実施形態の記載において引用されていないいかなる要素も排除した、本明細書中に記載の組成物、方法、およびその各成分を指す。
図１は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＩＴＲ－Ｌ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図２は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＩＴＲ－Ｌ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図３は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、ＩＴＲ－Ｌ、Ｆ１ ＯＲＩ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図４は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、ＩＴＲ－Ｌ、Ｆ１ ＯＲＩ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図５は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＰＶＵＩＩ制限部位、ＩＴＲ－Ｌ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。複製後、環状核酸をＰＶＵＩＩ制限酵素でさらに切断してアダプター配列およびＯＲＩを切断すると、一方が開放型末端となり、他方が閉鎖型末端となる。
図６は、閉鎖型環状直鎖ｒＡＡＶゲノムの生物産生の略図を示す。プラスミドテンプレートをＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、複製させる。閉鎖型直鎖ＤＮＡに自己アニーリングする閉鎖型環状ｓｓＤＮＡであるＡＡＶ核酸ベクターが複製される。
図７は、５’から３’への方向で、Ｓｆｉ１制限部位またはＰｖｕＩＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＩＴＲ－Ｌ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、および第２のＳｆｉ１制限部位またはＰｖｕＩＩ制限部位を、制限部位を介して末端にライゲーションされたアダプター配列と共に有するベクターの製造の略図を示す。アダプター配列のライゲーション前に、ベクターを、Ｓｆｉ１制限酵素またはＰｖｕＩＩ制限酵素を用いた切断を介して切り出す。このベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図８は、５’から３’への方向で、Ｆ１ ＯＲＩ、ＩＴＲ－Ｌ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＩＴＲ－Ｒ、ヘアピン配列、相補ＩＴＲ－Ｒ、導入遺伝子に連結された相補プロモーター（星印で示す）、相補ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結された相補プロモーター（星印で示す）、相補ＩＴＲ－Ｌ、およびＯＲＩΔ２９を有する自己相補性一本鎖ＤＮＡベクターの製造の略図を示す。この方法は、細菌パッケージング細胞およびヘルパーファージを使用する。アスタリスクは、相補配列（例えば、相補的なＴＲ配列または導入遺伝子配列）を示す。
図９は、一本鎖ベクター生成の略図を示す。（１）は、隣接ＰｖｕＩＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ（例えば、Ｍ１３）、ＩＴＲ（制限部位を介して末端にライゲーションされたアダプター配列を有する少なくとも１つの二本鎖ＩＴＲが含まれる）を有するベクターを示す。プラスミドをＰｖｕＩＩ制限酵素で切断し、アダプター配列をアニーリングして、ＤＮＡを環状化する。（２）は、Ｍ１３ ＯＲＩを有するテンプレートの宿主細胞中でのウイルスゲノム複製由来の中間体ダイマーをＨｉｒｔ抽出によって単離し、これをさらなる複製のためのテンプレートとして使用し、ｒＡＡＶウイルス産生または導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達のために使用することもできることを示す。ダブルＤ ＩＴＲ（ＤＤ－ＴＲ）が好ましい基質である。（３）は、下流でのｉｎ ｖｉｖｏ適用ができることを示す。
図１０は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を含み、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図１１は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図１２は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、Ｆ１ ＯＲＩ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図１３は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、Ｆ１ ＯＲＩ、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図１４は、５’から３’への方向で、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＰＶＵＩＩ制限部位、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有し、かつ制限部位を介して各末端にライゲーションされたアダプター配列を有する環状核酸の製造についての略図を示す。プラスミド断片を、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素での切断を介してプラスミドから切り出す。アダプター配列をプラスミド断片にライゲーションして、テンプレートを形成する。テンプレートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、細胞抽出物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）、または細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。複製後、環状核酸をＰＶＵＩＩ制限酵素でさらに切断してアダプター配列およびＯＲＩを切断すると、一方が開放型末端となり、他方が閉鎖型末端となる。
図１５は、５’から３’への方向で、Ｓｆｉ１制限部位またはＰｖｕＩＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、および第２のＳｆｉ１制限部位またはＰｖｕＩＩ制限部位を有し、制限部位を介して末端にライゲーションされたアダプター配列を有するベクターの製造の略図を示す。アダプター配列のライゲーション前に、ベクターを、Ｓｆｉ１制限酵素またはＰｖｕＩＩ制限酵素を用いた切断を介して切り出す。このベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、細菌パッケージング細胞中で）複製することができる。
図１６は、５’から３’への方向で、Ｆ１ ＯＲＩ、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結したプロモーター（星印で示す）、ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、ヘアピン配列、相補ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結された相補プロモーター（星印で示す）、相補ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、導入遺伝子に連結された相補プロモーター（星印で示す）、相補ＤＤ－ＩＴＲ（変異体）、およびＯＲＩΔ２９を有する自己相補性一本鎖ＤＮＡベクターの製造の略図を示す。この方法は、細菌パッケージング細胞およびヘルパーファージを使用する。アスタリスクは、相補配列（例えば、相補的なＴＲ配列または導入遺伝子配列）を示す。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載の本発明の１つの態様は、導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前述のテンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位（単数または複数）ならびに（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む工程；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする工程を含む、方法を提供する。
本明細書中に記載の発明の別の態様は、導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をプラスミドテンプレートで形質転換する工程であって、前述のプラスミドテンプレートが以下を含む工程：（ｉ）ファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｖ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、ここで、前述のプラスミドテンプレートが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする工程を含む、方法を提供する。
１つの実施形態では、環状核酸を産生するために使用されるテンプレートを、テンプレートの成分を含む二本鎖プラスミドＤＮＡ（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）をプラスミド上に存在する切断部位を特異的に標的にするヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）で切断することによって生成する。別の実施形態では、二本鎖プラスミドテンプレートを使用して環状核酸を産生することができる。テンプレート（すなわち、本明細書中に記載のプラスミドテンプレート）の成分を含むプラスミドを、当該分野で公知の標準的なクローニング技術を使用して生成することができる。切断部位を切断するとプラスミド断片（すなわち、２つの切断部位の間に見いだされる一本鎖線状ＤＮＡ）が切り出される。１つの実施形態では、次いで、プラスミド断片を切断末端でアダプタータンパク質にアニーリングする。例えば、切断部位が制限酵素で切断されると、「粘着」末端（すなわち、一方の鎖のいくつかの非対合ヌクレオチドが他方の鎖を超えて伸びているＤＮＡ二重らせんの末端）が産生される。相補粘着末端を有するアダプター配列は、当該分野で公知の標準的な技術（例えば、Ｔ４リガーゼおよびＡＴＰを使用したライゲーション反応）を使用して粘着末端にアニーリングすることができる。アダプター配列がプラスミド断片の末端にアニーリングされるとＤＮＡが環状化し、それにより、本明細書中でテンプレートと呼ばれる閉鎖型末端ＤＮＡ構造が作出される。
テンプレートを、宿主系においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで複製することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（例えば、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：６１２１（２０１９）に記載の標準的な方法を使用）；細胞抽出物（例えば、Ｗａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，１－１２（１９９７）に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物）；または当該分野で公知の細菌パッケージング細胞株（これらの引用の内容全体が、本明細書中で参考として援用される）。例えば、Ｃｈａｓｔｅｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６ Ｄｅｃ；３４（２１）：ｅ１４５（その内容全体が、本明細書中で参考として援用される）に記載のように、細菌パッケージング細胞株は、Ｍ１３系ヘルパープラスミドを発現することができる。
あるいは、本明細書中に記載のテンプレートは、複製される必要はなく，宿主系（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株）に直接接触させるために使用することができる。
テンプレート上に配置されたファージＯＲＩは、本明細書中で環状核酸と呼ばれる一本鎖の相補環状ＤＮＡの複製を開始させる。１つの実施形態では、テンプレートを、宿主系内で環状核酸を複製するのに十分な時間インキュベートする。１つの実施形態では、ファージＯＲＩは、いかなるさらなる成分（例えば、ヘルパーファージ）も必要とせずに複製を開始させる。別の実施形態では、ファージＯＲＩによる複製は、さらなる成分（例えば、ヘルパーファージ）の存在下で開始される。環状核酸の複製のために使用される宿主系は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ宿主系であり得る。
１つの実施形態では、テンプレートは一本鎖であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのテンプレートの複製により一本鎖環状核酸が生成される。一本鎖環状ＤＮＡは、例えば、導入遺伝子配列で自己アニーリングして二本鎖になることができる。
ＯＲＩがプラスミドテンプレートの両側に存在する（例えば、プラスミドテンプレートが、テンプレートの他のエレメントに隣接するＦ１ ＯＲＩおよびＯＲＩΔ２９を有する（例えば、図８を参照のこと））場合、一本鎖環状核酸は自己相補性導入遺伝子（例えば、治療導入遺伝子）を含む。１つの実施形態では、一本鎖環状核酸は、導入遺伝子のセンス配列および導入遺伝子のアンチセンス配列を１本の鎖上に含む。１つの実施形態では、センス配列およびアンチセンス配列は、鎖を湾曲させてセンス配列およびアンチセンス配列を結合させるリンカー（例えば、ホリデイリンカー）または欠損ＩＴＲで分離されている。リンカーが、鎖を湾曲させて導入遺伝子のセンス配列およびアンチセンス配列の結合を容易にする任意の配列であり得ることが本明細書中で特に意図される。１つの実施形態では、一本鎖環状核酸は、ＯＲＩに隣接する相補領域および自己相補性領域をさらに含む。例えば、図８を参照のこと。
環状核酸は、特定の宿主系で知られている標準的な技術（装置によって媒介される放出（超音波処理）または化学物質によって媒介される放出（界面活性剤）など）を使用して宿主系から放出される（すなわち、解放される）。放出後、環状核酸を、標準的な方法（例えば、カラムクロマトグラフィを使用した精製による）を使用して回収する。
本明細書中で生成された環状核酸は、閉鎖型、開放型、または開放型および閉鎖型の両方であり得る。１つの実施形態では、環状核酸は閉鎖型である。閉鎖型ＤＮＡベクターは、任意の立体配置（例えば、ドギーボーン、ダンベル、環状、閉鎖型線状二重鎖など）を有することができる。
１つの実施形態では、環状核酸は、ＯＲＩの下流に隣接した少なくとも第３の固有の切断部位を含む。環状核酸の複製後、この固有の切断部位を切断して環状核酸からＯＲＩを除去し、開放型末端を得ることができる。この核酸は、開放型および閉鎖型の両方である。開放型および閉鎖型の核酸を、例えば、導入遺伝子発現を介した遺伝子送達のために被験体に投与することができる。
本明細書中に記載の方法を使用して生成された環状核酸複製物を、前述の複製物が発現する導入遺伝子の送達のために使用するか、例えば、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの複製によってさらなる環状核酸を生成するために使用することができる。環状核酸複製物を、さらに、組換えウイルスベクター産生において、例えば、ＨＥＫ２９３細胞内でのアデノ随伴ウイルスベクターの産生のために使用することができる。
さらに、環状核酸を、例えば、下流に適用するためにキャプシドまたはリポソームにパッケージングすることができる。
１つの実施形態では、本明細書中に記載の方法を使用して製造された環状核酸を、組換えベクター（例えば、組換えウイルスベクター）の産生で使用することができる。例として、少なくとも１つのＩＴＲを有する環状核酸を、ＡＡＶベクターの産生において少なくとも１つのＩＴＲを発現するプラスミドの代わりに使用することができる。テンプレート組換えプラスミドを使用したＡＡＶゲノムの複製については、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｏｌ．Ｏｃｔ．１９８７（その内容全体が、本明細書中で参考として援用される）でさらに考察されている。組換えベクターの産生および核酸送達用ベクターの使用についてのプロトコールを、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）および他の標準的な実験マニュアル（例えば、Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：１９９７）に見出すことができる。さらに、ＡＡＶベクターの産生は、例えば、米国特許第９，４４１，２０６（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
本発明の方法で使用されるベクターの非限定的な例には、核酸を細胞内に送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド、テンプレート、非ウイルスベクター、またはウイルスベクター（組換えレトロウイルスゲノムをパッケージングすることができるレトロウイルスベクターなど））が含まれる（例えば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５（１９８６）を参照のこと）。次いで、例えば、組換えレトロウイルスベクターを使用して細胞に感染させ、それにより感染された細胞に本発明の治療導入遺伝子を送達させることができる。変更された核酸を哺乳動物細胞内に正確に移入する方法は、レトロウイルスベクターを使用することであるが、勿論これに限定されない。この手順のために他の技術が広く利用でき、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９４１－９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２－１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７、１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８－７４７，１９９６）、および現在公知であるか、その後に同定される任意の他のベクター系の使用が含まれる。当該分野で周知であり、かつ２またはそれを超える異なるウイルス由来のウイルスタンパク質および／または核酸を、機能的なウイルスベクターを産生するために任意の組み合わせで含むことができるキメラウイルス粒子も含まれる。また、本発明のキメラウイルス粒子は、（例えば、特定の細胞もしくは組織へのベクターの標的化を容易にし、そして／または特異的免疫応答を誘導するための）非ウイルス起源のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列を含むことができる。所与の条件のためのインキュベーション条件（例えば、タイミング、環境、培地など）は当該分野で公知であり、当業者が容易に同定することができる。
細胞内で産生されたウイルスベクターを、任意の標準的な技術を使用して放出させる（すなわち、ベクターを産生した細胞から開放する）ことができる。例えば、ウイルスベクターを、機械的方法（例えば、顕微溶液化、遠心分離、または超音波処理）または化学的方法（例えば、溶解緩衝液および界面活性剤）を介して放出することができる。次いで、当該分野で標準的な方法を使用して放出されたウイルスベクターを回収し（すなわち、採取し）、精製して、純粋な集団を得る。例えば、ウイルスベクターを、精製方法（深層濾過またはタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を使用した明澄化工程が含まれる）によってウイルスベクターが放出された緩衝液から回収することができる。本明細書の実施例に記載のように、ウイルスベクターを、超音波処理によって細胞から放出させ、カラムクロマトグラフィを使用した明澄化ライセートの精製によって回収することができる。
１つの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得るが、これらに限定されない。任意の態様の１つの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである。本発明のウイルスベクターの非限定的な例には、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびキメラウイルスベクターが含まれる。
当該分野で公知の任意のウイルスベクターを、本発明で使用することができる。かかるウイルスベクターの例には、以下に由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない：アデノウイルス科；ビルナウイルス科；ブニヤウイルス科；カリシウイルス科、カピロウイルス属；カルラウイルス属；カルモウイルスのウイルス属；カリモウイルスの属；クロステロウイルス属；コメリナイエローモットルウイルス属；コモウイルスのウイルス属；コロナウイルス科；ＰＭ２ファージ属；コルシコウイルス科；潜在ウイルスの属；種子伝染性潜伏ウイルスの属；ククモウイルスのウイルス属のファミリー（［ＰＨｇｒ］６ファージ属；サイシオウイルス科；カーネーションリングスポットウイルスの属；ディアンソウイルスのウイルス属；ソラマメウイルトウイルスの属；ファバウイルスのウイルス属；フィロウイルス科；フラビウイルス科；フロウイルス属；ジェミニウイルス（Ｇｅｒｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）の属；ジアルジアウイルスの属；ヘパドナウイルス科；ヘルペスウイルス科；ホルデイウイルスのウイルス属；イラルウイルス（Ｉｌｌａｒｖｉｒｕｓ）のウイルス属；イノウイルス科；イリドウイルス科；レヴィウイルス科；リポスリックスウイルス科；ルテオウイルス属；マラフィウイルスのウイルス属；トウモロコシ白化萎縮ウイルス属；ミクロウイルス科（ｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；ミオウイルス科；ネクロウイルス属；ネポウイルスのウイルス属；ノダウイルス科；オルトミクソウイルス科；パポーバウイルス科；パラミクソウイルス科；パースニップイエローフレックウイルス属；パルティティウイルス科；パルボウイルス科；ピーエネーションモザイクウイルス属；フィコドナウイルス科；ピコルナウイルス科；プラズマウイルス科；プロドウイルス科；ポリドナウイルス科；ポテックスウイルス属；ポティウイルス；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科；ラブドウイルス科；リジジオウイルスの属；シホウイルス科；ソベモウイルス属；ＳＳＶ１型ファージ；テクチウイルス科；テヌイウイルス；テトラウイルス科；トバモウイルスの属；トブラウイルスの属；トガウイルス科；トムブスウイルスの属；トロウイルスの属；トティウイルス科；ティモウイルスの属；および植物ウイルスサテライト。
本発明の方法によって産生されたウイルスベクターは、任意の天然に存在するおよび／または組換えのウイルスベクターのヌクレオチド配列のゲノム（一部または全体）（例えば、ＡＡＶ、ＡＶ、ＬＶなど）またはバリアントを含んでよい。ウイルスベクターバリアントは、核酸レベルおよびアミノ酸レベルで有意に相同するゲノム配列を有し、一般的に物理的および機能的に等価なウイルスベクターを産生し、類似の機序によって複製し、類似の機序によってアセンブリし得る。
バリアントウイルスベクター配列を、本明細書中に記載の宿主系中でウイルスベクターを産生するために使用することができる。例えば、所与のベクターに対して（例えば、ＡＡＶ、ＡＶ、ＬＶなど）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超えるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）。
ウイルス発現系が、本明細書中に記載の方法を使用して所与のウイルスベクターをその産生中に補完するのに必要な任意のエレメントを含むようにさらに改変されると理解すべきである。例えば、ある特定の実施形態では、核酸カセットは、末端反復配列に隣接している。１つの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの産生のために、ＡＡＶ発現系は、組換えＡＡＶプラスミド、Ｒｅｐを発現するプラスミド、Ｃａｐを発現するプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドのうちの少なくとも１つをさらに含むであろう。所与のウイルスベクターの相補エレメントは当該分野で周知であり、したがって、当業者は、本明細書中に記載のウイルス発現系を改変することができるであろう。
ＡＡＶベクターを製造するためのウイルス発現系（例えば、ＡＡＶ発現系）は、例えば、誘導性プロモーターの調節下でトランスの複製（Ｒｅｐ）遺伝子および／またはキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子をさらに含み得る。ＲｅｐおよびＣａｐは、これらの遺伝子の発現が共に「オン」になるような１つの誘導性プロモーターの調節下、または別個のインデューサーによって「オン」になる２つの個別の誘導性プロモーターの調節下で発現することができる。ＡＡＶゲノムの左側には、ｐ５およびｐ１９と呼ばれる２つのプロモーターが存在し、これらによって異なる長さの２つの重複する伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）を産生することができる。これらの核酸の各々はイントロンを含み、このイントロンはスプライシングで切り出されるか切り出されない場合があり、それにより、４つのＲｅｐ遺伝子（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）が得られる可能性がある。Ｒｅｐ遺伝子（特に、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）は、自己プライミング作用においてＩＴＲによって形成されたヘアピンに結合し、ヘアピン内の指定の末端分離部位を切断する。これらの遺伝子は、ＡＡＶゲノムのＡＡＶＳ１特異的組み込みに必要である。４つ全てのＲｅｐタンパク質は、ＡＴＰに結合し、ヘリカーゼ活性を保有することが示された。プラス鎖ＡＡＶゲノムの右側は、ｐ４０と呼ばれる１つのプロモーターから始まり、３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）の重複配列をコードする。ｃａｐ遺伝子は、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）と呼ばれるさらなる非構造タンパク質を産生する。このタンパク質は、ＯＲＦ２から産生され、キャプシドアセンブリ過程に不可欠である。ＡＡＶベクターの製造に必要なエレメントは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５４７８７４５Ａ号；同第５６２２８５６Ａ号；同第５６５８７７６Ａ号；同第６４４０７４２Ｂ１号；同第６６３２６７０Ｂ１号；同第６１５６３０３Ａ号；同第８００７７８０Ｂ２号；同第６５２１２２５Ｂ１号；同第７６２９３２２Ｂ２号；同第６９４３０１９Ｂ２号；同第５８７２００５Ａ号；および米国特許出願公開第２０１７／０１３０２４５号；同第２００５０２６６５６７Ａ１号；同第２００５０２８７１２２Ａ１号（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに概説され得る。
