CN118019757A

CN118019757A - Kcnv2基因疗法

Info

Publication number: CN118019757A
Application number: CN202280061604.XA
Authority: CN
Inventors: A·乔治亚迪斯
Original assignee: MeiraGTx UK II Ltd
Current assignee: MeiraGTx UK II Ltd
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2024-05-10
Also published as: KR20240052746A; EP4370538A1; AU2022311329A1; CA3225080A1; WO2023285986A1; IL310018A

Abstract

本文提供了用于表达Kv8.2的表达构建体、病毒基因组和载体，以及包含本文公开的载体的药物组合物。还提供了使用本文公开的表达构建体和载体的方法，包括治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与KCNV2基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体。

Description

KCNV2基因疗法

技术领域

本公开总体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明提供了用于治疗视网膜疾病的基因疗法的组合物和方法。

背景技术

Kv8.2是由KCNV2基因编码的电压门控钾通道亚基。KCNV2基因位于染色体9p24.2上，并且由2个编码545个氨基酸的蛋白质的外显子组成。所述蛋白质在人类、小鼠和猕猴的视网膜中在视杆细胞和视锥细胞光感受器内节(椭圆体和肌样区域)中表达，而在外节中不存在。Kv8.2与其他钾亚基相互作用，诸如在视杆细胞和视锥细胞内节中表达的Kv2.1，以及在人类中在视锥细胞中表达但在视杆细胞中不表达的Kv2.2。Kv8.2进一步与Kv2通道相互作用以改变其生物物理特性。

Kv8.2是迄今为止唯一与人类疾病有关的钾通道亚基。Kv8.2的变体/突变导致严重的遗传性光感受器营养不良，称为“伴有超常视杆细胞反应的视锥细胞营养不良”(CDSSR)。CDSSR的症状包括视敏度下降、色觉缺陷和视网膜电图反应改变(包括b波振幅升高)。

因此，迫切需要用于治疗与KCNV2突变相关的视网膜疾病(包括但不限于CDSSR)的新疗法。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种表达构建体，所述表达构建体包含：

(a)赋予在感光细胞中表达的启动子序列，和

(b)编码Kv8.2的核酸序列；

其中所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

在实施方案中，启动子序列是CAG或视紫红质激酶(RK)启动子序列。在实施方案中，启动子序列包含与SEQ ID:NO:8至少90％同一的序列。在实施方案中，启动子序列包含SEQ ID:NO:8的序列。在其他实施方案中，启动子序列包含与SEQ ID:NO:7至少90％同一的序列。在实施方案中，启动子序列包含SEQ ID:NO:7的序列。

在实施方案中，表达构建体还包含转录后调控元件。在实施方案中，表达构建体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在实施方案中，WPRE包含与SEQ ID NO:11至少90％同一的序列或包含SEQ ID NO:11的序列。

在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是来自WT KCNV2基因的编码序列(cds)。在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:9至少90％同一的序列。在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含含有SEQ ID NO:9的序列。

在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是密码子优化的KCNV2基因序列。在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少90％同一的序列。在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含含有SEQ ID NO:10的序列。

在实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:13至少90％同一的序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列编码包含SEQ ID NO:13的蛋白质。

在实施方案中，表达构建体还包含牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)信号。在实施方案中，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:12至少90％同一的序列。在实施方案中，聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:12。

在实施方案中，表达构建体包含与选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列至少90％同一的序列。在实施方案中，表达构建体包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列。

在另一方面，本公开提供了一种包含本文公开的表达构建体的载体。在实施方案中，载体是病毒载体。在实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。在实施方案中，载体包含源自AAV血清型AAV2的基因组。在实施方案中，载体包含源自AAV7m8的衣壳。在实施方案中，载体包含源自AAV5的衣壳。

在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的载体和药学上可接受的载剂(carrier)。

在另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与KCNV2基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体或药物组合物。在实施方案中，视网膜疾病是伴有超常视杆细胞反应的视锥细胞营养不良(CDSSR)。

在另一方面，本公开提供了一种增加有需要的受试者中KCNV2表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体或药物组合物。

在另一方面，本公开提供了一种增加有需要的受试者的光感受器中的Kv8.2水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体或药物组合物。

在实施方案中，载体或药物组合物是通过眼内注射施用。在所公开的方法的实施方案中，载体或药物组合物被注射到受试者的中央视网膜中。

附图说明

图1示出表达构建体的示意图：pCAG-KCNV2 WT、pCAG-KCNV2 Opti、pRT-KCNV2 WT和pRT-KCNV2 Opti。

图2示出如通过qPCR(转染后48小时)测定的相对于ARPE19细胞中KCNV2 WT和KCNV2 Opti的mRNA水平，HEK293细胞中KCNV2 WT和KCNV2 Opti的mRNA水平。

图3示出用pCAG-GFP(顶行)、pCAG-KCNV2 Opti(中间行)和pCAG-KCNV2 WT(底行)转染的ARPE19细胞的Kv8.2免疫荧光。比例尺＝10μm。

图4A和4B示出通过FACS分析的来自HEK293细胞的数据。图4A.显示来自分别用pCAG-KCNV2 WT和pCAG-KCNV2 Opti表达构建体转染的HEK293细胞的三个独立实验的平均荧光强度(MFI)的FACS数据。图4B.显示与分别用pCAG-KCNV2 WT或pCAG-KCNV2Opti表达构建体转染的细胞相比，未转染对照中Kv8.2-Alexa 488阳性细胞群体的百分比的FACS数据。在密码子优化(Opti)的载体与野生型(WT)载体之间Kv8.2阳性细胞％没有显著差异。

图5A和图5B示出经转导的ARPE19细胞中的转导效率。图5A示出用所示的AAV5载体以2感染复数(MOI)转染的Kv8.2免疫标记的ARPE19细胞中的Kv8.2荧光强度(每个细胞的平均积分密度)。图5B示出用所示的AAV5载体以2MOI转导后呈Kv8.2阳性的DAPI阳性ARPE19细胞的百分比。

图6示出视网膜类器官形态。整个视网膜类器官的实时明场成像。第140天转导发生时WT(顶行)和KCNV2 KO视网膜类器官的典型形态。视网膜类器官是层状的，具有光感受器外节(“刷状缘”)和偶见的视网膜色素上皮(RPE)簇。在WT与敲除(KO)视网膜类器官之间没有观察到总体形态学差异。

图7示出KCNV2 KO视网膜类器官(K28D5)中的转基因Kv8.2表达。用AAV7m8转导后三周的共焦平铺扫描分析。在最外层的感光细胞层中检测到信号。比例尺＝100μm和10μm。

图8示出视网膜内层细胞的AAV7m8转导。将经转导的视网膜冷冻切片用Kv8.2和视杆双极细胞标记物PKCa共染色。除了ONL之外，WT类器官在内核层(INL)(通过虚线与外核层(ONL)分开)中还含有多个Kv8.2阳性视网膜内层细胞(箭头)，而大多数Kv8.2阳性经转导细胞位于外核层中。pRK-KCNV2载体产生很少可检测到的Kv8.2蛋白(下图)，尽管在AAV7m8RK-KCVN2 Opti条件的ONL中可观察到一些Kv8.2阳性光感受器细胞(*)。比例尺＝10μm。

图9示出RPE细胞的AAV转导。除了光感受器之外，类器官中还存在RPE细胞。RPE存在于簇中(箭头)，而不是如在体内观察到的邻近光感受器外节的平面片。RPE是极化的，并在其顶端表面(A)处表达CRALBP，细胞核位于基底(B)。AAV有效转导视网膜类器官中的RPE细胞，在整个细胞质中检测到高水平的Kv8.2。相比之下，AAV RK-KCNV2在RPE细胞中没有产生可检测水平的Kv8.2表达。

图10示出分别用AAV5 pCAG-KCNV2-Opti、AAV5pRK-KCNV2-Opti、AAV7m9 pCAG-KCNV2-Opti和AAV7m9pRK-KCNV2-Opti转导米勒(Muller)胶质细胞。CRALBP对米勒胶质细胞进行染色，所述细胞跨越神经视网膜并通过与视杆细胞和视锥细胞的紧密连接形成外界膜。尽管米勒胶质细胞与感光细胞非常接近，但它们并未针对Kv8.2进行共染色。

图11示出转基因Kv8.2表达定位于质膜和光感受器内节。将克隆K28(分化5)用7m8AAV载体转导，其中密码子优化的载体和由CAG启动子驱动的WT KCNV2载体(CAG KCNV2-WT和7m8 CAG KCVN2 Opti)用视紫红质和Kv8.2染色。细胞核用DAPI复染。

