CN103764831A - 不含衣壳的aav载体、组合物以及制备载体和基因递送的方法 - Google Patents

Abstract

一种分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、感兴趣的核苷酸和第二AAV ITR，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列。所述核酸分子可以重复应用于宿主而不引发免疫应答。还提供制备和纯化这种核酸分子的方法以及这种核酸分子用于治疗目的的用途。

Description

不含衣壳的AAV载体、组合物以及制备载体和基因递送的方法

技术领域

本发明涉及将外源的，特别是异源的DNA序列递送至靶标，特别是靶细胞、组织、器官或生物体的方法。具体地，本发明涉及用于将异源DNA序列递送至靶标的新的没有病毒衣壳蛋白的裸腺伴随病毒(AAV)载体(此后“AAV0”)。本发明的重组AAV0载体可以用于将外源DNA序列体外、离体或体内递送至靶标。本发明还提供制备和纯化AAV0载体的方法。

背景技术

基因治疗的目的是纠正有缺陷的基因，所述有缺陷的基因构成疾病发展的基础。解决这个问题的常见方法包括将正常基因递送至细胞核。这个基因然后可以插入靶细胞的基因组，或者可以保持游离。将矫正基因递送至对象的靶细胞可以通过许多方法进行，包括使用病毒载体。在许多可用的病毒载体中(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等)，腺伴随病毒(AAV)作为多功能载体在基因治疗中越来越受欢迎。

腺伴随病毒(AAV)是细小病毒家族的成员。AAV基因组由线性单链DNA分子组成，其包含约4.7千碱基(kb)，并且由编码非结构性Rep(复制)和结构性Cap(衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框组成。AAV编码区的侧翼是两个起顺式作用的核苷酸反向末端重复(ITR)序列，长度为约145个核苷酸，具有可以折叠为发夹结构的中断的回文序列，在DNA复制起始期间作为引物发挥功能。除了它们在DNA复制中的作用，据证实ITR序列是病毒整合、从宿主基因组拯救以及病毒核酸衣壳化为成熟病毒粒子所必需的(Muzyczka,(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.158:97-129)。

来源于AAV的载体对于递送遗传物质特别有吸引力，这是因为：(i)它们能够感染(转导)各种非分裂和分裂细胞类型，包括肌肉纤维和神经元；(ii)它们没有病毒结构基因，从而消除了对病毒感染的天然宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒从未与人的任何病理关联；(iv)与能够整合入宿主细胞基因组的野生型AAV相比，复制缺陷的AAV载体一般保持游离，因此限制插入诱变或激活癌基因的风险；以及(v)与其他载体系统相比，AAV载体不触发显著的免疫应答(见ii)，因此允许治疗性转基因的长期表达(只要它们的基因产物未被排斥)。还可以以高滴度制备AAV载体，并且至少在啮齿动物中，动脉内、静脉内或腹腔内注射允许基因通过单次注射转移至显著的肌肉区域(Goyenvalle et al.,2004;Fougerousse etal.,2007;Koppanati et al.,2010;Wang et al.,2009)。关于递送遗传物质，与质粒DNA相比，AAV载体还具有多个优势。例如，从质粒表达异源基因是短期的，质粒通常具有较大的大小，并且质粒需要物理操作以递送入细胞(例如，显微注射、转染、电穿孔)。此外，基因如肌养蛋白的质粒转移引发宿主的免疫应答并且与低效率相关(Romero et al.,2004)。

但是，使用常规AAV作为基因递送载体也有许多缺点。首先，这种治疗的大部分潜在接受者已经对给定类型的AAV载体是血清反应阳性的(Boutin et al.,2010)。第二，在一些对象中，AAV载体可以引发温和的宿主免疫应答，这可能是由病毒衣壳或加工杂质引发的。在这种情况下，使用免疫抑制剂控制免疫应答仅为临时措施，因为一旦对象脱离这些免疫抑制剂，免疫应答复发(Lorain et al.,2008)。可能与AAV相关的主要缺点是其有限的病毒包装能力，仅为约4.5kb异源DNA(Dong et al.,1996;Athanasopoulos et al.,2004;Lai et al.,2010)。

使用双载体策略的不同方法试图扩大AAV载体包装能力，例如设计为向靶细胞递送大治疗基因的反式剪接(ts)和重叠(ov)AAV载体系统。例如，Lostal等人通过在外显子28/29连接处分拆dysferlin cDNA并将其克隆入两个独立的携带适当剪接序列的AAV载体来绕过关于dysferlin cDNA的大小限制，所述限制使得dysferlin cDNA不可以直接整合入AAV载体用于基因转移至肌肉。然而，即使这些方法仍有固有的效率低下。因此，小的包装能力仍是AAV基因治疗中的主要限制。尚未考虑去除衣壳(通过这种方式可以克服包装能力)，因为据认为衣壳对于允许载体进入细胞是必要的。

另一显著的缺点是AAV介导的基因表达相对较慢，因为在异源基因表达之前单链AAV DNA必须转化为双链DNA。虽然已尝试通过构建双链DNA载体来规避这个问题，但是这种策略进一步限制可以整合入AAV载体的转基因表达盒的大小(McCarty,2008;Varenika et al.,2009;Foust et al.,2009)。此外，在生长器官中，高效的AAV介导的基因治疗可能由于分裂细胞中的游离DNA稀释而丧失其效果(Cunningham et al.,2009)。

本发明通过提供用于向细胞、组织、器官或对象体外、离体或体内递送外源DNA的重组AAV0(“rAAV0”)载体来解决与AAV载体相关的一些或全部上述缺点。

发明概述

本发明是基于这样的发现，可以将外源DNA整合入没有衣壳的AAV基因组(或载体)(即，AAV0)并递送入靶细胞、组织、器官或对象，以高效表达感兴趣的蛋白或核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)而无需病毒衣壳介导的吸收过程。在本发明之前，据认为衣壳对于病毒载体高效吸收入细胞是必需的，并且不愿意免去它。事实上，纯化AAV载体的方法主要基于针对衣壳的抗体，这会抛弃未衣壳化的DNA，或者基于使用DNAase，DNAase会降解任何未衣壳化的DNA。

将本发明的rAAV0载体与基于质粒的表达载体区分开的结构特征包括在rAAV0载体中缺少原始(即未插入)细菌DNA，rAAV0载体缺少原核复制起点，rAAV0载体是自足(self-containg)的(即它们不需要除两个ITR以外的任何序列)，包括Rep结合位点和末端分辨位点(terminal resolution site)(RBS和TRS)，以及在ITR之间的外源序列，存在形成发夹的ITR序列，事实上rAAV0具有真核起点(即，它们在真核细胞中制备)，并且不存在细菌类型的DNA甲基化或哺乳动物宿主认为异常的任何其他甲基化。一般来说，本发明的载体优选不含任何原核DNA，但是考虑一些原核DNA可以作为外源序列插入。将rAAV0载体与质粒表达载体区分开的另一重要特征是rAAV0载体由单链或双链线性DNA组成，而质粒通常是双链DNA。

本发明的rAAV0载体与基于质粒的表达载体相比的一些优势包括但不限于：1)质粒包含细菌DNA序列并进行原核特异性甲基化，即嘌呤碱甲基化，而rAAV0载体序列具有真核起点；2)质粒在制备过程中需要存在抗性基因，但是rAAV0载体不需要；3)环状质粒在引入细胞时未被递送至细胞核并需要过量装载以绕过细胞核酸酶的降解，但是rAAV0载体包含赋予对核酸酶的抗性的病毒顺式元件，即ITR，并且可以设计为靶向并递送至细胞核。假设ITR功能的不可缺少的最小限定元件为Rep-结合位点(RBS；对于AAV2为5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’)和末端分辨位点(TRS；对于AAV2为5’-AGTTGG-3’)加上允许形成发夹的可变回文序列。

rAAV0载体与常规AAV载体相比的优势包括但不限于：1)常规AAV载体具有引起宿主免疫应答的衣壳，而无衣壳的rAAV0载体不会触发这样的应答；2)常规AAV载体具有有限的载物能力(约4.5kb)，而rAAV0载体不受这个限制，即它们可以整合入非常短的序列到比野生型AAV基因组的载物能力长超过10%的序列，即约5k碱基直至8、10或甚至15kb；3)常规AAV载体的制备是不均质的(即，包含完整AAV载体和空衣壳的混合物)，而rAAV0载体在本质上基本是均质的；以及4)常规AAV载体的组合物甚至在纯化之后仍是异质的，而rAAV0载体可以完全利用标准DNA分析技术来表征，允许获得均质且完全表征的终产物。此外，考虑到rAAV0载体缺少免疫原性，可以将不同rAAV0载体的混合物通过相同或不同途径向细胞、器官或对象共给药。

通常，本发明提供rAAV0载体以及它们在例如细胞、器官、组织和对象中表达蛋白或RNA或DNA中的用途。这样的表达并不限于一种蛋白或RNA分子，而是可以包括通过递送入宿主的多种不同rAAV0载体表达多种蛋白和/或RNA。这样的转导可以是瞬时的或永久的。例如，可以将编码旨在引发宿主基因组的永久性修饰或修正(例如，通过大范围核酸酶或锌指核酸酶)的产物的rAAV0载体瞬时转导入宿主。在其他方面，rAAV0载体可以递送可以影响基因编辑如外显子跳跃(skipping)的编码或非编码DNA。本发明的rAAV0载体还可以用于疫苗接种，这通过肌肉内注射来递送编码蛋白或者蛋白/DNA混合物的rAAV0载体，然后进行第二次注射，优选肌肉内注射，两次注射带来不被宿主(本身)的免疫系统全部识别的相同抗原(蛋白)的表达。本发明的rAAV0载体用于转基因递送入胚胎干细胞(ESC)或卵细胞以产生遗传敲除或敲入的动物模型。本发明的rAAV0载体还可以用于通过在新生儿期应用来诱导对基因产物的免疫耐受，以便为随后的替代疗法如酶疗法的免疫耐受铺平道路(Sun,B,et al Am.J.Hum.Genet.2007;81:1042–1049)。例如，Balb/c小鼠对GFP敏感且引发细胞和体液免疫应答。通过在出生时向它们注射少量携带GFP基因的rAAV0，可以诱导耐受，从而随后注射较大量的rAAV0或其他GFP携带载体不会引发显著的免疫应答。

在一方面，本发明提供分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、感兴趣的核苷酸序列(例如外源DNA的表达盒)和第二AAV ITR，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列。在另一实施方案中，本发明的核酸分子没有病毒衣壳蛋白编码序列(即其没有AAV衣壳基因，也没有其他病毒的衣壳基因)。此外，在一具体实施方案中，所述核酸分子也没有AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一优选实施方案中，本发明的核酸分子没有功能性AAV帽和AAV rep基因。

因此，本发明提供最小rAAV0载体，其具有两个AAV反向末端重复(ITR)和感兴趣的核苷酸序列(例如表达盒)，每个所述ITR均具有中断(或不连续)的回文序列，即，由3个片段组成的序列：在5’→3’阅读时相同但在相对放在一起时杂交的第一片段和最后一个片段，以及分隔所述相同的片段的一个不同片段。这样的序列，尤其是ITR形成发夹结构。感兴趣的核苷酸序列具体地可以是包含可操作地连接至外源DNA序列的至少一个启动子的表达盒，并且每一端的侧翼均有一个ITR。rAAV0载体不编码衣壳蛋白，并且rAAV0载体没有衣壳化。rAAV0载体可以是单链、双链或一端或两端通过ITR回文序列共价连接的双链体。在一优选实施方案中，rAAV0载体是单链的。

在一实施方案中，外源DNA序列编码治疗性蛋白，例如肌养蛋白；LARGE(Barresi et al.,2004)；dysferlin；钙激活中性蛋白酶3；Dux4；LAMA2；α-、β-、γ-和δ-肌聚糖(sarcoglycan)；FKRP、fukutin、WASP、因子VIII、因子IX、SMN1、U7、修饰的U7(美国临时申请61/314,830和WO2006/021724，两者均整体援引加入本文)、U1、RdCVF(Léveillard et al.,2010)、α-葡糖苷酶、大范围核酸酶或锌指核酸酶、以及肌动蛋白。但是，原则上认为编码蛋白或多肽的任何基因均在本发明的范围内，所述蛋白或多肽由于突变而减少或不存在，或者在过量表达时带来治疗益处。在其他实施方案中，外源DNA序列编码反义寡核苷酸(“AON”)或RNA(编码或非编码)如siRNA、shRNA、micro-RNA，以及它们的反义对应物(例如，antagoMiR)。在这类情况下，可以将在表达时引起有害表型的突变基因沉默以提供治疗益处。在另一实施方案中，rAAV0载体包含模板核苷酸序列，其在大范围核酸酶-或锌指核酸酶提供的双链断裂之后用作待插入的正确DNA链。

本发明的rAAV0载体可以包含期望的来自病毒外来源的其他引入序列。例如，可以引入所谓的自杀基因以消除转导的细胞。但是，不存在非插入的细菌DNA，并且优选完全不存在细菌DNA。

