JP2017192385A - 無カプシドａａｖベクター、組成物ならびにベクター製造および遺伝子運搬のための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】標的、特に標的細胞、組織、器官または生物に外因性ＤＮＡ配列、特に異種ＤＮＡ配列を運搬する方法の提供。
【解決手段】第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向反復（ＩＴＲ）、関心のあるヌクレオチド配列および第２ ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序で含み、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠く単離された線状核酸分子。関心あるヌクレオチド配列が外因性ＤＮＡの発現セットであることが好ましく、核酸分子が一本鎖であることが望ましい、線状核酸分子。
【選択図】なし

Description

本発明は、標的、特に標的細胞、組織、器官または生物に外因性ＤＮＡ配列、特に異種ＤＮＡ配列を運搬する方法に関する。特に、本発明は、標的への異種ＤＮＡ配列の運搬のための、ウイルスカプシドタンパク質を欠く新規裸アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（以下、「ＡＡＶ０」）に関する。本発明の組換えＡＡＶ０ベクターは標的への外因性ＤＮＡ配列のインビトロ、エクスビボまたはインビボ運搬に使用されうる。本発明はまた、ＡＡＶ０ベクターの製造方法および精製方法を提供する。

遺伝子治療は、疾患の発生の根底にある欠損遺伝子を矯正することを目的とする。この問題に対処する一般的アプローチは核への正常遺伝子の運搬を含む。ついで、この遺伝子は標的化細胞のゲノム内に挿入されることが可能であり、あるいはエピソームのままでありうる。対象者の標的細胞への矯正遺伝子の運搬は、ウイルスベクターの使用を含む多数の方法により行われうる。利用可能な多数のウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなど）のうち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が遺伝子治療における汎用ベクターとしての人気を得つつある。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科のメンバーである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース（ｋｂ）を含有する線状一本鎖ＤＮＡ分子から構成され、非構造Ｒｅｐ（複製）タンパク質および構造Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要オープンリーディングフレームからなる。ＡＡＶコード領域に隣接して、約１４５ヌクレオチド長の２つのシス作用性ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が存在し、それは、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するヘアピン構造体へと折り畳まれうる介在する回文配列を伴う。ＩＴＲ配列は、ＤＮＡ複製におけるその役割に加えて、ウイルス組込み、宿主ゲノムからのレスキューおよびウイルス核酸の包膜による成熟ビリオンの生成に必要であることが示されている（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９）。

ＡＡＶ由来のベクターは遺伝物質の運搬に特に魅力的である。なぜなら、（ｉ）それは、筋繊維およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染（形質導入）し、（ｉｉ）それはウイルス構造遺伝子を欠いているため、ウイルス感染に対する自然宿主細胞応答、例えばインターフェロン媒介性応答を生成せず、（ｉｉｉ）野生型ウイルスはヒトにおけるいずれの病理にも関連づけられておらず、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム内に組込まれうる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損型ＡＡＶベクターは一般にエピソームとして存続し、したがって、挿入突然変異誘発または癌遺伝子の活性化のリスクが抑制され、そして（ｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは有意な免疫応答を誘発せず（ｉｉを参照されたい）、したがって治療用トランスジーンの長期発現を（それらの遺伝子産物が拒絶されない限り）もたらすからである。また、ＡＡＶベクターは高力価で製造されることが可能であり、動脈内、静脈内または腹腔内注射は、１回の注射により、少なくともげっ歯類においては、重要な筋肉領域への遺伝子導入を可能にする（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４；Ｆｏｕｇｅｒｏｕｓｓｅら，２００７；Ｋｏｐｐａｎａｔｉら，２０１０；Ｗａｎｇら，２００９）。ＡＡＶベクターはまた、遺伝物質の運搬に関して、プラスミドＤＮＡと比較して多数の利点を有する。例えば、プラスミドからの異種遺伝子の発現は短期的であり、プラスミドは通常、大きなサイズを有し、プラスミドは、細胞内に運搬されるためには物理的に操作（例えば、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション）される必要がある。更に、ジストロフィンのような遺伝子のプラスミド導入は宿主内で免疫応答を惹起し、低効率に関連づけられる（Ｒｏｍｅｒｏら，２００４）。

しかし、遺伝子運搬ベクターとしての従来のＡＡＶの使用も多数の欠点を伴う。第１に、そのような治療を潜在的に受ける者の相当な割合は、与えられた型のＡＡＶベクターに対して既に血清陽性である（Ｂｏｕｔｉｎら，２０１０）。第２に、幾つかの個体においては、ＡＡＶベクターは、ウイルスカプシドまたは加工不純物により引き起こされうる軽度の宿主免疫応答を惹起しうる。この場合、免疫応答を抑制するための免疫抑制剤の使用は一時的手段に過ぎない。なぜなら、患者がこれらの免疫抑制剤の服用を止めると、免疫応答が回復するからである（Ｌｏｒａｉｎら，２００８）。おそらく、ＡＡＶに関連した主な欠点は、異種ＤＮＡ４．５ｋｂの、その限定されたウイルスパッケージング能であろう（Ｄｏｎｇら，１９９６；Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓら，２００４；Ｌａｉら，２０１０）。

ＡＡＶベクターのパッケージング能を拡大させるために、二重ベクター法を用いる種々のアプローチ、例えば、大きな治療用遺伝子を標的細胞に運搬するように設計されたトランス−スプライシング（ｔｓ）および重複（ｏｖ）ＡＡＶベクター系が試みられている。例えば、Ｌｏｓｔａｌらは、ジスフェルリンｃＤＮＡをエキソン２８／２９結合部において分割し、それを、適当なスプライス配列を含有する２つの独立したＡＡＶベクター内にクローニングすることにより、筋肉内への遺伝子導入のためのＡＡＶベクター内に直接的には組込まれ得ないジスフェルリンｃＤＮＡに関するサイズの制約を回避した（Ｌｏｓｔａｌら，２０１０）。更に、これらのアプローチでさえも、固有の非効率という欠点を有する。したがって、小さなパッケージング能は依然としてＡＡＶ遺伝子治療における大きな制約である。カプシドの除去は、パッケージング能を改善しうる方法とはみなされていない。なぜなら、カプシドは、細胞内へのベクター進入を可能にするのに必須だとみなされているからである。

もう１つの顕著な欠点は、異種遺伝子発現の前に一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことから、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現が比較的遅いことである。二本鎖ＤＮＡベクターを構築することによりこの問題を解決するための試みがなされているが、この方法は、ＡＡＶベクター内に組込まれうるトランスジーン発現カセットのサイズを更に制限する（ＭｃＣａｒｔｙ，２００８；Ｖａｒｅｎｉｋａら，２００９；Ｆｏｕｓｔら，２００９）。更に、成長している器官における有効なＡＡＶ媒介性遺伝子治療は、分裂細胞におけるエピソームＤＮＡ希釈により、その効果を喪失しうる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，２００９）。

Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９

本発明は、細胞、組織、器官または対象者への外因性ＤＮＡ配列のインビトロ、エクスビボまたはインビボ運搬のための組換えＡＡＶ０（「ｒＡＡＶ０」）ベクターを提供することにより、ＡＡＶベクターに関連した前記欠点の一部または全部に対処するものである。

発明の概括
本発明は、ウイルスカプシドによる取り込み過程の媒介を伴わない、関心のあるタンパク質またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデスオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の効率的発現のために、外因性ＤＮＡ配列が、カプシドを欠くＡＡＶゲノム（またはベクター）（すなわち、ＡＡＶ０）内に組込まれ、標的細胞、組織、器官または対象者に運搬されうるという知見に基づくものである。本発明前には、カプシドは細胞内へのウイルスベクターの効率的取り込みのために必要だとみなされていたため、それ無しで済ますことには抵抗があったであろう。実際、ＡＡＶベクターの精製方法は大部分が、非カプシド化（非包膜）ＤＮＡを後に残す、カプシドに対する抗体に基づくもの、または非カプシド化ＤＮＡを分解するＤＮアーゼの使用に基づくものであった。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターを、プラスミドに基づく発現ベクターから区別する構造的特徴には、以下のことが含まれる：ｒＡＡＶ０ベクターにおける元の（すなわち、未挿入）細菌ＤＮＡが存在しないこと、ｒＡＡＶ０ベクターが原核性複製起点を欠くこと、ｒＡＡＶ０ベクターが自己含有性であること［すなわち、それは、Ｒｅｐ結合および末端分離（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）ならびにＩＴＲ間の外因性配列を含む２つのＩＴＲ以外のいずれの配列をも要しない］、ヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ｒＡＡＶ０ベクターが真核生物由来であること（すなわち、それらは真核細胞において産生される）、および細菌型ＤＮＡメチル化、または哺乳類宿主により異常だとみなされる他の全てのメチル化が存在しないこと。一般に、本ベクターはいずれの原核性ＤＮＡをも含有しないことが好ましいが、幾つかの原核性ＤＮＡが外因性配列として挿入されうると想定される。ｒＡＡＶ０ベクターをプラスミド発現ベクターから区別するもう１つの重要な特徴は、ｒＡＡＶ０ベクターは一本鎖または二本鎖の両方の線状ＤＮＡからなるが、プラスミドは常に二本鎖ＤＮＡであることである。

プラスミドに基づく発現ベクターと比較した場合の本発明のｒＡＡＶ０ベクターの利点の幾つかには、限定的なものではないが以下のものが含まれる：１）プラスミドは細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核生物特異的メチル化、すなわち、プリン塩基メチル化に付されるが、ｒＡＡＶ０ベクター配列は真核生物由来である；２）プラスミドは産生過程中に耐性遺伝子の存在を要するが、ｒＡＡＶ０ベクターはそれを要しない；３）環状プラスミドは細胞内への導入の際に核に運搬されず、細胞ヌクレアーゼによる分解を回避するために過負荷を要するが、ｒＡＡＶ０ベクターは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与するウイルス性シス要素、すなわち、ＩＴＲを含有し、核に標的化および運搬されるように設計されうる。ＩＴＲ機能に不可欠な最小規定要素はＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ；５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（ＡＡＶ２の場合））および末端分離部位（ＴＲＳ；５’−ＡＧＴＴＧＧ−３’（ＡＡＶ２の場合））、ならびにヘアピン形成を可能にする可変回文配列であると仮定される。

通常のＡＡＶベクターと比較した場合のｒＡＡＶ０ベクターの利点には、限定的なものではないが以下のことが含まれる：１）通常のＡＡＶベクターは、宿主免疫応答を惹起するカプシドを有するが、そのような応答はカプシド非含有ｒＡＡＶ０ベクターによっては惹起されない；２）通常のＡＡＶベクターは、限られた運搬物容量（約４．５ｋｂ）を有するが、ｒＡＡＶ０ベクターは、この制限を受けず、それらは、非常に短い配列から、野生型ＡＡＶゲノムの運搬物容量より１０％以上長い配列まで、すなわち、約５ｋベースから８、１０または更には１５ｋｂまでの配列を組込みうる；３）通常のＡＡＶベクターの調製物は不均一である（すなわち、完全ＡＡＶベクターと空カプシドとの混合物を含有する）が、ｒＡＡＶ０ベクターは事実上、実質的に均一である；４）通常のＡＡＶベクターの組成物は精製後であっても不均一であるが、ｒＡＡＶ０ベクターは、標準的なＤＮＡ分析技術を用いて完全に特徴づけられることが可能であり、均一な且つ完全に特徴づけられた最終産物を得ることを可能にする。更に、ｒＡＡＶ０ベクターの免疫原性の欠如を考慮すると、種々のｒＡＡＶ０ベクターの混合物が、同じ又は異なる経路で、細胞、器官または対象者に共投与されうる。

一般に、本発明は、ｒＡＡＶ０ベクター、および例えば細胞、器官、組織および対象者においてタンパク質またはＲＮＡまたはＤＮＡを発現させるためのその使用を提供する。そのような発現は１つのタンパク質またはＲＮＡ分子には限定されず、宿主内に運搬される複数の異なるｒＡＡＶ０ベクターによる複数のタンパク質および／またはＲＮＡの発現を含みうる。そのような形質導入は一過性または永続的なものでありうる。例えば、（例えば、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼにより）宿主ゲノムの永続的な修飾または矯正を引き起こすように意図された産物をコードするｒＡＡＶ０ベクターは宿主内に一過性に形質導入されうる。他の態様においては、ｒＡＡＶ０ベクターは、エキソンスキッピングのような遺伝子編集に影響を及ぼしうるコードまたは非コードＤＮＡを運搬しうる。タンパク質またはタンパク質／ＤＮＡ混合物をコードするｒＡＡＶ０ベクターを筋肉内注射およびそれに続く第２注射（好ましくは筋肉内注射）［両方の注射は、宿主（自己）の免疫レパートリーにより認識されない同じ抗原（タンパク質）の発現をもたらす］により運搬することにより、本発明のｒＡＡＶ０ベクターをワクチン接種にも使用することも可能である。本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、遺伝的ノックアウトまたはノックイン動物モデルの作製のための、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または卵巣細胞内へのトランスジーン運搬に有用である。本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、酵素療法のような置換療法のための後続の免疫寛容を可能にするために、新生児期における適用により、遺伝子産物に対する免疫寛容を誘導するためにも使用されうる（Ｓｕｎ，Ｂら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００７；８１：１０４２−１０４９）。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスはＧＦＰに感受性であり、ＧＦＰに対する細胞性応答および体液性応答の両方を惹起する。それらに出生時に、ＧＦＰ遺伝子を含有する少量のｒＡＡＶ０を注射することにより、より大量のｒＡＡＶ０または他のＧＦＰ含有ベクターの後続注射が有意な免疫応答を惹起しないように寛容が誘導されうる。

１つの態様においては、本発明は、第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、関心のあるヌクレオチド配列（例えば、外因性ＤＮＡの発現カセット）および第２ ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序で含む単離された線状核酸分子を提供し、ここで、該核酸分子はＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠く。もう１つの実施形態においては、本発明の核酸分子はウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠く（すなわち、それはＡＡＶカプシド遺伝子を欠き、また、他のウイルスのカプシド遺伝子をも欠く）。また、特定の実施形態においては、該核酸分子はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列をも欠く。したがって、好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子は機能性ＡＡＶ ｃａｐおよびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を欠く。

したがって、本発明は、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および関心のあるヌクレオチド配列（例えば、発現カセット）を有する最小ｒＡＡＶ０ベクターを提供し、ここで、該ＩＴＲのそれぞれは、介在する（または不連続的な）回文配列を有し、すなわち、以下の３つのセグメントから構成される配列である：５’から３’へと読取った場合に同一であるが、互いに対して配置された場合にハイブリダイズする第１セグメントおよび最終セグメント、ならびに該同一セグメントを隔てる異なるセグメント。そのような配列、特にＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。関心のあるヌクレオチド配列は特に、各末端において１つのＩＴＲに隣接している、外因性ＤＮＡ配列に機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む発現カセットでありうる。ｒＡＡＶ０ベクターはカプシドタンパク質をコードしておらず、ｒＡＡＶ０ベクターはカプシド化（包膜）されていない。ｒＡＡＶ０ベクターは一本鎖、二本鎖または二重鎖であることが可能であり、その一方または両方の末端はＩＴＲ回文配列を介して共有結合されている。好ましい実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターは一本鎖である。

１つの実施形態においては、外因性ＤＮＡ配列は、例えば以下のような治療用タンパク質をコードしている：ジストロフィン；ＬＡＲＧＥ（Ｂａｒｒｅｓｉら，２００４）；ジスフェルリン；カルパイン３；Ｄｕｘ４；ＬＡＭＡ２；α−、β−、γ−およびδ−サルコグリカン；ＦＫＲＰ、フクチン、ＷＡＳＰ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ＳＭＮ１、Ｕ７、修飾Ｕ７（米国仮出願第６１／３１４，８３０号およびＷＯ２００６／０２１７２４（それらの両方の全体を参照により本明細書に組み入れることとする））、Ｕ１、ＲｄＣＶＦ（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら，２０１０）、α−グルコシダーゼ、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼおよびアクチン。しかし、原則として、過剰発現された場合に治療利益をもたらす、または突然変異により減少している若しくは存在しないタンパク質またはポリペプチドをコードする任意の遺伝子が、本発明の範囲内であるとみなされる。他の実施形態においては、外因性ＤＮＡ配列はアンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＯＮ」）またはＲＮＡ（コードまたは非コード）、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ）をコードしている。そのような場合、発現されると有害表現型を与える突然変異遺伝子は、治療利益を得るためにサイレンス化されうる。更にもう１つの実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターは、メガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼによりもたらされる二本鎖切断の後に挿入されるべき矯正用ＤＮＡ鎖として使用される鋳型ヌクレオチド配列を含む。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、所望により、ウイルス外由来の他の導入配列を含有しうる。例えば、形質導入細胞を排除するために、いわゆる自殺遺伝子が導入されうる。しかし、未挿入細菌ＤＮＡは存在せず、好ましくは、細菌ＤＮＡは全く存在しない。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、標的細胞への関心ヌクレオチド配列の運搬のための方法においても使用されうる。該方法は、特に、関心のある治療用遺伝子を、それを要する対象者の細胞へ運搬するための方法でありうる。本発明は、治療用外因性ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの治療レベルが発現されるように、該ポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの、対象者の細胞におけるインビボ発現を可能にする。これらの結果はｒＡＡＶ０ベクター運搬のインビボおよびインビトロの両方のモデルで認められる。外因性ＤＮＡ配列が例えばインビボで筋肉内投与により筋肉細胞に運搬可能であることは、より効率的かつ簡便な遺伝子導入方法をもたらす。したがって、１つの実施形態においては、本発明は、細胞、器官または組織、例えば骨格筋または心筋内への、選択された遺伝子の運搬方法に関する。