１つの実施形態では、ＡＡＶベクターを産生するための細胞を、懸濁培地中で培養する。別の実施形態では、細胞を、無動物成分条件下で培養する。無動物成分培地は、所与の細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）に適合する任意の無動物成分培地（例えば、無血清培地）であり得る。ＡＡＶベクターを増殖することができることが当該分野で公知の任意の細胞株を、本明細書中に記載の方法を使用したＡＡＶ産生のために使用することができる。ＡＡＶベクターを生成するために使用することができる例示的な細胞株には、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ－７、およびＮＳＯが含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態では、ＡＡＶベクター産生のための細胞株は、ＡＡＶベクター産生に必要な成分（例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、ＶＰ１など）のいずれかを安定に発現する。１つの実施形態では、ＡＡＶベクター産生のための細胞株は、ＡＡＶベクター産生に必要な成分（例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、ＶＰ１など）のいずれかを一過性に発現する。
ＡＡＶベクター産生のための細胞株がｒｅｐまたはｃａｐを安定にも一過性にも発現しない事象では、これらの配列は、例えば、本明細書中に記載の方法を使用して産生された環状核酸を介してＡＡＶ発現系に提供されることになる。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ配列は、当該分野で公知の任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコールは、典型的には、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一のプラスミド上で発現する。ＡＡＶの複製配列およびパッケージング配列は、共に提供される必要はないが、共に提供されると都合が良い場合がある。ＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドのアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥｌａ領域またはＥ３領域に挿入される）。また、ＥＢＶベクターは、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を発現するために使用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソームベクターであるが、連続的な細胞分裂にわたって高コピー数を依然として維持するであろうということである（すなわち、「ＥＢＶ系核エピソーム」と命名された染色体外エレメントとして細胞内に安定に組み込まれる（Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７（１９９２）を参照のこと））。
典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列の救出を防止し、そして／またはパッケージングを維持するためにＴＲに隣接しないであろう。
本明細書中に記載の方法を使用してレンチウイルスを製造するためのウイルス発現系は、核酸カセットに隣接した長末端反復（ＬＴＲ）をさらに含むであろう。ＬＴＲは、レトロウイルスＲＮＡの逆転写によって形成されたレトロトランスポゾンまたはプロウイルスＤＮＡのいずれかの末端で数百回または数千回反復する同一のＤＮＡ配列である。ＬＴＲは、ＬＴＲ特異的インテグラーゼを介した宿主染色体へのレトロウイルスＤＮＡの組み込みを媒介する。ＬＴＲおよびレンチウイルスベクターの製造方法は、例えば、米国特許第７０８３９８１Ｂ２号；同第６２０７４５５Ｂ１号；同第６５５５１０７Ｂ２号；同第８３４９６０６Ｂ２号；同第７２６２０４９Ｂ２号；および米国特許出願公開第２００７００２５９７０Ａ１号；同第２０１７００６７０７９Ａ１号；同第２０１１００２８６９４Ａ１（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
本明細書中に記載の方法を使用してアデノウイルスを製造するためのウイルス発現系は、核酸カセットに隣接したおよそ９０～１４０塩基対（正確な長さはセロタイプに依存する）の同一の逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含むであろう。ウイルスの複製起点は、正確にはゲノム末端のＩＴＲ内にある。アデノウイルスゲノムは、およそ３６０００塩基対の直鎖二本鎖ＤＮＡ分子である。しばしば、遺伝子療法で使用されるアデノウイルスベクターは、新規の遺伝情報を導入することができるＥ１領域を欠失している；Ｅ１欠失によって組換えウイルスの複製が欠損する。ＩＴＲおよびアデノウイルスベクターの製造方法は、例えば、米国特許第７５１０８７５Ｂ２号；同第７８２０４４０Ｂ２号；同第７７４９４９３Ｂ２号；同第７８２０４４０Ｂ２号；同第１００４１０４９Ｂ２；国際特許出願番号ＷＯ２００００７００７１Ａ１号；ＷＯ２００００７００７１Ａ１号；および米国特許出願公開第２００３００２２３５６Ａ１号；同第２００８００５０７７０Ａ１号（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
１つの実施形態では、ウイルス発現系は、宿主細胞（ウイルス、哺乳動物細胞、または昆虫細胞など）であり得る。昆虫細胞の例には、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ－５、およびＳ２の各昆虫細胞株が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶベクターを製造するためのウイルス発現系は、例えば、ウイルス発現系が昆虫細胞である場合、バキュロウイルス発現系をさらに含み得る。バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルス感染昆虫細胞からのウイルスの効率的な大量産生および組換えタンパク質の発現のために設計されている。バキュロウイルス発現系は、例えば、米国特許第６９１９０８５Ｂ２号；同第６２２５０６０Ｂ１号；同第５１９４３７６Ａ号（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
別の実施形態では、ウイルス発現系は無細胞系である。ウイルスベクター産生のための無細胞系は、例えば、Ｃｅｒｑｕｅｉｒａ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１６；Ｓｈｅｎｇ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７；およびＳｖｉｔｋｉｎ Ｙ．Ｖ．，ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
本明細書中に提供した１つの態様は、本明細書中に記載の方法のうちのいずれかを使用して製造されたベクターである。
本明細書中に提供した別の態様は、環状核酸ベクターであって、少なくとも１つの隣接切断部位、ならびに（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む環状核酸ベクターである。
本明細書中に提供したさらに別の態様は、環状核酸ベクターであって、（ｉ）ファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｖ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、ここで、前述のベクターが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む、環状核酸ベクターである。
宿主系が所与のベクターに必要な成分をさらに含むと理解される。例えば、ＡＡＶの産生には少なくとも１つの複製（Ｒｅｐ）遺伝子および／または少なくとも１つのキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子が存在する必要がある。１つの実施形態では、ベクターはＡＡＶであり、宿主系は、少なくとも１つの複製（Ｒｅｐ）遺伝子および／または少なくとも１つのキャプシド（Ｃａｐ）遺伝子を構成性に発現する。別の実施形態では、ベクターはＡＡＶであり、少なくとも１つのＲｅｐ遺伝子を発現する核酸および少なくとも１つのＣａｐ遺伝子を発現する核酸を、本明細書中に記載の方法の工程（ａ）の前に宿主系に形質転換するか、本明細書中に記載の方法の工程（ａ）と同時に形質転換する。ＡＡＶゲノムの左側には、ｐ５およびｐ１９と呼ばれる２つのプロモーターが存在し、これらによって異なる長さの２つの重複する伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）を産生することができる。これらの核酸の各々はイントロンを含み、このイントロンはスプライシングで切り出されるか切り出されない場合があり、それにより、４つのＲｅｐ遺伝子（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）が得られる可能性がある。Ｒｅｐ遺伝子（特に、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）は、自己プライミング作用においてＩＴＲによって形成されたヘアピンに結合し、ヘアピン内の指定の末端分離部位を切断する。これらの遺伝子は、ＡＡＶゲノムのＡＡＶＳ１特異的組み込みに必要である。４つ全てのＲｅｐタンパク質は、ＡＴＰに結合し、ヘリカーゼ活性を保有することが示された。プラス鎖ＡＡＶゲノムの右側は、ｐ４０と呼ばれる１つのプロモーターから始まり、３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）の重複配列をコードする。ｃａｐ遺伝子は、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）と呼ばれるさらなる非構造タンパク質を産生する。このタンパク質は、ＯＲＦ２から産生され、キャプシドアセンブリ過程に不可欠である。ＡＡＶベクターの製造に必要なエレメントは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５４７８７４５Ａ号；同第５６２２８５６Ａ号；同第５６５８７７６Ａ号；同第６４４０７４２Ｂ１号；同第６６３２６７０Ｂ１号；同第６１５６３０３Ａ号；同第８００７７８０Ｂ２号；同第６５２１２２５Ｂ１号；同第７６２９３２２Ｂ２号；同第６９４３０１９Ｂ２号；同第５８７２００５Ａ号；および米国特許出願公開第２０１７／０１３０２４５号；同第２００５０２６６５６７Ａ１号；同第２００５０２８７１２２Ａ１号（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに概説され得る。種々の実施形態では、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を発現する核酸を、標準的な方法（例えば、プラスミド、ウイルス、リポソーム、マイクロカプセル、非ウイルスベクターによるか、裸のＤＮＡとして）を使用して形質転換する。
１つの実施形態では、宿主系は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ウイルス、または細菌パッケージング細胞などの宿主細胞であり得る。例えば、ＡＡＶベクターを製造するための宿主系は、例えば、宿主系が昆虫細胞である場合、バキュロウイルス発現系をさらに含むことができる。バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルス感染昆虫細胞からのウイルスの効率的な大量産生および組換えタンパク質の発現のために設計されている。バキュロウイルス発現系は、例えば、米国特許第６９１９０８５Ｂ２号；同第６２２５０６０Ｂ１号；同第５１９４３７６Ａ号（各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。昆虫細胞の例には、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ－５、およびＳ２の各昆虫細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、宿主系は無細胞系である。例えば、ベクターを合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系でアセンブリすることができる。必要とされる酵素タンパク質（例えば、レンチウイルスについてはｐｏｌ；ＡＡＶについてはＲｅｐ）を発現するカセットを調製することができる。１つの実施形態では、無細胞系はヘルパーファージ粒子を含む。ヘルパーファージ粒子（例えば、Ｍ１３Ｋ０７）は、ファージベクターを使用する場合に粒子形成に必要な遺伝子産物を提供する。ヘルパーファージ粒子は、例えば、（２００５）Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ．Ｉｎ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに概説されている。
必要とされる構造タンパク質を発現する他のカセット（例えば、レンチウイルスについてはｇａｇおよびｅｎｖ；ＡＡＶについては、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を発現するｃａｐ遺伝子）をアセンブリすることができる。ＬＴＲまたはＩＴＲなどのパッケージング配列の間に最終的に隣接する所望の導入遺伝子に作動可能に連結された遺伝子を有する別のベクターが合成されるであろう。これを実施するための種々の方法が当該分野で公知である。ベクター産生のための無細胞系は、例えば、Ｃｅｒｑｕｅｉｒａ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１６；Ｓｈｅｎｇ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７；およびＳｖｉｔｋｉｎ Ｙ．Ｖ．，ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
複製起点
本明細書中に記載のテンプレートは、繊維状ファージ（Ｆｆファージ）由来の少なくとも１つの複製起点（ＯＲＩ）（すなわち、複製が開始される部位）を含む。繊維状ファージＯＲＩは、周知の通り、複製の開始、複製の終結、および複製によって産生された複製形態のパッケージングのための部位を定義するファージゲノム領域である。ファージのみに由来するＯＲＩを有する（すなわち、ファージ以外の生物に由来するＯＲＩを含まない）プラスミドは、ファージミドとして公知である。繊維状ＯＲＩを介したファージミドの複製は、例えば、Ｓｐｅｃｔｈｒｉｅ，Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｖ．２２８（３），１９９２；およびＮａｆｉｓｉ，ＰＭ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌ．２０１８（その各々の内容全体が、本明細書中で参考として援用される）にさらに概説されている。本発明で用いる適切な繊維状ファージＯＲＩは、Ｍ１３、ｆ１、またはｆｄファージ複製起点である。
本明細書中に記載のファージＯＲＩを用いることは、複製を開始させるためのヘルパーファージが必ずしも必要でなく、複製物におけるヘルパーファージ汚染の可能性が排除されるので有利である。本明細書中に記載のファージＯＲＩは、一本鎖環状物（すなわち、環状核酸）の複製を独立して開始させる。
本発明のＯＲＩは、テンプレート上のその位置に関して制限されない。ＯＲＩは、少なくとも１つのＩＴＲまたは少なくとも１つの切断部位の上流または下流に配置することができる。１つの実施形態では、ＯＲＩは左ＴＲの上流にある。１つの実施形態では、ＯＲＩは、ＴＲに隣接し、かつ導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある。
１つの実施形態では、テンプレートはＦ１ ＯＲＩを含む。Ｆ１は、ファージ粒子の複製およびｓｓＤＮＡのパッケージングが可能なファージ由来ＯＲＩである。１つの実施形態では、Ｆ１に由来するＯＲＩは、配列番号２３５のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2022537410000002
別の実施形態では、ＯＲＩはＭ１３に由来する。Ｍ１３ ＯＲＩは、テンプレートのＭ１３ヘルパー依存複製を容易にする。１つの実施形態では、Ｍ１３に由来するＯＲＩは、配列番号２３６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2022537410000003
１つの実施形態では、少なくとも１つのＯＲＩは、野生型ＯＲＩと比較して変異した第２のＯＲＩを含む。変異したＯＲＩは、単一のヌクレオチド変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換）を含むことができるか、野生型ＯＲＩ配列の少なくとも１つの部分（例えば、少なくとも５つのヌクレオチド）を欠くように短縮され得る。変異ＯＲＩは、非機能的ＯＲＩであり得る。例えば、非機能的ＯＲＩは、野生型ＯＲＩの機能（例えば、複製の開始）が低下しているか、完全に喪失されているであろう。
１つの実施形態では、変異ＯＲＩは変異Ｆ１ ＯＲＩ（Ｆ１－ＯＲＩΔ２９）である。変異ＯＲＩΔ２９は、複製開始能力を欠く短縮Ｆ１ ＯＲＩである。ＯＲＩΔ２９は、例えば、Ｓｐｅｃｔｈｒｉｅ，Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｖ．２２８（３），１９９２にさらに概説されている。１つの実施形態では、ＯＲＩΔ２９は、配列番号２３７のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2022537410000004
１つの実施形態では、変異ＯＲＩは変異Ｍ１３ ＯＲＩ（Ｍ１３－ＯＲＩΔ２９）である。変異ＯＲＩΔ２９は、複製開始能力を欠く短縮Ｍ１３ ＯＲＩである。１つの実施形態では、ＯＲＩΔ２９は、配列番号２３８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2022537410000005
本明細書中に記載の環状核酸は、他のタイプおよび種のＯＲＩを含まず、例えば、ベクターは、細菌または哺乳動物のＯＲＩを含まない。
ある特定の例では、ＯＲＩは、複製後にテンプレートから切り取られる。１つの実施形態では、ＯＲＩは少なくとも２つの切断部位に隣接している（すなわち、切断部位はＯＲＩのすぐ上流に配置され、第２の切断部位はＯＲＩのすぐ下流に配置されている）。この配置を有するテンプレートは複製後に切断されて、テンプレートからＯＲＩが除去される。被験体への導入遺伝子送達のためのテンプレートがファージＯＲＩを含まないことが本明細書中で特に意図される。
ある特定のＯＲＩには、複製を開始するためのさらなる細胞成分が存在することが必要である。例えば、Ｍ１３ ＯＲＩには、Ｍ１３由来ヘルパーファージが必要である。１つの実施形態では、ファージ由来ＯＲＩには、例えば、一本鎖テンプレートのｉｎ ｖｉｔｒｏ複製中にヘルパーファージが存在することが必要である。１つの実施形態では、宿主系は、ヘルパーファージを一過性に発現する。例えば、ヘルパーファージを、テンプレートの発現前、発現後、または発現と実質的に同時に宿主系で発現させることができる。別の実施形態では、宿主系は、ヘルパーファージを構成性に発現する。当業者は、特定のＯＲＩでの複製開始のためにさらなる成分（例えば、ヘルパー遺伝子）が必要であるかどうかを査定することができるであろう。
末端反復
本明細書中に記載のテンプレートは、少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）（例えば、逆位末端配列（ＩＴＲ））を含む。例えば、テンプレートは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれを超えるＴＲを含むことができる。１つの実施形態では、第２のＴＲが存在し、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している。
種々の実施形態では、ＴＲはＩＴＲである。ＩＴＲは、ヘアピン構造を形成し、逆位末端配列として機能する（すなわち、複製、組み込み、および／またはプロウイルス救出などの所望の機能を媒介する）任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得る。例えば、非ＡＡＶ ＩＴＲ配列（他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）の非ＡＡＶ ＩＴＲ配列など）またはＳＶ４０複製起点としての機能を果たすＳＶ４０ヘアピンを、ＩＴＲとして使用することができ、ＩＴＲを、短縮、置換、欠失、挿入、および／または付加によってさらに改変することができる。さらに、ＩＴＲは、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように、部分的または完全に合成され得る。典型的には、ＩＴＲは１４５ヌクレオチド長である。末端の１２５個のヌクレオチドが回文構造の二本鎖Ｔ型ヘアピン構造を形成する。この構造において、Ａ－Ａ’パリンドロームがステムを形成し，２つの小さい方のパリンドロームＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’がＴのクロスアームを形成する。Ｄ配列中の他の２０個のヌクレオチドは一本鎖のままである。ＡＡＶゲノムの文脈において、２つのＩＴＲ（ゲノムの各末端に１つずつ）が存在するであろう。
ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶ（セロタイプ１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３が含まれるが、これらに限定されない）、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または現在公知であるか、その後に発見される任意の他のＡＡＶに由来してよい。ＡＡＶ ＩＴＲは、末端反復が所望の機能（例えば、複製または組み込み）を媒介する限り、未変性の末端反復配列を有する必要はない（例えば、未変性のＡＡＶ ＩＴＲ配列を、挿入、欠失、短縮、および／またはミスセンス変異によって変更してよい）。
１つの実施形態では、ＩＴＲは野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、ＩＴＲは変異体ＩＴＲである。変異体ＩＴＲは、非機能的ＩＴＲであり得る。例えば、非機能的ＩＴＲは、野生型ＩＴＲの機能（例えば、複製、組み込み、および／またはプロウイルス救出を媒介する）が低下しているか、完全に喪失されているであろう。
１つの実施形態では、変異体ＩＴＲはＤＤ変異体ＩＴＲ（ＤＤ－ＩＴＲ）である。ＤＤ－ＩＴＲは、元のＩＴＲと同一の配列を有するが、Ａ配列に隣接する第２のＤ配列を含み、したがって、ＤおよびＤ’が存在する。ＤおよびＤ’をアニーリングすることができる（例えば、米国特許第５，４７８，７４５（その内容が本明細書中で参考として援用される）に記載）。各Ｄは、典型的には、約２０ｎｔ長であるが、５ヌクレオチド長ほどの大きさしかない場合がある。より短いＤ領域は、Ａ－Ｄジャンクションを保存している（例えば、３’末端でのＡ－Ｄジャンクションを保存する欠失によって生成される）。好ましくは、Ｄ領域は、ニッキング部位および／またはＡ－Ｄジャンクションを保持している。ＤＤ－ＩＴＲは、典型的には、約１６５ヌクレオチドである。ＤＤ－ＩＴＲは、ＤＮＡ構築物の複製のためのシスの情報を提供する能力を有する。したがって、ＤＤ－ＩＴＲは、例えば、図１に示すように、ホリデイ構造を形成することができるＤエレメントおよびＤ’エレメントに隣接する逆位回文配列（例えば、５’から３’への方向の配列５’－ＤＡＢＢ’ＣＣ’Ａ’Ｄ’－３’の（＋）鎖および５’から３’への方向の配列５’－ＤＡＣＣ’ＢＢ’Ａ’Ｄ’－３’を有する（＋）鎖に相補的な（－）鎖）を有する。ある特定の実施形態では、ＤＤ－ＩＴＲは、その成分（例えば、Ａ－Ｃ）が欠失していてよく、一方で、ＤエレメントおよびＤ’エレメントが依然として保持されている。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ホリデイ構造を形成する能力を依然として保持し、かつ２コピーのＤエレメント（ＤおよびＤ’）を保持する欠失を含む。ＤＤ－ＩＴＲを、未変性のＡＡＶ ＩＴＲまたは合成ＩＴＲから生成することができる。ある特定の実施形態では、欠失はＢ領域エレメントにある。ある特定の実施形態では、欠失はＣ領域エレメントにある。ある特定の実施形態では、欠失は、ＩＴＲのＢエレメント内およびＣエレメント内の両方にある。１つの実施形態では、Ｂエレメントおよび／またはＣエレメントの全体が欠失しており、例えば、単一のヘアピンエレメントと置換されている。１つの実施形態では、テンプレートは、少なくとも２つのＤＤ－ＩＴＲを含む。
合成ＩＴＲは、１またはそれを超える欠失、付加、置換、またはこれらの任意の組み合わせに起因して野生型ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶセロタイプ２ＩＴＲ（ＩＴＲ２）配列）とヌクレオチド配列が異なる天然に存在しないＩＴＲを指す。合成ＩＴＲ配列と野生型ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲ２）配列との間の相違は、単一ヌクレオチドの変化ほど小さくてよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６０、７０、８０、９０、または１００またはそれを超えるヌクレオチドまたはこれらの任意の範囲の変化）。いくつかの実施形態では、合成ＩＴＲ配列と野生型ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲ２）配列との間の相違は、わずか約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドまたはこれらの間の範囲でよい。
さらなるＴＲ（例えば、長末端反復（ＬＴＲ））を、本発明で使用することができる。
１つの実施形態では、テンプレート上に存在するＩＴＲを、例えば、ＡＡＶベクターの産生のために使用することができる。ＡＡＶベクターの産生方法は、上に記載されている。
切断部位
本明細書中に記載のテンプレートは、テンプレートの他のエレメントに隣接している少なくとも１つの切断部位を含む。切断部位は、ホスホジエステルバックボーンが選択的に破壊されるヌクレオチド配列である。例えば、酵素がホスホジエステルバックボーンを配列内の選択された部位で切断するので、ヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列は切断部位である。かかる切断部位は、エンドヌクレアーゼに応じて一本鎖または二本鎖であってよい。化学的切断部位（マクサム・ギルバート配列決定法で行われるピリミジン切断反応およびプリン切断反応、または米国特許第４，７９５，７００号（本明細書中で参考として援用される）に記載の酸化などの化学的方法による切断など）も含まれる。
