CN117858891A

CN117858891A - 用于基因疗法的经修饰aav衣壳及其方法

Info

Publication number: CN117858891A
Application number: CN202280054384.8A
Authority: CN
Inventors: 施霖宇; 柏伟娅; 薛媛媛
Original assignee: Huida Gene Therapy Singapore Private Ltd; Huida Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huida Gene Therapy Singapore Private Ltd; Huida Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2024-04-09
Also published as: WO2023284879A1; WO2023283962A1

Abstract

本文描述的本发明提供新型AAV衣壳，所述AAV衣壳用于改善针对神经组织、眼睛、及耳朵的向性，用于生成重组AAV病毒载体。

Description

用于基因疗法的经修饰AAV衣壳及其方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年7月16日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/106935的优先权，该申请的全部内容(包括所有附图和序列表)通过引用并入本文。

背景技术

作为载体的腺相关病毒AAV是单链DNA细小病毒，其基因组包含rep基因和cap基因且侧接两个末端反向重复序列(ITR)。rep基因从单个ORF编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，它们有助于AAV基因组复制和病毒粒子组装。三种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)由单个cap ORF产生，但是受稀有起始密码子(ACG)的转录和选择性剪接的调节。因此，VP1和VP2在其C-末端具有与VP3相同的氨基酸。另外地，衣壳组装所必需的组装活化蛋白(AAP)由cap基因内的框内移位ORF进行编码。所有AAV病毒粒子都由60个VP亚基构成，VP1:VP2:VP3的比率为1:1:10。目前，已识别出十三种AAV血清型和许多变体，它们识别不同的细胞受体，从而显示不同的组织型和细胞型向性谱。各种血清型之间的AAV VP3结构的比较揭示了散布有更多进化趋异区域的高度同源序列。这些氨基酸段通常指定为可变区(VR)I至IX。附带地，VR位于组装的衣壳表面处并且认为负责衣壳与细胞表面受体和其他宿主因子的相互作用。由于它们所在的位置，还预计VR对于衣壳组装不那么重要。因此，获得新型AAV载体的衣壳设计的指导原则是仅修饰表面VR，同时保持骨架序列不变，以维持组装支架的完整性。

重组腺相关病毒(rAAV)是用于体内基因转移的载体，用于实施基因疗法并促进对于多种基础科学研究和临床基因疗法来说至关重要的基因转移。几个特征使得rAAV作为基因递送媒介物(vehicle)有吸引力：(i)它们提供长期转基因表达，(ii)它们与任何已知人疾病无关，(iii)它们引发相对较弱的免疫反应，(iv)它们能够转导多种分裂和非分裂细胞类型，和(v)rAAV基因组可以包装到多种病毒的衣壳、或蛋白质外壳中，这些衣壳或蛋白质外壳具有不同的转导特征和组织向性。使用rAAV载体的基因疗法已经在临床试验中取得成功，包括治疗莱伯氏先天性黑朦(Leber’scongenital amaurosis(LCA))、脊髓性肌萎缩(SMA)和脂蛋白脂酶缺乏症。此外，基于rAAV基因的疗法已经在临床前模型中在包括雷特氏综合征(Rett syndrome)、先天性ALS、帕金森病、亨廷顿病在内的多种疾病中取得成功。

尽管现有的AAV载体构成了有价值的基因递送工具，但仍然强烈需要开发改善的AAV。由于缺乏可以有效转导某些困难细胞类型或组织的衣壳血清型，限制了rAAV在疾病治疗和科学研究中的成功应用。并且，始终需要具有更高转导效率的AAV载体来帮助患者以最低的药物剂量获得期望的治疗效果。

发明内容

本发明的一个方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:4的重靶向肽，所述重靶向肽被插入和/或取代在野生型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的GH环的亚结构域IV-VIII中的任何一个处的所述野生型AAV衣壳蛋白的一个或多个残基。

在某些实施方式中，所述重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域VIII中的所述一个或多个残基。

在某些实施方式中，所述重靶向肽被插入并取代与野生型AAV9 VP1衣壳蛋白残基A587和Q588相对应的两个残基。

在某些实施方式中，所述重靶向肽包含SEQ ID NO:1的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，所述重靶向肽包含SEQ ID NO:2的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，所述重靶向肽包含SEQ ID NO:3的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，所述野生型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白是AAV9 VP1、AAV9VP2、或AAV9 VP3。

在某些实施方式中，所述mAAV衣壳蛋白进一步包含除了引入的重靶向肽以外的一个或多个额外突变。

本发明的另一方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含SEQ ID NO:25的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

本发明的另一方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含SEQ ID NO:26的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

本发明的另一方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含SEQ ID NO:27的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

本发明的另一方面提供重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含被包封在包含本发明mAAV衣壳蛋白的衣壳壳体内的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述多核苷酸包含感兴趣的基因(GOI)，其侧接5’ITR、3’ITR、或二者。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因(GOI)是(a)编码营养因子、生长因子、或可溶性蛋白的核酸序列；(b)恢复在该基因中携带一个或多个遗传突变的人或动物的蛋白质功能的cDNA；(c)编码可以用于控制或改变细胞的活性或状态的蛋白质的cDNA；(d)编码用于评估细胞状态的蛋白质或核酸的cDNA；(e)用于执行基因组工程化的cDNA和/或相关指导RNA；(f)通过同源重组用于基因组编辑的序列；(g)编码治疗性RNA的DNA序列；(h)shRNA或人工miRNA递送系统；和/或(i)影响内源性基因剪接的DNA序列。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因是：RPE65、REP1、LRAT、GRP143、TYR、BEST1、MERTK、MYO7A、ADAM9、RGR、RS1、CEP290、RPGR、BBS4、USH2D、RPGRIP、TULP1、CRB1、GUCY2D、AIPL1、CRX、ABCA4、PDE6B、RHO、PRPH2、NR2E3、NRL、CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C、RLBP1、ND4、或拮抗其功能/表达的药剂。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，所述转录调控盒包含启动子，例如组成型启动子、或视网膜特异性启动子(例如，来自GFAP、RLBP1、ProB2、人RHO、RHOK、GRK1、人蓝视蛋白HB570、人蓝视蛋白HB569、PR0.5、PR1.7、PR2.1、3LCR-PR0.5、hIRBP、IRBPe/GNAT2、CAR/ARR3、Crx2kb、ProA1、ProA4、ProC1、mGrm6、ProB4、Cabp5、人红视蛋白、G1.7p、hRPE65p、NA65p、VMD2、或RS1的启动子)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述视网膜特异性启动子转录的增强子。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因是：载脂蛋白E(ApoE)、apoE2、运动神经元存活基因1(SMN1)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、battenin、天冬氨酸酰酶蛋白质(ASPA)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体三肽基肽酶I(TPP1)、溶酶体酸性β-半乳糖苷酶(βgal)、N-磺氨基葡糖磺基氢化酶(SGSH)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、NPC1、弗里德赖希共济失调蛋白(frataxin)(FXN)、巨轴突蛋白(gigaxonin)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、CLN6跨膜ER蛋白、α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、葡萄糖神经酰胺酶1(GBA1)、神经秩蛋白(neurturin)、颗粒蛋白前体(GRN)、甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、或拮抗其功能/表达的药剂。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，例如组成型启动子、或CNS特异性启动子(例如，来自Syn1、NSE、GFAP、MAG、MBP、F4/80、CD68、PAG、vGLUT、或GAD的启动子)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述CNS特异性启动子转录的增强子。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因是：ACTG1、BSND、CDH23、COL11A2、DSPP、GJA1、GJB2、GJB6、KCNQ4、MT-TS1、MYH9、MYO7A、POU3F4、PRPS1、SLC26A4、STRC、TBC1D24、TECTA、WFS1、ADCY1、BDP1、CABP2、CCDC50、CEACAM16、CIB2、CLDN14、CLIC5、COCH、COL4A6、CRYM、DCDC2、DIABLO、DIAPH1、ELMOD3、EPS8、ESPN、ESRRB、EYA4、GIPC3、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSDME、HGF、HOMER2、ILDR1、KARS1、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MET、MIR96、MSRB3、MT-CO1、MT-RNR1、MYH14、MYO15A、MYO3A、MYO6、NARS2、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PCDH15、PJVK、PNPT1、POU4F3、PTPRQ、RDX、RIPOR2、SERPINB6、SLC17A8、SLC26A5、SMPX、SYNE4、TJP2、TMC1、TMEM132E、TMIE、TMPRSS3、TNC、TPRN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、及WHRN、或拮抗其功能/表达的药剂。

在某些实施方式中，所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，所述转录调控盒包含启动子，例如组成型启动子、或毛细胞特异性启动子(例如，Myo15启动子、肌凝蛋白7A(Myo7A)启动子、肌凝蛋白6(Myo6)启动子、POU 4类同源盒3(POU4F3)启动子、OTOF启动子、FGF8启动子、VGLUT3启动子、其突变体、截短体或衍生物)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述毛细胞特异性启动子转录的增强子。

在某些实施方式中，所述被包封的多核苷酸进一步包含：1)增强子；2)促进GOI表达的内含子或外显子；3)WPRE序列；4)5’UTR编码序列；5)3’UTR编码序列；6)miRNA脱靶序列；和/或7)聚A信号序列。

本发明的另一方面提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白、与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述多核苷酸经密码子优化用于哺乳动物表达。

本发明的另一方面提供载体，所述载体包含本发明的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述载体是质粒或病毒载体(例如，HSV或杆状病毒载体)。

本发明的另一方面提供宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白、本发明的rAAV病毒颗粒、本发明的多核苷酸、或本发明的载体。

本发明的另一方面提供药物组合物，所述药物组合物包含本发明的经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白、本发明的rAAV病毒颗粒、本发明的多核苷酸、或本发明的载体。

本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明rAAV。

在某些实施方式中，当与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比时，所述rAAV病毒颗粒的感兴趣的基因优先在视网膜细胞中表达。

在某些实施方式中，所述视网膜细胞选自：光感受器(例如，视杆细胞；视锥细胞)、视网膜神经节细胞(RGC)、米勒细胞(muller cell)(米勒神经胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、或视网膜色素上皮(RPE)细胞。

在某些实施方式中，所述眼部疾病或病症是选自以下中的一种或多种：干眼综合征(例如，DES、慢性干眼症、干燥性角膜炎；干眼症；干性角结膜炎)、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎(虹膜炎)、脉络膜视网膜炎、后葡萄膜炎、结膜炎、过敏性结膜炎、角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎(VKC)、特应性角膜结膜炎、全身性免疫介导的疾病(例如瘢痕性结膜炎及眼表的其他自身免疫紊乱)、睑缘炎、巩膜炎、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration(AMD))、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病黄斑水肿(DME)、眼部新生血管、老年性黄斑变性(age-related maculardegeneration(ARMD))、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、巨细胞病毒(CMV)视网膜炎、视神经炎、球后视神经炎、及黄斑皱褶。

本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗中枢神经系统(CNS)疾病或紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明rAAV。

在某些实施方式中，当与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比时，所述rAAV病毒颗粒的感兴趣的基因优先在CNS细胞中表达。

在某些实施方式中，所述CNS细胞选自：神经元、神经胶质细胞、及血管细胞。

在某些实施方式中，所述CNS疾病或紊乱选自：脑或脊髓损伤、贝耳氏麻痹(Bell'spalsy)、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、外周神经病变、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)、头痛、癫痫、眩晕、及神经痛。

本发明的另一方面提供产生rAAV的方法，其中所述rAAV包含本发明的mAAV衣壳蛋白，所述方法包括将编码感兴趣的基因的rAAV载体引入到表达本发明mAAV衣壳蛋白的生产或包装细胞系中。

在某些实施方式中，所述生产或包装细胞系经编码本发明mAAV衣壳蛋白的载体感染。

在某些实施方式中，所述生产或包装细胞系是HEK293、HEK293T、A549、sf9(昆虫细胞)、或海拉细胞(HeLa cell)。

本发明的另一方面提供重靶向肽，所述重靶向肽包含SEQ ID NO:4(例如，SEQ IDNO:1-3中的任何一个)、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，当重靶向肽引入AAV9的VP1、VP2、和/或VP3衣壳蛋白的GH环的亚结构域VIII中时，所述重靶向肽赋予对视网膜组织/细胞及CNS的向性。

本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗听觉疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明rAAV病毒颗粒。

在某些实施方式中，与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，所述rAAV病毒颗粒的感兴趣的基因优先在毛细胞中表达。

在某些实施方式中，所述毛细胞选自：内毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈内毛细胞；及外毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈外毛细胞。

在某些实施方式中，所述听觉疾病或病症是与选自以下的一种或多种基因相关联的听觉疾病或病症：ACTG1、BSND、CDH23、COL11A2、DSPP、GJA1、GJB2、GJB6、KCNQ4、MT-TS1、MYH9、MYO7A、POU3F4、PRPS1、SLC26A4、STRC、TBC1D24、TECTA、WFS1、ADCY1、BDP1、CABP2、CCDC50、CEACAM16、CIB2、CLDN14、CLIC5、COCH、COL4A6、CRYM、DCDC2、DIABLO、DIAPH1、ELMOD3、EPS8、ESPN、ESRRB、EYA4、GIPC3、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSDME、HGF、HOMER2、ILDR1、KARS1、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MET、MIR96、MSRB3、MT-CO1、MT-RNR1、MYH14、MYO15A、MYO3A、MYO6、NARS2、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PCDH15、PJVK、PNPT1、POU4F3、PTPRQ、RDX、RIPOR2、SERPINB6、SLC17A8、SLC26A5、SMPX、SYNE4、TJP2、TMC1、TMEM132E、TMIE、TMPRSS3、TNC、TPRN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、及WHRN。

在某些实施方式中，所述听觉疾病或病症是与GJB2、MYO6、或OTOF相关联的听觉疾病或病症。

应理解，本文描述的本发明的任何一个实施方式，包括仅在实施例或权利要求中描述的那些实施方式，可以与本发明的任何一个或多个实施方式组合，除非明确否认或认为不当。

附图说明

图1A本发明的衣壳变体的示意图。

图1B衣壳变体中插入肽的氨基酸序列。

图2A玻璃体内注射后4周视网膜组织横截面中tdTomato表达的荧光显微评价。

图2B玻璃体内注射后4周视网膜组织横截面中tdTomato表达的荧光显微评价。RPE：视网膜色素上皮；ONL：外核层；INL：内核层；及GCL：神经节细胞层。

图3A视网膜下注射后4周视网膜组织横截面中tdTomato表达的荧光显微评价。

图3B视网膜下注射后4周视网膜组织横截面中tdTomato表达的荧光显微评价。RPE：视网膜色素上皮；ONL：外核层；INL：内核层；及GCL：神经节细胞层。

图4A鞘内注射后4周脑矢状截面中tdTomato表达的荧光显微评价。

图4B鞘内注射后4周脊髓横向截面中tdTomato表达的荧光显微评价。

图5示出了AAV1-AAV13 VP1衣壳的多序列比对，包括GH环内的保守结构域和可变序列(约230个氨基酸，位于βG与βH链之间)，包括GH环的亚结构域IV-VIII。序列1-14是AAV9(SEQ ID NO:15)、AAV1(SEQ ID NO:6)、AAV2(SEQ ID NO:7)、AAV3A(SEQ ID NO:8)、AAV3B(SEQ ID NO:9)、AAV4(SEQ ID NO:10)、AAV5(SEQ ID NO:11)、AAV6(SEQ ID NO:12)、AAV7(SEQ ID NO:13)、AAV8(SEQ ID NO:14)、AAV10(SEQ ID NO:16)、AAV11(SEQ ID NO:17)、AAV12(SEQ ID NO:18)、及AAV13(SEQ ID NO:19)。共有序列是SEQ ID NO:5。

图6示出了AAV衣壳的不同进化枝的系统发生树。

图7示出了与WT AAV9相比，本发明AAV突变体M5、M6、及M8在5E9 vg的剂量下对于OHC(顶圈、中圈、底圈)和IHC(顶圈、中圈、底圈)的转导效率。

具体实施方式

1.概述

本文描述的发明提供经修饰AAV衣壳，其与该经修饰衣壳所源自的野生型AAV9衣壳相比具有改变的向性；以及重组AAV(rAAV)病毒颗粒，其包含包括这样的经修饰AAV衣壳蛋白的AAV病毒衣壳壳体。

本发明部分地基于以下令人惊讶的发现：本发明的某些重靶向肽可以被插入和/或取代野生型AAV序列、特别地GH环内的序列(包括GH环亚结构域IV-VIII(例如，亚结构域VIII))中的某些残基，来改变向性。