本发明的rAAV0载体还可以用于将感兴趣的核苷酸序列递送至靶细胞的方法。所述方法具体地可以是将感兴趣的治疗基因递送至有需要的对象的细胞的方法。本发明允许在对象的细胞中体内表达治疗性外源DNA序列编码的多肽、蛋白或寡核苷酸，从而表达治疗水平的多肽、蛋白或寡核苷酸。在rAAV0载体递送的体内和体外模式中均观察到这些结果。例如通过体内肌肉内给药将外源DNA序列递送至肌肉细胞的能力提供更有效和方便的基因转移方法。因此在一实施方案，本发明涉及将所选的基因递送入细胞、器官或组织如骨骼肌或心肌的方法。

但是，本发明并不限于仅在肌肉细胞中递送和表达所选的基因，而是还可应用于其中期望表达治疗性多肽、蛋白或寡核苷酸的其他细胞类型，例如神经细胞。因此，在另一实施方案中，本发明涉及rAAV0载体介导的通过体内颅内或鞘内给药将期望的外源DNA序列递送至神经细胞。

关于递送方法，不应当认为本发明受到限制。例如，递送可以是局部的、组织内的(例如，肌肉内的、心内的、肝内的、肾内的、大脑内的)、结膜的(例如，眶外的、眶内的、眶后的、视网膜内的、视网膜下的)、粘膜的(例如，口服的、直肠的、鼻的、肺部的)、鞘内的、膀胱内的、颅内的、全身性的、腹腔内的、皮下的、皮肤的、血管内的(例如静脉内的、动脉内的)以及淋巴内的。在其他方面，还考虑通过高压血管内输液(例如静脉内或动脉内输液)和细胞内注射(例如细胞核内显微注射或胞浆内注射)的被动组织转导。

此外，递送并不限于一种rAAV0载体。因此，在另一方面，可以将包含不同外源DNA序列的多种rAAV0载体同时或顺序递送至靶细胞、组织、器官或对象。因此，这种策略可以允许表达多种基因。递送还可以多次进行，并且在临床情况下对于基因治疗重要的是可以以随后增加或减少的剂量进行，这是因为由于不存在病毒衣壳而缺少抗衣壳的宿主免疫应答。预期不会出现抗衣壳的应答，因为没有衣壳。如果期望，这可以通过实施例5的沿线多次注射(图7)以及通过测量抗体应答或者特异性T细胞激活或增殖来证实。此外，预期如果通过单链rAAV0递送，甚至针对转基因的蛋白产物的免疫原性会减少，因为单链AAV载体与双链AAV载体相比，比较不能引发很强的先天免疫应答(Wu et al,2011)。

在另一方面，本发明提供一种制备无衣壳的rAAV0载体的方法，尤其是具有足够高产率的方法以提供足够的载体用于体内实验。所述方法包括提供细胞，所述细胞包含两个AAV ITR、位于所述ITR之间的感兴趣的核苷酸(例如除了递送纯DNA模板，通常包含可操作地连接至外源DNA的至少一个启动子的表达盒)。感兴趣的核苷酸的每一端的侧翼有一个ITR且不编码AAV衣壳蛋白，并且细胞不表达AAV衣壳蛋白。细胞已包含Rep，或者用载体转导以包含Rep，然后在允许包含ITR和表达盒的DNA复制和释放并组成rAAV0载体的条件下生长。然后作为游离释放的rAAV0载体或者作为外来体(exosome)或微粒，收集并从细胞或上清纯化rAAV0载体。

在另一方面，本发明提供已经将rAAV0基因组稳定整合入它们自己的基因组的宿主细胞系。在一实施方案中，所述宿主细胞系为无脊椎动物细胞系，优选昆虫Sf9细胞。在另一实施方案中，所述宿主细胞系为哺乳动物细胞系，优选293细胞。虽然使用质粒转染将用于扩增的AAV0骨架引入生产细胞并不适合体内应用于哺乳动物(例如，人)，但是在Sf9细胞的情况下，可以设想使用第二载体如疱疹病毒来将Rep蛋白引入细胞，允许rAAV0的切除和扩增。在另一方面，可以将Rep编码基因稳定地整合入宿主细胞系(例如，Sf9细胞)。引入Rep基因的方法是多样的：例如，质粒转染、感染表达Rep的载体、表达Rep的稳定细胞系。在另一实施方案中，哺乳动物宿主细胞分离自患有疾病的对象。自体宿主细胞优选分离自这样的组织，其直接受疾病影响并且不能表达正常水平的基因产物，表达突变且没有功能或功能不良的基因产物，或者异常地过量表达导致疾病的基因产物。

在一方面，宿主细胞为干细胞。因此，rAAV0转导可以导致例如给定干细胞群体的瞬时转导，其中转移的游离基因或非编码RNA在随后的细胞世代中被稀释。或者，rAAV0介导的工程化大范围核酸酶的转移可以导致干细胞中的持续遗传修饰(Silva et al.,2011)。在这种情况下，虽然大范围核酸酶本身会随着随后的细胞分裂被稀释，但是rAAV0-大范围核酸酶介导的遗传修饰会在随后的细胞分裂中以孟德尔方式被继承。这可以矫正大范围核酸酶使用的主要缺点。

在另一方面，本发明提供从rAAV0基因组稳定整合入它们自己的基因组的宿主细胞系纯化rAAV0载体的方法。值得注意的是，质粒骨架并不适合rAAV0制备，这是因为其原核来源，具有明显的免疫原性风险。rAAV0制备进行两个步骤：第一，通过Rep蛋白从载体骨架切除(“拯救”)，第二，通过Rep蛋白扩增切除的载体基因组。仅转染包含AAV0的质粒会主要导致拯救的rAAV0，没有或很少扩增。这突出了携带AAV0载体的质粒的另一缺点：很少或没有扩增。在一实施方案中，将rAAV0载体纯化为DNA分子。在另一实施方案中，将rAAV0载体纯化为外来体或微粒。

本发明还提供一种治疗对象的疾病的方法，所述方法包括向所述对象的有需要的靶细胞(特别是肌肉细胞或组织)引入治疗有效量的rAAV0载体，任选使用药学可接受的载体(carrier)。虽然可以在载体(carrier)的存在下引入rAAV0载体，但是这样的载体(carrier)不是必需的。使用的rAAV0载体包含可用于治疗疾病的感兴趣的核苷酸序列。具体地，rAAV0载体可以包含可操作地连接至控制元件的期望的外源DNA序列，所述控制元件能够在引入对象时指导外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白或寡核苷酸的转录。rAAV0载体可以通过上文以及本文其他地方提供的任何合适的途径给药。在一优选实施方案中，所述疾病为杜兴肌营养不良(DMD)，并且转基因为肌养蛋白或编码优化的U7的rAAV0，所述优化的U7包含允许mdx小鼠模型中外显子23跳跃的适当的反义序列(参见Goyenvalle et al.,2004)。这种rAAV0-U7载体可以例如通过注射部位近端的绞扼止血器造成的平行的静脉血流淤塞下的股动脉的动脉内注射来给药。向转导的肌肉组织给药后4周可以观察到所得的外显子跳跃和肌养蛋白恢复。

本发明还提供一种治疗对象的遗传或获得性肌肉疾病或病症(或者简单地添加基因或抑制基因)的方法，所述方法通过：(1)从患有疾病的对象的肌肉活检物建立成肌细胞培养物(Bigot et al.,2008;Benchaouir et al.,2007)；(2)将rAAV0载体递送至成肌细胞或肌肉组织，所述载体包含可操作地连接至控制元件的期望的外源DNA序列，所述控制元件能够指导外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白或寡核苷酸的转录；(3)从培养物收集包含具有外源DNA序列的载体的外来体或微粒，或者收集DNA形式的rAAV0载体；以及(4)将收集的装有rAAV0的外来体或微粒或者DNA形式的rAAV0载体递送入所述对象。外来体或微粒可以具有特定的向性(例如，肌肉细胞特异性的)，从而具有转导相邻细胞的能力。

在另一实施方案中，可以离体转导分离自患者的干细胞以纠正宿主中基因产物的突变所引起的缺陷，或者利用rAAV0编码的DNA切割酶如锌指核酸酶纠正遗传缺陷(Connelly et al.,2010)。在另一实施方案中，所述DNA切割酶为大范围核酸酶(Silva et al.,2011)。在另一实施方案中，所述DNA切割酶为TAL效应核酸酶(Silva et al.,2012)。

对于遗传和获得性病症的潜在的细胞和基因治疗，干细胞如间充质干细胞、造血干细胞和iPS细胞是用rAAV0载体离体修饰的有吸引力的靶标。使得这些细胞类型对于治疗很理想的某些优点包括它们分化为多种谱系的能力，它们增殖和自我更新、迁移至损伤部位的能力，以及在离体转导时它们是低免疫原性的(hypoimmunogenic)，允许在纠正潜在缺陷时移植回宿主(Li et al.,2009;Benchaouir et al.,2007)。重要的是，虽然许多干细胞类型用包括AAV(Id.)在内的病毒载体转导效率低，但是rAAV0载体可以绕过这个缺点，这是由于对于细胞进入，它们不依赖于病毒衣壳，特别是在与微粒或外来体介导的递送组合时。参见High-Efficiency Transduction ofFibroblasts and Mesenchymal Stem Cells by Tyrosine-Mutant AAV2Vectors forTheir Potential Use in Cellular Therapy.Li M,Jayandharan GR,Li B,Ling C,Ma W,Srivastava A,Zhong L.,Hum Gene Ther.2010;21:1527-1543.

可以用rAAV0治疗的其他疾病包括但不限于DMD、脊髓型肌萎缩、庞帕病、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、ALS、癫痫、中风、囊性纤维化和实体瘤。在一优选实施方案中，所述疾病为DMD。特别有趣的应用是在癌症治疗中使用AAV0，这是因为重复治疗直至肿瘤减小或消除的能力，预期用本发明的rAAV0载体没有免疫应答。

本公开的这些和其他实施方案、特征和优点从下文所示的详细描述和所附的权利要求书会变得显而易见。

附图说明

图1为常规AAV(包含衣壳)与rAAV0的原理比较。常规AAV载体(上部)具有两个组分，衣壳和基因组，而rAAV0载体(底部)是无衣壳的。

图2为rAAV0载体合成和下游应用的方案。图2a示出5L生物反应器(B.Braun Medical Inc.)，其可以用来扩增Sf9细胞中的AAV0；以及Akta纯化器100(B.Braun Medical Inc.)，其可以用于下游AAV0纯化过程。图2b为详述使用Sf9细胞系统的AAV0扩增过程和下游纯化过程的示意图。

图3a为AAV0-GFP质粒的示意图，其基于pFBGR质粒并用来在宿主细胞中制备AAV0。来自AAV2的ITR位于GFP表达盒两端的侧面。按照转录的方向，GFP表达盒包含巨细胞病毒(CMV)启动子、p10启动子、编码GFP的DNA序列和转录终止序列。

在包括两个ITR和其间所夹的区域之外是杀稻瘟素S抗性基因，其可操作地连接至黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)立即早期-1(Op IE-1)启动子。

图3b为AAV基因组扩增的一般过程的示意图。在Rep存在下，从宿主基因组去除AAV基因组并扩增(Berns et al.,2007;Nash et al.,2007)。

图4是未消化的rAAV0载体或用SnaBI酶消化的rAAV0载体的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶上的条带反映在制备过程结束时DNA回收后rAAV0的各种构象(在右边的示意图中示出)。琼脂糖凝胶的第一泳道中的条带为DNA大小标记。标记“Ctrl”的第二泳道是来自未消化的rAAV0的DNA。指出对应于rAAV0串联体的条带。字母“A”和“A’”显示右边示意图所示的DNA产物。绝大多数rAAV0为单体形式(双链或转化的～2.5kb)。标记“SnaBI”的第三泳道中的条带是来自用SnaBI酶消化的rAAV0的DNA。字母“B”和“C”显示右边示意图所示的DNA产物。SnaBI消化释放包含ITR的380bp片段(条带“C”)。

图5a是使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂用rAAV0-GFP载体转染的293细胞的荧光显微图。将1x10⁶个细胞用5μg(左图)和9μg(右图)的rAAV0-GFP转染48小时。图5b是通过使用Xenoworks显微注射系统(SutterInstruments)用AAV0-GFP载体的溶液(0.02mg/ml)显微注射入细胞核(上图)或细胞质(下图)的C2C12成肌细胞的荧光显微图。还将四甲基罗丹明70,000MW赖氨酸-可固定的葡聚糖(Sigma)共同显微注射作为显微注射的区域标记。显微注射后2天，将肌管用多聚甲醛3.7%(Sigma)固定并在进一步的荧光染色之前用0.5%triton透化。左图示出DAPI(Sigma)染色的细胞核。中间的图示出GFP荧光。右图示出葡聚糖染色，允许确认显微注射部位(细胞核比细胞质)。利用装有CoolSNAP HQ2照相机(Roper Scientific)的NikonTi显微镜，使用40x1.0NA PL APO油浸物镜，通过(Molecular Devices)驱动获得荧光图像。