１つの実施形態では、テンプレートは、少なくとも１つの第２の切断部位をさらに含み、テンプレート上の前述の部位内にさらなるエレメント（例えば、少なくとも１つのＯＲＩ、少なくとも１つのＴＲ、および治療導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター）を、少なくとも２つの切断部位がこれらのエレメントに隣接するように含む。１つの実施形態では、第３の切断部位がＯＲＩのすぐ下流に配置されている。
１つの実施形態では、切断部位は、ヌクレアーゼによって切断される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ切断活性を保有する分子を指す。ヌクレアーゼ剤の特定の例には、亜鉛フィンガータンパク質、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、酵母アセンブリ、リコンビナーゼ、ロイシンジッパー、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、エンドヌクレアーゼ、および当業者に公知の他のヌクレアーゼが含まれる。ヌクレアーゼを、所与の標的部位（例えば、切断部位）を特異的に切断するように選択するか、設計することができる。例えば、切断されたポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドとの間に重複末端が作出されるように標的部位で切断するためのヌクレアーゼを選択することができる。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレアーゼの認識部位」は、ヌクレアーゼによってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を指す。
１つの実施形態では、ヌクレアーゼはプロテロメラーゼであり、切断部位はプロテロメラーゼ標的配列（例えば、ＴｅｌＮ認識部位）である。プロテロメラーゼ標的配列は、ＤＮＡテンプレート中に存在するとプロテロメラーゼの酵素活性によって閉鎖型直鎖ＤＮＡに変換可能な任意のＤＮＡ配列である。換言すれば、プロテロメラーゼ標的配列は、プロテロメラーゼによって二本鎖ＤＮＡを切断および再ライゲーションして共有結合によって閉鎖された線状ＤＮＡを形成するために必要である。
典型的には、プロテロメラーゼ標的配列は、本明細書中で完全逆位反復とも記載される任意の完全な回文配列（すなわち、２回回転対称性を有する任意の二本鎖ＤＮＡ配列）を含む。米国特許第９，１０９，２５０号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に示されるように、種々の中温性バクテリオファージおよび細菌プラスミド由来のプロテロメラーゼ標的配列は全て、完全逆位反復を含むという共通の特徴を有する。完全逆位反復の長さは、特定の生物に応じて異なる。Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉでは、完全逆位反復は、１４塩基対長である。種々の中温性バクテリオファージにおいて、完全逆位反復は、２２塩基対長またはそれを超える。また、一部の例（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ１５）では、中央の完全逆位パリンドロームは、逆位反復配列に隣接する（すなわち、より巨大な不完全逆位パリンドロームが形成される）。
１つの実施形態では、プロテロメラーゼは、配列番号２３９の配列を有する。
配列番号２３９は、プロテロメラーゼのヌクレオチド配列である。
Figure 2022537410000006
１つの実施形態では、ヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼであり、切断部位はエンドヌクレアーゼの認識部位（すなわち、制限部位）である。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の部位特異的切断を触媒することができる加水分解酵素である。制限エンドヌクレアーゼ作用の遺伝子座は、特異的ヌクレオチド配列の存在によって決定される。かかる配列は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位と呼ばれる。種々の供給源由来の制限エンドヌクレアーゼは、その認識部位（すなわち、制限部位）のヌクレオチド配列が単離され、特徴づけられている。いくつかの制限エンドヌクレアーゼは、両方の鎖上の同一の点のホスホジエステル結合を加水分解して、平滑末端を産生する。相互に由来する少数のヌクレオチドによって分離された結合の加水分解を触媒して、切断された分子の各末端に遊離一本鎖領域を産生する制限エンドヌクレアーゼもある。かかる一本鎖末端は自己相補性を示し、それ故に付着性があり、加水分解されたＤＮＡを再連結するために使用され得る。かかる酵素による切断に感受性を示す任意のＤＮＡが同一の認識部位を含むはずであるので、同一の付着末端が産生され、その結果、制限エンドヌクレアーゼで処置されているＤＮＡの異種配列を、同様に処置された他の配列に連結することが可能である。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４，１２３（１９７６）を参照のこと。制限部位は、その存在が比較的稀であるが、制限エンドヌクレアーゼを一般的に利用すると、制限部位配列を保有する二本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成によって大量に増幅される。したがって、ＤＮＡの実質的に任意のセグメントを、適切な制限オリゴヌクレオチドを分子の末端に付着させることによって任意の他のセグメントにカップリングし、産物を適切な制限エンドヌクレアーゼで加水分解することによって必要な付着末端を産生することができる。Ｈｅｙｎｅｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６３，７４８（１９７６）およびＳｃｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６，１７７（１９７７）を参照のこと。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の分布の重要な特徴は、前述の部位が読み枠に関して無作為に分布することである。したがって、隣接コドンの間で制限エンドヌクレアーゼによる切断が起こり得るか、この切断がコドン内で起こり得る。
制限部位を、その認識部位の塩基数（例えば、通常は４塩基と８塩基の間）によって分類することができる。配列中の塩基数により、任意の所与のゲノム内で偶然に認識部位が出現する頻度が決定されるであろう（例えば、４塩基対配列は、理論的には、４４すなわち２５６ｂｐ毎に１回、６塩基では４６すなわち４，０９６ｂｐ毎に１回、および８塩基では４８すなわち６５，５３６ｂｐ毎に１回認識部位が生じるであろう）。制限部位は回文構造（塩基配列を逆方向および順方向のいずれから読んでも同じであることを意味する）であることが多い。ミラー様回文構造は、通常のテキストにおいて見いだされるものと類似しており、ＤＮＡの一本鎖の配列を順方向および逆方向のいずれから読んでも同じである（例えば、ＧＴＡＡＴＧ（配列番号２４０））。また、逆位反復パリンドロームは、順方向および逆方向のいずれから読んでも同じであるが、順方向および逆方向の配列が相補ＤＮＡ鎖（すなわち、二本鎖ＤＮＡ）に見いだされる配列である（例えば、ＧＴＡＴＡＣ（配列番号２４１）は、ＣＡＴＡＴＧ（配列番号２４２）と相補的である）。逆位反復パリンドロームはより多く認められ、ミラー様パリンドロームより生物学的に重要である。
１つの実施形態では、テンプレート中の制限部位は、一般的ではない制限部位である（すなわち、前述の部位は、導入遺伝子配列中に一般的に見いだされない）。例えば、制限部位は、ミラー様パリンドローム制限部位、すなわち８塩基対の制限部位である。１つの実施形態では、テンプレートで使用される制限部位は、本発明の導入遺伝子（すなわち、治療導入遺伝子）中に見いだされない。当業者は、例えば、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）を使用して制限部位および導入遺伝子配列のヌクレオチドアラインメントを行うことによって、特定の制限部位が特定の導入遺伝子配列内に見いだされるかどうかを査定することができる。
１つの実施形態では、制限部位は、表１から選択される。表１から制限部位を選択する場合、その制限部位の切断に対応する制限酵素を使用する。
Figure 2022537410000007
Figure 2022537410000008
Figure 2022537410000009
Figure 2022537410000010
Figure 2022537410000011
Figure 2022537410000012
Figure 2022537410000013
Figure 2022537410000014
Figure 2022537410000015
表１では、全ての制限部位を、一文字表記による命名法を使用して５’から３’への方向で記載し、切断点を「／」で示す。括弧内の数字は、非回文構造の酵素の切断点を示す。例えば、ＧＧＴＣＴＣ（１／５）は、５’．．．ＧＧＴＣＴＣＮ／．．．３’およびその相補物３’．．．ＣＣＡＧＡＧＮＮＮＮＮ／．．．５’での切断を示す。
１つの実施形態では、テンプレートは、少なくとも１つのＳｗａＩ制限部位（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、またはそれを超えるＳｗａＩ制限部位）を含む。ＳｗａＩ制限部位は、５’－ＡＴＴＴＡＡＡＴ－３’（配列番号２７）のオクタヌクレオチド配列を有する。ＳｗａＩ制限酵素は、制限配列の中央を切断して平滑末端化したＤＮＡ断片が作出される。
１つの実施形態では、少なくとも２つの制限部位は同じである。例えば、テンプレートは、２つのＳｆ１制限部位を含むことができる。あるいは、少なくとも２つの制限部位は異なる。例えば、テンプレートは、Ｓｆｉ１制限部位およびＭｗｏＩ制限部位を有することができる。１つの実施形態では、少なくとも２つの相補ＳｗａＩ配列をアニーリングして、テンプレート配列内にループを形成する。ＳｗａＩループを、ＳｗａＩ制限酵素で切断することができる。
典型的には、切断部位を切断するために、核酸を、切断部位を活性化する酵素（例えば、プロテロメラーゼまたは制限酵素）に、切断部位を切断するのに十分な時間および条件下で接触させる。当業者は、正確な条件（例えば、温度、反応における試薬の濃度、および所与の酵素についての接触タイミング）を決定することができる。例えば、公知の制限酵素についての正確な条件を、ワールド・ワイド・ウェブｗｗｗ．ｅｎｚｙｍｅｆｉｎｄｅｒ．ｎｅｂ．ｃｏｍで見出すことができる。
アダプター配列
アダプター配列は、短鎖で合成された一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであり、他のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の末端にライゲートすることができる。１つの実施形態では、本明細書中に記載のアダプター配列は、一本鎖であり、例えば、ヘアピンループを介してライゲートされるＤＮＡを閉鎖する。アダプター配列は、ＤＮＡの環状化手段として、切断されたプラスミド断片の一方または両方の末端に付加される。１つの実施形態では、アダプター配列はプラスミド断片にライゲーションされ、アダプター配列はアダプター配列がライゲーションされた切断ＤＮＡの末端での閉鎖を指示する（例えば、図１～５、７、または９を参照のこと）。ＤＮＡ末端を閉鎖するために使用することができるアダプタータンパク質の例には、例えば、米国特許出願公開第２００９／００９８６１２号；および米国特許第６，３６９，０３８号；同第６，４５１，５６３号；同第６，８４９，７２５号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載のヘアピンループが含まれる。プラスミドから切り出されたプラスミド断片の切断末端に付加した場合にＤＮＡを環状化することができる任意の配列がアダプター配列であり得ることが想定される。
種々の実施形態では、アダプター配列または相補アダプター配列を、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）によって切断されたプラスミド断片の粘着末端にライゲーションする。アダプター配列を、本明細書中に記載の方法によって任意のプラスミド断片にハイブリッド形成することができる。１つの実施形態では、アダプター配列は、プラスミド断片へのアダプター配列のライゲーション／ハイブリッド形成を容易にする制限部位配列をさらに含み、プラスミド断片は、プラスミドからのプラスミド断片の切り出し後に前述の制限部位と同一または相補的な制限部位を有する。当業者は、例えば、標準的なサブクローニング法またはＰＣＲベースの技術を使用してアダプター配列に制限部位配列を付加する方法を承知しているであろう。制限部位配列を有するアダプター配列をライゲーションするために、例えば、アダプター配列を対応する制限酵素と接触させることによって制限部位を切断しなければならない。制限部位および相補制限部位をライゲーションする方法は、当該分野で周知であり、例えば、ワールド・ワイド・ウェブｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍで見出すことができる。例えば、切り出されたベクターおよびアダプタータンパク質を、リガーゼ（例えば、Ｔ４リガーゼ）およびＡＴＰの存在下にてｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートする。
例として、配列番号２４３の配列を有するヘアピンループアダプター配列は、Ｓｆｉ１制限部位配列（例えば、配列番号１６１）をさらに含むことができる。Ｓｆｉ１制限部位配列を有するアダプター配列を、制限酵素Ｓｆｉ１で、制限部位を切断するのに十分な時間にわたって消化することができる。これにより、Ｓｆｉ１制限酵素によって切り出されたプラスミド断片にアダプタータンパク質をハイブリッド形成するために使用することができる「粘着末端」がアダプター配列上に作出されるであろう。
配列番号２４３は、ヘアピンループアダプタータンパク質のヌクレオチド配列である。
Figure 2022537410000016
プロモーター
１つの実施形態では、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。導入遺伝子の発現を指示する種々のプロモーターを、本明細書中に記載している。例には、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、および／または誘導性プロモーターが含まれるが、これらに限定されず、これらのプロモーターのいくつかの非限定的な例には、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）、組織特異的プロモーター（例えば、筋肉ＭＣＫ、心臓（例えば、ＮＳＥ）、眼（例えば、ＭＳＫ））、および合成プロモーター（ＳＰ１エレメント）、およびニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢまたはＣＢＡ）が含まれる。プロモーターは、ヌクレアーゼ配列と作動可能に関連する任意の位置に存在することができる。
誘導性プロモーター
誘導性プロモーターは、インデューサーの存在、リプレッサーの非存在、または誘導性プロモーター由来の転写を誘導するのに適切な任意の他の物理的または化学的条件によって誘導されるプロモーターであり得る。用語「インデューサー」および「誘導条件」などは、そのように理解されるべきである。
非限定的な例として、本発明の実施形態で用いる誘導性プロモーターは、小分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン制御性（例えば、誘導性または抑制性）プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、メタロチオネイン誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、ｐＨ誘導性プロモーター、および金属誘導性プロモーターであってよい。
温度誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、温度低下によって誘導され得る（例えば、低温ショック応答性プロモーター）。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＣＨＯ細胞のＳ１００６ａ遺伝子（カルサイクリン）に由来する合成低温ショック応答性プロモーターである。Ｓ１００６ａ遺伝子（カルサイクリン）プロモーターの温度感受性は、Ｔｈａｉｓｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１（Ｔｈａｉｓｕｃｈａｔ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｃｈｏ ｃｅｌｌｓ’，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－１１－５１）（本明細書中で参考として援用される）によって同定された。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｈａｉｓｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１の図２に示された合成低温ショック応答性プロモーターの１つである。これらのプロモーターは、Ｔｈａｉｓｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１の図３に示されるように、温度低下によって誘導される。これらの合成プロモーター構築物のうちのほとんどは、３７℃での公知のプロモーターＳＶ４０に類似の発現を示し、温度を３３℃に低下させた場合には２～３倍誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｈａｉｓｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１の図２の由来のｓｐｓ５である。いくつかの好ましい実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｈａｉｓｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１の図２由来のｓｐｓ８である。
ｐＨ誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、プロモーターを含む細胞が曝露されたｐＨの低下または上昇によって誘導され得る。適切には、誘導性プロモーターは、ｐＨ低下によって誘導され得る（すなわち、酸性条件下で誘導可能なプロモーター）。適切な酸性誘導性プロモーターは、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６（Ｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｔｙｐｅ－ＩＩ Ｈ＋－ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ’，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１１（４），ｐｐ．１－２３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５４０４１））（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＹＧＰ１遺伝子またはＣＣＷ１４遺伝子に由来する酸性条件下で誘導可能な合成プロモーターである。酸性条件によるＹＧＰ１遺伝子またはＣＣＷ１４遺伝子の誘導性は、Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６（Ｒａｊｋｕｍａｒ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｙｅａｓｔ プロモーター’，４４（１７）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ５５３）（本明細書中で参考として援用される）によって研究され、転写因子結合部位を改変することによって改良された。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６の図１Ａ、２Ａ、３Ａ、および４Ａにおける酸性条件下で誘導可能な合成プロモーターのうちの１つである。これらのプロモーターは、Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６の図１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、および４Ｂに示すように、ｐＨの低下によって誘導される。これらの合成プロモーターのうちのほとんどは、ｐＨ６からｐＨ３に低下した場合に最大１０～１５倍誘導される。いくつかの好ましい実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６の図１由来のＹＧＰ１ｐｒである。他の好ましい実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６の図１由来のＹＧＰ１ｐｒである。
容量オスモル濃度誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、容量オスモル濃度誘導性プロモーターであり得る。容量オスモル濃度によって誘導される適切なプロモーターは、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ３９，ｐａｇｅｓ７３４７－７３５３（２０１２））（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
炭素源誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、特定の炭素源（例えば、非糖炭素源）の添加によって誘導され得る。あるいは、誘導性プロモーターは、炭素源の抜き取りまたは非存在によって誘導され得る。種々の炭素源の存在または非存在によって誘導される適切なプロモーターは、Ｗｅｉｎｈａｎｄｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４（Ｗｅｉｎｈａｎｄｌ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）’Ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔｓ’，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１３（１），ｐｐ．１－１７．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５－２８５９－１３－５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
アルコール（例えば、エタノール）誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、エタノールの添加によって誘導され得る。エタノールによって誘導される適切なプロモーターは、Ｍａｔｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ９７，ｐａｇｅｓ６８３５－６８４３（２０１３））（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
アミノ酸誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、１またはそれを超えるアミノ酸の添加によって誘導され得る。適切には、アミノ酸は、芳香族アミノ酸であり得る。適切には、アミノ酸は、ＧＡＢＡ（γアミノ酪酸）（神経伝達物質でもある）であり得る。芳香族アミノ酸およびＧＡＢＡによって誘導される適切なプロモーターは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ９９，ｐａｇｅｓ２７０５－２７１４（２０１５））（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
ホルモン（例えば、エクジソン）誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、ステロイドホルモンによって誘導され得る。適切には、ステロイドホルモンは、エクジソンであり得る。哺乳動物エクジソン誘導系は、Ｎｏ，Ｙａｏ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ（Ｎｏ，Ｄ．，Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．（１９９６）’Ｅｃｄｙｓｏｎｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９３（８），ｐｐ．３３４６－３３５１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９３．８．３３４６）（本明細書中で参考として援用される）によって作出された。Ｎｏ，Ｙａｏ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，１９９６の図２に示すように、哺乳動物細胞中で改変されたエクジソン受容体を発現させると、エクジソンの添加時にエクジソン応答性プロモーター由来の発現が誘導される。Ｎｏ，Ｙａｏ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，１９９６の図６に示すように、この系は、テトラサイクリン誘導系より基本活性が低く、誘導性が高かった。適切な市販の誘導系は、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１５）’Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ’，２１７４６０（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
テトラサイクリン制御性プロモーター－いくつかの実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンまたはその誘導体の存在または非存在によって誘導され得る。