在说明性(非限制性)实施方式中，野生型AAV9衣壳中GH环的亚结构域VIII中的两个残基(其与野生型AAV9 VP1衣壳蛋白的残基A587和Q588相对应)用几种本发明重靶向肽中的任何一种取代导致wt AAV9的改变向性，其中对组织如视网膜及CNS的向性增强。因此，包含这样的经修饰AAV衣壳的AAV病毒载体可以使用任何合适的递送方式(例如，通过玻璃体内注射或视网膜下注射到视网膜的转导、通过腰椎穿刺-鞘内注射到CNS的转导、或通过蜗管(scala media)注射到耳朵的毛细胞的转导)用于增强任何感兴趣的基因到作为靶组织的视网膜、CNS、或耳朵的递送。

本发明的rAAV病毒颗粒可以作为载体基因组用于将包含合适长度(例如，在各种AAV的包装限值内)的任何转基因或感兴趣的基因(GOI)的DNA(例如，单链DNA)或RNA核酸递送到与AAV衣壳壳体的向性相兼容的宿主细胞。如本文所用，rAAV载体在本文中是指AAV(病毒)载体、rAAV(病毒)载体、AAV(病毒)颗粒、或rAAV(病毒)颗粒。AAV或rAAV载体可以包含DNA或RNA病毒遗传物质作为其载体基因组。

利用上文描述的本发明的一般原理，本发明的更特别方面将在下文中进一步详细描述。

2.重靶向肽

本发明的一个方面提供重靶向肽，当其引入AAV衣壳中，如引入AAV衣壳(例如，AAV9)的VP1、VP2、和/或VP3的GH环的亚结构域IV或VIII中时，该重靶向肽赋予针对视网膜、CNS、或耳朵(听觉)组织/细胞类型/细胞的向性。

在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约6至14个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约6个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约7个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约8个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约9个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约10个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约11个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约12个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约13个残基。在某些实施方式中，本发明的重靶向肽的长度为约14个残基。

在某些实施方式中，本发明重靶向肽的长度为约9个或10个残基，且由下式I表示：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(式I)(SEQ ID NO:4)，

其中：

X1-X10各自表示如下文所定义的氨基酸；任选地，X2-X6之一(例如X5或X6)可以不存在(例如，X5可以不存在，或X6可以不存在，但不能二者都不存在)；

X1是D、E、N或Q，例如D或E；

X2是A、G、S、T、L、I、V、或不存在，例如，A、S、T或G(例如A或G)；

X3是T、S、P、A、G、或不存在，例如，T或S；

X4是V、L、I、G、A、或不存在，例如，V、L、或I；

X5是A、G、S、T、L、I、V、或不存在，例如，A、S、T、或G(例如，A或G)；

X6是A、G、S、T、L、V、或不存在，例如，A、S、T、或G(例如，A或G)；

X7是V、L、I、G、或A，例如，V、L、或I；

X8是F、Y、或P，例如，F或P；

X9是F、Y、或P，例如，F或P；和

X10是K、R、H、N、或Q，例如，K、R、或H(例如，K或R)。

在某些实施方式中，当SEQ ID NO:4的重靶向肽被插入AAV衣壳中时，它侧接多达4个残基(例如，X1的N末端的L1和L2，和/或X10的C末端的L3-L4)，其中L1-L4可以独立地天然存在于AAV衣壳中，或不天然存在于wt AAV衣壳中。

在某些实施方式中，L1-L4各自表示任选的接头氨基酸，它们共同在N末端(L1和L2)和/或C末端(L3和L4)处位于重靶向肽序列的两侧。

在某些实施方式中，L1、L2、L3和L4中的每一个(如果存在的话)独立地是任何氨基酸。

在某些实施方式中，L1-L4中的每一个独立地选自A、Q、L、I、V、G、S和T。

在某些实施方式中，L1-L4中的每一个独立地选自A、Q、G和S。

在某些实施方式中，L1-L2是/对应于AAV9 VP1残基Q585-S586、或A587-Q588，和/或L3-L4是/对应于AAV9 VP1残基A589-Q590。

在某些实施方式中，重靶向肽包含SEQ ID NO:1(EATVGLFPK)、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，重靶向肽包含SEQ ID NO:2(EATLAAVFPK)、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，重靶向肽包含SEQ ID NO:3(EATLGIFPK)、基本上由其组成、或由其组成。

3.AAV衣壳上的插入位点

本发明的向性改变或重靶向肽可以被插入多种野生型AAV衣壳(例如，野生型AAV9衣壳)中以改变它们的向性。

本领域已知的各种AAV血清型(例如，以上部分中所列的AAV血清型)共享相当大的序列和结构相似度，使得本发明的向性改变或重靶向肽可以被插入除本文所说明的野生型AAV9衣壳之外的AAV衣壳中，并且导致这些非基于AAV9的经修饰衣壳的向性改变。

在2002年以3A分辨率解析了第一批AAV衣壳之一——AAV2 VP1——的X射线晶体学结构(Xie,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.[美国国家科学院院刊]99:10405-10410,2002)，并且为促进AAV2和其他血清型的进一步重靶向修饰提供了至关重要的知识。特别地，AAV2(先前已确定其晶体结构的犬细小病毒)(Tsao,Science[科学]251:1456-1464,1991)和其他AAV血清型的氨基酸序列比对、以及其他中和抗体结合数据(例如表位定位和诱变)一起提供了大量关于干扰初级受体结合的AAV衣壳中某些表面展示结构域和区域的信息，从而作为定位外源表位插入的一般指南。

更特别地，Xie(上述)注意到，AAV2与其他结晶细小病毒的晶体结构之间存在显著的相似性和差异。所有细小病毒的核心共享由反平行β-折叠组成的β-桶状基序。尽管自主病毒与依赖病毒之间基序的序列同一性较低，但这些基序可以重叠，这表明高度的功能相似性。与此相比，所有构成AAV血清型的桶状基序的β-折叠共享高水平的序列同一性。β-折叠之间的环凸(looped-out)结构域通常具有较低的总体同一性，其中最长的环位于β-折叠G与H之间(或所谓的“GH环”)。对于AAV血清型、以及许多自主细小病毒来说，这个GH环的长度是大约230个氨基酸(Chapman及Rossmann,Structure,sequence,and functioncorrelations among parvoviruses[细小病毒的结构、序列、及功能相关性].Virology[病毒学]194:491-508,1993)，并且占总结构的三分之一以上。

尽管AAV血清型与自主细小病毒之间GH环的大小相似，但GH环的大小是衣壳的任何序列中最不同的。氨基酸水平上的这种低同源性反映在表面拓扑差异和受体结合的表位中。

例如，AAV2具有三个峰的三个簇，这些峰簇以AAV2衣壳的3次对称轴为中心并且相隔这些峰产生了直径为/>的口袋。构成这些结构的序列所有都来自GH环。在阿留申水貂病(Aleutian mink disease)细小病毒和在其GH环中少了96个氨基酸的昆虫浓核病毒中也发现了类似结构。这些观察结果说明GH环组装的灵活性、和它在GH环中进一步修饰用于衣壳重靶向的适用性。

在AAV血清型的衣壳序列中，GH环中存在具有低的或很少的序列同一性的可变区和亚结构域。因此，在某些实施方式中，本发明的重靶向肽可以被插入或取代相应AAV野生型衣壳GH环内的可变区或亚结构域(例如，AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、和这些AAV衣壳所属的相应进化枝中的相关AAV衣壳中任一种的GH环的亚结构域IV、V、VI、VII、或VIII)中的一个或多个残基(参见图6)。例如，AAV9、与AAVhu31及AAVhu32一起属于进化枝F。

下文提供代表性AAV衣壳VP1蛋白质序列，包括AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV PHP.eB、Anc80L65、Anc80L65AAP、和7m8的序列。

AAV1：SEQ ID NO:6，参见图5中的第2行。AAV2：SEQ ID NO:7，参见图5中的第3行。AAV3A：SEQ ID NO:8，参见图5中的第4行。AAV3B：SEQ ID NO:9，参见图5中的第5行。AAV4：SEQ ID NO:10，参见图5中的第6行。AAV5:SEQ ID NO:11，参见图5中的第7行。AAV6：SEQ IDNO:12，参见图5中的第8行。AAV7：SEQ ID NO:13，参见图5中的第9行。AAV8：SEQ ID NO:14，参见图5中的第10行。AAV9：SEQ ID NO:15，参见图5中的第1行。AAV10：SEQ ID NO:16，参见图5中的第11行。AAV11：SEQ ID NO:17，参见图5中的第12行。AAV12：SEQ ID NO:18，参见图5中的第13行。AAV13：SEQ ID NO:19，参见图5中的第14行。

AAV-DJ：SEQ ID NO:20。

AAV-PHP.eB：SEQ ID NO:21。

Anc80L65：SEQ ID NO:22。

Anc80L65AAP；SEQ ID NO:23

7m8：SEQ ID NO:24

使用默认参数，使用MUSCLE(对数期望的多重序列比较(MUltiple SequenceComparison by Log-Expectation))(获自EMBL-EBI网站的在线工具)对选定的衣壳序列进行比对，且结果(包括共有序列)示出于图5中。图5中相应地标记了代表性AAV衣壳(AAV1-AAV13)的βG和βHβ折叠、及其间的GH环序列、以及这些衣壳的亚结构域IV-VIII。

在某些实施方式中，亚结构域IV包含一段AAV衣壳残基、基本上由其组成、或由其组成，其中的第一个(即，该段的最N末端残基)紧邻与AAV9 VP1残基I451相对应残基的C末端，并且其中的最后一个(即，该段的最C末端残基)紧邻与AAV9VP1残基L461相对应残基的N末端。例如，在图5中，亚结构域IV中的AAV1衣壳残基段包括AAV1 VP1的残基N451–D460，且亚结构域IV中的AAV9衣壳残基段包括AAV9 VP1的残基N452–T460。

在某些实施方式中，亚结构域V包含一段AAV衣壳残基、基本上由其组成、或由其组成，其中的第一个(即，该段的最N末端残基)紧邻与AAV9 VP1残基Q487相对应残基的C末端，且其中的最后一个(即，该段的最C末端残基)紧邻与AAV9VP1残基A506相对应残基的N末端。换言之，亚结构域V中的AAV9衣壳残基段包括AAV9 VP1的残基R488–G505。

在某些实施方式中，亚结构域VI包含一段AAV衣壳残基、基本上由其组成、或由其组成，其中的第一个(即，该段的最N末端残基)紧邻与AAV9 VP1残基S526相对应残基的C末端，且其中的最后一个(即，该段的最C末端残基)紧邻与AAV9VP1残基S540相对应的残基的N末端。换言之，亚结构域VI中的AAV9衣壳残基段包括AAV9 VP1的残基H527–G539。

在某些实施方式中，亚结构域VII包含一段AAV衣壳残基、基本上由其组成、或由其组成，其中的第一个(即，该段的最N末端残基)紧邻与AAV9 VP1残基G544相对应的残基的C末端，且其中的最后一个(即，该段的最C末端残基)紧邻与AAV9VP1残基M559相对应的残基的N末端。换言之，亚结构域VII中的AAV9衣壳残基段包括AAV9 VP1的残基K545–V558。

在某些实施方式中，亚结构域VIII包含一段AAV衣壳残基、基本上由其组成、或由其组成，其中的第一个(即，该段的最N末端残基)紧邻与AAV9 VP1残基V580相对应的残基的C末端，且其中的最后一个(即，该段的最C末端残基)紧邻与AAV9VP1残基G594相对应的残基的N末端。换言之，亚结构域VIII中的AAV9衣壳残基段包括AAV9 VP1的残基A581–T593。

因此，在某些实施方式中，本发明的重靶向肽可以被插入或取代AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、和这些AAV衣壳所属的相应进化枝中的相关AAV衣壳中任一种的亚结构域IV(与AAV9 VP1的残基N452–T460相对应)(例如，AAV9的亚结构域IV)中的一个或多个残基。

在某些实施方式中，本发明的重靶向肽可以被插入或取代AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、和这些AAV衣壳所属的相应进化枝中的相关AAV衣壳中任一种的亚结构域V(与AAV9 VP1的残基R488–G505相对应)(例如，AAV9的亚结构域V)中的一个或多个残基。

在某些实施方式中，本发明的重靶向肽可以被插入或取代AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、和这些AAV衣壳所属的相应进化枝中的相关AAV衣壳中任一种的亚结构域VI(与AAV9 VP1的残基H527–G539相对应)(例如，AAV9的亚结构域VI)中的一个或多个残基。

在某些实施方式中，本发明的重靶向肽可以被插入或取代AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、和这些AAV衣壳所属的相应进化枝中的相关AAV衣壳中任一种的亚结构域VII(与AAV9 VP1的残基K545–V558相对应)(例如，AAV9的亚结构域VII)中的一个或多个残基。

在某些实施方式中，本发明的重靶向肽可以被插入或取代AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、和这些AAV衣壳所属的相应进化枝中的相关AAV衣壳中任一种的亚结构域VIII(与AAV9 VP1的残基A581–T593、或S586-A589相对应)(例如，AAV9的亚结构域VIII)中的一个或多个残基。

4.经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白及病毒颗粒

本发明的另一方面提供重组或经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，其包含SEQ IDNO:4的重靶向肽，所述重靶向肽被插入和/或取代在野生型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的GH环的亚结构域IV-VIII中的任何一个处的所述野生型AAV衣壳蛋白的一个或多个残基。

在某些实施方式中，重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域IV的一个或多个残基。在某些实施方式中，重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域V的一个或多个残基。在某些实施方式中，重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域VI的一个或多个残基。在某些实施方式中，重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域VII的一个或多个残基。在某些实施方式中，重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域VIII的一个或多个残基。

在某些实施方式中，重靶向肽被插入并取代与野生型AAV9 VP1衣壳蛋白残基A587和Q588相对应的两个残基。

在一些实施方式中，重靶向肽包含SEQ ID NO:1(EATVGLFPK)的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

在一些实施方式中，重靶向肽包含SEQ ID NO:2(EATLAAVFPK)的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

在一些实施方式中，重靶向肽包含SEQ ID NO:3(EATLGIFPK)的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

本发明的相关方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:25的多肽、基本上由其组成、或由其组成。本发明的相关方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:26的多肽、基本上由其组成、或由其组成。本发明的相关方面提供经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:27的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

上述代表性的基于重组AAV9 VP1的衣壳的蛋白质序列提供于下文中(肽插入以表示)。

/>

在某些实施方式中，VP1衣壳蛋白是来自AAV9。在某些实施方式中，重组VP1衣壳蛋白包含包括6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的重靶向肽插入。在某些实施方式中，重组VP1包含包括1、2、3、4、或5个氨基酸的缺失。

在某些实施方式中，与wt AAV9 VP1的A587和Q588相对应的残基的取代是由氨基酸序列如EATVGLFPK(SEQ ID NO:1)、EATLAAVFPK(SEQ ID NO:2)、或EATLGIFPK(SEQ ID NO:3)中的任何一个进行的。在一些实施方式中，该取代是由与SEQ ID NO:1-3中的任何一个相比具有不超过1、2、3、4、或5个改变(例如，保守取代)的氨基酸序列中的任一个进行的。

在一些实施方式中，肽插入是在S586(AAV9 VP1编号)之后。在一些实施方式中，删除氨基酸A587和Q588。

在某些实施方式中，mAAV衣壳蛋白进一步包含除了引入的重靶向肽以外的一个或多个额外突变。

在某些实施方式中，mAAV是基于或源自野生型AAV9衣壳，例如AAV9 VP1。在某些实施方式中，除了wt AAV9 VP1残基A587和Q588相对应的残基经SEQ ID NO:4(例如，SEQ IDNO:1-3中的任何一个)取代以外，经修饰衣壳在其他方面与wt AAV VP1(例如，wt AAV9VP1)衣壳蛋白相同。在其他实施方式中，除了引入的重靶向肽以外，例如与wt AAV9 VP1的残基A587和Q588相对应的残基经SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)取代，经修饰AAV衣壳蛋白进一步包含除与wt AAV9 VP1残基A587和Q588相对应的取代以外的残基中的一个或多个改变(例如，添加、缺失、和/或取代)，使得除与wt AAV9 VP1残基A587和Q588相对应的残基之外(即，在wt AAV9 VP1的残基1-586和589-736中)，经修饰AAV衣壳与相应wt AAV VP1衣壳具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性。在某些实施方式中，除了与wt AAV9 VP1残基A587和Q588相对应的SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)的取代以外，与wt AAV VP1相比，经修饰AAV衣壳蛋白进一步包含不超过75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸序列差异。在这里，氨基酸序列差异可以通过将经修饰AAV衣壳的序列与wt AAV(例如，AAV9)VP1的序列进行比对来评估，并将序列比对中的每个差异(取代、缺失、和添加)计为一个差异。