图6a是用AAV0-GFP(1ml的PBS中的100μg的AAV0-GFP)动脉内注射的小鼠腿的方案。图6b是已注射的小鼠腿(两个左图)和尚未注射的小鼠腿(两个右图)的荧光显微图；其显示没有动脉内注射AAV0-GFP，则GFP信号不可见(右图)。左图显示动脉内注射AAV0-GFP两周后导致腿中GFP的高效表达。图6c示出动脉内注射腿之后肌肉组织的冷冻切片中的GFP表达(横向(左图)和纵向(右图)10μm肌肉切片)。将细胞核用DAPI复染(蓝色)。

图7是以1周的间隔进行两次动脉内注射后小鼠腿的荧光显微图。如上图的方案所示，在左腿中进行第一次注射(1ml的PBS中的100μg的AAV0-GFP)，而在右腿中进行第二次注射(1ml的PBS中的100μg的AAV0-GFP)。分析之前允许小鼠在第二次注射后恢复8周。下图中的荧光显微图显示两条腿均等效转导，表明第一次注射对第二次注射没有负面影响。

图8是未消化的rAAV0载体(在CMV启动子下编码GFP)的琼脂糖凝胶(1%)(中间泳道300ng，而右边泳道1,5μg)。琼脂糖凝胶上的条带(2.6k碱基)反映在制备过程结束时DNA回收后rAAV0的线性单体单链结构。琼脂糖凝胶的左边泳道中的条带为DNA大小标记。

图9是在SSB(单链结合蛋白)存在下的AAVo的电子显微镜显微图。AAVo表现为线性结构，通过SSB方式显示为单链。

图10为4-12%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其显示通过商业DNA纯化装置(Qiagen Plasmid Plus Maxi试剂盒，Qiagen AAVo)或我们的色谱系统(纯化的AAVo)纯化后的AAVo样品中的蛋白含量。将不同量的编码GFP或U7的AAVo上样至4-12%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶并通过电泳分离。通过银染显示蛋白。注意到通过使用我们的色谱方法纯化后不能检测到蛋白污染。

发明详述

本发明提供分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、外源DNA的表达盒和第二AAV ITR，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列。本发明的核酸分子是没有衣壳蛋白的rAAV载体(rAAV0)，并且可以用于体外、离体或体内递送期望的外源DNA序列。

无论上文或下文，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均整体援引加入本文。

除非另有说明，本发明的实施会采用本领域技术内的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这类技术在文献中充分解释。参见，例如，Sambrook,et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Current Edition);DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,Current Edition);Nucleic AcidHybridization(B.Hames & S.Higgins,eds.,Current Edition);Transcriptionand Translation(B.Hames & S.Higgins,eds.,Current Edition);CRCHandbook of Parvoviruses,vol.I & II(P.Tijssen,ed.);Fundamental Virology,2nd Edition,vol.I&II(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)

下文详述本发明的各种组合物和方法。虽然本文举例了具体组合物和方法，但是应当理解许多可选的组合物和方法中的任一种均可应用并适合用于实施本发明。

定义

除非另有说明，本文所用的所有术语均具有本领域技术人员理解的相同含义，并且本发明的实施会采用微生物学和重组DNA技术的常规技术，这在本领域技术人员的知识之内。

如本文所用，术语“AAV0”指无衣壳的AAV载体构建体，其包含ITR和任何期望的载荷，例如外源基因或其他多核苷酸和启动子，但是没有衣壳。在一优选实施方案中，无衣壳的AAV载体构建体不含编码AAV Rep蛋白的序列。因此，如本文所用，术语“AAV0载体”或“重组AAV0载体(“rAAV0”)”指无衣壳的AAV构建体，作为最小组分，其包含两个ITR和待转移至宿主的外源DNA序列，所述外源DNA序列可操作地连接或未连接至控制元件。不要求所有ITR均源自一种类型的AAV。术语“AAV0载体”、“rAAV0载体”和“本发明的核酸分子”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“AAV0-质粒”指编码rAAV0载体的环状双链DNA，其能够在细菌细胞中扩增(即，具有允许已用该质粒转化的细菌生长的选择标记)，为了产生rAAV0载体本身的目的将其引入宿主细胞，其为线性单链或最终双链DNA。

如本文所用，术语“反向末端重复”或“ITR”指因为它们的对称性这样命名的AAV病毒顺式元件。这些元件对于AAV基因组的高效扩增非常重要。假设ITR功能的不可缺少的最小限定元件为Rep-结合位点(RBS；对于AAV2为5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’)和末端分辨位点(TRS；对于AAV2为5’-AGTTGG-3’)加上允许形成发夹的可变回文序列。根据本发明，ITR包含至少这3个元件(RBS、TRS和允许形成发夹的序列)。此外，在本发明中，术语“ITR”指已知的天然AAV血清型的ITR(例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11AAV的ITR)、通过融合来源于不同血清型的ITR元件形成的嵌合ITR以及它们的功能变体。ITR的功能变体指这样的序列，其表现出与已知的ITR的至少80%、85%、90%，优选至少95%序列相同性，允许在Rep蛋白的存在下扩增包含所述ITR的序列，并且允许转导细胞而不需要转染辅助(如实施例所示)。

如本文所用，术语“给药”、“引入”或“递送”指将用于重组蛋白或核苷酸表达的本发明的质粒或载体递送至细胞或者递送至对象的细胞和/或组织和/或器官。这样的给药、引入或递送可以在体内、体外或离体进行。可以通过以下方式将用于重组蛋白或多肽表达的质粒引入细胞：转染，这通常表示通过化学方法将异源DNA插入细胞(例如，磷酸钙转染、聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体转染)；物理方法(电穿孔或显微注射)；感染，这通常指通过感染性物质，即病毒(例如，表达AAV Rep基因的杆状病毒)引入；或者转导，这在微生物学中指用病毒稳定感染细胞，或者通过病毒性物质(例如，噬菌体)将遗传物质从一种微生物转移至另一种微生物。用于重组多肽、蛋白或寡核苷酸表达的本发明的载体可以通过物理方式递送(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂质体转染)，或者通过与药学可接受的载体(carrier)一起制备本发明的载体用于体外、离体或体内递送至细胞、组织、器官或对象。此外，本发明的AAV0载体可以在没有物理方式或载体(carrier)的辅助下进入细胞。

术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”通常分别指一般较小的具有4-约100碱基的核酸片段或一般更大的(例如，超过100个碱基且长达30千碱基)核酸分子以及与信使RNA(mRNA)或miRNA片段或分子的序列互补(反义)或相同(正义)的序列。但是，在本说明书中，所述术语可互换使用。寡核苷酸还可以指转录或非转录的DNA或RNA分子。

如本文所用，术语“中枢神经系统”或“CNS”指该术语在本领域中公认的用法。CNS涉及脑、视神经、颅神经和脊髓。CNS还包含填充脑室和脊髓中央管的脑脊液。脑的区域包括但不限于纹状体、海马、皮质、基底核、底丘脑核(STN)、脚桥核(PPN)、黑质(SN)、丘脑、壳或脑的尾状区域以及小脑、脊髓或者它们的组合。

如本文所用，术语“多连体化(concatamerize)”或“多连体化(concatemerize)”指通过连接重复序列形成多核苷酸分子。

如本文所用，术语“控制元件”指在递送入对象的细胞、组织和/或器官时能够指导或调控外源DNA序列的转录的DNA序列。

如本文所用，术语“转化的双链形式”指在宿主中使用的最终rAAV0形式。

如本文所用，术语“外源DNA序列”指不来源于其所处的宿主的核酸分子。其可以与宿主的DNA相同或者是异源的。实例为插入载体的感兴趣的序列。这类外源DNA序列可以源自各种来源，包括DNA、cDNA、合成DNA和RNA。这类外源DNA序列可以包含基因组DNA，所述基因组DNA可以或可以不包括天然存在或人工的内含子。此外，这样的基因组DNA可以与启动子区域或poly A信号序列联合获得。本发明中的外源DNA序列可以是cDNA。外源DNA序列包括但不限于任何DNA序列，其表达产生有待在宿主细胞中表达的基因产物。所述基因产物可以影响宿主细胞的生理。外源DNA序列还涵盖编码反义寡核苷酸的DNA序列。

如本文所用，术语“外来体(exosome)”指由一种或多种细胞膜蛋白产生囊泡。囊泡通常在细胞的内吞-溶酶体系统中产生，然后被细胞排出、分泌或“脱落”。如本文所用，术语“微粒(miroparticle)”指携带特异性蛋白和RNA载荷的膜包裹的细胞片段(参见EP申请10306226.1)。

如本文所用，术语“表达盒”指可操作地连接至启动子或足以指导转基因的转录的其他调控序列的外源DNA序列。合适的启动子包括例如组织特异性启动子。启动子还可以是AAV来源的。

如本文所用，术语“基因递送”或“基因转移”指将外源核酸序列如DNA可靠地插入宿主细胞的方法或系统。这类方法可以导致非整合转移的DNA的瞬时表达、转移的复制子(例如，附加体)的染色体外复制和表达、或者将转移的遗传物质整合入宿主细胞的基因组DNA。基因转移为获得性或遗传性疾病的治疗提供了独特的方法。

如本文所用，术语“遗传性肌肉病症”是指但不限于神经肌肉或肌肉骨骼疾病或病症，包括但不限于显性突变、隐性突变、X-连锁的核DNA突变或线粒体DNA突变引起的神经肌肉疾病；还包括大范围染色质缺失，其可以或可以不包含基因但影响基因编辑。实例包括显性或隐性肢带型肌营养不良、Duchenne和Becker MD、强直性肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良等。

如本文所用，术语“宿主细胞”指例如可以或已经用作rAAV载体的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已转导的原始细胞的子代。因此，如本文所用，术语“宿主细胞”一般指已用外源DNA序列转导的细胞。应当理解由于天然的、偶然或人为的突变，单个亲代细胞的子代可以不必在形态学上完全相同，或者在基因组或总DNA中与原始的亲代互补。

如本文所用，术语“神经细胞”指分离自脑、脊髓的细胞，或者来自中枢神经系统的任何区域的细胞，以及存在于对象的脑、脊髓或中枢神经系统中的任何细胞。神经细胞的实例包括神经元细胞，例如将神经或化学信号传输至脑或者从脑传输神经或化学信号的神经细胞(nerve cell)，如从身体的感觉感受器(眼、耳等)携带信号至CNS的感觉神经元或双极神经元；从肌肉和腺体携带信号至CNS的运动神经元或多极神经元(例如，脊髓运动神经元、椎体神经元、浦肯野细胞)；在CNS内形成神经布线(neural wiring)的中间神经元或假极性细胞。这些具有两个轴突(而不是一个轴突和一个树突)。术语神经细胞还意图包括组成90%的脑细胞的神经胶质细胞。神经胶质细胞是不携带神经冲动的神经细胞。神经胶质细胞的类型包括但不限于施万细胞、卫星细胞、小胶质细胞、少突神经胶质和星形胶质。

如本文所用，术语“神经变性病症”或“神经学病症”指引起神经细胞或神经细胞群体的形态学和/或功能异常的病症。神经变性病症可以导致对象中正常神经功能的障碍或不存在或者存在异常的神经功能。例如，神经变性病症可以是疾病、损伤和/或老化的结果。形态学和功能异常的非限制性实例包括神经细胞的物理恶化和/或死亡、神经细胞的异常生长模式、神经细胞之间的物理连接的异常、神经细胞过少或过多产生物质或多种物质如神经递质、神经细胞不能产生其正常产生的物质或多种物质、以异常模式或在异常时间产生物质如神经递质和/或传送电冲动。神经变性可以在对象的脑的任何区域发生，并且在许多病症中观察到，所述病症包括例如头部创伤、中风、ALS、多发性硬化、亨廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病。

如本文所用，术语“可操作地连接”对于rAAV0载体表示rAAV0载体的核苷酸组分互相在功能上相关用于所选的编码序列的有效控制。一般来说，“可操作地连接”的核酸序列是连续的，并且在分泌型前导的情况下，是连续和符合阅读框的。但是，增强子不必是连续的。

如本文所用，术语“包装”在rAAV0的上下文中表示包括基因组或其他编码序列加上控制元件(启动子)，或者两个ITR元件之间的正义或反义寡核苷酸。在大多数情况下，载体会具有控制元件，例如以便驱动U7或RNAi或shRNA的转录。但是，在其他情况下，rAAV0载体可以用来递送不必转录的DNA，因此缺少控制元件(例如，用于锌指或TAL核酸外切酶或者大范围核酸酶介导的基因修复的纠正基质)。

如本文所用，术语“药学可接受的”指在向人给药时，生理上可耐受并且通常不产生毒性或者过敏或相似的不良反应如胃部不适、头晕等的分子实体和组合物。优选地，如本文所用，术语“药学可接受的”表示联邦或州政府的监管机构批准或者美国药典或其他公认的药典列出可用于动物，更特别是用于人。