テトラサイクリンまたはその誘導体の非存在下で誘導される適切なプロモーターは、ｔｅｔ－ＯＦＦ系におけるプロモーターである。ｔｅｔ－ＯＦＦ系では、テトラサイクリン調節性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）は、テトラサイクリンまたはその誘導体の非存在下でｔＴＡ依存性プロモーターによる転写を活性化可能である。ｔＴＡおよびｔＴＡ依存性プロモーターは、Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，１９９２（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）’Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８９（１２），ｐｐ．５５４７－５５５１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８９．１２．５５４７）（本明細書中で参考として援用される）によって最初に作出された。ｔＴＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＴｎ１０でコードされるテトラサイクリン耐性オペロン（ｔｅｔリプレッサー）の、活性化サイクリン調節性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）との融合によって作出され、ｔＴＡ依存性プロモーターは、ｔｅｔオペレーター配列とヒトサイトメガロウイルスプロモーターＩＥ（ｈＣＭＶ－ＩＥ）由来の最小プロモーターとの組み合わせによって作出された。テトラサイクリンまたはその誘導体が添加された場合、ｔＴＡはｔＴＡ依存性プロモーター内のその標的配列にもはや結合することができず、ｔＴＡ依存性プロモーターに由来する発現は存在しない。これは、Ｊａｉｓｓｅｒ，２０００（Ｊａｉｓｓｅｒ，Ｆ．（２０００）’Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１１（ＳＵＰＰＬ．１６），ｐｐ．９５－１００）（本明細書中で参考として援用される）の図１Ａに示され、９６ページで説明されている。テトラサイクリンまたはその誘導体のｔＴＡへの結合によってもたらされる配置変化機序は、Ｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００（Ｏｒｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０００）’Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｅｔ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ－ｏｐｅｒａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ’，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７（３），ｐｐ．２１５－２１９．ｄｏｉ：１０．１０３８／７３３２４）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。テトラサイクリンがＴｅｔＲに結合すると結合したＤＮＡ結合ドメインの分離が増大し、ＴｅｔＲのそのオペレーターＤＮＡに対する親和性が失われる。
テトラサイクリンまたはその誘導体の存在によって誘導される適切なプロモーターは、ｔｅｔ－ＯＮ系におけるプロモーターである。Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３ Ｊｕｎ １９９５：Ｖｏｌ．２６８，Ｉｓｓｕｅ５２１８，ｐｐ．１７６６－１７６９ ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．７７９２６０３）（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、ｔｅｔ－ＯＮ系では、逆テトラサイクリン調節性トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）は、テトラサイクリンまたはその誘導体の存在下でｔＴＡ依存性プロモーターによる転写を活性化可能である。テトラサイクリンまたはその誘導体の非存在下では、ｔＴＡはｔＴＡ依存性プロモーター内のその標的配列にもはや結合することができず、ｔＴＡ依存性プロモーターに由来する発現は存在しない。これは、Ｊａｉｓｓｅｒ，２０００（Ｊａｉｓｓｅｒ，Ｆ．（２０００）’Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１１（ＳＵＰＰＬ．１６），ｐｐ．９５－１００）（本明細書中で参考として援用される）の図１Ｂに示され、９６ページで説明されている。
適切には、逆テトラサイクリン調節性トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）の改良バリアントを使用する。
適切な改良バリアントは、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００（Ｕｒｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０００）’Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ ｆｏｒ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｙｉｅｌｄ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９７（１４），ｐｐ．７９６３－７９６８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０１９２１９７）（本明細書中で参考として援用される）の表１に記載されている。バリアントｒｔＴＡ－Ｓ２およびｒｔＴＡ－Ｍ２は、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００の図３（テトラサイクリンまたはその誘導体の非存在下でのｔＴＡ依存性プロモーター由来のバックグラウンド発現が最小であることを示す）において基本活性がより低いことを示した。さらに、ｒｔＴＡ－Ｍ２は、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００の図３に示すようにテトラサイクリンおよびその誘導体に対する感受性が増加し、ｒｔＴＡの１／１０の濃度で機能する。いくつかの好ましい実施形態では、ｒｔＴＡの改良バリアントは、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００のｒｔＴＡ－Ｍ２である。
別の改良バリアントは、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００６（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２００６）’Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｅｔ－Ｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖｉｒａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ’，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３（１９），ｐｐ．１３８２－１３９０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０２７８０）（本明細書中で参考として援用される）の表１に記載されている。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００６の図３に記載するように、これらのバリアントの大多数は、ｒｔＴＡより転写活性およびドキシサイクリン感受性が高いことが示された。最も高性能のバリアントは、活性が７倍であり、ドキシサイクリンに対する感受性が１００倍であった。いくつかの好ましい実施形態では、ｒｔＴＡの改良バリアントは、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００６由来のＶ１４、Ｖ１５、またはＶ１６である。
適切な市販のテトラサイクリン誘導系は、Ｌｉｆｅ－ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴ－Ｒｅｘ系である（例えば、Ｌｉｆｅ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１４）’Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ－ＲＥｘＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ’，１，ｐｐ．１－１２を参照のこと。以下で入手可能である：ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｄｅ／ｄｅ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎ－ａｎｄ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｕｓｉｎｇ－ｔｈｅ－ｔｒｅｘ－ｓｙｓｔｅｍ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌ／）。
例えば、テトラサイクリン非存在かつエストロゲン存在下での誘導－誘導性プロモーターは、ある分子の非存在かつ異なる分子の存在によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｉｉｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）’Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ．’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（９），ｐｐ．６０５４－６０５９．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７０．９．６０５４－６０５９．１９９６）（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、誘導性プロモーターは、テトラサイクリンの除去およびエストロゲンの添加によって誘導され得る。この特異的誘導性は、ｔＴＡトランスアクチベーターのカルボキシ末端へのエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインの付加によって得られた。Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６の図３に示すように、かかる改変トランスアクチベーターは、テトラサイクリンの非存在かつエストロゲンの存在において目的の遺伝子の高発現を示した。
小分子エンハンサーによる誘導－誘導性プロモーターは、小分子エンハンサーによって誘導され得る。小分子エンハンサー（芳香族カルボン酸、ヒドロキサム酸、およびアセトアミドなど）によって誘導される適切なプロモーターは、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００８；１００：１１９３－１２０４）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
ミフェプリストン（ＲＵ－４８６）誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、合成ステロイドによって誘導され得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＲＵ－４８６としても公知のミフェプリストンによって誘導され得る。ハイブリッドミフェプリストン（ｍｉｆｅｓｐｒｉｓｔｏｎｅ）応答性転写因子であるＬｅｘＰＲトランスアクチベーターは、Ｅｍｅｌｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｐａｒｉｎｏｖ，２００８（Ｅｍｅｌｙａｎｏｖ，Ａ．ａｎｄ Ｐａｒｉｎｏｖ，Ｓ．（２００８）’Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＬｅｘＰＲ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｒｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ’，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０（１），ｐｐ．１１３－１２１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２００８．０４．０４２（本明細書中で参考として援用される））により、細菌ＬｅｘＡリプレッサーのＤＮＡ結合ドメイン、ヒトプロゲステロン受容体の短縮リガンド結合ドメイン、およびヒトＮＦ－ｋＢ／ｐ６５タンパク質の活性化ドメインの融合によって作出された。Ｅｍｅｌｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｐａｒｉｎｏｖ、２００８の図１および図２に示すように、ミフェプリストンを添加すると、ＬｅｘＰＲは、ＬｅｘＡ結合部位を保有するプロモーター配列に由来する発現を誘導する。適切な市販のミフェプリストン誘導系は、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍである（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｔ．（１９９４）’Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ ＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’，ｐｐ．１－２５を参照のこと）。
Ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター－いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ｃｕｍａｔｅの存在または非存在によって誘導され得る。
Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６（Ｍｕｌｌｉｃｋ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）’Ｔｈｅ ｃｕｍａｔｅ ｇｅｎｅ－ｓｗｉｔｃｈ：Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ’，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，ｐｐ．１－１８．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－６－４３（本明細書中で参考として援用される））のｃｕｍａｔｅスイッチ系では、リプレッサーＣｙｍＲがプロモーターの下流に配置されたＣｕＯ配列を含むプロモーター由来の転写を遮断する。ｃｕｍａｔｅが添加された時点で、ＣｙｍＲリプレッサーは、ＣｕＯに結合することができず、ＣｕＯを含むプロモーター由来の転写を進行することができる。これは、Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６の図１Ｂおよび図２に示されている。
別のｃｕｍａｔｅスイッチ系では、ＶＰ１６の活性化ドメインとのＣｙｍＲの融合から作出されたキメラトランスアクチベーター（ｃＴＡ）は、ｃｕｍａｔｅの存在下でプロモーターの上流にＣｕＯ配列を含むプロモーターに由来する転写を防止しない。ｃｕｍａｔｅの非存在下では、キメラトランスアクチベーター（ｃＴＡ）は、ＣｕＯ配列に結合し、転写を防止する。これは、Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６の図１Ｃおよび図３に示されている。
第３の立体配置では、逆キメラトランスアクチベーター（ｒｃＴＡ）は、ｃｕｍａｔｅの非存在下でプロモーターの上流にＣｕＯ配列を含むプロモーターに由来する転写を防止する。ｃｕｍａｔｅの存在下では、ｒｃＴＡはＣｕＯ配列に結合し、ＣｕＯ配列含むプロモーター由来の転写を進行することができる。これは、Ｍｕｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００６の図１Ｄおよび図７に示されている。
適切な市販のｃｕｍａｔｅ誘導系は、ＳＢＩ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ（２０２０）’Ｃｕｍａｔｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｌｔｉｍａｔｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｕｓｅ ＳＢＩ’ｓ ｃｕｍａｔｅ－ＣＵＭＡＴＥ－ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ ＳＹＳＴＥＭＳ’，ｐｐ．１－１３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）に見出される。
４－ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、４－ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）によって誘導され得る。適切な４－ヒドロキシタモキシフェン 誘導性プロモーターは、Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌｕｍｅ２３７，Ｉｓｓｕｅ３，２８ Ａｕｇｕｓｔ １９９７，Ｐａｇｅｓ７５２）（本明細書中で参考として援用される）によって記載されている。
ｇａｓ誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、ｇａｓ誘導性プロモーター（例えば、アセトアルデヒド誘導性プロモーター）であり得る。適切なｇａｓ誘導性プロモーターは、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４（Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００４）’Ｇａｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ’，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２（１１），ｐｐ．１４４０－１４４４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０２１）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。図１Ａに示すように、Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の未変性のアセトアルデヒド誘導ＡｌｃＲ－ＰａｌｃＡ系は、ＡｌｃＲ特異的オペレーターモジュールをヒト最小プロモーターに導入すること（合わせてＰＡＩＲと呼ばれる）によって哺乳動物用に適合されている。図１Ｃ、図２、および図３に示すように、ＡｌｃＲが目的の細胞内に構成性に発現される場合、アセトアルデヒドを導入すると、アセトアルデヒドはＡｌｃＲに結合し、次いで、ＰＡＩＲプロモーターの調節下にある目的の遺伝子が発現される。アセトアルデヒドの非存在下では、目的の遺伝子は発現されない。
リボスイッチ、リボザイム、およびアプタザイム誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、リボザイムの存在または非存在によって誘導され得る。リボザイムを、同様に、リガンドによって誘導することができる。
誘導性プロモーターは、代謝産物の非存下で誘導され得る。いくつかの実施形態では、代謝産物は、グルコサミン－６－リン酸応答性であり得る。グルコサミン－６－リン酸応答性遺伝子リプレッサーとして作用する適切なリボザイムは、Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４（Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００４）’Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ’，Ｎａｔｕｒｅ，４２８（６９８０），ｐｐ．２８１－２８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０２３６２）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。リボザイムは、図２Ｃに示した濃度に依存する様式でグルコサミン－６－リン酸によって活性化され、ｇｌｍＳ遺伝子の伝令ＲＮＡを切断する。改変すると、この天然系をｇｌｍＳ遺伝子以外の目的の遺伝子の制御のために適用することが可能である。
また、タンパク質発現を、リガンド誘導性アプタザイムによって下方制御することができる。タンパク質発現を、リボザイムの小分子誘導自己切断によりｍＲＮＡが分解されることによってタンパク質発現を下方制御するアプタザイムによって下方制御することができる（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６（Ｚｈｏｎｇ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｐｔａｚｙｍｅ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ’，ｅＬｉｆｅ，５（ＮＯＶＥＭＢＥＲ２０１６）．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１８８５８）（本明細書中で参考として援用される））。適切なアプタザイムは、（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）の図４Ａに示されている。（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）の図４に示すように、これらのアプタザイムは、目的の遺伝子の相対発現を低下させる。
また、タンパク質発現を、少分子依存性リボザイムによって上方制御することができる。リボザイムは、テトラサイクリン依存性であり得る。リガンドの非存在下で本来はｍＲＮＡを切断するリボザイム切断を防止することによってタンパク質発現スイッチをオンにすることができる適切なテトラサイクリン依存性リボザイムは、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．２０１５，４，５，５２６－５３４）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
また、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１２，４８，７２１５－７２１７）（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、タンパク質発現を、グアニン依存性アプタザイムによって制御することができる。
さらに、哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉを化学的に誘導可能なマイクロＲＮＡ前駆体アナログと薬物誘導性アロステリックリボザイムを組み合わせたＲＮＡ構造は、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，３９，１３９０６－１３９０７）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
メタロチオネイン誘導性プロモーター－メタロチオネイン誘導性プロモーターは、文献に記載されている。例えば、Ｓｈｉｎｉｃｈｉｒｏ Ｔａｋａｈａｓｈｉ’’Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｇｅｎｅ’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍａｒｃｈ ９，２０１５，Ｐ７９５－７９９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
ラパマイシン誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、ラパマイシンなどの小分子薬物によって誘導され得る。ラパマイシンを使用した遺伝子発現を薬理学的に調節するためのヒト化系は、Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌｕｍｅ２，ｐａｇｅｓ１０２８－１０３２（１９９６））（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ラパマイシンがＦＫＢＰ１２に結合し、次いで、この複合体がＦＲＡＰに結合する天然の能力を、Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６は、目的の遺伝子のラパマイシン特異的発現を誘導するために使用した。ＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰタンパク質のうちの１つのＤＮＡ結合ドメインへの融合および他のタンパク質のアクチベータードメインへの融合によって誘導を行った。図１ｂに示すように、ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰは相互作用しないので、ＦＫＢＰがＤＮＡ結合ドメインと融合され、かつＦＲＡＰがアクチベータードメインに融合される場合、ラパマイシンの非存在下で目的の遺伝子は転写されないであろう。図２および図３に示すように、ラパマイシンの存在下で、ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰは相互作用し、ＤＮＡ結合ドメインおよびアクチベータードメインは密接に接触し、その結果目的の遺伝子を転写する。
化学誘導接近誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、化学誘導接近によって調節され得る。タンパク質の存在量または活性の調節に適切な小分子ベースの系は、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１１ Ｍａｒ１５；４（１６４）：ｒｓ２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．２００１４４９）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
遺伝子発現は、Ｂｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｂｅｌｓｈａｗ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）’Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９３（１０），ｐｐ．４６０４－４６０７）（本明細書中で参考として援用される）に示された２つのタンパク質結合表面を組み合わせた分子による化学誘導接近によって誘導され得る。２つのタンパク質結合表面を組み合わせた分子による化学誘導接近による目的の遺伝子の転写活性化は、Ｂｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．の図３に示さされている。
Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ（登録商標）誘導性プロモーター－誘導性プロモーターは、合成小分子によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、これらの合成小分子は、ジアシルヒドラジンリガンドであり得る。遺伝子発現の誘導可能な上方制御および下方制御に適切な系は、Ｃｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（Ｖｏｌｕｍｅ６６，Ｉｓｓｕｅ８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｐｐ．２７）ｏｒ Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌｕｍｅ２５，ｐａｇｅｓ１０６－１１６（２０１８））（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）系は、それぞれがＤＮＡ結合ドメインおよび酸性転写活性化ドメインに融合されたエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびＲＸＲに由来する２つのキメラタンパク質からなる。核内受容体は、合成小分子リガンドが結合するとヘテロ二量体化して機能的転写因子を作出し、目的の遺伝子に連結された応答性プロモーター由来の転写を活性化することができる。