しかし、本発明は、筋細胞のみにおける、選択された遺伝子の運搬および発現には限定されず、治療用ポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの発現が望まれる他の細胞型、例えば神経細胞にも適用可能である。したがって、もう１つの実施形態においては、本発明は、インビボでの頭蓋内または鞘内投与による、神経細胞への、所望の外因性ＤＮＡ配列のｒＡＡＶ０ベクター媒介性運搬に関する。

本発明は、運搬方法に関して限定的だとみなされるべきではない。例えば、運搬は、局所、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝臓内、腎臓内、脳内）、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、網膜内、網膜下）、粘膜（例えば、口腔、直腸、鼻腔、肺）、鞘内、膀胱内、頭蓋内、全身、腹腔内、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内、動脈内）およびリンパ内へのものでありうる。他の態様においては、高圧血管内注入、例えば静脈内または動脈内注入および細胞内注射、例えば核内マイクロインジェクションまたは細胞質内注射による受動組織形質導入も想定される。

更に、運搬は、ｒＡＡＶ０ベクターの、１つの種には限定されない。したがって、もう１つの態様においては、異なる外因性ＤＮＡ配列を含む複数のｒＡＡＶ０ベクターが標的細胞、組織、器官または対象者に同時または連続的に運搬されうる。したがって、この方法は複数の遺伝子の発現を可能にしうる。運搬は複数回行われることが可能であり、重要なことには、ウイルスカプシドが存在しないことにより抗カプシド宿主免疫応答が生じないことを考慮すると、臨床状況での遺伝子治療において、後の用量を増加または減少させて、運搬が行われうる。カプシドが存在しないため、抗カプシド応答は生じないと予想される。これは、所望により、実施例５（図７）に基づいて複数の注射により、および抗体応答または特異的Ｔ細胞活性化もしくは増殖の測定により確認されうる。また、トランスジーンのタンパク質産物に対する免疫原性でさえも、一本鎖ｒＡＡＶ０により運搬されると低減されると予想される。なぜなら、一本鎖ＡＡＶベクターは、強力な先天性免疫応答を惹起する能力が、二本鎖ＡＡＶベクターより弱いからである（Ｗｕら，２０１１）。

更にもう１つの態様においては、本発明は、無カプシドｒＡＡＶ０ベクターの製造方法を提供し、顕著なことに、該方法は、インビボ実験のための十分なベクターを与えるのに十分な程度に高い収率を示す。該方法は、２つのＡＡＶ ＩＴＲ、該ＩＴＲ間に位置する、関心のあるヌクレオチド配列（例えば、純粋なＤＮＡ鋳型の運搬の場合を除き、外因性ＤＮＡに機能的に連結された通常は少なくとも１つのプロモーターを含む発現カセット）を含む細胞を準備することを含む。関心のあるヌクレオチド配列は、各末端において、１つのＩＴＲに隣接しており、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードしておらず、細胞はＡＡＶカプシドタンパク質を発現しない。細胞はＲｅｐを既に含有するか、またはＲｅｐを含有するように、ベクターで形質導入され、ついで、ＩＴＲおよび発現カセットを含みｒＡＡＶ０ベクターを構成するＤＮＡの複製および遊離を可能にする条件下で増殖される。ついでｒＡＡＶ０ベクターを集め、遊離放出ｒＡＡＶベクターとして、またはエキソソームもしくは微粒子として、細胞または上清から精製することが可能である。

更にもう１つの態様においては、本発明は、それ自身のゲノム内に安定に組込まれたｒＡＡＶ０ゲノムを有する宿主細胞系を提供する。１つの実施形態においては、宿主細胞系は無脊椎動物細胞系、好ましくは昆虫Ｓｆ９細胞である。もう１つの実施形態においては、宿主細胞系は哺乳類細胞系、好ましくは２９３細胞である。生産細胞おける増幅のためにＡＡＶ０バックボーンを導入するためのプラスミドトランスフェクションの利用は哺乳類（例えば、ヒト）へのインビボ適用には適切でないが、Ｓｆ９細胞の場合と同様に、ｒＡＡＶ０の切り出し及び増幅を可能にする、細胞内にＲｅｐタンパク質を導入するための例えばヘルペスウイルスのような第２のベクターの使用が想定されうるであろう。更にもう１つの態様においては、Ｒｅｐをコードする遺伝子が宿主細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）内に安定に組込まれうる。Ｒｅｐ遺伝子を導入するための手段は多種多様である：例えば、プラスミドのトランスフェクション、Ｒｅｐを発現するベクターの感染、Ｒｅｐを発現する安定な細胞系。更にもう１つの実施形態においては、哺乳類宿主細胞を、疾患に罹患した対象者から単離する。好ましくは、該疾患により直接的に損なわれており、正常レベルの遺伝子産物を発現せず、突然変異した及び非機能性または低機能性遺伝子産物を発現する、あるいは該疾患を招く遺伝子産物を異常に過剰発現する組織から、自己宿主細胞を単離する。

１つの態様においては、宿主細胞は幹細胞である。したがって、ｒＡＡＶ０形質導入は、例えば、与えられた幹細胞集団の一過性形質導入を引き起こすことが可能であり、この場合、導入されたエピソーム遺伝子または非コードＲＮＡは後続の細胞継代の際に希釈される。あるいは、操作されたメガヌクレアーゼのｒＡＡＶ０媒介性導入は、幹細胞における、継続する遺伝的修飾を招きうる（Ｓｉｌｖａら，２０１１）。この場合、メガヌクレアーゼ自体は後続の細胞分裂の際に希釈されるが、ｒＡＡＶ０−メガヌクレアーゼ媒介性遺伝的修飾は後続の細胞分裂によりメンデル様態で遺伝する。これはメガヌクレアーゼの使用の大きな欠点を修正しうるであろう。

更にもう１つの態様においては、本発明は、ｒＡＡＶ０ゲノムがそれ自身のゲノム内に安定に組込まれた宿主細胞系からのｒＡＡＶ０ベクターの精製方法を提供する。注目すべきことに、プラスミドバックボーンは、それが原核生物由来であることを考慮すると、ｒＡＡＶ０の産生に適さず、それは免疫原性の重大なリスクをもたらす。ｒＡＡＶ０産生は以下の２つの段階を受ける：第１に、Ｒｅｐタンパク質によるベクターバックボーンからの切り出し（「レスキュー」）、第２に、切り出されたベクターゲノムの、Ｒｅｐタンパク質による増幅。ＡＡＶ０を含有するプラスミドの単なるトランスフェクションは、増幅無しで又は不十分な増幅を伴って、主にレスキューされたｒＡＡＶ０を与える。これは、ＡＡＶ０ベクターを含有するプラスミドのもう１つの欠点（すなわち、増幅が不十分である又は生じないこと）を際立たせる。１つの実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターをＤＮＡ分子として精製する。もう１つの実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターをエキソソームまたは微粒子として精製する。

本発明はまた、所望により医薬上許容される担体を伴っていてもよい、治療的有効量のｒＡＡＶ０ベクターを、疾患の治療を要する、対象者の標的細胞（特に筋細胞または組織）内に導入することを含む、対象者における疾患の治療方法を提供する。ｒＡＡＶ０ベクターは担体の存在下で導入されうるが、そのような担体は要求されない。提供されるｒＡＡＶ０ベクターは、疾患の治療に有用な、関心のあるヌクレオチド配列を含む。特に、ｒＡＡＶ０ベクターは、対象内に導入された場合に、外因性ＤＮＡ配列によりコードされる所望のポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの転写を導きうる制御要素に機能的に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含みうる。ｒＡＡＶ０ベクターは、前記の及び本明細書のどこかに記載されているいずれかの適当な経路で投与されうる。好ましい実施形態においては、疾患はデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）であり、トランスジーンはジストロフィンであり、あるいはｍｄｘマウスモデルにおけるエキソン２３のスキッピングを可能にする適当なアンチセンス配列を含有する最適化Ｕ７をコードするｒＡＡＶ０である（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４を参照されたい）。このｒＡＡＶ０−Ｕ７ベクターは、例えば、注射部位の近位のガロットによる静脈流の並行的封鎖下、大腿動脈の動脈内注射により投与されうる。生じるエキソンスキッピングおよびジストロフィン回復は形質導入筋組織への投与の早くも４週間後には観察されうる。

本発明は更に、対象者における遺伝的または後天的筋肉疾患または障害（または単なる遺伝子の付加もしくは遺伝子の抑制）の治療方法を提供し、該方法は、（１）該疾患を有する対象者の筋肉生検物から筋芽細胞培養を樹立し（Ｂｉｇｏｔら，２００８；Ｂｅｎｃｈａｏｕｉｒ，２００７）、（２）所望の外因性ＤＮＡ配列によりコードされる所望のポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの転写を導きうる制御要素に機能的に連結された該外因性ＤＮＡ配列を含むｒＡＡＶ０ベクターを筋芽細胞または筋組織へ運搬し、（３）該外因性ＤＮＡ配列を含有するベクターを含有するエキソソームまたは微粒子を該培養から集め、あるいはＤＮＡの形態のｒＡＡＶ０ベクターを集め、（４）集められたｒＡＡＶ０で満たされたエキソソームもしくは微粒子またはＤＮＡ形態のｒＡＡＶ０ベクターを該対象者内に運搬することを含む。該エキソソームまたは微粒子は特定の向性（例えば、筋細胞特異的）を有することが可能であり、それにより、隣接細胞を形質導入する能力を有しうる。

もう１つの実施形態においては、宿主における遺伝子産物の突然変異により引き起こされた欠損を矯正するために、あるいはｒＡＡＶ０コード化ＤＮＡ切断酵素、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｃｏｎｎｅｌｌｙら，２０１０）を使用して遺伝的欠損を矯正するために、患者から単離された幹細胞をエキソビボで形質導入することが可能である。もう１つの実施形態においては、該ＤＮＡ切断酵素はメガヌクレアーゼである（Ｓｉｌｖａら，２０１１）。更にもう１つの実施形態においては、該ＤＮＡ切断酵素はＴＡＬエフェクターヌクレアーゼである（Ｓｕｎら，２０１２）。

幹細胞、例えば間充織幹細胞、造血幹細胞およびｉＰＳ細胞は、遺伝的および後天的障害の潜在的な細胞および遺伝子治療のためのｒＡＡＶ０ベクターでのエキソビボ修飾のための魅力的な標的である。これらの細胞型を治療に理想的なものにする或る利点には、複数の系列へと分化するそれらの能力、増殖および自己再生し、損傷部位へ遊走するそれらの能力、ならびにエクスビボで形質導入された場合に、それらが低免疫原性であるため、根源的な欠損の矯正の後に宿主内へ再移植されることが可能であることが含まれる（Ｌｉら，２００９；Ｂｅｎｃｈａｏｕｉｒら，２００７）。重要なことには、多数の幹細胞型は、ＡＡＶなどのウイルスベクターでは非効率的に形質導入されるが（同誌）、ｒＡＡＶ０ベクターは、微粒子またはエキソソーム媒介性運搬と組合された場合には特に、それがウイルスカプシドに非依存的に細胞進入することにより、この欠点を回避しうる。Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−Ｍｕｔａｎｔ ＡＡＶ２ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｕｓｅ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｌｉ Ｍ，Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ ＧＲ，Ｌｉ Ｂ，Ｌｉｎｇ Ｃ，Ｍａ Ｗ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ，Ｚｈｏｎｇ Ｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１：１５２７−１５４３を参照されたい。

ｒＡＡＶ０で治療されうる他の疾患には、ＤＭＤ、脊髄性筋委縮、ポンぺ病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、てんかん、卒中、嚢胞性線維症および充実性腫瘍が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態においては、疾患はＤＭＤである。特に興味深い用途は癌治療におけるＡＡＶ０の使用であろう。なぜなら、本発明のｒＡＡＶ０ベクターでは免疫応答が懸念されないため、腫瘍が縮小または排除されるまで治療が反復可能だからである。

本開示のこれらの及び他の実施形態、特徴および利点は、以下に記載されている詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。

発明の詳細な説明
本発明は、第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、外因性ＤＮＡの発現カセットおよび第２ ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序で含む単離された線状核酸分子を提供し、ここで、該核酸分子はＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。本発明の核酸分子は、カプシドタンパク質を欠くｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ０）であり、所望の外因性ＤＮＡ配列の、そのインビトロ、エクスビボまたはインビボでの使用のための運搬に使用されうる。

本明細書中で引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、前記のものも後記のものも、それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。

本発明の実施は、特に示されていない限り、当技術分野の技量の範囲内の、ウイルス学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の通常の方法を用いる。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照されたい。

本発明の種々の組成物および方法を以下に詳細に記載する。本明細書中には特定の組成物および方法が例示されているが、多数の代替的な組成物および方法のいずれもが本発明の実施における使用に適用可能であり好適であると理解される。

定義
特に示されていない限り、本明細書中で用いられている全ての用語は当業者にとって一般的なものと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内である、微生物学および組換えＤＮＡ技術の通常の技術を用いるであろう。

本明細書中で用いる「ＡＡＶ０」なる語は、無カプシドＡＡＶベクター構築物を意味し、これはＩＴＲと、いずれかの所望の運搬物、例えば外因性遺伝子または他のポリヌクレオチドおよびプロモーターとを含有するが、カプシドは含有しない。好ましい実施形態においては、無カプシドＡＡＶ構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする配列を含有しない。したがって、本明細書中で用いる「ＡＡＶ０ベクター」または「組換えＡＡＶ０ベクター」（「ｒＡＡＶ０」）なる語は、制御要素に機能的に連結されている又はされていない、宿主内に導入されるべき外因性ＤＮＡ配列と、２つのＩＴＲとを、最小成分として含む無カプシドＡＡＶ構築物を意味する。全てのＩＴＲが１つの型のＡＡＶに由来する必要はない。「ＡＡＶ０ベクター」、「ｒＡＡＶ０ベクター」および「本発明の核酸分子」なる語は本明細書において互換的に用いられる。

本明細書中で用いる「ＡＡＶ０−プラスミド」なる語は、ｒＡＡＶ０ベクターをコードしており、細菌細胞内で増幅可能であり（すなわち、該プラスミドで形質転換された細菌の増殖を可能にする選択マーカーを有し）、そしてｒＡＡＶ０ベクター自体を作製する目的で宿主細胞内に導入される環状二本鎖ＤＮＡを意味し、それは線状一本鎖または最終的には二本鎖ＤＮＡである。

本明細書中で用いる「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」なる語はＡＡＶウイルスのシス要素を意味し、それらの対称性ゆえに、そのように命名されている。これらの要素はＡＡＶゲノムの効率的な増幅に必須である。ＩＴＲ機能に不可欠な最小規定要素はＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ；５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（ＡＡＶ２の場合））および末端分離部位（ＴＲＳ；５’−ＡＧＴＴＧＧ−３’（ＡＡＶ２の場合））ならびにヘアピン形成を可能にする可変回文配列であると仮定される。本発明においては、ＩＴＲは少なくともこれらの３つの要素（ＲＢＳ、ＴＲＳ、およびヘアピンの形成を可能にする配列）を含む。また、本発明においては、「ＩＴＲ」なる語は、公知の天然ＡＡＶ血清型のＩＴＲ（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１ ＡＡＶのＩＴＲ）、異なる血清型に由来するＩＴＲ要素の融合により形成されるキメラＩＴＲ、およびそれらの機能的変異体を意味する。ＩＴＲの機能的変異体は、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、該ＩＴＲを含む配列の増幅を可能にする、そして（実施例に示されているとおり）トランスフェクション補助を要することなく細胞の形質導入を可能にする、公知ＩＴＲに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す配列を意味する。