术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸的聚合物，并且包括全长蛋白及其片段。本领域技术人员会理解，本发明还包括编码与已知的氨基酸序列相比在氨基酸序列或其他特性中具有轻微变化的那些多肽的核酸。可以通过中性的已知参数选择氨基酸取代，并且可以通过标准方法如诱导的点突变、缺失突变、插入突变或取代突变将其引入编码的核酸序列。一般优选氨基酸序列中的细小改变，例如保守的氨基酸替代、小的内部缺失或插入以及分子末端的添加或缺失。这些修饰可以导致氨基酸序列的改变，提供沉默突变，修改限制性位点，或者提供其他特异性突变。此外，它们可以导致所编码的蛋白的有益改变。

如本文所用，术语“纯化的”指在一定条件下分离的物质，所述条件减少或消除不相关的物质即杂质(包括从中获得该物质的天然物质)的存在。例如，纯化的rAAV0载体DNA优选基本上不含细胞或培养组分，包括组织培养组分、污染物等。可以利用选择小到80μm或甚至60μm的颗粒的专门的细胞分选机纯化外来体或微粒。参见EP10306226.1。

在物质的分析测试的上下文中，操作上使用术语“基本上不含”。优选地，基本上不含杂质的纯化的物质是至少50%纯的；更优选地，至少90%纯，并且更优选地，至少99%纯。可以通过色谱、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定和本领域已知的其他方法评价纯度。

如本文所用，术语“重组”指利用DNA重组(克隆)方法产生并可与天然或野生型核酸、载体、多肽或蛋白区分的核酸、载体、多肽或蛋白。

如本文所用，术语“拯救”指从双链分子形式释放AAV0基因组，例如包含在质粒、异源病毒基因组(例如，杆状病毒)中，或者细胞基因组中的前病毒。通常一起考虑释放和复制过程以包含拯救。从体外测定推断出复制和释放途径的几个步骤(Ward and Berns,1991;Hong et al,1992;Hong etal.,1994)。简单地说，重组事件发生在挤压出的双链ITR之间，导致共价封闭式的复制中间体，以前称为“没有末端”的DNA(Ni et al.,1994)。AAVp5Rep蛋白(Rep78或Rep68)中的任一种均具有序列特异性DNA结合和产生切口的活性，并且作用于封闭式的底物。Rep蛋白结合至ITR的茎区并解开双链DNA以暴露单链切口位点，末端分辨位点(trs)。Rep蛋白或细胞的解旋酶活性解开ITR，从而提供5’-突出，ca.125nt，以及细胞聚合酶复合物延伸的游离的3’-OH基团。线性双分子双链分子是没有末端的中间体的任一端上的末端分辨事件的产物。双分子双链DNA现在相当于退火的AAV基因组，并且对于拯救的前病毒DNA或来源于病毒粒子的DNA，复制可以无差别地进行。

如本文所用，术语“选择标记”指引入细胞的基因，其赋予适合选择的特征，以便指示转染或者意图将外源DNA引入细胞的其他方法的成功。一般来说，可以用作检测信号的直接或间接的任何物质均考虑为本发明范围内的选择标记。实例包括但不限于荧光标记如GFP、允许通过细胞分选来选择的标记膜肽以及允许通过抗性选择的抗生素。

抗生素和代谢选择标记通常用于产生稳定的真核细胞系。例如，抗生素G418对于真核细胞是致死的，但是被原核酶新霉素磷酸转移酶失活。相似地，潮霉素对于哺乳动物细胞是有毒的，但是被潮霉素磷酸转移酶失活。已开发缺少二氢叶酸还原酶(DHFR)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。这些细胞的存活依赖于外源甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷。因此，可以通过转染顺式的期望的转基因和DHFR并在HAT选择培养来中培养来产生稳定的CHO细胞系(在Hacker and Wurn,2007中综述)。

如本文所用，术语“对象”包括但不限于人、非人灵长类如黑猩猩以及其他猿和猴物种；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语并不表示特定年龄或性别。因此，旨在涵盖成年和新生对象以及胎儿，无论雄性或雌性。

如本文所用，术语“治疗基因”指这样的基因，在表达时，其赋予该基因所在的细胞或组织或者表达该基因的哺乳动物有益效果。有益效果的实例包括减轻疾病状况或疾病的迹象或症状，预防或抑制疾病状况或疾病，或者赋予期望的特征。治疗基因包括部分或完全纠正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因。

术语“治疗有效量”指在剂量和必需的时间有效实现期望的治疗结果的量。重组载体的治疗有效量可以根据以下因素变化，例如对象的疾病状态、年龄、性别和体重，以及载体在对象中引发期望的应答的能力。治疗有效量还是其中治疗的有益效果超过任何有毒或有害的效果的量。

如本文所用，术语“组织特异性启动子”指在特定器官或组织如中枢神经系统(CNS)的细胞中可操作的启动子。CNS的启动子的非限制性实例包括但不限于神经元特异性的启动子(例如，神经丝启动子；Byrne andRuddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)和神经胶质特异性的启动子(Morii et al.(1991)Biochem.Biophys Res.Commun.175:185-191)。优选地，启动子是组织特异性的，并且在中枢神经系统之外基本上不活化，或者启动子的活性在中枢神经系统中比其他系统中高。例如，脊髓、脑干、(髓质、脑桥和中脑)、小脑、间脑(丘脑、下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮质，在皮质内，枕骨、颞、顶叶或额叶)、底丘脑核(STN)、黑质(SN)或它们的组合特异性的启动子。启动子的其他实例为鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、神经元特异性的烯醇化酶(NSE)启动子、肌酸激酶启动子、结蛋白启动子、CAG启动子(由鸡b-肌动蛋白启动子和CMV增强子组成)(J.Miyazaki,1989)、肝特异性的TBG启动子(2个拷贝的α-1微珠蛋白/尿抑胰酶素增强子和甲状腺激素结合球蛋白启动子)(Yang,1997;Bell,2011)、偶联至TetOn/TetOff盒的CAG启动子(CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子)(Lhériteau E,2010)、天然的人U7启动子(美国临时申请61/314,830和WO2006/021724，两者均整体援引加入本文)、细胞特异性的G蛋白偶联受体激酶1的启动子(Khani SC,2007)等。

肌肉细胞特异性的启动子也是已知的(Himeda et al.,2011)。非限制性实例为肌肉特异性的肌酸激酶启动子、结蛋白启动子(Li et al.,1993)、肌球蛋白轻链启动子(Cox et al.,1992)、嵌合的肌肉特异性启动子(Frauli et al.,2003)以及肌钙蛋白C启动子-增强子(心肌)。

术语“转染”在本文中用来指细胞摄入外源核酸分子。当已将外源核酸分子引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见例如Graham et al.(1973)Virology,52:456,Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork,Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,andChu et al.(1981)Gene13:197。这类技术可以用来将一个或多个外源核酸分子引入合适的宿主细胞。

如本文所用，术语“载体”指任何非质粒的遗传元件，例如病毒、rAAV0、AAV、细小病毒、病毒粒子等。

如本文所用，“离体给药”指这样的过程，其中从对象收获原代细胞或整个器官，将rAAV0载体递送入所述细胞，并且将所述细胞重新给予相同或不同对象。

在本说明书中，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应当理解为包括所列举的范围内的任何整数值，并且在适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另有说明，本文所列举的关于任何物理特征如聚合物亚基、大小或厚度的任何数量范围应当理解为包括所列举的范围内的任何整数。

术语“约”或“大约”表示在值的统计学上有意义的范围内。这样的范围可以在一个数量级内，优选在给定值或范围的50%内，更优选在20%内，更优选在10%内，并且甚至更优选在5%内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许偏差取决于研究的具体系统，并且本领域技术人员可以容易地理解。

在下面的章节中描述本发明的进一步的细节：

I.AAV质粒构建和rAAV0载体制备

病毒衣壳对AAV载体的有限包装能力有部分责任。AAV0载体缺少衣壳而绕过了这个限制，并且允许将期望的外源DNA序列，甚至大小基本上超过AAV的包装能力的外源DNA序列整合入AAV0载体并在引入靶细胞、组织、器官或对象时表达。例如，考虑利用本发明的核酸分子(或rAAV0载体)会成功地转染5、8、10或15kb大的插入物。许多AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的(NCBI:NC002077;NC001401;NC001729;NC001829;NC006152;NC006260;NC006261;Kotin and Smith,TheSpringer Index of Viruses,http://oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04)。本发明的AAV0骨架可以来源于任何AAV血清型的基因组。优选地，AAV血清型为AAV2。

到目前为止，AAV基因组本身从未作为基因治疗的载体使用或纯化。即，到目前为止，AAV病毒介导的基因转移的所有已知的实施方式包括转移AAV衣壳蛋白中包裹的AAV病毒颗粒(例如，Doenecke et al.,2010;Wanget al.,2011;Stieger et al.,2010;van der Marel S et al.,2011;Jiminez et al.,2011;White et al.,2011)。虽然Doenecke等人报道质粒AAV介导的基因表达；但是这涉及将AAV序列整合入细菌质粒。(然而，如上所述，质粒骨架并不适合rAAV0制备，这是因为其原核来源，具有明显的免疫原性风险。此外，转染包含AAV0的质粒会主要导致拯救的rAAV0，没有或很少扩增)。网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/gmap.cgi?result=map&acc=NC_002077 & organism=2397也引用AAV的各种序列，但是不包括没有衣壳的序列。这与尚未考虑无衣壳的AAV0的观点一致。

因此，本发明涉及分离的不含衣壳的AAV基因组，其包含外源DNA的表达盒但没有衣壳编码序列。这对应于分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一AAV ITR、外源DNA的表达盒和第二ITR。在本发明的具体实施方案中，本发明的核酸分子为线性的单链或双链核酸。在一优选实施方案中，本发明的核酸分子是单链的。在这一优选实施方案的第一变体中，第一ITR位于核酸分子的5'端。在这一优选实施方案的第二变体中，第二ITR位于核酸分子的3'端。在这一优选实施方案的第三变体中，第一ITR位于5'端，并且第二ITR位于核酸分子的3'端。在一具体实施方案中，分离的核酸分子骨架来源于已知AAV基因组，例如在上述数据库中找到的AAV基因组。但是，本发明的分离的线性核酸分子还可以通过遗传工程来制备，通过提供构建载体所必需的每个元件，即通过提供外源DNA表达盒两侧的两个ITR。

值得注意的是，本发明涉及载体，其为线性的核酸分子。因此，应当理解本发明不对应于AAV质粒。实际上，质粒是细菌来源的环状核酸分子。因此，在目前的情况下，根据主题的结构(具体地，线性对环状)，还根据用于制备和纯化这些不同对象的方法(见下文)，并且还鉴于它们的DNA甲基化(对于质粒是原核类型的，而对于rAAV0是真核类型的)，本发明与质粒不同。

还值得注意的是，rAAV0载体(本发明的核酸分子)与工程化入不同的病毒衣壳(如重组腺病毒的衣壳)的AAV基因组(参见例如WO96/18727)不同，因为其不含任何病毒衣壳，并且具有被直接摄入宿主细胞的能力(没有衣壳蛋白对宿主细胞表面的干扰)，以及从细胞质转运至细胞核的能力(没有衣壳蛋白的干扰)。此外，本文所述的rAAV0载体在宿主中不引发由腺病毒衣壳或实际上用来包装AAV基因组的任何其他病毒衣壳引发的免疫应答。

在一实施方案中，AAV0骨架来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11基因组。在一具体实施方案中，AAV0骨架来源于AAV2基因组。在另一具体实施方案中，AAV0骨架是遗传工程化的合成骨架，其在5'和3'端包括来源于这些AAV基因组中的一个或多个的ITR。存在于本发明的核酸分子中(即rAAV0中)的两个ITR可以相同或不同。具体地，它们可以来源于相同的AAV基因组。在一具体实施方案中，存在于本发明的核酸分子中的两个ITR相同，并且具体地可以是AAV2ITR。