ＣＲＩＳＰＲ誘導性プロモーター－遺伝子発現は、ＣＲＩＳＰＲベースの転写制御因子によって誘導され得る。Ｆｅｒｒｙ，Ｌｙｕｔｏｖａ ａｎｄ Ｆｕｌｇａ，２０１７（Ｆｅｒｒｙ，Ｑ．Ｒ．Ｖ．，Ｌｙｕｔｏｖａ，Ｒ．ａｎｄ Ｆｕｌｇａ，Ｔ．Ａ．（２０１７）’Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＣＲＩＳＰＲ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ’，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，８，ｐｐ．１－１０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４６３３）（本明細書中で参考として援用される）の図１Ａに示すように、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９は、その関連する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計することによって目的の配列に指向することができ、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体にエフェクタードメインを係留することによって遺伝子発現を調整することができる。ｓｇＲＮＡの最小の操作に基づいた適切な多用途の誘導性ＣＲＩＳＰＲ－ＴＲプラットフォームは、Ｆｅｒｒｙ，Ｌｙｕｔｏｖａ ａｎｄ Ｆｕｌｇａ，２０１７に記載されている。
ＣＲＩＳＰＲベースの転写制御は、同様に、薬物によって誘導され得る。適切な薬物誘導性ＣＲＩＳＰＲベースの転写制御因子系は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）’Ｄｒｕｇ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ’，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂ．Ｖ．，１７，ｐｐ．１１７１－１１７７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｓｂｊ．２０１９．０７．０１５）（本明細書中で参考として援用される）に示されている。
１つの実施形態では、細胞をインデューサーと接触させるか、細胞を適切な誘導条件に適用すると、誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子が発現する。
本明細書中に記載の誘導性プロモーターは、誘導性プロモーターのインデューサーまたはリプレッサー（例えば、第２の異なるプロモーターのインデューサーまたはリプレッサー）の発現またはインデューサーもしくはリプレッサー自体をさらに調節することができる。１つの実施形態では、細胞は、タンパク質発現を停止することができる抑制性エレメントに作動可能に連結された第１の誘導性プロモーターを含む。
１つの実施形態では、第１の誘導性プロモーターは、第１の誘導性プロモーターの発現を抑制するタンパク質をさらにコードする。
１つの実施形態では、細胞は、第２の誘導性プロモーターの発現を誘導するタンパク質をさらにコードする第１の誘導性プロモーターを含む。
組織特異的プロモーター
本明細書中に開示の方法および組成物のいくつかの実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターであり、表２に開示したプロモーターが含まれるが、これらに限定されないプロモーターから選択することができる。「肝臓特異的」または「肝臓特異的発現」は、シス制御エレメント、シス制御モジュール、またはプロモーターが、他の組織（例えば、脾臓、筋肉、心臓、肺、および脳）と比較して優先的または支配的な様式で、肝臓（または肝臓由来細胞）内の遺伝子発現を増強するか駆動する能力を指す。遺伝子発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態であり得る。好ましい実施形態では、肝臓特異的発現は、他の（すなわち、非肝臓）組織または細胞における発現が無視できるような発現である（すなわち、発現は、高度に肝臓特異的である）。
肝臓特異的プロモーターは、本明細書中の表２に開示の肝臓特異的シス制御エレメント（ＣＲＥ）、合成肝臓特異的シス制御モジュール（ＣＲＭ）、または合成肝臓特異的プロモーターを含む。これらの肝臓特異的プロモーターエレメントは、最小肝臓特異的プロモーターを含む。
肝臓特異的プロモーターエレメントは、例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５３２６７号（その全体が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されている。
表２は、肝臓特異的プロモーター配列の例を示す。表２中の肝臓特異的プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅ）配列のサイズが比較的小さいことは、ベクターへの負荷量が最小となるので有利である。これは、容量が限られたベクター（ＡＡＶベースのベクターなど）でＣＲＥを用いる場合に特に重要である。
Figure 2022537410000017
他の肝臓特異的プロモーターには、ＬＤＬ受容体、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、およびα１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）のプロモーター、ならびにＨＣＢプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他の肝臓特異的プロモーターには、ＡＦＰ（α胎児タンパク質）遺伝子プロモーターおよびアルブミン遺伝子プロモーター（欧州特許出願特許第０４１５７３１号に開示）、α－１抗トリプシン遺伝子プロモーター（Ｒｅｔｔｅｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）１４６０－１４６４に開示）、フィブリノゲン遺伝子プロモーター、ＡＰＯ－Ａ１（アポリポタンパク質Ａ１）遺伝子プロモーター、ならびに肝臓転移酵素（例えば、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、およびγ－グルタミルトランスフェラーゼなど）のプロモーター遺伝子が含まれる。２００１／００５１６１１号およびＰＣＴ特許公開ＷＯ９０／０７９３６号およびＷＯ９１／０２８０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、例えば、ＵＳ２０１７０３２６２５６Ａ１（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示の組換え肝臓特異的プロモーターである。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、Ｂ型肝炎Ｘ－遺伝子プロモーターおよびＢ型肝炎コアタンパク質プロモーターである。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターを、これらのそれぞれのエンハンサーと共に使用することができる。エンハンサーエレメントを、リソソーム酵素をコードする核酸の５’末端または３’末端のいずれかに連結することができる。Ｂ型肝炎Ｘ遺伝子プロモーターおよびそのエンハンサーを、Ｔｗｕ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）３４４８－３４５３に記載の方法を使用して、３３２塩基対のＥｃｏＲＶ－ＮｃｏＩ ＤＮＡ断片としてウイルスゲノムから得ることができる。Ｂ型肝炎コアタンパク質プロモーターを、Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｖｉｒｏｌ１８９（１９９２）５９－６６に記載の方法を使用して、５８４塩基対のＢａｍＨＩ－ＢｇＩＩＩ ＤＮＡ断片としてウイルスゲノムから得ることができる。ＢａｍＨＩ－ＢｇＩＩＩ断片中の負の制御配列を前述の断片を挿入する前に除去する必要がある場合がある。
肝臓特異的プロモーターの機能的バリアント
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントを、プロモーター内で基準プロモーターエレメントと置換した場合に、実質的にその活性を保持するプロモーターエレメントと見なすことができる。例えば、表２に開示の所与のプロモーターの機能的バリアントを含む肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントは、好ましくは、（非改変プロモーターエレメントを含む不変のプロモーター配列と比較して）不変のプロモーターの活性の少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくはその活性の少なくとも９０％、より好ましくはその活性の少なくとも９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持する。
いくつかの実施形態では、表２に開示の肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントまたは機能的断片は、元の非改変配列に対して少なくとも約７５％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性を有し、また、対応する非改変プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも３５％、またはプロモーター活性の少なくとも約４５％、またはプロモーター活性の少なくとも約５０％、またはプロモーター活性の少なくとも約６０％、またはプロモーター活性の少なくとも約７５％、またはプロモーター活性の少なくとも約８０％、またはプロモーター活性の少なくとも約８５％、またはプロモーター活性の少なくとも約９０％、またはプロモーター活性の少なくとも約９５％を有する。プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、治療遺伝子またはレポーター遺伝子）の発現が肝臓由来細胞において優先的または支配的に生じる肝臓特異性を同定することができる。例えば、発現レベルが他の細胞型（すなわち、非肝臓由来細胞）よりも肝臓由来細胞において有意に高い場合を優先的または支配的な発現と定義することができる。
例えば、配列番号２４７の機能的バリアントまたは機能的断片は、配列番号２４７または元の非改変配列に対して少なくとも約７５％の配列同一性、または配列番号２４７または元の非改変配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、配列番号２４７または元の非改変配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性、配列番号２４７または元の非改変配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性、配列番号２４７または元の非改変配列に対して少なくとも約９８％の配列同一性を有し、また、配列番号２４７の対応する非改変プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも３５％、またはプロモーター活性の少なくとも約４５％、またはプロモーター活性の少なくとも約５０％、またはプロモーター活性の少なくとも約６０％、またはプロモーター活性の少なくとも約７５％、またはプロモーター活性の少なくとも約８０％、またはプロモーター活性の少なくとも約８５％、またはプロモーター活性の少なくとも約９０％、またはプロモーター活性の少なくとも約９５％を有する。
適切には、プロモーターエレメントの機能的バリアントは、基準プロモーターエレメントに対して有意なレベルの配列同一性を保持する。適切な機能的バリアントは、基準プロモーターエレメントに対して少なくとも７０％同一、より好ましくは基準プロモーターエレメントに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％同一の配列を含む。
本明細書中の表２に開示の肝臓特異的プロモーターの配列を実質的に活性を喪失することなく変更することができることに留意すべきである。したがって、肝臓特異的プロモーターの活性に有意に有害な改変が回避される場合、以下に考察した肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントを、表２に開示の肝臓特異的プロモーターの配列を改変することによって調製することができる。本開示に提供した情報を考慮すると、機能的バリアントを得るための本明細書中の表２に開示の肝臓特異的プロモーターの改変は容易である。さらに、本開示は、任意の所与の肝臓特異的プロモーターバリアントの機能性を容易に査定する方法を提供する。
導入遺伝子
本発明の方法を使用して製造した環状核酸またはベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞への核酸の送達に有用である。特に、環状核酸またはベクターを、核酸を動物（哺乳動物細胞が含まれる）に送達または移入するために有利に使用することができる。
目的の任意の核酸配列（単数または複数）は、本発明を使用して製造されたＤＮＡ構築物に送達され得る。１つの実施形態では、目的の核酸には、ポリペプチド（ウイルスポリペプチド（例えば、ウイルスによって発現され、そして／またはウイルス粒子産生に必要な任意のポリペプチド、例えば、Ｃａｐ、Ｒｅｐ、およびＡｄヘルパー遺伝子ポリペプチドなど）、治療ポリペプチド（例えば、医学的または獣医学的使用）、免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）、または診断ポリペプチドが含まれる）をコードする核酸が含まれる。１つの実施形態では、目的の核酸には、遺伝子編集ポリペプチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼなど）をコードする核酸が含まれる。１つの実施形態では、目的の核酸には、ＲＮＡ干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、または抑制性オリゴヌクレオチドなど）が含まれる。
１つの実施形態では、導入遺伝子は治療遺伝子である。治療遺伝子には、嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィンが含まれる）（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ５：１３０；米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号；国際公開ＷＯ／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１３７１４－１３７１９（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７－６４（２００８）を参照のこと）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド（ＩκＢドミナント変異体など）、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニ－ユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンギオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－抗トリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシンなど）、ペプチド成長因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質（ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦが含まれる）、グリア由来成長因子、およびトランスフォーミング成長因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンに影響を及ぼす分子（構成性に活性な短縮ｂＡＲＫｅｔなど）、抗炎症因子（ＴＲＡＰなど）、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、ならびにモノクローナル抗体（一本鎖モノクローナル抗体が含まれる；Ｍａｂの例はハーセプチン（登録商標）Ｍａｂである）が含まれるが、これらに限定されない。他の異種核酸配列の例は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん治療で使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、ならびに必要とする被験体に治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。また、パルボウイルスベクターを使用して、モノクローナル抗体および抗体断片（例えば、ミオスタチンに指向する抗体または抗体断片）を送達させることができる（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５８４－５９０（２００５）を参照のこと）。
ポリペプチドをコードする核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする核酸配列が含まれる。レポーターポリペプチドは、当該分野で公知であり、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、核酸（例えば、導入遺伝子）は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライソソーム媒介トランススプライシングを行うＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照のこと）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが含まれる）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照のこと）、および他の非翻訳ＲＮＡ（「ガイド」ＲＮＡなど）（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：４９２９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。非翻訳ＲＮＡの例には、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／もしくは予防するためならびに／または化学療法による損傷を防止するための心臓への投与のため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィ用）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を処置するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）を参照のこと）；ホスホランバン抑制性分子またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管疾患を処置するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）を参照のこと）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇用）、サルコグリカンに対するＲＮＡｉ（例えば、α、β、γ）、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、またはアクチビンＩＩ型可溶性受容体に対するＲＮＡｉ、抗炎症性ポリペプチドに対するＲＮＡｉ（ＩκＢドミナント変異体など）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）に対して指向するＲＮＡｉが含まれる。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、治療導入遺伝子は、プロテインホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を制御する亜鉛フィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン作動性受容体、β２－アドレナリン作動性受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンに影響を及ぼす分子（構成性に活性な短縮ｂＡＲＫｃｔなど）；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン抑制性分子またはドミナントネガティブ分子、例えば、ホスホランバンＳ１６Ｅ、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓ、または骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦが含まれる）をコードし得る。
また、環状核酸またはベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を有し、前述の遺伝子座で組換えられた核酸を含み得る。このアプローチを、例えば、宿主細胞における遺伝的欠陥を修正するために利用することができる。
さらなる代替物として、環状核酸またはベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に産生されることが望ましい任意のポリペプチドをコードすることができる。例えば、環状核酸またはベクターは、培養細胞および培養細胞から単離された発現遺伝子産物に導入され得る。
１つの実施形態では、治療遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結される。治療導入遺伝子の発現を指示する種々のプロモーターを、本明細書中に記載している。例には、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、および／または誘導性プロモーターが含まれるが、これらに限定されず、いくつかの非限定的な例には、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）、組織特異的プロモーター（例えば、筋肉ＭＣＫ）、心臓（例えば、ＮＳＥ）、眼（例えば、ＭＳＫ）、および合成プロモーター（ＳＰ１エレメント））、およびニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢまたはＣＢＡ）が含まれる。プロモーターは、ヌクレアーゼ配列と作動可能に関連する任意の位置に存在することができる。
さらに、１またはそれを超えるプロモーター（同じであるか、異なる場合がある）は、同一の核酸分子内に共に存在するか、核酸分子上の異なる位置に存在することができる。さらに、内部リボゾーム進入シグナル（ＩＲＥＳ）および／または他のリボソーム－リードスルーエレメントが核酸分子上に存在することができる。１またはそれを超えるかかるＩＲＥＳおよび／またはリボソームリードスルーエレメント（同じであるか、異なる場合がある）は、同一の核酸分子内に共に存在するか、核酸分子上の異なる位置に存在することができる。複数のヌクレアーゼ配列が核酸分子上に存在する場合、かかるＩＲＥＳおよびリボソームリードスルーエレメントを使用して、ｃａｐ非依存性機序によって伝令ＲＮＡ配列を翻訳することができる。
本発明の環状核酸ベクターは、標準的なＤＮＡベクターと比較して、広範な細胞（分裂細胞、非分裂細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、ＣＮＳ細胞、皮膚細胞、網膜細胞、または心臓細胞などが含まれる）への核酸の形質導入効率を高める手段を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の環状核酸ベクターの形質導入効率は、標準的なＤＮＡベクターと比較して少なくとも約１０％（例えば、プラスミドベクターまたは非閉鎖型線状ベクターと比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、またはそれを超えて）増加する。本明細書中で使用される場合、「形質導入」は、細胞への遺伝子材料の移入を指す。形質導入効率は、当該分野で周知の技術によって測定することができ、例えば、当業者は、ＰＣＲベースのアッセイまたはウェスタンブロッティングによって細胞に移入されている遺伝子材料のレベルを測定／決定することができる。１つの実施形態では、導入効率を、類似の核酸（例えば、プロモーター、導入遺伝子など）を含むウイルスベクターに対して測定することができる。ウイルスベクターは、当該分野で公知の任意のベクター（ＡＡＶ、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびパルボウイルスベクターなどが含まれる）であり得る。
本明細書中に引用した全ての刊行物、特許出願、特許、特許公開、および他の文献は、文献が示された文および／または段落に関する教示のために、その全体が参考として援用される。
以下の実施例は、本発明を例示するために記載し、本発明を制限すると解釈されないものとする。
２０１９年６月２１日に出願された発明者がＡｓｋｌｅｐｉｏｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＲｉｃｈａｒｄ Ｊｕｄｅ Ｓａｍｕｌｓｋｉである国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３８５１５（ＰＣＴ整理番号０４６１９２－０９２６２０ＷＯＰＴ）における任意の開示が、本出願のクレームのいずれか１つまたは複数に定義の発明、または本出願もしくは本出願に由来する任意の特許において将来的に出願され得る補正されたクレームで定義されるべき任意の発明の範囲内にあり、かつクレームが適用される任意の関連国の法律が国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３８５１５号（ＰＣＴ整理番号０４６１９２－０９２６２０ＷＯＰＴ）の開示が関連国のクレームに対する先行技術の一部であると定めている範囲内にある限り、これにより、本発明者らは、本出願または本出願に由来する任意の特許の無効の防止に必要な範囲まで、本出願または本出願に由来する任意の特許のクレームに由来する前記開示を放棄する権利を保有する。
例えば、制限されないが、本発明者らは、現在のもしくは将来に補正された本出願、または本出願に由来する任意の特許の任意のクレームに由来する任意の１またはそれを超える以下の主題を放棄する権利を保有する：
Ａ．国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３８５１５号（ＰＣＴ整理番号０４６１９２－０９２６２０ＷＯＰＴ）の実施例７および８に開示の任意の主題；または
Ｂ．国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３８５１５号（ＰＣＴ整理番号０４６１９２－０９２６２０ＷＯＰＴ）の図１１～１４に開示の任意の主題；または
Ｃ．環状核酸ベクターを製造する方法であって、宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前述のテンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位および以下を含む工程：（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、ここで、少なくとも１つのＴＲがＡＡＶダブルＤ－ＩＴＲ（ｄｄ－ＩＴＲ）である；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする、回収する工程を含む、方法；または