本明細書中で用いる「投与」、「導入」または「運搬」なる語は、組換えタンパク質またはヌクレオチド発現のための本発明のプラスミドまたはベクターの、対象者の細胞および／または組織および／または器官への運搬を意味する。そのような投与、導入または運搬はインビボ、インビトロまたはエクスビボで生じうる。組換えタンパク質またはポリペプチド発現のためのプラスミドはトランスフェクションにより細胞内に導入されることが可能であり、これは、典型的には、化学的手段［例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはリポフェクション］；物理的手段（エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション）；感染［これは、典型的には、感染因子、すなわち、ウイルス（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子を発現するバキュロウイルス）の導入を意味する］；または形質導入［これは、微生物学においては、ウイルスによる細胞の安定な感染、またはウイルス性因子（例えば、バクテリオファージ）による１つの微生物から別の微生物への遺伝物質の導入を意味する］による細胞内への異種ＤＮＡの挿入を意味する。組換えポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの発現のための本発明のベクターは、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはリポフェクション）により、または細胞、組織、器官もしくは対象者へのインビトロ、エクスビボもしくはインビボ運搬のための医薬上許容される担体でベクターを調製することにより運搬されうる。更に、本発明のＡＡＶ０ベクターは物理的手段または担体の補助無しで細胞に進入しうる。

「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」なる語は、通常、それぞれ、一般的にはより小さな４〜約１００塩基を有する核酸断片、または一般的にはより大きな（例えば、１００塩基を超え３０キロベースまでの）核酸分子、およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ断片または分子の配列に対して相補的（アンチセンス）または同一（センス）である配列を意味する。しかし、本明細書においては、これらの用語は互換的に用いられている。オリゴヌクレオチドは、転写される又は転写されないＤＮＡまたはＲＮＡ分子をも意味しうる。

本明細書中で用いる「中枢神経系」または「ＣＮＳ」なる語は、該用語の、当技術分野で認識されている用法に関するものである。ＣＮＳは脳、視神経、脳神経および脊髄に関連している。ＣＮＳは、脳室および脊髄中心管を満たす脳脊髄液をも含む。脳の領域は、線条体、海馬、皮質、基底核、視床下核（ＳＴＮ）、中脳橋被蓋核（ＰＰＮ）、黒質（ＳＮ）、視床、被殻、または脳の尾状領域、ならびに小脳、脊髄またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書中で用いる「コンカテマー化」または「鎖状化」は、反復する配列を連結することによるポリヌクレオチド分子の形成を意味する。

本明細書中で用いる「制御要素」なる語は、対象者の細胞、組織および／または器官内への運搬に際して外因性ＤＮＡ配列の転写を指令または調節しうるＤＮＡ配列を意味する。

本明細書中で用いる「変換（された）二本鎖形態」なる語は、宿主において機能的である最終的なｒＡＡＶ０形態を意味する。

本明細書中で用いる「外因性ＤＮＡ配列」なる語は、それが配置される宿主に由来しない核酸配列を意味する。それは宿主のＤＮＡと同一または異種でありうる。一例は、ベクター内に挿入される、関心のある配列である。そのような外因性ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡを含む種々の起源に由来しうる。そのような外因性ＤＮＡ配列は、天然に存在する又は人工的なイントロンを含む又は含まないことが可能であるゲノムＤＮＡを含みうる。更に、そのようなゲノムＤＮＡは、プロモーター領域またはポリＡシグナル配列を伴って得られうる。本発明における外因性ＤＮＡ配列はｃＤＮＡでありうる。外因性ＤＮＡ配列には、宿主細胞において発現されるべき遺伝子産物を産生する発現をもたらす任意のＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。該遺伝子産物は宿主細胞の生理に影響を及ぼしうる。外因性ＤＮＡ配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列をも含む。

本明細書中で用いる「エキソソーム」なる語は、１以上の細胞膜タンパク質から生じる小胞を意味する。小胞は、通常、細胞のエンドサイトーシス−リソソーム系において産生され、ついで該細胞により放出、分泌または「発散（ｓｈｅｄ）」される。本明細書中で用いる「微粒子」なる語は、特定のタンパク質およびＲＮＡ運搬物を含有する、膜で覆われた細胞断片を意味する（ＥＰ出願１０３０６２２６．１を参照されたい）。

本明細書中で用いる「発現カセット」なる語は、トランスジーンの転写を導くのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に機能的に連結された外因性ＤＮＡ配列を意味する。適当なプロモーターには、例えば組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターはＡＡＶ由来でありうる。

本明細書中で用いる「遺伝子運搬」または「遺伝子導入」なる語は、外来核酸配列、例えばＤＮＡを、信頼しうる様態で宿主細胞内に挿入するための方法または系を意味する。そのような方法は、非組込み導入ＤＮＡの一過性発現、染色体外複製、および導入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ内への導入遺伝物質の組込みをもたらしうる。遺伝子導入は後天的および遺伝的疾患の治療のための特有のアプローチをもたらす。

本明細書中で用いる「遺伝的筋障害」なる語は、優性突然変異、劣性突然変異、Ｘ連鎖核ＤＮＡ突然変異またはミトコンドリアＤＮＡ突然変異により引き起こされる神経筋疾患（これらに限定されるものではない）を含む、そしてまた、遺伝子を含有することも含有しないこともあるが遺伝子編集に影響を及ぼす大領域クロマチン欠失を含む、神経筋または筋骨格の疾患または障害（これらに限定されるものではない）を意味する。具体例には、優性または劣性肢帯筋異栄養症、デュシェンヌおよびベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）ＭＤ、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィーなどが含まれる。

本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語は、例えば、ｒＡＡＶベクターの被導入体として使用可能な又は使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を意味する。該用語は、形質導入された元の細胞の後代を含む。したがって、本明細書中で用いる「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列で形質導入された細胞を意味する。単一の親細胞の後代は、自然、偶発的または意図的突然変異により、形態学的に又はゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいと理解される。

本明細書中で用いる「神経細胞」なる語は、脳、脊髄から単離された細胞、または中枢神経系のいずれかの領域からの細胞、および対象者の脳、脊髄または中枢神経に存在するいずれかの細胞を意味する。神経細胞の例には、ニューロン細胞、例えば、神経シグナルまたは化学的シグナルを脳へ又は脳から伝達する神経細胞、例えば、身体の感覚受容器（目、耳など）からＣＮＳへメッセージを運ぶ感覚ニューロンまたは双極ニューロン；筋肉および腺からＣＮＳへシグナルを運ぶ運動ニューロンまたは多極ニューロン細胞（例えば、脊髄運動ニューロン、錐体細胞、プルキンエ細胞）；ＣＮＳ内の神経接続を形成するニューロン間またはシュードポラレ（ｐｓｅｕｄｏｐｏｌａｒｅ）細胞が含まれる。これらは（１つの軸索および１つの樹状突起の代わりに）２つの軸索を有する。神経細胞なる語は、脳の細胞の９０％を構成するグリア細胞をも含むと意図される。グリア細胞は、神経インパルスを運ばない神経細胞である。グリア細胞の型には、シュワン細胞、衛星細胞、ミクログリア、オリゴデンドログリアおよびアストログリアが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本明細書中で用いる「神経変性障害」または「神経学的障害」なる語は、神経細胞または神経細胞集団の形態学的および／または機能的異常を引き起こす障害を意味する。神経変性障害は、対象者における正常な神経機能の不全もしくは非存在、または異常な神経機能の存在をもたらしうる。例えば、神経変性障害は疾患、損傷および／または老化の結果でありうる。形態学的および機能的異常の非限定的な例には、神経細胞の物理的悪化および／もしくは死、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的接続の異常、神経細胞による物質（例えば、神経伝達物質）の過少もしくは過剰産生、神経細胞が通常産生する物質の、該神経細胞による産生（例えば、神経伝達物質のような物質の産生）の不全、ならびに／または異常なパターンもしくは少なくとも異常な回数での電気インパルスの伝達が含まれる。神経変性は対象者の脳の任意の領域で生じる可能性があり、例えば頭部外傷、脳卒中、ＡＬＳ、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む多数の障害と共に見られる。

ｒＡＡＶ０ベクターに関して本明細書中で用いる「機能的に連結（されている）」なる語は、ｒＡＡＶ０ベクターのヌクレオチド成分が、選択されたコード配列の機能的な制御のために、互いに機能的に関連していることを意味する。一般に、「機能的に連結された」核酸配列は連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、リーディングフレームが一致している。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。

ｒＡＡＶ０の文脈において本明細書中で用いる「パッケージング」なる語は、ゲノムまたは他のコード配列ならびに制御要素（プロモーター）、またはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を、２つのＩＴＲ要素間に包含することを意味する。ほとんどの場合、該ベクターは、例えば、Ｕ７またはＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡの転写を導くための制御要素を有するであろう。しかし、場合によっては、転写されることを必ずしも必要とせず、したがって制御要素を欠くＤＮＡを運搬するために（例えば、ジンクフィンガーのための矯正用マトリックスまたはＴＡＬエキソヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ媒介性遺伝子修復）、ｒＡＡＶ０ベクターが使用されうる。

本明細書中で用いる「医薬上許容される」なる語は、ヒトに投与された場合に、典型的に毒性またはアレルギーまたは同様の望ましくない反応、例えば胃の不調、眩暈などをもたらさない生理的に許容される分子および成分を意味する。好ましくは、本明細書中で用いる「医薬上許容される」なる語は、動物、より詳しくはヒトにおける使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。

「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は本明細書においては互換的に用いられ、アミノ酸の重合体を意味し、完全長タンパク質およびその断片を含む。当業者に理解されるとおり、本発明は、アミノ酸配列または他の特性において、既知アミノ酸配列からの若干の変異を有する、それらのポリペプチドをコードする核酸をも含む。アミノ酸置換は、中性となるように、公知パラメーターにより選択されることが可能であり、例えば点、欠失、挿入および置換突然変異体の誘導のような標準的な方法により、それをコードする核酸配列内に導入されうる。アミノ酸配列における小さな変化、例えば保存的アミノ酸置換、小さな内部欠失または挿入、および分子の末端における付加または欠失が一般に好ましい。これらの修飾は、アミノ酸配列における変化をもたらし、サイレント突然変異を与え、制限部位を修飾し、または他の特定の突然変異をもたらしうる。また、それらはコード化タンパク質に対する有益な変化をもたらしうる。

本明細書中で用いる「精製（された）」なる語は、無関係な物質、すなわち不純物（該物質の入手源である天然物を含む）の存在を低減または排除する条件下で単離された物質に関するものである。例えば、精製されたｒＡＡＶ０ベクターＤＮＡは、好ましくは、組織培養成分、混入物などを含む、細胞または培養成分を実質的に含有しない。ｒＡＡＶ０を含有するエキソソームまたは微粒子は、僅か８０または更には６０μｍの粒子を選別する専門化された細胞分取装置を使用して精製されうる。ＥＰ １０３０６２２６．１を参照されたい。

「実質的に含有しない」なる語は物質の分析試験の文脈において機能的に用いられる。好ましくは、不純物を実質的に含有しない精製された物質は、少なくとも５０％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイおよび当技術分野で公知の他の方法により評価されうる。

本明細書中で用いる「組換え体」なる語は、ＤＮＡ組換え（クローニング）法を用いて作製された、天然または野生型核酸、ベクター、ポリペプチドまたはタンパク質から区別可能な核酸、ベクター、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

本明細書中で用いる「レスキュー」なる語は、例えばプラスミド内に含有されている二重鎖分子形態、異種ウイルスゲノム（例えば、バキュロウイルス）または細胞ゲノム内のプロウイルスからのＡＡＶ０ゲノムの放出を意味する。放出および複製過程を一緒にして、典型的には、レスキューを構成するとみなされる。複製および放出経路における幾つかの段階がインビトロアッセイから推論された（ＷａｒｄおよびＢｅｒｎｓ，１９９１；Ｈｏｎｇら，１９９２；Ｈｏｎｇら，１９９４）。簡潔に説明すると、組換え事象は、追い出された二重鎖ＩＴＲの間で生じて、共有結合により末端が閉じられた複製中間体（以前は「無末端」ＤＮＡと呼ばれていた（Ｎｉら，１９９４））を与えうる。ＡＡＶ ｐ５ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）はいずれかも、配列特異的ＤＮＡ結合およびニック化活性を有し、末端が閉じられた基質に作用する。Ｒｅｐタンパク質はＩＴＲのステム領域に結合し、二重鎖ＤＮＡをほどいて、一本鎖ニック化部位、末端分離部位（ｔｒｓ）を露出させる。Ｒｅｐタンパク質または細胞ヘリカーゼ活性のいずれかがＩＴＲをほどき、それにより５’側の突出している約１２５ｎｔ、および細胞ポリメラーゼ複合体により伸長される遊離３’−ＯＨ基を与える。線状二分子二重鎖分子が無末端中間体の両末端における末端分離事象の産物である。該二分子二重鎖ＤＮＡは今や、アニール化ＡＡＶゲノムと等価であり、レスキューされたプロウイルスＤＮＡまたはビリオン由来ＤＮＡの両方に関して、区別不可能な様態で、複製が進行しうる。

本明細書中で用いる「選択マーカー」なる語は、トランスフェクションまたは細胞内への外因性ＤＮＡの導入を意図した他の方法の成功を示すための、選択に適した形質を付与する、細胞内に導入される遺伝子を意味する。一般に、検出可能なシグナルとして用いられうる直接的または間接的なあらゆるものが本発明の範囲内の選択マーカーであると想定される。具体例には、蛍光マーカー、例えばＧＦＰ、細胞分取による選択を可能にするマーカー膜ペプチド、および耐性による選択を可能にする抗生物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。

抗生物質および代謝選択マーカーは、通常、安定な真核生物系を作製するために使用される。例えば、抗生物質Ｇ４１８は真核細胞に致死的であるが、原核生物酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼにより不活性化される。同様に、ヒグロマイシンは哺乳類細胞に毒性であるが、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼにより不活性化される。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系が開発されている。これらの細胞は、生存するためには、外因性グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンに依存的である。したがって、安定なＣＨＯ細胞系は、所望のトランスジーンおよびＤＨＦＲをシスでトランスフェクトし、ＨＡＴ選択培地内で培養することにより作製されうる（ＨａｃｋｅｒおよびＷｕｒｎ，２００７に概説されている）。

本明細書中で用いる「対象者」なる語は、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の霊長類およびサル種；家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシ；ペット哺乳動物、例えばイヌおよびネコ；実験用動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモットなどを含むが、これらに限定されるものではない。該用語は特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、雌雄にかかわらず、成体および新生児対象者ならびに胎児が含まれることを意図している。

本明細書中で用いる「治療用遺伝子」なる語は、発現されると、それが存在する細胞もしくは組織に対して、または該遺伝子が発現された哺乳動物に対して有益な効果をもたらす遺伝子を意味する。有益な効果の例には、状態または疾患の徴候または症状の改善、状態または疾患の予防または抑制、所望の特性の付与が含まれる。治療用遺伝子には、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損を部分的または全体的に矯正する遺伝子が含まれる。

「治療的有効量」なる語は、所望の治療結果を達成するための、必要な投与量および期間における有効な量を意味する。該組換えベクターの治療的有効量は、個体の病態、年齢、性別および体重ならびに該ベクターが個体において所望の応答を惹起する能力のような要因によって変動しうる。また、治療的有効量は、治療的に有益な効果がいずれかの毒性または有害効果に勝っている量である。

本明細書中で用いる「組織特異的プロモーター」なる語は、個々の器官または組織、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞において機能しうるプロモーターを意味する。ＣＮＳのためのプロモーターの非限定的な例には、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）およびグリア特異的プロモーター（Ｍｏｒｉｉら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５：１８５−１９１）が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、プロモーターは組織特異的であり、中枢神経系以外においては本質的に活性でなく、あるいはプロモーターの活性は、中枢神経系においては、他の系におけるよりも高い。例えば、プロモーターは脊髄、脳幹（髄、橋および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質または皮質内、後頭、側頭、頭頂または前頭葉）、視床下核（ＳＴＮ）、黒質（ＳＮ）またはそれらの組合せに特異的である。プロモーターの他の例としては、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリｂ−アクチンプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーから構成される）（Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，１９８９）、肝特異的ＴＢＧプロモーター（２コピーのα−１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーおよび甲状腺ホルモン結合性グロブリンプロモーター）（Ｙａｎｇ，１９９７；Ｂｅｌｌ，２０１１）、ＴｅｔＯｎ／ＴｅｔＯｆｆボックスに結合したＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター）（Ｌｈｅｒｉｔｅａｕ Ｅ，２０１０）、天然ヒトＵ７プロモーター（米国仮出願第６１／３１４，８３０号およびＷＯ２００６／０２１７２４（これらの両方の全体を参照により本明細書に組み入れることとする））、細胞特異的Ｇプロテイン結合受容体キナーゼ１のためのプロモーター（Ｋｈａｎｉ ＳＣ，２００７）などが挙げられる。

