KR20140023310A - 벡터 제조 및 유전자 전달을 위한 캡시드-결핍 ａａｖ 벡터, 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

제1 아데노-연관 바이러스(AAV) 말단 역반복(ITR), 관심대상인 뉴클레오티드 서열 및 제2 AAV ITR을 순서대로 포함하는 단리된 선형 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있음. 상기 핵산 분자는 면역 반응을 일으키지 않고 반복적으로 숙주에게 적용될 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자의 제조 및 정제 방법, 및 상기 핵산 분자의 치료적 용도가 제공된다.

Description

벡터 제조 및 유전자 전달을 위한 캡시드-결핍 ＡＡＶ 벡터, 조성물 및 방법{CAPSID-FREE AAV VECTORS, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR VECTOR PRODUCTION AND GENE DELIVERY}

본 발명은 표적, 특히 표적 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 외인성, 특히 이종성 DNA 서열을 전달하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이종성 DNA 서열을 표적에 전달하기 위한 바이러스 캡시드 단백질이 결핍된 새로운 네이키드(naked) 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(이하, "AAV0")에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 AAV0 벡터는 외인성 DNA 서열을 표적에게 시험관내, 생체외 또는 생체내 전달하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 AAV0 벡터를 제조하고 정제하는 방법을 제공한다.

유전자 치료법은 질환의 발달의 기저를 이루는 결합 유전자를 보정하는 것을 목적으로 한다. 이러한 과제를 다루기 위한 흔한 접근법에는 정상적인 유전자를 핵에 전달하는 것이 수반된다. 이러한 유전자는 그 후 표적화된 세포의 게놈에 삽입되거나, 또는 에피좀으로 남을 수 있다. 대상체의 표적 세포에 보정(corrective) 유전자를 전달하는 것은 바이러스 벡터의 이용을 포함한 다수의 방법들을 통해 수행될 수 있다. 이용가능한 다수의 바이러스 벡터들(예컨대, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 등) 중에서, 아데노-연관 바이러스(AAV)는 유전자 치료법에서 다재다능한 벡터로서 인기를 얻고 있다.

아데노-연관 바이러스(AAV)는 파르보비리다애 과에 속한다. AAV 게놈은 약 4.7 킬로베이스(kb)를 함유하고 비-구조적 Rep(레플리케이션) 및 구조적 Cap(캡시드) 단백질을 인코딩하는 2개의 주요 오픈 리딩 프레임으로 이루어진 선형 단일가닥 DNA 분자로 구성된다. AAV 코딩 영역을 플랭킹(flanking)하는 것은, DNA 복제의 개시 동안 프라이머로서 작용하는 헤어핀 구조로 폴딩될 수 있는 비연속성(interrupted)의 팔린드롬(palindrome) 서열을 갖는 약 145 뉴클레오티드 길이의 2개의 시스-작용 뉴클레오티드 ITR(inverted terminal repeat: 말단 역반복) 서열이다. DNA 복제에서의 역할 외에, ITR 서열은 바이러스 통합, 숙주 게놈으로부터의 축출, 및 바이러스 핵산의 성숙 비리온으로의 캡시드화에 필요한 것으로 나타났다(Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).

AAV에서 유래된 벡터는 유전 물질을 전달하는데 특히 매력적인데, 그 이유는 (i) 상기 벡터는 매우 다양한 비-분할 및 분할 세포 유형들(근육 섬유 및 뉴런을 포함함)을 감염(형질도입)시킬 수 있고; (ii) 상기 벡터는 바이러스 구조 유전자가 없으므로, 바이러스 감염에 대한 천연적인 숙주 세포 반응, 예컨대 인터페론-매개 반응이 제거되고; (iii) 야생형 바이러스는 인간의 병리학과 전혀 연관되지 않아 왔으며; (iv) 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있는 야생형 AAV와 달리, 레플리케이션-결핍 AAV 벡터는 일반적으로 에피좀으로서 지속됨에 따라, 종양유전자의 활성화 또는 삽입 돌연변이생성의 위험을 제한하고; 및 (v) 다른 벡터계와 달리, AAV 벡터는 유의적인 면역 반응을 유발시키지 않음에 따라(ii 참조), 치료적 이식유전자의 장기간 발현을 허용하기 때문이다(벡터의 유전자 산물이 거부되지 않는다면). 또한, AAV 벡터는 높은 역가에서 생산될 수 있고, 동맥내, 정맥내 또는 복강내 주사는 적어도 설치류에서 단일 주사를 통해 유의적인 근육 영역으로 유전자를 이동시킬 수 있다(Goyenvalle et al., 2004; Fougerousse et al., 2007; Koppanati et al., 2010; Wang et al., 2009). 또한, AAV 벡터는 유전 물질의 전달과 관련하여 플라스미드 DNA에 대해 복수의 장점들을 갖고 있다. 예를 들어, 플라스미드로부터 이종성 유전자의 발현은 단기간이고, 플라스미드는 일반적으로 크기가 더 크고, 플라스미드는 세포에 전달되기 위해 물리적으로 조작될 필요가 있다(예컨대, 미세주사, 형질감염, 전기천공). 또한, 디스트로핀과 같은 유전자의 플라스미드 이동은 숙주에서 면역 반응을 유발하며, 낮은 효율과 연관된다(Romero et al., 2004).

그러나, 유전자 전달 벡터로서 통상의 AAV를 사용하는 것도 또한 다수의 결점들과 연관된다. 첫째, 상기 치료법의 잠재적인 수용체들 중 유의적인 비율이 AAV 벡터의 특정 유형에 대해 이미 혈청 반응 양성이다(Boutin et al., 2010). 둘째, 일부 개개인들에서, AAV 벡터는 바이러스 캡시드 또는 공정 불순물에 의해 매개되는 것과 같은 온화한 숙주 면역 반응을 유발할 수 있다. 이러한 점에서, 면역 반응을 조절하기 위한 면역억제제의 사용은 일시적인 방편일 뿐인데, 그 이유는 대상체에서 상기 면역억제제가 없어지면 면역 반응은 돌아오기 때문이다(Lorain et al., 2008). 아마도, AAV와 연관되는 주요 결점은 약 4.5 kb의 이종성 DNA의 제한된 바이러스 패키징 용량이다(Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010).

이중-벡터 전략을 이용하는 다른 접근법들은 표적 세포에 큰 치료 유전자를 전달하도록 설계된 트랜스-스플라이싱(ts) 및 오버랩핑(ov) AAV 벡터계와 같이 AAV 벡터 패키징 용량을 확장시키기 위해 시도되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Lostal et al.]에서는 엑손 28/29 접합에서 다이스페린(dysferlin) cDNA를 분열시키고, 이것을 적절한 스플라이스 서열을 갖는 2개의 독립적인 AAV 벡터에 클로닝시킴으로써, 근육으로 유전자 이동을 위한 AAV 벡터로 직접 혼입될 수 없는 다이스페린 cDNA에 대해 크기 제한을 우회하였다(Lostal et al., 2010). 그러나, 여전히 이러한 접근법들은 본래의 비효율성이 문제시된다. 따라서, 작은 패키징 용량은 AAV 유전자 치료법에 있어서 주요한 한계점으로 남아 있다. 캡시드는 세포에 벡터가 진입할 수 있도록 하는데 필수적인 것으로 고려되기 때문에, 캡시드의 제거는 패키징 용량을 극복할 수 있는 방법으로 고려되어 오지 않았다.

또다른 주목할만한 결점은, 단일가닥 AAV DNA가 이종성 유전자 발현에 앞서 이중가닥 DNA로 전환되어야 한다면 AAV-매개 유전자 발현이 상대적으로 느리다는 점이다. 이중가닥 DNA 벡터를 구축함으로써 상기 문제를 회피하려는 시도들이 행해져 왔지만, 이러한 전략은 또한 AAV 벡터에 통합될 수 있는 이식유전자 발현 카세트의 크기를 제한한다(McCarty, 2008; Varenika et al., 2009; Foust et al., 2009). 또한, 성장하는 기관에 있어서 효과적인 AAV-매개 유전자 치료법은 분할하는 세포에서 에피좀성 DNA 희석에 기인하여 그의 효과를 상실할 수 있다(Cunningham et al., 2009).

본 발명은 세포, 조직, 기관 또는 대상체에게 외인성 DNA 서열을 시험관내, 생체외 또는 생체내 전달하기 위한 재조합 AAV0("rAAV0") 벡터를 제공함으로써, AAV 벡터와 관련하여 전술한 결점들 일부 또는 전부를 다룬다.

본 발명의 요약

본 발명은 외인성 DNA 서열이 캡시드가 결핍된 AAV 게놈(또는 벡터)(즉, AAV0)에 혼입될 수 있고, 바이러스 캡시드에 의한 흡수 과정의 매개 없이 관심대상인 단백질 또는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데스옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 효과적으로 발현하기 위해 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체로 전달될 수 있다는 발견에 기초한다. 본 발명에 앞서, 캡시드는 세포에 바이러스 벡터를 효과적으로 흡수시키는데 필요한 것으로 고려되었으며, 캡시드를 생략하는 것은 꺼려해왔다. 실제로, AAV 벡터의 정제 방법은 주로 비캡시드화된 DNA를 남겨놓는 캡시드에 대한 항체에 기초하였거나, 또는 임의의 비캡시드화된 DNA를 분해시키는 DNAase를 이용하는 것에 기초하였다.

본 발명의 rAAV0 벡터를 플라스미드-기초 발현 벡터와 구분시키는 구조적 특징들에는, rAAV0 벡터에서 본래의(즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 결핍, rAAV0 벡터는 원핵생물 복제 원점을 결핍한다는 점, rAAV0 벡터는 자가-함유인 점, 즉 rAAV0 벡터는 Rep 결합 부위(RBS: Rep binding site) 및 말단 분해 부위(TRS: terminal resolution site)를 포함한 2개의 ITR 및 ITR 사이의 외인성 서열 이외의 다른 어떠한 서열도 필요로 하지 않는다는 점, 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재, rAAV0 벡터는 진핵생물 기원이라는 점(즉, rAAV0 벡터는 진핵생물 세포에서 생성됨), 및 박테리아-유형 DNA 메틸화 또는 포유류 숙주에 의해 비정상적으로 여겨지는 실제로 임의의 다른 메틸화들의 부재가 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 어떠한 원핵생물 DNA도 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵생물 DNA가 외인성 서열로서 삽입될 수 있다는 점이 고려된다. rAAV0 벡터를 플라스미드 발현 벡터와 구분하는 또다른 중요한 특징은 rAAV0 벡터가 두 개의 단일가닥 또는 이중가닥 선형 DNA로 구성되는 반면, 플라스미드는 항상 이중가닥 DNA로 구성된다는 점이다.

플라스미드-기초 발현 벡터에 대해 본 발명의 rAAV0 벡터가 갖는 이점들에는 하기가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 1) 플라스미드는 박테리아 DNA 서열을 함유하고, 원핵생물-특이적 메틸화, 즉 퓨린 염기 메틸화를 받는 반면, rAAV0 벡터 서열은 진핵생물에 기원함; 2) 플라스미드는 생산 과정 동안 내성 유전자의 존재를 필요로 하는 반면, rAAV0 벡터는 그렇지 않음; 3) 원형 플라스미드는 세포 내에 도입시에 핵에 전달되지 않고, 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해 과다적재(overloading)를 필요로 하는 반면, rAAV0 벡터는 뉴클레아제에 대한 내성을 부여하는 바이러스 시스-성분, 즉 ITR을 함유하고, 핵을 표적으로 하여 전달되도록 설계될 수 있음. ITR 기능에 필수적인 최소 한정 요소는 Rep-결합 부위(RBS; AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3') 및 말단 분해 부위(TRS; AAV2에 대해 5'-AGTTGG-3') 플러스 헤어핀 형성을 허용하는 가변적인 팔린드롬 서열이라는 가설이 제기된다.

통상의 AAV 벡터에 대해 rAAV0 벡터가 갖는 이점에는 하기가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 1) 통상의 AAV 벡터는 숙주 면역 반응을 유발하는 캡시드를 갖는 반면, 캡시드-결핍 rAAV0 벡터는 숙주 면역 반응을 야기하지 않음; 2) 통상의 AAV 벡터는 한정된 적재 용량(약 4.5 kb)을 갖는 반면, rAAV0 벡터는 이러한 한정을 받지 않음, 즉 매우 짧은 서열부터 야생형 AAV 게놈의 적재 용량보다 10% 이상 더 긴 서열, 즉 약 5 kbase 내지 8, 10 또는 심지어 15 kb까지의 서열을 혼입할 수 있음; 3) 통상의 AAV 벡터의 제제는 비균질적인(즉, 완전한 AAV 벡터 및 공동(empty) 캡시드의 혼합물을 함유함) 반면, rAAV0 벡터는 사실상 실질적으로 균질함; 및 4) 통상의 AAV 벡터의 조성물은 정제 이후에도 이종성인 반면, rAAV0 벡터는 균질하고 완전하게 특징화된 최종 산물을 획득할 수 있도록 하는 표준 DNA 분석 기법을 사용하여 완전히 특징화될 수 있음. 또한, rAAV0 벡터의 면역원성의 결핍을 고려해볼 때, 상이한 rAAV0 벡터들의 혼합물은 같거나 다른 경로를 통해 세포, 기관 또는 대상체에 공-투여될 수 있다.

일반적으로, 본 발명은 rAAV0 벡터와 함께, 예를 들어 세포, 기관, 조직 및 대상체에서 단백질 또는 RNA 또는 DNA를 발현하기 위한 상기 벡터의 용도를 제공한다. 이러한 발현은 하나의 단백질 또는 RNA 분자에 한정되지 않으며, 숙주에 전달되는 복수의 개별적 rAAV0 벡터를 통한 복수의 단백질 및/또는 RNA의 발현을 포함할 수 있다. 이러한 형질도입(transduction)은 일시적이거나 또는 영구적일 수 있다. 예를 들어, (예컨대, 메가뉴클레아제 또는 징크 핑거 뉴클레아제를 통해) 숙주 게놈의 영구적인 변형 또는 보정을 유발하기 위한 산물을 인코딩하는 rAAV0 벡터는 숙주에 일시적으로 형질도입될 수 있다. 또다른 측면에서, rAAV0 벡터는 유전자 편집, 예컨대 엑손 스키핑(skipping)에 영향을 미칠 수 있는 코딩 또는 비코딩 DNA를 전달할 수 있다. 또한, 본 발명의 rAAV0 벡터는 근육내 주사, 이어서 제2주사, 바람직하게는 근육내 주사에 의해 단백질 또는 단백질/DNA 혼합물을 인코딩하는 rAAV0 벡터를 전달함으로써 백신화에 이용될 수 있고, 상기 두 번의 주사는 숙주(자신)의 면역 레퍼토리에 의해 인지되지 않는 동일한 항원(단백질)의 발현을 전달한다. 본 발명의 rAAV0 벡터는 유전적 넉아웃 또는 넉인 동물 모델을 생성하기 위한 배아줄기세포(ESC) 또는 난소 세포로의 이식유전자 전달에 대해 유용성을 갖는다. 또한, 본 발명의 rAAV0 벡터는 효소 치료법과 같은 대체 요법을 위한 후속적인 면역 관용을 준비하기 위해, 신생아기에 적용함으로써 유전자 산물에 대해 면역 관용을 유도하는데 사용될 수도 있다(Sun, B, et al Am. J. Hum. Genet. 2007;81:1042-1049). 예를 들어, Balb/c 마우스는 GFP에 대해 민감하고 이에 대해 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응 모두를 시작한다. 태어날 때 GFP 유전자를 함유한 rAAV0을 소량 주사함으로써, 면역 관용이 유도될 수 있으므로, 더 많은 양의 rAAV0 또는 다른 GFP 함유 벡터의 후속 주사는 유의적인 면역 반응을 유발하지 않을 것이다.

일측면에서, 본 발명은 하기를 순서대로 포함하는 단리된 선형 핵산 분자를 제공한다: 제1 아데노-연관 바이러스(AAV) 말단 역반복(ITR), 관심대상인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외인성 DNA의 발현 카세트), 및 제2 AAV ITR, 여기서 상기 핵산 분자는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있음. 추가 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있다(즉, AAV 캡시드 유전자가 결핍되었으며, 또한 다른 바이러스들의 캡시드 유전자도 결핍되어 있음). 또한, 특정 구현예에서, 핵산 분자는 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 또한 결핍되어 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 기능적 AAV cap 및 AAV rep 유전자가 결핍되어 있다.

이에 따라, 본 발명은 2개의 AAV 말단 역반복(ITR) 및 관심대상인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 발현 카세트)을 갖는 최소 rAAV0 벡터를 제공하며, 상기 ITR 각각은 비연속성의(또는 비접경된) 팔린드롬 서열, 즉 하기 3개의 절편으로 구성된 서열을 갖는다: 5'→3'을 판독할 때 동일하지만 서로에 대해 위치될 때 혼성화하는 첫번째 절편과 마지막 절편, 및 상기 동일한 절편들을 분리하는 다른 절편. 상기 서열들, 특히 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 상기 관심대상인 뉴클레오티드 서열은 특히 외인성 DNA 서열에 작동적으로 결합된(operatively linked) 하나 이상의 프로모터를 포함하는 발현 카세트일 수 있으며, 이는 하나의 ITR에 의해 각 말단에서 플랭킹될 수 있다. rAAV0 벡터는 캡시드 단백질을 인코딩하지 않으며, rAAV0 벡터는 캡시드화되지 않는다. rAAV0 벡터는 단일가닥, 이중가닥, 또는 ITR 팔린드롬을 통해 공유 결합된 하나 또는 두개의 말단을 갖는 듀플렉스(duplex)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, rAAV0 벡터는 단일가닥이다.