利用已知的技术构建rAAV0质粒(即，用于制备rAAV0线性载体的质粒–参见上文提供的定义)以至少提供按照转录的方向可操作地连接的以下组分：5'ITR；包括启动子在内的控制元件，感兴趣的外源DNA序列；转录终止区；以及3'ITR。值得注意的是，ITR内的核苷酸序列基本上代替rep和cap编码区。虽然rep序列理想地由辅助质粒或载体编码，但是其可以可选地由rAAV0质粒本身携带。在这类情况下，rep序列优选位于ITR之间所夹的区域之外，但是也可以位于ITR之间所夹的区域之内。将期望的外源DNA序列可操作地连接至在细胞、组织、器官或对象中(即，体外、离体或体内)指导转录或表达其编码的多肽、蛋白或寡核苷酸的控制元件。这类控制元件可以包含通常与所选基因相关的控制序列。可选地，可以采用异源控制序列。可用的异源控制序列一般包括来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列的控制序列。实例包括但不限于启动子如SV40早期启动子；小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)；劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子；合成启动子；杂合启动子等。此外，来源于非病毒基因如小鼠金属硫蛋白基因的序列也可以在本文中使用。这类启动子序列可商购自例如Stratagene(San Diego,Calif.)。可选地，启动子可以是组织特异性的启动子。来自任何AAV血清型的ITR均适合用作本发明的rAAV0质粒中的5’和3’ITR，并且来自不同AAV血清型的ITR可以用于每个5’和3’ITR。许多AAV血清型的ITR序列是已知的。例如，SEQID NO:1和2是AAV2的ITR序列。SEQ ID NO:3-6分别提供AAV1、3、4和5的基因组序列。这些血清型的ITR序列在本领域是已知的。参见例如Chiorini,JA et al,1997,J.Virol.71(9):6823–6833Vol.71,No.9，其公开了AAV2、AAV3和AAV4的ITR序列。

rAAV0质粒还可以包括可选择的标记或选择标记用于建立宿主细胞rAAV0载体产生细胞系。将选择标记可操作地连接至启动子，例如，黄杉毒蛾立即早期-1启动子(Op IE-1)。在一实施方案中，可以将选择标记插入3’ITR的下游(即，3’)。在另一实施方案中，可以将选择标记插入5’ITR的上游(即，5’)。适当的选择标记包括例如赋予药物抗性的那些选择标记。选择标记可以是例如杀稻瘟素S-抗性基因、卡那霉素、遗传霉素等。在一优选实施方案中，药物选择标记为杀稻瘟素S-抗性基因。

由于没有病毒衣壳带来的包装限制，用于rAAV0质粒和载体的合适的外源DNA序列的大小不受限制。因此，在一些实施方案中，外源DNA序列可以超过5000bp，并且在其他实施方案中，外源DNA序列可以超过10000bp。换句话说，可以将超过AAV包装能力至少10%，事实上20%且15kb大的外源DNA序列容易地整合入AAV0载体。对用于本发明的外源DNA序列的性质没有具体要求。外源DNA序列包括例如编码受体对象缺陷或缺失的蛋白的基因，或者编码具有期望的生物学或治疗效果(例如，抗细菌、抗病毒或抗肿瘤功能)的蛋白的基因。在其他实施方案中，外源DNA序列编码可以发挥功能以纠正缺陷基因或转录物的表达的基因产物(例如，修饰的U7，大范围核酸酶，反式剪接盒，或者调节转录后的加工机制(例如，剪接))。外源DNA序列优选编码与给药的组织相关的蛋白。外源DNA序列还可以编码纠正的DNA链，编码多肽、正义或反义寡核苷酸或者RNA(编码或非编码的；例如siRNA、shRNA、微小RNA以及它们的反义对应物(例如，antagoMiR))。

合适的外源DNA序列包括但不限于编码多肽、蛋白或寡核苷酸的外源DNA序列，所述多肽、蛋白或寡核苷酸用于治疗内分泌、代谢、血液、肝脏、心血管、神经、肌肉骨骼、泌尿系统、肺部和免疫病症，包括这类病症如炎性疾病，自身免疫、慢性、传染性和遗传疾病，例如杜兴肌肉综合征、脊髓型肌萎缩(SMA)、AIDS、癌症(特别是实体瘤)、高胆固醇血症(hypercholestemia)、胰岛素病症如糖尿病、生长病症、各种血液病症(包括各种贫血、地中海贫血和血友病)；遗传缺陷如囊性纤维化、戈谢病、赫尔勒病、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、气肿、庞帕病、早衰、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、ALS、癫痫、中风等。

rAAV0载体编码的合适的转基因包括例如肌养蛋白；LARGE(Barresiet al.,2004)；dysferlin；钙激活中性蛋白酶3；Dux4；LAMA2；α-、β-、γ-和δ-肌聚糖；FKRP、fukutin、WASP、因子VIII、因子IX、SMN1、U7、U1、RdCVF(Léveillard et al.,2010)、α-葡糖苷酶、LAMIN A/C、ZMPSTE4和肌动蛋白。原则上认为编码蛋白或多肽的任何基因均在本发明的范围内，所述蛋白或多肽由于突变而减少或不存在，或者在过量表达时带来治疗益处。

在本发明的范围内还考虑使用U7技术以跳过框外的基因(Pietri-Rouxel等人，2010；美国临时申请61/314,830和WO2006/021724，整体援引加入本文。这样，可以调控任何基因的表达。在这上下文中，可以通过U7系统减少基因的表达，其中已知突变的版本引起疾病，但是对于生物体或器官的正常功能不是必需的(例如，SOD1、DM1)。U7系统还可以用于通过反式剪接进行基因纠正(美国临时专利申请第61/249,702号，其整体援引加入本文，以及EP2010/065142，其也适合与rAAV0载体系统一起使用。重要的是，rAAV0技术还允许基因(例如，携带显性突变的基因)的平行(即，分离)下调以及相同基因的取代(以恢复其生理特性)。通过这种方式，一rAAV0载体用来关闭基因，而另一rAAV0载体用来引入正常拷贝的相同基因，减少或消除一个对另一个的干扰并允许两种干预的独立剂量给药。这样的方法可以使用例如读框外外显子跳跃用于基因沉默(Id.)，使用编码外显子跳跃诱导AON的一rAAV0载体并用第二rAAV0载体引入正常的基因拷贝，其中密码子优化使得正常基因拷贝对引入外显子跳跃的寡反义序列不敏感(参见例如Dominquez et al.,2010and Millington-Ward et al.,2011)。在这个上下文中，还很重要的是两个载体可以以独立的方式剂量给药并重复，从而允许调整靶组织中期望的表达水平。在另一实施方案中，可以平行引入不同的rAAV0载体以同时或连续取代基因的不同同种型。

本发明进一步提供制备rAAV0载体的方法，所述方法包括：

-向宿主细胞提供如上文所述的rAAV0质粒，其中宿主细胞和质粒均没有衣壳蛋白编码基因，

-在允许产生AAV0基因组的条件下培养宿主细胞，

-收获细胞并分离从所述细胞产生的AAV0基因组。

在上述方法中，允许产生AAV0基因组的条件特别是如下文提供的包含诱导Rep蛋白表达的条件。

利用针对细胞的量适当规模化的质粒纯化试剂盒已成功地分离rAAV0载体。例如，Qiagen EndoFree质粒试剂盒已用来从Sf9细胞分离和纯化rAAV0。为质粒分离开发的其他方法可以适合rAAV0，因为原理是相同的，即将低分子量DNA与细胞基因组DNA分级分离，并且从产物去除蛋白和RNA。

本领域已知的用于产生AAV载体的任何细胞系均可以用作宿主rAAV0载体生成细胞系。具体地，考虑其中AAV-REP蛋白可以用于AAV0基因组动员的细胞类型(例如，Sf9、293等)。还可以使用已知被AAV感染的其他细胞系，例如Huh-7、HeLa、HepG2、Hep1A、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1180、单核细胞以及成熟和未成熟的树突细胞。仅为了示例的目的，下文我们描述了利用Sf9昆虫细胞产生rAAV0载体的过程。

可以利用本领域已知的试剂(例如，脂质体、磷酸钙)或物理方式(例如，电穿孔)通过瞬时转染将rAAV0质粒引入Sf9细胞。可选地，可以建立稳定的Sf9细胞系，其已将rAAV0质粒稳定地整合入它们的基因组。可以通过将选择标记并入如上文所述的rAAV0质粒来建立这类稳定细胞系。

通常，通过引入编码rAAV基因组、Rep蛋白和Cap蛋白的质粒或多种质粒产生具有衣壳的AAV病毒粒子。在反式引入这些辅助质粒时，从宿主基因组“拯救”(即，释放并随后恢复)AAV基因组并进一步衣壳化以产生传染性AAV。但是，据发现这类衣壳化的AAV病毒载体转导某些细胞或组织类型的效率低。相比之下，本发明人意外地发现用无衣壳的AAV0载体转导对于难以用常规AAV病毒粒子转导的细胞或组织类型效率高。本发明与这类常规方法的区别在于仅需要反式的AAV Rep编码载体。AAVRep编码载体可以是例如表达Rep蛋白的杆状病毒的形式。如上文所述，可以通过不同方式引入Rep，例如通过质粒转染、病毒转导或稳定整合入细胞系，其中在启动子激活时诱导表达。因此，一旦将AAV Rep编码载体引入Sf9细胞系(已将rAAV0质粒稳定整合入其基因组)，rAAV0载体从宿主基因组拯救，但是不进一步衣壳化为病毒颗粒。对于rAAV0质粒，还可能加入AAV Rep蛋白编码核苷酸序列。

可以利用本领域已知的方法或利用可商购的试剂盒(例如，Qiagenminiprep试剂盒)纯化DNA形式的所拯救的rAAV0载体。

拯救的rAAV0载体还可以以外来体或微粒的形式纯化。本领域已知许多细胞类型不仅释放可溶性蛋白，而且还通过膜微泡脱落释放复杂的蛋白/核酸载荷(Cocucci et al,2009;EP10306226.1)。这类小泡包括微泡(也称为微粒)和外来体(也称为纳囊泡(nanovesicle))，两者均包含蛋白和RNA作为载荷。微泡从质膜的直接出芽产生，而外来体在多泡核内体与质膜融合时释放入细胞外环境。因此，可以从已用rAAV0载体转导的细胞分离包含rAAV0载体的微泡和/或外来体。可以通过将培养基过滤或以20000g超速离心来分离微泡，并且以100000g超速离心分离外来体。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并且取决于分离小泡的具体细胞类型。优选地，首先通过低速离心(例如，以2000g离心5-20分钟)使培养基澄清，并且利用例如Amicon离心柱(Millipore,Watford,UK)进行自旋浓缩。微泡和外来体可以通过FACS或MACS进一步纯化，通过使用识别微泡和外来体上存在的特异性表面抗原的特异性抗体。其他微泡和外来体纯化方法包括但不限于免疫沉淀、亲和层析、过滤以及用特异性抗体或适配体包被的磁珠。在纯化时，用例如磷酸缓冲盐水洗涤小泡。使用微泡或外来体递送rAAV0小泡的一个优点是这些小泡可以通过在它们的膜上包括各细胞类型上的特异性受体识别的蛋白来靶向各种细胞类型。(还参见EP10306226.1)

如上文所述，用于rAAV0载体制备的宿主细胞并不限于Sf9细胞。在一些实施方案中，分离自患有疾病的对象的细胞可以用作rAAV0载体制备的宿主。在一优选实施方案中，细胞可以分离自受疾病具体影响的组织。例如，肌肉细胞可以分离自患有肌营养不良的对象。在某些情况下，rAAV0载体转导的宿主细胞(例如，培养的成肌细胞)会主动脱落包含rAAV0载体的外来体和/或微粒。然后这些外来体和/或微粒可以作为组织培养上清收获并用于随后的载体转导。在一实例中，包含外来体和/或微粒的培养上清可以用来将rAAV0载体递送入视网膜细胞以治疗例如RPGRIP1缺陷(Lhériteau et al.,2009)或色素性视网膜炎(Ji-jing Pang et al.,2008)。综述参见Rolling et al.,2010。

在一具体实施方案中，制备rAAV0载体的方法包括以下步骤：

-用包含AAV0构建体的质粒转染昆虫细胞(特别是Sf9细胞)，

-任选地，利用质粒上存在的选择标记建立克隆细胞系，

-将Rep编码基因引入(通过用携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞，

-收获细胞并纯化rAAV0载体。

纯化具体可以这样完成，使细胞沉淀进行碱裂解，离心裂解物并将上清装在保留核酸的离子交换柱(例如Sartobind Q)上。然后将物质洗脱(例如用1.2M NaCl溶液)并装在凝胶过滤柱(例如6快速流动GE)上。然后通过沉淀回收AAV0载体。

通过本发明的制备方法，可以制备大量rAAV0载体。

在另一实例中，rAAV0载体可以用来体外转染干细胞。这些可以是任何种类的干细胞，例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、成体干细胞以及循环或组织常驻性干细胞。实例包括但不限于CD133+细胞、mesangioblast和ALDH+干细胞。可以将这些干细胞离体培养并用rAAV0载体转导以引发基因表达的瞬时或永久改变。瞬时改变可以通过转导能够诱导、沉默或修改基因表达的DNA或RNA序列来完成，通过引入偶联至功能性启动子的基因，或者通过引入偶联至能够诱导外显子跳跃事件(读框内或读框外)的反义序列的U1或U7基因，或者通过赋予反式沉默序列。如果在细胞培养的早期世代阶段进行转导，rAAV0载体会通过随后的传代稀释并最终丢失，即，这会导致基因表达的瞬时改变。相比之下，如果DNA切割酶由转移的基因如锌指核酸酶或大范围核酸酶或TAL核酸外切酶编码，则这可以导致受体细胞的永久性(孟德尔)基因改变。在这个上下文中，AAV0技术的一个具体优势是由于加入比常规AAV载体所允许的更大的序列的能力以及用包含互补载荷的一种或多种AAV0载体转染的可能性，可以将纠正DNA基质同时转移入这些细胞。