筋細胞特異的プロモーターも公知である（Ｈｉｍｅｄａら，２０１１）。非限定的な例としては、筋特異的クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター（Ｌｉら，１９９３）、ミオシン軽鎖プロモーター（Ｃｏｘら，１９９２）、キメラ筋特異的プロモーター（Ｆｒａｕｌｉら，２００３）およびトロポニンＣプロモーター−エンハンサー（心筋）が挙げられる。

本明細書中で用いる「トランスフェクション」なる語は細胞による外因性核酸分子の取り込みを意味する。細胞が「トランスフェクト」されているのは、外因性核酸が細胞膜内に導入されている場合である。多数のトランスフェクション技術が当技術分野において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術は、１以上の外因性核酸分子を適当な宿主細胞内に導入するために用いられうる。

本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、いずれかの非プラスミド遺伝的要素、例えばウイルス、ｒＡＡＶ０、ＡＡＶ、パロウイルス、ビリオンなどを意味する。

本明細書中で用いる「エクスビボ投与」は、一次細胞または全器官を対象者から集め、ｒＡＡＶ０ベクターを該細胞内に運搬し、該細胞を同じ又は異なる対象者に再投与する過程を意味する。

本明細書においては、特に示されていない限り、いずれの濃度範囲、百分率範囲、比範囲または整数範囲も、挙げられている範囲内の任意の整数の値、および適当な場合には、それらの割合（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。また、特に示されていない限り、いずれかの物理的特性（例えば、重合体サブユニット、サイズまたは厚さ）に関する、本明細書におけるいずれの数値範囲も、挙げられている範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。

「約」または「およそ」なる語は値の統計的に有意な範囲内を意味する。そのような範囲は、与えられた値または範囲の桁の範囲内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、より好ましくは１０％以内、より一層好ましくは５％以内でありうる。「約」または「およそ」なる語に含まれる許容可能な変動は研究中の個々の系に左右され、当業者により容易に理解されうる。

本発明の更なる詳細を以下の節で説明する。

Ｉ．ＡＡＶ０プラスミドの構築およびｒＡＡＶ０ベクターの製造
ウイルスカプシドは、ＡＡＶベクターのパッケージング能が制限される原因の１つである。ＡＡＶ０ベクターのカプシドの欠如はこの制限を回避し、所望の外因性ＤＮＡ配列が、サイズにおいてＡＡＶのパッケージング能を相当に超える場合であっても、ＡＡＶ０ベクター内に組込まれ、標的細胞、組織、器官または対象者への導入後に発現されることを可能にする。例えば、本発明の核酸分子（またはｒＡＡＶ０ベクター）を使用して、５、８、１０または１５ｋｂもの大きさのインサートが成功裏にトランスフェクトされると想定される。多数のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が公知である（ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１；ＫｏｔｉｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）。本発明のＡＡＶ０バックボーンはいずれかのＡＡＶ血清型のゲノムに由来しうる。好ましくは、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。

現在のところ、ＡＡＶゲノム自体が遺伝子治療用のベクターとして使用されたり精製されたことはない。すなわち、現在までのＡＡＶウイルス媒介性遺伝子導入の全ての公知実施形態は、ＡＡＶカプシドタンパク質内に包膜されたＡＡＶウイルス粒子の導入を含む（例えば、Ｄｏｅｎｅｃｋｅら，２０１０；Ｗａｎｇら，２０１１；Ｓｔｉｅｇｅｒら，２０１０；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ Ｓら，２０１１；Ｊｉｍｉｎｅｚら，２０１１；Ｗｈｉｔｅら，２０１１）。ＤｏｅｎｅｃｋｅらはプラスミドＡＡＶ媒介性遺伝子発現を報告しているが、これは、ＡＡＶ配列を細菌プラスミド内に組込むことを含むものであった（しかし、前記のとおり、プラスミドバックボーンは、それが、免疫原性の有意なリスクをもたらす原核生物由来であることを考慮すると、ｒＡＡＶ０の製造には適していない。更に、ＡＡＶ０を含有するプラスミドのトランスフェクションは、主として、増幅をほとんど又は全く伴うことなく、レスキューされたｒＡＡＶ０を与えるであろう）。また、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｍａｐ．ｃｇｉ？ｒｅｓｕｌｔ＝ｍａｐ＆ａｃｃ＝ＮＣ ００２０７７＆ｏｒｇａｎｉｓｍ＝２３９７はＡＡＶの種々の配列を記載しているが、カプシドを含有しないものを含んでいない。これは、無カプシドＡＡＶ０が想定されていないという見解に合致している。

したがって、本発明は、外因性ＤＮＡのための発現カセットを含むがカプシドコード配列を欠く単離された無カプシドＡＡＶゲノムに関する。これは、第１ ＡＡＶＩＴＲ、外因性ＤＮＡの発現カセットおよび第２ ＩＴＲをこの順序で含む単離された線状核酸分子に対応する。本発明の特定の実施形態においては、本発明の核酸分子は線状一本鎖または二本鎖核酸である。好ましい実施形態においては、本発明の核酸は一本鎖である。この好ましい実施形態の第１の変形態様においては、第１ ＩＴＲは該核酸分子の５’末端に位置する。この好ましい実施形態の第２の変形態様においては、第２ ＩＴＲは該核酸分子の３’末端に位置する。この好ましい実施形態の第３の変形態様においては、第１ ＩＴＲは該核酸分子の５’末端に位置し、第２ ＩＴＲは３’末端に位置する。特定の実施形態においては、単離された核酸分子バックボーンは、公知ＡＡＶゲノム、例えば、前記データベース中に見出されるものから誘導される（由来する）。しかし、本発明の単離された線状核酸分子は、該ベクターの構築に必要な各要素を提供すること、すなわち、外因性ＤＮＡ発現カセットに隣接する２つのＩＴＲを提供することにより、遺伝子工学によっても製造されうる。

注目すべきことに、本発明は、線状である核酸分子であるベクターに関する。したがって、本発明はＡＡＶプラスミドに対応しないと理解されるべきである。実際、プラスミドは細菌由来の環状核酸分子である。したがって、この場合、本発明とプラスミドとは、対象物の構造（特に、線状であるか環状であるか）、そしてまた、これらの異なる対象物を製造し精製するために用いられる方法（後記を参照されたい）、そしてまた、プラスミドでは原核生物型でありｒＡＡＶ０では真核生物型であるそれらのＤＮＡメチル化において異なる。

同様に注目すべきことに、ｒＡＡＶ０ベクター（本発明の核酸分子）は、異なるウイルスカプシド、例えば、組換えアデノウイルスのウイルスカプシド（例えば、ＷＯ ９６／１８７２７を参照されたい）へと改変操作されたＡＡＶゲノムとは異なる。なぜなら、それはいずれのウイルスカプシドをも含有せず、カプシドタンパク質との宿主細胞表面の干渉を伴うことなく直接的に宿主細胞内に取り込まれることが可能であり、カプシドタンパク質の干渉を伴うことなく細胞質から核内に輸送されることが可能だからである。また、本明細書に記載されているｒＡＡＶ０ベクターは、アデノウイルスカプシドまたはＡＡＶゲノムをパッケージングするために使用される実に全ての他のウイルスカプシドにより惹起される、宿主における免疫応答を惹起しない。

１つの実施形態においては、ＡＡＶ０バックボーンはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１ゲノムに由来する。特定の実施形態においては、ＡＡＶ０バックボーンはＡＡＶ２ゲノムに由来する。もう１つの特定の実施形態においては、ＡＡＶ０バックボーンは、これらのＡＡＶゲノムの１以上から誘導されたＩＴＲをその５’および３’末端に含むように遺伝的に操作された合成バックボーンである。本発明の核酸分子（すなわち、ｒＡＡＶ０ベクター）に存在する２つのＩＴＲは同じ又は異なりうる。特に、それらは同じＡＡＶゲノムに由来しうる。特定の実施形態においては、本発明の核酸分子に存在する２つのＩＴＲは同じであり、特に、ＡＡＶ２ ＩＴＲでありうる。

ｒＡＡＶ０プラスミド（すなわち、ｒＡＡＶ０線状ベクターを後に製造するために使用されるプラスミド−前記の定義を参照されたい）は、転写の方向に機能的に連結された成分として以下のものを少なくとも得るために、公知技術を用いて構築される：５’ＩＴＲ；プロモーター、関心のある外因性ＤＮＡ配列を含む制御要素；転写終結領域；および３’ＩＴＲ。注目すべきことに、それらのＩＴＲ内のヌクレオチド配列はｒｅｐおよびｃａｐコード領域に取って代わる。ｒｅｐ配列は理想的にはヘルパープラスミドまたはベクターによりコードされるが、その代わりに、それはｒＡＡＶ０プラスミド自体により運ばれうる。そのような場合、ｒｅｐ配列は、好ましくは、それらのＩＴＲの間に挟まれた領域の外に位置するが、それらのＩＴＲの間に挟まれた領域内に位置することも可能である。所望の外因性ＤＮＡ配列は、そのコード化ポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの転写または発現を細胞、組織、器官または対象者（すなわち、インビトロ、エクスビボまたはインビボ）において導く制御要素に機能的に連結される。そのような制御要素は、選択された遺伝子に通常付随している制御配列を含みうる。あるいは、異種制御配列が使用されうる。有用な異種制御配列には、一般に、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。具体例には、例えばＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどのようなプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、非ウイルス遺伝子、例えばマウスメタロチオネイン遺伝子に由来する配列も本発明において有用であろう。そのようなプロモーター配列は、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から商業的に入手可能である。あるいは、プロモーターは組織特異的プロモーターでありうる。いずれかのＡＡＶ血清型からのＩＴＲが本発明のｒＡＡＶ０プラスミドにおける５’および３’ＩＴＲとしての使用に適しており、異なるＡＡＶ血清型からのＩＴＲが５’および３’ＩＴＲのそれぞれに使用されうる。多数のＡＡＶ血清型のＩＴＲ配列が公知である。例えば、配列番号１および２はＡＡＶ２のＩＴＲ配列である。配列番号３〜６はそれぞれＡＡＶ１、３、４および５のゲノム配列を示す。これらの血清型のＩＴＲ配列は当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ４のＩＴＲ配列を開示しているＣｈｉｏｒｉｎｉ，ＪＡら，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（９）：６８２３−６８３３ Ｖｏｌ．７１，Ｎｏ．９を参照されたい。

ｒＡＡＶ０プラスミドは、宿主ｒＡＡＶ０ベクター産生細胞系の樹立において使用される、選択可能または選択マーカーをも含みうる。選択マーカーは、プロモーター、例えばオルジア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）最初期−１プロモーター（Ｏｐ ＩＥ−１）に機能的に連結される。１つの実施形態においては、選択マーカーは３’ＩＴＲの下流（すなわち、３’側）に挿入されうる。もう１つの実施形態においては、選択マーカーは５’ＩＴＲの上流（すなわち、５’側）に挿入されうる。適当な選択マーカーには、例えば、薬物耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどでありうる。好ましい実施形態においては、薬物選択マーカーはブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。

ウイルスカプシドにより課されるパッケージングの制限が存在しないため、ｒＡＡＶ０プラスミドおよびベクターにおいて使用される適当な外因性ＤＮＡ配列はサイズにおいて限定されない。したがって、幾つかの実施形態においては、外因性ＤＮＡ配列は５，０００ｂｐを超えることが可能であり、他の実施形態においては、外因性ＤＮＡ配列は１０，０００ｂｐを超えることが可能である。換言すれば、ＡＡＶパッケージング能を少なくとも１０％、実際には２０％超える、そして１５ｋｂもの大きさの外因性ＤＮＡ配列が、ＡＡＶ０ベクター内に容易に組込まれうる。本発明において使用される外因性ＤＮＡ配列の種類に関する特定の要件は存在しない。外因性ＤＮＡ配列には、例えば、受容対象者において欠損している又は欠いているタンパク質をコードする遺伝子、あるいは所望の生物学的または治療効果（例えば、抗細菌、抗ウイルスまたは抗腫瘍機能）を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。他の実施形態においては、外因性ＤＮＡ配列は、欠損遺伝子または転写産物の発現を矯正するように機能しうる遺伝子産物（例えば、修飾Ｕ７、メガヌクレアーゼ、トランススプライシングカセット、または転写後プロセシングメカニズム（例えば、スプライシング）をモジュレーションするためのもの）をコードする。外因性ＤＮＡ配列は、好ましくは、それが投与される組織に関係のあるタンパク質をコードする。また、外因性ＤＮＡ配列は、矯正ＤＮＡ鎖をコードし、ポリペプチド、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ（コード体または非コード体；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡおよびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードしうる。

適当な外因性ＤＮＡ配列には、内分泌、代謝、血液、肝、心血管、神経、筋骨格、泌尿器、肺および免疫障害、例えば、炎症疾患、自己免疫、慢性、感染性および遺伝的疾患、例えばデュシェンヌ筋症候群、脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）、エイズ、癌（特に充実性腫瘍）、高コレステロール血症、インスリン障害、例えば糖尿病、成長障害、種々の血液障害、例えば種々の貧血、サラセミアおよび血友病のような障害；遺伝的欠損、例えば嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏症、気腫、ポンペ病、早老症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、てんかん、卒中などの治療に使用されるポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドをコードするものが含まれるが、これらに限定されるものではない。

ｒＡＡＶ０ベクターによりコードされる適当なトランスジーンには、例えば、ジストロフィン；ＬＡＲＧＥ（Ｂａｒｒｅｓｉら，２００４）；ジスフェルリン；カルパイン３；Ｄｕｘ４；ＬＡＭＡ２；α−、β−、γ−およびδ−サルコグリカン；ＦＫＲＰ、フクチン、ＷＡＳＰ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ＳＭＮ１、Ｕ７、Ｕ１、ＲｄＣＶＦ（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら，２０１０）、α−グルコシダーゼ、ＬＡＭＩＮ Ａ／Ｃ、ＺＭＰＳＴＥ４およびアクチンが含まれる。原則として、突然変異のために減少している又は存在しない、あるいは過剰発現されると治療的利益をもたらすタンパク質またはポリペプチドをコードする任意の遺伝子が、本発明の範囲内であるとみなされる。

また、フレームから遺伝子を外す（ｓｋｉｐ）ためのＵ７技術の利用が本発明の範囲内で想定される（Ｐｉｅｔｒｉ−Ｒｏｕｘｅｌら，２０１０；米国仮出願第６１／３１４，８３０号およびＷＯ２００６／０２１７２４（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする））。このようにして、任意の遺伝子の発現が調節されうる。この場合、突然変異形態が疾患の原因となることが知られているが、生物または器官の正常な機能に必須ではない遺伝子（例えば、ＳＯＤ１、ＤＭ１）の発現は、Ｕ７系により低減されうる。Ｕ７系はトランススプライシングによる遺伝子矯正にも使用されうる（米国仮特許出願第６１／２４９，７０２号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）およびＥＰ２０１０／０６５１４２（ｒＡＡＶ０ベクター系との使用にも適している））。重要なことに、ｒＡＡＶ０技術は、遺伝子（例えば、優性突然変異を含有する遺伝子）の並行（すなわち、脱共役）ダウンレギュレーションおよびその遺伝子の置換（その生理的特性を回復させるためのもの）をも可能にする。このように、遺伝子を抑制するために、１つのｒＡＡＶ０ベクターを使用し、同じ遺伝子の正常コピーを導入するために、もう１つのｒＡＡＶ０ベクターを使用し、これにより、該ベクターの相互間の干渉が低減または排除され、それらの２つの介入の、独立した投与が可能となる。そのようなアプローチは、例えば、エキソン−スキッピングを誘導するＡＯＮをコードする１つのｒＡＡＶ０ベクターを使用する遺伝子サイレンシング（同誌）のためのアウト・オブ・フレーム（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）エキソンスキッピングを用い、第２のｒＡＡＶ０ベクターで正常な遺伝子コピーを導入することが可能である。この場合、コドンの最適化が、該正常遺伝子コピーを、該エキソンスキッピングを導入するオリゴアンチセンス配列に対して不感受性にする（例えば、Ｄｏｍｉｎｑｕｅｚら，２０１０およびＭｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄら，２０１１を参照されたい）。この場合、それらの２つのベクターが、反復的に、独立した様態で投与されることが可能であり、それにより、標的組織における所望の発現レベルの調節を可能にしうることも重要である。更にもう１つの実施形態においては、異なるアイソフォームの遺伝子を同時または連続的に置換するために、異なるｒＡＡＶ０ベクターが同時に導入されうる。