在某些实施方式中，mAAV是基于或源自野生型AAV衣壳VP2，例如wt AAV9衣壳VP2，其与wt AAV9 VP1的残基138-736相对应。因此，wt AAV9 VP2的残基1与wt AAV9 VP1的残基138相对应，并且VP2的残基A450和Q451分别与VP1的残基A587和Q588相对应。在某些实施方式中，除了与wt AAV9 VP2残基A450和Q451相对应的SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)的取代以外，经修饰衣壳在其他方面与wt AAV VP2(例如，wt AAV9 VP2)衣壳蛋白相同。在其他实施方式中，除了与wt AAV9 VP2的残基A450和Q451相对应的残基经SEQID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)取代以外，经修饰AAV衣壳蛋白进一步包含除与wt AAV9 VP2 A450和Q451相对应残基以外的残基中的一个或多个改变(例如，添加、缺失、和/或取代)，使得除与wt AAV9 VP2残基A450和Q451相对应的经取代残基之外(即，在wtAAV9 VP2的残基1-449和452-599中)，经修饰AAV衣壳与相应wt AAV VP2衣壳具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性。在某些实施方式中，除了与wt AAV9 VP2残基A450和Q451相对应的残基经SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)取代以外，与相应wt AAVVP2相比，经修饰AAV衣壳蛋白进一步包含不超过60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸序列差异。在这里，氨基酸序列差异可以通过将经修饰AAV衣壳的序列与wt AAV(例如，AAV9)VP2的序列进行比对来评估，并将序列比对中的每个差异(取代、缺失和添加)计为一个差异。

在某些实施方式中，mAAV是基于或源自野生型AAV衣壳VP3，例如野生型AAV9衣壳VP3，其与wt AAV9 VP1的残基203-736相对应。因此，AAV9 VP3的残基1与AAV9 VP1的残基203相对应，并且VP3的残基A385和Q386分别与VP1的残基A587和Q588相对应。在某些实施方式中，除了与wt AAV9 VP3残基A385和Q386相对应的残基经SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)取代以外，经修饰衣壳在其他方面与wt AAV VP3衣壳蛋白相同。在其他实施方式中，除了与wt AAV9 VP3的残基A385和Q386相对应的残基经SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)取代以外，经修饰AAV衣壳蛋白进一步包含除与wt AAV9VP3残基A385和Q386相对应的经取代残基以外的残基中的一个或多个改变(例如，添加、缺失、和/或取代)，使得除与wt AAV9 VP3残基A385和Q386相对应的经取代残基之外(即，在wtAAV9 VP3的残基1-384和387-534中)，经修饰AAV衣壳与相应wt AAV VP3衣壳具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性。在某些实施方式中，除了与wt AAV9 VP3残基A385和Q386相对应的残基经SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:1-3中的任何一个)取代以外，与相应wt AAVVP3相比，经修饰AAV衣壳蛋白进一步包含不超过55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸序列差异。在这里，氨基酸序列差异可以通过将经修饰AAV衣壳的序列与wt AAV(例如，AAV9)VP3的序列进行比对来评估，并将序列比对中的每个差异(取代、缺失和添加)计为一个差异。

5.具有mAAV衣壳蛋白的病毒颗粒

本发明的另一方面提供重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含被包封在包含本文描述的本发明mAAV衣壳蛋白的衣壳壳体内的多核苷酸。

如本文所用，“AAV或rAAV病毒颗粒”包括包含多核苷酸的病毒颗粒，该多核苷酸被包封在包含本发明的任何一种或多种经修饰AAV衣壳蛋白的衣壳壳体内。衣壳壳体可以仅由本发明的经修饰AAV衣壳组成，或可以包含本发明的经修饰AAV衣壳以及任何腺相关病毒(AAV)(例如，属于依赖性细小病毒属(genus Dependoparvovirus)的那些AAV，依赖性细小病毒属又属于细小病毒科(family Parvoviridae))的任何其他野生型或工程化衣壳。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP1衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP2衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP3衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP1衣壳和经修饰AAV(例如，AAV9)VP2衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP2衣壳和经修饰AAV(例如，AAV9)VP3衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP1衣壳和经修饰AAV(例如，AAV9)VP3衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在某些实施方式中，衣壳壳体包含本文描述的经修饰AAV(例如，AAV9)VP1衣壳、经修饰AAV(例如，AAV9)VP2衣壳、和经修饰AAV(例如，AAV9)VP3衣壳。衣壳壳体可以进一步包含wt AAV(例如，AAV9)VP1、VP2、和/或VP3。

在上述实施方式中的任一个中，衣壳壳体可以进一步包含来自非AAV9 AAV衣壳、或非AAV9细小病毒衣壳的一个或多个额外VP衣壳。

在某些实施方式中，多核苷酸包含感兴趣的基因(GOI)，其侧接5’ITR和3’ITR、或这些ITR中的一个。例如，在一些实施方式中，GOI(例如，ssDNA或ssRNA)连接到3’ITR(但不连接5’ITR)。应注意，在ssRNA的上下文中，ITR是指RNA序列。

5’ITR、3’ITR、或两个ITR可以来自AAV9、非AAV9 AAV(例如，AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10、AAVpo.1、AAV12等)。例如，在一个实施方式中，5’ITR可以来自AAV2(或AAV9)。在另一实施方式中，3’ITR可以来自AAV2(或AAV9)。在又另一实施方式中，5’及3’ITR二者都来自AAV2(或AAV9)。

在某些实施方式中，5’ITR、3’ITR、或二者是野生型ITR序列。在某些实施方式中，一个或两个ITR是经修饰ITR序列，其可以具有突变，例如缺失，例如5’ITR中的5’缺失、或3’ITR中的3’缺失、或内部缺失，只要经修饰ITR含有功能性RBE(Rep结合元件)序列即可。在某些实施方式中，经修饰ITR含有RBE序列、在末端重复序列内包含内部发夹的单个尖端的小回文序列(或RBE’序列)、及trs(末端解链位点)。

GOI可以是任何基因或编码序列，包括蛋白质或多肽、或非蛋白质产物的编码序列，例如任何非翻译RNA或非编码RNA(ncRNA，例如siRNA、piRNA、短发夹RNA或shRNA、微RNA或miRNA或其前体，包括前体miRNA和初级miRNA、反义序列或寡核苷酸(ASO)、CRISPR/Cas的指导RNA或gRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、lncRNA、Xist、和HOTAIR、核酶、适配体、或其他不编码蛋白质的功能性多核苷酸)。

在某些实施方式中，GOI是(a)编码营养因子、生长因子、或可溶性蛋白的核酸序列；(b)恢复在该基因中携带一个或多个遗传突变的人或动物的蛋白质功能的cDNA；(c)编码可以用于控制或改变细胞的活性或状态的蛋白质的cDNA；(d)编码用于评估细胞状态的蛋白质或核酸的cDNA；(e)用于执行基因组工程化的cDNA和/或相关指导RNA；(f)通过同源重组用于基因组编辑的序列；(g)编码治疗性RNA的DNA序列；(h)shRNA或人工miRNA递送系统；和/或(i)影响内源性基因剪接的DNA序列。

例如，在某些实施方式中，被包封在本发明经修饰AAV衣壳内的AAV病毒载体包含编码蛋白质或多肽的GOI，该蛋白质或多肽修复靶细胞(有待经AAV感染)中的基因缺陷，其中该GOI在该靶细胞中的表达修复该缺陷。此实施方式的非限制性实施例包括在基因中具有无效或部分功能丧失突变的靶细胞，使得基因缺乏基因产物是靶细胞中缺陷的原因，并且GOI的表达部分或完全恢复基因的功能以修复缺陷。

在某些实施方式中，被包封在本发明经修饰AAV衣壳内的AAV病毒载体包含编码拮抗剂的GOI，该拮抗剂修复靶细胞(有待经AAV感染)中的基因缺陷，其中该拮抗剂/GOI在该靶细胞中的表达修复该缺陷。此实施方式的非限制性实施例包括具有有害突变(例如，显性功能获得性突变、存在造成缺陷的野生型或突变基因、重复或其他大规模基因组缺陷等)的靶细胞，使得有害突变的存在是靶细胞中缺陷的原因，并且GOI/拮抗剂的表达至少部分地或完全缓解该缺陷。拮抗剂可以是RNAi试剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、ZFN、靶向一个或多个疾病基因的TALEN或CRISPR/Cas系统、用于基因编辑的DNA碱基或RNA碱基编辑器、经编码的中和抗体或其抗原结合片段等中的任一个。

在某些实施方式中，GOI影响基因添加/基因替代。在某些实施方式中，GOI影响基因敲低/敲除。在某些实施方式中，GOI影响基因校正(例如，使用DNA碱基编辑)。在某些实施方式中，GOI影响RNA校正(例如，使用RNA碱基编辑)。在某些实施方式中，GOI影响基因表达校正(例如，使用ASO或CRISPR等来调节转录本剪接)。

编码序列或感兴趣的基因的转录本可以在细胞内部进一步经加工(例如，前体miRNA或初级miRNA可以在转录之后进一步经加工以变成miRNA，mRNA可以经剪接)。转录本或RNA编码序列的加工可以产生一种或多种RNA产物，例如siRNA、miRNA和/或mRNA，该RNA产物可进一步翻译成一种或多种蛋白产物，或引入其他细胞机器，例如RISC复合物或CRISPR/Cas效应酶(例如2类、II型、V型或VI型效应酶)中。

在某些实施方式中，GOI可以在外显子之间包含一个或多个内含子。在其他实施方式中，GOI对应于cDNA(例如，没有未剪接的内含子)。

在某些实施方式中，GOI包含一个编码序列。在某些实施方式中，GOI包含多于一个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)编码序列。在某些实施方式中，GOI包含两个或更多个编码相同或不同产物(例如，抗体的轻链和重链、蛋白质及非编码多核苷酸、两种功能上相关或互补的产物等)的编码序列。

GOI编码序列的长度、或GOI的所有编码序列的组合长度不超过可包装到特定或选择的AAV病毒颗粒中的DNA或RNA的最大长度，其在一种特定的AAV病毒颗粒和另一种病毒颗粒之间可以是不同的。在某些实施方式中，AAV的包装容量是约4.7kb、或4.3kb至5.2kb之间。

蛋白质可以是任何感兴趣的蛋白质，包括酶、结构蛋白、膜蛋白、细胞因子、抗体或其抗原结合片段、G蛋白、GPCR、激酶、转录因子等。

在某些实施方式中，GOI编码用于治疗眼部疾病或病症(例如，遗传性视网膜营养不良(IRD)、视网膜色素变性(RP)、无脉络膜症、斯特格氏病(Stargardt disease)、视锥细胞-视杆细胞营养不良(CRD)、莱伯氏先天性黑朦(LCA))的产物。

在某些实施方式中，眼部疾病或病症是由于常染色体隐性突变或由其引起的，并且GOI编码修复该常染色体隐性突变的基因产物(例如，GOI编码作为常染色体隐性突变的主体的野生型基因)。

在某些实施方式中，眼部疾病或病症是由于常染色体显性突变或由其引起的，并且GOI编码修复该常染色体显性突变的基因产物(例如，GOI编码突变体的拮抗剂，例如，CRISPR/Cas效应子和指导RNA、或特异性靶向突变基因或转录本的RNAi试剂或反义)。

在某些实施方式中，眼部疾病或病症是由于X连锁突变或由其引起的，并且GOI编码修复该X连锁突变的基因产物。

在某些实施方式中，GOI编码用于治疗神经元/CNS疾病或紊乱的产物。

在某些实施方式中，GOI经密码子优化以在靶组织中最优表达。在某些实施方式中，靶组织是哺乳动物组织，例如人组织。

在某些实施方式中，GOI处于启动子，以及任选地，调节(例如，增强)从启动子转录的增强子的转录控制之下。

示例性非限制性启动子包括：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、温度敏感型启动子等。示例性启动子及增强子描述于本文下文中(通过引用并入)。

在某些实施方式中，启动子特异性针对眼部组织，例如视网膜特异性启动子。

在某些实施方式中，启动子特异性针对CNS组织，例如神经元特异性启动子、或神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞)特异性启动子。

在某些实施方式中，包含GOI的多核苷酸进一步包含增强该GOI表达的内含子和/或外显子。

如本文所用，“内含子”是指DNA或RNA的非编码片段，通常通过剪接将该非编码片段从转录的RNA中去除。然而，本发明的多核苷酸序列可以包含内含子序列，例如来自异源基因(关于感兴趣的基因或GOI的“异源”，其作为通过本发明的rAAV病毒颗粒递送至宿主细胞的转基因表达)的内含子序列，以增强GOI的表达。本发明RNA序列中的这样的内含子序列可以通过剪接去除，也可以不去除。此外，这样的内含子序列可以进一步包含转录的增强子或其一部分，因为某些增强子可以位于编码DNA的内含子内。

如本文所用，“外显子”是指DNA或RNA的编码片段，外显子翻译成蛋白序列。然而，在某些实施方式中，本发明的多核苷酸序列内的外显子序列可以编码GOI的一部分或全部，该GOI作为通过本发明的rAAV病毒颗粒递送至宿主细胞的转基因表达。在其他实施方式中，本发明的多核苷酸序列内的外显子序列可以属于异源基因(关于GOI)，并且这样的外显子的存在可以增强GOI的表达。

示例性内含子/外显子描述于本文下文中(通过引用并入)。

在某些实施方式中，包含GOI的多核苷酸进一步包含聚A信号序列。示例性聚A信号及序列描述于本文下文中(通过引用并入)。

在某些实施方式中，包含GOI的多核苷酸进一步包含5’UTR区、3’UTR区、或二者。示例性UTR描述于本文下文中(通过引用并入)。

在某些实施方式中，包含GOI的多核苷酸进一步包含填充序列。

本发明的另一方面提供多核苷酸，该多核苷酸编码本发明经修饰衣壳蛋白中的任何一种。

本发明的另一方面提供载体，该载体包含本发明的多核苷酸。

在某些实施方式中，载体是质粒、或病毒载体，例如AdV、HSV、或经设计用于AAV生产的杆状病毒载体。

本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗或预防眼部疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者(一只或两只眼睛)施用治疗有效量的本发明rAAV、或包含本发明经修饰AAV衣壳中的任何一种的rAAV。

术语“治疗”可以包括预防细胞、组织、系统、动物或人中发生疾病、病症或病况，该细胞、组织、系统、动物或人可能易患该疾病、病症和/或病况，但尚未诊断为患有该疾病、病症和/或病况；稳定疾病、病症或病况，例如遏制它的发展；和/或减轻该疾病、病症或病况的一种或多种症状，例如引起该疾病、病症和/或病况的消退。然而，在某些实施方式中，治疗不是仅预防治疗，和/或不是仅预防性治疗(例如，治疗不包括预防或预防性治疗)。

如本文所用，“预防”病症或病况的治疗是指在统计样本中，相对于未治疗的对照样本减少经治疗样本中该病症或病况的发生，或相对于未治疗的对照样本延迟该病症或病况的一种或多种症状的发作或减轻症状的严重性的治疗。

在某些实施方式中，其中与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，rAAV的/由rAAV编码的感兴趣的基因优先在视网膜细胞中表达。

在某些实施方式中，视网膜细胞选自：光感受器(例如，视杆细胞；或视锥细胞)、视网膜神经节细胞(RGC)、米勒细胞(米勒神经胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、或视网膜色素上皮(RPE)细胞。

在某些实施方式中，眼部疾病或病症是选自以下中的一种或多种：干眼综合征(例如，DES、慢性干眼症、干燥性角膜炎；干眼症；干性角结膜炎)、干燥综合征、葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎(虹膜炎)、脉络膜视网膜炎、后葡萄膜炎、结膜炎、过敏性结膜炎、角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎(VKC)、特应性角膜结膜炎、全身性免疫介导的疾病(例如瘢痕性结膜炎及眼表的其他自身免疫紊乱)、睑缘炎、巩膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病黄斑水肿(DME)、眼部新生血管、老年性黄斑变性(ARMD)、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、巨细胞病毒(CMV)视网膜炎、视神经炎、球后视神经炎、视网膜色素变性(RP)、斯特格氏病、全色盲及黄斑皱褶。