일구현예에서, 외인성 DNA 서열은 치료 단백질, 예컨대 디스트로핀; LARGE(Barresi et al., 2004); 다이스페린; 칼페인 3; Dux 4; LAMA2; α-, β-, γ- 및 δ-사르코글리칸; FKRP, 후쿠틴, WASP, 제VIII인자, 제IX인자, SMN1, U7, 개질된 U7(미국 가출원 61/314,830 및 WO2006/021724, 이들 두 공보는 본원에 전체로서 참조로 삽입됨), U1, RdCVF(Leveillard et al., 2010), α-글루코시다제, 메가뉴클레아제 또는 징크-핑거 뉴클레아제, 및 액틴을 인코딩한다. 그러나, 원칙적으로는, 돌연변이에 기인하여 감소되거나 사라진 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 유전자, 또는 과발현될 때 치료적 이점을 전달하는 임의의 유전자도 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 고려된다. 또다른 구현예에서, 외인성 DNA 서열은 안티센스 올리고뉴클레오티드("AON") 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩), 예컨대 siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이의 안티센스 대응물(예컨대, antagoMiR)을 인코딩한다. 상기의 경우, 발현될 때 유해한 표현형을 야기하는 돌연변이된 유전자는 치료적 이점을 제공할 수 있도록 침묵될 수 있다. 또다른 구현예에서, rAAV0 벡터는 메가뉴클레아제 또는 징크 핑거 뉴클레아제에 의한 이중가닥 분열 이후에 삽입되는 보정(correcting) DNA 가닥으로서 사용되는 주형 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 rAAV0 벡터는 원한다면 엑스트라바이러스 기원의 다른 도입된 서열들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 형질도입된 세포를 제거하기 위해 소위 자살 유전자가 도입될 수 있다. 그러나, 삽입되지 않은 박테리아 DNA는 존재하지 않으며, 바람직하게는 어떠한 박테리아 DNA도 존재하지 않는다.

또한, 본 발명의 rAAV0 벡터는 관심대상인 뉴클레오티드 서열을 표적 세포에 전달하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 관심대상인 치료 유전자를 대상체의 세포에 전달하기 위한 방법일 수 있다. 본 발명은 대상체의 세포에서 치료적 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 생체내 발현을 가능하게 하여, 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 치료적 수준이 발현되도록 한다. 이러한 결과들은 rAAV0 벡터 전달의 생체내 모델과 시험관내 모델 모두에서 나타난다. 예를 들어, 생체내 근육내 투여에 의해 근육 세포에 외인성 DNA 서열을 전달하는 능력은 유전자 이동 방법을 더욱 효과적이고 간편하게 한다. 따라서, 일구현예에서, 본 발명은 선택된 유전자를 세포, 기관, 또는 조직, 예컨대 골격근 또는 심근으로 전달하는 방법에 관한 것이다.

다만, 본 발명은 근육 세포에서만 선택된 유전자를 전달하고 발현하는 것에 한정되는 것이 아니라, 치료 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드가 발현되기를 원하는 다른 세포 유형들, 예를 들어 신경 세포에도 적용이 가능하다. 따라서, 또다른 구현예에서, 본 발명은 생체내 두개내 또는 척추강내 투여에 의해 원하는 외인성 DNA 서열을 신경 세포로 rAAV0 벡터-매개 전달하는 것에 관련된다.

본 발명은 전달 방법에 관련되어 한정하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 예를 들어, 전달은 국부, 조직내(예컨대, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 결막 (예컨대, 안와외, 안와내, 안와후, 망막내, 망막하), 점막(예컨대, 구강, 직장, 코, 폐), 척추강내, 방광내, 두개내, 전신성, 복강내, 피하, 피부, 혈관내 (예컨대 정맥내, 동맥내), 및 림프내일 수 있다. 또다른 측면에서, 고압 혈관내 주입, 예컨대 정맥내 또는 동맥내 주입을 통한 수동적인 조직 형질도입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사가 또한 고려된다.

또한, 전달은 한 종의 rAAV0 벡터로 한정되지 않는다. 이에 따른 또다른 측면에서, 상이한 외인성 DNA 서열을 포함하는 복수의 rAAV0 벡터가 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체에 동시에 또는 연속적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이러한 전략에 의해 복수의 유전자들의 발현이 가능해질 수 있다. 또한, 전달은 수회 실시될 수도 있고, 바이러스 캡시드의 부재에 기인한 항-캡시드 숙주 면역 반응의 결핍을 고려해볼 때, 임상 셋팅의 유전자 요법에 있어서 중요하게는, 점차 증가하거나 감소하는 투여량으로 실시될 수도 있다. 캡시드가 없기 때문에 어떠한 항-캡시드 반응도 일어나지 않을 것이라는 점이 예상된다. 이는 원한다면 실시예 5에 따라 여러번의 주사에 의해(도 7) 그리고 항체 반응이나 특이적 T 세포 활성화 또는 증식의 측정에 의해 확인될 수 있다. 또한, 이식유전자의 단백질 산물에 대한 면역원성조차도 단일 가닥 rAAV0에 의해 전달된다면 감소될 것으로 기대되는데, 그 이유는 단일 가닥 AAV 벡터가 이중 가닥 AAV 벡터에 비해 강한 선천성 면역 반응을 더 적게 유발할 수 있기 때문이다(Wu et al, 2011).

또다른 측면에서, 본 발명은 캡시드-결핍 rAAV0 벡터의 제조방법, 특히 생체내 실험을 위해 충분한 벡터를 제공하기 위해 수율이 충분히 놓은 방법을 제공한다. 상기 방법에는, 2개의 AAV ITR, ITR들 사이에 위치한 관심대상인 뉴클레오티드 서열(예컨대, 순수 DNA 주형의 전달을 제외하고는, 일반적으로 외인성 DNA에 작동적으로 결합된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 발현 카세트)을 포함하는 세포를 제공하는 단계가 포함된다. 상기 관심대상인 뉴클레오티드 서열은 하나의 ITR에 의해 각 말단에서 플랭킹되고, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하지 않으며, 세포는 AAV 캡시드 단백질을 발현하지 않는다. 상기 세포는 Rep를 이미 함유하고 있거나 또는 Rep 함유 벡터로 형질도입되며, 그 후 ITR 및 발현 카세트를 포함하고 rAAV0 벡터를 구성하는 DNA의 복제 및 방출을 허용하는 조건하에서 성장한다. 이어서, rAAV0 벡터는 자유 방출된 rAAV0 벡터로서 또는 엑소좀 또는 미립자로서 세포 또는 상청액으로부터 수집되고 정제될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 rAAV0 게놈을 자신의 게놈 안으로 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주를 제공한다. 일구현예에서, 숙주 세포주는 무척추동물 세포주, 바람직하게는 곤충 Sf9 세포이다. 또다른 구현예에서, 숙주 세포주는 포유류 세포주, 바람직하게는 293 세포이다. 세포 생산에 있어서 증폭을 위한 AAV0 백본을 도입하기 위해 플라스미드 형질감염(transfection)을 이용하는 것이 포유류(예컨대, 인간)에 대한 생체내 적용에 적합하지 않을지라도, Sf9 세포의 경우에서와 같이 rAAV0의 절제 및 증폭을 허용할 수 있도록 세포 내에 Rep 단백질을 도입하기 위한 헤르페스 바이러스와 같은 제2벡터를 사용하는 것을 고려해볼 수 있다. 또다른 측면에서, Rep-인코딩 유전자는 숙주 세포주(예컨대, Sf9 세포)에 안정적으로 통합될 수 있다. Rep 유전자를 도입하는 수단은 여러 개이다: 예컨대, 플라스미드의 형질감염, Rep를 발현하는 벡터의 감염, Rep를 발현하는 안정적인 세포주. 또다른 구현예에서, 포유류 숙주 세포는 질환을 앓고 있는 대상체로부터 단리된다. 자가조직 숙주 세포는 바람직하게는 질환으로부터 직접 영향을 받고 정상적인 수준의 유전자 산물을 발현하지 못하거나, 돌연변이되어 기능을 상실하거나 기능이 낮아진 유전자 산물을 발현하거나, 또는 비정상적으로 유전자 산물을 과발현하여 질환을 유발하는, 조직으로부터 단리된다.

일측면에서, 숙주 세포는 줄기세포이다. 따라서, rAAV0 형질도입은 예를 들어 특정 줄기세포 군의 일시적 형질도입을 야기할 수 있으며, 여기서 전달된 에피좀성 유전자 또는 비-코딩 RNA가 후속되는 세포 계대에서 희석된다. 선택적으로, 가공된 메가뉴클레아제의 rAAV0-매개 전달은 줄기세포에서 유전적 변형의 지속을 가져올 수 있다(Silva et al., 2011). 이 경우, 메가뉴클레아제 그 자체는 후속되는 세포 분열에서 희석되는 반면, rAAV0-메가뉴클레아제-매개 유전적 변형은 후속되는 세포 분열을 통해 멘델 방식으로 유전될 것이다. 이는 메가뉴클레아제 사용의 주된 결점을 바로잡을 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 rAAV0 게놈을 자신의 게놈으로 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주로부터 rAAV0 벡터를 정제하는 방법을 제공한다. 특히, 플라스미드 백본은 면역원성의 유의적인 위험을 가진 그의 원핵생물 기원을 고려해볼 때 rAAV0 생성에 적합하지 않다. rAAV0 생성은 두 개의 단계를 겪는다: 첫째, Rep 단백질을 통해 벡터 백본으로부터 절제("축출(rescue)"), 및 둘째, Rep 단백질에 의해 삭제된 벡터 게놈의 증폭. AAV0 함유 플라스미드의 단순한 형질감염에 의해서는, 주로 축출된 rAAV0이 증폭이 없거나 증폭이 낮은 채로 생성될 것이다. 이는 AAV0 벡터를 갖는 플라스미드의 추가 결점을 강조한다: 증폭이 더 낮거나 증폭이 없다는 점. 일구현예에서, rAAV0 벡터는 DNA 분자로서 정제된다. 또다른 구현예에서, rAAV0 벡터는 엑소좀 또는 미립자로서 정제된다.

또한, 본 발명은 대상체의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 rAAV0 벡터를 임의적으로는 약학적으로 허용가능한 캐리어와 함께 대상체의 표적 세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 단계를 포함한다. rAAV0 벡터는 캐리어의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 캐리어가 요구되는 것은 아니다. 이용되는 rAAV0 벡터는 상기 질환을 치료하는데 유용한 관심대상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, rAAV0 벡터는 대상체 내에 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩되는 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 유도할 수 있는 조절 성분에 작동적으로 결합된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. rAAV0 벡터는 앞에서 언급되고 본원의 다른 부분에서 언급되는 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 질환은 듀켄근이영양증(DMD: Duchenne muscular dystrophy)이고, 이식유전자는 mdx 마우스 모델에서 엑손 23의 스키핑을 허용하는 적합한 안티센스 서열을 함유하는 최적화된 U7을 인코딩하는 rAAV0 또는 디스트로핀이다(Goyenvalle et al., 2004 참조). 상기 rAAV0-U7 벡터는 예를 들어 주사 부위에 근위의 개로트(garrot)에 의해 정맥 흐름을 병렬적으로 폐색하면서 대퇴 동맥의 동맥내 주사를 통해 투여될 수 있다. 그 결과 엑손 스키핑 및 디스트로핀 복구는 형질도입된 근육 조직에 투여한지 4주가 경과되자마자 곧 관찰될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계에 의해, 대상체의 유전적 또는 후천적 근육 질환 또는 장애를 치료하는(또는, 단순하게는 유전자 또는 억제 유전자를 첨가하는) 방법을 제공한다: (1) 질환을 앓는 대상체의 근육 생검으로부터 근아세포 배양을 구축하는 단계(Bigot et al., 2008　; Benchaouir et al., 2007), (2) rAAV0 벡터를 근아세포 또는 근육 조직에 전달하는 단계, 여기서 상기 벡터는 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩되는 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 유도할 수 있는 조절 성분에 작동적으로 결합된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함함, (3) 배양으로부터 외인성 DNA 서열을 갖는 벡터를 함유하는 엑소좀 또는 미립자를 수집하거나, 또는 DNA 형태의 rAAV0 벡터를 수집하는 단계, 및 (4) 대상체에게 상기 수집된 rAAV0-충진된 엑소좀 또는 미립자 또는 DNA 형태의 rAAV0 벡터를 전달하는 단계. 상기 엑소좀 또는 미립자는 특정 굴성(예컨대, 근육 세포 특이적)을 가질 수 있으며, 이에 따라 인접 세포를 형질도입하는 능력을 가질 수 있다.

또다른 구현예에서, 환자에게서 단리된 줄기세포는 생체외 형질도입되어, 숙주에게서 유전자 산물의 돌연변이에 의해 야기된 결핍증을 보정하거나, 또는 선택적으로는 징크 핑거 뉴클레아제와 같은 rAAV0-인코딩된 DNA-절단 효소를 이용하여 유전적 결함을 보정할 수 있다(Connelly et al., 2010). 또다른 구현예에서, DNA-절단 효소는 메가뉴클레아제이다(Silva et al., 2011). 또다른 구현예에서, DNA-절단 효소는 TAL 이펙터 뉴클레아제이다(Sun et al., 2012).

줄기세포, 예컨대 간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포 및 iPS 세포는 선천적 및 후천적 장애의 잠재적인 세포 및 유전자 치료법에 대해 rAAV0 벡터에 의한 생체외 변형을 위한 매력적인 표적이다. 치료법에 대해 이상적인 이러한 세포 유형들을 만드는 이점들 중에는, 복수 계통으로 분화하는 세포의 능력, 증식하고 자가재생하고 손상 부위로 이동하는 세포의 능력, 및 생체외 형질도입될 때 세포는 하이포(hypo)면역원성이므로 근본적인 결점을 바로잡을 때 숙주 내로 되돌아가는 이식을 가능하게 한다는 점이 포함된다(Li et al., 2009; Benchaouir et al., 2007). 중요하게는, 다수의 줄기세포 유형들이 AAV(Id.)를 포함하여 바이러스 벡터에 의해 비효율적으로 형질도입되지만, rAAV0 벡터는 특히 미립자- 또는 엑소좀-매개 전달과 조합될 때 세포 진입시에 바이러스 캡시드에 대한 비-의존성에 기인하여 상기 단점을 우회할 수 있다. 문헌 [High-Efficiency Transduction of Fibroblasts and Mesenchymal Stem Cells by Tyrosine-Mutant AAV2 Vectors for Their Potential Use in Cellular Therapy. Li M, Jayandharan GR, Li B, Ling C, Ma W, Srivastava A, Zhong L., Hum Gene Ther. 2010; 21:1527-1543] 참조.

rAAV0으로 치료될 수 있는 다른 질환들에는 DMD, 척수성 근위축증, 폼페병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 알츠하이머 질환, ALS, 간질, 뇌졸중, 낭포성 섬유증 및 고형 종양이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환은 DMD이다. 어떠한 면역 반응도 본 발명의 rAAV0 벡터에 대해 예상되지 않기 때문에, 종양이 감소되거나 제거될 때까지 치료를 반복하는 능력에 기인하여 암 치료에 있어서 AAV0을 사용하는 것은 특히 흥미로운 적용이 될 것이다.

본 개시내용의 상기 및 다른 구현예들, 특징들 및 이점들은 하기의 상세한 설명과 특허청구범위에서 명백해질 것이다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 제1 아데노-연관 바이러스(AAV) 말단 역반복(ITR), 외인성 DNA의 발현 카세트 및 제2 AAV ITR을 순서대로 포함하는 단리된 선형 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍된 것이다. 본 발명의 핵산 분자는 캡시드 단백질이 결핍된 rAAV 벡터(rAAV0)이고, 시험관내, 생체외 또는 생체내 이용을 위해 원하는 외인성 DNA 서열을 전달하는데 사용될 수 있다.

본 명세서의 상기 부분과 하기 부분에서 인용되는 공보, 특허 및 특허 출원들 모두는 전체로서 본원에 참조로 삽입된다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는다면 당업계의 기술상식 내에서 바이러스학, 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법들을 이용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 전체로서 설명되어 있다. 예컨대, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijssen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.) 참조.

본 발명의 다양한 조성물들과 방법들은 하기에서 자세하게 개시된다. 본 명세서에서 특정 조성물과 방법이 예시되더라도, 수많은 임의의 대체 조성물과 방법들이 본 발명을 실시하는데 있어서 적용가능하고 적합하다는 점이 이해될 것이다.

정의

달리 나타내지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 것과 동일한 의미를 가지며, 본 발명을 실시하기 위해 당업자의 기술상식 내에서 미생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법들을 이용할 것이다.

"AAV0"라는 용어는 ITR 및 원하는 임의의 적재물, 예컨대 외인성 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오티드 및 프로모터를 함유하지만, 캡시드를 함유하지 않는, 캡시드-결핍 AAV 벡터 구축물을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 캡시드-결핍 AAV 벡터 구축물은 AAV Rep 단백질을 인코딩하는 서열을 함유하지 않는다. 따라서, "AAV0 벡터" 또는 "재조합 AAV0 벡터(rAAV0)"는 최소 성분으로서 2개의 ITR 및 조절 성분에 작동적으로 결합되거나 결합되지 않은 숙주에게 전달되는 외인성 DNA 서열을 포함하는 캡시드-결핍 AAV 구축물을 나타낸다. 모든 ITR이 한 종류의 AAV로부터 기원할 필요는 없다. "AAV0 벡터", "rAAV0 벡터" 및 "본 발명의 핵산 분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

"AAV0-플라스미드"라는 용어는 rAAV0 벡터를 인코딩하고, 박테리아 세포에서 증폭할 수 있고(즉, 플라스미드에 의해 형질전환된 박테리아의 성장을 허용하는 선택적 마커를 갖고), 선형 단일가닥 DNA 또는 결과적으로 이중가닥 DNA인 rAAV0 벡터 그 자체를 생성하기 위한 목적으로 숙주 세포 내에 도입되는, 원형 이중가닥 DNA를 나타낸다.

"말단 역반복" 또는 "ITR"이라는 용어는 대칭성 때문에 이름붙여진 AAV 바이러스 시스-성분을 나타낸다. 이 성분은 AAV 게놈의 효과적인 증식에 필수적이다. ITR 기능에 필수적인 최소 한정 성분은 Rep-결합 부위(RBS; AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3') 및 말단 분해 부위(TRS; AAV2에 대해 5'-AGTTGG-3') 플러스 헤어핀 형성을 허용하는 가변적인 팔린드롬 서열이라는 가설이 제기된다. 본 발명에 따르면, ITR은 적어도 상기 3개의 요소(RBS, TRS 및 헤어핀의 형성을 허용하는 서열)를 포함한다. 또한, 본 발명에서 "ITR"은 공지된 천연 AAV 혈청형의 ITR(예컨대, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 AAV의 ITR), 다양한 혈청형에서 유래한 ITR 성분들의 융합을 통해 형성된 키메라 ITR, 및 이들의 기능적 변이체를 나타낸다. ITR의 기능적 변이체는 공지된 ITR과 서열 상동성이 적어도 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 95%이고, Rep 단백질의 존재하에 상기 ITR을 포함하는 서열의 증식을 가능하게 하고, 형질감염 도움을 필요로 하지 않고 세포의 형질도입을 가능하게 하는(실시예에서 보여진 바와 같음) 서열을 나타낸다.