本発明は更に、
・前記のｒＡＡＶ０プラスミドを含有する宿主細胞を準備し、ここで、該宿主細胞および該プラスミドは、カプシドタンパク質をコードする遺伝子を欠き、
・ＡＡＶ０ゲノムの産生を可能にする条件下、該宿主細胞を培養し、
・該細胞を集め、該細胞から産生されたＡＡＶ０ゲノムを単離することを含む、ｒＡＡＶ０ベクターの製造方法を提供する。

前記方法においては、ＡＡＶ０ゲノムの産生を可能にする条件は、特に、後記に示されているとおり、Ｒｅｐタンパク質発現の誘導を含むものである。

ｒＡＡＶ０ベクターは、細胞の量に関して適切に規模調節されたプラスミド精製キットを使用して成功裏に単離されている。例えば、Ｓｆ９細胞からｒＡＡＶ０を単離し精製するために、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄキットが使用されている。プラスミド単離のために開発されている他の方法も、原理（すなわち、低分子量ＤＮＡを細胞ゲノムＤＮＡから分画し、タンパク質およびＲＮＡを産物から除去すること）は同じであるため、ｒＡＡＶ０に適合化されうる。

ＡＡＶベクターを製造するための当技術分野で公知のいずれかの細胞系が宿主ｒＡＡＶ０ベクター産生細胞系として使用されうる。特に、ＡＡＶ−ＲＥＰタンパク質がＡＡＶ０ゲノムの動員に使用されうる細胞型（例えば、Ｓｆ９、２９３など）が想定される。ＡＡＶに感染することが知られている他の細胞系、例えばＨｕｈ−７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１１８０、単球ならびに成熟もしくは未熟樹状細胞も使用されうる。専ら例示目的として、Ｓｆ９昆虫細胞を使用する、ｒＡＡＶ０ベクターの製造方法を以下に記載する。

ｒＡＡＶ０プラスミドは、当技術分野で公知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）または物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）を用いる一過性トランスフェクションにより、Ｓｆ９細胞内に導入されうる。あるいは、ｒＡＡＶ０プラスミドがゲノム内に安定に組込まれた安定なＳｆ９細胞系が樹立されうる。そのような安定な細胞系は、前記のとおり、ｒＡＡＶ０プラスミド内に選択マーカーを組込むことにより樹立されうる。

通常、カプシドを有するＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶゲノム、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする単一または複数のプラスミドを導入することにより産生される（Ｇｒｉｍｍら，１９９８）。これらのヘルパープラスミドのトランスでの導入に際して、ＡＡＶゲノムが宿主ゲノムから「レスキュー」され（すなわち、放出され、ついで回収され）、更に包膜されて、感染性ＡＡＶを産生する。しかし、そのような包膜ＡＡＶウイルスベクターは、ある細胞および組織型を非効率的に形質導入することが判明した。これとは対照的に、無カプシドＡＡＶ０ベクターでの形質導入は、通常のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難な細胞および組織型に非常に効率的であることが、本発明者らにより見出された。本発明は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード化ベクターだけがトランスで必要とされる点で、そのような通常の方法からは区別されうる。ＡＡＶ Ｒｅｐコード化ベクターは、例えば、Ｒｅｐタンパク質を発現するバキュロウイルスの形態でありうる。前記のとおり、Ｒｅｐは、種々の手段により、例えば、プロモーター活性化に際して発現が誘導される、細胞系におけるプラスミドトランスフェクション、ウイルス形質導入または安定な組込みにより導入されうる。したがって、ｒＡＡＶ０プラスミドがゲノム内に安定に組込まれたＳｆ９細胞系内にＡＡＶ Ｒｅｐコード化ベクターが導入されると、ｒＡＡＶ０ベクターは宿主ゲノムからレスキューされるが、ビリオン粒子へと更に包膜されることはない。ｒＡＡＶ０プラスミドはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード化ヌクレオチド配列を取り込むことも可能である。

レスキューされたｒＡＡＶ０ベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて、または商業的に入手可能なキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット）を使用して、ＤＮＡの形態で精製されうる。

レスキューされたｒＡＡＶ０ベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製されうる。多数の細胞型は、膜微小胞放出により、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸運搬物をも遊離することが、当技術分野で公知である（Ｃｏｃｕｃｃｉら，２００９；ＥＰ １０３０６２２６．１）。そのような小胞には、微小胞（微粒子とも称される）およびエキソソーム（ナノ小胞とも称される）が含まれ、これらは共に、タンパク質およびＲＮＡを運搬物として含む。微小胞は細胞膜の直接的な出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）から生じ、エキソソームは細胞膜との多小胞エンドソームの融合に際して細胞外環境中に放出される。したがって、ｒＡＡＶ０ベクター含有微小胞および／またはエキソソームは、ｒＡＡＶ０ベクターで形質導入された細胞から単離されうる。微小胞は２０，０００ｇでの、そしてエキソソームは１００，０００ｇでの超遠心分離または濾過に培地を付すことにより、それらは単離されうる。超遠心分離の最適な持続時間は実験的に決定されることが可能であり、小胞が単離される個々の細胞型に左右されるであろう。好ましくは、培地が、まず、低速遠心分離（例えば、２０００ｇで５〜２０分間）で清澄化され、例えばＡｍｉｃｏｎ遠心カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用する遠心濃縮に付される。微小胞およびエキソソームは、該微小胞およびエキソソーム上に存在する特異的表面抗原を認識する特異的抗体を使用することにより、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより更に精製されうる。他の微小胞およびエキソソーム精製方法には、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィー、濾過、および特異的抗体またはアプタマーで被覆された磁性ビーズが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製の際に、小胞は例えばリン酸緩衝食塩水で洗浄される。ｒＡＡＶ０小胞を運搬するために微小胞またはエキソソームを使用する１つの利点は、それぞれの細胞型上の特異的受容体により認識されるタンパク質をそれらの膜上に含ませることにより、これらの小胞が種々の細胞型に標的化されうることである（ＥＰ １０３０６２２６．１をも参照されたい）。

前記のとおり、ｒＡＡＶ０ベクターの製造のための宿主細胞はＳｆ９細胞に限定されない。幾つかの実施形態においては、疾患に罹患した対象者から単離された細胞がｒＡＡＶ０ベクターの製造のための宿主細胞として使用されうる。好ましい実施形態においては、該細胞は、該疾患に明確に罹患した組織から単離されうる。例えば、筋細胞は、筋ジストロフィーに罹患した対象者から単離されうる。幾つかの場合、ｒＡＡＶ０ベクターで形質導入された宿主細胞（例えば、培養筋芽細胞）は、ｒＡＡＶ０ベクターを含むエキソソームおよび／または微粒子を活発に放出するであろう。ついで、これらのエキソソームおよび／または微粒子は組織培養上清として集められ、後続のベクター形質導入に使用されうる。一例においては、エキソソームおよび／または微粒子含有培養上清が、例えばＲＰＧＲＩＰ１欠乏症（Ｌｈｅｒｉｔｅａｕら，２００９）または色素性網膜炎（Ｊｉ−ｊｉｎｇ Ｐａｎｇら，２００８）を治療するためにｒＡＡＶ０ベクターを網膜細胞内に運搬するために使用されうる。総説としては、例えばＲｏｌｌｉｎｇら，２０１０を参照されたい。

特定の実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターの製造方法は、
・ＡＡＶ０構築物を含有するプラスミドで昆虫細胞（特にＳｆ９細胞）をトランスフェクトし、
・場合によっては、該プラスミド上に存在する選択マーカーを使用して、クローン性細胞系を樹立させ、
・Ｒｅｐコード遺伝子を（該遺伝子を含有するバキュロウイルスによる感染またはトランスフェクションにより）該昆虫細胞内に導入し、
・該細胞を集め、該ｒＡＡＶ０ベクターを精製する工程を含む。

精製は、特に、細胞ペレットをアルカリ細胞溶解に付し、ライセートを遠心分離し、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ）上に上清をローディングすることにより行われうる。ついで物質を（例えば、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で）溶出し、ゲル濾過カラム（例えば、６ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ ＧＥ）上にローディングする。ついでＡＡＶ０ベクターを沈殿により回収する。

本発明の製造方法により、大量のｒＡＡＶ０ベクターが製造されうる。

もう１つの例においては、ｒＡＡＶ０は、インビトロで幹細胞をトランスフェクトするために使用されうる。これらは、任意の種類の幹細胞、例えば胚性幹細胞、誘導性多能性幹細胞、成体幹細胞および循環または組織存在幹細胞でありうる。具体例には、ＣＤ１３３＋細胞、メサンジオブラスト（ｍｅｓａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）およびＡＬＤＨ＋幹細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの幹細胞はエクスビボで培養され、遺伝子発現の一過性または永続的修飾を誘導するためにｒＡＡＶ０ベクターにより形質導入されうる。一過性修飾は、機能性プロモーターに結合した遺伝子を導入することにより、またはエキソンスキッピング事象（フレームが一致または不一致のもの）を誘導しうるアンチセンス配列に結合したＵ１もしくはＵ７遺伝子を導入することにより、またはトランススプライシング配列を付与することにより、遺伝子発現を誘導、サイレンシングまたは修飾しうるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の形質導入により達成されうる。形質導入が細胞培養の初期継代段階で行われる場合、ｒＡＡＶ０ベクターは後続継代により希釈され、最終的には喪失する、すなわち、これは遺伝子発現の一過性修飾をもたらすであろう。これとは対照的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼまたはＴＡＬエキソヌクレアーゼのようなＤＮＡ切断酵素が導入遺伝子によりコードされている場合、これは受容細胞の永続的（メンデル）遺伝子修飾を引き起こしうる。この場合のＡＡＶ０技術の格別の利点は、通常のＡＡＶベクターにより可能となるものより大きな配列が組込まれることが可能であり、また、相補的運搬物を含有する１つ又は複数のＡＡＶ０ベクターでのトランスフェクションが可能であることにより、これらの細胞内に矯正ＤＮＡマトリックスが同時に導入されうることである。

ＩＩ．ｒＡＡＶ０ベクターの投与
ｒＡＡＶ０ベクターが運搬される細胞はヒトおよび他の哺乳類、例えば霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラットおよびマウスに由来しうる。ｒＡＡＶ０ベクターは、限定的でない任意の細胞型、組織または器官に運搬されうる。ｒＡＡＶ０が運搬される標的となりうる細胞の例には、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）の細胞、筋細胞、骨芽細胞、腫瘍細胞、リンパ球などが含まれるが、これらに限定されるものではない。ｒＡＡＶ０が運搬される標的となりうる組織および器官の例には、筋肉、心筋、平滑筋、脳、骨、結合組織、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、ミエリン、前立腺、精巣、胸腺、甲状腺、気管などが含まれる。好ましい細胞型としては、筋細胞、ＣＮＳの細胞およびＰＮＳの細胞が挙げられる。好ましい組織および器官としては、筋肉、心臓、眼および脳が挙げられる。

標的細胞型が存在する個々の組織に応じて、ｒＡＡＶ０ベクターにおいて外因性ＤＮＡ配列の転写を導く組織特異的プロモーターを組込むことにより、関心のあるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質またはＡＯＮの組織特異的発現が達成されうる。組織特異的プロモーターの例は既に記載されているとおりである。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、ｒＡＡＶ０ベクターを細胞と接触させることを含むいずれかの手段により細胞に運搬されうる。すなわち、ｒＡＡＶ０ベクターは細胞進入用トランスフェクション試薬を絶対に必要とするわけではない。これらは顕著に意外な特性である。なぜなら、この分野における従来の仮説によると、ＡＡＶ粒子による形質導入は、ＡＡＶ粒子のエンドサイトーシス、核へのその細胞内トラフィッキング、およびその核内輸送を含むからである（例えば、Ｄｉｎｇら，２００５を参照されたい）。ついで、包膜されたＡＡＶゲノムが核においてＡＡＶ粒子から放出される。この見解によると、当業者は、無カプシドＡＡＶゲノムの使用は細胞の形質導入を全くもたらさないと予想したであろう。なぜなら、細胞への進入や、核内へのトランスロケーションが不可能であり、またはエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼによるゲノムの分解が生じうるからである。この定説に反して、本発明者らは、無カプシドＡＡＶ０ゲノムが細胞を形質導入し、遺伝子発現が達成可能な機能的形態で核に到達しうることを示した。

したがって、本発明はまた、細胞内へのｒＡＡＶ０ベクターの進入を促進するトランスフェクション剤または追加的な物理的手段の存在下、少なくとも１つのｒＡＡＶ０ベクターを細胞表面と接触させることを含む、細胞における、関心のある核酸の運搬のための方法に関する。本発明はまた、細胞内へのｒＡＡＶ０ベクターの進入を促進するトランスフェクション剤または追加的な物理的手段の存在下、少なくとも１つのｒＡＡＶ０ベクターを細胞表面と接触させることを含む、所望の遺伝子産物またはオリゴヌクレオチドの発現を細胞において引き起こさせるための方法に関する。

ｒＡＡＶ０ベクターは、細胞内への遺伝物質の、トランスフェクション試薬に基づく運搬に代わる、代替手段を提供しうる。しかし、幾つかの実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターは、細胞内への進入を促進するトランスフェクション試薬または物理的手段と共に使用されうる。インビトロでは、ｒＡＡＶ０ベクターは、ＤＮＡを細胞内に運搬するための当技術分野で公知の方法により、細胞内に運搬されうる。例えば、ｒＡＡＶ０ベクターは、標準的なトランスフェクション法（例えば、トランスフェクション試薬、例えば、リポソーム、アルコール、ポリリシンに富む化合物、アルギニンに富む化合物およびリン酸カルシウム）、マイクロインジェクションなどにより細胞内に導入されうる。細胞内への導入の他の方法には、例えば、タンパク質への結合、ナノ粒子、または細胞由来微小胞（例えば、微粒子、エキソソーム）内への封入（パッケージング）が含まれる（ＥＰ １０３０６２２６．１を参照されたい）。

対象者の細胞、組織または器官へのインビボ運搬の場合には、ｒＡＡＶ０］ベクターは、対象者への投与に適した医薬組成物中に配合されうる。典型的には、医薬組成物はｒＡＡＶ０ベクターと医薬上許容される担体とを含む。本明細書中で用いる「医薬上許容される担体」には、生理的に許容されるあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが含まれる。医薬上許容される担体の例には、水、塩類液、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１以上およびそれらの組合せが含まれる。ｒＡＡＶ０ベクターを含む医薬組成物は、例えば、カッコウアザミ、噴霧剤、蛍光懸濁剤、坐剤、点眼剤および注射用懸濁剤として運搬されうる。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、局所、全身、羊膜内、鞘内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝臓内、腎臓内、脳内）、鞘内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内）および粘膜（例えば、経口、直腸、鼻腔内）投与に適した医薬組成物中に配合されうる。高圧静脈内または動脈内注入および細胞内注射、例えば核内マイクロインジェクションまたは細胞質内注射による受動組織形質導入も想定される。

治療目的の医薬組成物は、典型的に、無菌性であり、かつ製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。該組成物は、溶液（水剤）、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高いｒＡＡＶ０ベクター濃度に適した他の秩序だった構造体として製剤化されうる。無菌注射液は、ｒＡＡＶ０ベクター化合物の必要量を、必要に応じて前記の成分の１つ又は組合せと共に、適当なバッファーに配合し、ついで滅菌濾過に付すことにより製造されうる。