图12示出Kv8.2与Kv.2.1在光感受器内节的共定位。WT对比用AAV5 CAG-WT或AAV5CAG-Opti载体转导的经转导KCNV2 KO类器官的高倍共聚焦显微术。钾通道Kv2.1定位于球状内节结构的质膜，载体来源的Kv8.2在内节中以与WT相似的表达模式共表达。

图13A、13B和13C示出WT、对照和经转导的视网膜类器官中的TUNEL染色。图13A用DAPI和末端脱氧核苷酸基转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)(细胞凋亡的指标)染色的WT视网膜类器官冷冻切片的全共聚焦平铺扫描(40倍放大倍数)。TUNEL反应性在视网膜细胞层(INL和ONL)中几乎不存在，但可在类器官的中心(虚线区域)和非视网膜组织区域中检测到。图13B定性地，相对于WT，KCNV2KO类器官中的TUNEL反应性没有增加，并且用AAV 7m8转导的KO类器官中没有增加。图13C.定性地，相对于WT，KCNV2 KO类器官中的TUNEL反应性没有增加，并且用包含WT或密码子优化的KCNV2的AAV5载体转导的KO类器官中没有增加。

图14示出AAV转导的视网膜类器官中的视锥细胞数量。LM视蛋白染色用于确定WT、KCNV2 KO和用所示载体转导的类器官中每100μm的视锥细胞平均数量。每个点代表一个经转导的类器官，其视锥细胞是从一个7μm视网膜冷冻切片中计数的。整个类器官在40倍放大倍数下成像，并且对每μm的视锥细胞进行计数(每个类器官计数34至483个)。所有类器官都具有良好的视锥细胞分布。与WT未编辑的对照相比，未转导的KCNV2 KO类器官具有显著更多的视锥细胞(p＝0.004，未配对t检验)。AAV转导(所有分组的载体)相对于WT并未减少视锥细胞数量(p＝0.2)，但相对于未转导确实减少了视锥细胞数量(p＝0.02)。误差棒＝Stdev。

图15A和15B示出通过qPCR测定的经转导的视网膜类器官中的相对mRNA水平。图15A用含有光感受器特异性RK或组成型CAG启动子的不同AAV载体转导的KCNV2 KO克隆K5、K12和K28中的KCNV2表达驱动两种不同型式的KCNV2基因的表达：密码子优化的或WT。包括未处理的KO KCNV2克隆和WT同基因对照I5进行比较。图显示用不同的AAV载体AAV5-CAG-KCNV2opti、AAV7m8-CAG-KCNV2opti、AAV5-RK-KCNV2opti或AAV7m8-RK-KCNV2-Opti转导后21天，密码子优化的KCNV2的表达。结果表示为KCNV2 mRNA表达相对于最低表达样品(AAV5CAG-KCNV2-Opti)的倍数变化。图15B示出用所示AAV载体转导后21天WT KCNV2的表达的图。结果表示为WT KCNV2 mRNA相对于来自同一KO克隆的年龄匹配的未转导对照的倍数变化。

图16A和16B示出视网膜类器官免疫荧光的定量。图16A示出外核层(ONL)中的总Kv8.2荧光。条形＝针对测量的面积归一化并表示为WT对照类器官中的荧光％的经转导类器官中的平均荧光。采集平铺扫描图像以获得ONL的整个长度上的荧光测量值。虚线代表未转导KO对照类器官中的平均“背景”信号。每个点代表一个类器官。n＝3-4个来自独立实验的类器官。误差棒＝+/-SEM。在7m8和AAV5衣壳中的CAG启动子与RK启动子之间存在总荧光的显著差异(分别p＝0.031和0.028，双尾配对学生t检验)。尽管密码子优化(Opti)的载体中荧光强度有增加的趋势，但具有CAG或RK启动子的载体中在WT与Opti之间没有显著差异。图16B示出经转导的KCNV2 KO、WT和AAV 7m8 Kv8.2转导的类器官的光感受器层中的代表性免疫荧光。将Kv8.2和钾通道亚基Kv.2.1、视锥抑制蛋白(Arr3)和细胞核用DAPI染色。比例尺＝10μm。

图17示出经转导的类器官中Kv8.2和Kv2.1的相对共定位。将类器官冷冻切片用Kv.2.1和Kv8.2共染色，并在FIJI中的阈值图像上测量总共定位面积，并针对每个类器官测定的视网膜长度归一化。结果表示为相对于未转导对照的倍数变化。通过单因素ANOVA和邓尼特氏(Dunnett’s)多重比较检验对结果进行分析。*p＝0.02，**p＝0.002。

图18A、18B和18C示出经转导的类器官中的邻位连接测定(PLA)信号特异性。图18A.Kv2.1和Kv8.2共染色后的PLA信号(点)在光感受器内节/外节所在外周的视网膜类器官中丰富。图18B KCNV2KO类器官的ONL(光感受器层)中很大程度上不存在PLA信号。图18C针对每个类器官的测量面积归一化的PLA斑点(成像J)的定量(n＝3个目标区域(ROI))。相对于WT(克隆K28和K12)，KCNV2 KO光感受器中的PLA信号显著降低(p<0.03)。误差棒＝SEM。

图19示出AAV5和AAV7m8转导的光感受器中的PLA信号。来自7μm类器官冷冻切片的63x最大强度投影。光感受器层(ONL)具有在外丛状层上方的DAPI通道中可见的独特紧凑结构，所述层没有任何细胞核。PLA信号(点)表示Kv.2.1/Kv8.2蛋白质-蛋白质相互作用。PLA信号集中在ONL的顶端边缘，在光感受器内节(IS)的区域中。与源自IPSC克隆K12的未转导的KCNV2 KO类器官相比，经转导的类器官具有更高的PLA信号密度。

图20A和20B示出两个经转导的视网膜类器官克隆(分别为克隆12和克隆28)中PLA斑点的定量。条形代表每个视场ONL中PLA斑点的平均数量(每100-150个光感受器大约32个，每个视场计数10-600个斑点)，针对测量面积归一化。误差棒＝SEM)。

具体实施方式

本文提供了用于表达钾电压门控通道调节剂(Potassium Voltage-GatedChannel Modifier)亚家族V成员2(Kv8.2)的表达构建体、病毒基因组和载体，以及使用所述表达构建体、病毒基因组和载体来治疗与KCNV2基因中的一个或多个突变相关的视网膜疾病的方法。

Kv8.2

Kv8.2是电压门控钾通道亚基。KCNV2基因位于染色体9p24.2上，并且包含2个编码545个氨基酸的Kv8.2蛋白质的外显子。Kv8.2不能形成功能性同聚通道，但与其他钾通道亚基Kv2.1和Kv2.2相互作用以改变其生物物理特性。Kv8.2是迄今为止唯一与人类疾病有关的沉默亚基。变体/突变导致严重的遗传性光感受器营养不良，称为“伴有超常视杆细胞反应的视锥细胞营养不良”(CDSSR)。

KCNV2(Kv8.2)在人类、小鼠和猕猴的视网膜中在视杆细胞和视锥细胞光感受器内节(椭圆体和肌样区域)中表达，而在外节中不存在。Kv8.2与在视杆细胞和视锥细胞内节中表达的Kv2.1以及在人类中在视锥细胞中表达但在视杆细胞中不表达的Kv2.2。

KCNV2(Kv8.2)纯合敲除(KO)小鼠显示与人类病症的许多相似性，包括对亮光刺激的a波反应减少且b波反应升高的视网膜电图(ERG)。KCNV2 KO小鼠表现出视锥细胞数量减少(WT的80％)、整个视网膜的TUNEL阳性细胞增加(1、3和6个月大时)以及外核层整体变薄(ONL，6个月大时WT的60％)。

许多重要的光感受器蛋白的正确亚细胞定位先前已被证明(例如视紫红质、RetGC、ABCA4位于视杆细胞外节；Bassoon、Ribeye位于突触末端)。人胚胎干细胞(HESC)或诱导型多能干细胞(IPSC)来源的人视网膜类器官中钾通道亚基Kv8.2、Kv2.1和Kv2.2的存在尚未在任何出版物中进行研究，尽管已通过单细胞RNA测序在人视网膜类器官中检测到KCNV2转录物的存在。记录的Kv8.2及其结合配偶体功能的物种特异性差异(例如，小鼠视网膜中不存在Kv2.2)使得人类细胞模型的使用对于开发潜在KCNV2 AAV基因疗法非常重要。