"투여", "도입" 또는 "전달"이라는 용어는 대상체의 세포에 또는 세포 및/또는 조직 및/또는 기관에 재조합 단백질 또는 뉴클레오티드 발현을 위해 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 전달하는 것을 나타낸다. 상기 투여, 도입 또는 전달은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 발현을 위한 플라스미드는 형질감염(이는 통상적으로 화학적 수단(예컨대, 인산칼슘 형질감염, 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 리포펙션)에 의해 이종성 DNA를 세포 내에 삽입하는 것을 의미함); 물리적 수단(전기천공 또는 미세주사); 감염(이는 통상적으로 감염원, 즉 바이러스(예컨대, AAV Rep 유전자를 발현하는 바큘로바이러스)에 의한 도입을 나타냄); 또는 형질도입(이는 미생물학에서 바이러스에 의한 세포의 안정적인 감염 또는 바이러스 제제(예컨대, 박테리오파지)에 의해 하나의 미생물로부터 다른 미생물로 유전 물질의 이동을 나타냄)에 의해 세포 내에 도입될 수 있다. 재조합 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드 발현을 위한 본 발명에 따른 벡터는 물리적 수단(예컨대, 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 미세주사 또는 리포펙션)에 의해 전달되거나, 또는 세포, 조직, 기관 또는 대상체에게 시험관내, 생체외 또는 생체내 전달하기 위한 약학적으로 허용가능한 캐리어와 함께 벡터를 제조함으로써 전달될 수 있다. 또한, 본 발명의 AAV0 벡터는 물리적 수단 또는 캐리어의 도움 없이 세포에 진입할 수 있다.

통상적으로, "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 각각 일반적으로 4 내지 약 100 베이스를 갖는 더 작은 핵산 단편 또는 일반적으로 더 큰(예컨대, 100 베이스를 초과하여 30 킬로베이스까지) 핵산 분자 및 메신저 RNA(mRNA) 또는 miRNA 단편 또는 분자의 서열에 대해 상보적이거나(안티센스) 또는 동일한(센스) 서열을 나타낸다. 그러나, 본 명세서에서 상기 용어들은 상호교환적으로 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 또한 전사되거나 전사되지 않은 DNA 또는 RNA 분자를 나타낼 수도 있다.

"중추신경계" 또는 "CNS"라는 용어는 당업계에서 알려진 용어의 사용을 나타낸다. CNS는 뇌, 시신경, 뇌신경 및 척수와 관련된다. CNS는 또한 뇌실 및 척수 중심관을 채우는 뇌척수액을 포함한다. 뇌의 영역에는 선조체, 해마, 피질, 기저핵, 시상하부 핵(STN), 대뇌각교뇌 핵(PPN), 흑질(SN), 시상, 피곡, 또는 뇌의 미상 영역, 뿐만 아니라 소뇌, 척수 또는 이의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

"콘카타머화"라는 용어는 반복되는 서열들을 결합하여 폴리뉴클레오티드 분자를 형성하는 것을 나타낸다.

"조절 성분(control element)"이라는 용어는 대상체의 세포, 조직 및/또는 기관에 전달할 때 외인성 DNA 서열의 전사를 유도하거나 제어할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다.

"전환된 이중가닥 형태"라는 용어는 숙주에서 작동적인 최종 rAAV0 형태를 나타낸다.

"외인성 DNA 서열"이라는 용어는 상기 서열이 위치하는 숙주로부터 유래되지 않은 핵산 서열을 나타낸다. 이는 숙주의 DNA와 동일할 수도 있고 이종성일 수도 있다. 그 예는 벡터 내에 삽입된 관심대상의 서열이다. 이러한 외인성 DNA 서열은 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한 다양한 원으로부터 유래될 수 있다. 상기 외인성 DNA 서열은 자연적으로 발생하거나 또는 인위적인 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 상기 게놈 DNA는 프로모터 영역 또는 폴리 A 신호 서열과 공동으로 획득될 수 있다. 본 발명의 외인성 DNA 서열은 cDNA일 수 있다. 외인성 DNA 서열에 포함되는 임의의 DNA 서열(다만, 이에 한정되지 않음)은 그의 발현에 의해 숙주 세포에서 발현되어지는 유전자 산물이 생성된다. 상기 유전자 산물은 숙주 세포의 생리에 영향을 미칠 수 있다. 외인성 DNA 서열에는 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 DNA 서열이 포함될 수 있다.

"엑소좀(exosome)"이라는 용어는 하나 이상의 세포막 단백질로 만들어진 소포를 나타낸다. 소포는 정상적으로는 세포의 식균-리소좀계에서 생성되며, 그 후 세포에 의해 방출되거나, 분비되거나, 또는 "쉐딩(shed)"된다. "미립자"라는 용어는 특이적 단백질 및 RNA 적재량을 함유하는 막-피복 세포 단편을 나타낸다(유럽 출원 10306226.1 참조).

"발현 카세트"라는 용어는 프로모터 또는 이식유전자의 전사를 유도하는데 충분한 다른 조절 서열에 작동적으로 결합된 외인성 DNA 서열을 나타낸다. 적합한 프로모터에는 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 프로모터는 또한 AAV로부터 기원된 것일 수 있다.

"유전자 전달" 또는 "유전자 이동"이라는 용어는 외부 핵산 서열, 예컨대 DNA를 숙주 세포 내에 확실하게 삽입하기 위한 방법 또는 시스템을 나타낸다. 이러한 방법은 통합되지 않은 전달된 DNA의 일과성 발현, 전달된 레플리콘(예컨대, 에피좀)의 염색체외 복제 및 발현, 또는 숙주 세포의 게놈 DNA로 전달된 유전 물질의 통합을 야기할 수 있다. 유전자 이동은 후천적 및 선천적 질환을 치료하기 위한 특별한 접근법을 제공한다.

"유전적 근육 장애"라는 용어는 신경근계 또는 근골격계 질환 또는 장애를 나타내지만 이에 한정되는 것은 아니며, 여기에는 비제한적으로 우성 돌연변이(들), 열성 돌연변이(들), X-결합된 핵 DNA 돌연변이(들) 또는 미토콘드리아 DNA 돌연변이(들)에 의해 야기되는 신경근계 질환이 포함되고; 또한 유전자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있지만 유전자 편집에 영향을 미치는 광범위한 염색질 삭제가 포함된다. 그 예에는 우성 또는 열성의 지대근이영양증, 듀켄 및 베커 MD, 근긴장성근이영양증, 안면견갑상완근이영양증 등이 포함된다.

"숙주 세포"라는 용어는 rAAV 벡터의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된, 예를 들어 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 나타낸다. 이러한 용어에는 형질도입된 본래 세포의 자손이 포함된다. 따라서, "숙주 세포"는 본원에서 일반적으로 외인성 DNA 서열이 형질도입된 세포를 나타낸다. 단일 모세포의 자손은 자연적, 우연적 또는 고의적 돌연변이에 기인하여 형태학적으로 또는 게놈적으로 완전히 동일하다고 할 수 없고 본래 모세포에 대해 전체 DNA가 상보적이라고 할 수 없다는 점이 이해될 것이다.

"신경 세포"라는 용어는 뇌에서 단리된 세포, 중추신경계의 임의 영역의 척수 또는 세포, 뿐만 아니라 대상체의 뇌, 척수 또는 중추신경계에 존재하는 임의의 세포를 나타낸다. 신경 세포의 예에는 뉴런 세포, 예컨대 뇌에 그리고 뇌로부터 신경 또는 화학적 신호를 전송하는 신경 세포, 예컨대 신체의 감각 수용체(눈, 귀 등)에서 CNS로 메세지를 운반하는 감각 뉴런 또는 이극성 뉴런; 근육 및 분비샘에서 CNS로 신호를 운반하는 운동뉴런 또는 다극성 뉴런 세포(예컨대, 척추 운동 뉴런, 각추 뉴런, 푸르키네 세포); CNS 내에서 신경 배선을 형성하는 중간 뉴런 또는 가극성(pseudopolar) 세포가 포함된다. 이는 (축색돌기 및 수상돌기 대신에) 2개의 축색돌기를 갖는다. 신경 세포라는 용어는 또한 뇌의 세포의 90퍼센트를 이루는 교질 세포를 포함하는 것으로 여겨진다. 교질 세포는 신경 자극을 운반하지 않는 신경 세포이다. 교질 세포의 유형에는 쉬반세포, 위성세포, 소교세포, 희돌기교세포 및 성상교세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

"신경퇴행성 장애" 또는 "신경 장애"라는 용어는 신경 세포 또는 신경 세포 군의 형태학적 및/또는 기능적 이상을 야기하는 장애를 나타낸다. 신경퇴행성 장애는 대상체에서 정상적 신경 기능의 손상 또는 부재를 유발하거나, 이상적 신경 기능의 존재를 유발할 수 있다. 예를 들어, 신경퇴행성 장애는 질환, 손상 및/또는 노화의 결과일 수 있다. 형태학적 및 기능적 이상의 비제한적인 예에는 신경 세포의 물리적 퇴화 및/또는 사멸, 신경 세포의 이상적 성장 패턴, 신경 세포들간의 물리적 연결의 비정상, 신경 세포에 의한 신경전달물질과 같은 물질 또는 물질들의 저생산 또는 과생산, 정상적으로 생산하는 물질 또는 물질들에 대해 신경 세포의 생산 실패, 신경전달물질과 같은 물질들의 생성 실패, 및/또는 비정상적 패턴으로 또는 비정상적인 시간에 전기 자극의 전송이 포함된다. 신경퇴화는 대상체의 임의의 뇌 영역에서 발생할 수 있으며, 예를 들어 두부 외상, 뇌졸중, ALS, 다발성 경화증, 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환 및 알츠하이머 질환을 포함하는 다수의 장애들과 함께 나타난다.

rAAV0 벡터와 관련하여 본원에서 사용되는 "작동적으로 결합된"이라는 용어는 rAAV0 벡터의 뉴클레오티드 성분이 선택된 코딩 서열의 작동적 조절을 위해 상호간에 기능적으로 관련된다는 것을 의미한다. 일반적으로, "작동적으로 결합된" 핵산 서열은 접경되고, 분비 리더(secretory leader)의 경우에는 접경되고 리딩 프레임 내에 있다. 그러나, 인핸서는 접경될 필요는 없다.

rAAV0의 측면에서 본원에서 사용되는 "패키징"이라는 용어는 2개의 ITR 성분 사이에 게놈 또는 다른 인코딩 서열 플러스 조절 성분(프로모터), 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 의미한다. 대부분의 경우에, 벡터는 조절 성분, 예를 들어 U7 또는 RNAi 또는 shRNA의 전사를 유도하기 위한 조절 성분을 가질 것이다. 그러나, 다른 경우에는, rAAV0 벡터는 반드시 전사될 필요가 없는 DNA를 전달하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 조절 성분(예컨대, 징크-핑거 또는 TAL 엑소뉴클레아제-매개 또는 메가뉴클레아제-매개 유전자 수선을 위한 보정 매트릭스(correcting matrix))을 결핍할 것이다.

"약학적으로 허용가능한"이라는 용어는 생리학적으로 용인될 수 있고 인간에게 투여될 때 통상적으로 독성 또는 알러지 또는 유사한 부반응, 예컨대 위 불량, 현기증 등을 유발하지 않는 분자체 및 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한"은 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 연방정부 또는 주정부의 규제기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에서 나열된 것을 의미한다.

"폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산의 중합체를 나타내고, 전장길이 단백질 및 이의 단편이 포함된다. 당업자가 인식하듯이, 본 발명에는 또한 아미노산 서열이 약간 변형되거나 공지된 아미노산 서열과 다른 성질을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산도 포함된다. 아미노산 치환은 중립적인 알려진 매개변수들에 의해 선택될 수 있으며, 유발된 점, 결실, 삽입 및 치환 돌연변이와 같은 표준 방법들에 의해 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열 내로 도입될 수 있다. 아미노산 서열의 마이너 변화, 예컨대 보존 아미노산 대체, 소량의 내부 결실 또는 삽입, 및 분자의 말단에서 부가 또는 결실이 일반적으로 바람직하다. 이러한 변형은 아미노산 서열의 변화를 야기하거나, 침묵 돌연변이를 제공하거나, 제한 부위를 변형시키거나, 도는 다른 특이적 돌연변이들을 제공할 수 있다. 부가적으로, 이는 인코딩된 단백질에 대해 유익한 변화를 가져올 수 있다.

"정제된"이라는 용어는 원 물질을 포함하여 관련되지 않는 물질, 즉 불순물의 존재를 감소 또는 제거하는 조건하에서 단리된 물질을 나타낸다. 예를 들어, 정제된 rAAV0 벡터 DNA는 바람직하게는 조직 배양 성분, 오염물질 등을 포함한 세포 또는 배양 성분이 실질적으로 없다. rAAV0을 함유하는 엑소좀 또는 미립자는 80 또는 심지어 60 μm 정도로 작은 입자를 선택하는 전문 세포 분류기를 이용하여 정제될 수 있다. EP 10306226.1 참조.

"실질적으로 없는"은 물질의 분석 시험 측면에서 운용적으로 사용된다. 바람직하게는, 불순물이 실질적으로 없는 정제된 물질은 50% 이상의 순도; 더 바람직하게는, 90% 이상의 순도, 더 바람직하게는 99% 이상의 순도를 갖는다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역검정, 조성 분석, 생물학적 검정, 및 당업계에 알려진 다른 방법들에 의해 평가될 수 있다.

"재조합"이라는 용어는 DNA 재조합(클로닝) 방법을 이용하여 생성되고 본래의 또는 야생형 핵산, 벡터, 폴리펩티드 또는 단백질과는 구별될 수 있는 핵산, 벡터, 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다.

"축출(rescue)"이라는 용어는 예컨대 플라스미드, 이종성 바이러스 게놈(예컨대, 바큘로바이러스), 또는 세포 게놈의 프로바이러스에 함유된, 듀플렉스 분자 형태로부터 AAV0 게놈이 배출되는 것을 나타낸다. 배출 및 복제 과정은 함께 축출을 포함하는 것으로 여겨지는 것이 통상적이다. 복제 및 배출 경로에서 여러 단계들은 시험관내 어세이로부터 추론되었다(Ward and Berns, 1991; Hong et al, 1992; Hong et al., 1994). 요약하면, 재조합 사건은 압출된 듀플렉스 ITR 사이에서 발생하여, 이전에 "말단-없는(no-end)" DNA로서 지칭되는 공유적 폐쇄-말단 복제 중간체를 생성한다(Ni et al., 1994). AAV p5 Rep 단백질 중 어느 하나(Rep 78 또는 Rep 68)는 서열 특이적 DNA 결합 및 절단 활성을 가지며, 폐쇄 말단 기질에 대해 작용한다. Rep 단백질은 ITR의 줄기 영역에 결합하며, 듀플렉스 DNA에 대해 풀림 작용을 하여 단일 가닥 절단 부위, 말단 분해 부위(trs)를 노출시킨다. Rep 단백질 또는 세포 헬리카제 활성은 ITR에 대해 풀림 작용을 하고, 이에 따라 세포 폴리머라제 복합체에 의해 연장되는 자유 3'-OH 기 및 약 125 nt의 5'-오버행(overhang)을 제공한다. 선형 2분자 듀플렉스 분자는 말단-없는(no-end) 중간체의 양쪽 끝에서 말단 분해 사건의 생성물이다. 이제, 2분자 듀플렉스 DNA는 어닐링된 AAV 게놈과 동등하며, 복제는 축출된 프로바이러스 DNA 또는 비리온-유래된 DNA 모두에 대해 구별되지 않게 진행될 수 있다.

"선택성 마커"라는 용어는, 형질감염 또는 세포 내에 외인성 DNA를 도입하기 위한 목적의 다른 과정의 성공 여부를 나타내기 위하여 선택에 적합한 특성을 부여하는 세포 내에 도입된 유전자를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 범위 내에서 선택성 마커로서 고려되는 것은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호로서 사용될 수 있는 임의의 것이다. 그 예에는 형광성 마커, 예컨대 GFP, 세포 선별에 의한 선택을 가능하게 하는 마커 막 펩티드, 및 내성에 의한 선택을 가능하게 하는 항생물질이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

항생물질 및 대사 선택성 마커는 통상적으로 안정적인 진핵생물 세포주를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 항생물질 G418은 진핵생물 세포에 대해 치사적이지만, 원핵생물 효소 네오마이신 포스포트랜스페라제에 의해 불활성화된다. 유사하게, 히그로마이신은 포유류 세포에는 독성이지만, 히그로마이신 포스포트랜스페라제에 의해 불활성화된다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 결핍하여 발달되었다. 이러한 세포는 생존을 위해 외인성 글리신, 히포크산틴 및 티미딘에 의존적이다. 따라서, 안정적인 CHO 세포주는 원하는 이식유전자 및 DHFR를 시스(cis)에서 형질감염시키고 HAT 선택 배지에서 배양함으로써 생산될 수 있다(문헌 [Hacker and Wurn, 2007]에서 리뷰됨).

"대상체"라는 용어에는 인간, 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종들; 가축 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축 포유류, 예컨대 개 및 고양이; 실험 동물, 예컨대 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인 및 신생 대상체 뿐만 아니라 태아는 수컷인지 암컷인지 여부에 무관하게 포함되는 것으로 여겨진다.

"치료 유전자"라는 용어는 유전자가 발현될 때 유전자가 존재하는 세포 또는 조직에 대해 또는 유전자가 발현되는 포유류에 대해 이로운 효과를 부여하는 유전자를 나타낸다. 이로운 효과의 예에는 상태 또는 질환의 징후 또는 증상의 완화, 상태 또는 질환의 예방 또는 억제, 또는 원하는 특질의 수여가 포함된다. 치료 유전자에는 세포 또는 포유류에서 유전적 결함을 부분적으로 또는 전체적으로 보정하는 유전자가 포함된다.

"치료적 유효량"이라는 용어는 원하는 치료 결과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 기간에 대해, 효과적인 양을 나타낸다. 재조합 벡터의 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 원하는 반응을 유발하기 위한 벡터의 능력과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료적으로 이로운 효과가 더 큰 양이다.