ｒＡＡＶ０ベクターのインビボ投与の場合、例えば、静脈内、動脈内注射または流体力学的移動局所性潅流により、ｒＡＡＶ０ベクターの広範な筋肉内分布が達成されうる。運搬の量および方法に応じて、与えられた標的筋肉における筋繊維の２０〜９５％が形質導入されうる。ｒＡＡＶ０ベクターのＣＮＳまたはＰＮＳにおける広範な分布は、ｒＡＡＶ０ベクターを脳脊髄液内に注射することにより、例えば腰椎穿刺（例えば、Ｋａｐａｄｉａら，１９９６）により達成されうる。あるいは、神経細胞を標的化するための、脳の特定の部位への該ベクターの厳密な運搬は、定位固定性マイクロインジェクション技術（Ｓｎｙｄｅｒ−Ｋｅｌｌｅｒら，２０１０）を用いて行われうる。特に好ましい運搬方法は、ｒＡＡＶ０ベクターによりコードされるポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの発現を要する脳または筋肉の特定の領域へｒＡＡＶ０ベクターを運搬する方法である。ｒＡＡＶ０ベクターの直接注射は、皮下、頭蓋内、筋肉内または皮内のいずれであっても、標準的な針およびシリンジ法を用いて、または無針技術により行われうる。前記方法は、医薬上許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物の形態のｒＡＡＶ０ベクターで行われうる。細胞を使用する又は使用しない局所適用も想定され、後者は、表皮水疱症の劣性形態に対する局所製剤としてＡＡＶ０を皮膚上に直接使用する。

核酸分子、例えば本開示のｒＡＡＶ０の運搬のための他の方法は、例えば、Ｂｏａｄｏら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１３０８−１３１５（１９９８）；Ｔｙｌｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２１：２８０−２８４（１９９９）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：５５９２−５５９６（１９９５）；Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１５：７３−１０７（１９９５）；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４９１０−４９１６（１９９８）；Ｔｙｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７０５３−７０５８（１９９９）；Ａｋｈｔａｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２：１３９（１９９２）；“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，（Ａｋｈｔａｒ編，１９９５）；Ｍａｕｒｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−１４０（１９９９）；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３７：１６５−１９２（１９９９）；ならびにＬｅｅら，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２（２０００）に記載されている。これらのプロトコールは、本開示において想定される実質的にあらゆるｒＡＡＶ０ベクターの運搬を補足または相補するために用いられうる。

適当な用量は、治療される個々の細胞型、組織、器官または対象者に左右されるであろう。対象者に投与される場合、用量は、種々の要因のなかでもとりわけ、治療される個々の哺乳動物（例えば、ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、治療される対象者の年齢および全身状態、治療される状態の重症度、問題の個々の治療用ポリペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチド、その投与方法に左右されるであろう。適当な有効量は当業者により容易に決定されうる。

「治療的有効量」は、臨床治験により決定されうる比較的広い範囲内に含まれ、個々の用途に左右されるであろう（神経細胞は非常に少量で済むが、全身注射は大量を要するであろう）。例えば、ヒト対象者の骨格筋または心筋内への直接的なインビボ注射の場合、治療的有効量はｒＡＡＶ０の約１μｇ〜１００ｇのオーダーであろう。ｒＡＡＶ０ベクターを運搬するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合には、治療的有効量は実験的に決定されうるが、１μｇ〜約１００ｇのベクターを運搬すると予想される。

インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０^６細胞）に運搬されるｒＡＡＶ０ベクターの有効量はｒＡＡＶ０ベクターの１〜２０μｇ、好ましくは５〜１５μｇ、より好ましくは８〜１０μｇのオーダーであろう。ｒＡＡＶ運搬物が大きくなればなるほど、高い用量を要するであろう。エキソソームまたは微粒子が使用される場合には、有効なインビトロ用量は実験的に決定されうるが、一般に同じ量のベクターが運搬されると意図されるであろう。

治療は単一用量または複数用量の投与を含みうる。対象者は、２以上の用量、実際には必要に応じて複数用量の投与を受けうる。なぜなら、ｒＡＡＶ０ベクターはウイルスカプシドが存在しないため、抗カプシド宿主免疫応答を惹起しないからである。そのようなものとして、当業者は適当な用量数を容易に決定することが可能である。投与される用量の数は、例えば、１〜１００、好ましくは２〜２０用量のオーダーでありうる。

ＩＩＩ．ｒＡＡＶ０ベクターの治療用途
本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、ポリペプチド、タンパク質または非コードＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドをコードする外因性ＤＮＡ配列を、例えば、筋肉またはＣＮＳの疾患に罹患している対象者の筋肉の細胞およびＣＮＳに運搬するのに特に適している。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターは、疾患または障害において欠損しているペプチドまたはタンパク質の発現が、該疾患または症状に関連した症状の改善をもたらすように、該ペプチドまたはタンパク質から利益が得られうる、そのような多数の神経疾患および神経変性疾患に特に有用である。適用可能な疾患の幾つかの例には、デュシェンヌ筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮、エイズ、ポンペ病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏症、気腫、早老症、ＡＬＳ、てんかん、卒中、高コレステロール血症、インスリン障害（例えば、糖尿病）、成長障害、種々の血液障害（例えば、貧血、サラセミア、血友病）、遺伝的欠損（例えば、嚢胞性線維症）、癌（特に充実性腫瘍）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

幾つかの実施形態においては、ｒＡＡＶ０ベクターは、疾患の発生原因となる異常タンパク質を生成する根本的欠損メカニズムを標的化することにより、異常タンパク質の発現を矯正するために使用されうる。ジストロフィン遺伝子の異常スプライシングは、例えば、ＡＯＮ、Ｕ７またはトランススプライシングカセット（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４；Ｌｏｒａｉｎら，２０１０；ならびに特許出願ＷＯ２００６／０２１７２４、米国仮出願６１／３１４，８３０、米国仮特許出願第６１／２４９，７０２号およびＥＰ ２０１０／０６５１４２（それらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする））をコードするヌクレオチド配列を含有するｒＡＡＶ０ベクターを罹患筋肉組織に使用して矯正されうる。他の実施形態においては、完全長ジストロフィン遺伝子含有ｒＡＡＶ０ベクターが罹患筋肉組織へ運搬されうる。

異常な遺伝子産物の発現に関わる多数の疾患がＡＡＶ０媒介性遺伝子治療の候補となる。例えば、欠損ジストロフィン遺伝子産物により生じるデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に対する遺伝子治療は、対象者の体内の罹患筋肉が治療されうるように該欠損ジストロフィン遺伝子を機能性ジストロフィン遺伝子で置換することを含む。ジストロフィン遺伝子における突然変異は横紋筋におけるジストロフィンの産生不全を引き起こす。しかし、突然変異の度合は表現型の重症度と直接的には相関しない。未熟終止コドンおよびそれに伴う翻訳停止をもたらすアウトオブフレーム欠失またはナンセンス突然変異は、重度の表現型により特徴づけられるジストロフィン欠乏症を引き起こす。インフレーム欠失は通常、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）として公知の、より軽度のミオパシーの原因となる。

ＡＡＶ０ベクター媒介性治療の効力は、関心のあるトランスジーンを発現するｒＡＡＶ０ベクターを、当技術分野において利用可能な動物モデルまたは患者から単離された細胞内に導入することにより確認されうる。２つの十分に特徴づけられた、ＤＭＤに関する遺伝的動物モデルが存在する。ｍｄｘマウスは、完全長野生型ジストロフィンタンパク質の合成を妨げる、ジストロフィン遺伝子のエキソン２３にナンセンス突然変異を含有する。ｍｄｘマウスは変性に対抗する代償メカニズムを示し、これは、機械的損傷を回復させる再生過程を維持しうるであろう。ｍｄｘマウスはＤＭＤの全ての症状を示すわけではなく、その寿命はほぼ正常である。ＧＲＭＤ（ゴールデンレトリバー筋ジストロフィー）のイヌは、リーディングフレームを破壊する、イントロン６におけるスプライス部位突然変異のため、機能性ジストロフィンを欠いている。ＧＲＭＤにおいては、ヒトＤＭＤの場合と同様に、線維の進行性変性が、顕著な筋内膜および筋周膜線維症を伴う骨格筋衰弱を容赦なく引き起こす。ＧＲＭＤは依然として、そのＤＭＤ様表現型のため、ＤＭＤに対する可能な療法の評価のための最良の利用可能なモデルとなっている。

本発明のｒＡＡＶ０ベクターを運搬するための方法は、一般に、通常のウイルスベクターに用いられるものと同じである（例えば、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４；Ｔｏｒｏｍａｎｏｆｆら，２０１０；Ｌｏｗｅｒｙら，２０１０；Ｄｕｑｕｅら，２００９を参照されたい）。ＡＡＶ０ベクターは、カプシドを欠いていても、細胞または核に進入するための形質導入補助を必要としない。したがって、本発明はまた、形質導入補助の使用を伴うことなく細胞、組織または器官を本発明のｒＡＡＶ０ベクターと接触させることを含む、細胞、組織または器官における外因性ＤＮＡの運搬のための方法を提供する。

もう１つの例においては、ｒＡＡＶ０ベクターは、癌の状況における選択的遺伝子導入により、細胞死を誘発するように適合化されうる（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，２０１１を参照されたい）。

また、本発明は、関心のある核酸を含む本発明のｒＡＡＶ０ベクターを対象者に投与することを含む、関心のある核酸の運搬を要する対象者の細胞における、関心のある核酸の運搬のための、非免疫原性である又は低減した免疫原性を有する方法を提供する。また、本発明は、関心のある核酸を含む本発明のｒＡＡＶ０ベクターの複数の投与を含む、関心のある核酸の運搬を要する対象者の細胞における、関心のある核酸の運搬のための方法を提供する。本発明のｒＡＡＶ０ベクターは免疫応答を誘導しないため、包膜ベクターで観察されるものとは逆に、そのような複数の投与方法は本発明のｒＡＡＶ０ベクターに対する宿主免疫系応答により妨げられないであろう。

図１は通常のＡＡＶ（カプシド含有）とｒＡＡＶ０との図示による比較である。通常のＡＡＶベクター（上）はカプシドおよびゲノムの２つの成分を有するが、ｒＡＡＶ０ベクター（下）は無カプシド体である。 図２はｒＡＡＶ０ベクターの合成および下流用途のスキームである。図２ａは、Ｓｆ９細胞においてＡＡＶ０を増幅するために使用されうる５Ｌ バイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、および下流ＡＡＶ０精製法に使用されうるＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １００（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を示す。図２ｂは、Ｓｆ９細胞系を使用するＡＡＶ０増幅法および下流精製法を詳細に示すスキームである。 図３ａは、宿主細胞においてＡＡＶ０を製造するために使用される、ｐＦＢＧＲプラスミドに基づくＡＡＶ０−ＧＦＰプラスミドの図である。ＡＡＶ２由来のＩＴＲがＧＦＰ発現カセットの両末端に隣接している。ＧＦＰ発現カセットは、転写の方向に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ｐ１０プロモーターおよびＧＦＰをコードするＤＮＡ配列、ならびに転写終結配列を含む。 それらの２つのＩＴＲに挟まれており、それらを含む領域の外側に、オルジア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）最初期−１（ＯｐＩＥ−１）プロモーターに機能的に連結されたブラスチシジンＳ−耐性遺伝子が存在する。 図３ｂはＡＡＶゲノム増幅の一般的プロセスの図示である。Ｒｅｐの存在下、ＡＡＶゲノムが宿主ゲノムから取り出され、増幅される（Ｂｅｒｎｓら，２００７；Ｎａｓｈら，２００７）。 図３ｂはＡＡＶゲノム増幅の一般的プロセスの図示である。Ｒｅｐの存在下、ＡＡＶゲノムが宿主ゲノムから取り出され、増幅される（Ｂｅｒｎｓら，２００７；Ｎａｓｈら，２００７）。 図４は、未消化ｒＡＡＶ０ベクター、またはＳｎａＢＩ酵素で消化されたｒＡＡＶ０ベクターのアガロースゲルである。アガロースゲル上のバンドは製造プロセスの終了時のＤＮＡ回収の後のｒＡＡＶ０の種々のコンホメーション（図において右側に示されている）を表す。アガロースゲルの第１レーン内のバンドはＤＮＡサイズマーカーである。「Ｃｔｒｌ」と表示されている第２レーンは未消化ｒＡＡＶ０からのＤＮＡである。ｒＡＡＶ０コンカテマーに対応するバンドが示されている。文字「Ａ」および「Ａ’」は、図において右側に示されているＤＮＡ産物を表す。ｒＡＡＶ０の大部分は単量体形態（二本鎖の又は変換された〜２．５ｋｂ）である。「ＳｎａＢＩ」と表示されている第３レーン内のバンドは、ＳｎａＢＩ酵素で消化されたｒＡＡＶ０からのＤＮＡである。文字「Ｂ」および「Ｃ」は、図において右側に示されているＤＮＡ産物を表す。ＳｎａＢＩ消化は、ＩＴＲを含有する３８０ｂｐの断片（バンド「Ｃ」）を遊離する。 図５は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション試薬として使用してｒＡＡＶ０−ＧＦＰベクターでトランスフェクトされた２９３細胞の蛍光ミクログラフである。１×１０^６個の細胞を５μｇ（左パネル）および９μｇ（右パネル）のｒＡＡＶ０−ＧＦＰで４８時間トランスフェクトした。図５ｂは、Ｘｅｎｏｗｏｒｋｓマイクロインジェクション系（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ＡＡＶ０−ＧＦＰベクターの溶液（０．０２ｍｇ／ｍｌ）で核内（上パネル）または細胞質内（下パネル）にマイクロインジェクションされたＣ２Ｃ１２筋芽細胞の蛍光ミクログラフである。また、テトラメチルローダミン７０，０００ＭＷリシン固定可能デキストラン（Ｓｉｇｍａ）をマイクロインジェクションの領域マーカーとして同時マイクロインジェクションした。マイクロインジェクションの２日後、筋管を、パラホルムアルデヒド３．７％（Ｓｉｇｍａ）を使用して固定し、０．５％ トリトンで透過性亢進させた後、蛍光染色に付した。左パネルは、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）により染色された核を示す。中央パネルはＧＦＰ蛍光を示す。右パネルは、マイクロインジェクション部位の確認（核か細胞質か）を可能にするデキストラン染色を示す。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により駆動される４０×１．０ ＮＡ ＰＬ ＡＰＯ油対物レンズを使用するＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ２カメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｔｉ顕微鏡を使用して、蛍光イメージを得た。 図６ａは、ＡＡＶ０−ＧＦＰ（１ｍｌのＰＢＳ中の１００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰ）が動脈内注射されているマウスの脚の図である。図６ｂは、注射されたマウスの脚（左の２つのパネル）および注射されていないマウスの脚（右の２つのパネル）の蛍光ミクログラフである。それは、ＡＡＶ０−ＧＦＰの動脈内注射を行わなかった場合には、ＧＦＰシグナルが視認されないことを示している（右パネル）。左パネルは、ＡＡＶ０−ＧＦＰの動脈内注射が、２週間後に、該脚においてＧＦＰの効率的発現をもたらすことを示している。図６ｃは該脚の動脈内注射の後の筋組織の凍結切片（横断（左パネル）および縦断（右パネル）１０μｍ筋切片）におけるＧＦＰ発現を示す。核をＤＡＰＩ（青）で対比染色した。 図７は１週間間隔のＡＡＶ０−ＧＦＰの２回の動脈内注射の後のマウスの脚の蛍光ミクログラフである。上パネルの図に示されているとおり、１回目の注射は左脚に行い（１ｍｌのＰＢＳ中の１００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰ）、２回目の注射は右脚に行った（１ｍｌのＰＢＳ中の１００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰ）。マウスを、分析前に、２回目の注射の後８週間、回復させた。下パネルの蛍光ミクログラフは、両脚が、等しい効率で形質導入されたことを示しており、このことは、１回目の注射が２回目の注射に負の影響を及ぼさなかったことを示唆している。 図８は未消化ｒＡＡＶ０ベクター（ＣＭＶプロモーター下でＧＦＰをコードしている）のアガロースゲル（１％）である（３００ｎｇの中央レーンおよび１，５μｇの右レーン）。アガロースゲル上のバンド（２．６ｋベース）は製造プロセスの終了時のＤＮＡ回収の後のｒＡＡＶ０の線状単量体一本鎖構造を表す。アガロースゲルの左レーンのバンドはＤＮＡサイズマーカーである。 図９はＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質）の存在下のＡＡＶｏの電子顕微鏡ミクログラフである。ＡＡＶｏは線状構造として現れ、これは、ＳＳＢ実施形態により表されるとおり一本鎖である。 図１０は、市販のＤＮＡ精製装置（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉキット，Ｑｉａｇｅｎ ＡＡＶｏ）または本発明者らのクロマトグラフィー系（精製ＡＡＶｏ）による精製の後のＡＡＶｏサンプルにおけるタンパク質含有量を示す４〜１２％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。ＧＦＰまたはＵ７のいずれかをコードする種々の量のＡＡＶｏを４〜１２％勾配のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、電気泳動により分離した。タンパク質を銀染色により表示させた。本発明者らのクロマトグラフィー法を用いることによる精製の後でタンパク質汚染物は検出できなかったことに注目されたい。

