CN112063625A

CN112063625A - 编码arl2bp的核酸及其应用

Info

Publication number: CN112063625A
Application number: CN202011015907.7A
Authority: CN
Inventors: 李斌; 任盛
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd; Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Co
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码ARL2BP的核酸及其应用。本发明对ADP‑核糖基化因子样蛋白2结合蛋白(ARL2BP)编码基因序列进行了优化，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效转录和高效表达ARL2BP蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)，并构建了ARL2BP的重组表达载体。与未优化的ARL2BP的DNA编码序列相比，优化后的序列ARL2BP蛋白表达水平显著提高，能够非常有效地治疗视网膜色素变性，并且安全性好。

Description

编码ARL2BP的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码ARL2BP的核酸及其应用。

背景技术

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一组进行性致盲的遗传性视网膜疾病，以视网膜光感受器和色素上皮变性为主要特征，感光细胞的变性和凋亡是视力持续下降并最终失明的原因。流行病学调查显示，西方国家发病率约为1/4000～1/3500，国内约1/4016～1/3467，现有的治疗方法尚不能治愈，只能在不同程度上阻止RP进展。

基因治疗是通过基因载体将外源性正常基因导入患者细胞内，以纠正或替代致病基因，眼与其他内脏器官相比更适合基因治疗，因为眼部的相对封闭状态及血-视网膜屏障能够避免载体向体内扩散，使眼球处于部分免疫赦免状态，从而限制了针对转染基因及载体蛋白的免疫反应。

ARL2BP即ADP-核糖基化因子样蛋白2结合蛋白(ADP ribosylation factor likeGTPase 2 binding protein)。ADP-核糖基化因子(ARF)样蛋白(ARLs)由RAS相关GTPases的ARF家族中功能独特的一组蛋白组成。由于ARF样蛋白酶、效应蛋白和GTP酶激活蛋白在纤毛形成和信号传导中起着关键作用，因此ARL2BP是纤毛相关疾病例如视网膜色素变性的基因治疗的候选靶点。

但如何使ARL2BP能够更有效的应用于RP的治疗，仍是本领域需要解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供编码ARL2BP的核酸及其应用，该编码序列能够提高ARL2BP的表达水平，提高防治RP的效果。并提供了并提供表达ARL2BP的腺相关病毒载体，并将它们应用于制备防治RP的药物。

本发明提供的编码ARL2BP的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸；

II)、与I)所述核酸的序列至少具有85％的同源性，且编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白的核酸；

III)、与I)～II)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明还提供了ARL2BP的转录单元，其包括：启动子、所述的核酸和终止子。

在本发明中，所述启动子为CMV启动子。一些实施例中，所述CMV启动子的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和所述的核酸。或者，所述重组载体包括骨架载体和本发明所述的转录单元。

本发明所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV2-7M8、AAV8或AAV9。一些实施例中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2。一些具体实施例中，所述腺相关病毒载体的骨架载体为pscAAV2。

一些实施例中，所述重组载体中，包括AAV2 5’ITR，CMV启动子，本发明所述的核酸，bGHpolyA序列和AAV2 3’ITR。

本发明所述的重组载体在制备防治眼部疾病的药物中的应用。

本发明中，所述眼部疾病为ARL2BP相关疾病。一些具体实施例中，所述眼部疾病为视网膜色素变性。本发明所述防治包括增加外核层细胞核层数，增长连接纤毛，恢复连接纤毛的稳定性，保证视细胞外节段的发育，保留更多视细胞，恢复眼对光刺激的a波振幅。

本发明还提供了一种药物，其包括本发明所述的重组载体。

本发明所述的药物中，还包括其他具有改善ARL2BP水平或活性的药物。

本发明还提供了一种防治ARL2BP相关疾病的方法，其为给予本发明所述的药物。

一些实施例中，本发明所述药物包括所述的重组载体和药学上可接受的辅料。本发明所述的药物的剂型为注射液剂。

本发明还提供了一种药物的递送方法，将如所述的药物制剂注射至眼部，优选地所述注射为玻璃体腔注射或视网膜下注射。

本发明所述的药物可以有效的在视网膜细胞表达ARL2BP，修复因为ARL2BP突变造成的视网膜疾病。

本发明对ADP-核糖基化因子样蛋白2结合蛋白(ARL2BP)编码基因序列进行了优化，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效转录和高效表达ARL2BP蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)，并构建了ARL2BP的重组表达载体。与未优化的ARL2BP的DNA编码序列相比，优化后的序列ARL2BP蛋白表达水平显著提高，能够非常有效地治疗视网膜色素变性，并且安全性好。