本发明的另一方面提供在有需要的受试者中治疗中枢神经系统(CNS)疾病或紊乱的方法，该方法包括向该受试者(CNS)施用治疗有效量的本发明rAAV、或包含本发明经修饰AAV衣壳中的任何一种的rAAV。

在某些实施方式中，与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，rAAV病毒颗粒的感兴趣的基因优先在CNS细胞中表达。

在某些实施方式中，CNS细胞选自：神经元、神经胶质细胞、及血管细胞。

在某些实施方式中，所述CNS疾病或紊乱选自：脑或脊髓损伤、贝耳氏麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、外周神经病变、格林-巴利综合征、头痛、癫痫、眩晕、及神经痛。

本发明的另一方面提供生产包含本发明经修饰AAV衣壳蛋白的rAAV的方法，该方法包括在适合于将感兴趣的基因包装到包含本发明经修饰AAV衣壳蛋白的AAV衣壳壳体中的条件下，将编码所述GOI的rAAV载体引入表达本发明经修饰AAV衣壳蛋白的生产或包装细胞系。

在某些实施方式中，生产或包装细胞系经编码本发明经修饰AAV衣壳蛋白的载体感染。

在某些实施方式中，生产或包装细胞系是HEK293、HEK293T、sf9(昆虫细胞)、A549、或海拉细胞。

利用上文一般描述的本发明，本发明的其他方面将在下文详细地提供。应理解，本发明的任何一个实施方式，包括仅在权利要求或实施例中描述的那些实施方式，可以与本发明的任何一个或多个额外的实施方式组合，除非明确否认或认为不当。

6.ITR-AAV血清型

包含本发明经修饰AAV衣壳的本发明病毒颗粒可用于包封具有至少一个ITR序列(例如5’ITR、3’ITR、或二者)的任何多核苷酸序列。ITR序列可以源自本领域中各种AAV血清型的任何已知的ITR序列，包括任何天然或重组AAV血清型。

示例性非限制性ITR序列可以是、或可以源自以下AAV血清型中的任何一种：AAV1、AAV10、AAV106.1/hu.37、AAV11、AAV114.3/hu.40、AAV 12、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.1/hu.43、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV16.12/hu.l 1、AAV16.3、AAV16.8/hu.10、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAVl-7/rh.48、AAVl-8/rh.49、AAV2、AAV2.5T、AAV2-15/rh.62、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV 223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV2-3/rh.61、AAV24.1、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV27.3、AAV29.3/bb.l、AAV29.5/bb.2、AAV2G9、AAV-2-前体miRNA-101、AAV3、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-11/rh.53、AAV3-3、AAV33.12/hu.l7、AAV33.4/hu.l5、AAV33.8/hu.l6、AAV3-9/rh.52、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV4-19/rh.55、AAV42.12、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV4-4、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV4-8/r 11.64、AAV4-8/rh.64、AAV4-9/rh.54、AAV5、AAV52.1/hu.20、AAV52/hu.19、AAV5-22/rh.58、AAV5-3/rh.57、AAV54.1/hu.21、AAV54.2/hu.22、AAV54.4R/hu.27、AAV54.5/hu.23、AAV54.7/hu.24、AAV58.2/hu.25、AAV6、AAV6.1、AAV6.1.2、AAV6.2、AAV7、AAV7.2、AAV7.3/hu.7、AAV8、AAV-8b、AAV-8h、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAVA3.3、AAV A3.4、AAV A3.5、AAV A3.7、AAV-b、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5Rl、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAV-h、AAVH-1/hu.l、AAVH2、AAVH-5/hu.3、AAVH6、AAVhE1.1、AAVhER1.14、AAVhErl.16、AAVhErl.18、AAVhER1.23、AAVhErl.35、AAVhErl.36、AAVhErl.5、AAVhErl.7、AAVhErl.8、AAVhEr2.16、AAVhEr2.29、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhEr2.4、AAVhEr3.1、AAVhu.l、AAVhu.10、AAVhu.ll、AAVhu.l、AAVhu.12、AAVhu.13、AAVhu.14/9、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.19、AAVhu.2、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.3、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.4、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44Rl、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48Rl、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.5、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.53、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.6、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.7、AAVhu.8、AAVhu.9、AAVhu.t 19、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVLG-9/hu.39、AAV-LK01、AAV-LK02、AAVLK03、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAVN721-8/rh.43、AAV-PAEC、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAVpi.l、AAVpi.2、AAVpi.3、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.l3R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.2、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.2R、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.43、AAVrh.44、AAVrh.45、AAVrh.46、AAVrh.47、AAVrh.48、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.50、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.55、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.59、AAVrh.60、AAVrh.61、AAVrh.62、AAVrh.64、AAVrh.64Rl、AAVrh.64R2、AAVrh.65、AAVrh.67、AAVrh.68、AAVrh.69、AAVrh.70、AAVrh.72、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、BAAV、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、牛AAV、山羊AAV、日本AAV 10、真实型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、AAV-LK16、AAAV、AAV改组100-1、AAV改组100-2、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV SM 100-10、AAV SM 100-3、AAVSM 10-1、AAV SM 10-2、和/或AAV SM 10-8。

7.进一步突变和杂合衣壳

在一个方面，除了引入SEQ ID NO:4(例如取代与wt AAV9 VP1衣壳残基A587和Q588相对应的残基)以外，本发明的经修饰AAV衣壳可以包含一个或多个额外改变。

例如，在某些实施方式中，本发明的经修饰AAV衣壳可以包含除取代之外其他方面相同的wt AAV9序列中的进一步改变，例如Pulicherla等人(Molecular Therapy[分子疗法]19(6):1070-1078,2011)描述的序列改变，或例如AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84中的改变。

特别地，在某些实施方式中，本发明的经修饰AAV衣壳可以另外包含氨基酸390-627(AAV9 VP1编号)中的一个或多个改变，如Pulicherla等人(Molecular Therapy[分子疗法]19(6):1070-1078,2011,通过引用并入本文)所述。额外的改变可以是但不限于：AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T、W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A,；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)、和AAV9.95(T1605A；F535L)。

在某些实施方式中，本发明的经修饰AAV衣壳可以另外包含US 6,156,303中描述的序列改变，例如AAV3B(US 6,156,303的SEQ ID NO:1和10)、AAV6(US 6,156,303的SEQ IDNO:2、7和11)、AAV2(US 6,156,303的SEQ ID NO:3和8)、AAV3A(US 6,156,303的SEQ ID NO:4和9)、或其衍生物。

在某些实施方式中，本发明的经修饰AAV衣壳可以额外包含AAV-DJ或其变体的特征，例如，AAVDJ8(或AAV-DJ8)，如Grimm等人(Journal of Virology[病毒学杂志]82(12):5887-5911,2008)所述。AAV-DJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变以除去肝素结合结构域(HBD)。作为非限制性实施例，US 7,588,772中描述为SEQ ID NO:1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1)R587Q(氨基酸587处的Arg变为谷氨酰胺Gln)，和(2)R590T。作为另一非限制性实施例，AAV-DJ样序列改变可以包含以下三个突变中的一个或多个：(1)K406R，(2)R587Q，和(3)R590T。

在某些实施方式中，本发明的经修饰AAV衣壳可以额外包含WO2015/121501中描述的序列特征，例如真实型AAV(ttAAV)(WO2015/121501的SEQ ID NO:2)、所谓的UPenn AAV10(WO2015/121501的SEQ ID NO:8)、或所谓的日本AAV10(WO2015/121501的SEQ ID NO:9)、或其变体。

在另一方面，本发明的经修饰AAV衣壳可以与具有不同向性的任何一种或多种AAV一起使用以产生杂合衣壳壳体。本文或上文描述的AAV血清型中的任何一种或多种(参见上文，通过引用并入本文)可以与经修饰AAV衣壳一起用于这个目的。

在又一方面，本发明的经修饰AAV衣壳可用于源自两种或更多种衣壳的杂合衣壳序列中。例如，AAV2G9包含来自AAV2和AAV9的序列。本文或上文所述的AAV血清型中的任何一种或多种(参见上文第2部分，通过引用并入本文)可以与经修饰AAV衣壳一起用于这个目的。

在某些实施方式中，本发明的经修饰AAV衣壳可以额外包含至少一个AAV衣壳CD8⁺T细胞表位。作为非限制性实施例，AAV可以是AAV1、AAV2或AAV8。

在某些实施方式中，经修饰AAV衣壳可以额外包含PHP.A或PHP.B的特征，如Deverman(Nature Biotechnology.[自然·生物技术]34(2):204-209,2016,通过引用并入本文)中所述。

在某些实施方式中，经修饰AAV衣壳可以额外包含通过Deverman等人(NatureBiotechnology[自然·生物技术]34(2):204-209,2016,通过引用并入本文)描述的基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)产生的血清型特征。与其他AAV血清型相比，以这种方式生成的AAV血清型具有改善的CNS转导和/或神经元和星形细胞向性。

8.内含子、外显子、UTR、增强子、和其他元件

本发明的rAAV病毒颗粒包含编码感兴趣的基因(GOI)的多核苷酸，并且可以进一步包含可增强或调节GOI表达的额外任选的序列元件(例如表达控制元件)。

存在于含有GOI的多核苷酸中的表达控制元件促进适当的异源多核苷酸(例如，GOI)转录和/或翻译，包括例如内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mRNA和终止密码子的框内翻译等。

典型地，表达控制元件(一些在本发明的RNA或DNA序列内)是一个或多个核酸序列，例如影响可操作地连接的异源多核苷酸(例如，GOI)表达的启动子和增强子。这些元件典型地以顺式作用，但也可能以反式作用。表达控制可以在转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平上实现。典型地，在转录的多核苷酸的5’端(即“上游”)附近并列有调节转录的表达控制元件。表达控制元件也可以位于转录的序列的3'末端(即“下游”)或转录本内(例如，内含子中)。表达控制元件可以位于远离转录的感兴趣的基因序列的距离处(例如，距感兴趣的基因多核苷酸100至500、500至1000、2,000至5,000或更多个核苷酸)。然而，由于病毒载体(例如AAV载体)的多核苷酸长度限制，这些表达控制元件典型地将在距转录的感兴趣的基因序列的1-1,000、1-500、1-250或1-100个核苷酸内。

一些可能存在于本发明多核苷酸上的非限制性表达控制元件在下文中进一步详细描述。

内含子

已知内含子具有转录后调控元件，可有效诱导mRNA转运出细胞核并增强mRNA稳定性。

在某些实施方式中，含有GOI的多核苷酸包括一个或多个内含子或其片段。在一些实施方式中，一个或多个内含子是感兴趣的基因的片段。在一些实施方式中，一个或多个内含子与感兴趣的基因异源。

据报道，内含子影响基因表达水平。这种作用称为基因表达的内含子介导增强(IME)(Lu等人,Mol Genet Genomics[分子遗传学基因组学]279:563-572,2008)。在一些实施方式中，与没有所述一个或多个内含子的序列的基因表达相比，基因表达水平增加约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍或约10倍。

非限制性内含子包括SV40内含子、β球蛋白内含子和短嵌合内含子(CIB)。其他内含子包括Lu等人,Hum Gene Ther.[人类基因治疗]2017；28(1):125-134(通过引用并入)中描述的ColE2-RNA-OUT、OIPR、和R6K-RNA-OUT内含子；人血红蛋白亚基β(HBB2)合成内含子(Snyder等人,人类基因治疗,8(1997),第1891-1900页，通过引用并入)。

在一些实施方式中，一个或多个内含子可以小于25个核苷酸、小于50个核苷酸、小于100个核苷酸、小于150个核苷酸、小于200个核苷酸、小于250个核苷酸、小于300个核苷酸、小于350个核苷酸、小于400个核苷酸、小于450个核苷酸、或小于500个核苷酸。

在一些实施方式中，一个或多个内含子可以大于25个核苷酸、大于50个核苷酸、大于100个核苷酸、大于150个核苷酸、大于200个核苷酸、大于250个核苷酸、大于300个核苷酸、大于350个核苷酸、大于400个核苷酸、大于450个核苷酸、或大于500个核苷酸。

在一些实施方式中，一个或多个内含子可以是约50至约100个核苷酸、约50至约200个核苷酸、约50至约300个核苷酸、约50至约400个核苷酸、约50至约500个核苷酸、约100至约200个核苷酸、约100至约300个核苷酸、约100至约400个核苷酸、约100至约500个核苷酸、约200至约300个核苷酸、约200至约400个核苷酸、约200至约500个核苷酸、约300至约400个核苷酸、约300至约500个核苷酸、或约400至约500个核苷酸。

增强子

如本文所用，术语“增强子”可以是指位于感兴趣的基因附近的序列。增强子元件典型地位于含有GOI的多核苷酸中启动子元件的上游，但也可以位于内含子序列(例如，感兴趣的基因)的下游或内部，并保持功能。因此，增强子或其部分可以存在于转录的RNA序列中。

合适的增强子的非限制性实施例包括CMV增强子。

在某些实施方式中，增强子元件可以位于感兴趣的基因上游或下游的100个碱基对、200个碱基对、或300个或更多碱基对(例如，在RNA AAV载体或DNA AAV载体中)。增强子元件典型地使感兴趣的基因的表达增加高于由启动子元件提供的增加的表达。

非翻译区(UTR)

如本文所用，“非翻译区”(“UTR”)是指转录后未翻译的RNA。例如，5’UTR位于感兴趣的基因起始密码子的上游，并且3’UTR位于感兴趣的基因终止密码子的下游。在一些实施方式中，5’和/或3’UTR可以具有插入、缺失或修饰以增强转录的感兴趣的基因的稳定性。例如，5′UTR可以包含翻译起始序列，例如但不限于Kozak序列和内部核糖体进入位点(IRES)。Kozak序列具有共有的CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子之后是另一个G。

已知3′UTR具有嵌入其中的一段腺苷和尿苷。这些富含AU的特征在高周转率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可以分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的几个分散的拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这类ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE的定义不太明确。这些富含U的区域不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这类的两个充分研究的实施例。已知与ARE结合的大多数蛋白会使信使不稳定，而已经记载ELAV家族的成员，尤其是HuR增加mRNA的稳定性。HuR结合所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3′UTR中将导致HuR结合，并从而使信使在体内稳定。这些5’和/或3’UTR序列中的任一个都可以存在于本发明的RNA序列中。

在一些实施方式中，5’UTR和/或3’UTR可以包含与感兴趣的基因异源的序列。在一些实施方式中，5’UTR和/或3’UTR对感兴趣的基因是天然的。

在某些实施方式中，来自在特定组织或器官例如肺、肝、胰腺、内皮细胞、CNS、神经元、星形胶质细胞、骨骼肌、心肌、平滑肌、血液、造血细胞中正常表达的mRNA的5’UTR和/或3’UTR可用于本发明的RNA序列中，该RNA序列包含靶向这些组织中的一种或多种的GOI。

聚腺苷酸化序列

在某些实施方式中，DNA AAV载体或RNA AAV载体包含转录的经修饰AAV ITR，该转录的经修饰AAV ITR在聚A序列、聚A信号序列(例如，AAUAAA)、或RNA转录终止序列(例如，组蛋白下游元件)的5’。

本文上文定义了“聚A序列”、“聚A尾”、“聚A信号序列”和“RNA转录终止序列”。

代表性聚A信号序列和周围序列包括人生长激素(hGH)聚A序列(参见Liu等人,Gene Ther[基因治疗]20:308–317,2013，通过引用并入)、牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpA)(Goodwin和Rottman，J Biol Chem.[生物化学杂志]1992年8月15日；267(23):16330-4，通过引用并入)、SV40早期或晚期聚腺苷酸化信号、以及Choi等人(Mol Brain.[分子脑]2014；7:17，通过引用并入本文)中使用的合成聚A信号。

转录增强子

如本文所用，“转录增强子”是指可以增加感兴趣的基因转录的顺式作用核苷酸序列。在一些实施方式中，转录增强子可以位于本发明含有GOI的多核苷酸的内含子中或部分位于外显子区域中。

WPRE

在某些实施方式中，本发明含有GOI的多核苷酸包含由编码DNA上的WPRE序列编码的转录的WPRE序列。

土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)是600bp左右的DNA序列，该DNA序列在转录时会产生增强表达的三级结构。

WPRE常用于分子生物学，以增加由病毒载体递送的基因的表达。它是具有γ、α和β组分的三联调控元件。α组分长80bp：

GCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGT(SEQ ID NO:30)。单独使用时，α组分的活性仅为完整的三联WPRE序列的9％，其与土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV8)基因组的碱基对1093-1684具有100％同一性。