"조직-특이적 프로모터"라는 용어는 특정 기관 또는 조직, 예컨대 중추신경계(CNS)의 세포에서 작동할 수 있는 프로모터를 나타낸다. CNS에 대한 프로모터의 비제한적인 예에는 뉴런-특이적 프로모터(예컨대, 신경필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477) 및 교질 특이적 프로모터(Morii et al. (1991) Biochem. Biophys Res. Commun. 175: 185-191)가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 프로모터는 조직 특이적이고 본질적으로 중추신경계 외부에서는 활성이 아니거나, 또는 프로모터의 활성이 다른 계에서보다 중추신경계에서 더 높다. 예를 들어, 척수, 뇌간, (수질, 뇌교 및 중뇌), 소뇌, 간뇌(시상, 시상하부), 종뇌(선상체, 대뇌 피질, 또는 피질내, 전두엽, 측두엽 또는 후두엽), 시상하부 핵(STN), 흑질(SN), 또는 이들의 조합에 대해 특이적인 프로모터. 프로모터의 또다른 예는 CBA(Chicken Beta Actin) 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터, CAG 프로모터(닭 b-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서로 구성됨)(J. Miyazaki, 1989), 간-특이적 TBG 프로모터(α-1 마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서 및 티로이드 호르몬-결합 글로불린 프로모터의 2 복제)(Yang, 1997; Bell, 2011), TetOn/TetOff 박스에 커플링된 CAG 프로모터(CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터)(Lheriteau E, 2010), 천연 인간 U7 프로모터(미국 가출원 61/314,830 및 WO2006/021724, 이들 두 공보는 본원에 전체로서 참조로 삽입됨), 세포-특이적 G 단백질-결합 수용체 키나제 1에 대한 프로모터(Khani SC, 2007) 등이다.

근육 세포 특이적 프로모터도 또한 공지되어 있다(Himeda et al., 2011). 비제한적인 예로서, 근육-특이적 크레아틴 키나제 프로모터, 데스민 프로모터(Li et al., 1993), 미오신 경쇄 프로모터(Cox et al., 1992), 키메라 근육 특이적 프로모터(Frauli et al., 2003) 및 트로포닌 C 프로모터-인핸서(심근)가 있다.

"형질감염"이라는 용어는 세포에 의한 외인성 핵산 분자의 흡수를 나타낸다. 세포는 외인성 핵산이 세포막 내부에 도입되었을 때 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법들은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197 참조. 이러한 기법들은 적합한 숙주 세포 내에 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 도입하는데 사용될 수 있다.

"벡터"라는 용어는 임의의 비-플라스미드 유전적 성분, 예컨대 바이러스, rAAV0, AAV, 파르보바이러스, 비리온 등을 나타낸다.

"생체외 투여"는 일차 세포 또는 전기관이 대상체에서 채취되고, rAAV0 벡터가 세포 내에 전달되고, 같거나 다른 대상체에게 세포가 재투여되는 과정을 나타낸다.

본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 나타내지 않는다면, 인용된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적합하다면 이의 분수(예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것이라고 이해될 것이다. 또한, 임의의 물리적 성질, 예컨대 폴리머 아단위, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에서 인용되는 임의의 수치 범위는 달리 나타내지 않는다면, 인용된 범위 내에서 임의의 정수를 포함하는 것이라고 이해될 것이다.

"약" 또는 "대략"이라는 용어는 값의 통계적으로 유의미한 범위 내를 가리킨다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 자릿수 내, 바람직하게는 50% 내, 더 바람직하게는 20% 내, 더 바람직하게는 10% 내, 더욱더 바람직하게는 5% 내의 정도일 수 있다. "약" 또는 "대략"에 의해 포함되는 허용가능한 차이는 시험되는 특정 계에 의존하며, 당업자에 의해 용이하게 인식될 수 있다.

본 발명의 추가 상세내용은 하기의 섹션에 기재된다:

I. AAV0 플라스미드 구축 및 rAAV0 벡터 생성

바이러스 캡시드는 AAV 벡터의 한정된 패키징 용량에 부분적으로 책임이 있다. AAV0 벡터에 대해 캡시드가 결핍되면, 상기 한정을 우회하게 되고, 원하는 외인성 DNA 서열, 심지어 크기면에서 AAV의 패키징 용량을 실질적으로 초과하는 서열이 AAV0 벡터 내에 혼입되고, 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체 내로 도입될 때 발현될 수 있다. 5, 8, 10 또는 15 kb만큼 큰 삽입물이 본 발명의 핵산 분자(또는 rAAV0 벡터)를 이용하여 성공적으로 형질감염될 것이라는 점이 고려된다. 다수의 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다(NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses, http://oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04). 본 발명의 AAV0 백본은 임의의 AAV 혈청형의 게놈에서 유래될 수 있다. 바람직하게는, AAV 혈청형은 AAV2이다.

지금까지, AAV 게놈 그 자체로는 유전자 치료법을 위한 벡터로서 사용되거나 정제된 적은 전혀 없었다. 즉, 오늘날까지 AAV 바이러스-매개 유전자 이동에 대해 알려져 있는 모든 구현예들에는 AAV 캡시드 단백질 내에 캡슐화된 AAV 바이러스 입자의 이동이 수반된다(예컨대, Doenecke et al., 2010; Wang et al., 2011; Stieger et al., 2010; van der Marel S et al., 2011; Jiminez et al., 2011; White et al., 2011). 문헌 [Doenecke et al]에서는 플라스미드 AAV-매개 유전자 발현에 대해 보고되었지만, 여기에는 박테리아 플라스미드 내에 AAV 서열을 혼입시키는 것이 수반되었다(그러나, 전술한 바와 같이, 플라스미드 백본은 면역원성의 유의적인 위험을 가진 그의 원핵생물 기원을 고려해볼 때 rAAV0 생성에 적합하지 않음. 더욱이, AAV0을 함유하는 플라스미드의 형질감염은 증폭을 시키지 않거나 증폭이 미약한 상태로 축출된 rAAV0을 대부분 생성할 것임). 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/gmap.cgi?result=map&acc=NC_002077&organism=2397에도 역시 AAV의 다양한 서열들이 언급되어 있지만, 캡시드가 없는 것은 포함되어 있지 않다. 이는 캡시드-결핍 AAV0이 고려된 적이 없다는 관점과 일치한다.

따라서, 본 발명은 외인성 DNA에 대한 발현 카세트를 포함하지만 캡시드 코딩 서열이 결핍된 단리된 캡시드-결핍 AAV 게놈에 관한 것이다. 이는 제1의 AAV ITR, 외인성 DNA의 발현 카세트 및 제2의 ITR을 순서대로 포함하는 단리된 선형 핵산 분자에 대응한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 선형 단일가닥 또는 이중가닥 핵산이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단일가닥이다. 이러한 바람직한 구현예의 첫번째 변형예에서, 제1의 ITR은 핵산 분자의 5' 말단에 위치한다. 이러한 바람직한 구현예의 두번째 변형예에서, 제2의 ITR은 핵산 분자의 3' 말단에 위치한다. 이러한 바람직한 구현예의 세번째 변형예에서, 제1의 ITR은 핵산 분자의 5' 말단에 위치하고, 제2의 ITR은 핵산 분자의 3' 말단에 위치한다. 특정 구현예에서, 단리된 핵산 분자 백본은 상기에서 언급된 데이터베이스에서 확인되는 것과 같은 공지된 AAV 게놈으로부터 유래된다. 그러나, 본 발명의 단리된 선형 핵산 분자는 또한 벡터의 구축에 필요한 각 성분들을 제공함으로써, 즉 외인성 DNA 발현 카세트를 플랭킹한 2개의 ITR을 제공함으로써, 유전공학적으로 생성될 수 있다.

특히, 본 발명은 핵산 분자가 선형인 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 AAV 플라스미드에 상응하지 않는다는 점이 이해되어야 한다. 실제로, 플라스미드는 박테리아 기원의 원형 핵산 분자이다. 따라서, 이 경우 본 발명과 플라스미드는, 대상-물질의 구조(특히, 선형 vs 원형) 측면에서, 이들 다른 목적물들을 생산하고 정제하기 위해 사용되는 방법 측면에서(하기 참조), 및 플라스미드에 대해서는 원행생물 타입이고 rAAV0에 대해서는 진핵생물 타입인 이들의 DNA 메틸화 측면에서, 상이하다.

또한, 특히 rAAV0 벡터(본 발명의 핵산 분자)는 재조합 아데노바이러스에서와 같이 다른 바이러스 캡시드 내로 가공된 AAV 게놈(예를 들어, WO 96/18727 참조)과도 다른데, 그 이유는 어떠한 바이러스 캡시드도 갖고 있지 않으며, 캡시드 단백질에 의한 숙주 세포 표면의 간섭 없이 직접적으로 숙주 세포 내에 포함되는 능력, 뿐만 아니라 캡시드 단백질의 간섭 없이 세포질로부터 핵으로 이송되는 능력을 갖기 때문이다. 또한, 본 발명에 따른 rAAV0 벡터는 아데노바이러스 캡시드 또는 실제로 AAV 게놈을 패키징하는데 사용되는 임의의 다른 바이러스 캡시드에 의해 유발되는 숙주에서의 면역 반응을 일으키지 않는다.

일구현예에서, AAV0 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 게놈으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, AAV0 백본은 AAV2 게놈으로부터 유래된다. 또다른 특정 구현예에서, AAV0 백본은 상기 AAV 게놈 중 하나 이상에서 유래된 ITR을 5' 및 3' 말단에 포함하도록 유전공학적으로 가공된 합성 백본이다. 본 발명의 핵산 분자(즉 rAAV0 벡터) 내에 존재하는 2개의 ITR은 같거나 다를 수 있다. 특히, 이들은 동일한 AAV 게놈에서 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자 내에 존재하는 2개의 ITR은 동일하고, 특히 AAV2 ITR일 수 있다.

rAAV0 플라스미드(즉, 나중에 rAAV0 선형 벡터를 생성하는데 사용되는 플라스미드 - 상기에서 주어진 정의들을 참조할 것)는 적어도 전사의 방향에서 작동적으로 결합된 성분들: 5' ITR; 프로모터를 포함하는 조절 성분, 관심대상인 외인성 DNA 서열; 전사 종결 영역; 및 3' ITR을 제공하기 위하여, 공지된 기법들을 이용하여 구축된다. 특히, ITR 내의 뉴클레오티드 서열은 rep 및 cap 코딩 영역을 실질적으로 대체한다. rep 서열은 이상적으로는 헬퍼 플라스미드 또는 벡터에 의해 인코딩되지만, 이는 선택적으로는 rAAV0 플라스미드 그 자체에 의해 함유될 수 있다. 이 경우, rep 서열은 바람직하게는 ITR들 사이에 샌드위치된 영역의 외부에 위치하지만, ITR들 사이에 샌드위치된 영역 내부에 위치될 수도 있다. 원하는 외인성 DNA 서열은 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서(즉, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서) 인코딩된 폴리펩티드, 단백질, 또는 이의 올리고뉴클레오티드의 전사 또는 발현을 유도하는 조절 성분에 작동적으로 결합된다. 상기 조절 성분은 선택된 유전자와 정상적으로 연관되는 조절 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 이종성 조절 서열이 이용될 수 있다. 유용한 이종성 조절 서열에는 일반적으로 포유류 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열에서 유래된 것이 포함된다. 그 예에는 프로모터, 예컨대 SV40 초기 프로모터; 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 말기 프로모터(Ad MLP); 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉석 초기 프로모터 영역(CMVIE); 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터; 합성 프로모터; 혼성 프로모터 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 비-바이러스 유전자, 예컨대 뮤린 메탈로티오네인 유전자에서 유래된 서열이 본원에서 사용될 수도 있다. 이러한 프로모터 서열은 예컨대 Stratagene(San Diego, Calif.)에서 상업적으로 구입가능하다. 선택적으로, 상기 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 임의의 AAV 혈청형의 ITR은 본 발명의 rAAV0 플라스미드에서 5' 및 3' ITR로서 사용하는데 적합할 수 있으며, 다른 AAV 혈청형의 ITR이 5' 및 3' ITR 각각에 대해 사용될 수 있다. 다수의 AAV 혈청형들의 ITR 서열이 공지되어 있다. 예를 들어, 서열번호 1 및 2는 AAV2에 대한 ITR 서열이다. 서열번호 3-6은 각각 AAV1, 3, 4 및 5에 대한 게놈 서열을 제공한다. 이러한 혈청형들의 ITR 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV2, AAV3 및 AAV4에 대한 ITR 서열이 개시되어 있는 문헌 [Chiorini, JA et al, 1997, J. Virol.71(9): 6823-6833 Vol. 71, No. 9] 참조.

rAAV0 플라스미드는 또한 숙주 세포 rAAV0 벡터 생성 세포주의 구축에 있어서 사용하기 위한 선택성 또는 선택적 마커를 포함할 수 있다. 선택적 마커는 프로모터, 예를 들어 오르기이아 슈도츄가타 즉시 초기-1 프로모터(Op IE-1)에 작동적으로 결합된다. 일구현예에서, 선택적 마커는 3' ITR의 다운스트림에서(즉, 3') 삽입될 수 있다. 또다른 구현예에서, 선택적 마커는 5' ITR의 업스트림에서(즉, 5') 삽입될 수 있다. 적합한 선택적 마커에는 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선택적 마커는 예를 들어 블라스티사이딘 S-내성 유전자, 카나마이신, 게네티신 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약물 선택적 마커는 블라스티사이딘 S-내성 유전자이다.

rAAV0 플라스미드 및 벡터에 사용하기에 적합한 외인성 DNA 서열은 바이러스 캡시드에 의해 부여되는 패키징 제약이 없으므로 크기에서 제한되지 않는다. 이와 같이 일부 구현예들에서, 외인성 DNA 서열은 5,000 bp를 초과할 수 있고, 다른 구현예에서 외인성 DNA 서열은 10,000 bp를 초과할 수 있다. 즉, 적어도 10%, 실제로 20% 정도로 AAV 패키징 용량을 초과하고 15 kb만큼 큰 외인성 DNA 서열이 AAV0 벡터 내에 용이하게 혼입될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 외인성 DNA 서열의 정체성에 관해 어떠한 특정 필요조건도 없다. 외인성 DNA 서열은 예를 들어 수용 대상체에서 결핍되거나 상실된 단백질을 인코딩하는 유전자, 또는 원하는 생물학적 또는 치료적 효과(예컨대, 항박테리아, 항바이러스 또는 항종양 기능)를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 또다른 구현예에서, 외인성 DNA 서열은 결함 유전자의 발현을 보정하는 작용을 할 수 있는 유전자 산물 또는 전사물(예컨대, 변형된 U7, 메가뉴클레아제, 트랜스스플라이싱 카세트, 후-전사 가공 메카니즘(예컨대, 스플라이싱)의 제어)을 인코딩할 것이다. 외인성 DNA 서열은 바람직하게는 투여되는 조직과 관련되는 단백질을 인코딩한다. 외인성 DNA 서열은 또한 보정 DNA 가닥을 인코딩할 수 있고, 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩; 예컨대, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이의 안티센스 대응물(예컨대, antagoMiR))를 인코딩할 수 있다.

적합한 외인성 DNA 서열에는 비제한적으로 내분비성, 대사적, 혈액학적, 간, 심혈관, 신경계, 근골격, 비뇨기과, 폐 및 면역 장애, 예를 들어 염증 질환, 자가면역, 만성, 전염성 및 유전적 질환, 예컨대 듀켄근증후군, 척수성 근위축증(SMA), AIDS, 암(특히, 고형 종양), 고콜레스테롤혈증, 인슐린 장애, 예컨대 당뇨병, 성장 장애, 다양한 혈액 장애, 예컨대 다양한 빈혈증, 지중해빈혈 및 혈우병; 유전적 결함, 예컨대 낭포성 섬유증, 고오슈병, 헐러병, 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍증, 기종, 폼페병, 조로증, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 알츠하이머 질환, ALS, 간질, 뇌졸중 등을 치료하는데 사용되는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 서열들이 포함된다.

rAAV0 벡터에 의해 인코딩되는 적합한 이식유전자에는 예를 들어 디스트로핀; LARGE(Barresi et al., 2004); 다이스페린; 칼페인 3; Dux 4; LAMA2; α-, β-, γ- 및 δ-사르코글리칸; FKRP, 후쿠틴, WASP, 제VIII인자, 제IX인자, SMN1, U7, U1, RdCVF(Leveillard et al., 2010), α-글루코시다제, LAMIN A/C, ZMPSTE 4, 및 액틴이 포함된다. 원칙적으로는, 돌연변이에 기인하여 감소되거나 사라진 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 유전자, 또는 과발현될 때 치료적 이점을 전달하는 임의의 유전자도 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 고려된다.

프레임 밖으로 유전자를 스키핑하기 위한 U7 기법을 사용하는 것(Pietri-Rouxel et al., 2010; 미국 가출원 61/314,830 및 WO2006/021724, 이들은 본원에 전체로서 참조로 삽입됨)이 또한 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 이러한 방식으로, 임의의 유전자의 발현이 조절될 수 있다. 본 발명에서, 돌연변이된 형태가 질환의 원인인 것으로 알려져 있지만 유기체 또는 기관의 정상적인 기능에 대해 필수적이지는 않은 유전자(예컨대, SOD1, DM1)의 발현은 U7 시스템을 통해 감소될 수 있다. U7 시스템은 또한 트랜스-스플라이싱을 통해 유전자 보정에 사용될 수 있다(본원에 전체로서 참조로 삽입되는 미국 가특허출원 제61/249,702호, 및 EP2010/065142, 이는 또한 rAAV0 벡터 시스템의 사용을 위해 받아들여짐). 중요하게는, rAAV0 기법은 또한 유전자(예컨대, 우성 돌연변이를 갖는 유전자)의 병렬적(즉, 분리된) 하향조절 및 동일한 유전자의 치환(생리학적 성질을 복구하기 위함)을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 하나의 rAAV0 벡터는 유전자를 셧다운시키는데 사용되고, 다른 벡터는 동일한 유전자의 정상 복제본을 도입하는데 사용되어, 상호간의 간섭을 감소 또는 제거하고 2개의 개입물의 독립적인 투여를 허용한다. 상기 접근법은 예컨대 엑손-스키핑 유도 AON을 인코딩하는 하나의 rAAV0 벡터를 이용하여 유전자 침묵을 위한 프레임외(out-of-frame) 엑손 스키핑(Id.)을 이용하고, 제2의 rAAV0 벡터에 의해 정상적 유전자 복제본을 도입할 수 있으며, 여기서 코돈 최적화는 엑손 스키핑을 도입한 올리고안티센스 서열에 대해 민감하지 않은 정상적 유전자 복제본을 제공한다(예를 들어, 문헌 [Dominquez et al., 2010] 및 [Millington-Ward et al., 2011] 참조). 본 발명에서, 2개의 벡터가 독립적인 방식으로 반복적으로 투여될 수 있고, 이에 따라 표적 조직에서 원하는 발현 수준을 조정할 수 있다는 점은 또한 중요하다. 또다른 구현예에서, 다른 rAAV0 벡터들이 유전자의 다른 이소폼들을 동시적으로 또는 연속적으로 치환하기 위해 병렬적으로 도입될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 rAAV0 벡터의 제조 방법을 제공한다:

- 전술한 바와 같은 rAAV0 플라스미드를 갖는 숙주 세포를 제공하는 단계, 여기서 숙주 세포와 플라스미드는 모두 캡시드 단백질 인코딩 유전자가 결핍된 것임,

- AAV0 게놈의 생성이 허용되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계,

- 세포를 채취하고, 상기 세포로부터 생성된 AAV0 게놈을 단리하는 단계.