附图说明

图1示wtARL2BP和coARL2BP序列比对，优化前后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；

图2示AAV2-coARL2BP载体图谱(A)和AAV2-wtARL2BP载体图谱(B)，载体包含AAV25’ITR，CMV启动子，密码子优化后的ARL2BP cDNA或野生型ARL2BP cDNA，bGHpolyA序列和AAV2 3’ITR；

图3示AAV2-coARL2BP和AAV2-wtARL2BP质粒在293细胞中的表达效率，A：在293细胞中分别转染AAV2-coARL2BP和AAV2-wtARL2BP质粒，48小时后裂解细胞，Western blot检测ARL2BP蛋白表达水平，B：AAV2-coARL2BP和AAV2-wtARL2BP质粒转染293细胞表达ARL2BP蛋白相对丰度定量；

图4示优化前后ARL2BP蛋白与ARL2蛋白相互作用效果验证，AAV2-coARL2BP和AAV2-wtARL2BP质粒转染Y79细胞，48小时后裂解细胞提取蛋白，将等量的提取蛋白用于ARL2BP特异性的免疫沉淀，富集得到的产物利用ARL2抗体进行Western Blot检测；

图5示AAV2-coARL2BP病毒玻璃体腔注射后，敲除小鼠视网膜ARL2BP基因表达检测，将AAV2-coARL2BP病毒对ARL2BP敲除小鼠进行玻璃体腔注射，注射2个月后取小鼠视网膜利用Western Blot对治疗眼(AAV2-coARL2BP)和未治疗眼(AAV2-GFP)进行ARL2BP蛋白表达检测；

图6示AAV2-coARL2BP病毒处理后，敲除小鼠治疗眼(KO-AAV2-coARL2BP)和未治疗眼(KO-AAV2-GFP)及野生型小鼠(WT)视网膜外核层厚度检测与连接纤毛长度测量，A：注射后210天取敲除小鼠的治疗眼和未治疗眼以及野生型小鼠眼部视网膜，进行免疫荧光染色，根据外层细胞核数量和层数对距离视神经长度不同的三个区域(1,2,3)的上段与下段外核层厚度进行定量分析，B：注射后210天取敲除小鼠的治疗眼和未治疗眼以及野生型小鼠眼部视网膜，进行免疫荧光染色，对指示纤毛长度的标志蛋白分布的起点与终点距离进行测量，统计连接纤毛的平均长度；

图7示AAV2-coARL2BP病毒处理后，小鼠视网膜电位图检测，注射后2个月敲除小鼠的治疗眼(KO-AAV2-coARL2BP)和未治疗眼(KO-AAV2-GFP)以及野生型小鼠(WT)视网膜电图分析，在黑暗条件下给予不同强度的光刺激，记录光刺激下各小鼠(n＝10)眼睛的a波振幅。

具体实施方式

本发明提供了编码ARL2BP的核酸及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

ARL2BP即ADP-核糖基化因子样蛋白2结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，野生型编码ARL2BP的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示，记为wtARL2BP。本发明对编码ARL2BP的cDNA序列进行密码子优化(codon optimization)得到coARL2BP，具体地，本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。本发明提供的编码ARL2BP的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸；

III)、与I)～II)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明中，所述核酸是指由多个核苷酸聚合成的生物大分子化合物，本发明所述的核酸可以是DNA分子、RNA分子、PNA分子或LNA的形式。其可以为单链、双链形式存在，可为线性或环状。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

一些实施例中，所述编码ARL2BP的核酸的序列为：atggacgctctggaaggtgagagcttcgcactcagctttagtagcgcatccgacgctgaatttgacgctgtcgtcggatacctggaagatatcatcatggacgacgaatttcaactgttgcaaagaaactttatggataaatactacctcgaatttgaagacaccgaagaaaataaactcatatatacccctattttcaacgaatacatctccctggtggagaagtacattgaggagcagttgctgcagaggatccccgagttcaacatggccgcttttactactacccttcagcatcacaaagacgaagtagctggcgacatcttcgacatgcttcttactttcacagatttccttgcgtttaaagaaatgttcctggactatcgagcggagaaggaggggagggggctggatctgtcatctggcctggtagtgacatcactgtgcaaatctagctcccttcccgccagccagaataatctgcgccattag(如SEQ ID NO:3所示，记为coARL2BP)。