在某些实施方式中，WPRE序列或其部分(例如γ、α和β元件，优选按给定顺序)存在于编码被包封在本发明rAAV病毒颗粒中的含有GOI的多核苷酸序列的3’UTR区中，以大幅增加本发明含有GOI的多核苷酸的稳定性和蛋白产量。

在某些实施方式中，WPRE序列是含有最小γ元件和部分α-β元件的短WPRE(WPRE2)(参见Kalev-Zylinska,J Neurosci.[神经科学杂志]2007,27:10456-10467,通过引用并入)。

在某些实施方式中，WPRE序列是含有最小γ和α元件的短WPRE(WPRE3)(参见Choi等人,Mol Brain[分子脑]7,17(2014)，通过引用并入)。

在某些实施方式中，本发明的RNA序列包含WPRE序列和缺乏内含子的GOI。

启动子

如本文所用，术语“启动子”定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。

因此，在一些实施方式中，本发明含有GOI的多核苷酸可以包含用于转录GOI的启动子。

如本文所用，术语“启动子/调控序列”意指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，这种序列可以是核心启动子序列。在其他情况下，这种序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织或细胞类型特异性方式表达基因产物(例如，本发明的RNA序列)的启动子/调控序列。

如本文所用，术语“可操作的连接”或“可操作地连接”是指如此描述的组分的物理并列或功能性并列以允许它们以其预期方式起作用。在与异源多核苷酸可操作连接的表达控制元件的实施例中，这种关系使得控制元件调节异源多核苷酸的表达。更特别地，例如，两个可操作地连接的DNA序列意指两个DNA以这样的关系排列(顺式或反式)，使得DNA序列中的至少一个能够对另一个序列发挥生理作用。

在某些实施方式中，该启动子是组成型启动子。

如本文所用，“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

在某些实施方式中，示例性启动子可以包括：β葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即时-早期(Ie)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物，例如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、和泛素C(UBC)启动子。

在某些实施方式中，该启动子是诱导型启动子。

如本文所用，“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

在某些实施方式中，启动子是组织特异性启动子、物种特异性启动子、或细胞周期特异性启动子。参见Parr等人,Nat.Med.[自然医学]3:1145-9,1997(全部内容通过引用并入本文)。

如本文所用，“组织或细胞类型特异性”启动子是当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，由于例如细胞/组织是启动子通常在其中具有活性的细胞类型或组织类型，因此优选地导致基因产物在特定细胞类型或特定组织中产生的核苷酸序列。

组织或细胞类型特异性启动子可以包括神经元组织特异性启动子；CNS-或PNS-特异性启动子，例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、或神经元启动子；造血谱系特异性启动子，例如B细胞启动子、T细胞启动子、NK细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子；内皮细胞启动子；胰腺启动子；肝(liver/hepatic)细胞启动子；肺组织启动子等。

代表性组织特异性启动子包括朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血小板衍生的生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)、突触蛋白1(Syn1)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或神经丝重链(NFH)、β-球蛋白小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子。

星形胶质细胞特异性启动子包括神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。

少突胶质细胞特异性启动子包括髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。

在某些实施方式中，该启动子是视网膜特异性启动子。在某些实施方式中，启动子是来自或源自以下的启动子：GFAP、RLBP1、ProB2、人RHO、RHOK、GRK1、人蓝视蛋白HB570、人蓝视蛋白HB569、PR0.5、PR1.7、PR2.1、3LCR-PR0.5、hIRBP、IRBPe/GNAT2、CAR/ARR3、Crx2kb、ProA1、ProA4、ProC1、mGrm6、ProB4、Cabp5、人红视蛋白、G1.7p、hRPE65p、NA65p、VMD2、或RS1。

在某些实施方式中，该启动子是CNS特异性启动子。在某些实施方式中，启动子是来自或源自Syn1、NSE、GFAP、MAG、MBP、F4/80、CD68、PAG、vGLUT、或GAD的启动子。

在一些实施方式中，启动子与感兴趣的基因异源。在一些实施方式中，启动子是感兴趣的基因的天然启动子。在一些实施方式中，异源启动子包括插入、缺失、取代、和/或其他突变。在一些实施方式中，天然启动子包括插入、缺失、取代、和/或其他突变。

在某些实施方式中，启动子是Pol II启动子。在某些实施方式中，启动子是PolIII启动子，例如H1和U6启动子。

在某些实施方式中，启动子选自CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、截短的CMV-鸡b-肌动蛋白启动子(smCBA启动子)、EF1α启动子、CBh启动子、SFFV启动子、EFS启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子、内耳基因相关或特异性启动子，例如Myo15启动子、肌凝蛋白7A(Myo7A)启动子、肌凝蛋白6(Myo6)启动子、POU 4类同源盒3(POU4F3)启动子、OTOF启动子、FGF8启动子、VGLUT3启动子、及其突变体、截短体、或衍生物。

microRNA脱靶位点

尽管本发明AAV病毒颗粒的局部递送可以优先将本发明的AAV病毒颗粒递送到特定靶细胞、组织、或器官，但是通过例如静脉内注射或其他血管内施用的全身性递送有时可以导致一种或多种非靶细胞、组织、或器官的感染、和由本发明AAV载体基因组携带的转基因或感兴趣的基因(GOI)的不期望表达。例如，肝是许多AAV载体的主要靶，即使转基因的肝表达对于某些GOI可能是不期望的。在非靶组织或器官中的其他不期望的、且潜在地毒性脱靶转导和转基因表达可以包括CNS、骨骼肌、心脏、胰脏、及抗原呈递细胞(APC)。这样的不期望的脱靶转导已导致一系列毒性副作用，包括血小板减少、转氨酶升高、致死性出血和休克、贫血、肾衰竭、补体活化、神经元变性、肝酶急性升高和/或血小板减少。

本发明AAV病毒颗粒的组织或细胞特异性表达可以部分地通过AAV病毒颗粒的病毒衣壳、以及组织或细胞特异性启动子来控制。同时，在其他实施方式中，组织或细胞特异性表达可以部分地通过存在于本发明AAV载体基因组的RNA转录本中的某些组织脱靶位点或脱靶序列来控制。基于某些内源性微RNA(miRNA)或受控外源性miRNA在非靶向组织中的表达，这样的组织脱靶位点/序列可以阻止、遏制、或以其他方式抑制GOI在本发明AAV载体基因组上的表达。特别地，小的、非编码miRNA通常通过两种机制通过转录后沉默来调节基因表达——当与靶mRNA序列部分互补时，通过降低靶mRNA稳定性和/或蛋白质表达(例如，降低两倍至四倍或更少)，或当与靶mRNA接近完全互补时，通过切割靶mRNA和/或触发它的降解。

因此，在某些实施方式中，本发明的AAV载体基因组包含微RNA(miR)脱靶位点/序列、或微RNA结合位点系列(miRBSS)、或其反向补体的编码序列，其中该miR结合位点系列包含miR结合位点(miRBS)的一个、两个、三个、四个、五个、或更多个拷贝。在某些实施方式中，miR结合位点系列包含可能相同或不同的miR结合位点的三个拷贝。

如本文所用，“miR结合位点系列”或“miR结合位点”包括通过转录AAV载体基因组产生的RNA转录本上的RNA序列。“miR结合位点系列”或“miR结合位点”还包括与RNA序列相对应的DNA序列，因为它们的差别仅在于DNA中的T和RNA中的U。这样的DNA的反向补体是RNA序列的编码序列。换言之，在某些实施方式中，在含有DNA正链的表达盒中，miR结合位点序列是它结合的miRNA的反向补体。

miR结合位点与微RNA(miR)指导链序列(例如，宿主细胞内天然存在的miR的指导链序列)基本上是互补的(例如，是它的反向补体序列)，使得当AAV载体基因组在AAV感染的宿主细胞中转录以产生包含miR结合位点或miR结合位点系列的RNA转录本时，miR(例如，宿主细胞内天然存在的miR)可以结合miR结合位点或miR结合位点系列以干扰宿主细胞中RNA转录本上任何转基因的表达。

在某些实施方式中，miR结合位点系列或miR结合位点位于转基因(或感兴趣的基因(GOI))转录本的3’-UTR区中，在聚A序列之前。在某些实施方式中，miR结合位点系列或miR结合位点位于转基因的5’-UTR区中。在某些实施方式中，miR结合位点系列或miR结合位点位于转基因的5’-UTR和3’-UTR区二者中。例如，在某些实施方式中，AAV载体基因组包含位于5’UTR中的至少两个(例如三个)miR结合位点、和位于3’UTR中的至少两个(例如三个)miR结合位点的编码序列。

在某些实施方式中，该至少一个或多个(例如，三个)miR结合位点的第一个的起始点在距基因编码序列的3’端或RNA转录本中聚A序列的起点20、40、60、80、100、120个核苷酸内。

在某些实施方式中，该至少一个或多个(例如，三个)miR结合位点的最后一个的末端在距基因编码序列的5’端或GOI RNA转录本的5’端20、40、60、80、100、120个核苷酸内。

在某些实施方式中，每个miR结合位点独立地(设计成)与宿主细胞中的miR具有100％同一性、或接近100％同一性(例如，最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个错配)。在某些实施方式中，错配的核苷酸是连续的。在某些实施方式中，错配的核苷酸是非连续的。在某些实施方式中，错配的核苷酸出现在miR结合位点的种子区结合序列之外，例如在miR结合位点的一端或两端处。在某些实施方式中，每个miR结合位点独立地与宿主细胞中的miR具有至少约90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性、或接近100％同一性。在这个实施方式中，包含miR结合位点的RNA转录本在与宿主细胞中的miR结合时，其最终裂解和/或降解，从而阻止/减弱/消除任何转基因在RNA转录本上的表达。

在某些实施方式中，每个miR结合位点独立地具有与具有一些错配的miRNA种子序列的精确互补性(100％)、或部分互补性。在某些实施方式中，每个miR结合位点独立地包含至少7-8个与miRNA种子序列100％互补的核苷酸。在某些实施方式中，每个miR结合位点独立地由与miRNA种子序列100％互补的序列组成。在某些实施方式中，每个miR结合位点系列含有与miRNA种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。

在某些实施方式中，100％互补性区域构成每个miR结合位点序列长度的至少30％。在某些实施方式中，miR结合位点序列的其余部分与miRNA具有至少约80％至约99％互补性。

在某些实施方式中，每个miR结合位点都独立地(设计成)与宿主细胞中的miR有些相同，使得包含该miR结合位点的RNA转录本与宿主细胞中具有降低的互补性的miR结合，并降低(但不是完全消除)转基因在RNA转录本上的表达。

在某些实施方式中，miRBSS包含miR结合位点的两个或更多个拷贝，例如三个miR结合位点。

在某些实施方式中，miR结合位点的两个或更多个拷贝(例如，miR结合位点的三个拷贝)是串联的，例如连续出现，或彼此或互相之间由一个或多个核苷酸隔开。

在某些实施方式中，miR结合位点的两个或更多个拷贝在序列上是相同的。例如，三个miR结合位点在序列上可以是相同的。

在某些实施方式中，miR结合位点的两个或更多个拷贝在序列上是不同的。例如，在一些实施方式中，miR结合位点系列包含在序列上不同的miR结合位点的两个拷贝、基本上由其组成、或由其组成。在其他实施方式中，miR结合位点系列包含在序列上各自不同的miR结合位点的三个拷贝、基本上由其组成、或由其组成。在又一实施方式中，miR结合位点系列包含miR结合位点的三个拷贝、基本上由其组成、或由其组成，该拷贝中两个在序列上是相同的，而第三个在序列上是不同的。在这个实施方式中，具有相同序列的两个miR结合位点可以是串联的，或可以由具有不同序列的miR结合位点隔开。

在某些实施方式中，miR结合位点或序列区域中的每一个可以独立地具有例如但不限于以下的长度：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、或125个核苷酸。

在某些实施方式中，miR结合位点或序列区域中的每一个独立地为至少约7至约28个核苷酸长度、至少约8至约28个核苷酸长度、7至28个核苷酸、8至18个核苷酸、12至28个核苷酸、约20至约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸、或约26个核苷酸长度，并且其任选地含有至少一个与miRNA的种子序列(例如，miR183)互补的连续区域(例如，7或8个核苷酸)。

在某些实施方式中，miR结合位点与在非靶组织中以高拷贝数表达的miR互补，例如大于10,000个拷贝/细胞、20,000个拷贝/细胞、30,000个拷贝/细胞、40,000个拷贝/细胞、50,000个拷贝/细胞、60,000个拷贝/细胞、70,000个拷贝/细胞、80,000个拷贝/细胞、或100,000个拷贝或更多个拷贝/细胞。

在某些实施方式中，miR结合位点与在心脏和骨骼肌中表达的miR(例如miR-1)互补。

在某些实施方式中，miR结合位点与在肝脏或肝细胞中表达的miR(例如miR122)互补。

在某些实施方式中，miR结合位点与在造血谱系(包括免疫细胞(例如，抗原呈递细胞或APC，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞、和B-淋巴细胞)，例如US2018/0066279(所有都通过引用并入本文，尤其表1-3)中描述的那些造血谱系)中表达的miR互补，该miR包括miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-8a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-l、miR-21、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-l、miR-106a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-142-3p(miR142)、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223、和miR-424。

在某些实施方式中，miR结合位点与在APC(例如树突状细胞(DC))中表达的APC特异性miR(例如miR-30b、miR-34a、miR-125a、miR-125b、miR-142-3p、和miR-155)互补。

在某些实施方式中，miR结合位点系列包含造血谱系特异性miR的至少一个miR结合位点序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，所述造血谱系特异性miR的至少一个miR结合位点序列包含与US2018/0066279(通过引用并入本文)的表2中序列中的任何一个具有至少80％、85％、90％、至少95％、至少99％、或100％同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。

造血谱系特异性miR(反向补体)的miR结合位点序列

/>

在某些实施方式中，miR结合位点与在DRG(背根神经节)神经元中表达的miR(例如，miR96、miR182、或miR183)互补。

在某些实施方式中，miR结合位点系列包含至少一个miR183结合位点序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，该至少一个miR183结合位点包含与具有至少80％、85％、90％、至少95％、至少99％、或100％同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成，其中与miR-183种子序列互补的序列以双下划线表示。

在某些实施方式中，miR结合位点系列包含至少一个miR182结合位点序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，该至少一个miR182结合位点包含与AGTCTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO：29)具有至少80％、85％、90％、至少95％、至少99％、或100％同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，miR结合位点系列包含至少一个miR96结合位点序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，该至少一个miR96结合位点包含与AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO：30)具有至少80％、85％、90％、至少95％、至少99％、或100％同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。

在某些实施方式中，miR结合位点系列包含至少1、2、3、4、5、或6个miR183/182/96结合位点序列。

在某些实施方式中，miR结合位点系列包含可能相同或不同的两个或更多个miR结合位点。在某些实施方式中，miR结合位点系列内的miR结合位点是连续的且未由一个或多个间隔子隔开。

如此处所用，“间隔子”通常是位于两个或更多个连续miR结合位点序列之间的长度为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的任何选定的核酸序列。

在某些实施方式中，miR结合位点系列内miR结合位点中的至少两个或更多个由间隔子隔开。在某些实施方式中，间隔子是长度为约1至约12个核苷酸、或长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个核苷酸的非编码序列。在某些实施方式中，间隔子位于第一个miR结合位点序列的3’处和/或最后一个miR结合位点序列的5’处。在某些实施方式中，当多于一个间隔子存在于miR结合位点系列中时，miR结合序列之间的间隔子是相同的。在其他实施方式中，至少两个间隔子在序列上是不同的。

在某些实施方式中，本发明的AAV载体基因组包含限制GOI在RPE细胞中表达的miRBS。特别地，RPE特异性miR-204的miR结合位点可以阻断RPE细胞中AAV介导的基因表达，导致PR特异性表达。因此，在这样的实施方式中，本发明的AAV载体基因组包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、或6个)限制GOI在RPE细胞中表达的miR-204结合位点。

在某些其他实施方式中，本发明的AAV载体基因组包含限制GOI在PR中表达的miRBS。特别地，PR特异性miR-124的miR结合位点可以阻断PR(光感受器)细胞中AAV介导的基因表达，导致RPE特异性表达。因此，在这样的实施方式中，本发明的AAV载体基因组包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、或6个)限制GOI在PR细胞中表达的miR-124结合位点。