상기 방법에서, AAV0 게놈의 생성이 허용되는 조건은 하기에 기재되는 바와 같이 특히 Rep 단백질 발현의 유도를 포함하는 조건이다.

rAAV0 벡터는 세포의 양에 대해 적절하게 눈금매겨진 플라스미드 정제 키트를 이용하여 성공적으로 단리되었다. 예를 들어, Qiagen EndoFree Plasmid 키트는 Sf9 세포로부터 rAAV0을 단리하고 정제하는데 사용되었다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법들은 rAAV0을 위해 개조될 수 있는데, 그 이유는 상기 방법의 원리, 즉 세포 게놈 DNA로부터 저분자량의 DNA를 분획화하는 것과 산물로부터 단백질 및 RNA를 제거하는 것이 동일하기 때문이다.

AAV 벡터를 생성하기 위해 당업계에 알려진 임의의 세포주가 숙주 rAAV0 벡터 생성 세포주로서 사용될 수 있다. 특히, AAV-REP 단백질이 AAV0 게놈 고정을 위해 사용될 수 있는 세포 유형들(예컨대, Sf9, 293 등)이 고려된다. AAV에 의해 감염되는 것으로 알려진 다른 세포주들, 예컨대 Huh-7, HeLa, HepG2, Hep1A, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1180, 단핵구, 및 성숙 및 비성숙 수지상세포가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 목적으로만, 본 출원인은 Sf9 곤충 세포를 이용하여 rAAV0 벡터를 제조하는 방법을 하기에 기재한다.

rAAV0 플라스미드는 당업계에 알려져 있는 시약(예컨대, 리포좀, 인산칼슘) 또는 물리적 수단(예컨대, 전기천공)을 이용하여 일과성 형질감염에 의해 Sf9 세포 내에 도입될 수 있다. 선택적으로, rAAV0 플라스미드를 게놈 내에 안정적으로 통합시킨 안정적인 Sf9 세포주가 구축될 수 있다. 이러한 안정적인 세포주는 전술한 바와 같이 rAAV0 플라스미드 내에 선택적 마커를 혼입시킴으로써 구축될 수 있다.

통상적으로, 캡시드를 가진 AAV 비리온은 rAAV 게놈, Rep 단백질 및 Cap 단백질을 인코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입함으로써 생성된다(Grimm et al., 1998). 상기 헬퍼 플라스미드를 트랜스(trans)로 도입할 때, AAV 게놈은 숙주 게놈으로부터 축출되고(즉, 배출되고 이어서 회수되고), 추가로 캡시드화되어 전염성 AAV가 생성된다. 그러나, 이와 같이 캡시드화된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효과적으로 형질도입한다는 것이 확인되었다. 이와 달리, 캡시드-결핍 AAV0 벡터에 의한 형질도입은 통상의 AAV 비리온으로 형질도입하기 어려운 세포 및 조직 유형들에 대해 매우 효과적인 것으로 본 발명자들에 의해 놀랍게도 확인되었다. 본 발명은 단지 AAV Rep 인코딩 벡터가 트랜스(trans)로 요구된다는 점에서, 상기 통상의 방법들과는 구분될 수 있다. AAV Rep 인코딩 벡터는 예를 들어 Rep 단백질을 발현하는 바큘바이러스의 형태일 수 있다. 전술한 바와 같이, Rep는 다양한 수단들에 의해, 예컨대 플라스미드 형질감염, 바이러스 형질도입, 또는 세포주내 안정적 통합을 통해 도입될 수 있으며, 이에 따라 프로모터 활성화시에 발현이 유도된다. 따라서, AAV Rep 인코딩 벡터가 게놈 내에 rAAV0 플라스미드를 안정적으로 통합시킨 Sf9 세포주 내에 도입되면, rAAV0 벡터는 숙주 게놈으로부터 축출되지만, 비리온 입자로 더 캡시드화되지 않는다. rAAV0 플라스미드가 AAV Rep 단백질 인코딩 뉴클레오티드 서열을 혼입하는 것도 또한 가능하다.

축출된 rAAV0 벡터는 당업계에 공지된 방법들을 이용하거나 시판되는 키트(예컨대, Qiagen miniprep 키트)를 이용하여 DNA의 형태로 정제될 수 있다.

축출된 rAAV0 벡터는 또한 엑소좀 또는 미립자의 형태로 정제될 수 있다. 다수의 세포 유형들이 막 마이크로소포 쉐딩을 통해 복합 단백질/핵산 적재물 뿐만 아니라 가용성 단백질을 배출한다는 점이 당업계에 알려져 있다(Cocucci et al, 2009; EP 10306226.1). 이러한 소포에는 마이크로소포(이는 미립자라고도 지칭됨) 및 엑소좀(이는 나노소포라고도 지칭됨)이 포함되며, 이들 둘 모두는 적재물로서 단백질 및 RNA를 포함한다. 마이크로소포는 원형질막의 직접적인 출아로부터 생성되며, 엑소좀은 원형질막에 의한 다소포성의 엔도좀의 융합시에 세포외 환경으로 배출된다. 따라서, rAAV0 벡터-함유 마이크로소포 및/또는 엑소좀은 rAAV0 벡터로 형질도입된 세포로부터 단리될 수 있다. 마이크로소포는 배양배지를 여과하거나 20,000g에서 초원심분리시킴으로써, 엑소좀은 100,000g에서 초원심분리시킴으로써, 단리될 수 있다. 초원심분리의 최적 기간은 실험적으로 결정될 수 있으며, 이는 소포가 단리되어 나오는 특정 세포 유형에 의존할 것이다. 바람직하게는, 배양배지는 먼저 저속 원심분리(예컨대, 5-20분 동안 2000g)에 의해 클리어링되고, 예컨대 Amicon spin column(Millipore, Watford, UK)을 이용하여 스핀 농축된다. 마이크로소포 및 엑소좀은 마이크로소포 및 엑소좀 상에 존재하는 특이적 표면 항원을 인식하는 특이적 항체를 이용함으로써 FACS 또는 MACS를 통해 추가 정제될 수 있다. 또다른 마이크로소포 및 엑소좀 정제 방법들에는 면역침전, 친화성 크로마토그래피, 여과, 및 특이적 항체 또는 액타머로 코팅된 자성 비드가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 정제시에, 소포는 예컨대 인산완충식염수로 세척된다. rAAV0 소포를 전달하기 위해 마이크로소포 또는 엑소좀을 이용하는 장점 중 하나는, 이들 소포는 각 세포 유형들에 대해 특이적 수용체에 의해 인식되는 막 단백질 상에 포함됨으로써 다양한 세포 유형들로 표적화될 수 있다는 점이다(또한, EP 10306226.1 참조).

전술한 바와 같이, rAAV0 벡터 생성을 위한 숙주 세포는 Sf9 세포로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질환을 앓는 대상체에서 단리된 세포가 rAAV0 벡터 생성을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 질환에 의해 특이적으로 영향받는 조직으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포는 근이영양증으로 고통받는 대상체에서 단리될 수 있다. 일부 경우에, rAAV0 벡터-형질도입된 숙주 세포(예컨대, 배양된 근아세포)는 rAAV0 벡터를 포함하는 엑소좀 및/또는 미립자를 활발하게 쉐딩할 것이다. 그 후, 이들 엑소좀 및/또는 미립자는 조직 배양 상청액으로서 채취될 수 있고, 후속되는 벡터 형질도입을 위해 사용될 수 있다. 일례로서, 엑소좀 및/또는 미립자-함유 배양 상청액은 예를 들어 RPGRIP1 결핍증(Lheriteau et al., 2009) 또는 색소성망막염(Ji-jing Pang et al., 2008)을 치료하기 위해 망막 세포에 rAAV0 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 리뷰를 위해, 문헌 [Rolling et al., 2010] 참조.

특정 구현예에서, rAAV0 벡터의 제조방법은 하기 단계를 포함한다:

- AAV0 구축물을 함유하는 플라스미드에 의해 곤충 세포(특히, Sf9 세포)를 형질감염시키는 단계,

- 선택적으로, 플라스미드에 존재하는 선택적 마커를 이용하여 클론 세포주를 수립하는 단계,

- 상기 곤충 세포 내에 (상기 유전자를 함유하는 바큘로바이러스에 의한 감염 또는 형질감염에 의해) Rep 코딩 유전자를 도입하는 단계,

- 세포를 채취하고, rAAV0 벡터를 정제하는 단계.

특히, 정제는 세포 펠릿을 알칼리 용균시키고, 용균액을 원심분리하고, 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼(예컨대 Sartobind Q)상에 상청액을 로딩시킴으로써 수행될 수 있다. 그 후, 물질은 (예컨대, 1.2M NaCl 용액으로) 용출되고, 겔 여과 컬럼(예컨대, 6 패스트 플로우 GE)상에 로딩된다. 그 후, AAV0 벡터는 침전에 의해 회수된다.

본 발명의 제조방법 덕분에, 다량의 rAAV0 벡터가 생성될 수 있다.

또다른 예에서, rAAV0 벡터는 시험관내에서 줄기세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 이는 임의 종류의 줄기세포, 예컨대 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 성체줄기세포, 및 순환 또는 조직-거주 줄기세포일 수 있다. 그 예에는 CD 133+ 세포, 메산지오블라스트 및 ALDH+ 줄기세포가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 줄기세포는 생체외에서 배양되고 rAAV0 벡터에 의해 형질도입되어 유전자 발현의 일과성 또는 영구적 변형을 유발할 수 있다. 일과성 변형은, 기능적 프로모터에 커플링된 유전자를 도입함으로써, 또는 엑손 스키핑 사건(프레임내 또는 프레임외)을 유도할 수 있는 안티센스-서열과 커플링된 U1 또는 U7 유전자를 도입함으로써, 또는 트랜스-스플라이싱 서열을 부여함으로써, 유전자 발현을 유도, 침묵 또는 변형시킬 수 있는 DNA 또는 RNA 서열의 형질도입에 의해 달성될 수 있다. 형질도입이 세포 배양의 초기 계대 시기 동안 수행된다면, rAAV0 벡터는 후속되는 계대를 통해 희석될 것이고 결국 상실될 것이다, 즉 이는 유전자 발현의 일과성 변형을 야기할 것이다. 이와 달리, 이동된 유전자에 의해 DNA-절단 효소, 예컨대 징크-핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제 또는 TAL 엑소뉴클레아제가 인코딩된다면, 이는 수용체 세포의 영구적(멘델) 유전자 변형을 야기할 수 있다. 본 발명에 있어서, 통상의 AAV 벡터에 의해 허용되는 것보다 더 큰 서열을 혼입하는 능력에 기인할 뿐만 아니라, 상보적 적재물을 함유하는 하나 또는 복수의 AAV0 벡터에 의한 형질감염의 가능성에 기인하여, 보정 DNA 매트릭스는 상기 세포들 내에 동시적으로 이동될 수 있다는 점은 AAV0 기법의 특정 이점이다.

II. rAAV0 벡터의 투여

rAAV0 벡터가 전달되어지는 세포는 인간, 및 다른 포유류들, 예컨대 영장류, 말, 양, 염소, 돼지, 개, 래트 및 마우스로부터 유래될 수 있다. rAAV0 벡터는 비제한적으로 임의의 세포 유형, 조직 또는 기관에 전달될 수 있다. rAAV0이 전달되어질 수 있는 세포의 예에는 중추신경계(CNS)의 세포, 말초신경계(PNS)의 세포, 근세포, 골아세포, 종양세포, 림프구 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. rAAV0 벡터가 전달되어질 수 있는 조직 및 기관의 예에는 근육, 심근, 평활근, 뇌, 뼈, 결합 조직, 심장, 신장, 간, 폐, 림프절, 유선, 미엘린, 전립선, 고환, 흉선, 갑상선, 기도 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 세포 유형은 근세포, CNS의 세포, 및 PNS의 세포이다. 바람직한 조직 및 기관은 근육, 심장, 눈 및 뇌이다.

표적 세포 유형이 있는 특정 조직에 따라, 관심대상인 DNA, RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 AON의 조직-특이적 발현은, rAAV0 벡터에서 외인성 DNA 서열의 전사를 유도하는 조직-특이적 프로모터를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 조직-특이적 프로모터의 예는 앞서 기재된 바와 같다.

본 발명의 rAAV0 벡터는 rAAV0 벡터를 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 임의의 수단에 의해 세포에 전달될 수 있다. 즉, rAAV0 벡터는 세포 진입을 위해 형질감염 시약을 전혀 필요로 하지 않는다. 이는 매우 예측하기 어려운 성질인데, 그 이유는 당업계의 전통적인 가설에 따르면, AAV 입자에 의한 형질도입에는 AAV 입자의 엔도사이토시스, 핵에 대한 AAV 입자의 세포내 트래피킹, 및 AAV 입자의 핵 가져오기가 포함되기 때문이다(예를 들어, 문헌 [Ding et al., 2005] 참조). 그 후, 캡시드화된 AAV 게놈은 AAV 입자로부터 핵에 배출된다. 이러한 점에 따르면, 당업자라면 캡시드-결핍 AAV 게놈을 사용할 경우 세포에 진입할 수 없거나, 핵 내에 이동될 수 없거나, 또는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제에 의한 게놈의 분해가 있을 수 있다는 점 때문에 세포의 어떠한 형질도입도 유발하지 않을 것이라고 예상하게 될 것이다. 상기 도그마와는 달리, 본 발명자들은 캡시드-결핍 AAV0 게놈이 세포를 형질도입할 수 있고, 유전자 발현이 달성될 수 있는 기능적 형태로 핵에 도달할 수 있다는 것을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 또한 세포 내 관심대상인 핵산의 전달 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 형질감염제 또는 세포 내에 상기 rAAV0 벡터의 진입을 촉진하는 부가적인 물리적 수단들의 부재하에 하나 이상의 rAAV0 벡터를 세포의 표면과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 세포 내에서 원하는 유전자 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현을 유발하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 형질감염제 또는 세포 내에 상기 rAAV0 벡터의 진입을 촉진하는 부가적인 물리적 수단들의 부재하에 하나 이상의 rAAV0 벡터를 세포의 표면과 접촉시키는 단계를 포함한다.

rAAV0 벡터는 세포 내에 유전 물질의 형질감염 시약-기초 전달에 대한 대안을 나타낼 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, rAAV0 벡터는 형질감염 시약 또는 세포내 진입을 촉진하는 물리적 수단과 결합되어 사용될 수 있다. 시험관내에서, rAAV0 벡터는 세포 내에 DNA를 전달하기 위해 당업계에 알려진 방법들에 의해 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, rAAV0 벡터는 표준 형질감염 방법(예컨대, 형질감염 시약, 예컨대 리포좀, 알콜, 폴리리신-풍부 화합물, 아르기닌-풍부 화합물 및 인산칼슘), 미세주사 등에 의해 세포 내에 도입될 수 있다. 세포 내 도입의 다른 방법들에는 예를 들어 단백질, 나노입자에 대한 접합, 또는 세포-유래된 마이크로소포(예컨대, 미립자, 엑소좀) 내 패키징이 포함된다(EP 10306226.1 참조)

대상체의 세포, 조직 또는 기관에 생체내에서 전달하기 위해, rAAV0 벡터는 대상체에게 투여하기에 적절한 약학 조성물 내에 혼입될 수 있다. 통상적으로, 약학 조성물은 rAAV0 벡터 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함한다. "약학적으로 허용가능한 캐리어"에는 생리학적으로 양립될 수 있는 임의의 모든 용매, 분산매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등이 포함된다. 약학적으로 허용가능한 캐리어의 예에는 하나 이상의 물, 염류액, 인산완충식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합이 포함된다. rAAV0 벡터를 포함하는 약학 조성물은 예를 들어 아게라툼, 스프레이, 경구 현탁액, 좌제, 점안액 및 주사 현탁액으로서 전달될 수 있다.

본 발명의 rAAV0 벡터는 국부, 전신성, 양막내, 척추강내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예컨대, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 척추강내, 방광내, 결막(예컨대, 안와외, 안와내, 안와후, 망막내), 및 점막(예컨대, 구강, 직장, 코) 투여에 적합한 약학 조성물 내에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입을 통한 수동적인 조직 형질도입, 뿐만 아니라 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사가 또한 고려된다.

치료 목적의 약학 조성물은 통상적으로 제조 및 저장의 조건하에서 멸균적이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 rAAV0 벡터의 높은 농도에 적합할 수 있는 다른 규칙적인 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 상기 언급된 성분들 중 하나 또는 조합물을 갖는 적합한 완충액 중에 필요량의 rAAV0 벡터 화합물을 혼입시킴으로써, 필요하다면 여과된 멸균을 시킴으로써 제조될 수 있다.

rAAV0 벡터의 생체내 투여를 위해, rAAV0 벡터의 광범위한 분포는 예를 들어 정맥내, 동맥내 주사 또는 유체 국소영역 관류에 의해 근육 내에서 달성될 수 있다. 투여량 및 전달 방식에 따라, 특정 표적 근육에서 근섬유의 20-95%가 형질도입될 수 있다. 또한, rAAV0 벡터의 광범위한 분포는 rAAV0 벡터를 뇌척수액 내에 예컨대 요추 천자에 의해 주사함으로써 CNS 또는 PNS에서 달성될 수 있다(예컨대, Kapadia et al., 1996). 선택적으로, 신경 세포를 표적으로 하기 위하여 뇌의 특이적 부위에 벡터를 정확하게 전달하는 것은 정위적(stereotactic) 미세주사 기법을 이용하여 실시될 수 있다(Snyder-Keller et al., 2010). 특히 바람직한 전달 방법은 rAAV0 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 발현을 필요로 하는 뇌 또는 근육의 특이적 영역으로 rAAV0 벡터를 전달하는 것이다. 피하, 두개내, 근육내 또는 피내인지 여부와 무관하게 rAAV0 벡터를 직접 주사하는 것은 표준 니들 및 주사기 방법론을 이용하거나, 또는 니들-결핍 기법을 이용하여 일어날 수 있다. 상기 방법들은 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 담체를 포함하는 약학 조성물 형태의 rAAV0 벡터를 가지고 수행될 수 있다. 국부 적용은 또한 세포와 함께 또는 세포 없이 고려되며, 후자는 수포성표피박리증의 열성 형태에 대한 국부 제제에서 피부상에 직접적으로 AAV0을 사용한다(예컨대, 문헌 [Yan et al., 2010] 참조).