一些实施例中，所述编码ARL2BP的核酸与SEQ ID NO:3至少具有85％的同源性。

另一些实施例中，所述编码ARL2BP的核酸与SEQ ID NO:3至少具有90％的同源性。

另一些实施例中，所述编码ARL2BP的核酸与SEQ ID NO:3至少具有95％的同源性。

另一些实施例中，所述编码ARL2BP的核酸与SEQ ID NO:3至少具有98％的同源性。

另一些实施例中，所述编码ARL2BP的核酸与SEQ ID NO:3至少具有99％的同源性。

对优化前后的序列wtARL2BP/coARL2BP进行细胞水平表达效率检测，发现优化后的序列表达效率显著提高。体外细胞验证优化蛋白与ARL2的相互作用。对ARL2BP敲除的小鼠进行玻璃体腔注射AAV2-coARL2BP，可在小鼠的视网膜组织细胞检测到ARL2BP表达。210天后检测小鼠视网膜外核层(ONL)厚度，发现和对照AAV处理相比，AAV2-coARL2BP处理的小鼠视网膜外核层厚度显著增加，连接纤毛长度显著增长。同时视网膜电位图结果显示敲除小鼠治疗眼对刺激反应强烈。AAV2-coARL2BP处理的小鼠视网膜结构和功能均有显著的恢复，证明AAV2-coARL2BP药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。

本发明中，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。本发明提供的ARL2BP的转录单元包括：启动子、本发明所述的核酸和终止子。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。一些实施例中，所述转录单元中的启动子为CMV启动子。一些具体实施例中，所述CMV启动子的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。一些实施例中，所述的转录单元中终止子为polyA序列。本发明中的转录单元中，编码ARL2BP的核酸的3’端还包括bGHpolyA序列。一个具体实施例中，本发明所述转录单元包括顺序连接的：CMV启动子、SEQ ID NO:3所示序列的核酸片段、终止子和hGHpolyA信号片段。

在本领域，外源基因的表达通常通过将目的基因编码区序列(CDS)克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用骨架上构建的启动子驱动目的基因表达来实现。本发明中，所述重组载体，是指利用基因工程重组DNA技术，将DNA片段连接入骨架载体形成的基因表达载体。本发明提供的重组载体包括骨架载体和所述的核酸。所述骨架载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。载体优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。本发明所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV2-7M8、AAV8或AAV9。一些实施例中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2。一些具体实施例中，所述腺相关病毒载体的骨架载体为pscAAV2。一些实施例中，所述重组载体中，包括AAV2 5’ITR，CMV启动子，本发明所述的核酸，bGHpolyA序列和AAV2 3’ITR。具体的，本发明构建的重组载体如图2所示。

在本申请中，术语“腺相关病毒载体”或“AAV”通常是指腺病毒本身或其衍生物。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)通常是指一类属于微小病毒科、依赖病毒属的单链DNA病毒。AAV基因组可以包含DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框(ORF)。所述开放的阅读框可以包括rep和cap。rep由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的多个重叠基因组成，cap包含编码衣壳蛋白的重叠核苷酸序列，所述核苷酸序列可以包括VP1，VP2和VP3。所述衣壳蛋白相互作用形成衣壳。AAV具有多种常见血清型,100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

在本申请中，术语“血清型”通常是指通过血清学方法对腺相关病毒衣壳表面的表位进行检测，并对腺相关病毒进行分型。腺相关病毒具有多种常见血清型，100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

本发明还提供了一种表达ARL2BP的细胞株的制备方法，其包括：将所述的质粒组合转染宿主细胞，经纯化获得ARL2BP的腺相关病毒。所述宿主细胞为293细胞、293T细胞、人视网膜母细胞瘤细胞。在所述转染步骤中，采用PEI试剂，所述重组质粒与PEI试剂的质量比为1:2。

本发明所述的重组载体在制备防治眼部疾病的药物中的应用。本发明中，所述眼部疾病为ARL2BP相关疾病。一些具体实施例中，所述眼部疾病为视网膜色素变性。本发明所述防治包括增加外核层细胞核层数，增长连接纤毛，恢复连接纤毛的稳定性，保证视细胞外节段的发育，保留更多视细胞，恢复眼对光刺激的a波振幅。