II.rAAV0载体的给药

向其递送rAAV0载体的细胞可以来源于人以及其他哺乳动物如灵长类、马、绵羊、山羊、猪、狗、大鼠和小鼠。可以将rAAV0载体递送至任何细胞类型、组织或器官，没有限制。可以向其递送rAAV0的细胞的实例包括但不限于中枢神经系统(CNS)的细胞、外周神经系统(PNS)的细胞、肌肉细胞、成骨细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞等。可以向其递送rAAV0载体的组织和器官的实例包括肌肉、心肌、平滑肌、脑、骨、结缔组织、心脏、肾、肝、肺、淋巴结、乳腺、髓鞘、前列腺、睾丸、胸腺、甲状腺、气管等。优选的细胞类型为肌肉细胞、CNS的细胞和PNS的细胞。优选的组织和器官为肌肉、心脏、眼和脑。

根据靶细胞所位于的具体组织，感兴趣的DNA、RNA、多肽、蛋白或AON的组织特异性表达可以通过在rAAV0载体中加入驱动外源DNA序列的转录的组织特异性启动子来实现。组织特异性启动子的实例如上文所示。

可以通过任何方式将本发明的rAAV0载体递送至细胞，包括使rAAV0载体与细胞接触。即，rAAV0载体并不绝对需要转染试剂用于细胞进入。这是非常意外的特性，因为根据本领域的经典假设，通过AAV颗粒转导包括AAV颗粒的内吞作用，其胞内运输至细胞核及其入核(参见例如Ding etal.,2005)。然后在细胞核中从AAV颗粒释放衣壳化的AAV基因组。根据这个观点，本领域技术人员预期使用无衣壳的AAV基因组会导致没有细胞转导，因为不能进入细胞或易位入细胞核，或者基因组可能被核酸内切酶或核酸外切酶降解。与这个教导相反，本发明人证实无衣壳的AAV0基因组能够转导细胞，并且以功能形式到达细胞核，由此可以实现基因表达。

因此本发明还涉及将感兴趣的核酸递送入细胞的方法，所述方法包括在转染试剂或额外的物理手段的存在下使至少一种rAAV0载体与细胞表面接触以促进所述rAAV0载体进入细胞。其还涉及在细胞中引起期望的基因产物或寡核苷酸的表达的方法，所述方法包括在转染试剂或额外的物理手段不存在的情况下使至少一种rAAV0载体与细胞表面接触以促进所述rAAV0载体进入细胞。

rAAV0载体可以作为基于转染试剂的将遗传物质递送入细胞的一种替代。但是，在一些实施方案中，rAAV0载体可以与转染试剂或物理手段联用以促进进入细胞。在体外，可以通过本领域已知的将DNA递送入细胞的方法将rAAV0载体递送入细胞。例如，可以通过标准转染方法(例如，转染试剂如脂质体、醇、富含多聚赖氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物和磷酸钙)、显微注射等将rAAV0载体引入细胞。引入细胞的其他方法包括例如缀合至蛋白、纳米颗粒或者包装入细胞来源的微泡(例如，微粒、外来体)(参见EP10306226.1)。

对于体内递送至对象细胞、组织或器官，可以将rAAV0载体加入适合向对象给药的药物组合物。通常，所述药物组合物包含rAAV0载体和药学可接受的载体(carrier)。如本文所用，“药学可接受的载体(carrier)”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体(carrier)的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，或者它们的组合。包含rAAV0载体的药物组合物可以作为例如藿香、喷雾剂、口服混悬剂、栓剂、滴眼液和可注射的混悬剂递送。

可以将本发明的rAAV0载体加入适合局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹腔内、皮下、气管、组织内(例如，肌肉内、心内、肝内、肾内、大脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如，眶外、眶内、眶后、视网膜内)和粘膜(例如，口服、直肠、鼻部)给药的药物组合物中。还考虑通过高压静脉内或动脉内输液以及细胞内注射如细胞核内显微注射或胞浆内注射的被动组织转导。

用于治疗目的的药物组合物通常在制备和储存条件下必须是无菌的和稳定的。组合物可以配制为溶液剂、微乳剂、分散剂、脂质体或适合高rAAV0载体浓度的其他有序结构。无菌的可注射的溶液可以这样制备，将需要量的rAAV0载体化合物与需要的上文所列的一种成分或多种成分的组合加入适当的缓冲液，然后过滤除菌。

对于rAAV0载体的体内给药，rAAV0载体的广泛分布可以通过例如静脉内、动脉内注射或流体动力局部灌注在肌肉中实现。根据剂量和递送模式，可以转导给定靶肌肉中20-95%的肌纤维。rAAV0载体的广泛分布还可以通过将rAAV0载体例如通过腰椎穿刺注射入脑脊液来在CNS或PNS中实现(例如，Kapadia et al.,1996)。可选地，将载体精确递送入脑的特定部位以靶向神经细胞可以利用立体定向显微注射技术来进行(Snyder-Keller et al.,2010)。特别优选的递送方法是将rAAV0载体递送至需要表达rAAV0载体编码的多肽、蛋白或寡核苷酸的脑或肌肉的特定区域的方法。无论皮下、颅内、肌肉内或皮内，rAAV0载体的直接注射可以利用标准针头和注射器方法或者通过无针技术进行。上述方法可以用包含药学可接受的载体(carrier)或媒介物的药物组合物形式的rAAV0载进行。还考虑有或无细胞的局部施用，后者在皮肤上直接使用局部制剂的AAV0用于大疱性表皮松解的隐性形式(参见例如Yan et al.,2010)。

用于递送核酸分子如本公开的rAAV0载体的其他方法描述于例如Boado et al.,J.Pharm.Sci.87:1308-1315(1998);Tyler et al.,FEBS Lett.421:280-284(1999);Pardridge et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA92:5592-5596(1995);Boado,Adv.Drug Delivery Rev.15:73-107(1995);Aldrian-Herrada etal.,Nucleic Acids Res.26:4910-4916(1998);Tyler et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA96:7053-7058(1999);Akhtar et al.,Trends Cell Bio.2:139(1992);"Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics,"(ed.Akhtar,1995);Maurer et al.,Mol.Membr.Biol.16:129-140(1999);Hofland and Huang,Handb.Exp.Pharmacol137:165-192(1999);以及Lee et al.,ACS Symp.Ser.752:184-192(2000)。这些方案可以用来补充或完成本公开内考虑的几乎任何rAAV0载体的递送。

适当的剂量取决于具体细胞类型、组织、器官或治疗的对象。当向对象给药时，剂量会取决于治疗的具体哺乳动物(例如，人或非人灵长类或其他哺乳动物)，待治疗的对象的年龄和一般疾病状况，治疗的疾病状况的严重程度，有问题的具体的治疗性多肽、蛋白或寡核苷酸，其给药模式等。

本领域技术人员可以容易地确定适当的有效量。

“治疗有效剂量”会落在相对广泛的范围内，所述范围可以通过临床试验确定，并且取决于具体应用(神经细胞会需要非常少的量，而全身注射会需要大量)。例如，对于直接体内注射入人类对象的骨骼肌或心肌，治疗有效剂量会在约1μg-100g的rAAV0载体的数量级上。如果外来体或微粒用来递送rAAV0载体，则治疗有效剂量可以通过实验来确定，但是预期递送1μg-约100g的载体。

对于体外转染，递送至细胞(1x10⁶个细胞)的rAAV0载体的有效量在1-20μg rAAV0载体，优选5-15μg，并且更优选8-10μg的数量级上。较大的rAAV载荷会需要较高的剂量。如果使用外来体或微粒，有效的体外剂量可以通过实验确定，但是计划一般递送相同量的载体。

治疗可以包括单一剂量或多剂量的给药。可以向对象给药超过一个剂量，事实上根据需要给药多剂量，因为rAAV0载体不引发抗衣壳的宿主免疫应答，这是由于不存在病毒衣壳。因此，本领域技术人员可以容易地确定适当数量的剂量。给药的剂量的数量可以例如在1-100，优选2-20个剂量的数量级上。

III.rAAV0载体的治疗用途

本发明的rAAV0载体特别适合将编码多肽、蛋白的外源DNA序列或者非编码的DNA、RNA或寡核苷酸递送至例如患有肌肉或CNS疾病的对象的肌肉和CNS的细胞。

本发明的rAAV0载体特别用于许多神经学或神经变性疾病，所述疾病可以受益于在疾病或病症中缺陷的肽或蛋白的表达，从而所述肽或蛋白的表达会导致与疾病或病症相关的症状的改善。可应用的疾病的一些实例包括但不限于杜兴肌营养不良、脊髓型肌萎缩、AIDS、庞帕病、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、戈谢病、赫尔勒病、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、气肿、早衰、ALS、癫痫、中风、高胆固醇血症、胰岛素病症(例如，糖尿病)、生长病症、各种血液病症(例如，贫血、地中海贫血和血友病)、遗传缺陷(例如，囊性纤维化)、癌症(特别是实体瘤)等。

在一些实施方案中，rAAV0载体可以用来纠正异常蛋白的表达，这通过靶向产生负责疾病发展的异常蛋白的潜在缺陷机制。肌养蛋白基因的异常剪接可以利用包含例如编码AON、U7或反式剪接盒的核苷酸序列的rAAV0载体来纠正以影响肌肉组织(参见例如Goyenvalle et al.,2004；Lorainet al.,2010；以及专利申请WO2006/021724、美国临时申请61/314,830、美国临时专利申请第61/249,702号和EP2010/065142，全部援引加入本文)。在其他实施方案中，可以递送包含全长肌养蛋白基因的rAAV0载体以影响肌肉组织。

涉及异常基因产物的表达的许多疾病是AAV0介导的基因治疗的候选。例如，证实由于缺陷的肌养蛋白基因产物的杜兴肌营养不良(DMD)的基因治疗涉及用功能性肌养蛋白基因代替缺陷的肌养蛋白基因，从而可以治疗对象体内受影响的肌肉。肌养蛋白基因中的突变导致在横纹肌中不能产生肌养蛋白。但是，突变的程度不与表型的严重程度直接相关。产生提前终止密码子和随后的翻译停止的读框外缺失或无义突变导致特征为严重表型的肌养蛋白缺陷。读框内缺失通常负责已知为Becker肌营养不良(BMD)的较轻的肌病。

AAV0载体介导的治疗的效力可以通过将表达感兴趣的转基因的rAAV0载体引入分离自患者或本领域可用的动物模型的细胞来证实。有两个良好表征的DMD的遗传动物模型。mdx小鼠在肌养蛋白基因的外显子23中包含无义突变，其妨碍全长的野生型肌养蛋白的合成。mdx小鼠表现出抵消变性的补偿机制，其可以维持再生过程以修复机械损伤。mdx小鼠不表现出DMD的症状，并且其寿命几乎是正常的。GRMD(黄金猎犬肌营养不良)狗缺少功能性肌养蛋白，这是因为内含子6中的剪接位点突变，其破坏读框。在GRMD中，如人DMD，纤维的逐步退化不可避免地导致骨骼肌萎缩，具有显著的肌内膜和肌束膜纤维化。因为其DMD样表型，GRMD是评价DMD的潜在治疗的最佳可用模型。

递送本发明的rAAV0载体的方法一般与用于常规病毒载体的方法相同(参见例如Goyenvalle et al.,2004;Toromanoff et al.,2010;Lowery et al.,2010;Duque et al.,2009)。尽管没有衣壳，AAV0载体不需要转导辅助以进入细胞或细胞核。因此，本发明还提供将外源DNA递送入细胞、组织或器官的方法，所述方法包括使所述细胞、组织或器官与本发明的rAAV0载体接触，不使用转导辅助。

在另一实例中，rAAV0载体可以用来通过在癌症的背景中选择性基因转移来诱导细胞死亡(参见例如Gruber et al.,2011)。

此外，本发明提供将感兴趣的核酸递送入有需要的对象的细胞的方法，其中所述方法是非免疫原性的，或者具有减少的免疫原性，所述方法包括向所述对象给药包含感兴趣的核酸的本发明的rAAV0载体。此外，本发明提供将感兴趣的核酸递送入有需要的对象的细胞的方法，所述方法包括多次给药包含感兴趣的核酸的本发明的rAAV0载体。因为本发明的rAAV0载体不诱导免疫应答，所以与用衣壳化的载体所观察到的相反，这样的多次给药策略不会受到针对本发明的rAAV0载体的宿主免疫系统应答的损害。

上述公开一般描述本公开，其通过以下实施例进一步描述。这些具体实施例仅为了说明目的提供，并不是为了限制本公开的范围。虽然本文已采用具体靶标、术语和值，但是这类靶标、术语和值同样应理解为示例性的，并不限制本公开的范围。