前記開示は本開示を一般的に説明しているが、これは以下の実施例により更に詳しく説明される。これらの特定の実施例は専ら例示目的で記載されており、本開示の範囲を限定するものではない。同様に、特定の標的、用語および値がここで用いられているが、そのような標的、用語および値は典型的なものであり、本開示の範囲を限定しないと理解されるであろう。

実施例１：ｒＡＡＶ０ベクターの製造のためのｒＡＡＶ０プラスミドの構築
ＡＡＶ０−ＧＦＰプラスミド（「ｐＦＢＧＲ／Ｂｌａｓ」）を以下のとおりに構築した。ブラスチシジンＳ遺伝子（２７８４−３１８３ｂｐ）をオルジア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）最初期−１プロモーター（ＯｐＩＥ−１；２４０１−２６９２ｂｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびＥＭ７プロモーター（２７０７−２７６５ｂｐ）プロモーター［ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＣＡＴプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）におけるもの］と共に、プライマー配列５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＶＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号７）および５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴ−３’（配列番号８）を使用する高忠実度ＰＣＲにより増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、８６５ｂｐ ＰＣＲ産物をＡＡＶ２パッケージングプラスミドｐＦＢＧＲ（Ｕｒａｂｅら，２００２）のＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローニングした。制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定を行って、正しいプラスミドの構築を確認した。

実施例２：ｒＡＡＶ０ベクターの製造および精製
ｐＦＢＧＲ／Ｂｌａｓプラスミドに関して、クローン性Ｓｆ９細胞系を樹立した。Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ−９）細胞をｐＦＢＧＲ／Ｂｌａｓプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、昆虫細胞培養培地（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｉｎｃ．）内で２７℃で３日間、細胞をインキュベートした。ついでブラスチシジンＳ ＨＣｌ（５０μｇ／ｍｌ）を加えて、安定な形質転換体を選択した。２週間の選択期間の後、希釈クローニングおよび直接コロニー転移技術を用いて、独立したクローン細胞系を得た。ブラスチシジンＳ ＨＣｌ選択（１０μｇ／ｍｌ）下で特徴的なコロニーを形成させるために、形質転換細胞を１０％ ＦＢＳ ＨｙＱ増殖培地内で培養し、増殖させた。

ブラスチシジン耐性クローン細胞系を、ＡＡＶ Ｒｅｐ ７８およびＲｅｐ ５２（「Ｒｅｐ−Ｂａｃ」）タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスに個々に感染させ（ＭＯＩ＝５）、ＧＦＰ発現に関してスクリーニングした。Ｒｅｐ−Ｂａｃは、Ｕｒａｂｅら，２００２に記載されているとおりであった。Ｖｉｒａｇら，２００９に記載されているとおり、動物研究のための十分な量が得られるように該組換えバキュロウイルスを産生させた。Ｒｅｐ−Ｂａｃ感染後、蛍光顕微鏡検査下、そしてまた、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ）により、多数の細胞系がＧＦＰを発現することが判明した。染色体外ＤＮＡを該Ｒｅｐ−Ｂａｃ細胞から抽出し、アガロースゲル電気泳動により分析した。Ｒｅｐ−Ｂａｃ感染後の２．６ｋｂのバンドの存在は、「プロウイルス」ｒＡＡＶ０−ＧＦＰゲノムが染色体ＤＮＡから「レスキュー」され、高いコピー数でＡＡＶ ＤＮＡとして複製されたことを示した。

ＡＡＶ０ベクターを単離し、精製するために、クローン性Ｓｆ９細胞系を増殖させ、Ｒｅｐ−Ｂａｃの感染（ＭＯＩ＝１〜３）の時点で２×１０^６細胞／ｍＬで播いた。細胞生存度およびサイズを毎日モニターした（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）。細胞直径の増加はバキュロウイルス感染の成功の指標である。平均細胞直径が１７〜２０μｍに達したら、ＡＡＶ０ベクターを集めた。蛍光顕微鏡検査およびＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるＧＦＰ発現の証明はＳｆ９／ＩＴＲ−ＧＦＰ細胞の効率的なＲｅｐバキュロウイルス感染を示した。ＡＡＶ０−ＧＦＰベクターＤＮＡ抽出をＱｉａｇｅｎミニプレップキットで培養細胞（１ｍＬ）から行って、ＡＡＶ０−ＧＦＰベクターＤＮＡの存在を確認した。より大きな規模のＤＮＡ抽出は、Ｑｉａｇｅｎギガプレップキットを使用して行われうる。

実施例３：インビトロでのｒＡＡＶ０ベクター媒介性遺伝子発現
２９３細胞およびＣ２Ｃ１２細胞の核または細胞質内へのｒＡＡＶ０−ＧＦＰベクターのマイクロインジェクションを、Ｘｅｎｏｗｏｒｋｓマイクロインジェクション系（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。テトラメチルローダミン７０，０００ＭＷ リシン固定可能デキストランをマイクロインジェクションの領域マーカーとして同時マイクロインジェクションした。各をＤＡＰＩで染色した。

更に、通常のプラスミド−ＤＮＡと比較してｒＡＡＶ０の追加的特性を示すために、細胞質内にマイクロインジェクションされた場合にｒＡＡＶ０が細胞を形質導入する能力を試験した。実際には、プラスミド−ＤＮＡは核内に直接運搬される必要があり、細胞質マイクロインジェクションは有効でない。ここでは、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を２日間成長させ、分化させた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の核または細胞質内へのＡＡＶ０−ＧＦＰベクターの溶液（０．０２ｍｇ／ｍｌ）のマイクロインジェクションを、Ｘｅｎｏｗｏｒｋｓマイクロインジェクション系（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。また、テトラメチルローダミン７０，０００ＭＷ リシン固定可能デキストラン（Ｓｉｇｍａ）をマイクロインジェクションの領域マーカーとして同時マイクロインジェクションした。マイクロインジェクションの４８時間後、筋芽細胞を、パラホルムアルデヒド３．７％（Ｓｉｇｍａ）を使用して固定し、０．５％ トリトンで透過性亢進させた。全蛍光染色をＦｌｕｏｒｏｍｏｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）においてマウントした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、核を染色した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により駆動される４０×１．０ ＮＡ ＰＬ ＡＰＯ油対物レンズを使用するＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ２カメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｔｉ顕微鏡を使用して、図５に示されている蛍光イメージを得た。図５ｂを参照されたい。

図５ｂにおける結果（左パネル）は、細胞核が蛍光染料により染色されたことを示しており、そしてそれは、該構築物が核に運搬されたことを示している。ＧＦＰ蛍光はＧＦＰ発現を証明しており、そしてそれは、形質導入されたｒＡＡＶ０−ＧＦＰベクターからの転写を示している。

実施例４：動脈内注射によるインビボでのｒＡＡＶ０ベクター媒介性遺伝子発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを麻酔し、単一手動高圧注射のために右後脚を又は二重手動高圧注射のために両脚を摘出することにより、大腿動脈内へのＡＡＶ０−ＧＦＰベクターの動脈内注射を行った。大腿静脈および２つの側枝を固定した後、カテーテルを大腿動脈内に導入し、１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰベクター調製物を１００ｍｌ／ｓの速度で注射した。注入の１分後、大腿静脈の固定を外し、開放循環に接続した。注入の２週間後、脚をＧＦＰ発現に関して分析した。

実施例５：インビボのｒＡＡＶ０ベクター媒介性遺伝子発現は免疫応答を惹起しない
マウスにＡＡＶ０−ＧＦＰの２回の強力大腿内注射を１週間間隔で行った。１回目の注射は左脚に行い（１ｍｌのＰＢＳ中の１００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰ）、２回目は１週間後に右脚に行った（１ｍｌのＰＢＳ中の１００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰ）。２回目の注射の後８週間、マウスを回復させた後、通常のＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡検査による分析を行った。通常、＞４８時間後のｒＡＡＶの再投与は中和抗体の存在により不可能である（Ｌｏｒａｉｎら，２００８）。１週間後の再注射が対側性脚形質導入の低減を招かないことはｒＡＡＶ０ベクターに対する免疫応答の非存在を示している。

実施例６：網膜下注射によるｒＡＡＶ０ベクター媒介性遺伝子発現
眼窩後注射のために、動物を麻酔し、例えばインスリンシリンジを使用して、４００μＬのＰＢＳ中に２００μｇのＡＡＶ０−ＧＦＰベクターを含有する溶液を眼窩後洞内に注射する。一般に、マウスもしくはラット（Ｔｉｍｍｅｒｓら，２００１）またはイヌもしくは非ヒト霊長類（Ｗｅｂｅｒら，２００３）の網膜下注射には標準的な技術を用いる。ｒＡＡＶ０ベクターは組織特異的プロモーター、例えば細胞特異的Ｇプロテイン共役受容体キナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーターを含有し、これは杆体および錐体光受容体において強固なトランスジーン発現を確立しうる（Ｋｈａｎｉら，２００７）。もう１つのプロモーターの例は、神経網膜を効率的に標的化する遍在性ｓｍＣＢＡプロモーターであろう（Ｈａｉｒｅら，２００６）。これらのプロモーターは、治療されるべき疾患において発現を欠いている所望のトランスジーン、例えばグアニル酸シクラーゼ−１遺伝子（その突然変異はレーバー先天性黒内障（Ｂｏｙｅら，２０１０）を引き起こす）、または同様にレーバー先天性黒内障を引き起こすＲＰＥ６５遺伝子（Ｌｈｅｒｉｔｅａｕら，２０１０）、または突然変異していれば劣性色素性網膜炎を引き起こすＲＤ１０遺伝子（Ｐａｎｇら，２０１１）に、制御要素として連結されうる。遺伝子治療アプローチに適した網膜疾患の総説としては、ＳｔｉｅｇｅｒおよびＬｏｒｅｎｚ，２０１０を参照されたい。典型的には、マウスにおいては０．５〜２μｌまたはイヌもしくは非ヒト霊長類においては５０〜６００μｌの種適合化容量中の５×１０ｅ９〜５×１０ｅ１１個のベクター粒子が、全身麻酔下、網膜下に注射されるであろう。より大きな動物においては、このアプローチは硝子体切除術と組合されうる。典型的には、イヌの場合、強膜切開後に硝子体を介してカニューレを挿入し、タペツム網膜中心の下の網膜下腔を顕微鏡観察制御下で標的化することにより、制御された自動化網膜下注射を行うために、４４ゲージ カニューレ（Ｃｏｒｎｅａｌ）が粘性流体注射（ＶＦＩ）系（Ｄ．Ｏ．Ｒ．Ｃ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に接続されるであろう（Ｗｅｂｅｒら，２００３）。トランスジーン発現は、疾患特異的視覚的機能試験により機能的に、そして標準的な技術（例えば、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫蛍光）により生化学的に調べられるであろう。効力は、当業者に公知の技術（例えば、視力試験、空間配向試験、網膜電図検査、視覚誘発電位）を用いて、視力改善の尺度として決定されうる。測定可能な改善度合が得られると予想される。

実施例７：全身注射によるインビボのｒＡＡＶ０ベクター媒介性遺伝子発現
実施例２および図１に記載されているとおり、尾−静脈注射により、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）にｒＡＡＶ０−ＧＦＰを投与する。ＡＡＶ０−ＧＦＰ調製物は、０．５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１００〜２００μｇのｒＡＡＶ０−ＧＦＰからなる。注射の２週間後から種々の時点でＧＦＰ発現に関して組織（例えば、筋肉、心臓、脳、肝臓、腎臓）を分析する。全てでないとしても多数の器官が形質導入されると予想される。

実施例８：ｒＡＡＶ０ベクターのエキソソームおよび／または微粒子媒介性運搬
本発明は更に、（１）ＤＭＤを有する対象者の筋生検物からの筋芽細胞培養を樹立し、（２）関心のあるＤＮＡをコードするｒＡＡＶ０ベクターで該筋芽細胞培養を形質導入し、（３）該培養からエキソソームまたは微粒子を集め、（４）集めたエキソソームまたは微粒子を該対象者に導入することによる、デュシェンヌ筋ジストロフィーを有する対象者の治療方法を提供する。

ＤＭＤを有する対象者の筋生検物から培養された筋芽細胞を、関心のあるＤＮＡをコードするｒＡＡＶ０ベクターで形質導入する。宿主細胞からの最適なｒＡＡＶ０含有エキソソームまたは微粒子放出を示す実験的に決定された時間の後、培養上清を集め、まず、２０分の時点で２０００ｇで清澄化する。ついで該前清澄化上清を、微粒子の場合には２０，０００ｇで７０分間、エキソソームの場合には１００，０００ｇで７０分間、遠心カラム（例えば、Ａｍｉｃｏｎ遠心カラム；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用して濃縮した。超遠心分離の最適な持続時間は実験的に決定されうる。該微粒子またはエキソソームを含有する超遠心分離ペレットを例えばＰＢＳで洗浄した後、該懸濁化ペレットを直接使用することが可能であり、あるいは例えばＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィーまたは特異的抗体もしくはアプタマーで被覆された磁性ビーズによる、小胞の表面上で発現されることが知られているタンパク質に対する抗体を使用する追加的な精製工程に付すことが可能である。

ついで、精製されたｒＡＡＶ０含有微粒子またはエキソソームを、ＤＭＤを有する対象者の罹患筋肉組織内に直接的に注射し、またはＤＭＤを有する患者から単離された培養幹細胞と共にインキュベートすることが可能である。後者の場合、該微粒子またはエキソソームをインターナリゼーションした培養幹細胞を患者の罹患組織内に再導入することが可能である。

ｒＡＡＶ０ベクターを含有する微粒子またはエキソソームはインターナリゼーションされ、該ベクターは核に進入し、外因性ＤＮＡを発現すると予想される。

実施例９：ｒＡＡＶ０−Ｕ７プラスミドおよびベクターの作製
実施例１に記載されているのと実質的に同じ方法で、ｒＡＡＶ０−Ｕ７プラスミドおよびベクターを作製した。簡潔に説明すると、完全なＵ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子（４４５ｂｐ）を、以下のプライマーを使用するＰＣＲによりマウスゲノムＤＮＡから増幅した：５’−ＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧ−３’（配列番号９）および５’−ＣＡＧＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡ−３’（配列番号１０）。記載されているとおりに（Ｓ１）、Ｓｍドメイン（ＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ；配列番号１１）をｓｍＯＰＴ（ＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ；配列番号１２）に変化させ、ヒストン プレｍＲＮＡ対形成領域を、ａ）ジストロフィン遺伝子のエキソン２３の上流の分岐点にわたる配列（ＢＰ２２：５’−ＡＡＡＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣ−３’；配列番号１３）およびｂ）エキソン２３ドナースプライス部位に直接隣接した配列（ＳＤ２３：５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴ−３’；配列番号１４）に相補的な４４ｂｐにより置換した。ついで、得られたＵ７ｓｍＯＰＴ−ＳＤ２３／ＢＰ２２断片をｐＦＢＧＲ／Ｂｌａｓプラスミド内に導入して、ｒＡＡＶ０−Ｕ７−ｓｍＯＰＴ−ＳＤ２３／ＢＰ２２プラスミドを得た。Ｕ７ ｓｎＲＮＡ構築物の更なる詳細は、２０１０年３月１７日付け出願の共有仮特許出願６１／３１４，８３０（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されうる。Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４も参照されたい。

実施例１０
インビボでのジストロフィンのエキソンスキッピングのためのｒＡＡＶ０−Ｕ７ベクターの治療用途
本発明は更に、実施例４に記載されているとおりの大腿動脈内へのｒＡＡＶ０−Ｕ７の動脈内注射または実施例６に記載されているとおりの全身運搬を用いることによる、デュシェンヌ筋ジストロフィーを有する対象者の治療方法を提供する。ｒＡＡＶ０バックボーンに対する免疫応答の欠如は、実施例５に説明されているとおり標的組織におけるＵ７のレベルが臨床的に妥当になるまで反復治療を行うことをも可能にする。治療用途は、ＤＭＤのよく知られたマウスモデルであるｍｄｘマウスにおいて評価され、該マウスに関しては、ジストロフィン プレｍＲＮＡのエキソン２３をスキッピングすることによる効率的なジストロフィンレスキューを可能にするＵ７手段が開発されている（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４）。治療動物を治療後の種々の時点で犠死させ、ジストロフィンレスキューをＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、スキッピングレベルを決定するため）、ウエスタンブロット、および組織凍結切片上の免疫蛍光（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら，２００４に記載されているとおり）（タンパク質合成および局在化を決定するため）により分析する。