KCNV2突变可引起视网膜疾病，包括光感受器营养不良，诸如伴有超常视杆细胞反应的视锥细胞营养不良(CDSSR)。此类疾病的诊断是通过电生理学评估而确定的；功能结果取决于疾病的阶段和个体的年龄。例如，CDSSR与对亮光刺激的a波反应减少且b波反应升高的视网膜电图(ERG)相关。视锥细胞数量减少(正常值的约80％)可支持视锥细胞营养不良的诊断。例如，具有异常KCNV2表达的视网膜可具有TUNEL阳性细胞增加和外核层整体变薄(ONL，正常的60％)。

表达构建体

在一方面，提供了表达构建体，所述表达构建体包含：(a)赋予在感光细胞中表达的启动子序列，和(b)编码钾电压门控通道调节剂亚家族V成员2(Kv8.2)的核酸序列；其中所述核酸序列可操作地连接至启动子。如本文所用，“可操作地连接”是指表达控制序列(例如启动子)与Kv8.2的编码序列和表达控制序列邻接，所述表达控制序列反式或在一定距离处起作用以控制Kv8.2的表达。表达控制序列包括适当的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；高效的RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质加工和/或分泌的序列。

大量的表达控制序列(例如天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的)是本领域已知的，并且可用于驱动基因的表达，这取决于所需表达的类型。对于真核细胞，表达控制序列通常包括启动子、增强子以及可包括剪接供体和受体位点的聚腺苷酸化序列。聚腺苷酸化(poly A)序列通常插入在编码Kv8.2的序列之后和3'ITR序列之前。可用于本文公开的方法中的rAAV的另一个调控组件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列可用于从单个基因转录物产生多于一个多肽。IRES(或其他合适的序列)用于产生含有多于一条多肽链的蛋白质，或用于从同一细胞或在同一细胞内表达两种不同的蛋白质。示例性IRES是脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入序列，其支持光感受器、RPE和神经节细胞中的转基因表达。优选地，IRES位于rAAV载体中编码Kv8.2的序列的3'。

在一个实施方案中，启动子序列包含视紫红质激酶(RK)启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列包含与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，启动子序列包含SEQ ID NO:7。

在一个实施方案中，启动子序列包含合成的巨细胞病毒来源的启动子序列(CAG)。在一些实施方案中，启动子序列包含与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，启动子序列包含SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，启动子对感光细胞具有特异性，即启动子在感光细胞中具有活性，但在其他细胞类型中具有降低的活性或没有活性。

在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是来自WT KCNV2基因的编码序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含SEQ ID NO:9。

在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是密码子优化的序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含SEQ ID NO:10。

在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ IDNO:13至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列编码包含SEQ ID NO:13的蛋白质。

在一个实施方案中，表达构建体包含转录后调控元件。在一个实施方案中，表达构建体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，转录后调控元件包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，转录后调控元件包含SEQ ID NO:11。

在一个实施方案中，表达构建体包含聚腺苷酸化信号。在一个实施方案中，表达构建体包含牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:12。

载体

在一方面，提供了重组载体及其用于将转基因或表达构建体引入细胞中的用途。在一些实施方案中，重组载体包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含额外DNA元件，所述额外DNA元件包括提供DNA在宿主细胞中的复制和靶基因在靶细胞中以适当水平表达的DNA片段。普通技术人员理解表达控制序列(启动子、增强子等)是基于其促进靶基因在靶细胞中的表达的能力来选择的。如本文所用，“载体”是指包含待在体外或体内递送至宿主细胞中的多核苷酸的媒介物。载体的非限制性实例包括重组质粒、酵母人工染色体(YAC)、微型染色体、DNA微环或病毒(包括病毒来源的序列)。载体还可指包含待在体外或体内递送至宿主细胞中的核酸的病毒粒子。在一些实施方案中，载体是指包含重组病毒基因组的病毒粒子，其中所述重组病毒基因组包含一个或多个ITR和转基因。

在一个实施方案中，重组载体是病毒载体或多个病毒载体的组合。

在一方面，提供了包含本文公开的任何表达构建体的载体。

在一方面，提供了包含核酸的载体，所述核酸包含(a)赋予在感光细胞中表达的启动子序列，和(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子。

在一些实施方案中，启动子对感光细胞具有特异性。

在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是密码子优化的序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含SEQ IDNO:10。

在一个实施方案中，载体包含含有转录后调控元件的核酸。在一个实施方案中，载体包含含有土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的核酸。在一些实施方案中，转录后调控元件包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，转录后调控元件包含SEQ ID NO:11。

在一个实施方案中，载体包含含有聚腺苷酸化信号的核酸。在一个实施方案中，载体包含含有牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)信号的核酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:12。

在一个实施方案中，载体包含含有一个或多个反向末端重复序列(ITR)的核酸。在一个实施方案中，ITR序列源自AAV血清型2。在一个实施方案中，5’ITR序列包含与SEQ IDNO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，5’ITR序列包含SEQ ID NO:5。在一个实施方案中，3’ITR序列包含与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，3’ITR序列包含SEQ ID NO:6。

在一些实施方案中，载体包含核酸，所述核酸包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列。

在一个实施方案中，提供了包含核酸的载体，所述核酸包含以下中的一者或多者：

(a)包含RK启动子序列的启动子序列；

(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(e)一个或多个ITR。在一些实施方案中，核酸包含两个ITR序列。

(a)包含CAG启动子序列的启动子序列；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(a)包含RK启动子序列的启动子序列；

(b)编码Kv8.2的密码子优化的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(a)包含CAG启动子序列的启动子序列；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(a)启动子序列，所述启动子序列包含含有与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列的启动子序列；

(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子，并且其中编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；

(c)转录后调控元件，所述转录后调控元件包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；

(d)聚腺苷酸化信号，所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；以及

(a)启动子序列，所述启动子序列包含含有与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列的启动子序列；

(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子，并且其中编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；

(a)启动子序列，所述启动子序列包含与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；

(b)编码Kv8.2蛋白的核酸序列，其中所述Kv8.2蛋白包含与SEQ ID NO:13至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列，并且其中编码Kv8.2蛋白的核酸序列可操作地连接至启动子；

(a)启动子序列，所述启动子序列包含与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；

(a)包含SEQ ID NO:7的启动子序列；

(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子，并且其中编码Kv8.2的核酸序列包含SEQ ID NO:9；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:8的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:7的启动子序列；

(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子，并且其中编码Kv8.2的核酸序列包含SEQ ID NO:10；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:8的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:7的启动子序列；

(b)编码Kv8.2蛋白的核酸序列，其中所述Kv8.2蛋白包含SEQ ID NO:13，并且其中编码Kv8.2蛋白的核酸序列可操作地连接至启动子；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:8的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

病毒载体

用于在靶细胞、组织或生物体中表达靶基因的病毒载体是本领域已知的，并且包括例如AAV载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体病毒载体、痘苗病毒载体或合成病毒载体(例如，嵌合病毒、花叶病毒或假型化病毒、和/或含有外来蛋白质、合成聚合物、纳米粒子或小分子的病毒)。

AAV载体

腺相关病毒(AAV)是小型单链DNA病毒，其需要辅助病毒来促进有效复制。AAV的4.7kb基因组的特征在于两个反向末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框，其分别编码Rep蛋白和Cap蛋白。Rep阅读框编码分子量为78kD、68kD、52kD和40kD的四种蛋白质。这些蛋白质的功能主要是调控AAV复制以及将AAV挽救并整合到宿主细胞的染色体中。Cap阅读框编码分子量为85kD(VP 1)、72kD(VP2)和61kD(VP3)的三种结构蛋白，它们形成病毒粒子衣壳。AAV病毒粒子中80％以上的总蛋白质包含VP3。5'和3'末端的rep和cap开放阅读框两侧是约141bp长的ITR。ITR是AAV复制、挽救、包装和AAV基因组整合所必需的唯一顺式元件。整个rep和cap结构域可被切除并用治疗性或报告基因转基因置换。

重组腺相关病毒“rAAV”载体包括原子任何腺相关病毒血清型的任何载体。rAAV载体可具有全部或部分缺失的AAV野生型基因中的一个或多个，优选为Rep和/或Cap基因，但保留功能性侧接ITR序列。

在一些实施方案中，病毒载体是rAAV病毒粒子，其包含rAAV基因组和一种或多种衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV基因组包含本文公开的表达盒。

在一些实施方案中，本文公开的病毒载体包含核酸，所述核酸包含分别位于编码Kv8.2的序列的5'和3'的AAV 5’ITR和3’ITR。然而，在某些实施方案中，可能需要核酸含有串联排列的5’ITR和3’ITR序列，例如5'至3'或头对尾或呈另一种替代构型。在其他实施方案中，可能需要核酸含有ITR的多个拷贝或具有位于编码Kv8.2的序列的5'和3'两者的5’ITR(或相反，3’ITR)。ITR序列可位于紧邻异源分子的上游和/或下游，或者可存在插入序列。ITR无需为野生型核苷酸序列，并且可改变(例如通过核苷酸的插入、缺失或取代)，只要序列提供功能性挽救、复制以及包装即可。ITR可选自AAV2，或选自其他AAV血清型，如本文所述。