本发明还提供了一种药物，其包括本发明所述的重组载体。

一些实施例中，所述药物包括所述的质粒载体和药学上可接受的辅料。本发明所述的药学上可接受的辅料包括药学中可接受的载体、赋形剂或渗透压调节剂。“药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。本发明所述的药物的剂型为注射液剂。本发明所述的药物中，还包括其他具有改善ARL2BP水平或活性的药物。

本发明还提供了一种防治ARL2BP相关疾病的方法，其为给予本发明所述的药物。本发明还提供了一种药物的递送方法，将如所述的药物制剂注射至眼部，优选地为玻璃体腔注射或视网膜下注射。

本发明证实使用AAV2-coARL2BP药物处理可以显著改善ARL2BP突变导致视网膜色素变性的小鼠的视网膜病理症状，以及达到视网膜功能的恢复。玻璃体腔注射AAV2-coARL2BP药物，ARL2BP可以在视网膜外核层高效表达，并且增加视网膜外核层厚度，以及增加连接纤毛的长度。同时，视网膜电位图显示，和对照组相比，AAV2-coARL2BP药物处理组小鼠对刺激反应强烈。因此此AAV2-coARL2BP药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1密码子优化的ARL2BP具有更高的表达效率

1、实验方法

1.1质粒载体构建

1.1.1.将AAV2-CMV质粒骨架，coARL2BP片段和wtARL2BP片段分别同时用Hind III与Xho I双酶切，然后将酶切后的片段分别与骨架进行连接，构建获得AAV2-coARL2BP和AAV2-wtARL2BP。

1.1.2.连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。

1.2细胞转染

1.2.1. 293细胞在细胞培养孔板中接板，待细胞生长至汇集度达到70％-80％。

1.2.2.更换培养基为DMEM+1×GlutaMAX。

1.2.3.将AAV2-coARL2BP和AAV2-wtARL2BP质粒与PEI试剂分别用培养基稀释后混匀，比例为1:2，混匀后室温静置20min，将混合物添加到细胞培养液中，轻轻摇匀。

1.2.4.将细胞培养板置于37℃的CO₂培养箱培养48hr。

1.3 Western Blot

1.3.1.蛋白样品制备，按1:100的比例在裂解液中加入PMSF(按用量现配现用)。

1.3.2.使用强裂解液裂解细胞。

1.3.3.使用BCA法测定蛋白浓度。

1.3.4.电泳

a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。

b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。

c、将5μl预染蛋白质分子marker SDS-PAGE加入加样孔内，使用1×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。

1.3.5.转膜

将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

1.3.6.封闭

转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入TBS洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。

1.3.7.一抗孵育

按照比例使用5％的脱脂奶粉/PBS+2％BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。

1.3.8.二抗孵育

加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。

1.3.9.蛋白检测

使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。

1.4实验结果和讨论

通过优化密码子使用偏好，DNA重复序列，mRNA二级结构，GC含量等多个参数，我们得到了和wtARL2BP序列显著不同的优化序列coARL2BP(图1)。把wt/co ARL2BP序列构建到AAV载体(图2)，然后在293细胞中转染相同量的两种质粒，并检测ARL2BP基因的表达，发现序列优化后的ARL2BP表达效率更高(图3)，证明密码子优化能够在不改变蛋白序列的情况下提高蛋白的表达水平，为细胞提供更多的正常功能的蛋白，从而更好地弥补基因突变造成的缺陷。

实施例2优化后ARL2BP蛋白与ARL2蛋白相互作用验证

1、实验方法

1.1细胞转染

宿主细胞为人视网膜母细胞瘤细胞系(Y79)，参照实施例1相应步骤。

1.2免疫沉淀

1.2.1.收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12000g，30min后取上清。

1.2.2.取裂解液将1μg相应的抗体和10-50μlprotein A-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。

1.2.3.免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min，将protein A-beads离心至管底；