핵산 분자, 예컨대 본 발명의 rAAV0 벡터를 전달하기 위한 또다른 방법들은 예를 들어 하기에 개시되어 있다: Boado et al., J. Pharm. Sci. 87:1308-1315 (1998); Tyler et al., FEBS Lett. 421:280-284 (1999); Pardridge et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:5592-5596 (1995); Boado, Adv. Drug Delivery Rev. 15:73-107 (1995); Aldrian-Herrada et al., Nucleic Acids Res. 26:4910-4916 (1998); Tyler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 96:7053-7058 (1999); Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics," (ed. Akhtar, 1995); Maurer et al., Mol. Membr.Biol. 16:129-140 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol 137:165-192 (1999); and Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-192 (2000). 이들 프로토콜은 본 발명에서 고려되는 거의 임의의 rAAV0 벡터의 전달을 보충하거나 상호보완하기 위해 이용될 수 있다.

적합한 투여량은 치료하려는 특정 세포 유형, 조직, 기관 또는 대상체에 의존될 것이다. 대상체에 투여될 때, 투여량은 다른 요인들 중에서도 치료하려는 특정 포유류(예컨대, 인간 또는 비인간 영장류, 또는 다른 포유류), 치료하려는 대상체의 연령 및 일반적 상태, 치료하려는 상태의 중증도, 문제되는 특정 치료 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드, 투여 방식에 의존될 것이다. 적합한 유효량은 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

"치료적 유효 투여량"은 임상시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이며, 특정 적용에 의존될 것이다(신경 세포는 매우 적은 양을 필요로 할 것인 반면, 전신성 주사는 많은 양을 필요로 할 것임). 예를 들어, 인간 대상체의 골격근 또는 심근 내에 직접적으로 생체내 주사하기 위해, 치료적 유효 투여량은 rAAV0 벡터 약 1μg 내지 100g에 따르게 될 것이다. 엑소좀 또는 미립자가 rAAV0 벡터를 전달하는데 사용되는 경우에, 치료적 유효 투여량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 벡터 1μg 내지 약 100g을 전달하는 것으로 기대된다.

시험관내 형질감염을 위해, 세포들(1x10⁶ 세포)에 전달하기 위한 rAAV0 벡터의 유효량은 1 내지 20μg rAAV0 벡터, 바람직하게는 5 내지 15μg, 더 바람직하게는 8 내지 10μg에 따르게 될 것이다. 더 큰 rAAV 적재물은 더 높은 투여량을 필요로 할 것이다. 엑소좀 또는 미립자가 사용되는 경우에, 시험관내 유효 투여량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 일반적으로 동일한 양의 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.

치료에는 단일 투여량 또는 복수 투여량의 투여가 수반될 수 있다. 대상체는 일회 이상의 투여량, 실제로는 필요에 따라 복수의 투여량이 투여될 수 있는데, 그 이유는 rAAV0 벡터가 바이러스 캡시드의 부재에 기인하여 항-캡시드 숙주 면역 반응을 유발하지 않기 때문이다. 이와 같이, 당업자라면 적절한 횟수의 투여량을 용이하게 결정할 수 있다. 투여되는 투여량의 횟수는 예를 들어 1-100회, 바람직하게는 2-20회 투여량에 따를 수 있다.

III. rAAV0 벡터의 치료적 용도

본 발명의 rAAV0 벡터는 특히 폴리펩티드, 단백질을 인코딩하는 외인성 DNA 서열, 또는 비-코딩 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드를 예를 들어 근육 또는 CNS 질환을 앓는 대상체의 근육 및 CNS의 세포에 전달하는데 적합하다.

본 발명의 rAAV0 벡터는 특히 질환 또는 장애에서 결함있는 펩티드 또는 단백질의 발현으로부터 이익을 얻을 수 있는 다수의 신경 및 신경퇴행성 질환들에 대해 유용하며, 상기 펩티드 또는 단백질의 발현은 질환 또는 장애와 연관되는 증상들의 완화를 야기할 것이다. 적용가능한 질환의 일부 예에는 듀켄근이영양증, 척수성 근위축증, AIDS, 폼페병, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 알츠하이머 질환, 고오슈병, 헐러병, 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍증, 기종, 조로증, ALS, 간질, 뇌졸중, 고콜레스테롤혈증, 인슐린 장애(예컨대, 당뇨병), 성장 장애, 다양한 혈액 장애(예컨대, 빈혈증, 지중해빈혈, 혈우병), 유전적 결함(예컨대, 낭포성 섬유증), 암(특히, 고형 종양) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 구현예에서, rAAV0 벡터는 질환의 발달에 원인이 되는 이상 단백질을 유발하는 근본적인 결함 메카니즘을 표적으로 함으로써 이상 단백질의 발현을 보정하는데 사용될 수 있다. 디스트로핀 유전자의 이상 스플라이싱은, 이상 근육 조직에 대해 예를 들어 AON, U7을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 트랜스-스플라이싱 카세트(예를 들어, Goyenvalle et al., 2004; Lorain et al., 2010; 및 특허출원 WO2006/021724, 미국 가출원 61/314,830, 미국 가특허출원 61/249,702, 및 EP 2010/065142 참조, 이들 모두는 전체가 본원에 참조로서 삽입됨)를 함유하는 rAAV0 벡터를 사용하여 보정될 수 있다. 또다른 구현예에서, rAAV0 벡터를 함유하는 전장길이 디스트로핀 유전자가 이상 근육 조직에 전달될 수 있다.

이상 유전자 산물의 발현이 수반되는 다수의 질환들은 AAV0-매개 유전자 치료에 대한 후보가 된다. 예를 들어, 결함이 있는 디스트로핀 유전자 산물에 기인하여 나타나는 듀켄근이영양증(DMD)에 대한 유전자 치료법은 결함이 있는 디스트로핀 유전자를 기능적 디스트로핀 유전자로 대체하는 것을 포함하며, 이에 따라 대상체의 신체에서 이상 근육이 치료될 수 있다. 디스트로핀 유전자의 돌연변이는 횡문근에서 디스트로핀의 생성 장애를 야기한다. 그러나, 돌연변이의 정도가 표현형의 중증도와 직접적으로 연관되지는 않는다. 프레임외 결실 또는 정상보다 이른 종결 코돈을 생산하고 그 후 번역의 중지를 유발하는 넌센스 돌연변이는 중증의 표현형을 특징으로 하는 디스트로핀 결핍증을 야기한다. 일반적으로 프레임내 결실은 베커근이영양증(BMD)으로 알려져 있는 더 온화한 근 질환의 원인이 된다.

AAV0 벡터-매개 요법의 효율성은 관심대상인 이식유전자를 발현하는 rAAV0 벡터를 환자 또는 당업계에서 이용가능한 동물 모델로부터 단리된 세포 내에 도입함으로써 확인할 수 있다. DMD에 대해 잘 특징화된 유전적 동물 모델 2개가 있다. mdx 마우스는 디스트로핀 유전자의 엑손 23에서 넌센스 돌연변이를 가지며, 이는 전장길이의 야생형 디스트로핀 단백질의 합성을 못하게 한다. mdx 마우스는 변성에 대해 반작용적인 보상 메카니즘을 나타내며, 이는 기계적 손상을 보구하는 재생 과정을 유지할 수 있다. mdx 마우스는 DMD의 모든 증상들을 나타내지 않으며, 그 수명은 거의 정상이다. GRMD(Golden Retriever Muscle Dystrophy: 골든 리트리버 근이영양증) 개는 인트론 6에서 스플라이스 부위 돌연변이 때문에 기능적 디스트로핀을 결핍하며, 이는 리딩 프레임을 분열시킨다. GRMD에서, 인간 DMD에서와 같이, 섬유의 점진적 분해는 현저한 근내막 및 근주막 섬유증과 함께 골격근조직 소모를 거침없이 야기한다. 이의 DMD-유사 표현형 때문에, GRMD는 DMD에 대한 잠재적 치료법의 평가를 위해 가장 유용한 모델로 남아있다.

본 발명의 rAAV0 벡터를 전달하는 방법은 일반적으로 통상의 바이러스 벡터에 대해 사용되는 방법과 동일하다(예를 들어, Goyenvalle et al., 2004; Toromanoff et al., 2010; Lowery et al., 2010; Duque et al., 2009 참조). 캡시드가 없더라도, AAV0 벡터는 세포 또는 핵에 진입하기 위해 형질도입의 도움을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명은 또한 세포, 조직 또는 기관에서 외인성 DNA를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 형질도입 도움을 받지 않고 본 발명의 rAAV0 벡터를 상기 세포, 조직 또는 기관과 접촉시키는 단계를 포함한다.

또다른 예에서, rAAV0 벡터는 암의 측면에서 선택적 유전자 이동에 의해 세포 사멸을 유도하도록 개질될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Gruber et al., 2011] 참조).

또한, 본 발명은 대상체의 세포에서 관심대상인 핵산을 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 비면연원성이거나 면역원성이 감소되며, 상기 관심대상인 핵산을 포함하는 본 발명의 rAAV0 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 대상체의 세포에서 관심대상인 핵산을 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 관심대상인 핵산을 포함하는 본 발명의 rAAV0 벡터를 복수회 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 rAAV0 벡터는 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 상기 복수회 투여 전략은 캡시드화된 벡터에서 관찰되는 것과는 대조적으로 본 발명의 rAAV0 벡터에 대해 숙주 면역계 반응에 의해 손상되지 않을 것이다.

상기 내용은 일반적으로 본 발명을 기재한 것이며, 이는 하기의 실시예에서 추가 기재된다. 이들 특정 예들은 예증의 목적으로만 제공되는 것이고, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 특이적인 목표들, 용어들 및 값들이 본 발명에서 이용되었지만, 상기 목표들, 용어들 및 값들은 마찬가지로 본 발명의 범위를 예시적이고 비제한적으로서 이해될 것이다.

도 1은 통상의 AAV(캡시드-함유)와 rAAV0의 도식적 비교이다. 통상의 AAV 벡터(상부)는 캡시드 및 게놈의 2개 성분을 갖는 반면, rAAV0 벡터(하부)는 캡시드-결핍되어 있다.
도 2는 rAAV0 벡터 합성 및 다운스트림 적용에 대한 도식도이다. 도 2a는 Sf9 세포에서 AAV0을 증폭시키는데 사용될 수 있는 5L 생물반응기(B. Braun Medical Inc.) 및 다운스트림 AAV0 정제 과정에 사용될 수 있는 Akta Purifier 100(B. Braun Medical Inc.)을 도시한다. 도 2b는 Sf9 세포계를 사용한 AAV0 증폭 과정 및 다운스트림 정제 과정을 상세하게 나타낸 도식도이다.
도 3a는 pFBGR 플라스미드에 기초하고 숙주 세포에서 AAV0을 만드는데 사용되는 AAV0-GFP 플라스미드의 도식도이다. AAV2의 ITR이 GFP 발현 카세트의 양 말단에 플랭킹된다. GFP 발현 카세트는 전사 방향으로 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, p10 프로모터, 및 GFP를 인코딩하는 DNA 서열, 및 전사 종결 서열을 포함한다.
2개의 ITR 사이에 샌드위치된 영역 및 2개의 ITR을 포함하는 영역 이외의 것은 블라스티사이딘 S-내성 유전자이고, 이는 오르기이아 슈도츄가타 즉시 초기-1(Op IE-1) 프로모터에 작동적으로 결합된다.
도 3b는 AAV 게놈 증폭의 일반적 과정을 나타내는 도식도이다. Rep의 존재하에, AAV 게놈은 숙주 게놈으로부터 제거되고, 증폭된다(Berns et al., 2007; Nash et al., 2007).
도 4는 SnaBI 효소에 의해 소화되는 rAAV0 벡터 또는 소화되지 않는 rAAV0 벡터의 아가로스 겔이다. 아가로스 겔상에서의 밴드는 생산 과정의 말기에 DNA 회수 이후 rAAV0의 다양한 입체형태들(우측에 도식적으로 묘사됨)을 반영한다. 아가로스 겔의 제1레인의 밴드는 DNA 크기 마커이다. "Ctrl"이라고 표지된 제2레인은 소화되지 않는 rAAV0의 DNA이다. rAAV0 콘카타머에 상응하는 밴드가 표시된다. "A" 및 "A’"라는 문자는 우측의 도식에서 보여지는 DNA 산물을 나타낸다. rAAV0의 거의 대부분은 단량체 형태(이중가닥 또는 전환된 형태, 약 2.5kb)이다. "SnaBI"라고 표지된 제3레인의 밴드는 SnaBI 효소에 의해 소화된 rAAV0의 DNA이다. "B" 및 "C"라는 문자는 우측의 도식에서 보여지는 DNA 산물을 나타낸다. SnaBI 소화는 ITR을 함유하는 380 bp 단편을 배출한다(밴드 "C").
도 5a는 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 rAAV0-GFP 벡터로 형질감염된 293 세포의 형광 현미경 사진이다. 1x10⁶개 세포가 48시간 동안 5μg(좌측 패널) 및 9μg(우측 패널)의 rAAV0-GFP로 형질감염되었다. 도 5b는 Xenoworks 미세주사 시스템(Sutter Instruments)을 사용하여 핵 내에(상부 패널) 또는 세포질 내에(하부 패널) AAV0-GFP 벡터의 용액(0.02 mg/ml)으로 미세주사된 C2C12 근아세포의 형광 현미경 사진이다. 테트라메틸로다민 70,000 MW 리신-고정가능 덱스트란(Sigma)이 미세주사의 영역 마커로서 또한 공-미세주사되었다. 미세주사한지 2일 후에, 근관세포(myotube)는 파라포름알데히드 3.7%(Sigma)를 사용하여 고정되었으며, 추가 형광 염색하기 전에 0.5% 트리톤으로 투과성이 되었다. 좌측 패널은 DAPI(Sigma)로 염색된 핵을 보여준다. 중간 패널은 GFP 형광을 보여준다. 우측 패널은 미세주사 부위를 확인할 수 있게 해주는 덱스트란 염색을 보여준다(핵 vs 세포질). 형광 이미지는 Metamorph(Molecular Devices)에 의해 구동되는 40x 1.0 NA PL APO 오일 대물렌즈를 이용하여 CoolSNAP HQ2 카메라(Roper Scientific)가 구비된 Nikon Ti 현미경에 의해 획득되었다.
도 6a는 AAV0-GFP(1ml의 PBS 중 100μg의 AAV0-GFP)가 동맥내 주사된 마우스 다리의 도식도이다. 도 6b는 주사된 마우스 다리의 형광 현미경 사진(2개의 좌측 패널) 및 주사되지 않은 마우스 다리의 형광 현미경 사진(2개의 우측 패널)이며; 이는 AAV0-GFP의 동맥내 주사 없이는 어떠한 GFP 신호도 보이지 않는다는 점을 나타낸다(우측 패널). 좌측 패널은 AAV0-GFP의 동맥내 주사가 2주 후에 다리에서 GFP의 효과적인 발현을 야기한다는 점을 보여준다. 도 6c는 다리의 동맥내 주사 후에 근육 조직의 크리오섹션에서 GFP 발현을 보여준다(가로(좌측 패널) 및 세로(우측 패널) 10μm 근육 섹션). 핵은 DAPI(청색)로 대조염색되었다.
도 7은 1주 간격으로 AAV0-GFP의 2회 동맥내 주사 후에 촬영한 마우스 다리의 형광 현미경 사진이다. 상부 패널의 도식도에서 보여지는 바와 같이, 제1회 주사는 좌측 다리에서 실시되었으며(1ml의 PBS 중 100μg의 AAV0-GFP), 제2회 주사는 우측 다리에서 실시되었다(1ml의 PBS 중 100μg의 AAV0-GFP). 마우스는 분석하기에 앞서 제2회 주사한 후 8주 동안 회복시킬 수 있게 하였다. 하부 패널의 형광 현미경 사진은 양쪽 다리가 동일한 효율로 형질도입되었음을 보여주며, 이는 제1회 주사가 제2회 주사에 대해 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
도 8은 (CMV 프로모터 하에서 GFP를 인코딩하는) 소화되지 않은 rAAV0 벡터의 아가로스 겔(1%)이다(300 ng 중간 레인, 및 1,5μg 우측 레인). 아가로스 겔상에서의 밴드(2.6 kbase)는 생산 과정의 말기에 DNA 회수 이후 rAAV0의 선형 단량체성 단일가닥 구조를 반영한다. 아가로스 겔의 좌측 레인의 밴드는 DNA 크기 마커이다.
도 9는 SSB(단일 가닥 결합 단백질)의 존재하에 AAVo의 전자현미경사진이다. AAVo은, SSB 구현에 의해 나타내어질 때 단일 가닥인, 선형 구조로서 보여진다.
도 10은 시판되는 DNA 정제 기기(Qiagen Plasmid Plus Maxi 키트, Qiagen AAVo)에 의해, 또는 본 발명자들의 크로마토그래피 시스템(purified AAVo)에 의해, 정제 이후에 AAVo 샘플 내 단백질 함량을 보여주는 4-12% 구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔이다. GFP 또는 U7을 인코딩하는 AAVo이 다양한 양으로 4-12% 구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 로딩되었으며, 전기영동에 의해 분리되었다. 은 염색에 의해 단백질이 나타났다. 특히, 본 발명자들의 크로마토그래피 과정을 사용하여 정제한 후에는 어떠한 단백질 오염물도 검출될 수 없었다는 점에 주목된다.