在一些实施方案中，病毒载体是AAV载体，诸如AAV1(即，含有AAV1 ITR和AAV1衣壳蛋白的AAV)、AAV2(即，含有AAV2 ITR和AAV2衣壳蛋白的AAV)、AAV3(即，含有AAV3 ITR和AAV3衣壳蛋白的AAV)、AAV4(即，含有AAV4 ITR和AAV4衣壳蛋白的AAV)、AAV5(即，含有AAV5ITR和AAV5衣壳蛋白的AAV)、AAV6(即，含有AAV6 ITR和AAV6衣壳蛋白AAV)、AAV7(，即含有AAV7 ITR和AAV7衣壳蛋白的AAV)、AAV8(即，含有AAV8ITR和AAV8衣壳蛋白的AAV)、AAV9(即，含有AAV9 ITR和AAV9衣壳蛋白的AAV)、AAVrh74(即，含有AAVrh74 ITR和AAVrh74衣壳蛋白的AAV)、AAVrh.8(即，含有AAVrh.8ITR和AAVrh.8衣壳蛋白的AAV)或AAVrh.10(即，含有AAVrh.10ITR和AAVrh.10衣壳蛋白的AAV)。

在一些实施方案中，病毒载体是假型化AAV载体，其含有来自一种AAV血清型的ITR和来自不同AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，假型化AAV是AAV2/5(即，含有AAV2ITR和AAV5衣壳蛋白的AAV)。在一些实施方案中，假型化AAV是AAV2/7m8(即，含有AAV2 ITR和AAV7m8衣壳蛋白的AAV)。

在一些实施方案中，AAV载体含有重组衣壳蛋白，诸如含有来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh74、AAVrh.8或AAVrh.10的衣壳蛋白中的一种或多种的嵌合体的衣壳蛋白。在实施方案中，衣壳是变体AAV衣壳，诸如AAV2变体rAAV2-retro(来自以引用的方式并入本文中的WO 2017/218842的SEQ ID NO:44)。

在一方面，提供了包含核酸的病毒基因组，所述核酸包含(a)赋予在感光细胞中表达的启动子序列，和(b)编码Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子。

在一个实施方案中，启动子序列包含RK启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列包含与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，启动子序列包含SEQ ID NO:7。

在一个实施方案中，启动子序列包含CAG启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列包含与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，启动子序列包含SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，启动子对感光细胞具有特异性。

在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是来自野生型KCNV2基因的编码序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，编码RetGC的核酸序列包含SEQ ID NO:9。

在一个实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列是密码子优化的序列。在一些实施方案中，编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，编码RetGC的核酸序列包含SEQ ID NO:10。

在一个实施方案中，病毒基因组包含含有转录后调控元件的核酸。在一个实施方案中，病毒基因组包含含有WPRE的核酸。在一些实施方案中，转录后调控元件包含与SEQ IDNO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，转录后调控元件包含SEQ ID NO:11。

在一个实施方案中，病毒基因组包含含有聚腺苷酸化信号的核酸。在一个实施方案中，病毒基因组包含含有BGH-polyA信号的核酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:12。

在一方面，病毒基因组包含含有一个或多个反向末端重复序列(ITR)的核酸。在一个实施方案中，ITR序列源自AAV血清型2。在一个实施方案中，5’ITR序列包含与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，5’ITR序列包含SEQID NO:5。在一个实施方案中，3’ITR序列包含与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一个实施方案中，3’ITR序列包含SEQ ID NO:6。

在一些实施方案中，病毒基因组包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1-4的序列中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含核酸，所述核酸包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列。

在一个实施方案中，提供了包含核酸的病毒基因组，所述核酸包含以下中的一者或多者：

(a)包含RK启动子序列的启动子序列；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(e)一个或多个ITR。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个ITR序列。

(a)包含CAG启动子序列的启动子序列；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(a)包含RK启动子序列的启动子序列；

(b)编码密码子优化的Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(a)包含CAG启动子序列的启动子序列；

(c)WPRE；

(d)BGH-polyA信号；以及

(b)编码密码子优化的Kv8.2的核酸序列，其中编码Kv8.2的核酸序列可操作地连接至启动子，并且其中编码Kv8.2的核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列；

(a)包含SEQ ID NO:7的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:8的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:7的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:8的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:7的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

(a)包含SEQ ID NO:8的启动子序列；

(c)包含SEQ ID NO:11的转录后调控元件；

(d)包含序列SEQ ID NO:12的聚腺苷酸化信号；以及

腺病毒(AV)载体包括例如基于人类2型腺病毒和人类5型腺病毒的那些，其已通过E1和E3区中的缺失而变为复制缺陷型。可将转录盒插入E1区中，从而产生重组E1/E3缺失AV载体。腺病毒载体还包括辅助物依赖性高容量腺病毒载体(也称为高容量“无内脏”或“去内脏”载体)，所述载体不含病毒编码序列。这些载体含有病毒DNA复制和包装所需的顺式作用元件，主要为反向末端重复序列(ITR)和包装信号(CY)。这些辅助物依赖性AV载体基因组具有携带从几百个碱基对至约36kb的外来DNA的潜力。

或者，可使用诸如慢病毒载体的其他系统。基于慢病毒的系统可转导非分裂以及分裂细胞，使它们可用于靶向例如CNS的非分裂细胞的应用。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒，并且像所述病毒一样，整合至宿主基因组中，从而提供非常长期的基因表达的潜力。

还可使用例如阳离子脂质、聚合物或两者作为载剂通过非病毒载体系统将携带含有表达盒的靶基因的包括质粒、YAC、微型染色体以及微环的多核苷酸引入细胞或生物体中。还可使用共轭聚L-赖氨酸(PLL)聚合物和聚乙烯亚胺(PEI)聚合物系统来将载体递送至细胞。针对细胞培养物与生物体，用于将载体递送至细胞的其他方法包括流体力学注射和电穿孔以及使用超声波。关于用于基因递送的病毒和非病毒递送系统的综述，参见以引用的方式并入本文的Nayerossadat,N.等人(Adv Biomed Res.2012；1:27)。

rAAV病毒粒子产生

本文公开的rAAV病毒体可使用本文描述的材料和方法以及本领域技术人员已知的材料和方法来构建和产生。用于构建本发明的任何实施方案的此类工程化方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括遗传工程化、重组工程化和合成技术。参见例如，上文引用的Sambrook等人和Ausubel等人；以及国际专利公布号WO 95/13598。此外，适合于在腺病毒衣壳中产生rAAV盒的方法已在美国专利号5,856,152和5,871,982中进行了描述。

简言之，为了将rAAV基因组包装到rAAV病毒粒子中，宿主细胞必须含有表达AAVrep和AAV cap或其功能片段所必需的序列以及AAV生产所需的辅助基因。AAV rep和cap序列获自如本文鉴定的AAV来源。AAV rep和cap序列可以本领域技术人员已知的任何方式引入宿主细胞中，包括但不限于转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包衣微丸、病毒感染和原生质体融合。在一个实施方案中，rep和cap序列可通过一种或多种核酸分子转染至宿主细胞中并作为附加体稳定存在于细胞中。在另一个实施方案中，rep和cap序列稳定整合到细胞的基因组中。另一个实施方案具有在宿主细胞中瞬时表达的rep和cap序列。例如，用于这种转染的有用核酸分子从5'至3'包含启动子、插入启动子与rep基因序列起始位点之间的任选间隔区、AAV rep基因序列和AAV cap基因序列。

可在单个载体上提供rep和cap序列以及它们的表达控制序列，或者可在其自己的载体上提供每个序列。优选地，rep和cap序列被提供在同一载体上。或者，rep和cap序列可提供在含有待引入宿主细胞中的其他DNA序列的载体上。优选地，用于这种构建体中的启动子可以是本领域技术人员已知的任何合适的组成型、诱导型或天然启动子。提供rep和cap蛋白的分子可呈将这些组分转移至宿主细胞中的任何形式。理想地，这种分子呈质粒形式，其可含有其他非病毒序列，诸如标记基因的序列。这种分子不含AAV ITR，并且通常不含AAV包装序列。为了避免同源重组的发生，这种质粒中避免了其他病毒序列，特别是腺病毒序列。理想地构建这种质粒以便其可稳定地转染至细胞中。