Ｄ．環状核酸ベクターを製造する方法であって、宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前述のテンプレートが、少なくとも２つの隣接切断部位を含み、かつ、前述の部位内に、以下が存在する工程：（ｉ）少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｉｉ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、ここで、少なくとも１つのＴＲがＡＡＶダブルＤ－ＩＴＲ（ｄｄ－ＩＴＲ）である；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする工程を含む、方法；または
Ｅ．導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、（ａ）宿主系をプラスミドテンプレートで形質転換する工程であって、前述のプラスミドテンプレートが以下を含む工程：（ｉ）ファージ複製起点（ＯＲＩ）；（ｉｉ）短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；（ｉｖ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、ここで、前述のプラスミドテンプレートが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含み、ここで、少なくとも１つのＴＲがＡＡＶダブルＤ－ＩＴＲ（ｄｄ－ＩＴＲ）である；（ｂ）前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および（ｃ）産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、前述の環状核酸が自己アニーリングする工程を含む方法
Ｆ．以下から選択される環状核酸のうちのいずれか：
ａ．少なくとも１つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも１つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｂ．少なくとも２つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも１つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｃ．少なくとも３つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも１つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｄ．少なくとも１つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも１つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｅ．少なくとも２つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも１つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｆ．少なくとも３つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも１つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｇ．少なくとも１つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも２つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｈ．少なくとも２つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも２つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｉ．少なくとも３つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも２つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｊ．少なくとも１つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも２つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｋ．少なくとも２つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも２つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｌ．少なくとも３つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも２つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｍ．少なくとも１つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも３つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｎ．少なくとも２つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも３つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｏ．少なくとも３つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも３つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｐ．少なくとも１つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも３つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｑ．少なくとも２つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも３つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｒ．少なくとも３つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも３つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｓ．少なくとも１つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも４つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｔ．少なくとも２つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも４つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｕ．少なくとも３つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも４つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｖ．少なくとも１つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも４つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｗ．少なくとも２つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも４つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｘ．少なくとも３つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも４つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｙ．少なくとも１つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも５つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｚ．少なくとも２つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも５つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーター有する環状核酸であって、前述の少なくとも２つの切断部位が、任意の順序で５’から３’への方向にて、他の成分に隣接している、環状核酸；または
ａａ．少なくとも３つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも５つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｂｂ．少なくとも１つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも５つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｃｃ．少なくとも２つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも５つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｄｄ．少なくとも３つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも５つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｅｅ．少なくとも１つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも６つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｆｆ．少なくとも２つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも６つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｇｇ．少なくとも３つの切断部位、ファージＯＲＩ、少なくとも６つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを有する環状核酸であって、前述の少なくとも２つの切断部位が他の成分に隣接しており、第３の切断部位が少なくとも１つのＯＲＩの下流にある、環状核酸
ｈｈ．少なくとも１つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも６つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｉｉ．少なくとも２つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも６つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で５’から３’への方向にて有する環状核酸；または
ｊｊ．少なくとも３つの切断部位、少なくとも２つのファージＯＲＩ、少なくとも６つのｄｄ－ＩＴＲ、および導入遺伝子に連結された少なくとも１つのプロモーターを、任意の順序で有する環状核酸。
Ｇ．ｄｄ－ＩＴＲではない少なくとも１つのさらなるＩＴＲをさらに含む［Ｅ］由来の環状核酸のうちのいずれか。
Ｈ．少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む［Ｅ］由来の環状核酸のうちのいずれか。
Ｉ．少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む［Ｅ］由来の環状核酸のうちのいずれか。
Ｊ．導入遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つのさらなるプロモーターをさらに含む［Ｅ］由来の環状核酸のうちのいずれか。
制限されないが、本発明者らは、上記の放棄の権利の保有を、少なくとも本出願に添付の請求項１～７３および［０１５０］に記載のパラグラフ１～７５に適用することを明言する。
本明細書中に記載の発明を、以下の番号をつけたパラグラフにさらに記載することができる：
１．導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、
ａ．宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前述のテンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位、および以下を含む工程：
ｉ．少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
ｉｉｉ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列；
ｂ．前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および
ｃ．産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、
前述の環状核酸が自己アニーリングする工程
を含む、方法。
２．前述のテンプレートが、第２の隣接切断部位をさらに含み、前述の２つの部位内に（ｉ）～（ｉｉｉ）がある、パラグラフ１に記載の方法。
３．前述のテンプレートが、少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
４．回収された前述の環状核酸の少なくとも１つの切断部位を切断する工程（例えば、図５を参照のこと）をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
５．回収後に前述の環状核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製工程をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
６．前述のテンプレートが少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
７．前述のテンプレートが少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
８．前述のアダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
９．前述のアダプター配列が切断部位をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１０．前述の回収された環状核酸が、前述の導入遺伝子の送達のために使用される、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１１．前述の回収された環状核酸が、組換えウイルスベクター産生のために使用される、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１２．前述の環状核酸が、自己アニーリングされた二本鎖である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１３．前述のベクターが一本鎖である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１４．第２のＴＲが存在し、前述の導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１５．前述のＯＲＩが左ＴＲの上流にある、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１６．前述のＯＲＩが前述のＴＲに隣接しており、かつ前述の導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１７．前述の宿主系が細菌パッケージング細胞である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１８．前述の宿主系が無細胞系である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
１９．前述の宿主系が無細胞系であり、かつヘルパーファージ粒子を含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２０．前述の宿主系が宿主細胞である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２１．前述の宿主細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞、または昆虫細胞である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２２．前述のウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、またはポックスウイルス（ＰＶ）である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２３．前述のベクターが、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２４．前述のウイルスがＡＡＶであり、かつ変異体ＩＴＲを有し、ここで、前述の変異体ＩＴＲがダブルＤ変異体ＩＴＲである、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２５．前述の少なくとも１つのＴＲが、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２６．前述のベクターが隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前述の隣接物の間に、前述の導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および前述の導入遺伝子のアンチセンス相補物がある、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２７．前述のＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２８．前述のＯＲＩが、前述のＩＴＲの上流、かつ前述の上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
２９．前述の少なくとも１つのファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、またはＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３０．前述のテンプレート（ｔｅｍｐｌｅ）が、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３１．前述の短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３２．前述の少なくとも２つの切断部位が制限部位である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３３．前述の少なくとも２つの制限部位が同じであるか異なる、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３４．前述の制限部位が、前述の導入遺伝子配列内に見いだされない、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３５．前述の切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３６．前述のプロモーターが、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３７．前述の導入遺伝子が治療遺伝子である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
３８．導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、
ａ．宿主系をプラスミドテンプレートで形質転換する工程であって、前述のプラスミドテンプレートが以下を含む工程：
ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
ｉｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
ｉｖ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、
ここで、前述のプラスミドテンプレートが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む；
ｂ．前述の宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および
ｃ．産生された前述の環状核酸を回収する工程であって、
前述の環状核酸が自己アニーリングする工程
を含む方法。
３９．前述のＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
４０．前述の導入遺伝子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
４１．前述の短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、前述のパラグラフのいずれかに記載の方法。
４２．パラグラフ１～４１のいずれかの方法によって製造された環状核酸ベクター。
４３．環状核酸ベクターであって、
少なくとも１つの隣接切断部位：
ｉ．少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）；および
ｉｉｉ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列
を含む、環状核酸ベクター。
４４．前述のテンプレートが、第２の隣接切断部位をさらに含み、前述の２つの部位内に（ｉ）～（ｉｉｉ）がある、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
４５．前述のベクターが、前述の少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
４６．前述のベクターが、少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
４７．前述のベクターが、少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
４８．前述のアダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
４９．前述のアダプター配列が切断部位をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５０．前述のベクターが、前述の導入遺伝子の送達のために使用される、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５１．前述のベクターが、組換えウイルスベクター産生のために使用される、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５２．前述のベクターが、自己アニーリングし、かつ二本鎖である、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５３．前述のベクターが一本鎖である、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５４．第２のＴＲが存在し、前述の導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５５．前述のＯＲＩが左ＴＲの上流にある、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５６．前述のＯＲＩが前述のＴＲに隣接しており、かつ前述の導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５７．前述の少なくとも１つのＴＲが、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５８．前述のベクターが隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前述の隣接物の間に、前述の導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および前述の導入遺伝子のアンチセンス相補物がある、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
５９．前述のＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６０．前述のＯＲＩが、前述のＩＴＲの上流、かつ前述の上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６１．前述のファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、またはＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６２．前述のテンプレート（ｔｅｍｐｌｅ）が、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６３．前述の短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６４．前述の少なくとも２つの切断部位が制限部位である、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６５．前述の少なくとも２つの制限部位が同じであるか異なる、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６６．前述の制限部位が、前述の導入遺伝子配列内に見いだされない、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６７．前述の切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６８．前述のプロモーターが、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
６９．前述の導入遺伝子が治療遺伝子である、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
７０．以下を含む環状核酸ベクター：
ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
ｉｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
ｉｖ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、
ここで、前述のベクターが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む。