실시예 1: rAAV0 벡터 생성을 위한 rAAV0 플라스미드의 구축

AAV0-GFP 플라스미드("pFBGR/Blas")가 다음과 같이 구축되었다. pIB/V5-His/CAT 플라스미드(Invitrogen Inc.)에서 오르기이아 슈도츄가타 즉시 초기-1 프로모터(Op IE-1; 2401-2692 bp)(Invitrogen, Inc.) 및 EM7 프로모터(2707-2765 bp)에 따라 블라스티사이딘 S 유전자(2784-3183 bp)가 프라이머 서열s 5'-ATAAGCTTACGCTCAGTGGAAVGAAAAC-3'(서열번호 7) 및 5'-ATAAGCTTGACGTGTCAGTGTCAGTCCTGCTCCT-3'(서열번호 8)을 사용하여 고정확 PCR에 의해 증폭되었다. Hind III 소화 이후에, 865 bp PCR 산물이 AAV2 패키징 플라스미드 pFBGR의 Hind III 부위 내에 클로닝되었다(Urabe et al., 2002). 제한지도 작성 및 DNA 시퀀싱이 정확한 플라스미드 구축을 확인하기 위해 수행되었다.

실시예 2: rAAV0 벡터의 생성 및 정제

클론 Sf9 세포주가 pFBGR/Blas 플라스미드에 대해 수립되었다. 스포도프테라 프루기페르다(Sf-9) 세포는 Cellfectin(Invitrogen)을 사용하여 pFBGR/Blas 플라스미드에 의해 형질감염되었다. 형질감염 후에, 세포는 곤충 세포 배양배지(HyClone Inc.)에서 3일 동안 27℃에서 인큐베이션되었다. 그 후, 블라스티사이딘 S HCl(50μg/ml)이 안정적인 형질전환체를 선택하기 위해 첨가되었다. 2주의 선택 기간 후, 희석 클로닝 및 직접 콜로니 이동 기법들이 사용되어, 독립적인 클론 세포주들이 획득되었다. 형질전환된 세포는 10% FBS HyQ 성장배지에서 배양되고 증식되어, 블라스티사이딘 S HCl 선택(10 μg/ml)하에서 구별되는 콜로니들을 형성하였다.

블라스티사이딘-내성 클론 세포주는 AAV Rep 78 및 Rep 52 ("Rep-Bac") 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스에 의해 개별적으로 감염되었으며(MOI=5), GFP 발현에 대해 스크리닝되었다. 상기 Rep-Bac는 문헌 [Urabe et al., 2002]에 개시된 바와 같았다. 재조합 바큘로바이러스는 문헌 [Virag et al., 2009]에 개시된 바와 같이 동물 연구를 위해 충분한 양이 생성되도록 제조되었다. Rep-Bac 감염 후에, 다수의 세포주들이 형광 현미경 및 유동세포계수기(Guava EasyCyte)에 의해 GFP를 발현하는 것으로 확인되었다. 염색체외 DNA는 Rep-Bac 세포로부터 추출되었으며, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석되었다. Rep-Bac 감염 이후에 2.6 kb 밴드의 존재에 의해, "프로바이러스" rAAV0-GFP 게놈이 염색체 DNA로부터 "축출"되었으며 높은 복제수로 AAV DNA로서 복제되었다는 것이 보여졌다.

AAV0 벡터를 단리하고 정제하기 위해, 클론 Sf9 세포주는 증식되고, Rep-Bac에 의한 감염시에 2x10⁶ 세포/mL로 파종되었다(MOI=1 내지 3). 세포 생존율 및 크기는 매일 모니터링되었다(Cellometer). 세포 직경의 증가는 성공적인 바큘로바이러스 감염의 지표이다. AAV0 벡터는 평균 세포 직경이 17-20μm에 이르렀을 때 채취되었다. 형광 현미경 및 Guava EasyCyte(Millipore)에 의한 GFP 발현의 확인에 의해, Sf9/ITR-GFP 세포의 효과적인 Rep 바큘로바이러스 감염이 보여졌다. AAV0-GFP 벡터 DNA 추출은 AAV0-GFP 벡터 DNA의 존재를 확인하기 위하여 배양된 세포(1mL)로부터 Qiagen miniprep 키트에 의해 수행되었다. 더 큰 규모의 DNA 추출은 Qiagen gigaprep 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

실시예 3: 시험관내 rAAV0 벡터-매개 유전자 발현

293 세포 및 C2C12 세포의 핵 또는 세포질에 rAAV0-GFP 벡터의 미세주사는 Xenoworks 미세주사 시스템(Sutter Instruments)을 사용하여 수행되었다. 테트라메틸로다민 70,000 MW 리신-고정가능 덱스트란이 미세주사의 영역 마커로서 공-미세주사되었다. 핵은 DAPI에 의해 염색되었다.

또한, 보통의 플라스미드-DNA에 비해 rAAV0의 부가적인 성질들을 입증하기 위하여, 세포질에 미세주사될 때 세포를 형질도입하는 rAAV0의 능력이 테스트되었다. 실제로, 플라스미드-DNA는 핵에 직접 전달될 필요가 있고, 세포질 미세주사는 유효하지 않다. 여기서, C2C12 근아세포는 성장되고 2일 동안 분화되었다. C2C12 근관세포의 핵 또는 세포질에 AAV0-GFP 벡터의 용액(0.02 mg/ml)을 Xenoworks 미세주사 시스템(Sutter Instruments)에 의해 미세주사하였다. 테트라메틸로다민 70,000 MW 리신-고정가능 덱스트란(Sigma)이 미세주사의 영역 마커로서 또한 공-미세주사되었다. 미세주사한지 48시간 후에, 근관세포는 파라포름알데히드 3.7%(Sigma)를 사용하여 고정되었으며, 0.5% 트리톤으로 투과성이 되었다. 모든 형광 염색은 Fluoromont G (Southern Biotech)에서 마운팅되었다. 핵은 DAPI(Sigma)를 사용하여 염색되었다. 도 5에 도시된 형광 이미지는 Metamorph(Molecular Devices)에 의해 구동되는 40x 1.0 NA PL APO 오일 대물렌즈를 이용하여 CoolSNAP HQ2 카메라(Roper Scientific)가 구비된 Nikon Ti 현미경에 의해 획득되었다. 도 5b 참조.

도 5b의 결과(좌측 패널)는 세포 핵이 형광 염료에 의해 염색되었음을 보여주며, 이는 결국 구축물이 핵에 전달되었다는 점을 나타내는 것이다. GFP 형광은 GFP 발현을 확인하였으며, 이는 결국 형질도입된 rAAV0-GFP 벡터의 전사 형태를 나타낸다.

실시예 4: 동맥내 주사를 통한 생체내 rAAV0 벡터-매개 유전자 발현

대퇴 동맥으로 AAV0-GFP 벡터의 동맥내 주사는, C57BL/6 마우스를 마취시키고, 단일 수동 고압 주사를 위해 오른쪽 뒷다리를 격리하거나 이중 수동 고압 주사를 위해 양쪽 뒷다리를 격리함으로써, 수행되었다. 대퇴정맥 및 2개의 측부혈관(collateral)을 클램핑한 후에, 대퇴동맥에 카테터가 도입되었으며, 1ml의 인산완충식염수(PBS) 중 100μg의 AAV0-GFP 벡터 제제가 100ml/s의 속도로 주사되었다. 주입한지 1분 후에, 대퇴정맥은 개방 순환에 연결되어 클램핑이 제거되었다. 주입한지 2주 후에, 다리는 GFP 발현에 대해 분석되었다.

실시예 5: 생체내 rAAV0 벡터-매개 유전자 발현은 면역 반응을 유발하지 않는다.

마우스에게 1주 간격으로 AAV0-GFP를 2회의 고출력 대퇴부내 주사로 제공하였다. 제1회 주사는 좌측 다리에서 실시되었으며(1ml의 PBS 중 100μg의 AAV0-GFP), 일주일 후에 제2회 주사는 우측 다리에서 실시되었다(1ml의 PBS 중 100μg의 AAV0-GFP). 마우스는 통상의 Zeiss 형광 현미경으로 분석하기에 앞서 제2회 주사한 후 8주 동안 회복시킬 수 있게 하였다. 정상적으로는, 48시간이 지나고난 후 rAAV의 재투여는 중화 항체의 존재 때문에 불가능하다(Lorain et al., 2008). 1주일 후의 재-주사에 의해 반대측 다리의 형질도입이 줄어들지 않았다는 사실은 rAAV0 벡터에 대한 면역 반응이 부재한다는 것을 나타낸다.

실시예 6: 망막하 주사를 통한 rAAV0 벡터-매개 유전자 발현

안와후 주사를 위해, 동물은 마취되고, 400μl의 PBS 중 200μg의 AAV0-GFP 벡터를 함유하는 용액을 안와후 부비강으로 예를 들어 인슐린 주사기를 이용하여 주사될 것이다. 일반적으로, 표준 기법들이 마우스 또는 래트(Timmers et al., 2001) 또는 개 또는 비-인간 영장류(Weber et al., 2003)의 망막하 주사를 위해 적용될 것이다. rAAV0 벡터는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 세포-특이적 G-단백질-결합 수용체 키나제 1(GRK1) 프로모터를 함유할 것이며, 이는 로드 및 콘 광수용체에서 활발한 이식유전자 발현을 수립할 수 있다(Khani et al., 2007). 다른 프로모터 예는 신경 망막을 효과적으로 표적으로 하는 유비쿼터스 smCBA 프로모터가 될 것이다(Haire et al., 2006). 이러한 프로모터들은, 치료하려는 질환에서 발현이 결핍된 원하는 이식유전자에 대해, 예컨대 돌연변이가 레버 선천적 흑내장을 유발하는 구아닐레이트 시클라제-1 유전자에 대해(Boye et al., 2010), 또는 레버 선천적 흑내장을 역시 유발하는 RPE 65 유전자에 대해(Lheriteau et al., 2010), 또는 돌연변이되면 열성 색소성망막염을 유발하는 RD 10 유전자에 대해(Pang et al., 2011), 조절 성분으로서 결합될 수 있다. 유전자 치료 접근법에 대해 받아들여지는 망막 질환의 리뷰를 위해, 문헌 [Stieger and Lorenz, 2010] 참조. 통상적으로, 5x10e9 내지 5x10e11의 벡터 입자는, 마우스에서는 0.5-2μl 또는 개 또는 비-인간 영장류에서는 50-600μl의 종-조절된 부피로 일반적 마취하에서 망막하 주사될 것이다. 더 큰 동물들에서, 이러한 접근법은 유리체 절제술과 조합될 수 있다. 통상적으로 개에 대해, 44-게이지 카뉼라(Corneal)는, 유리체를 통해 공막절개술 후에 카뉼라를 삽입하고, 현미경을 조절하면서 피막의 중심 망막의 기저를 이루는 망막하 공간을 표적으로 함으로써, 제어되고 자동화된 망막하 주사를 전달하기 위하여, 점성 유체 주사(VFI) 시스템(D.O.R.C. International, Netherlands)에 결합될 것이다(Weber et al., 2003). 이식유전자 발현은 질환-특이적 시각 기능 테스트에 따라 기능적으로 연구되고, 표준 기법들(예컨대, PCR, 웨스턴 블롯팅, 면역형광)에 의해 생화학적으로 연구될 것이다. 당업자에게 알려져 있는 기법들(예컨대, 시력 테스트, 공간 배향 테스트, 망막전도검사, 시각적 유발 전위)을 이용하여, 시력 복구의 측정으로서 효능이 결정될 수 있다. 복구의 측정가능한 정도는 발생한 것으로 기대된다.

실시예 7: 전신성 주사를 통한 생체내 rAAV0 벡터-매개 유전자 발현

마우스(C57BL/6)는 꼬리 정맥 주사를 통해 실시예 2 및 도 1에 기재된 바와 같이 rAAV0-GFP가 투여될 것이다. AAV0-GFP 제제는 0.5ml의 인산완충식염수(PBS) 중 100-200μg의 rAAV0-GFP로 구성될 것이다. 조직(예컨대, 근육, 심장, 뇌, 간, 신장)은 주사한지 2주 후부터 다양한 시간 지점에서 GFP 발현이 분석될 것이다. 모두는 아니더라도 수많은 기관들이 형질도입될 것이라는 점이 예상된다.

실시예 8: rAAV0 벡터의 엑소좀- 및/또는 미립자-매개 전달

또한, 본 발명은 (1) DMD를 앓는 대상체의 근육 생검으로부터 근아세포 배양물을 수립하고, (2) 관심대상인 DNA를 인코딩하는 rAAV0 벡터에 의해 근아세포 배양물을 형질도입하고, (3) 상기 배양물로부터 엑소좀 또는 미립자를 수집하고, (4) 수집된 엑소좀 또는 미립자를 대상체에 도입함으로써, 듀켄근이영양증을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

DMD를 앓는 대상체의 근육 생검으로부터 배양된 근아세포는 관심대상인 DNA를 인코딩하는 rAAV0 벡터에 의해 형질도입된다. 숙주 세포로부터 최적의 rAAV0-함유 엑소좀 또는 미립자 쉐딩을 반영하는 실험적으로 결정된 기간 이후에, 배양 상청액은 수집되고, 우선 예를 들어 2000g에서 20분 클리어링된다. 사전-클리어링된 상청액은 그 후 스핀 컬럼(예컨대, Amicon spin column; Millipore, Watford, UK)을 사용하여, 미립자에 대해서는 70분 동안 20,000g에서, 엑소좀에 대해서는 70분 동안 100,000g에서, 농축된다. 초원심분리의 최적의 기간은 실험적으로 결정될 수 있다. 미립자 또는 엑소좀을 함유하는 초원심분리된 펠릿을 예를 들어 PBS로 세척할 때, 현탁된 펠릿은 직접 사용될 수도 있고, 소포의 표면상에 발현되는 것으로 알려져 있는 단백질에 대한 항체를 이용하여, 예를 들어 FACS, MACS, 면역침전, 친화성 크로마토그래피, 또는 특이적 항체 또는 액타머로 코팅된 자성 비드에 의해, 추가 정제 단계가 처리될 수 있다.

그 후, 정제된 rAAV0-함유 미립자 또는 엑소좀은 DMD를 앓는 대상체의 이상 근육 조직에 직접 주사되거나, 또는 DMD를 앓는 환자로부터 단리된 배양 줄기세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 후자의 경우, 미립자 또는 엑소좀을 내재화한 배양 줄기세포는 환자의 이상 조직 내에 재도입될 수 있다.

rAAV0 벡터를 함유한 미립자 또는 엑소좀은 내재화될 것이고, 상기 벡터는 핵에 진입하여 외인성 DNA를 발현할 것이라는 점이 예상된다.

실시예 9: rAAV0-U7 플라스미드 및 벡터의 생성

rAAV0-U7 플라스미드 및 벡터는 실시예 1과 본질적으로 동일한 방법으로 제조되었다. 요약하면, 전장 U7 snRNA 유전자(445 bp)가 프라이머로서 5'-TAACAACATAGGAGCTGTG-3'(서열번호 9) 및 5'-CAGATACGCGTTTCCTAGGA-3'(서열번호 10)을 사용하여 마우스 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. Sm 도메인(AATTTGTCTAG; 서열번호 11)은 개시된 바와 같이 smOPT(AATTTTTGGAG; 서열번호 12)로 바뀌었으며(S1), 히스톤 전-mRNA 페어링 영역은 하기 서열에 상보적으로 44 bp가 대체되었다: a) 디스트로핀 유전자의 엑손 23의 업스트림에서 분기점에 걸친 서열(BP22: 5'-AAATAGAAGTTCATTTACACTAAC-3': 서열번호 13), 및 b) 엑손 23 공여(donor) 스플라이스 부위에 바로 인접한 서열(SD23: 5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3': 서열번호 14). 생성된 U7smOPT-SD23/BP22 단편은 그 후 pFBGR/Blas 플라스미드에 도입되어, rAAV0-U7-smOPT-SD23/BP22 플라스미드를 생성하였다. U7 snRNA 구축물의 추가 상세내용은 본원에 전체로서 참조로 삽입되는 공개된 가특허출원 61/314,830(출원일 2010년 3월 17일)에서 확인할 수 있다. 또한, 문헌 [Goyenvalle et al., 2004] 참조.

실시예 10: 생체내 디스트로핀의 엑손 스키핑에 대한 rAAV0-U7 벡터의 치료적 용도

또한, 본 발명은 실시예 4에 기재된 바와 같이 대퇴 동맥에 rAAV0-U7을 동맥내 주사함으로써, 또는 실시예 6에 기재된 바와 같이 전신성 전달을 함으로써, 듀켄근이영양증을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, rAAV0 백본에 대한 면역 반응의 결핍은, 표적 조직 내 U7의 수준이 실시예 5에서 설명된 바와 같이 임상적으로 적절할 때까지 반복 치료를 가능하게 해준다. 치료적 용도는 DMD의 잘 알려져 있는 마우스 모델인 mdx 마우스에서 평가될 것이며, 이를 위해 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 23을 스키핑함으로써 효과적인 디스트로핀 축출을 할 수 있는 U7 툴이 개발되었다(Goyenvalle et al., 2004). 처치된 동물들은 치료 후 다양한 시점에서 희생될 것이며, 디스트로핀 축출은 RT-PCR(즉, 스키핑 수준을 결정하기 위함), 웨스턴 블롯팅, 및 조직 크리오섹션에 대한 면역형광(문헌 [Goyenvalle et al., 2004]에 개시된 바와 같음)에 의해 분석되어 단백질 합성 및 편재화를 결정한다.

실시예 11: AAV0 벡터의 구조적 특징화

전술한 바와 같이 생성된 rAAV0 벡터는 아가로스 겔(1%) 전기영동을 이용하여 구조적 분석이 수행되었다(도 8). 아가로스 겔상에서의 밴드(2.6 kbase)는 생산 과정의 말기에 DNA 회수 이후 rAAV0의 선형 단량체성 단일가닥 구조를 반영한다.

SSB(단일 가닥 결합 단백질)의 존재하에 rAVV0 벡터의 전자현미경법이 또한 수행되어, rAAV0 벡터의 단일가닥 성질이 확인되었다. AAV 샘플은 약 15ng/μl에서 1X TE(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8)로 희석되었다. 그 후, 30μl의 희석된 샘플은 37℃에서 15분 동안 1μl의 10mg/ml T4 Gene 32 단백질(이는 SSB 단백질임)과 함께 인큐베이션되었다. 그 후, 상기 샘플은 과량의 단백질을 제거하기 위해 1X TE 완충액에서 예비 평형화된 Superose 6 여과 컬럼상에서 정제되었다. 이어서, 상기 샘플은 탄산화된 구리 그리드상에 증착되고 펜틸아민으로 기능화되었다. 이는 아세트산 우라닐(양성 염색)과 대조되었으며, 암시야 투과 전자 현미경(Zeiss 902)으로 관찰되었다. 도 9에서 보여지는 바와 같이, rAAV0은 선형 구조로서 나타나며, 이는 SSB 결합에 의해 드러날 때 단일 가닥이다.