尽管提供rep和cap的分子可瞬时转染至宿主细胞中，但优选用在宿主细胞中表达功能性rep/cap蛋白所必需的序列稳定地转化宿主细胞，例如作为附加体或通过整合至宿主细胞的染色体中。取决于控制这种稳定转染的宿主细胞的表达的启动子，rep/cap蛋白可瞬时表达(例如，通过使用诱导型启动子)。

用于构建本发明的实施方案的方法是常规遗传工程化或重组工程化技术，诸如上述参考文献中描述的那些。例如，可根据制造商的说明书，使用磷酸钙法(Clontech)或Effectene试剂(Qiagen,Valencia,Calif.)利用三重转染方法来产生rAAV。还参见Herzog等人,1999,Nature Medic.,5(1):56-63，对于以下实施例中使用的方法，采用具有转基因的质粒CPA-RPE65(一种含有rep和cap的辅助质粒)，以及提供E2A、E4Orf6和VA的腺病毒辅助功能的质粒。虽然本说明书提供了具体构建体的说明性实例，但使用本文提供的信息，本领域技术人员可使用间隔区、启动子和其他元件(包括至少一个翻译起始点和终止信号以及任选添加聚腺苷酸化位点)的选择来选择和设计其他合适的构建体。

然后通过培养含有如本文所述的rAAV病毒的宿主细胞来产生rAAV病毒粒子，所述宿主细胞含有待包装至rAAV病毒粒子中的rAAV基因组、在指导其表达的调控序列控制下的AAV rep序列和AAV cap序列。合适的病毒辅助基因，例如腺病毒E2A、E4Orf6和VA以及其他可能的辅助基因，可以本领域已知的多种方式提供至培养物，优选提供在单独的质粒上。此后，在不存在污染性辅助病毒或WT AAV的情况下，从细胞或细胞培养物中分离指导转基因表达的重组AAV病毒粒子。

KCNV2基因的表达可以本领域已知的方式测量。例如，可在体外感染靶细胞，并通过DNA印迹或定量聚合酶链反应(PCR)来监测细胞中转基因的拷贝数。RNA表达水平可通过RNA印迹或定量逆转录酶(RT)-PCR(qPCR)来监测；并且蛋白质表达水平可通过蛋白质印迹、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或通过下面实施例中详述的具体方法来监测。

药物组合物

本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的任何载体和药学上可接受的赋形剂。

优选通过常规方法评估含有编码Kv8.2的基因的重组AAV的污染，然后配制成适合施用于患者的药物组合物。

这种配制涉及使用药学上和/或生理学上可接受的媒介物或载剂，特别是适合于视网膜下注射的媒介物或载剂，诸如缓冲盐水或其他缓冲剂，例如HEPES，以将pH维持在适当的生理水平。

本发明的载体可被配制成药物组合物。除了载体之外，这些组合物还可包含药学上和/或生理学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂或本领域技术人员熟知的其他添加剂。此类材料应该是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的精确性质可由技术人员根据施用途径来确定。药物组合物通常呈液体形式。液体药物组合物通常包含液体载剂，诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。另外的载剂提供于以引用的方式并入本文的国际专利公布号WO 00/15822中。可包含生理盐水溶液、氯化镁、右旋糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，可使用表面活性剂，诸如普朗尼克酸(PF68)0.001％。在一些情况下，使用林格氏注射液、乳酸林格氏注射液或哈特曼氏溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

对于延迟释放，载体可包含在被配制用于缓慢释放的药物组合物中，诸如根据本领域已知的方法在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载剂系统中。

如果要长期保存病毒，则可在存在甘油的情况下冷冻。

治疗方法

本文提供了一种治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与KCNV2基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体。本文提供了用于治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法中的载体，其中所述视网膜疾病与KCNV2基因中的一个或多个突变相关。在一些实施方案中，受试者携带KCNV2中的突变。

在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。如本文所用的术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验室动物、家养宠物和农场动物。哺乳动物包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、绵羊或猫等。个体和患者也是本文的受试者。

如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗，其中目标是为了减慢(减少)不希望的生理疾患、病症或疾病，或为了获得有益或所需的临床结果。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于：症状的减轻；疾患、病症或疾病的程度减小；疾患、病症或疾病的状态稳定(即，没有恶化)；疾患、病症或疾病的发作延迟或疾患、病症或疾病的进展减慢；疾患、病症或疾病状态的改善(amelioration)；以及疾患、病症或疾病的缓解(无论部分还是全部)或增强或改善。治疗包括在没有过度水平的副作用的情况下引发临床上显著的反应。治疗还包括与不接受治疗情况下的预期存活期相比存活期延长。术语“预防(prevent)”、“预防(prevention)”等是指在明显的疾病或病症发作之前起作用，以防止疾病或病症发展或使疾病或病症的程度最小化，或减缓其发展过程。

在一些实施方案中，视网膜疾病是视锥细胞营养不良。在一个实施方案中，视网膜疾病是伴有超常视杆细胞反应的视锥细胞营养不良(CDSSR)。

在一方面，提供了一种方法，所述方法包括：

(a)确定受试者是否携带KCNV2基因中的突变；以及

(b)如果所述受试者携带KCNV2基因中的突变，则向所述受试者施用包含本文公开的载体的药物组合物。

施用途径和方法

在一些实施方案中，本文公开的载体或药物组合物是通过眼内注射施用。在一些实施方案中，本文公开的载体或药物组合物是通过直接视网膜、视网膜下或玻璃体内注射施用。在一些实施方案中，本文公开的载体或药物组合物被施用至受试者的中央视网膜。

本发明载体的剂量可根据各种参数来确定，特别是根据待治疗患者的年龄、体重和状况、具体的眼部病症以及所述疾病(如果进行性)发展的程度、施用途径以及所需的方案来确定。再次，医生将能够确定任何特定患者所需的施用途径和剂量。携带在启动子序列控制下编码所需转基因的核酸序列的rAAV的有效量理想地在约1×10⁹至2×10¹²个rAAV基因组颗粒之间或在1×10¹⁰至2×10¹¹个基因组颗粒之间。基因组颗粒在本文中被定义为含有单链DNA分子的AAV衣壳，可用序列特异性方法(诸如实时PCR)对其进行定量。在一些实施方案中，以约150至约800μl之间的体积提供约1×10⁹至2×10¹²个rAAV基因组颗粒。在一些实施方案中，以约250至约500μl之间的体积提供约1×10¹⁰至2×10¹¹个rAAV基因组颗粒。主治医师可选择这些范围内的其他剂量。

剂量可作为单次剂量提供，但可对另一只眼睛重复，或者在载体可能由于某种原因(诸如手术并发症)没有靶向视网膜的正确区域的情况下重复。治疗优选地是对每只眼睛进行单一永久性治疗，但是可以考虑重复注射，例如在未来几年和/或用不同的AAV血清型。因此，可能需要施用本文公开的药物组合物的多个“加强”剂量。例如，根据转基因在眼部靶细胞内的持续时间，可以6个月间隔或在第一次施用后每年递送加强剂量。此类加强剂量及其需要可由主治医师使用例如本领域已知的视网膜和视觉功能测试以及视觉行为测试来监测。其他类似的测试可用于确定所治疗受试者随时间推移的状态。主治医师可选择适当的测试。或者，本文公开的方法还可涉及在单次或多次感染中注射更大量的含载体溶液，以允许视觉功能水平接近在WT视网膜中发现的水平。

额外方法

在一方面，提供了一种增加有需要的受试者中Kv8.2表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的载体。在一方面，提供了一种增加细胞中Kv8.2表达的方法，所述方法包括使所述细胞与本文公开的载体接触。

制品和药盒

还提供了用于本文所述的方法中的药盒和制品。在多个方面，药盒包含合适包装中的本文所述的组合物(例如，用于递送Kv8.2编码序列的组合物)。用于本文所述的组合物(诸如用于注射的眼用组合物)的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶、广口瓶、软包装(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可进一步对这些制品进行灭菌和/或密封。

还提供了包含本文所述的组合物的药盒。这些药盒还可包含关于使用组合物的方法(诸如本文所述的用途)的说明书。本文所述的药盒还可包括从商业和用户观点来看理想的其他材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及带有用于执行组合物的施用或执行如本文所述的任何方法的说明书的包装插页。例如，在一些实施方案中，药盒包含用于在靶细胞中表达Kv8.2蛋白的包含KCNV2转基因的rAAV、适合注射的药学上可接受的载剂、以及以下中的一种或多种：缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有执行注射的说明书的包装插页。