实施例

实施例1：用于制备rAAV0载体的rAAV0质粒的构建

AAV0-GFP质粒(“pFBGR/Blas”)如下构建。利用引物序列5’-ATAAGCTTACGCTCAGTGGAAVGAAAAC-3’(SEQ ID NO:7)和5’-ATAAGCTTGACGTGTCAGTGTCAGTCCTGCTCCT-3’(SEQ ID NO:8)，通过高保真PCR，扩增pIB/V5-His/CAT质粒(Invitrogen Inc.)中的杀稻瘟素S基因(2784-3183bp)以及黄杉毒蛾立即早期-1启动子(Op IE-1;2401-2692bp)(Invitrogen,Inc.)和EM7启动子(2707-2765bp)。Hind III消化后，将865bp PCR产物克隆入AAV2包装质粒，pFBGR(Urabe et al.,2002)的Hind III位点。进行限制性图谱和DNA测序以证实正确的质粒构建。

实施例2：制备和纯化rAAV0载体

针对pFBGR/Blas质粒建立克隆Sf9细胞系。利用Cellfectin(Invitrogen)，用pFBGR/Blas质粒转染秋粘虫(Spodoptera frugiperda,Sf-9)细胞。转染后，将细胞在昆虫细胞培养基(HyClone Inc.)中于27℃下培养3天。然后添加杀稻瘟素S HCl(50μg/ml)以选择稳定的转化子。两周的选择期后，将稀释克隆和直接菌落转移技术用于获得独立的克隆细胞系。将转化的细胞在10%FBS HyQ生长培养基中培养并扩增以在杀稻瘟素S HCl选择(10μg/ml)下形成独立的菌落。

将杀稻瘟素抗性克隆细胞系单独地用表达AAV Rep78和Rep52(“Rep-Bac”)蛋白的重组杆状病毒感染(MOI=5)，并筛选GFP表达。Rep-Bac描述于Urabe et al.,2002。如Virag et al.,2009所述制备重组杆状病毒以产生足以用于动物研究的量。Rep-Bac感染后，在荧光显微镜下并且通过流式细胞术(Guava EasyCyte)发现许多细胞系表达GFP。从Rep-Bac细胞提取染色体外DNA并且同琼脂糖凝胶电泳进行分析。Rep-Bac感染后2.6kb条带的存在表明，从染色体DNA“释放”了“前病毒”rAAV0-GFP基因组并且作为AAV DNA以高拷贝数复制。

为了分离和纯化AAV0载体，在用Rep-Bac感染时扩增克隆Sf9细胞系并且以2x10⁶细胞/mL接种(MOI=1-3)。每天监控细胞活力和大小(Cellometer)。细胞直径的增加表示成功的杆状病毒感染。一旦平均细胞直径达到17-20μm就收获AAV0载体。通过荧光显微镜和Guava EasyCyte(Millipore)证实GFP表达表明Sf9/ITR-GFP细胞的有效Rep杆状病毒感染。用Qiagen miniprep试剂盒从培养的细胞(1mL)提取AAV0-GFP载体DNA以证实AAV0-GFP载体DNA的存在。更大水平的DNA提取可以用Qiagengigaprep试剂盒进行。

实施例3：rAAV0载体介导的体外基因表达

利用Xenoworks微注射系统(Sutter Instruments)，将rAAV0-GFP载体微注射入293细胞和C2C12细胞的细胞核或细胞质中。共微注射四甲基罗丹明70000MW赖氨酸可固定葡聚糖作为微注射的区域标记物。细胞核用DAPI染色。

此外，为了证实rAAV0与常规质粒-DNA相比额外的性质，当微注射入细胞质时测试rAAV0转导细胞的能力。实际上，质粒-DNA需要直接递送入细胞核中，细胞质微注射并不是有效的。这里，使C2C12成肌细胞生长并分化2天。利用Xenoworks微注射系统(Sutter Instruments)，将AAV0-GFP载体的溶液(0.02mg/ml)微注射入C2C12肌管的细胞核或细胞质中。共微注射四甲基罗丹明70000MW赖氨酸可固定葡聚糖(Sigma)作为微注射的区域标记物。微注射后48小时，利用聚甲醛3.7%(Sigma)固定肌管，并用0.5%Triton透化。所有荧光染色固定在Fluoromont G(Southern Biotech)中。细胞核用DAPI(Sigma)染色。示于图5中的荧光图用配有CoolSNAPHQ2相机(Roper Scientific)的Nikon Ti显微镜获得，利用40x1.0NA PL APO油镜，通过Metamorph(Molecular Devices)驱动。参见图5b。

图5b中的结果(左边)证实，细胞核被荧光染料染色，这又表明构建体被递送入细胞核中。GFP荧光证实GFP表达，这又表明从转导的rAAV0-GFP载体的转录。

实施例4：通过动脉内注射的rAAV0载体介导的体内基因表达

通过麻醉C57BL/6小鼠，分离右后肢用于单手动高压注射，或者两肢用于双手动高压注射来将AAV0-GFP载体动脉内注射入股动脉中。箝住股静脉和两根侧支血管后，将导管引入股动脉中，并以100ml/s的速率注射1ml磷酸缓冲盐水(PBS)中的100μgAAV0-GFP载体制品。灌注后1分钟，放开结扎的股静脉以打开循环。灌注后2周分析肢的GFP表达。

实施例5：rAAV0载体介导的体内基因表达不引起免疫应答

小鼠以1周的间隔接受两次高动力股动脉内AAV0-GFP注射。第一次注射在左腿(1ml PBS中的100μg AAV0-GFP)上进行，并且一周后的第二次注射在右腿上进行(1ml PBS中的100μg AAV0-GFP)。第二次注射后，在用常规Zeiss荧光显微镜分析之前，使小鼠恢复8周。通常，>48h后再给药rAAV是不可能的，因为存在中和抗体(Lorain et al.,2008)。1周后再注射导致未减少的对侧腿转导表明不存在针对rAAV0载体的免疫应答。

实施例6：通过视网膜下注射的rAAV0载体介导的基因表达

对于眼窝注射，将动物麻醉，并利用诸如胰岛素注射器向眼窝窦注射含有400μL PBS中的200μg AAV0-GFP载体的溶液。通常，标准技术可以用于小鼠或大鼠(Timmers et al.,2001)或犬或非人灵长类(Weber et al.,2003)的视网膜下注射。rAAV0载体会含有组织特异性启动子如细胞特异性G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)，其能够在视杆和视锥细胞光受体中建立稳健的转基因表达(Khani et al.,2007)。另一启动子实例为广谱(ubiquitous)smCBA启动子，其有效地靶向神经视网膜(Haire et al.,2006)。这些启动子可以作为控制元件连接至期望的转基因，其在要治疗的疾病中缺少表达，例如鸟氨酸环化酶-1基因，其突变导致Leber先天性黑朦(Leber Congenital Amaurosis)(Boye et al.,2010)；或者连接至RPE65基因，其也导致Leber先天性黑朦(Lhériteau et al.,2010)；或者连接至RD10基因，其如果突变会导致隐性遗传视网膜色素变性(Pang et al.,2011)。对于可通过基因疗法修复的视网膜疾病的综述，参见Stieger and Lorenz,2010。通常，在一般麻醉下，以小鼠中0.5-2μl或者犬或非人灵长类中50-600μl的物种适应体积，视网膜下注射5x10e9-5X10e11载体颗粒。在较大的动物中，这种方法可以与玻璃体切除术组合。典型地，对于犬，将44号套管(Corneal)连接至粘性流体注射(VFI)系统(D.O.R.C.International,Netherlands)，通过在显微术控制下，在巩膜切开术后将套管通过玻璃体插入并靶向绒毡层中央视网膜下的视网膜下空间，以递送受控且自动的视网膜下注射(Weber et al.,2003)。通过标准技术(如，PCR、蛋白印记、免疫荧光)，根据疾病特异性视觉功能测试功能性且生物化学地研究转基因表达。利用本领域人员已知的技术(例如视觉测试、空间定位测试、视网膜电图、视觉诱发电位)，测定效率作为视力恢复的量度。预期获得可测量程度的恢复。

实施例7：通过全身注射的rAAV0载体介导的体内基因表达

如实施例2和图1所述，通过尾静脉注射向小鼠(C57BL/6)给药rAAV0-GFP。AAV0-GFP制品由0.5ml磷酸缓冲盐水(PBS)中的100-200μgrAAV0-GFP。在注射开始后2周，在不同时间点分析组织(如，肌肉、心脏、脑、肝、肾)的GFP表达。预期，如果不是所有器官，许多器官会被转导。

实施例8：外来体和/或微粒介导的rAAV0载体的递送

本发明还提供通过以下步骤治疗患有杜兴肌营养不良的对象的方法：(1)从患有DMD的患者的肌肉活检建立成肌细胞培养物；(2)用编码感兴趣DNA的rAAV0载体转导所述成肌细胞培养物；(3)从所述培养物收集外来体或微粒；以及(4)将收集的外来体或微粒引入对象。

用编码感兴趣DNA的rAAV0载体转导来自患有DMD的对象的肌肉活检的成肌细胞培养物。实验确定持续时间后(其反映最优的含rAAV0的外来体或微粒从宿主细胞脱落)，收集培养物上清并首先在例如2000g下20分钟澄清。然后利用离心管(例如Amicon spin column;Millipore,Watford,UK)将预离心的上清在20000g下离心70分钟(对于微粒)和100000g下70分钟(对于外来体)。超速离心的最优时间可以根据实验确定。在用例如PBS洗涤超速离心的含微粒或外来体的沉淀时，可以直接使用悬浮的沉淀或者通过例如FACS、MACS、免疫沉淀、亲和力层析或用特异性抗体或适配体包衣非磁珠利用抗体进行额外的纯化步骤，所述抗体针对已知在囊泡表面上表达的蛋白。

然后将纯化的含rAAV0的微粒或外来体直接注射入患有DMD的对象的受影响的肌肉组织，或者可以用分离自患有DMD的对象的培养的干细胞温育。在后一种情况中，可以将已经内化微粒或外来体的培养的干细胞再引入患者的受影响的组织。

预期带有rAAV0载体的微粒或外来体会被内化，载体会进入细胞核并表达外源DNA。

实施例9：产生rAAV0-U7质粒和载体

以和实施例1所述基本上相同的方式产生rAAV0-U7质粒和载体。简言之，通过PCR从小鼠基因组DNA利用以下引物扩增全长U7snRNA基因(445bp)：5′-TAACAACATAGGAGCTGTG-3′(SEQ ID NO:9)和5′-CAGATACGCGTTTCCTAGGA-3′(SEQ ID NO:10)。如所述(S1)，将Sm结构域(AATTTGTCTAG;SEQ ID NO:11)变为smOPT(AATTTTTGGAG;SEQ ID NO:12)，并且将组蛋白前体-mRNA(pre-mRNA)配对区域用与以下序列互补的44bp代替：a)穿过肌养蛋白基因的外显子23的分支点上游的序列(BP22:5′-AAATAGAAGTTCATTTACACTAAC-3′;SEQ ID NO:13)和b)紧接在外显子23供体剪接位点的序列(SD23:5′-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3′;SEQ ID NO:14)。然后将所得的U7smOPT-SD23/BP22片段引入pFBGR/Blas质粒以产生rAAV0-U7-smOPT-SD23/BP22质粒。U7snRNA构建体的进一步细节可以在2010年3月17日提交的共有临时专利申请61/314,830中找到，该申请整体援引加入本文。还参见Goyenvalle et al.,2004。

实施例10：肌养蛋白的外显子跳跃的rAAV0-U7载体的体内治疗用途

本发明还提供通过如实施例4所述将rAAV0-U7动脉内注射入股动脉或者如实施例6所述全身递送来治疗患有杜兴肌营养不良的对象的方法。如实施例5所述，缺少针对rAAV0骨架的免疫应答还允许重复治疗脂质靶组织中的U7水平临床上相关。在mdx小鼠中评价治疗用途，这是一种公知的DMD的小鼠模型，已经对其开发了U7工具，其通过跳跃肌养蛋白前体mRNA而允许有效的肌养蛋白拯救(rescue)(Goyenvalle et al.,2004)。在处理后，在不同的时间点处死处理的动物，并通过RT-PCR(即，确定跳跃水平)、蛋白印迹和组织冰冻切片上的免疫荧光(如Goyenvalle et al.,2004所述)分析和肌养蛋白拯救以确定蛋白合成和定位。

实施例11：AAV0载体的结构表征

将如之前所述制备的rAAV0载体利用琼脂糖凝胶(1%)电泳进行结构分析(图8)。琼脂糖凝胶上的条带(2.6kb)反映了在制备过程结束时DNA回收后rAAV0的线性单体单链结构。

还在SSB(单链结合蛋白)的存在下进行rAVV0载体的电子显微镜检查以证实rAAV0载体的单链结构。将AAV样品在1X TE(10mM Tris,1mMEDTA,pH8)中以约15ng/μl稀释。然后将30μl稀释的样品用1μl的10mg/ml T4Gene32蛋白(一种SSB蛋白)在37℃下温育15分钟。然后将样品在预先于1X TE缓冲液中平衡的Superose6过滤柱上纯化以除去过量的蛋白。然后将样品沉积在碳酸铜网格上并用戊胺官能化。将它们用乙酸铀酰(阳性染色)形成反差并在暗视野投射电子显微镜(Zeiss902)下观察。如图9所示，rAAV0表现出线性结构，其为通过SSB结合所揭示的单链结构。