７１．前述のＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
７２．前述の導入遺伝子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
７３．前述の短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
７４．前述のヌクレアーゼがプロテロメラーゼである、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
７５．前述のヌクレアーゼがプロテロメラーゼである、前述のパラグラフのいずれかに記載のベクター。
実施例１：環状核酸を産生するテンプレートの作製。
被験体においてヒト第ＩＸ因子ミニ遺伝子を発現するためのベクターの生成に有用なテンプレートを作製する方法を本明細書中に例示する。５’から３’への方向に、ＢＡＭＨＩ制限部位、Ｆ１ ＯＲＩ、ＰｖｕＩＩ制限部位、ＩＴＲ－Ｌ、第ＩＸ因子のコード領域に作動可能に連結された配列番号２４７肝臓特異的プロモーター、ＩＴＲ－Ｒ、およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位を有するプラスミドを、ＢＡＭＨＩ制限酵素およびＨＩＮＤＩＩＩ制限酵素を用いて３７℃で２４時間消化する。消化物を電気泳動ゲルにて泳動して、プラスミド断片を可視化および単離する。プラスミド断片をゲルから切り取り、精製する。ＢＡＭＨＩ制限部位配列を有するアダプター配列およびＨＩＮＤＩＩＩ制限部位配列を有するアダプター配列を、同一の様式でさらに消化し、精製する。
環状核酸テンプレートを形成するために、アダプター配列をプラスミド断片の切断物にアニーリングする。精製されたプラスミド断片およびアダプター配列を、リガーゼ（Ｔ４リガーゼなど）およびＡＴＰの存在下にて室温で少なくとも１時間ライゲーションする。ライゲーション反応物を６５℃で１０分間熱失活させて、リガーゼ酵素を不活化する。
環状核酸テンプレートをＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、３７℃で１４～１６時間振盪して増殖させて、環状核酸の複製を誘導する。第ＩＸ因子導入遺伝子をコードする環状核酸を、細胞を溶解するための細菌溶解試薬を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞から放出させる。放出後、第ＩＸ因子の環状核酸を、例えば、カラムクロマトグラフィを使用した精製による標準的な方法を使用して回収する。自己アニーリングした環状核酸を回収し、ｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子の送達のために直接使用するか、ウイルス産生のために使用することができる（実施例２を参照のこと）。
回収された第ＩＸ因子の環状核酸を、ＰｖｕＩＩ制限酵素を用いて２５℃で２４時間さらに消化して、ＰｖｕＩＩ切断部位を切断する（例えば、図５を参照のこと）。ＰｖｕＩＩでの切断によってＯＲＩが除去され、第ＩＸ因子の核酸産物に開放型の末端が作出される。開放型環状核酸を、導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達または組換えウイルスＤＮＡの産生のために使用することができる。環状核酸は、組換えウイルス産生や導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ送達のために使用すべきＰｖｕＩＩで消化される必要はない。
実施例２：環状核酸は、受容細胞中で存続する
臨床での妥当性を実証するために、肝臓特異的プロモーター（配列番号２４７）によって駆動されるヒト第ＩＸ因子のミニ遺伝子を含む発現カセットを、異なるベクター（本発明の（すなわち、実施例１で産生された）自己アニーリングした環状核酸）、対応する線状ＤＮＡ、および対応するプラスミドＤＮＡを使用して血友病Ｂマウスの肝臓に送達させた。マウスを、注射後の種々の時間（３、４、５、６、７、８、９、１０週間後、および３ヶ月後、５ヶ月後、１０ヶ月後、１年後など）で血清ヒト第ＩＸ因子濃度を分析することによってベクターの存在および第ＩＸ因子の遺伝子発現について分析する。
第ＩＸ因子発現カセットを含む環状核酸のレシピエントは、一本鎖線状ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ対照のレシピエントより大量のベクターが経時的に存在し、第ＩＸ因子濃度が高いと予想される。ベクターの存在量およびヒト第ＩＸ因子の濃度は、環状核酸のレシピエント中で経時的に持続され、対照のレシピエント中で経時的に減少すると予想される。さらに、経時的に、レシピエントマウスにおける環状核酸中での第ＩＸ因子の発現は、対照のレシピエントにおける第ＩＸ因子の発現より実質的に高いレベルかつ実質的に長期間存続すると予想される。この予想を、ＥＬＩＳＡ分析による血清中のヒト第ＩＸ因子の定量および出血性素因の補正の同定によって判定し、また、ベクター投与後の異なる時間におけるサザンブロット分析による処置マウスの肝臓中のベクターの定量によって判定する。さらに、処置マウスにおけるベクターを含む肝細胞核数を肝臓切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によって判定して、ベクターを含む肝細胞核の相対数が類似するかどうかを検証する。
ｉｎ ｖｉｖｏでの送達ＤＮＡの分子構造
ベクターは、経時的に存続するレシピエント組織中でコンカテマーを形成すると予想される。コンカテマーは染色体外に存続するか、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。これを実証するために、レシピエントマウス肝臓組織を、サザンブロット分析によってベクターＤＮＡの分子構造について分析する。ＤＮＡを単離し、次いで、ベクター内を切断しないか、発現カセット中を１回切断する制限エンドヌクレアーゼで消化する。切断ＤＮＡを分析して、マウスゲノムへのＤＮＡの組み込みまたは染色体外の保持を判定する。ベクターＤＮＡ内を切断できないエンドヌクレアーゼでの消化に由来する全ての試料中の高分子量バンドの産生は、マウスゲノムへのＤＮＡベクターの組み込みまたはｉｎ ｖｉｖｏでのコンカテマーの急速な形成のいずれかと一致する。これら２つの可能性を、発現カセット中を１回切断する制限エンドヌクレアーゼでの肝臓ＤＮＡ試料の消化によって識別する。この消化による高分子ＤＮＡシグナルのＤＮＡラダーへの変換は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるコンカテマー化を示すであろう。
高分子量ＤＮＡの大部分は、コンカテマーに由来し得る。しかしながら、これが細胞外であるかゲノムに組み込まれているかどうかを判断するために、マウスに本発明の環状核酸を注射するか、第ＩＸ因子トランスポゾン（Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３５－４１）を２／３部分的肝切除物に組み込む。トランスポゾン群では、一方のプラスミドから発現されたトランスポザーゼは、第２のプラスミド由来のトランスポゾンＩＴＲに隣接したヒト第ＩＸ因子の発現カセットの放出および放出された導入遺伝子の発現カセットのマウスゲノムへの挿入を媒介する。部分的な肝切除によって肝細胞が１または２ラウンド細胞分裂し、染色体外ＤＮＡが有意に喪失する場合、これは、組み込みプラスミド注入マウス（その導入遺伝子発現が肝細胞増殖の誘導によって変化しないはずである）と対照的に、ベクターＤＮＡ処置マウスにおける部分的肝切除後の同一の期間にわたる遺伝子発現が１／１０に低下することを示すであろう。これらのデータは、本発明の転写活性環状核酸が優位に肝臓内の染色体外に残存することを示すであろう。別の結果は、活性環状核酸が肝臓細胞染色体に組み込まれることを示すであろう。
方法
動物研究。８～１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手する。全ての動物に対する手技を、スタンフォード大学および国立衛生研究所が定めたガイダンスにしたがって実施する。４０マイクログラムのＤＮＡを含む２ｍｌの０．８５％生理食塩液を、以前に記載のように（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１２５８－１２６６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１７３５－１７３７）、マウス尾静脈に注射する。各注射について、ＤＮＡの質量は同じであるが、一方で分子比は変動し得る（例えば、２倍）。他の研究では、分子比の小さな変動は、遺伝子発現に有意な影響を及ぼさないと予想されている。後眼窩技術によって定期的にマウスから出血させる。一部の例では、以前に記載のように（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：４９－５２（２０００））、マウスの肝臓の２／３を外科的に部分切除する。マウスにおける出血時間を、以前に記載のように（Ｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３５－４１）、２～３ｍｍの尾の切り口由来の血液の凝固に必要な時間を測定することによって判定する。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成。尾静脈注入による４０μｇの各対照ＤＮＡの投与から２～３週間後のマウスのパラフィン包埋肝臓の５マイクロメートルの切片を、以前に記載のプロトコール（Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３７９３－３８０３）にしたがってｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成のために処理する。脱パラフィン、再水和、変性、およびプロテイナーゼでの消化後、切片を、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のＤＩＧ標識キットを使用してジゴキシゲニンで標識したベクターに特異的な変性ＤＮＡプローブとインキュベートする。ハイブリッド形成後、切片を、アルカリホスファターゼと抱合したヤギ抗ジゴキシゲニン抗体とインキュベートし、アルカリホスファターゼ結合ベクターＤＮＡを、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド－５－４－クロロ－３－インドリルホスファート（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって可視化する。
ＥＬＩＳＡ定量。ＤＮＡ送達後、マウスから定期的に採血し、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：３０５６－３０６１）をＥＬＩＳＡによって定量する。
サザンブロット分析。ＤＮＡ注射後の一定期間にマウスを屠殺し、総肝臓ＤＮＡを塩析法によって調製する。２０ミリグラムの肝臓ＤＮＡを制限酵素で消化し、ゲル電気泳動によって分離し、プローブとしてｃＤＮＡを使用したサザンブロットハイブリッド形成によって分析する。放射性ＤＮＡバンドを、ホスホイメージャー分析によって定量する。
本発明は、本明細書中に開示の例示の実施形態によって本発明の範囲が制限されないものとし、これらの実施形態は本発明の１つの態様の例示を意図し、機能的に等価な任意のクローン、ＤＮＡ、またはアミノ酸の配列が本発明の範囲内にある。実際に、本明細書中に示し、記載した実施形態に加えて、本発明の種々の修正形態が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修正形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
実施例３：環状核酸は形質導入を高める。
実施例１で産生された第ＩＸ因子を発現する自己アニーリングした環状核酸は、核酸構築物を発現する標準的なベクター（例えば、レンチウイルスベクター）と比較して、形質導入を高める。各構築物を、尾静脈注射によってマウスに注射した。第ＩＸ因子の導入遺伝子の発現は肝臓特異的プロモーターによって駆動されるため、発現は、肝臓に制限されると予想される。注射７日後（ｄｐｉ）に、マウスを屠殺し、肝臓を入手し、ウェスタンブロッティングによって第ＩＸ因子の導入遺伝子のタンパク質発現について探索する。環状核酸由来の導入遺伝子発現は、標準的なベクターと比較して７０倍に高められることが見出される。全ての結果を、測定された効果がバッチや精製方法に特異的でないことを確認するためにいくつかの方法（例えば、密度超遠心分離、アフィニティクロマトグラフィ）によって精製された独立したベクター調製物を使用した複数の実験で確認する。第ＩＸ因子を発現する環状核酸の形質導入は、類似の核酸構築物を発現するＡＡＶベクターの形質導入と比較して有意に高められることがさらに見出される。これらの実験を、ヒト酸性Ａｃｉｄ－ａ１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を発現する環状核酸を用いて繰り返し、標準的なベクターと比較して高められた形質導入が同様に認められる。
適切な時点で試験されたことをさらに確実にするために、７、１４、２１、および４２ｄｐｉに回収した測定物を使用して環状核酸および標準的な核酸ベクター由来の導入遺伝子発現の経時変化を取った。発現動態は同一なようであり、７ｄｐｉで頑強な発現が認められ、標準的なベクターの注射の７日後と４２日後との間に７．５倍に増加し、環状核酸注射後の同一の期間中に１２倍に増加する。全ての時点で、環状核酸は、標準的なベクターよりおよそ２桁優れている（７日目で１００倍、１４日目で１７６倍、２１日目で８１倍、および４２日目で１５９倍）。まとめると、これらのデータは、本発明の環状核酸が導入遺伝子の形質導入を高めるのに非常に有効なベクターであることを実証している。
実施例４：環状核酸を使用したウイルスベクターの製造。
実施例１で産生された末端が開放型および閉鎖型の第ＩＸ因子核酸構築物を使用して、ＡＡＶ産生のための安定な細胞株（Ｐｒｏ１０細胞）中でウイルスベクターを製造する。例えば米国特許第９，４４１，２０６号に記載のＡＡＶ産生のためのこれらの安定なＰｒｏ１０細胞は、ＡＡＶベクターの大量産生に理想的である。細胞株を、トランスフェクションによって第ＩＸ因子核酸構築物と接触させて環状核酸を発現させる。第ＩＸ因子核酸構築物の発現を、プラスミドに特異的なプライマーを使用したＰＣＲベースのアッセイによって確認する。
トランスフェクション。安定なＰｒｏ１０細胞を、第ＩＸ因子核酸構築物でトランフェクトし、Ｒｅｐ２およびセロタイプ特異的Ｃａｐ２をコードするパッケージングプラスミドでもトランスフェクトする：あるいは、本明細書中に記載の方法によって作製された自己アニーリングした環状核酸としてＡＡＶ－Ｒｅｐ／Ｃａｐも提供し、そして／または本明細書中に記載の方法によって作製した自己アニーリングした環状核酸としてＡｄ－ヘルパープラスミド（ＸＸ６８０：アデノウイルスヘルパー配列をコードする）も提供する。
トランスフェクション１日目に、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞をカウントし、トランスフェクションのために希釈する。トランスフェクションカクテルを混合するために、以下の試薬を、以下の順序：プラスミドＤＮＡ、ＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）、または他の無血清の適合トランスフェクション培地でコニカルチューブに添加し、次いで、トランスフェクション試薬をプラスミドＤＮＡに対して特定の比で添加する。カクテルを反転させて混合した後に室温でインキュベートする。トランスフェクションカクテルをピペットでフラスコに入れ、振盪機／インキュベーターに戻す。全ての最適化研究を、培養体積３０ｍＬで行い、その後により大きな培養体積で可視化する。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採取する。
Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒシステムを使用したｒＡＡＶの産生。トランスフェクションの２日前にｗａｖｅバッグに播種する。バッグへの播種から２日後に、細胞培養物を計数し、次いで、細胞培養物をトランスフェクション前に拡大／希釈する。次いで、ｗａｖｅバイオリアクターの細胞培養物をトランスフェクトする。トランスフェクションから少なくとも４８時間後に細胞培養物をｗａｖｅバイオリアクターバッグから採取する。
力価：ＡＡＶ力価を、ＤＮａｓｅ消化後に検量線（ＡＡＶ ＩＴＲ特異的）に対するｑＰＣＲおよび第ＩＸ因子の核酸構築物に特異的なプライマーを使用して計算する。
振盪フラスコおよび６０個のＷａｖｅバイオリアクターバッグからの浮遊細胞の回収。トランスフェクションから４８時間後、細胞培養物を、振盪フラスコから注ぎ出すか、ｗａｖｅバイオリアクターバッグからポンピングすることによって５００ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に回収する。次いで、細胞培養物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心機およびＨ６０００Ａローターを用いて６５５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を破棄し、細胞を１×ＰＢＳに再懸濁し、５０ｍＬコニカルチューブに移し、６５５×ｇで１０分間遠心分離する。この時点で、ペレットを、－６０℃未満で保存するか、精製を継続することができる。
ｑＰＣＲを用いた細胞ライセート由来のｒＡＡＶの力価測定。１０ｍＬの細胞培養物を取り出し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心機およびＨ６０００Ａローターを用いて６５５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を細胞ペレットからデカントする。次いで、細胞ペレットを、５ｍＬのＤＮａｓｅ緩衝液（５ｍＭ ＣａＣ１２、５ｍＭ ＭｇＣ１２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に再懸濁し、その後に超音波処理して細胞を効率的に溶解する。次いで、３００ｕＬを取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に入れる。次いで、１４０単位のＤＮａｓｅＩを各試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ＤＮａｓｅ消化の有効性を判定するために、４～５ｍｇの第ＩＸ因子核酸構築物を、ＤＮａｓｅを添加済みおよび無添加の非トラスフェクション細胞ライセートに添加する。５０μＬのＥＤＴＡ／サルコシル溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を各チューブに添加し、７０℃で２０分間インキュベートする。次いで、５０μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、５５℃で少なくとも２時間インキュベートする。試料を１５分間ボイルしてプロテイナーゼＫを失活させる。ｑＰＣＲによって分析するためのアリコートを各試料から取り出す。細胞あたりどのくらいのｒＡＡＶベクターが生成されるかを有効に判定するために、２つのｑＰＣＲ反応を行う。一方のｑＰＣＲ反応を、プラスミドＸＸ６８０、ｐＸＲ２、および第ＩＸ因子核酸構築物のバックボーン上の相同配列に結合するように設計されたプライマーセット２ｓを使用して設定する。第２のｑＰＣＲ反応を、第ＩＸ因子ミニ遺伝子内の領域に結合して増幅するためのプライマーセットを使用して設定する。ｑＰＣＲを、３０ＲｏｃｈｅのＳｙｂｒグリーン試薬およびライトサイクラー４８０を使用して行う。試料に対して９５℃で１０分間の変性、その後の４５サイクル（９０℃で１０秒間、６２℃で１０秒間、および７２℃で１０秒間）および融解曲線解析（９９℃で３０秒間を１サイクル、６５℃で１分間継続）を実施する。
粗ライセート由来のｒＡＡＶの精製。各細胞ペレットを、最終体積１０ｍＬに調整する。ペレットを短時間ボルテックスし、１秒間のオン、１秒間のオフによってバーストする収率３０％の超音波処理を４分間行う。超音波処理後、５５０ＵのＤＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、ペレットを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣＳＢ遠心機およびＨＳ－４ローターを使用して９４００×ｇで遠心分離して細胞デブリをペレット化し、明澄化されたライセートをＴｙｐｅ７０Ｔｉ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ ３６１６２５）に移す。ｒＡＡＶの単離のための浮遊ＨＥＫ２９３細胞の採取および溶解に関して、当業者は、顕微溶液化などの機械的方法または界面活性剤などの化学的方法を用いることができ、その後に深層濾過またはタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を使用した明澄化工程を使用することができる。
ＡＡＶベクターの精製。明澄化したＡＡＶライセートを、当業者が承知しており、以下の文書（Ａｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ｋａｌｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｚｏｌｏｔｕｋｉｎ ｅｔ ａｌなど）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されていると考えられるカラムクロマトグラフィ法によって精製する。
実施例５：コンカテマーＤＮＡの増幅
ヒト第ＩＸ因子遺伝子、ＤＤ－ＩＴＲ、およびプロテロメラーゼＴｅｌＮの結合配列を含むテロメア末端をコードする核酸を含む環状核酸を、ＤＮＡテンプレートとして使用する。テンプレートのテロメア末端を含む回文配列の半分の切片に相補的な単一の回文構造のオリゴヌクレオチドを、特異的プライマーとして使用する。プライマーは、ＤＮＡテンプレート上の２つの同一の部位に結合する。
環状核酸の変性および単一のプライマーのアニーリングを、例えば、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むアニーリング／変性緩衝液中で行う。９５℃で１分間加熱し、この温度で１～１０分間保持し、その後にテンプレートへの特異的プライマーの結合を最大にするように最適化された冷却プロフィールを慎重に調節することによって変性させる。次いで、適切なＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に最適な温度まで低下させる。かかる適切な酵素の１つは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージφ２９から単離した３０℃で最適に作用するφ２９である。
次いで、酵素φ２９およびＰＰｉ（酵母無機ピロホスファターゼ）を含む適切な体積の反応緩衝液を、アニーリングしたＤＮＡ／プライマー反応物に添加する。反応混合物を、およそ３０℃で５時間と２０時間の間またはそれを超えてインキュベートする。適切な反応緩衝液は、典型的には、３５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰを含む。
次いで、ＲＣＡによって増幅されたコンカテマーＤＮＡを、プロテロメラーゼＴｅｌＮと、適切な緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴなど）中で、反応が完了するまで３０℃でインキュベートする。得られた閉鎖型線状ＤＮＡ産物は、例えば、精製すべき量に応じてゲル電気泳動または適切なクロマトグラフ法によって精製され得る。
これらの方法は、産物がテンプレートと同一であるサイクル反応のために提供する。この反応物は、この方法の工程のサイクルを追加することによって非常に少量のテンプレートから容易にスケールアップされる。
これらの方法は、産物がテンプレートと同一であるサイクル反応のために提供する。この反応物は、この方法の工程のサイクルを追加することによって非常に少量のテンプレートから容易にスケールアップされる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、
ａ．宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前記テンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位および以下を含む工程：
ｉ．少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
ｉｉｉ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列；
ｂ．前記宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および
ｃ．工程ｂで産生された前記環状核酸を回収する工程であって、
前記環状核酸が自己アニーリングする、回収する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記テンプレートが、第２の隣接切断部位をさらに含み、前記２つの部位内に前記（ｉ）～（ｉｉｉ）がある、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記テンプレートが、少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
回収された前記環状核酸の少なくとも１つの切断部位を切断する工程（例えば、図５を参照のこと）をさらに含む、項目１～３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
回収後に前記環状核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製工程をさらに含む、項目１～４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記テンプレートが少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記テンプレートが少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記アダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
前記アダプター配列が切断部位をさらに含む、項目６または７に記載の方法。
（項目１０）
前記回収された環状核酸が、前記導入遺伝子の送達のために使用される、項目１～９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記回収された環状核酸が、組換えウイルスベクター産生のために使用される、項目１～９のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記環状核酸が、自己アニーリングされた二本鎖である、項目１～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ベクターが一本鎖である、項目１～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