应理解，本发明不限于所描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可以变化。与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案。还应理解，本说明书中本发明的公开内容包括此类特定特征的所有可能组合。例如，在本发明的特定方面或实施方案或特定权利要求的上下文中公开了特定特征的情况下，所述特征也可以在可能的程度上与本发明的其他特定方面和实施方案组合使用和/或在本发明的其他特定方面和实施方案的上下文中使用，并且通常在本发明中使用。

在本文中提及包括两个或更多个定义的步骤的方法的情况下，定义的步骤可以以任何顺序或同时进行(除非上下文排除该可能性)，并且所述方法可以包括在任何定义的步骤之前，在两个定义的步骤之间或在所有定义的步骤之后进行的一个或多个其他步骤(除非上下文排除那些可能性)。

所有其他引用的专利和申请通过引用整体并入本文。此外，在以引用的方式并入本文中的参考文献中的术语的定义和使用与本文中提供的这个术语的定义不一致或相矛盾时，以本文中提供的这个术语的定义为准并且参考文献中的这个术语的定义不再适用。

为了便于更好地理解本发明，给出具体实施方案的以下实施例。以下实施例不应理解为限制或限定本发明的整个范围。

实施例

实施例1：AAV-KCNV2表达构建体设计和生产

首先，将KCNV2 cDNA或密码子优化的KCNV2 cDNA克隆到普遍存在的CAG启动子或光感受器特异性RK1启动子下游的AAV单链主链中。将Kozak共有序列置于启动子与转基因之间。将土拨鼠肝炎病毒突变体6(WPREm6)序列置于转基因与polyA之间。polyA序列是牛生长激素polyA(BghpA)序列。关于四种表达构建体的示意图，参见图1。克隆是在VectorBuilder,Inc.(Chicago,IL,USA)进行的。收到质粒后，在Genewiz(SouthPlainfield,NJ,USA)进行完整测序(包括ITR区域)，并使用Snapgene(San Diego,CA,USA)将序列与质粒图谱进行比对。通过在HEK293 T细胞中三重转染将四种构建体包装到AAV5和7m8衣壳中，并在SignaGen实验室(Frederick,MD,USA)通过氯化铯离心进行纯化。

实施例2：通过细胞系中的转染验证CAG表达构建体。

为了验证转基因表达构建体，使用标准核转染技术转染HEK293和视网膜色素上皮(ARPE19)细胞。最初，用分别包含在CAG启动子控制下的WT KCNV2基因或密码子优化的KCNV2基因的表达构建体(pCAG-KCNV2 WT和pCAG-KCNV2 Opti)转染细胞。使用包含绿色荧光蛋白(GFP)转基因和人巨细胞病毒(CMV)启动子(CMV-GFP)的表达质粒作为对照。通过qPCR、免疫荧光和FACS验证表达。

通过qPCR验证CAG表达构建体。

分别使用pCAG-KCNV2 WT或pCAG-KCNV2 Opti表达构建体，分别在HEK293或ARPE19细胞核转染后48小时评估KCNV2 WT和KCNV2 Opti mRNA水平。使用被设计用于检测WT和Opti转录物的TAQMAN引物探针组通过qPCR测定mRNA水平。将表达水平针对管家基因GAPDH和β肌动蛋白归一化。两种表达质粒在两种细胞系中均产生可检测的KCNV2 mRNA。尽管转染相同量的质粒DNA，但在48小时时ARPE19的WT和Opti转录物均比HEK293少，表明转染效率较差(图2)。由于引物对之间的扩增效率存在差异，因此在此分析中无法直接比较Opti和WT转录物水平。

通过免疫荧光验证CAG表达构建体。

将ARPE19细胞分别用pCAG-KCNV2 WT和pCAG-KCNV2 Opti表达构建体进行核转染。ARPE19细胞还用来自Lonza Biosciences(Morrisville,NC,USA)的pmaxGFP(由CAG启动子驱动的GFP)表达构建体转染作为对照。使用KCNV2兔多克隆第一抗体(Sigma Aldrich#HPA031131，1:100)和驴抗兔Alexa Fluor 555第二抗体检测Kv8.2蛋白。某些用两种KCNV2表达质粒转染的ARPE19细胞产生可通过免疫荧光检测到的Kv8.2蛋白(图3)。如通过许多ARPE19细胞没有可检测的Kv8.2蛋白所指示，转染水平较低。Kv8.2蛋白定位于细胞膜和细胞质。

通过荧光激活单细胞分选(FACS)验证CAG表达构建体

用3.5μg pCAG-KCNV2 WT或pCAG-KCNV2 Opti表达构建体转染HEK293细胞，并在48小时后收获。pCMV-GFP表达构建体用作对照。使用Kv8.2第一抗体(Sigma Aldrich#HPA031131，1:100)和Alexa Fluor 488抗兔抗体对悬浮液中的细胞进行染色。将细胞群体针对未转染的对照进行门控(图4)。48小时时，WT对比密码子优化质粒中Kv8.2表达细胞的数量没有显著差异(n＝3个独立实验)。

中值荧光强度(MFI)用于定量转染细胞中Kv8,2蛋白表达水平。48小时时，KCNV2WT对比KCNV2 Opti表达构建体中Kv8.2/Alexa Fluor 488染色细胞的中值荧光之间没有显著差异(n＝3个独立实验)。

实施例3：ARPE19细胞中表达构建体的AAV转导

将AAV5 KCNV2载体(CAG-KCNV2 WT、CAG-KCNV2 Opti、RK-KCNV2 WT和RK-KCNV2Opti)以2感染复数(MOI)转导至室载玻片上的ARPE19细胞中(每个细胞1E4个载体基因组(VG)和每个细胞1E5个VG)并在21天后固定。将用Kv8.2第一抗体和Alexa Fluor555第二抗体染色的细胞通过共聚焦成像。在FIJI(Image J)中进行分析之前，对每个条件拍摄三幅图像(来自三个孔)并进行盲法处理。相对于DAPI对Kv8.2表达细胞的百分比进行评分，并在FIJI(Image J)中对Kv8.2表达细胞的平均染色强度(积分密度)进行定量。

表达AAV(Opti和WT)的CAG启动子在Kv8.2表达细胞百分比和Kv8.2染色强度水平方面得分高于RK(Opti和WT)。尽管变异性很高，但CAG Opti和CAG WT载体在任一MOI下在Kv8.2表达细胞中均没有显著不同的染色强度水平。CAG Opti在1E4条件下具有显著更多的Kv8.2阳性细胞，但在1E5条件下则没有(图5)。

实施例4：类器官中表达构建体的AAV转导

使用表达构建体进行类器官的AAV转导的方法

将视网膜类器官转移至96孔低附着板(每孔一个类器官)中，并在第140天用八种AAV KCNV2构建体(AAV5 CAG-KCNV2 WT、AAV5 CAG-KCNV2 Opti、AAV5 RK-KCNV2 WT、AAV5RK-KCNV2Opti、AAV7m8 CAG-KCNV2 WT、AAV7m8 CAG-KCNV2 Opti、AAV7m8 RK-KCNV2 WT和AAV7m8 RK-KCNV2 Opti)中的一种以总计100μL培养基中每个类器官3E11个病毒基因组(VG)的剂量转导。第二天，将类器官转移至24孔低附着板中，并在3天后更换培养基。基于形态选择用于转导的视网膜类器官；选择存在清晰的层状结构和可见的外节刷状边界(图6)进行固定和通过免疫荧光进行分析。具有内部花式结构(其中光感受器存在于内部结构中)的类器官被转导用于qPCR分析，其中测定来自整个类器官的mRNA。

将类器官再培养3周，然后通过快速冷冻整个类器官(qPCR和蛋白质印迹)或在4％多聚甲醛(PFA)中在4℃下固定30分钟来收获。接下来，将类器官在标准磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中洗涤两次，然后在4℃下浸入含有30％蔗糖的PBS中过夜。第二天，将类器官包埋在最佳切割温度(OCT)化合物中，并在-80℃下保存，然后以7μm进行冷冻切片。

对于KCNV2 KO类器官的每次转导，均包括来自同一克隆和分化批次的未转导对照以及WT(非CRISPR编辑)对照。

感光细胞最外层中的AAV7m8 KCNV2转导

AAV转导后三周，对KCNV2 KO视网膜类器官进行切片并测定转基因KCNV2蛋白产物Kv8.2。全视网膜类器官的共聚焦分析揭示，KCNV2 WT和KCNV2密码子优化载体均在最外光感受器层中表达(图7)。