为了评价通过层析或Qiagen试剂盒纯化的AAVo中的蛋白污染物，在4-12%SDS-PAGE(NuPAGE Tris-Acetate Mini Gels,Invitrogen)上分离rAAVo样品，并对蛋白进行银染(Silver Stain Plus,BioRad)。

测试两种类型的rAAVo载体：编码CMV启动子下的GFP的AAVo(GFP)和带有U7snRNA的表达盒的AAVo(U7)。对于每种样品，在凝胶上上样不同量的DNA：

1：15μl，200ng/ml AAVo(U7)-纯化

2：15μl，350ng/ml AAVo(GFP)-纯化

3：15μl，700ng/ml AAVo(U7)-Qiagen

4：5μl，3300ng/ml AAVo(GFP)-Qiagen

5：15μl，350ng/ml AAVo(GFP)-纯化

6：7.5μl，700ng/ml AAVo(U7)-Qiagen

7：1.6μl，3300ng/ml AAVo(GFP)-Qiagen。

凝胶示于图10。在纯化的rAAV0样品中没有鉴定污染蛋白。因此，本文鉴定的性质仅仅归因于rAAV0载体自身，而不是已经存在于样品中的辅助蛋白。

******************

虽然在每种实施方案中描述了本公开，但是预期本领域技术人员可以对其进行某些修饰和改变而不偏离之前的说明书所示和所附权利要求书中进一步体现的公开的实质精神和范围。本公开并不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的那些以外，通过前述说明书和附图，本公开的各种修饰对本领域技术人员是明显的。这样的修饰也意图落在所附权利要求书的范围内。还应当理解，所有的值都是约数，并且为说明而提供。

本说明书中所指的美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利公开、图、表格和网站明确地整体援引加入本文。

各种实施方案

1.不含衣壳的腺伴随病毒载体(AAV0载体)，其包含两个AAV反向末端重复(ITR)和表达盒，每个所述ITR具有形成发夹结构的中断的回文序列，所述盒包含至少一个可操作地连接至外源DNA的启动子，其中：

所述表达盒每一端的侧翼均有一个反向末端重复，

所述载体不编码AAV衣壳蛋白，并且所述载体没有衣壳化。

2.实施方案1的AAV0载体，其中所述外源DNA包含约4200-约15000个核苷酸。

3.实施方案1的AAV0载体，其中所述外源DNA的长度超过衣壳化的AAV载体的包装能力。

4.实施方案1的AAV0载体，其中所述外源DNA序列编码蛋白。

5.实施方案1的AAV0载体，其中所述外源DNA序列编码正义或反义寡核苷酸。

6.一种制备不含衣壳的腺伴随病毒(AAV0)载体的方法，所述方法包括：

(a)提供包含两个AAV ITR、位于所述ITR之间的表达盒的细胞，所述表达盒包含至少一个可操作地连接至外源DNA的启动子；其中

所述表达盒的每一端的侧翼均有一个反向末端重复且不编码AAV衣壳蛋白，并且所述细胞不表达AAV衣壳蛋白；

(b)如果所述细胞中不存在AAV Rep基因或蛋白，则任选地向所述细胞提供AAV Rep基因或蛋白，但不提供AAV Cap基因或蛋白；

(c)使所述细胞在允许包含ITR和表达盒的DNA复制和释放并构成AAV0载体的条件下生长；

(d)从所述细胞收集拯救的AAV0载体。

7.实施方案6的方法，其中步骤(a)的细胞还包含选择标记。

8.实施方案6的方法，其中所述细胞系为Sf9。

9.实施方案7的方法，其中所述选择标记为杀稻瘟素S-抗性基因。

10.实施方案6的方法，其中拯救的AAV0载体以裸DNA或者掺入在外来体或微粒中收集。

11.实施方案10的方法，其中所述载体以纯化的裸DNA收集。

12.实施方案10的方法，其中以微粒或外来体的形式收集并纯化所述载体。

13.一种介导哺乳动物细胞中外源DNA的表达的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述细胞递送有效量的不含衣壳的腺伴随病毒(AAV0)载体，所述载体包含两个AAV反向末端重复(ITR)和表达盒，每个所述ITR均具有形成发夹结构的中断的回文序列，所述盒包含至少一个可操作地连接至外源DNA的启动子，其中(i)所述表达盒的每一端的侧翼均有一个反向末端重复，(ii)所述载体不编码AAV衣壳蛋白，并且(iii)所述载体没有衣壳化；并且(iv)所述载体没有免疫原性。

(b)使所述细胞在允许细胞表达外源DNA的条件下生长；

其中所述有效量足以允许细胞表达期望水平的外源DNA。

14.实施方案13的方法，其中所述外源DNA的长度超过包含衣壳的常规AAV载体的包装能力。

15.实施方案13的方法，其中所述递送包括简单地引入胞外培养基中的AAV0载体，并且不包括使用任何其他转导手段。

16.实施方案14的方法，其中所述外源DNA的长度为约4.2-约15kb。

17.实施方案14的方法，其中所述外源DNA长达约5kb。

18.实施方案14的方法，其中所述外源DNA长达约5kb。

19.实施方案14的方法，其中所述外源DNA长达约8kb。

20.实施方案14的方法，其中所述外源DNA长达约10kb。

21.一种介导哺乳动物的器官或组织中的外源DNA表达的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述哺乳动物递送有效量的不含衣壳的腺伴随病毒(AAV0)载体，所述载体包含两个AAV反向末端重复(ITR)和表达盒，每个所述ITR均具有形成发夹结构的中断的回文序列，所述盒包含至少一个可操作地连接至外源DNA的启动子，其中(i)所述表达盒的每一端的侧翼均有一个反向末端重复，(ii)所述载体不编码AAV衣壳蛋白，并且(iii)所述载体没有衣壳化；(b)等待所述器官或组织内的细胞进行外源DNA的表达；

其中所述有效量足以允许细胞表达期望水平的外源DNA。

22.实施方案21的方法，其中所述递送步骤包括全身递送至所述哺乳动物。

23.实施方案21的方法，其中所述外源DNA的长度超过包含衣壳的常规AAV载体的包装能力。

24.实施方案23的方法，其中所述外源DNA的长度为约4.2kb-约15kb。

25.实施方案22的方法，其中所述全身递送包括动脉内或肌肉内注射。

26.实施方案21的方法，其中所述递送步骤包括视网膜下注射。

27.实施方案25的方法，其中所述AAV0载体包含指导所述外源DNA优先或完全在特异性器官或组织中表达的启动子。

28.实施方案13或21的方法，其中所述外源DNA编码U7snRNA。

29.实施方案13或21的方法，其中所述外源DNA编码RNAi或siRNA。

30.实施方案13的方法，其中所述递送包括使用转染试剂或物理手段以促进进入细胞。

31.实施方案13的方法，其中所述递送在不存在促进所述rAAV0载体进入细胞的转染试剂或额外的物理手段的情况下进行。

32.一种治疗有需要的对象的疾病的方法，所述疾病涉及由于减少或终止的多肽表达或者表达所述多肽的无功能或功能较差的类似物而表现出症状的遗传缺陷，所述方法包括向所述对象递送有效量的实施方案1的载体，其中所述外源DNA包含跳跃、纠正、沉默或掩盖该缺陷的寡核苷酸或多核苷酸，导致与疾病或病症相关的症状的改善。

33.实施方案32的方法，其包括向所述对象递送有效量的实施方案1的载体，其中所述外源DNA编码RNAi或siRNA或者反义寡核苷酸或多核苷酸。

34.实施方案32的方法，其包括向所述对象递送有效量的实施方案1的载体，其中所述外源DNA编码寡核苷酸或多核苷酸，其表达会通过修复所述多肽的至少部分功能而导致与所述疾病相关的症状的改善。

35.一种在细胞中引起期望的基因产物或寡核苷酸的表达的方法，所述方法包括在转染试剂或额外的物理手段不存在的情况下使至少一种rAAV0载体与细胞表面接触以促进所述rAAV0载体进入细胞。

36.用一种或多种rAAV0载体向相同宿主重复给药期望的编码或不编码具体蛋白的DNA或RNA序列而不引发针对所述rAAV0载体的宿主的免疫应答的方法。

37.实施方案1的AAV0载体，其中单链线性DNA序列具有通过细胞膜进入细胞以及从细胞质转运至细胞膜的能力，不受病毒衣壳蛋白的干扰。

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Claims (22)

1.一种分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、感兴趣的核苷酸序列和第二AAV ITR，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列。

2.权利要求1的分离的线性核酸分子，其中所述感兴趣的核苷酸序列为外源DNA的表达盒。

3.权利要求1或2的分离的线性核酸分子，其中所述核酸分子是单链的。

4.权利要求1-2中任一项的分离的线性核酸分子，其没有AAV rep蛋白编码序列。

5.权利要求1-4中任一项的分离的线性核酸分子，其中所述感兴趣的核苷酸序列包含约4200-约15000个核苷酸。

6.权利要求2-5中任一项的分离的线性核酸分子，其中所述外源DNA序列编码蛋白或者正义寡核苷酸或反义寡核苷酸。

7.权利要求2-6中任一项的分离的线性核酸分子，其包含指导所述外源DNA优先或完全地以组织或器官特异性方式表达的启动子。

8.权利要求2-7中任一项的分离的线性核酸分子，其中所述外源DNA编码U7snRNA、RNAi或siRNA。

9.一种制备权利要求1-8中任一项的分离的线性核酸分子的方法，所述方法包括：

(a)提供包含核酸序列的细胞，所述核酸序列包含两个AAV ITR和位于所述ITR之间的感兴趣的核苷酸序列；其中所述核酸序列没有AAV衣壳蛋白编码基因，并且所述细胞不表达AAV衣壳蛋白；

(b)如果所述细胞中不存在AAV Rep基因或蛋白，则任选地向所述细胞提供AAV Rep基因或蛋白，但不提供AAV Cap基因或蛋白；

(c)使所述细胞在允许包含ITR和表达盒的DNA复制和释放并构成AAV0载体的条件下生长；

(d)从所述细胞收集拯救的AAV0载体。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞系为Sf9。

11.权利要求1-8中任一项的分离的线性核酸分子，其可以通过权利要求9或10的方法获得，或者通过权利要求9或10的方法获得。

12.一种介导哺乳动物细胞中外源DNA的表达的体外方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述细胞递送有效量的权利要求1-8中任一项或权利要求11的分离的线性核酸分子；

(b)使所述细胞在允许细胞表达所述外源DNA的条件下生长；

其中所述有效量足以允许细胞表达期望水平的所述外源DNA。

13.权利要求12的方法，其中所述递送包括简单地引入胞外培养基中的分离的线性核酸分子，并且不包括使用任何其他转导手段。

14.一种在细胞中引起期望的基因产物或寡核苷酸表达的体外方法，所述方法包括在不存在转染试剂或额外的物理手段的情况下使至少一种权利要求1-8中任一项或权利要求10的分离的线性核酸分子与细胞表面接触以促进所述rAAV0载体进入所述细胞。

15.权利要求1-8中任一项或权利要求11的分离的线性核酸分子，其用于将介导外源DNA表达的感兴趣的核苷酸序列递送入对象的细胞、器官或组织的方法。

16.权利要求1-8中任一项或权利要求11的分子，其用于介导对象，特别是哺乳动物的细胞、器官或组织中的外源DNA表达的方法。

17.权利要求1-8中任一项或权利要求11的分离的线性核酸分子，其用于治疗有需要的对象中的疾病的方法，所述疾病涉及由于减少或终止的多肽表达或者表达所述多肽的无功能或功能较差的类似物而表现出症状的遗传缺陷，其中所述外源DNA包含跳跃、纠正、沉默或掩盖该缺陷的寡核苷酸或多核苷酸，导致与疾病或病症相关的症状的改善。

18.权利要求17的分离的线性核酸分子，其中所述外源DNA编码RNAi或siRNA或者反义寡核苷酸或多核苷酸。

19.权利要求17的分离的线性核酸分子，其中所述外源DNA编码寡核苷酸或多核苷酸，所述寡核苷酸或多核苷酸的表达会通过恢复所述多肽的至少部分功能而导致与所述疾病相关的症状的改善。

20.权利要求15-17中任一项的分离的线性核酸分子，其中所述递送步骤包括全身递送至所述哺乳动物，特别是通过动脉内或肌肉内注射递送至所述哺乳动物。

21.权利要求12-14中任一项的方法，或者权利要求15-19中任一项的分离的线性核酸分子，其中所述递送包括使用转染试剂或物理手段以促进进入细胞。

22.权利要求12-14中任一项的方法，或者权利要求15-19中任一项的分离的线性核酸分子，其中所述递送在不存在促进所述rAAV0载体进入细胞的转染试剂或物理手段的情况下进行。

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