9.使用方法

本发明的rAAV病毒颗粒可用于将任何感兴趣的基因递送到任何合适的靶细胞、组织或生物体，用于基因疗法的任何用途。

用于眼部基因疗法的AAV

遗传性视网膜营养不良(IRD)涵盖多种致盲性疾病，3,000人中大约1人受到影响。存在显著的基因型和表型变异，目前有超过300个基因和基因座与IRD、以及以常染色体隐性、常染色体显性或X连锁模式遗传的病况有关。在突破性临床试验导致有史以来第一个FDA批准的体内基因产品voretigene neparvovec-rzyl(也称为Luxturna)之后，IRD已经成为医学兴趣的主要话题。随着第二代病毒载体效率的改善和正在研究的额外进展，用于常染色体隐性疾病的眼部基因疗法正迅速扩展。此外，正在评价利用基因编辑和RNA调节策略治疗更大的基因中的突变以拮抗显性突变的有害效果。这些技术在常染色体显性疾病的治疗中将尤其重要。而且，基因编辑和RNA调节策略不仅可用于拮抗显性突变的有害效果，而且可用于大的基因缺陷校正。例如，DNA编辑(或DNA碱基编辑)或基因表达校正(例如，通过使用CRISPR或反义寡核苷酸(ASO)来调节转录本剪接)都可以用于这个目的。

经修饰AAV衣壳和包含其的rAAV可以用于基因疗法中这样的眼部疾病的治疗。利用基于血清型2的AAV转导视网膜色素上皮(RPE)细胞已经部分地校正了LCA2中的视网膜失明。然而，用于视网膜失明的基因疗法的许多应用依赖于视杆细胞和视锥细胞光感受器(PR)的有效转导，这是利用第一代载体技术难以实现的。正常的人视网膜含有两类主要的感光神经元：视杆细胞PR，其对昏暗的光敏感，及视锥细胞PR，其对明亮的光刺激有反应。基因突变阻碍这两组细胞中的一组或两组的功能，并且导致它们的变性及随后视力丧失。超过200个不同的基因/座与这些类型的之致盲性病症有关(参见sph.uth.tmc.edu dotretnet dot disease dot htm)。

因此，在某些实施方式中，利用本发明经修饰AAV衣壳进行包封的AAV载体基因组涵盖的本发明GOI包括引起上述网站中列出的病症中任一种的已知靶基因中的任何一种，例如作为由本发明AAV载体携带的GOI，其表达缓解该病症的至少一种症状的靶基因。

在某些其他实施方式中，有待由使用本发明经修饰AAV衣壳进行包封的AAV载体基因组涵盖的本发明GOI包括拮抗引起上述网站中列出的病症中任一种的已知靶基因中的任何一种的功能/表达的药剂，例如，其表达与该病症的至少一种症状有关或是该至少一种症状的原因、并且通过该药剂(拮抗已知靶基因的功能/表达)下调其表达缓解该病症的至少一种症状的靶基因。这样的拮抗剂的代表性非限制性实施例包括以下中的任何一种或多种：ZFN、TALEN、或CRISPR系统核酸酶(靶向显性疾病基因，和/或用作校正基因或调节基因表达的工具)；抗体或其抗原结合片段(中和显性疾病基因的基因产物，例如抗VEGF抗体)；RNAi试剂(siRNA、shRNA、miRNA等)、反义多核苷酸、或其他非编码多核苷酸(下调显性疾病基因的表达)等。

在某些实施方式中，靶基因的代表性(非限制性)实施例包括以下中的任何一种或多种：RPE65、REP1、LRAT、GRP143、TYR、BEST1、MERTK、MYO7A、ADAM9、RGR、RS1、CEP290、RPGR、BBS4、USH2D、RPGRIP、TULP1、CRB1、GUCY2D、AIPL1、CRX、ABCA4、PDE6B、RHO、PRPH2、NR2E3、NRL、CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C、RLBP1、和ND4。

视网膜色素变性(RP)主要影响视杆细胞PR，但可以导致继发性视锥细胞异常。视锥细胞和视锥细胞-视杆细胞营养不良(例如斯特格氏病)的特征在于原发性视锥细胞受累，其中可能伴随视杆细胞的损失。全色盲与降低的或最小的视锥细胞功能有关，并且这种病症的完整形式是常染色体隐性遗传。由于视网膜色素上皮的萎缩，年龄相关性黄斑变性影响视网膜中央的视杆细胞和视锥细胞。对于PR转导，AAV2、AAV7和AAV8可以有效地转导视杆细胞，只有AAV9以低剂量有效地靶向中央和外周的视锥细胞，这可能是由于半乳糖基化聚糖(AAV9的主要受体)在视锥细胞PR上的丰富性。因此，AAV9和具有本发明经修饰AAV衣壳的衍生物是用于需要恢复视锥细胞PR功能的策略的理想候选物。

尽管AAV9通过视网膜下注射在小鼠视网膜中示出了较差的长期转导稳定性，但它在非人灵长类动物中显示出完全不同的模式，AAV9不仅能像其他AAV血清型一样靶向视杆细胞，而且在注射后4个月以低剂量有效地靶向中央和外周视锥细胞。因此，AAV9和具有本发明经修饰AAV衣壳的衍生物是尤其在人中用于视网膜转导的理想载体。

在某些实施方式中，本发明的rAAV是局部施用，用于眼部基因疗法。对于PR或视网膜RPE细胞的转导，在一些实施方式中，将本发明的rAAV颗粒施用至视网膜下隙(即，在RPE与PR之间液体注射后形成的腔)。在某些实施方式中，将本发明的rAAV施用至眼睛的玻璃体，这导致内层视网膜内细胞、主要地神经节细胞和米勒神经胶质细胞的转导。

由于内界膜处的物理屏障或在ILM处缺乏合适的受体，当玻璃体内施用时，很少有天然存在的AAV血清型能够转导PR。每种施用途径都有它的优点和缺点。玻璃体内注射是最小侵入性的，但导致较高的免疫反应。rAAV的视网膜下注射将帮助降低产品的免疫原性且需要较少的产品，然而它是侵入性的。

本发明的rAAV病毒颗粒可用于将任何感兴趣的基因递送到任何合适的靶细胞、组织或生物体(例如眼部组织/细胞或CNS组织或细胞)，用于任何基因疗法对这样的合适靶细胞、组织或生物体的任何用途。

在一些实施方式中，将包含本发明经修饰AAV衣壳的rAAV施用于有需要的受试者。在一些实施方式中，可以施用rAAV来治疗眼部疾病或病症。在一些实施方式中，通过玻璃体内注射(即，通过将载体注射于眼睛的玻璃体内)或视网膜下注射(即，通过将载体注射于RPE细胞与光感受器之间的空间中)来施用rAAV。

在一些实施方式中，眼部疾病是选自以下中的一种或多种：干眼综合征(例如，DES、慢性干眼症、干燥性角膜炎；干眼症；干性角结膜炎)、干燥综合征、葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎(虹膜炎)、脉络膜视网膜炎、后葡萄膜炎、结膜炎、过敏性结膜炎、角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎(VKC)、特应性角膜结膜炎、全身性免疫介导的疾病(例如瘢痕性结膜炎及眼表的其他自身免疫紊乱)、睑缘炎、巩膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病黄斑水肿(DME)、眼部新生血管、老年性黄斑变性(ARMD)、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、巨细胞病毒(CMV)视网膜炎、视神经炎、球后视神经炎、视网膜色素变性(RP)、斯特格氏病、全色盲及黄斑皱褶。

在一个实施方式中，眼部疾病是干眼综合征。在一个实施方式中，眼部疾病是过敏性结膜炎。在一个实施方式中，眼部疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)。在一个实施方式中，眼部疾病是糖尿病视网膜病变。

通过包含本发明经修饰AAV衣壳的rAAV可治疗的代表性眼部疾病进一步描述于下文。

如本文所用，术语“眼部疾病”、“眼部病况”、“眼睛疾病”及“眼睛病况”是指会对视力造成威胁、导致眼睛不适、并且可以预示全身性健康问题的眼睛疾病/病况。

干眼综合征(DES、慢性干眼症、干燥性角膜炎；干眼症；干性角结膜炎)可以定义为包括各种导致维持眼睛表面的天然泪膜丧失、或组成改变的病症的病况。没有这个泪膜，视力受损并且患者可能遭受严重的眼部不适。DES可以通过泪液过度蒸发或泪腺(其是泪液产生的部位)中泪液产生的减少而引起。尽管这种病况的确切原因尚不清楚，但是有证据支持减少的泪液产生与泪器的一个或多个组分的炎症之间的联系。

DES也可以是干燥综合征的表现，干燥综合征是其中产生泪液及唾液的腺体受到破坏的自身免疫紊乱。这导致口腔干燥、流泪减少、及其他粘膜干燥。

非感染性葡萄膜炎是与显著的视力发病率相关的慢性炎症性、公认的Th1/Th17介导的自身免疫性疾病，并且潜在地致盲。葡萄膜炎导致的失明通常不是由单次炎症发作产生的；相反，炎症的反复发作造成累积性损害。导致视力丧失的炎症并发症可以包括黄斑囊样水肿、白内障、玻璃体碎屑、青光眼、黄斑病变(瘢痕形成及萎缩)、视神经病变及视网膜脱离中的一种或多种。

前葡萄膜炎(虹膜炎)发生在眼睛前部并且是最常见的葡萄膜炎形式。睫状体平坦部炎是睫状体平坦部的炎症，该睫状体平坦部是虹膜与脉络膜之间的狭窄区域。后葡萄膜炎(软骨炎)主要影响脉络膜(葡萄膜束的后部)。如果视网膜也受累，则将它称为脉络膜视网膜炎。后葡萄膜炎的发生可能与自身免疫性疾病有关，或在全身感染后发生。在后葡萄膜炎中，炎症可以持续数月至数年，并且可能导致永久的视力损伤，即使经过治疗也如此。

葡萄膜炎会导致视力损伤、眼部疼痛和视力丧失。据估计，美国约10％的新失明病例是由葡萄膜炎引起的。仅在美国就有大约300,000人患有葡萄膜炎，他们中的大多数受前葡萄膜炎的影响。FDA批准的用于治疗葡萄膜炎的唯一治疗剂类别是皮质类固醇，该皮质类固醇因多种副作用出名，例如高血压、高血糖症、及高胆固醇血症、及在眼睛中青光眼及白内障形成。

结膜炎(红眼病)描述了造成结膜肿胀、瘙痒、灼烧、及发红的一组疾病，该结膜是衬于眼睑并覆盖巩膜的暴露区域、或白眼球的保护性膜。

角膜炎是角膜(眼睛前部的透明部分)的炎症。角膜炎可以由感染性因子(细菌、真菌、病毒、寄生虫等)或非感染性因子引起(例如，某些类型的自身免疫性疾病与各种非感染性角膜炎相关)。

角膜结膜炎是指角膜和结膜的炎症。

春季角膜结膜炎(VKC)是以上眼睑上坚硬、隆起的鹅卵石样肿块为特征的复发性眼部炎症性疾病。结膜还可能肿胀及增厚。结膜是衬于眼睑以及眼睛的暴露部分(角膜除外)的最外层膜。

特应性角膜结膜炎是称为特应症的病况的结果。特应症是其中免疫系统响应于给定过敏原产生高于正常的抗体的遗传性疾病。

全身性免疫介导的疾病(例如瘢痕性结膜炎和其他眼部表面的自身免疫紊乱)代表一组临床异质性病况，其中急性和慢性自身反应机制可以对眼睛造成严重损害。当严重并影响结膜的上皮和固有质时，可发生瘢痕形成，这由于纤维化而导致显著的机械改变。这些病况虽然通常不常见，但可能是严重的病理及视力残疾的原因。

睑缘炎是引起眼睑炎症的常见病况。

巩膜炎是影响眼睛的白色外层(称为巩膜)的严重炎症性疾病。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是逐渐破坏敏锐的中央视力的与年龄相关的疾病。AMD影响位于视网膜中心的黄斑。AMD存在两种形式：湿性和干性。当视网膜后面的异常血管开始在黄斑下生长时，发生湿性AMD。这些新的血管往往极为脆弱且经常漏出血液及流体。血液及流体将黄斑从它在眼睛后部的正常位置抬高。迅速发生对黄斑的损害。当黄斑中的感光细胞慢慢分解、逐渐地使受影响眼睛的中央视力模糊时，发生干性AMD。

糖尿病可以以多种方式影响眼睛。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的并发症，其是由眼睛后部的感光组织(视网膜)的血管受损引起的。最初，糖尿病视网膜病变可能不引起任何症状或仅轻微的视力问题。然而，最终，糖尿病视网膜病变会导致失明。糖尿病黄斑水肿(DME)是由于从黄斑内血管渗出流体而引起的糖尿病视网膜肿胀。

眼部新血管形成是眼睛中血管的异常或过度形成。眼部新血管形成已经在糖尿病视网膜病变及年龄相关性黄斑变性(AMD)中证实。

增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)是眼睛内瘢痕组织的形成。“增殖”，由于细胞增殖，且“玻璃体视网膜病变”，由于涉及玻璃体及视网膜的问题。在PVR中，疤痕组织在视网膜上形成薄片，该薄片收缩。这种显著收缩将视网膜拉向眼睛的中心，并且使视网膜严重分离和扭曲。PVR可以发生在后部及前部，伴有视网膜的前向及周向折叠。

巨细胞病毒(CMV)与疱疹病毒有关并且几乎存在于每个人中。当人的免疫系统由于疾病(HIV)、器官或骨髓移植、或化疗而受到抑制时，CMV病毒可以对眼睛和身体的其他部位造成损害和疾病。CMV在约30％的病例中通过对视网膜造成损害来影响眼睛。这种情况称为CMV视网膜炎。

当视神经发炎并且髓鞘受损或破坏时，发生视神经炎。在位于眼睛后面的视神经部分中发生的神经损伤称为球后视神经炎，这是有时用于视神经炎的另一个术语。

视网膜前膜(黄斑皱褶)是在黄斑上形成的瘢痕组织样膜。它通常进展缓慢，并通过引起模糊和扭曲来影响中央视觉。随着它进展，黄斑上膜的拉扯可能引起肿胀。

额外可治疗的视网膜疾病和致病基因(例如，可以用于基因疗法的GOI)描述于https://sph.uth.edu/retnet/disease.htm(通过引用并入本文)中。它们包括：隐性视网膜色素变性(SAMD11、EMC1、DHDDS、RP59、POMGNT1、MDDGA3、MDDGB3、MDDGC3、RP76、RPE65、LCA2、RP20)、隐性Senior-Loken综合征(NPHP4或SLSN4)、隐性厄舍尔综合征(Ushersyndrome)(ESPN或DFNB36)、隐性莱伯氏先天性黑朦(NMNAT1、LCA9、或PNAT1)、显性视神经萎缩伴神经病变及肌肉病变或显性夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)(MFN2、CMT6、CMT2A2、或MARF)、隐性良性弗雷克视网膜(fleck retina)(PLA2G5)、显性视神经萎缩、耳聋、鱼鳞癣及神经元异常(ELOVL1)、青少年型及晚发型隐性斯特格氏病、隐性黄斑营养不良、隐性视网膜色素变性、隐性眼底黄色斑点症、隐性视锥细胞-视杆细胞营养不良(ABCA4、ABCR、ARMD2、CORD3、RP19、STGD1)等。

在某些实施方式中，可治疗的视网膜疾病及致病基因包括但不限于：全色盲(CNGA3、CNGB3)、无脉络膜症(REP1)、莱伯氏先天性黑朦(CEP290、GUCY2D、RPE65)、莱伯氏遗传性视神经病变(ND4)、视网膜劈裂症(RS1)、视网膜色素变性(PDE6B、RHO、RPE65、USH2A、RLBP1)、厄舍尔综合征(MYO7A、USH2A)、X连锁RP(RPGR)、及年龄相关性黄斑变性(ABCA4、ARMS2、C2、C3、CFB、CFH、ERCC6、FBLN5、HMCN1、HTRA1、RAX2、TLR3、TLR4、抗VEGF抗体)。用于中枢神经系统(CNS)疾病的基因疗法的AAV