视网膜内层细胞的AAV7m8 KCNV2转导

在经转导的类器官的视网膜内层中几乎检测不到Kv8.2产物。用双极细胞标记物PKCa共染色揭示没有Kv8.2染色PKCa阳性双极细胞，但是WT视网膜类器官具有若干对Kv8.2呈免疫阳性的视网膜内层细胞(白色箭头图7)，可能是无长突细胞、水平细胞或视锥双极细胞。相比之下，经转导的KCNV2 KO视网膜类器官具有非常少的Kv8.2阳性视网膜内层细胞，尽管在含有CAG启动子的载体中经转导的光感受器有高表达(图8)，从而表明AAV无法接近这些层和/或感光细胞的优先载体嗜性。

视网膜色素上皮(RPE)细胞的AAV7m8 KCNV2转导

色素RPE细胞和光感受器源自相同的发育祖细胞群体。在体内，RPE单层位于光感受器外节附近，限定视网膜下空间的边界。视网膜类器官中的RPE细胞在类器官的外表面成簇排列(图9，左图)。在存在的情况下，RPE细胞被AAV5和7m8两者转导，并且CAG-KCVN2表达高水平的Kv8.2蛋白。RK-KCNV2在RPE细胞中不表达可检测的Kv8.2，可能是由于RK启动子的光感受器特异性。

米勒胶质细胞的AAV7m8 KCNV2转导

米勒胶质细胞横跨视网膜的整个厚度，提供结构支撑并形成外界膜和内界膜。除了RPE细胞之外，CRALBP是视网膜类器官中米勒胶质细胞的标记物，可看到它跨越内核层和外核层并形成外界膜。用CRALBP与Kv8.2共染色揭示了这两种标记物没有共染色，表明AAV5和AAV7m8确实在米勒胶质细胞中转导和/或表达转基因(图10)。

实施例5：AAV7m8 KCNV2转导细胞中的Kv8.2定位

光感受器内节中的Kv8.2定位

据报道，内源性KCNV2(Kv8.2)蛋白在视杆细胞和视锥细胞内节的质膜中表达，而不是在外节中表达。光感受器蛋白运输至其正确的亚细胞区室对其功能至关重要，并且错误折叠的蛋白质的错误运输是许多遗传性视网膜变性病症的致病性的基础。

将经转导的视网膜类器官用视紫红质染色，发现其正确定位于膜状外节结构。发现转基因kv8.2(7m8 CAG-WT和7m8 CAG-Opti)定位于感光细胞体的内节(IS)和质膜(图11)。外节(OS)不存在Kv8.2染色。这表明从WT和密码子优化载体两者产生的蛋白质在翻译后适当地运输。

AAV7m8 KCNV2转导细胞中Kv8.2与Kv2.1共定位

KCVN2基因产物Kv8.2与视网膜中的钾通道亚基Kv2.1相互作用。Kv8.2是沉默Kv通道亚基，并且因此只能通过其与较大Kv通道亚基的相互作用来发挥作用。在WT视网膜类器官中，aKv2.1抗体清楚地标记了光感受器内节，在视锥细胞内节(椭圆体区域)中具有更强的信号(图12)。内源性Kv8.2蛋白(图12)存在于视杆细胞和视锥细胞内节中，其中与Kv2.1共定位。在KO视网膜类器官中，Kv8.2不存在，Kv2.1染色的内节椭圆体图案被检测到光感受器。AAV来源的Kv8.2蛋白(WT和密码子优化载体两者)也在经转导的视网膜类器官的光感受器内节结构中表达，表明两种转基因均被翻译成蛋白质，所述蛋白质被有效地运输至正确的亚细胞区室(图12)。

实施例6：AAV转导后的挽救和毒性的评估

在1、3和6月龄的KCNV2 KO小鼠模型中报告了整个视网膜的TUNEL反应性增加，并且在6月龄时报告了每mm2的视锥细胞数量减少至WT的80％。为了确定我们的胎儿期KCNV2KO视网膜细胞模型是否在转导时重现了这些表型并评估任何载体相关的细胞毒性，在WT对比KO类器官和用所有AAV载体转导的KO类器官中测量了TUNEL反应性和视锥细胞数量。

AAV转导类器官中的TUNEL反应性

TUNEL是通过标记细胞凋亡过程中产生的双链DNA断裂中的3'-羟基末端来检测DNA片段化的方法。在KCNV2 KO转导类器官对比未转导对照和WT中评估视网膜类器官冷冻切片中的TUNEL反应性。

图13A示出转导后3周AAV5 CAG-KCNV2-Opti处理的视网膜类器官(克隆K28)的TUNEL染色。TUNEL阳性细胞主要出现在类器官的中心(虚线)，而视网膜细胞层(ONL、INL)中没有或很少有TUNEL阳性细胞。相对于WT，KCNV2 KO光感受器中的TUNEL反应性没有增加，表明在此模型中在此时间点没有发生“体外”视网膜变性。

两种AAV血清型均未在具有WT或密码子优化转基因的ONL或INL中引起显著水平的TUNEL阳性细胞(图13b和13c)。这表明所测试的AAV血清型和过表达的转基因蛋白对视网膜细胞没有细胞毒性。类器官中心存在TUNEL阳性细胞已在其他HIPSC视网膜类器官模型中被广泛报道并且最可能是由于缺氧和/或向视网膜类器官中心的细胞的营养转移不良所致。

AAV转导类器官中的克隆细胞数量

KCNV2 KO小鼠在6月龄时表现出视锥细胞轻度损失至WT水平的80％。为了确定这种表型是否在人类胎儿期视网膜类器官中重现，通过免疫荧光对WT和KCNV2 KO视网膜类器官中每100μm视网膜组织的视锥细胞进行了定量。L/M视蛋白阳性视锥细胞数量从在40倍放大倍数下(7μm视网膜冰冻切片)取得的整个类器官平铺扫描进行计数，并针对视网膜组织的总长度进行归一化。对总计12个WT和8个未处理的KO视网膜类器官中的平均视锥细胞数量进行计数。相对于WT，KCNV2 KO细胞系中的视锥细胞数量显著增加(图14)。经转导的视网膜类器官(所有分组的载体n＝30)显示WT与经转导的类器官之间没有统计学显著差异p＝0.2，但相对于未转导的KO显著降低(p＝0.02)。

实施例7：经转导的类器官中转基因KCNV2 mRNA和Kv8.2蛋白的定量评估。

qPCR评估经转导的类器官中的KCNV2 mRNA水平

通过qPCR对载体驱动的转基因表达进行定量比较。在用WT和由RK或CAG启动子驱动的密码子优化型式的KCNV2基因转导并通过AAV2/5或AAV2/7m8递送的KCNV2 KO类器官中评估KCNV2mRNA表达水平。通过快速冷冻在转导后21天收获来自克隆K12、K5和K28的整个经转导类器官。根据SOP(PRCL-SOP-RNA纯化cDNA合成)提取RNA，DNA酶处理并从0.1μg RNA制备cDNA。将基因表达水平根据内源性管家基因GAPDH和β肌动蛋白归一化，并使用ΔΔCT方法确定相对表达。

与接受AAV5-RK-密码子优化的KCNV2、AAV5-CAG-密码子优化的KCNV2或AAV7m8-CAG密码子优化的KCNV2的视网膜类器官相比，在用AAV7m8-RK-密码子优化的KCNV2转导的视网膜类器官中观察到最高水平的KCNV 2-Opti表达(图15a)。

在用AAV7m8-CAG-WT KCNV2转导的类器官中观察到最高水平的载体来源的KCNV2WT mRNA。用AAV7m8-CAG-WT KCNV2处理的类器官中的KCNV2表达比未转导的KCNV2 KO对照高约138倍(图9b)，并且AAV7m8-RK-WT KCNV2比未转导的对照高约86倍。用AAV5(在CAG启动子或RK启动子的控制下)递送的不同型式的KCNV2 WT基因转导的视网膜类器官比未转导的对照高约10倍(图15B)。

总体而言，发现AAV2-7m8在经转导视网膜类器官中的光感受器方面比AAV5更有效。令人感兴趣地，在由光感受器特异性RK启动子或组成型CAG启动子驱动的载体中，WT或Opti KCNV2 mRNA没有显著差异。

通过免疫荧光评估经转导类器官中的Kv8.2蛋白水平。

Kv8.2蛋白水平在经转导类器官的外核层中表达(参见图7、图16B)。为了确定载体之间的相对累积蛋白水平，用Kv8.2抗体对类器官冷冻切片进行染色，并且在FIJI(ImageJ)中对ONL中的总累积荧光(原始积分密度)进行定量，并针对测量的总ONL面积进行归一化。图16示出表示为包埋在同一块上并在同一天成像的WT类器官的百分比的总荧光。在7m8和AAV5衣壳中的CAG启动子与RK启动子之间存在总荧光的显著差异(分别p＝0.031和0.028，双尾配对学生t检验)。尽管密码子优化(Opti)的载体中荧光强度有增加的趋势，但具有CAG或RK启动子的WT与Opti载体之间没有显著差异。