第２のＴＲが存在し、前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＯＲＩが左ＴＲの上流にある、項目１～１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＯＲＩが前記ＴＲに隣接しており、かつ前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある、項目１～１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記宿主系が細菌パッケージング細胞である、項目１～１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記宿主系が無細胞系である、項目１～１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記宿主系が無細胞系であり、かつヘルパーファージ粒子を含む、項目１～１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記宿主系が宿主細胞である、項目１～１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞、または昆虫細胞である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、またはポックスウイルス（ＰＶ）である、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
前記ベクターが、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである、項目１１および２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ウイルスがＡＡＶであり、かつ変異体ＩＴＲを有し、ここで、前記変異体ＩＴＲがダブルＤ変異体ＩＴＲである、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記少なくとも１つのＴＲが、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである、項目１～２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記ベクターが隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前記隣接ＤＤ－ＩＴＲの間に、前記導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および前記導入遺伝子のアンチセンス相補物がある、項目１～２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、項目２５～２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＯＲＩが、前記ＩＴＲの上流、かつ前記上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている、項目１～２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１つのファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、およびＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、項目１～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記テンプレートが、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、項目１～２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記少なくとも２つの切断部位が制限部位である、項目１～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記少なくとも２つの制限部位が同じであるか異なる、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記制限部位が、前記導入遺伝子配列内に見いだされない、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、項目１～３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記プロモーターが、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される、項目１～３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記導入遺伝子が治療遺伝子である、項目１～３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、
ａ．宿主系をプラスミドテンプレートで形質転換する工程であって、前記プラスミドテンプレートが以下を含む工程：
ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
ｉｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
ｉｖ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、
ここで、前記プラスミドテンプレートが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む；
ｂ．前記宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および
ｃ．産生された前記環状核酸を回収する工程であって、前記環状核酸が自己アニーリングする工程
を含む、方法。
（項目３９）
前記ＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記導入遺伝子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、項目３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
項目１～４１のいずれか１項に記載の方法によって製造された環状核酸ベクター。
（項目４３）
環状核酸ベクターであって、
少なくとも１つの隣接切断部位、ならびに
ｉ．少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）；および
ｉｉｉ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列
を含む、環状核酸ベクター。
（項目４４）
前記テンプレートが、第２の隣接切断部位をさらに含み、前記２つの部位内に前記（ｉ）～（ｉｉｉ）がある、項目４３に記載のベクター。
（項目４５）
前記ベクターが、前記少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）、項目４３または４４に記載のベクター。
（項目４６）
前記ベクターが、少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む、項目４３～４５のいずれか１項に記載のベクター。
（項目４７）
前記ベクターが、少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む、項目４３～４６のいずれか１項に記載のベクター。
（項目４８）
前記アダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）、項目４６または４７に記載のベクター。
（項目４９）
前記アダプター配列が切断部位をさらに含む、項目４６または４７に記載のベクター。
（項目５０）
前記ベクターが、前記導入遺伝子の送達のために使用される、項目４３～４９のいずれかに記載のベクター。
（項目５１）
前記ベクターが、組換えウイルスベクター産生のために使用される、項目４３～４９のいずれかに記載のベクター。
（項目５２）
前記ベクターが、自己アニーリングし、かつ二本鎖である、項目４３～５１のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５３）
前記ベクターが一本鎖である、項目４３～５２のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５４）
第２のＴＲが存在し、前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している、項目４３～５３のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５５）
前記ＯＲＩが左ＴＲの上流にある、項目４３～５４のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５６）
前記ＯＲＩが前記ＴＲに隣接しており、かつ前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある、項目４３～５５のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５７）
前記少なくとも１つのＴＲが、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである、項目４３～５６のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５８）
前記ベクターが隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前記隣接ＤＤ－ＩＴＲの間に、前記導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および前記導入遺伝子のアンチセンス相補物がある、項目４３～５７のいずれか１項に記載のベクター。
（項目５９）
前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、項目５７または５８に記載のベクター。
（項目６０）
前記ＯＲＩが、前記ＩＴＲの上流、かつ前記上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている、項目４３～５９のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６１）
前記ファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、およびＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、項目４３～６０のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６２）
前記テンプレートが、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、項目４３～６１のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６３）
前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、項目４３～６２のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６４）
前記少なくとも２つの切断部位が制限部位である、項目４３～６３のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６５）
前記少なくとも２つの制限部位が同じであるか異なる、項目６４に記載のベクター。
（項目６６）
前記制限部位が、前記導入遺伝子配列内に見いだされない、項目６４に記載のベクター。
（項目６７）
前記切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、項目４３～６６のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６８）
前記プロモーターが、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される、項目４３～６７のいずれか１項に記載のベクター。
（項目６９）
前記導入遺伝子が治療遺伝子である、項目４３～６８のいずれか１項に記載のベクター。
（項目７０）
環状核酸ベクターであって、
ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
ｉｉ．短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
ｉｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
ｉｖ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列
を含み、
ここで、前記ベクターが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む、環状核酸ベクター。
（項目７１）
前記ＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む、項目７０に記載のベクター。
（項目７２）
前記導入遺伝子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む、項目７０または７１に記載のベクター。
（項目７３）
前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、項目７０～７２のいずれか１項に記載のベクター。

Claims (73)

  1. 導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、
    ａ．宿主系をテンプレートと接触させる工程であって、前記テンプレートが、少なくとも１つの隣接切断部位および以下を含む工程：
    ｉ．少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；
    ｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
    ｉｉｉ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列；
    ｂ．前記宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および
    ｃ．工程ｂで産生された前記環状核酸を回収する工程であって、
    前記環状核酸が自己アニーリングする、回収する工程
    を含む、方法。
  2. 前記テンプレートが、第２の隣接切断部位をさらに含み、前記２つの部位内に前記（ｉ）～（ｉｉｉ）がある、請求項１に記載の方法。
  3. 前記テンプレートが、少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）、請求項１または２に記載の方法。
  4. 回収された前記環状核酸の少なくとも１つの切断部位を切断する工程（例えば、図５を参照のこと）をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 回収後に前記環状核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製工程をさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記テンプレートが少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記テンプレートが少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記アダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記アダプター配列が切断部位をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
  10. 前記回収された環状核酸が、前記導入遺伝子の送達のために使用される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記回収された環状核酸が、組換えウイルスベクター産生のために使用される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  12. 前記環状核酸が、自己アニーリングされた二本鎖である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ベクターが一本鎖である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 第２のＴＲが存在し、前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ＯＲＩが左ＴＲの上流にある、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＯＲＩが前記ＴＲに隣接しており、かつ前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記宿主系が細菌パッケージング細胞である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記宿主系が無細胞系である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記宿主系が無細胞系であり、かつヘルパーファージ粒子を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記宿主系が宿主細胞である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞、または昆虫細胞である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、またはポックスウイルス（ＰＶ）である、請求項１１に記載の方法。
  23. 前記ベクターが、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである、請求項１１および２２に記載の方法。
  24. 前記ウイルスがＡＡＶであり、かつ変異体ＩＴＲを有し、ここで、前記変異体ＩＴＲがダブルＤ変異体ＩＴＲである、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記少なくとも１つのＴＲが、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ベクターが隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前記隣接ＤＤ－ＩＴＲの間に、前記導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および前記導入遺伝子のアンチセンス相補物がある、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、請求項２５～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ＯＲＩが、前記ＩＴＲの上流、かつ前記上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１つのファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、およびＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記テンプレートが、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記少なくとも２つの切断部位が制限部位である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記少なくとも２つの制限部位が同じであるか異なる、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記制限部位が、前記導入遺伝子配列内に見いだされない、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記プロモーターが、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記導入遺伝子が治療遺伝子である、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 導入遺伝子を含む環状核酸ベクターを製造する方法であって、
    ａ．宿主系をプラスミドテンプレートで形質転換する工程であって、前記プラスミドテンプレートが以下を含む工程：
    ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
    ｉｉ．短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
    ｉｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
    ｉｖ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、
    ここで、前記プラスミドテンプレートが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む；
    ｂ．前記宿主系を、環状核酸を産生するのに十分な複製時間にわたってインキュベートする工程；および
    ｃ．産生された前記環状核酸を回収する工程であって、前記環状核酸が自己アニーリングする工程
    を含む、方法。
  39. 前記ＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記導入遺伝子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法によって製造された環状核酸ベクター。
  43. 環状核酸ベクターであって、
    少なくとも１つの隣接切断部位、ならびに
    ｉ．少なくとも１つのファージ複製起点（ＯＲＩ）；
    ｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）；および
    ｉｉｉ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列
    を含む、環状核酸ベクター。
  44. 前記テンプレートが、第２の隣接切断部位をさらに含み、前記２つの部位内に前記（ｉ）～（ｉｉｉ）がある、請求項４３に記載のベクター。
  45. 前記ベクターが、前記少なくとも１つのＯＲＩのすぐ下流に少なくとも１つのさらなる切断部位をさらに含む（例えば、図５を参照のこと）、請求項４３または４４に記載のベクター。
  46. 前記ベクターが、少なくとも１つのアダプター配列をさらに含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載のベクター。
  47. 前記ベクターが、少なくとも２つのアダプター配列をさらに含む、請求項４３～４６のいずれか１項に記載のベクター。
  48. 前記アダプター配列が、切断されたＤＮＡの閉鎖を誘導する（例えば、図１～５、７、および９を参照のこと）、請求項４６または４７に記載のベクター。
  49. 前記アダプター配列が切断部位をさらに含む、請求項４６または４７に記載のベクター。
  50. 前記ベクターが、前記導入遺伝子の送達のために使用される、請求項４３～４９のいずれかに記載のベクター。
  51. 前記ベクターが、組換えウイルスベクター産生のために使用される、請求項４３～４９のいずれかに記載のベクター。
  52. 前記ベクターが、自己アニーリングし、かつ二本鎖である、請求項４３～５１のいずれか１項に記載のベクター。
  53. 前記ベクターが一本鎖である、請求項４３～５２のいずれか１項に記載のベクター。
  54. 第２のＴＲが存在し、前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の両側がＴＲに隣接している、請求項４３～５３のいずれか１項に記載のベクター。
  55. 前記ＯＲＩが左ＴＲの上流にある、請求項４３～５４のいずれか１項に記載のベクター。
  56. 前記ＯＲＩが前記ＴＲに隣接しており、かつ前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列の上流にある、請求項４３～５５のいずれか１項に記載のベクター。
  57. 前記少なくとも１つのＴＲが、変異体ＩＴＲ、合成ＩＴＲ、野生型ＩＴＲ、または非機能的ＩＴＲである、請求項４３～５６のいずれか１項に記載のベクター。
  58. 前記ベクターが隣接ＤＤ－ＩＴＲを有し、前記隣接ＤＤ－ＩＴＲの間に、前記導入遺伝子のセンス鎖に作動可能に連結されたプロモーター、複製欠損ＩＴＲ、および前記導入遺伝子のアンチセンス相補物がある、請求項４３～５７のいずれか１項に記載のベクター。
  59. 前記ＩＴＲがＡＡＶ ＩＴＲである、請求項５７または５８に記載のベクター。
  60. 前記ＯＲＩが、前記ＩＴＲの上流、かつ前記上流ＩＴＲのすぐ下流に配置されている、請求項４３～５９のいずれか１項に記載のベクター。
  61. 前記ファージＯＲＩが、Ｍ１３由来ＯＲＩ、Ｆ１由来ＯＲＩ、およびＦｄ由来ＯＲＩからなる群から選択される、請求項４３～６０のいずれか１項に記載のベクター。
  62. 前記テンプレートが、複製を開始しない短縮ＯＲＩである第２のＯＲＩをさらに含む、請求項４３～６１のいずれか１項に記載のベクター。
  63. 前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、請求項４３～６２のいずれか１項に記載のベクター。
  64. 前記少なくとも２つの切断部位が制限部位である、請求項４３～６３のいずれか１項に記載のベクター。
  65. 前記少なくとも２つの制限部位が同じであるか異なる、請求項６４に記載のベクター。
  66. 前記制限部位が、前記導入遺伝子配列内に見いだされない、請求項６４に記載のベクター。
  67. 前記切断部位が、ヌクレアーゼによって切断される、請求項４３～６６のいずれか１項に記載のベクター。
  68. 前記プロモーターが、構成性プロモーター、抑制性プロモーター、ユビキタスプロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、および合成プロモーターからなる群から選択される、請求項４３～６７のいずれか１項に記載のベクター。
  69. 前記導入遺伝子が治療遺伝子である、請求項４３～６８のいずれか１項に記載のベクター。
  70. 環状核酸ベクターであって、
    ｉ．ファージ複製起点（ＯＲＩ）；
    ｉｉ．短縮ファージＯＲＩ（例えば、ＯＲＩΔ２９）；
    ｉｉｉ．少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）、および；
    ｉｖ．導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列
    を含み、
    ここで、前記ベクターが、５’から３’への方向で、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングすることが可能なヘアピン配列によって分離されたセンス配列およびアンチセンス配列を含む、環状核酸ベクター。
  71. 前記ＯＲＩに隣接するリンカーおよび自己相補リンカーをさらに含む、請求項７０に記載のベクター。
  72. 前記導入遺伝子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を二本鎖に結合可能なリンカー配列によって分離されたセンス配列およびそのアンチセンス相補物を含む、請求項７０または７１に記載のベクター。
  73. 前記短縮ＯＲＩがＯＲＩΔ２９である、請求項７０～７２のいずれか１項に記載のベクター。
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