在一些实施方式中，将包含本发明经修饰AAV衣壳的rAAV病毒颗粒施用给患者以治疗该患者的神经系统紊乱，包括CNS疾病或紊乱。

神经系统紊乱——大脑、脊柱和相关神经的紊乱——是全球疾病负担的主要因素，其相关经济成本高得惊人。影响CNS的神经系统紊乱仍未完全了解。已经探索各种治疗方法——尤其药物治疗、基于装置的疗法、物理疗法、手术干预——以缓解造成的人痛苦程度。实际上，尽管对CNS功能的认知有进步，但由于许多原因，例如CNS的复杂性、组织有限的再生能力、以及由于血脑屏障(BBB)而难以将常规药物输送到器官，使用现代医学和手术方法治疗神经系统紊乱仍然困难。允许递送编码潜在治疗分子的遗传物质的基因疗法代表了有吸引力的选项。基因疗法可以导致一种或多种转基因的稳定或诱导型表达，并且可以允许靶细胞中接近特异性的表达。基因疗法不仅认为适用于罕见的遗传病症，还可以为更具挑战性和复杂性的疾病(例如，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)或帕金森病)提供治疗机会。近年来，使用病毒载体的基因疗法——将治疗性基因或抑制性RNA编码到病毒衣壳中并将它施加到神经系统——已经成为神经系统紊乱疗法的临床可行的选项。实际上，AAV载体已经示出了介导到啮齿动物、猴子和人的脑的安全及长期基因转移。

然而，基因疗法对CNS的应用受有效基因递送障碍的限制。第一个关键障碍是需要能够安全、有效、且持久的将基因转移到神经元和神经胶质的载体。基于AAV2的第一代AAV载体对于需要在脑中更广泛的基因转移的许多应用来说效率太低。然而，第二代载体(例如人分离物AAV9)显著更有效且示出了将CNS基因转移的应用扩展到影响整个CNS的疾病的潜力。

在CNS中进行有效基因疗法的第二个关键障碍是载体递送方法。AAV9在静脉内递送后可以跨越BBB以转导CNS内的细胞，这是一种已经在患有SMA的婴儿中示出了前景的方法(FDA批准药物：Zolgensma)。然而，虽然跨BBB的AAV9递送在小鼠中是有效的，但当扩大到大型动物时，这种方法的低效率需要极大的载体剂量。这些剂量导致在外周器官中的高水平转导以及潜在的相关毒性，并且面临制造限制，这可能阻止了除婴儿治疗以外的临床应用。

最近，许多团队已经证明将AAV载体递送到脑脊髓液(CSF)中可以在大型动物的整个大脑和脊髓中实现转导。这种方法的可扩展性和相对非侵入性使得将它转化到临床有吸引力，且实际上，已经开始针对SMA(NCT03381729)及巨轴索神经病变(NCT02362438)的鞘内AAV9递送进行试验。

为了最大化鞘内AAV递送的效力，确定将载体施用于CSF中的最优途径。

因此，在一些实施方式中，将包含本发明经修饰AAV衣壳的rAAV病毒颗粒施用到脑脊髓液(CSF)中。

在某些实施方式中，使用腰椎穿刺作为最小侵入性方式来施用包含本发明经修饰AAV衣壳的rAAV病毒颗粒。

在某些实施方式中，rAAV是通过玻璃体内注射来施用的。

在某些实施方式中，rAAV是通过视网膜下注射来施用的。

在一些实施方式中，rAAV是通过鞘内注射(例如，腰椎穿刺-鞘内注射)来施用的。

如本文所用，术语“鞘内施用”是指将药剂(例如，包含rAAV的组合物)施用到椎管中。例如，鞘内施用可以包括在椎管的颈椎区域、椎管的胸部区域、或椎管的腰椎区域中进行注射。典型地，鞘内施用是通过将药剂(例如，包含本发明rAAV病毒颗粒的组合物)注射到椎管的蛛网膜下腔(蛛网膜下隙)中来进行，该蛛网膜下腔是椎管的蛛网膜与软脊膜之间的区域。蛛网膜下隙由海绵状组织占据，该海绵状组织由小梁(从蛛网膜延伸并融入软膜中的脆弱结缔组织长丝)和其中含有脑脊髓液的互连通道组成。在一些实施方式中，鞘内施用不是施用到脊髓血管中。

在一些实施方式中，将包含本发明经修饰AAV衣壳的rAAV病毒颗粒施用给患者以治疗该患者的CNS疾病或紊乱。

如本文所用，“CNS疾病或紊乱”是中枢神经系统疾病或紊乱。在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病或紊乱影响脊髓(例如，脊髓病变)、大脑(例如，脑病变)、或大脑及脊髓周围的组织。在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病或紊乱具有遗传起源，或者是遗传的，或者是通过体细胞突变获得的。在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病或紊乱是心理病况或病症，例如注意缺陷多动障碍、孤独症谱系障碍、心境障碍、精神分裂症、抑郁症、雷特氏综合征等。在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病或紊乱是自身免疫紊乱。在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病或紊乱是CNS癌症，例如脑或脊髓癌和/或肿瘤。在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病或紊乱是癌症，该癌症可以是CNS原发性癌，例如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤等，或可以是已经转移到CNS组织的癌症，例如已经转移到脑的肺癌。

可治疗的CNS疾病或紊乱的其他非限制性实施例包括帕金森病、溶酶体贮积症、缺血、神经病理性疼痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、及卡纳万病(Canavandisease)(CD)。

在某些实施方式中，CNS疾病或紊乱是阿尔茨海默氏病(AD)、路易体痴呆(Lewybody dementia)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、中风、及创伤性脑损伤。

在一些实施方式中，CNS疾病或紊乱是脑或脊髓损伤、贝耳氏麻痹、脑性麻痺、颈椎病、腕管综合征、亨廷顿病、运动神经元疾病(MND)、神经纤维瘤病、外周神经病变、腕管综合征、痴呆、头痛、癫痫、眩晕、及神经痛。

在某些实施方式中，可治疗的CNS疾病致病基因包括但不限于：载脂蛋白E(ApoE)、apoE2、运动神经元存活基因1(SMN1)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、CLN3、天冬氨酸酰酶蛋白质(ASPA)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体三肽基肽酶I(TPP1)、GLB1、N-磺氨基葡糖磺基氢化酶(SGSH)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、NPC1、弗里德赖希共济失调蛋白(FXN)、GAN、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、CLN6跨膜ER蛋白、α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、葡萄糖神经酰胺酶1(GBA1)、神经秩蛋白、颗粒蛋白前体(GRN)、甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、白血病抑制因子(LIF)、及睫状神经营养因子(CNTF)。

因此，在某些实施方式中，有待由使用本发明经修饰AAV衣壳进行包封的AAV载体基因组涵盖的本发明GOI包括引起本文所公开的CNS紊乱中任一种的已知靶基因(例如，本文所公开的靶基因)中的任何一种，例如，作为由本发明AAV的载体携带的GOI，其表达缓解相应的CNS紊乱的至少一种症状的靶基因。

在某些其他实施方式中，有待由使用本发明经修饰AAV衣壳进行包封的AAV载体基因组涵盖的本发明GOI包括拮抗引起本文所公开CNS紊乱中任一种的已知靶基因中的任何一种的功能/表达的药剂，例如，其表达与CNS紊乱的至少一种症状有关或是该至少一种症状的原因、并且通过该药剂(拮抗已知靶基因的功能/表达)下调其表达缓解该CNS紊乱的至少一种症状的靶基因。这样的拮抗剂的代表性非限制性实施例包括以下中的任何一种或多种：ZFN、TALEN、或CRISPR系统核酸酶(靶向显性疾病基因，和/或用作校正基因或调节基因表达的工具)；抗体或其抗原结合片段(中和显性疾病基因的基因产物，例如抗VEGF抗体)；RNAi试剂(siRNA、shRNA、miRNA等)、反义多核苷酸、或其他非编码多核苷酸(下调显性疾病基因的表达)等。

用于听觉疾病或病症的基因疗法的AAV

“听觉疾病或病症”意指与一只或两只耳朵和/或听觉系统(hearing system，auditory system)的一部分或全部有关的任何疾病或病症，包括但不限于外耳、中耳、内耳、及听觉神经系统。

在一些实施方式中，将治疗有效量的包含本发明经修饰AAV衣壳的本发明rAAV病毒颗粒施用给有需要的患者以治疗听觉疾病或病症。

在某些实施方式中，与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，rAAV病毒颗粒的感兴趣的基因优先在毛细胞中表达。

在某些实施方式中，毛细胞选自：内毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈内毛细胞；及外毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈外毛细胞。

在某些实施方式中，听觉疾病或病症是与选自以下的一种或多种基因相关联的听觉疾病或病症：ACTG1、BSND、CDH23、COL11A2、DSPP、GJA1、GJB2、GJB6、KCNQ4、MT-TS1、MYH9、MYO7A、POU3F4、PRPS1、SLC26A4、STRC、TBC1D24、TECTA、WFS1、ADCY1、BDP1、CABP2、CCDC50、CEACAM16、CIB2、CLDN14、CLIC5、COCH、COL4A6、CRYM、DCDC2、DIABLO、DIAPH1、ELMOD3、EPS8、ESPN、ESRRB、EYA4、GIPC3、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSDME、HGF、HOMER2、ILDR1、KARS1、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MET、MIR96、MSRB3、MT-CO1、MT-RNR1、MYH14、MYO15A、MYO3A、MYO6、NARS2、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PCDH15、PJVK、PNPT1、POU4F3、PTPRQ、RDX、RIPOR2、SERPINB6、SLC17A8、SLC26A5、SMPX、SYNE4、TJP2、TMC1、TMEM132E、TMIE、TMPRSS3、TNC、TPRN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、及WHRN。

在某些实施方式中，听觉疾病或病症是与GJB2、MYO6、或OTOF相关联的听觉疾病或病症。

在某些实施方式中，rAAV是通过蜗管注射来施用的。

10.载体(质粒或杆粒)

本发明的另一方面提供包含含有GOI的多核苷酸的AAV病毒载体，该AAV病毒载体可以被包封到包含本发明经修饰AAV衣壳的衣壳壳体中。

在相关方面，本发明进一步提供可用于产生本发明AAV病毒载体的载体(例如，质粒、基于HSV的载体、或杆状病毒载体)。

例如，在一些实施方式中，载体包含编码本发明经修饰AAV衣壳中任一种的多核苷酸。

在一些实施方式中，载体是包含AAV的rep和cap基因的编码序列的HSV载体，该cap基因编码本发明经修饰AAV衣壳中的任何一种。这样的HSV载体可以与另一种包含侧接一对AAV ITR序列编码序列的GOI的HSV载体一起使用，以共感染生产细胞，来生成包含包封ITR侧接的GOI的本发明经修饰AAV衣壳的AAV病毒颗粒。

在一些实施方式中，载体是包含AAV的rep和cap基因的编码序列的杆状病毒载体，该cap基因编码本发明经修饰AAV衣壳中任一种。这样的杆状病毒载体可以与另一种包含侧接一对AAV ITR序列编码序列的GOI的杆状病毒载体一起使用，以共感染昆虫生产细胞(例如Sf9)，来生成包含包封ITR侧接的GOI的本发明经修饰AAV衣壳的AAV病毒颗粒。

如本文所用，“载体”通常是指包含分离的核酸(DNA或RNA)并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质的组合物。载体可以是表达载体。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒、杆粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实施例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

11.AAV颗粒和AAV颗粒的群体

在某些实施方式中，本发明提供分离的rAAV病毒颗粒，该病毒颗粒包含被包封在本文所述的本发明经修饰AAV衣壳中任一种中的含有GOI的多核苷酸。

在本发明的rAAV载体中，rAAV基因组可以是单链(ss)核酸或双链(ds)、自身互补(sc)核酸。

本发明的相关方面还提供本发明分离的rAAV病毒颗粒的群体。

在一些实施方式中，rAAV颗粒的群体含有本发明的多个rAAV病毒颗粒，其中该群体中的rAAV颗粒的约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多具有本发明被包封的含有GOI的多核苷酸序列。

12.宿主细胞以及AAV生产

rAAV生产的一般原理是本领域已知的。参见以下综述，例如，Carter(CurrentOpinions in Biotechnology[生物技术新见],1533-539,1992)；和Muzyczka,Curr.Topicsin Microbial,and Immunol[微生物学和免疫学的当前主题]158:97-129,1992，将两者通过引用并入本文)。以下文献中描述了多种方法：Ratschin等人(Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]4:2072,1984；Hermonat等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:6466,1984)；Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:3251,1985)；McLaughlin等人(J.Virol[病毒学杂志]62:1963,1988)；以及Lebkowski等人(Mol.Cell.Biol[分子细胞生物学]7:349,1988)，Samulski等人(J.Virol[病毒学杂志]63:3822-3828,1989)；U.S.5,173,414；WO 95/13365和U.S.5,658,776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441；WO 97/08298；WO 97/21825；WO 97/06243；WO 99/11764；Perrin等人(Vaccine[疫苗]13:1244-1250,1995)；Paul等人(Human Gene Therapy[人基因疗法]4:609-615,1993)；Clark等人(Gene Therapy[基因疗法]3:1124-1132,1996)；U.S.5,786,211；U.S.5,871,982；以及U.S.6,258,595。

包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这样的细胞包括可用于包装AAV和腺病毒的HEK293、HEK293T和Sf9细胞。

通常通过将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细胞系来生成基因疗法中使用的病毒载体。载体典型地含有包装并且随后整合到宿主(如果合适的话)中所需的最小病毒序列，其他病毒序列由编码有待表达的蛋白的表达盒替代。缺失的病毒功能可以由包装细胞系以反式提供，通常是由于这些病毒功能/蛋白(例如AAV的rep和cap基因)作为整合到包装细胞中的转基因或作为引入到该包装细胞中的第二病毒载体或表达载体上的转基因而表达的结果。

例如，基因疗法中使用的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的末端反向重复(ITR)序列，该序列是包装并整合到宿主基因组中所需的。将病毒DNA包装在细胞系中，该细胞系含有编码其他AAV基因即rep和cap但缺乏ITR序列的辅助质粒。该细胞系还经作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体复制和来自辅助质粒的AAV基因表达。辅助质粒由于缺乏ITR序列而未大量包装。腺病毒的污染可以通过例如进行腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少。

在一些实施方式中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生重组AAV。典型地，通过用有待包装到AAV颗粒中的重组AAV载体(包含感兴趣的基因)、AAV辅助功能载体和辅佐功能载体转染宿主细胞产生重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(例如，rep和cap)，该序列以反式起作用，用于生产性AAV复制和包封。优选地，AAV辅助功能载体支持高效的AAV载体生产，而不生成任何可检测的野生型AAV病毒粒子(例如，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。该辅佐功能载体编码用于AAV进行复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能(例如，“辅佐功能”)的核苷酸序列。辅佐功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与活化AAV基因转录、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅佐功能可源自已知的辅助病毒的任一种，如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒-1型)和牛痘病毒。

在一些实施方式中，使用包装在昆虫细胞(例如Sf9细胞)中的杆状病毒表达系统生产本发明rAAV。参见例如，WO 2007046703、WO 2007148971、WO 2009014445、WO2009104964、WO 2013036118、WO 2011112089、WO 2016083560、WO 2015137802和WO2019016349，将所有文献通过引用并入本文。

载体滴度通常表示为病毒基因组/ml(vg/ml)。在某些实施方式中，病毒滴度高于1×10⁹、高于5×10¹⁰、高于1×10¹¹、高于5×10¹¹、高于1×10¹²、高于5×10¹²、或高于1×10¹³vg/ml。

实施例

下文提供的实施例用于说明本发明的几个示例性实施方式，并且在任何方面都不是限制性的。

实施例1：AAV衣壳设计

与第一个识别出的AAV-AAV2相比，第二代载体AAV9在小鼠模型中具有更普遍的全身表达分布，并且它还示出了跨越血脑屏障(BBB)以转导中枢神经系统(CNS)的潜力。AAV9还可以有效感染小鼠和NHP两者中的视网膜细胞(包括RPE、米勒细胞、PR细胞，尤其视锥细胞)。因此，AAV9是理想的亲代AAV载体，对其进行修饰或优化以获得具有改善特性的新型AAV载体。

在过去十年间，基于诱变策略或肽插入策略的功能性AAV文库筛选已经识别出数种具有更高感染性或更低免疫原性的新型衣壳变体。部分地基于对这些成功的经修饰衣壳的氨基酸序列进行分析，合理地设计肽库(具有不同的生物化学特性或生物功能的肽)以插入AAV9衣壳蛋白的VRVIII中(图1A和图1B)。在评价具有经修饰衣壳的AAV9变体的体内转导效率之前，单个地测试它们在293T细胞和ARPE-19细胞中的生产力和感染性。将生产力差的变体——小于野生型AAV9生产力的10％——丢弃。选择在转导293T和ARPE细胞方面具有优异性能的变体并评价它们在小鼠视网膜和CNS中的转导效率。