实施例8：Kv8.2和Kv2.1在经转导的视网膜类器官中的共定位。

通过免疫荧光评估的Kv8.2和Kv2.1的相对共定位

Kv8.2在视网膜中通过与电压门控钾通道Kv2.1形成异聚体来发挥作用。定性分析揭示载体来源的Kv8.2与内源性Kv2.1在光感受器内节的共定位(图12)。为了确定恢复的Kv8.2的相对水平，进行了定量免疫荧光和共定位分析。将7um类器官冷冻切片用Kv8.2和Kv2.1共染色，并且整个类器官切片在40倍放大倍数下成像，随后在LSM软件中合并以创建整个类器官的平铺扫描，将其导出到FIJI图像分析软件中。在FIJI(image J)中采集并分析了每个载体n＝3-5个类器官的平铺扫描。使用“图像计算>和”函数确定内节区域中的总共定位面积，以确定Kv.2.1和Kv8.2通道两者中高于阈值的像素。将此值针对目标区域的长度归一化，以考虑不同的视网膜类器官尺寸。

WT(CTR)与未处理的KCNV2KO类器官之间存在显著差异(图16)。在7m8 CAG-WT和7m8 CAG-Opti处理的类器官中平均共定位面积有增加的趋势，但差异未达到显著性(单因素ANOVA，D邓尼特氏多重比较检验)。7m8 RK-WT和RK-Opti平均共定位面积与未处理的相似，表明缺乏可通过这种方法检测到的载体来源的Kv8.2表达。

通过邻位连接测定评估的Kv8.2和Kv2.1的共定位和邻近性

开发了邻位连接测定(PLA)来评估钾通道亚基Kv8.2与Kv2.1之间光感受器中的蛋白质-蛋白质相互作用。将经转导的KCNV2 KO视网膜类器官连同WT(阳性对照)和未转导的KO(阴性对照)固定并包埋在同一块上的OCT中进行冷冻切片。将7μm冷冻切片用Kv8.2(兔)和Kv2.1(小鼠)抗体以及兔和小鼠PLA正负探针共染色。连接和扩增步骤(双链-橙色)后，通过共焦显微镜在63倍放大倍数下可视化外核层中的PLA斑点。观察整个类器官，在感光细胞层的位置处，特别是在光感受器内节所在的位置，存在明显的PLA信号浓度(图18A)。这证实了kv.8.2/Kv2.1相互作用在预期细胞类型和亚细胞区室中的特异性。此外，通过KCNV2 KO视网膜类器官的ONL处信号的显著减少证实了特异性(图18B、18C)。PLA信号的定量揭示了相对于在同一载玻片上加工的WT类器官，KCNV2 KO克隆(K28和K12)中每个ONL区域的PLA斑点数量显著减少(图18C)。

经转导的视网膜类器官中PLA信号的定量

用AAV载体转导的KCNV2 KO视网膜类器官表达KCNV2mRNA和Kv8.2蛋白。载体来源的经翻译蛋白质的功能取决于其与电压门控钾通道kv2.1形成异聚体的能力。除了评估蛋白质中载体来源的KCNV2转录物和Kv8.2的总量之外，我们还使用PLA来评估其与Kv2.1相互作用的程度。

将用来自克隆系的8种所示载体中的一种转导的KCNV2 KO类器官与WT(阳性对照)和未转导的KCNV2 KO类器官(阴性对照)包埋在同一冷冻保存组织块中，在KCNV2 KO克隆细胞系中K12和K28中重复实验。如上所述，将7μm冷冻切片用Kv8.2(兔)和Kv2.1(小鼠)抗体以及兔和小鼠PLA正负探针共染色。使用63倍放大倍数的最大强度z投影来定量每个视场的PLA斑点。每个z投影捕获100-150个感光细胞，并且含有17(未转导)至550个斑点(最大信号)。Kv8.2抗体滴度从1:100降至1:400，以使信号最大化而无PLA斑点的聚结。图19示出相对于WT和未转导的，来自用AAV 2/5和AAV7m8衣壳两者转导的KCNV2 KO克隆K12的代表性最大强度投影。相对于未转导的类器官，PLA斑点在经转导的类器官中更丰富，其中信号频率在光感受器内节区域的顶端边缘处最高。使用FIJI(Image J)“分析颗粒”函数对ONL中的斑点进行定量。ONL尺寸的区域差异需要将信号标针对所测量的ONL区域归一化。

AAV转导对PLA斑点数量具有显著影响(P>0.001，单因素ANOVA)，个体比较显示所有载体产生比未转导显著更高的信号(图20A和20B)。CAG WT载体产生的PLA信号显著高于RKWT载体(K12 p＝0.02，K28 P＝0.01)，但CAG Opti与RK Opti载体之间没有显著差异(K12p＝0.17，K28 p＝0.77)。在两个克隆中，在7m8 RK Wt与7m8 RK Opti之间存在显著差异(K12 p<0.0001，K28 p>0.01)。

KCNV2 KO光感受器中较高的PLA信号是较高功能蛋白水平的指标。在所有7m8载体中，信号与WT水平没有显著差异–克隆K12中的7m8 RK-WT除外。

这表明所有7m8载体都能够以足够的功效将KCNV2递送至人感光细胞，从而能够使功能性Kv2.1/Kv8.2异聚体恢复到WT水平。

序列概述

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Claims

1.一种表达构建体，所述表达构建体包含：

(a)赋予在感光细胞中表达的启动子序列，和

(b)编码Kv8.2的核酸序列；

其中所述核酸序列与所述启动子可操作地连接。

2.如权利要求1所述的表达构建体，其中所述启动子序列是CAG或视紫红质激酶(RK)启动子序列。

3.如权利要求2所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含与SEQ ID:NO:8至少90％同一的序列。

4.如权利要求3所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含SEQ ID:NO:8的序列。

5.如权利要求2所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含与SEQ ID:NO:7至少90％同一的序列。

6.如权利要求5所述的表达构建体，其中所述启动子序列包含SEQ ID:NO:7的序列。

7.如前述权利要求中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体还包含转录后调控元件。

8.如权利要求7所述的表达构建体，其中所述表达构建体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

9.如权利要求7所述的表达构建体，其中所述WPRE包含与SEQ ID NO:11至少90％同一的序列。

10.如权利要求9所述的表达构建体，其中所述WPRE包含含有SEQ ID NO:11的序列。

11.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列是WT KCNV2基因。

12.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:9至少90％同一的序列。

13.如权利要求12所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列包含含有SEQ ID NO:9的序列。

14.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列是密码子优化的KCNV2基因序列。

15.如权利要求1-10中任一项所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:10至少90％同一的序列。

16.如权利要求15所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列包含含有SEQ ID NO:10的序列。

17.如权利要求1-16中任一项所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:13至少90％同一的序列。

18.如权利要求17所述的表达构建体，其中编码所述Kv8.2的所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:13的蛋白质。

19.如前述权利要求中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体还包含牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)信号。

20.如权利要求19所述的表达构建体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:12至少90％同一的序列。

21.如权利要求20所述的表达构建体，其中所述聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:12。

22.如前述权利要求中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含与选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列至少90％同一的序列。

23.如权利要求22所述的表达构建体，其中所述表达构建体包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列。

24.一种载体，所述载体包含如前述权利要求中任一项所述的表达构建体。

25.如权利要求24所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

26.如权利要求25所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。

27.如权利要求26所述的载体，其中所述载体包含源自AAV血清型AAV2的基因组。

28.如权利要求26或27中任一项所述的载体，其中所述载体包含源自AAV7m8的衣壳。

29.如权利要求26或27中任一项所述的载体，其中所述载体包含源自AAV5的衣壳。

30.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求24-29中任一项所述的载体和药学上可接受的载剂。

31.一种用于治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病与KCNV2基因中的一个或多个突变相关，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求24-29中任一项所述的载体或如权利要求30所述的药物组合物。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述视网膜疾病是伴有超常视杆细胞反应的视锥细胞营养不良(CDSSR)。

33.一种增加有需要的受试者中KCNV2表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求24-29中任一项所述的载体或如权利要求30所述的药物组合物。

34.一种增加有需要的受试者的光感受器中的Kv8.2水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求24-29中任一项所述的载体或如权利要求30所述的药物组合物。

35.如权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述载体或所述药物组合物是通过眼内注射施用。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述载体或所述药物组合物被注射到所述受试者的中央视网膜中。