実施例１１：ＡＡＶ０ベクターの構造的特徴づけ
既に記載されているとおりに製造されたｒＡＡＶ０ベクターを、アガロースゲル（１％）電気泳動を用いる構造分析に付した（図８）。該アガロースゲル上のバンド（２．６ｋベース）は製造プロセスの終了時のＤＮＡ回収の後のｒＡＡＶ０の線状単量体一本鎖構造を表す。

該ｒＡＡＶ０ベクターの一本鎖の性質を確認するために、ＳＳＢ（一本鎖結合性タンパク質）の存在下のｒＡＡＶ０ベクターの電子顕微鏡検査も行った。ＡＡＶサンプルを約１５ｎｇ／μｌで１×ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）中で希釈した。ついで３０μｌの該希釈サンプルを１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ Ｔ４ Ｇｅｎｅ ３２タンパク質（これはＳＳＢタンパク質である）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。ついで該サンプルを、１×ＴＥバッファー中で予め平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６濾過カラム上で精製して、過剰なタンパク質を除去した。ついで該サンプルを、炭化されペンチルアミンで官能基化された銅グリッド上で析出させた。それらを酢酸ウラニルで対比染色（ポジティブ染色）し、暗視野透過型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ９０２）下で観察した。図９に示されているとおり、ｒＡＡＶ０は線状構造として現れ、これは、ＳＳＢ結合により示されるとおり、一本鎖である。

クロマトグラフィーまたはＱｉａｇｅｎキットにより精製されたＡＡＶｏにおけるタンパク質汚染を評価するために、ｒＡＡＶｏサンプルを４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、タンパク質に関して銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ，ＢｉｏＲａｄ）した。

以下の２つのタイプのｒＡＡＶｏベクターを試験した：ＣＭＶプロモーター下でＧＦＰをコードするＡＡＶｏ（ＧＦＰ）、およびＵ７ ｓｎＲＮＡの発現カセットを含有するＡＡＶｏ（Ｕ７）。各サンプルに関して、種々の量のＤＮＡをゲル上にローディングした。

１：２００ｎｇ／ｍｌで１５μｌのＡＡＶｏ（Ｕ７）−精製体
２：３５０ｎｇ／ｍｌで１５μｌのＡＡＶｏ（ＧＦＰ）−精製体
３：７００ｎｇ／ｍｌで１５μｌのＡＡＶｏ（Ｕ７）−Ｑｉａｇｅｎ
４：３３００ｎｇ／ｍｌで５μｌのＡＡＶｏ（ＧＦＰ）−Ｑｉａｇｅｎ
５：３５０ｎｇ／ｍｌで１５μｌのＡＡＶｏ（ＧＦＰ）−精製体
６：７００ｎｇ／ｍｌで７．５μｌのＡＡＶｏ（Ｕ７）−Ｑｉａｇｅｎ
７：３３００ｎｇ／ｍｌで１．６μｌのＡＡＶｏ（ＧＦＰ）−Ｑｉａｇｅｎ。

該ゲルは図１０に示されている。精製されたｒＡＡＶ０サンプルにおいて、汚染タンパク質は特定されていない。したがって、ここにおいて特定されている特性は専らｒＡＡＶ０ベクター自体によるものであり、該サンプル中に存在していたであろうヘルパータンパク質によるものではない。

本開示はその種々の実施形態のそれぞれにおいて説明されているが、前記の説明に記載されており以下の特許請求の範囲において更に例示される本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく、それらに対する或る修飾が当業者により施され、達成されうると予想される。本開示は、本明細書に記載されている特定の実施形態により、範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本開示の種々の修飾が前記説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。更に、全ての値は近似値であり、説明のために示されていると理解されるべきである。

本明細書中で言及されている全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許刊行物、図、表およびウェブサイトの全体を参照により明示的に本明細書に組み入れることとする。

種々の実施形態
１．２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）と発現カセットとを含む無カプシドアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ０ベクター）であって、該ＩＴＲのそれぞれは、ヘアピン構造を形成する介在回文配列を有し、該カセットが、外因性ＤＮＡに機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含み、ここで、
該発現カセットが各末端において１つの逆方向末端反復に隣接しており、
該ベクターがＡＡＶカプシドタンパク質をコードしておらず、該ベクターが包膜（カプシド化）されていない、無カプシドアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ０ベクター）。

２．該外因性ＤＮＡが約４，２００〜約１５０００ヌクレオチドを含む、実施形態１記載のＡＡＶ０ベクター。

３．該外因性ＤＮＡが長さにおいて包膜ＡＡＶベクターのパッケージング能を超える、実施形態１記載のＡＡＶ０ベクター。

４．該外因性ＤＮＡ配列がタンパク質をコードしている、実施形態１記載のＡＡＶ０ベクター。

５．該外因性ＤＮＡ配列がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしている、実施形態１記載のＡＡＶ０ベクター。

６．（ａ）２つのＡＡＶ ＩＴＲ、それらのＩＴＲの間に位置する発現カセットを含む細胞を準備し（ここで、該発現カセットは、外因性ＤＮＡに機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含み、ここで、該発現カセットは各末端において１つの逆方向末端反復に隣接しており、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードしておらず、該細胞はＡＡＶカプシドタンパク質を発現しない）、
（ｂ）場合によっては、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子またはタンパク質を、該細胞内に既に存在しない場合に、該細胞内に供与し、しかし、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子またはタンパク質を供与せず、
（ｃ）該ＩＴＲと該発現カセットとを含みＡＡＶ０ベクターを構成するＤＮＡの複製および放出を可能にする条件下、該細胞を増殖させ、
（ｄ）レスキューされたＡＡＶ０ベクターを該細胞から集めることを含む、無カプシドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ０）ベクターの製造方法。

７．工程（ａ）の細胞が選択マーカーを更に含む、実施形態６記載の製造方法。

８．該細胞系がＳｆ９である、実施形態６記載の製造方法。

９．該選択マーカーがブラスチシジンＳ耐性遺伝子である、実施形態７記載の製造方法。

１０．レスキューされたＡＡＶ０ベクターを裸ＤＮＡとして集め、またはエキソソームもしくは微粒子内に取り込ませる、実施形態６記載の製造方法。

１１．該ベクターを、精製された裸ＤＮＡとして集める、実施形態１０記載の製造方法。

１２．該ベクターを集め、微粒子またはエキソソームの形態で精製する、実施形態１０記載の製造方法。

１３．哺乳類細胞において外因性ＤＮＡの発現を引き起こさせるための方法であって、該方法が、
（ａ）２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）と発現カセットとを含む無カプシドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ０）ベクターの有効量を該細胞に運搬し［ここで、該ＩＴＲのそれぞれは、ヘアピン構造を形成する介在回文配列を有し、該カセットは、該外因性ＤＮＡに機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含み、ここで、（ｉ）該発現カセットは各末端において１つの逆方向末端反復に隣接しており、（ｉｉ）該ベクターはＡＡＶカプシドタンパク質をコードしておらず、（ｉｉｉ）該ベクターは包膜されておらず、（ｉｖ）該ベクターは免疫原性ではない］、
（ｂ）該細胞による該外因性ＤＮＡの発現を可能にする条件下、該細胞を増殖させる工程を含み、
該有効量が、該細胞による該外因性ＤＮＡの発現の所望のレベルを可能にするのに十分なものである、方法。

１４．該外因性ＤＮＡの長さが、カプシドを含む通常のＡＡＶベクターのパッケージング能を超える、実施形態１３記載の方法。

１５．該運搬が、細胞外培地内に該ＡＡＶ０ベクターを導入することのみを含み、いずれの他の形質導入手段の使用をも含まない、請求項１３記載の方法。

１６．該外因性ＤＮＡが約４．２ｋｂから約１５ｋｂまでの長さである、実施形態１４記載の方法。

１７．該外因性ＤＮＡが約５ｋｂまでの長さである、実施形態１４記載の方法。

１８．該外因性ＤＮＡが約５ｋｂまでの長さである、実施形態１４記載の方法。

１９．該外因性ＤＮＡが約８ｋｂまでの長さである、実施形態１４記載の方法。

２０．該外因性ＤＮＡが約１０ｋｂまでの長さである、実施形態１４記載の方法。

２１．哺乳動物の器官または組織において外因性ＤＮＡの発現を引き起こさせるための方法であって、該方法が、
（ａ）２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）と発現カセットとを含む無カプシドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ０）ベクターの有効量を該哺乳動物に運搬し［ここで、該ＩＴＲのそれぞれは、ヘアピン構造を形成する介在回文配列を有し、該カセットは、該外因性ＤＮＡに機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含み、ここで、（ｉ）該発現カセットは各末端において１つの逆方向末端反復に隣接しており、（ｉｉ）該ベクターはＡＡＶカプシドタンパク質をコードしておらず、（ｉｉｉ）該ベクターは包膜されていない］、（ｂ）該器官または組織内の細胞が該外因性ＤＮＡの発現を引き起こすのを待つ工程を含み、
該有効量が、該細胞による該外因性ＤＮＡの発現の所望のレベルを可能にするのに十分なものである、方法。

２２．該運搬工程が該哺乳動物への全身運搬を含む、実施形態２１記載の方法。

２３．該外因性ＤＮＡの長さが、カプシドを含む通常のＡＡＶベクターのパッケージング能を超える、実施形態２１記載の方法。

２４．該外因性ＤＮＡが約４．２ｋｂから約１５ｋｂまでの長さである、実施形態２３記載の方法。

２５．該全身運搬が動脈内または筋肉内注射を含む、実施形態２２記載の方法。

２６．該運搬工程が網膜下注射を含む、実施形態２１記載の方法。

２７．該ＡＡＶ０ベクターが、特異的器官または組織において優先的または独占的に該外因性ＤＮＡの発現を導くプロモーターを含む、実施形態２５記載の方法。

２８．該外因性ＤＮＡがＵ７ ｓｎＲＮＡをコードしている、実施形態１３または２１記載の方法。

２９．該外因性ＤＮＡがＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡをコードしている、実施形態１３または２１記載の方法。

３０．該運搬が、細胞内への進入を促進するトランスフェクション試薬または物理的手段の使用を含む、実施形態１３記載の方法。

３１．細胞内への該ｒＡＡＶ０の進入を促進するトランスフェクション試薬または追加的な物理的手段の非存在下で該運搬を行う、実施形態１３記載の方法。

３２．疾患の治療を要する対象者における疾患の治療方法であって、該疾患が、ポリペプチドの非機能的もしくは機能不良類似体の発現における又はポリペプチドの発現の低減もしくは停止による症状を現す遺伝的欠損を含み、該方法が、実施形態１記載のベクターの有効量を該対象者に運搬することを含み、該外因性ＤＮＡが、該欠損をスキップし、矯正し、サイレンシングし又は遮蔽（マスク）して該疾患または障害に関連した症状の改善をもたらすオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、方法。

３３．該方法が、実施形態１記載のベクターの有効量を該対象者に運搬することを含み、該外因性ＤＮＡがＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドをコードしている、実施形態３２記載の方法。

３４．該方法が、実施形態１記載のベクターの有効量を該対象者に運搬することを含み、該外因性ＤＮＡが、該ポリペプチドの少なくとも部分的な機能を回復させることにより疾患関連症状の改善をもたらす発現を示すオリゴまたはポリヌクレオチドをコードしている、実施形態３２記載の方法。

３５．細胞において所望の遺伝子産物またはオリゴヌクレオチドの発現を引き起こさせるための方法であって、該細胞内への該ｒＡＡＶ０の進入を促進するトランスフェクション剤または追加的な物理的手段の非存在下、少なくとも１つのｒＡＡＶ０ベクターを該細胞の表面と接触させることを含む、方法。

３６．ｒＡＡＶ０ベクターに対する宿主の免疫応答を惹起することなく、１以上のｒＡＡＶ０ベクターで特異的タンパク質をコードする又はコードしない所望のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同じ宿主に反復的に投与するための方法。

３７．ウイルスカプシドタンパク質による干渉を伴うことなく、一本鎖線状ＤＮＡ配列が細胞膜を介して細胞内に取り込まれることが可能であり、細胞質から核へ輸送されることが可能である、実施形態１記載のＡＡＶ０ベクター。

Claims (22)

1. 第１アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向反復（ＩＴＲ）、関心のあるヌクレオチド配列および第２ ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序で含み、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠く単離された線状核酸分子。
2. 関心のあるヌクレオチド配列が外因性ＤＮＡの発現カセットである、請求項１記載の単離された線状核酸分子。
3. 核酸分子が一本鎖である、請求項１または２記載の単離された線状核酸分子。
4. ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている、請求項１〜２のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
5. 関心のあるヌクレオチド配列が約４，２００〜約１５０００ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
6. 外因性ＤＮＡ配列がタンパク質またはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしている、請求項２〜５のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
7. 外因性ＤＮＡの発現を優先的または独占的に組織または器官特異的に導くプロモーターを含む、請求項２〜６のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
8. 外因性ＤＮＡがＵ７ ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡをコードしている、請求項２〜７のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
9. 請求項１〜８のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子の製造方法であって、
   （ａ）２つのＡＡＶ ＩＴＲと、該ＩＴＲ間に位置する関心のあるヌクレオチド配列とを含む核酸配列を含む細胞を準備し、ここで、核酸配列は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする遺伝子を欠いており、細胞はＡＡＶカプシドタンパク質を発現せず、
   （ｂ）場合によっては、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子またはタンパク質を、細胞内に既に存在しない場合に、細胞内に供与し、しかし、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子またはタンパク質を供与せず、
   （ｃ）ＩＴＲと発現カセットとを含みＡＡＶ０ベクターを構成するＤＮＡの複製および放出を可能にする条件下、細胞を増殖させ、
   （ｄ）レスキューされたＡＡＶ０ベクターを細胞から集める
   ことを含む、方法。
10. 細胞系がＳｆ９である、請求項９記載の方法。
11. 請求項９または１０記載の方法により入手可能な又は入手した、請求項１〜８のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
12. 哺乳類細胞において外因性ＤＮＡの発現を引き起こさせるためのインビトロ方法であって、
    （ａ）請求項１〜８のいずれか１項または請求項１１記載の単離された線状核酸分子の有効量を細胞に運搬する工程、
    （ｂ）細胞による外因性ＤＮＡの発現を可能にする条件下、細胞を増殖させる工程
    を含み
    有効量が、細胞による外因性ＤＮＡの所望のレベルの発現を可能にするのに十分なものである、方法。
13. 運搬が、単離された線状核酸分子を細胞外培地内に導入することのみを含み、その他の形質導入手段の使用は含まない、請求項１２記載の方法。
14. 細胞において所望の遺伝子産物またはオリゴヌクレオチドの発現を引き起こさせるためのインビトロ方法であって、細胞内へのｒＡＡＶ０の進入を促進するトランスフェクション剤または追加的な物理的手段の非存在下、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１０記載の少なくとも１つの単離された線状核酸分子を細胞の表面と接触させることを含む、方法。
15. 対象者の細胞、器官または組織において外因性ＤＮＡの発現を引き起こす、関心のあるヌクレオチド配列を運搬するための方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１１記載の単離された線状核酸分子。
16. 対象者の、特に哺乳動物の、細胞、器官または組織において外因性ＤＮＡの発現を引き起こさせるための方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１１記載の分子。
17. 疾患の治療を要する対象者において疾患の治療方法に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１１記載の単離された線状核酸分子であって、疾患が、ポリペプチドの発現の低減もしくは停止による又はポリペプチドの非機能的もしくは機能不良類似体の発現による症状を現す遺伝的欠損に関わり、外因性ＤＮＡが、欠損をスキップ、矯正、サイレンシング又は遮蔽することで疾患または障害に付随する症状の改善をもたらすオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、単離された線状核酸分子。
18. 外因性ＤＮＡがＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをコードしている、請求項１７記載の単離された線状核酸分子。
19. 外因性ＤＮＡが、オリゴまたはポリヌクレオチドをコードし、その発現がポリペプチドの少なくとも部分的な機能を回復させることにより疾患関連症状の改善をもたらす、請求項１７記載の単離された線状核酸分子。
20. 運搬工程が、特に動脈内または筋肉内注射による、哺乳動物への全身運搬を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
21. 運搬が、細胞内への進入を促進するトランスフェクション試薬または物理的手段の使用を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法、または請求項１５〜１９のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。
22. 運搬を、細胞内へのｒＡＡＶ０ベクターの進入を促進するトランスフェクション剤または追加的な物理的手段の非存在下で行う、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法、または請求項１５〜１９のいずれか１項記載の単離された線状核酸分子。

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