크로마토그래피 또는 Qiagen 키트에 의해 정제된 AAVo에서 단백질 오염물질을 평가하기 위하여, rAAVo 샘플은 4-12% SDS-PAGE(NuPAGE Tris-Acetate Mini Gels, Invitrogen)상에 분리되었으며, 단백질에 대해 은 염색되었다(Silver Stain Plus, BioRad).

2개 유형의 rAAVo 벡터가 테스트되었다: CMV 프로모터 하에서 GFP를 인코딩하는 AAVo(GFP), 및 U7 snRNA에 대한 발현 카세트를 함유하는 AAVo(U7). 각 샘플에 대해, 다른 양의 DNA가 겔상에 로딩되었다:

1: 15μl의 200ng/ml AAVo(U7)-purified

2: 15μl의 350ng/ml AAVo(GFP)-purified

3: 15μl의 700ng/ml AAVo(U7)-Qiagen

4: 5μl의 3300ng/ml AAVo(GFP)-Qiagen

5: 15μl의 350ng/ml AAVo(GFP)-purified

6: 7.5μl의 700ng/ml AAVo(U7)-Qiagen

7: 1.6μl의 3300ng/ml AAVo(GFP)-Qiagen.

겔이 도 10에 보여진다. 정제된 rAAV0 샘플에서 어떠한 오염 단백질도 확인되지 않았다. 따라서, 여기에서 확인된 성질들은 오로지 rAAV0 벡터 그 자체에 기인한 것이고, 샘플에 존재하는 헬퍼 단백질에 기인하는 것이 아닌다.

본 발명의 다양한 구현예들 각각에 대해 개시하였으나, 본 명세서에 기재한 바와 같이 그리고 하기 특허청구범위에서 추가로 구현되는 바와 같이, 본 발명의 실제 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 한, 본 발명에 대한 일부 변형들은 당업자에게 받아들여지고 유효할 수 있다는 점이 기대된다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 구현예들에 의해 그 범위가 제한되어져서는 안 된다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형들이 본 명세서 및 도면에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도되어진다. 모든 값들은 근사치이고 개시를 위해 제공된다는 점이 또한 이해될 것이다.

본 명세서에서 인용된 모든 미국 특허, 미국 특허출원공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원, 비특허공보, 도면, 표 및 웹사이트들은 전체로서 본원에 참조로 삽입된다는 점은 분명하다.

다양한 구현예

1. 2개의 AAV 말단 역반복(ITR) 및 발현 카세트를 포함하는 캡시드-결핍 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV0 벡터), 여기서 상기 ITR 각각에는 헤어핀 구조를 형성하는 팔린드롬 서열이 개입되며, 상기 카세트는 외인성 DNA에 작동적으로 결합된 하나 이상의 프로모터를 포함함,

여기서 상기 발현 카세트는 하나의 말단 역반복에 의해 각 말단상에 플랭킹되어 있으며, 상기 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하지 않고, 상기 벡터는 캡시드화되지 않음.

2. 구현예 1에 있어서, 외인성 DNA가 약 4,200 내지 약 15000 뉴클레오티드를 포함하는 것인, AAV0 벡터.

3. 구현예 1에 있어서, 외인성 DNA는 캡시드화된 AAV 벡터의 패키징 용량의 길이를 초과하는 것인, AAV0 벡터.

4. 구현예 1에 있어서, 외인성 DNA 서열은 단백질을 인코딩하는 것인, AAV0 벡터.

5. 구현예 1에 있어서, 외인성 DNA 서열은 센스 또는　안티센스 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 것인, AAV0 벡터.

6. 하기 단계를 포함하는, 캡시드-결핍 아데노-연관 바이러스(AAV0) 벡터의 제조방법:

(a) 2개의 AAV ITR, 2개의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트를 포함하는 세포를 제공하는 단계,

여기서 상기 발현 카세트는 외인성 DNA에 작동적으로 결합된 하나 이상의 프로모터를 포함하고, 상기 발현 카세트는 하나의 말단 역반복에 의해 각 말단상에 플랭킹되고 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하지 않으며, 상기 세포는 AAV 캡시드 단백질을 발현하지 않음;

(b) 선택적으로, AAV Rep 유전자 또는 단백질이 세포에 이미 존재하지 않는 경우, 상기 세포 내에 AAV Cap 유전자 또는 단백질이 아닌 AAV Rep 유전자 또는 단백질을 제공하는 단계;

(c) ITR 및 발현 카세트를 포함하고 AAV0 벡터를 구성하는 DNA의 복제 및 배출을 허용하는 조건하에서 세포를 성장시키는 단계;

(d) 상기 세포로부터 축출된 AAV0 벡터를 수집하는 단계.

7. 구현예 6에 있어서, (a) 단계의 세포가 선택적 마커를 더 포함하는 것인 제조방법.

8. 구현예 6에 있어서, 세포주가 Sf9인 제조방법.

9. 구현예 7에 있어서, 선택적 마커가 블라스티사이딘 S-내성 유전자인 제조방법.

10. 구현예 6에 있어서, 축출된 AAV0 벡터는 네이키드(naked) DNA로서 수집되거나, 또는 엑소좀 또는 미립자에 혼입되는 제조방법.

11. 구현예 10에 있어서, 상기 벡터는 정제된 네이키드(naked) DNA로서 수집되는 제조방법.

12. 구현예 10에 있어서, 상기 벡터는 미립자 또는 엑소좀의 형태로 수집되고 정제되는 제조방법.

13. 하기 단계를 포함하는, 포유류 세포에서 외인성 DNA의 발현을 조정하는 방법:

(a) 2개의 AAV 말단 역반복(ITR) 및 발현 카세트를 포함하는 유효량의 캡시드-결핍 아데노-연관 바이러스(AAV0) 벡터를 세포에 전달하는 단계,

여기서 상기 ITR 각각에는 헤어핀 구조를 형성하는 팔린드롬 서열이 개입되며, 상기 카세트는 외인성 DNA에 작동적으로 결합된 하나 이상의 프로모터를 포함하며, 여기서 (i) 상기 발현 카세트는 하나의 말단 역반복에 의해 각 말단상에 플랭킹되어 있으며, (ii) 상기 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하지 않고, (iii) 상기 벡터는 캡시드화되지 않으며, (iv) 상기 벡터는 면역원성이 아님;

(b) 외인성 DNA의 세포에 의한 발현을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 성장시키는 단계;

여기서, 상기 유효량은 외인성 DNA의 세포에 의한 발현의 원하는 수준을 허용하는데 충분한 양임.

14. 구현예 13에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 캡시드를 포함하는 통상의 AAV 벡터의 패키징 용량을 초과하는 방법.

15. 구현예 13에 있어서, 상기 전달하는 단계는 세포외 매질에서 AAV0 벡터를 도입하는 것을 단지 포함하고, 다른 어떠한 형질도입 수단의 사용도 포함하지 않는 방법.

16. 구현예 14에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 약 4.2 내지 약 15kb인 방법.

17. 구현예 14에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 약 5kb 이하인 방법.

18. 구현예 14에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 약 5kb 이하인 방법.

19. 구현예 14에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 약 8kb 이하인 방법.

20. 구현예 14에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 약 10kb 이하인 방법.

21. 하기 단계를 포함하는, 포유류의 기관 또는 조직에서 외인성 DNA의 발현을 조정하는 방법:

(a) 2개의 AAV 말단 역반복(ITR) 및 발현 카세트를 포함하는 유효량의 캡시드-결핍 아데노-연관 바이러스(AAV0) 벡터를 포유류에 전달하는 단계,

여기서 상기 ITR 각각에는 헤어핀 구조를 형성하는 팔린드롬 서열이 개입되며, 상기 카세트는 외인성 DNA에 작동적으로 결합된 하나 이상의 프로모터를 포함하며, 여기서 (i) 상기 발현 카세트는 하나의 말단 역반복에 의해 각 말단상에 플랭킹되어 있으며, (ii) 상기 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하지 않고, (iii) 상기 벡터는 캡시드화되지 않음;

(b) 상기 기관 또는 조직 내에서 세포가 외인성 DNA의 발현을 정교하게 하도록(elaborate) 기다리는 단계;

여기서, 상기 유효량은 외인성 DNA의 세포에 의한 발현의 원하는 수준을 허용하는데 충분한 양임.

22. 구현예 21에 있어서, 상기 전달하는 단계는 상기 포유류에 전신성 전달을 포함하는 방법.

23. 구현예 21에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 캡시드를 포함하는 통상의 AAV 벡터의 패키징 용량을 초과하는 방법.

24. 구현예 23에 있어서, 외인성 DNA의 길이가 약 4.2 내지 약 15kb인 방법.

25. 구현예 22에 있어서, 상기 전신성 전달은 동맥내 또는 근육내 주사를 포함하는 방법.

26. 구현예 21에 있어서, 상기 전달하는 단계는 망막하 주사를 포함하는 방법.

27. 구현예 25에 있어서, AAV0 벡터는 특이적 기관 또는 조직에서 우선적으로 또는 배타적으로 상기 외인성 DNA의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 방법.

28. 구현예 13 또는 21에 있어서, 외인성 DNA는 U7 snRNA를 인코딩하는 방법.

29. 구현예 13 또는 21에 있어서, 외인성 DNA는 RNAi 또는 siRNA를 인코딩하는 방법.

30. 구현예 13에 있어서, 상기 전달하는 단계는 형질감염 시약 또는 세포 내의 진입을 촉진하는 물리적 수단의 사용을 포함하는 방법.

31. 구현예 13에 있어서, 상기 전달하는 단계는 형질감염제 또는 상기 rAAV0 벡터의 세포내 진입을 촉진하는 부가적 물리적 수단의 부재하에서 수행되는 방법.

32. 대상체의 질환을 치료하는 방법으로서,

상기 질환은 폴리펩티드의 발현의 감소 또는 중지에 기인하여 증상을 나타내는 유전적 결함이 수반되는 것이거나, 또는 상기 폴리펩티드의 비기능적이거나 기능이 약화된 유사체의 발현이 수반되는 것이고,

상기 방법은 구현예 1에 따른 벡터를 유효량으로 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하며, 외인성 DNA는 상기 결함을 스키핑(skip), 보정(correct), 침묵(silence) 또는 차폐(mask)하여 질환 또는 장애와 연관되는 증상의 완화를 야기하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.

33. 구현예 32에 있어서, 구현예 1에 따른 벡터를 유효량으로 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하며, 외인성 DNA는 RNAi 또는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 것인, 방법.

34. 구현예 32에 있어서, 구현예 1에 따른 벡터를 유효량으로 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하며, 외인성 DNA는 발현될 때 폴리펩티드의 기능을 적어도 부분적으로 복구함으로써 상기 질환과 연관된 증상의 완화를 야기하는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 것인, 방법.

35. 세포에서 원하는 유전자 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현을 유발하는 방법으로서, 형질감염제 또는 상기 rAAV0 벡터의 세포내 진입을 촉진하는 부가적인 물리적 수단들의 부재하에 하나 이상의 rAAV0 벡터를 세포의 표면과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.

36. rAAV0 벡터에 대한 숙주의 면역 반응을 유발하지 않으면서, 하나 이상의 rAAV0 벡터와 함께 특이적 단백질을 인코딩하거나 인코딩하지 않는 원하는 DNA 또는 RNA 서열을 동일한 숙주에게 반복적으로 투여하는 방법.

37. 구현예 1에 있어서, 단일 가닥 선형 DNA 서열은, 바이러스 캡시드 단백질에 의한 간섭 없이, 세포막을 거쳐 세포 내에 포함되는 능력 및 세포질로부터 핵으로 이송되는 능력을 갖는 것인, AAV0 벡터.

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> ASSOCIATION INSTITUT DE MYOLOGIE ET AL; <120> CAPSID-FREE AAV VECTORS, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR VECTOR PRODUCTION AND GENE DELIVERY <130> IP20132309FR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 145 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 2 <211> 144 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 2 ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaa 144 <210> 3 <211> 4718 <212> DNA <213> adeno-associated virus 1 <400> 3 ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 ggcaactcca tcactagggg taatcgcgaa gcgcctccca cgctgccgcg tcagcgctga 180 cgtaaattac gtcatagggg agtggtcctg 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cttccacctc 2700 gtcagacgcc gaagctggac ccagcggatc ccagcagctg caaatcccag cccaaccagc 2760 ctcaagtttg ggagctgata caatgtctgc gggaggtggc ggcccattgg gcgacaataa 2820 ccaaggtgcc gatggagtgg gcaatgcctc gggagattgg cattgcgatt ccacgtggat 2880 gggggacaga gtcgtcacca agtccacccg aacctgggtg ctgcccagct acaacaacca 2940 ccagtaccga gagatcaaaa gcggctccgt cgacggaagc aacgccaacg cctactttgg 3000 atacagcacc ccctgggggt actttgactt taaccgcttc cacagccact ggagcccccg 3060 agactggcaa agactcatca acaactactg gggcttcaga ccccggtccc tcagagtcaa 3120 aatcttcaac attcaagtca aagaggtcac ggtgcaggac tccaccacca ccatcgccaa 3180 caacctcacc tccaccgtcc aagtgtttac ggacgacgac taccagctgc cctacgtcgt 3240 cggcaacggg accgagggat gcctgccggc cttccctccg caggtcttta cgctgccgca 3300 gtacggttac gcgacgctga accgcgacaa cacagaaaat cccaccgaga ggagcagctt 3360 cttctgccta gagtactttc ccagcaagat gctgagaacg ggcaacaact ttgagtttac 3420 ctacaacttt gaggaggtgc ccttccactc cagcttcgct cccagtcaga acctgttcaa 3480 gctggccaac ccgctggtgg accagtactt gtaccgcttc gtgagcacaa 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musculus <400> 13 aaatagaagt tcatttacac taac 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ggccaaacct cggcttacct 20

Claims (22)

1. 제1 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 말단 역반복(ITR: inverted terminal repeat), 관심대상인 뉴클레오티드 서열 및 제2 AAV ITR을 순서대로 포함하는 단리된 선형 핵산 분자로서,
   상기 핵산 분자는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서,
   상기 관심대상인 뉴클레오티드 서열은 외인성 DNA의 발현 카세트인 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 핵산 분자는 단일가닥인 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   AAV rep 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 관심대상인 뉴클레오티드 서열은 약 4,200 내지 약 15000개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 외인성 DNA 서열은 단백질 또는 센스 또는　안티센스 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   조직-특이적 또는 기관-특이적 방식으로 상기 외인성 DNA의 발현을 우선적으로 또는 배타적으로 유도하는 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 외인성 DNA는 U7 snRNA, RNAi 또는 siRNA를 인코딩하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
9. 하기 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자의 제조방법:
   (a) 2개의 AAV ITR 및 상기 ITR 사이에 위치한 관심대상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계, 여기서 상기 핵산 서열은 AAV 캡시드 단백질 인코딩 유전자가 결핍된 것이고, 상기 세포는 AAV 캡시드 단백질을 발현하지 않음;
   (b) 선택적으로, AAV Rep 유전자 또는 단백질이 상기 세포에 이미 존재하지 않는 경우, 상기 세포 내에 AAV Cap 유전자 또는 단백질이 아닌 AAV Rep 유전자 또는 단백질을 제공하는 단계;
   (c) ITR 및 발현 카세트를 포함하고 AAV0 벡터를 구성하는 DNA의 복제 및 배출을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 성장시키는 단계;
   (d) 상기 세포로부터 축출된 AAV0 벡터를 수집하는 단계.
10. 제9항에 있어서,
    상기 세포주는 Sf9인 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제9항 또는 제10항에 따른 제조방법에 의해 획득될 수 있거나 획득된, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 선형 핵산 분자.
12. 하기 단계를 포함하는, 포유류 세포에서 외인성 DNA의 발현을 조정하기 위한 시험관내 방법:
    (a) 제1항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자를 유효량으로 상기 세포에 전달하는 단계;
    (b) 외인성 DNA의 세포에 의한 발현을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 성장시키는 단계,
    여기서, 상기 유효량은 외인성 DNA의 세포에 의한 발현의 원하는 수준을 허용하는데 충분한 양임.
13. 제12항에 있어서,
    상기 전달하는 단계는 세포외 매질에서 상기 단리된 선형 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하고, 다른 형질도입 수단의 사용은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 시험관내 방법.
14. 세포에서 원하는 유전자 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현을 유발하기 위한 시험관내 방법으로서,
    형질감염제 또는 상기 rAAV0 벡터의 세포내 진입을 촉진하는 부가적인 물리적 수단의 부재하에, 제1항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 선형 핵산 분자를 상기 세포의 표면과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
15. 대상체의 세포, 기관 또는 조직에서 외인성 DNA의 발현을 조정하는 관심대상인 뉴클레오티드 서열을 전달하기 위한 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자.
16. 대상체, 특히 포유류의 세포, 기관 또는 조직에서 외인성 DNA의 발현을 조정하기 위한 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자.
17. 대상체의 질환 치료방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자로서,
    상기 질환은 폴리펩티드의 발현의 감소 또는 중지에 기인하여 증상을 나타내는 유전적 결함이 수반되는 것이거나, 또는 상기 폴리펩티드의 비기능적이거나 기능이 약화된 유사체의 발현이 수반되는 것이고,
    외인성 DNA는 상기 결함을 스키핑(skip), 보정(correct), 침묵(silence) 또는 차폐(mask)하여 질환 또는 장애와 연관되는 증상의 완화를 야기하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단리된 선형 핵산 분자.
18. 제17항에 있어서,
    상기 외인성 DNA는 RNAi, siRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
19. 제17항에 있어서,
    상기 외인성 DNA는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 것이고, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리펩티드의 기능을 적어도 부분적으로 복구함으로써 상기 질환과 연관된 증상의 완화를 야기하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전달하는 단계는 상기 포유류에게 전신성 전달, 특히 동맥내 또는 근육내 주사를 통한 전달을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 선형 핵산 분자.
21. 전달이 형질감염 시약 또는 세포내 진입을 촉진하는 물리적 수단의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 시험관내 방법, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자.
22. 전달이 형질감염제 또는 상기 rAAV0 벡터의 세포내 진입을 촉진하는 부가적인 물리적 수단의 부재하에 실시되는 것을 특징으로 하는, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 시험관내 방법, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 단리된 선형 핵산 분자.

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