1.2.4.protein A-beads用1ml裂解缓冲液洗3～4次，最后加入15μl的2×SDSBuffer加热10分钟，上样进行免疫印迹分析。

1.3 Western Blot

参照实施例1相应步骤。

1.4实验结果和讨论

将等量的AAV2-coARL2BP质粒与AAV2-wtARL2BP质粒分别转染人视网膜母细胞瘤细胞系(Y79)，48小时后裂解细胞，将等量的提取蛋白与ARL2BP特异性抗体4℃孵育，免疫沉淀反应后得到对应的富集产物，将富集产物用ARL2特异性抗体进行Western blot检测。结果发现实验组(AAV2-coARL2BP)和对照组(AAV2-wtARL2BP)富集产物都能与ARL2抗体结合，且实验组的信号要强于对照组(图4)。ARL2BP作为ARL2(ADP核糖基化因子类蛋白2)的效应蛋白，在细胞内通过与其形成复合体行使功能，维持视细胞外节段和纤毛的完整结构。我们的实验证明了优化后的编码ARL2BP蛋白的核酸能够在体外视细胞高效表达，且与ARL2蛋白高效结合。

实施例3 AAV-coARL2BP基因治疗药物改善ARL2BP敲除小鼠眼部功能，修复视网膜结构

1、病毒药物注射小鼠

1.1.分别准备好5×10¹²vg/ml的AAV2-coARL2BP药物、5×10¹²vg/ml的AAV2-GFP。

1.1.2、准备2-4月龄的ARL2BP敲除小鼠，分为两组，每组各6只。

1.1.3.将1μl/眼的AAV2-coARL2BP药物通过玻璃体腔注射进入适龄小鼠眼内，为AAV2-coARL2BP组小鼠；

将1μl/眼的AAV-GFP病毒通过玻璃体腔注射进入适龄小鼠眼内，为AAV-GFP组小鼠。

1.1.4.在两组小鼠注射后210天时，处死小鼠，将小鼠视网膜组织分离出，染色检测视网膜视细胞数量以及目的蛋白含量。

2、Western Blot

参照实施例1相应步骤。

3、视网膜电图分析

3.1.对小鼠进行麻醉和瞳孔扩张处理，同时向眼部滴入包含电极的2.5％羟丙甲纤维素液体，记录角膜电位反应。

3.2.暗适应条件下让小鼠适应黑暗过夜，用LED灯给予不同强度的短暂闪光刺激，记录暗适应ERG。

4、视网膜组织免疫荧光染色

4.1.取视网膜组织制片，用0.01MPBS冲洗5min×3次。

4.2.滴加10％正常山羊血清37℃封闭45min。

4.3.吸去多余液体，加入一抗(1：100)，放入湿盒中，37℃1h后置于4℃冰箱中过夜(保持在湿盒中)。

4.4. 0.01MPBS冲洗5min×3次。

4.5.在黑暗条件下加入二抗(1：200)，37℃温育45min。

4.6.在黑暗条件下吸弃二抗(注：不再冲洗)，加入DAPI染液，室温作用20min。

4.7.在黑暗条件下0.01MPBS冲洗5min×6次。

4.8.在黑暗条件下用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。

5、实验结果与讨论

为了证明AAV-coARL2BP基因治疗药物对ARL2BP突变引起的视网膜色素变性的治疗作用，利用ARL2BP敲除小鼠进行了体内实验。通过玻璃体腔注射药物，210天后观察药物治疗对小鼠眼部病变的改善情况。首先，我们取小鼠视网膜组织提取蛋白对ARL2BP在小鼠眼部表达进行检测，发现药物注射眼中(AAV2-coARL2BP)能够检测到ARL2BP蛋白而对照眼中(AAV2-GFP)检测不到ARL2BP的表达(图5)，说明药物注射能够正确传递药物到小鼠眼部组织。随后，接受药物注射的敲除的眼部组织被用来进行视网膜免疫染色分析，对距离视神经不同区域进行了人为划分(上段1,2,3；下段-1，-2，-3)，对不同区域的外核层厚度的定量分析表明，治疗眼的外核层细胞核层数明显大于对照眼(图6A)。标志蛋白分布的起点与终点能够指示连接纤毛的分布，我们将连接纤毛的平均长度进行了测量，发现治疗眼中连接纤毛显著长于对照眼(图6B)。以上结果说明药物注射后治疗眼中表达的ARL2BP一定程度上恢复了连接纤毛的稳定性，保证了视细胞外节段的发育，使更多的视细胞得以保留。同时，我们利用视网膜电图分析对敲除小鼠的药物治疗眼(KO-AAV2-coARL2BP)和对照眼(KO-AAV2-GFP)的功能进行了评估。发现黑暗条件下，治疗眼的a波振幅在给予不同强度的外界光刺激下均显著高于对照眼(图7)，这说明药物治疗对眼部功能起到了明显的改善作用。

综合以上结果，我们证明了AAV-coARL2BP基因治疗药物对ARL2BP突变引起的视网膜色素变性的治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 编码ARL2BP的核酸及其应用

<130> MP2022731

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 163

<212> PRT

<213> 人类(human)

<400> 1

Met Asp Ala Leu Glu Gly Glu Ser Phe Ala Leu Ser Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Ser Asp Ala Glu Phe Asp Ala Val Val Gly Tyr Leu Glu Asp Ile Ile

20 25 30

Met Asp Asp Glu Phe Gln Leu Leu Gln Arg Asn Phe Met Asp Lys Tyr

35 40 45

Tyr Leu Glu Phe Glu Asp Thr Glu Glu Asn Lys Leu Ile Tyr Thr Pro

50 55 60

Ile Phe Asn Glu Tyr Ile Ser Leu Val Glu Lys Tyr Ile Glu Glu Gln

65 70 75 80

Leu Leu Gln Arg Ile Pro Glu Phe Asn Met Ala Ala Phe Thr Thr Thr

85 90 95

Leu Gln His His Lys Asp Glu Val Ala Gly Asp Ile Phe Asp Met Leu

100 105 110

Leu Thr Phe Thr Asp Phe Leu Ala Phe Lys Glu Met Phe Leu Asp Tyr

115 120 125

Arg Ala Glu Lys Glu Gly Arg Gly Leu Asp Leu Ser Ser Gly Leu Val

130 135 140

Val Thr Ser Leu Cys Lys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ser Gln Asn Asn

145 150 155 160

Leu Arg His

<210> 2

<211> 492

<212> DNA

<213> 人类(Human)

<400> 2

atggacgcct tagaaggaga gagctttgcg ctgtctttct cctccgcctc tgatgcagaa 60

tttgatgctg tggttggata tttagaggac attatcatgg atgacgagtt ccagttatta 120

cagagaaatt tcatggacaa gtactacctg gagtttgaag acacagaaga gaataaactc 180

atctacacac ctatttttaa tgaatacatt tctttggtag aaaaatacat tgaagaacag 240

ctgctgcagc ggattcctga gttcaacatg gcagccttca ccacaacatt acagcaccat 300

aaggatgaag tggctggtga catattcgac atgctgctca ccttcacaga ttttctggct 360

tttaaagaaa tgtttttgga ctacagagca gaaaaagaag gccgaggact ggacttaagc 420

agtggcttag tggtgacttc attgtgcaaa tcatcttctc tgccagcttc ccagaacaat 480

ctgcggcact ag 492

<210> 3

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggacgctc tggaaggtga gagcttcgca ctcagcttta gtagcgcatc cgacgctgaa 60

tttgacgctg tcgtcggata cctggaagat atcatcatgg acgacgaatt tcaactgttg 120

caaagaaact ttatggataa atactacctc gaatttgaag acaccgaaga aaataaactc 180

atatataccc ctattttcaa cgaatacatc tccctggtgg agaagtacat tgaggagcag 240

ttgctgcaga ggatccccga gttcaacatg gccgctttta ctactaccct tcagcatcac 300

aaagacgaag tagctggcga catcttcgac atgcttctta ctttcacaga tttccttgcg 360

tttaaagaaa tgttcctgga ctatcgagcg gagaaggagg ggagggggct ggatctgtca 420

tctggcctgg tagtgacatc actgtgcaaa tctagctccc ttcccgccag ccagaataat 480

ctgcgccatt ag 492

<210> 4

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt gcaccaaaat caacgggact 120

ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180

gggaggtcta tataagcaga gct 203

Claims

1.编码ARL2BP的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸；

III)、与I)～II)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

2.ARL2BP的转录单元，其包括：启动子、权利要求1所述的核酸和终止子。

3.根据权利要求2所述的转录单元，其特征在于，所述启动子为CMV启动子。

4.重组载体，其包括骨架载体和权利要求1～3任一项所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为病毒载体；

所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2或AAV2-7M8。

6.根据权利要求4或5所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体为pscAAV2。

7.权利要求4～6任一项所述的重组载体在制备防治眼部疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述眼部疾病为视网膜色素变性。

9.一种药物，其特征在于，包括权利要求4～6任一项所述的重组载体。

10.一种药物的递送方法，其特征在于，将如权利要求9所述的药物制剂注射至眼部，所述注射为玻璃体腔注射或视网膜下注射。