实施例2：rAAV体内转导效率

方法

质粒

使用转基因质粒AAV-CAG-tdTomato载体以提供待包装到所指示AAV衣壳中的报告基因。在BBI生命科学公司(BBI Life Sciences Corporation)中合成pAAV-rep2/cap9和pAAV-rep2/cap9变体。pHelper是辅助质粒，其含有为AAV病毒生成提供辅助功能的AdV基因。

rAAV生成

通过使用聚乙烯亚胺(PEI)对293T细胞进行三重转染，生成了重组AAV。在转染后72小时时从培养基中收获了病毒颗粒，并且在120小时时从细胞和培养基中收获了病毒颗粒。将细胞沉淀物重悬于具有10mM MgCl₂和150mM氯化钠的10mM Tris(pH 7.6)中，冻融三次，并在37℃下使用125U/mL苯佐那酶(Benzonase)(西格玛公司(Sigma))处理至少1小时。通过以下浓缩病毒培养基：使用具有625mM氯化钠的10％聚乙二醇8000(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))进行沉淀，重悬于具有0.001％Pluronic^TM F-68非离子表面活性剂的PBS中，并然后添加到裂解物中。然后将合并的储液调整到1000mM NaCl，在37℃下孵育1小时，并通过在2000g下离心进行澄清。然后利用碘克沙醇(iodixanol)(Optiprep,西格玛公司；D1556)不连续梯度(15％、25％、40％和58％)对澄清的储液进行纯化。将病毒浓缩并在具有0.001％Pluronic^TM F-68非离子表面活性剂的PBS中配制。通过使用以线性化基因组质粒作为标准品的qPCR测量DNA酶I抗性载体基因组的数目确定了病毒滴度。

动物

C57BL/6J动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司(Beijing Vital RiverLaboratory Animal Technology Co.,Ltd.)，并在现场动物设施中以12hr:12hr光/暗循环圈养，随意进食和饮水。所有实验方案均经动物护理和使用委员会(Animal Care and UseCommittee)批准。

rAAV视网膜下注射

将动物随机分配到多个组。将1μL(5E8或5×10⁸vg)rAAV注射到八周龄C57B1/6小鼠眼睛的视网膜下隙。注射之后四(4)周，将小鼠处死并收集器官。

rAAV玻璃体内注射

将动物随机分配到多个组。向八周龄C57B1/6小鼠玻璃体内注射1μL(1E9或1×10⁹vg)rAAV。注射之后四(4)周，将小鼠处死并收集器官。

rAAV鞘内注射

将动物随机分配到多个组。将3μL(3E9或3×10⁹vg)rAAV注射到新生(P0-P2)C57B1/6小鼠脊髓的椎间隙中。注射之后四(4)周，将小鼠处死并收集器官。

组织制备和免疫组织化学

在AAV注射后四周，将小鼠麻醉并在室温(RT)下用pH 7.4的PBS经心脏灌注，然后用新鲜制备的、在PB中的冰冷的4％多聚甲醛(PFA)进行灌注。将器官(眼睛、脊髓及脑)在4％PFA中后固定过夜。将脑和脊髓在脱水后用OCT包埋用于冷冻切片。对于视网膜复合体，在脱水步骤前在角膜上做一个刀切，并在包埋前取出晶状体。使用冷冻切片机(徕卡公司(Leica)CM1950)将生物体或组织切成20μm厚的切片，并将切片直接封于载玻片上。将载玻片在60℃下烘烤1-2小时，随后与DAPI(1:1000)一起孵育1小时。之后，使用尼康公司(Nikon)Ni-E电动直立荧光显微镜或尼康公司C2si+共聚焦显微镜捕获图像。

识别出了数种具有改变的衣壳蛋白的新型AAV。与野生型AAV相比，新型AAV在通过玻璃体内注射或视网膜下注射施用时展现出更高的视网膜细胞感染性。视网膜细胞可以是PR(例如，视杆细胞；视锥细胞)、视网膜神经节细胞(RGC)、米勒细胞(米勒神经胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、或RPE细胞。还获得了两种具有改善的CNS转导效率的AAV。

rAAV玻璃体内注射

为了评价新型衣壳通过玻璃体内注射在视网膜中的性能，将首选候选物变体AAV9-M5、AAV9-M6和AAV9-M8与亲代AAV9进行比较。将单链CAG-tdTomato表达盒进行包装，并将总共2E9个载体基因组(vg)经玻璃体内注射到2月龄的野生型小鼠(n＝6)中。在注射后4周，使所有小鼠安乐死，并处理视网膜用于DAPI染色。视网膜横截面的共聚焦扫描揭示了AAV9治疗的眼睛仅具有有限的tdTomato信号，主要在脉络膜处，其中在神经节细胞层中仅具有稀疏的tdTomato阳性细胞。然而，与亲代AAV9相比，对于跨越所有视网膜层的tdTomato信号，工程化衣壳AAV-M6达到了更高水平，而工程化衣壳AAV9-M5和AAV9-M8达到了甚至更高水平。特别地，许多PR内段、外核层和RPE层内的细胞体是tdTomato阳性的(图2A和图2B)。

rAAV视网膜下注射

为了评价新型衣壳通过视网膜下注射在视网膜中的性能，将首选候选物变体AAV9-M5、AAV9-M6和AAV9-M8与亲代AAV9(野生型)进行比较。使用相对低剂量5E8或5×10⁸vg以更好地区分病毒载体的转导效率，因为AAV9通过视网膜下注射在小鼠视网膜中已经具有良好的转导能力。在成年C57Bl/6小鼠(n＝6)中视网膜下注射在CAG启动子控制下编码tdTomato的AAV9、AAV9-M5、AAV9-M6和AAV9-M8的等分样品(1μL)。

为了识别在视网膜下施用每种病毒载体后有效转导的细胞层，在注射后四周，通过直接荧光评价对视网膜切片进行分析，以评估AAV载体向性。如图3A和图3B中所示，所有载体都可以有效地转导RPE。接受AAV9-M5、AAV9-M6和AAV9-M8的视网膜在位于ONL的PR中示出了远更强的tdTomato表达。此外，AAV9-M8、且特别地AAV9-M6还可以到达视网膜的内部部分，强烈地转导INL和RGC。总之，与AAV9相比，AAV9变体的总体视网膜转导效率好得多，尤其AAV9-M6。

rAAV鞘内注射

为了评价新型衣壳通过鞘内注射在中枢神经系统(CNS)中的性能，将首选候选物变体AAV9-M5、AAV9-M6和AAV9-M8与亲代AAV9进行比较。使用AAV9变体和AAV9包装由广谱(ubiquitous)CAG启动子驱动的单链(ss)tdTomato报告基因(ss-CAG-tdTomato)。通过鞘内注射将约3E9或3×10⁹vg的每种载体施用至新生小鼠(P0-P2)，并在4周后评估tdTomato表达。AAV9-M5、且特别地AAV9-M8看起来比AAV9更有效地转导CNS，如通过显微镜检查脑和脊髓的薄切片所判断的(图4A和图4B)。

实施例3：内耳中的rAAV体内转导效率

方法

质粒

使用转基因质粒AAV-CAG-tdTomato载体以提供待包装到所指示AAV衣壳中的报告基因。在BBI生命科学公司合成了pAAV-rep2/cap9(野生型(WT)AAV9)和pAAV-rep2/cap9变体(AAV9-M5、AAV9-M6、和AAV9-M8)。pHelper是辅助质粒，其含有为AAV病毒生成提供辅助功能的AdV基因。

rAAV颗粒生成

通过使用聚乙烯亚胺(PEI)对293T细胞进行三重转染，生成了rAAV病毒颗粒。在转染后72小时时从培养基中收获了rAAV颗粒，并且在转染后120小时时从细胞和培养基中收获了rAAV颗粒。

特别地，将293T细胞沉淀物重悬于具有10mM MgCl₂和150mM氯化钠的10mM Tris(pH 7.6)中，冻融三次，并在37℃下使用125U/mL苯佐那酶(西格玛公司)处理至少1小时用于细胞裂解。通过以下浓缩培养基：使用具有625mM氯化钠的10％聚乙二醇8000(西格玛奥德里奇公司)进行沉淀，重悬于具有0.001％Pluronic^TM F-68非离子表面活性剂的PBS中，并然后添加到细胞裂解物中。然后将合并的储液调整到1,000mM NaCl，在37℃下孵育1小时，并通过在2000g下离心进行澄清。然后利用碘克沙醇(Optiprep，西格玛公司；D1556)不连续梯度(15％、25％、40％和58％)对澄清的储液进行纯化。将rAAV颗粒浓缩并在具有0.001％Pluronic^TM F-68非离子表面活性剂的PBS中配制。通过使用以线性化基因组质粒作为标准品的qPCR测量DNA酶I抗性载体基因组的数目确定了rAAV滴度。

动物

FVB/NCrl小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在现场动物设施中以12hr:12hr光/暗循环圈养，随意进食和饮水。所有实验方案均经辉大生物科技有限公司(HuiGene Therapeutics Co.,Ltd)的动物护理和使用委员会批准。

通过蜗管注射的rAAV内耳注射

将FVB/NCrl小鼠随机分配到多个组。向出生后0-3日龄的FVB/NCrl小鼠(幼鼠)(n≥3)通过其蜗管以3nL/sec的注射速率注射剂量为5E9(5×10⁹)个载体基因组(vg)的包装tdTomato报告基因的rAAV(具有衣壳AAV9-M5(“M5”)、AAV9-M6(“M6”)、AAV9-M8(“M8”))和对照衣壳WT AAV9(“AAV9”)到它们的内耳中。简言之，通过在冰中低温暴露1分钟来麻醉幼鼠。麻醉后，在耳后切开并在手术显微镜下暴露耳泡和镫骨动脉后，在纳升显微注射系统(Nanoliter Microinjection System)(WPI公司，美国佛罗里达州萨拉索塔(Sarasota，FL，USA))上用玻璃微量移液管通过耳蜗侧壁进行注射。在注射并皮肤缝合后，幼鼠在完全康复后送回它们母亲身边。手术后实施标准的术后护理。

组织制备和免疫组织化学

rAAV内耳注射后两周，收获了注射的小鼠的颞骨，清洗，并用4％多聚甲醛在4℃下固定过夜。在10％EDTA中充分脱钙后，剥离整个感觉上皮并保存在PBS中直到染色。将所有感觉上皮样品在4℃下分别在含有1％Triton X-100(1％PBS-T)和10％驴血清的PBS中透化和封闭过夜。为了观察毛细胞(内耳中的初级感觉受体细胞)，使用抗MYO7A(肌凝蛋白7a)初级抗体(1:500稀释在1％PBS-T中，普罗透斯生物科学公司(Proteus BioSciences))作为毛细胞的标记物，并使用合适的Alex缀合的二级抗体检测该初级抗体，并且使用DAPI来标记细胞核(1:800稀释在PBS中，西格玛公司，D9542)。使用奥林巴斯公司(Olympus)FV3000IX83激光扫描共聚焦显微镜和40倍物镜可视化并捕获荧光Z堆叠图像。光学共聚焦截面的最大强度投影示出于图7和图8中。使用ImageJ FiJi(NIH,https://imagej.net/software/fiji/)软件对每0.25mm×0.125mm矩形区域所有肌凝蛋白7a阳性毛细胞的数量进行计数，该矩形区域沿宽度方向包含三排OHC(外毛细胞)和一排IHC(内毛细胞)。

结果：

因为在较高剂量下，本发明的WT AAV9和AAV9突变体都达到100％或接近100％的转导效率，因此在较低(次优)剂量(例如5E9 vg)下测试WT AAV9与AAV9突变体之间的比较，以证明AAV9突变体的优势。

在5E9 vg的剂量下，与wt AAV9相比，所有三种工程化衣壳AAV9-M5、AAV9-M6和AAV9-M8在顶圈、中圈和底圈OHC和底圈IHC中引起显著改善的tdTomato红色荧光信号，并且在顶圈和中圈IHC中引起相当的tdTomato红色荧光信号(图7)。这些数据示出了，与野生型AAV9衣壳相比，本发明的突变体衣壳赋予毛细胞显著改善的转导效率。

尽管本文已经描述了本发明的说明性实施方式，但应当理解，本发明不限于所描述的那些，并且本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下实现各种其他改变和修改。

通过引用并入

每个专利文件的全部公开内容，包括专利申请文件、科学文献、政府报告、网站和本文引用的其他参考文献，出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。本文所公开的所有序列表、或序列辨识号以其整体并入本文。

所述文献，在它们提供补充本文所阐述内容的示例性程序或其他细节的意义上来说，明确地通过引用并入本文。

本文并入优先PCT申请(PCT/CN2021/106935)某些序列的部分序列表。

/>

Claims

1.一种经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:4的重靶向肽，所述重靶向肽被插入和/或取代在野生型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的GH环的亚结构域IV-VIII中的任何一个处的所述野生型AAV衣壳蛋白的一个或多个残基。

2.如权利要求1所述的mAAV衣壳蛋白，其中所述重靶向肽被插入和/或取代GH环的亚结构域VIII的所述一个或多个残基。

3.如权利要求1或2所述的mAAV衣壳蛋白，其中所述重靶向肽被插入并取代与野生型AAV9 VP1衣壳蛋白残基A587和Q588相对应的两个残基。

4.如权利要求1-3中任一项所述的mAAV衣壳蛋白，其中所述重靶向肽包含SEQ ID NO:1的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

5.如权利要求1-3中任一项所述的mAAV衣壳蛋白，其中所述重靶向肽包含SEQ ID NO:2的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

6.如权利要求1-3中任一项所述的mAAV衣壳蛋白，其中所述重靶向肽包含SEQ ID NO:3的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

7.如权利要求1-6中任一项所述的mAAV衣壳蛋白，其中所述野生型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白是AAV9 VP1、AAV9 VP2、或AAV9 VP3。

8.如权利要求1-7中任一项所述的mAAV衣壳蛋白，所述mAAV衣壳蛋白进一步包含除了引入的重靶向肽以外的一个或多个额外突变。

9.一种经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含SEQID NO:25的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

10.一种经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含SEQID NO:26的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

11.一种经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白，所述经修饰腺相关病毒衣壳蛋白包含SEQID NO:27的多肽、基本上由其组成、或由其组成。

12.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含被包封在包含权利要求1-11中任一项所述的mAAV衣壳蛋白的衣壳壳体内的多核苷酸。

13.如权利要求12所述的rAAV病毒颗粒，其中所述多核苷酸包含感兴趣的基因(GOI)，所述感兴趣的基因侧接5’ITR、3’ITR、或二者。

14.如权利要求13所述的rAAV病毒颗粒，其中所述感兴趣的基因是：RPE65、REP1、LRAT、GRP143、TYR、BEST1、MERTK、MYO7A、ADAM9、RGR、RS1、CEP290、RPGR、BBS4、USH2D、RPGRIP、TULP1、CRB1、GUCY2D、AIPL1、CRX、ABCA4、PDE6B、RHO、PRPH2、NR2E3、NRL、CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C、RLBP1、ND4、VEGF、或拮抗其功能/表达的药剂。

15.如权利要求14所述的rAAV病毒颗粒，其中所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，所述转录调控盒包含启动子，例如组成型启动子、或视网膜特异性启动子(例如，来自GFAP、RLBP1、ProB2、人RHO、RHOK、GRK1、人蓝视蛋白HB570、人蓝视蛋白HB569、PR0.5、PR1.7、PR2.1、3LCR-PR0.5、hIRBP、IRBPe/GNAT2、CAR/ARR3、Crx2kb、ProA1、ProA4、ProC1、mGrm6、ProB4、Cabp5、人红视蛋白、G1.7p、hRPE65p、NA65p、VMD2、或RS1的启动子)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述视网膜特异性启动子转录的增强子。

16.如权利要求13所述的rAAV病毒颗粒，其中所述感兴趣的基因是：载脂蛋白E(ApoE)、apoE2、运动神经元存活基因1(SMN1)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、CLN3、天冬氨酸酰酶蛋白质(ASPA)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体三肽基肽酶I(TPP1)、GLB1、N-磺氨基葡糖磺基氢化酶(SGSH)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、NPC1、弗里德赖希共济失调蛋白(FXN)、GAN、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、CLN6跨膜ER蛋白、α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、葡萄糖神经酰胺酶1(GBA1)、神经秩蛋白、颗粒蛋白前体(GRN)、甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、或拮抗其功能/表达的药剂。

17.如权利要求16所述的rAAV病毒颗粒，其中所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，例如组成型启动子、或CNS特异性启动子(例如，来自Syn1、NSE、GFAP、MAG、MBP、F4/80、CD68、PAG、vGLUT、或GAD的启动子)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述CNS特异性启动子转录的增强子。

18.如权利要求13所述的rAAV病毒颗粒，其中所述感兴趣的基因是：

ACTG1、BSND、CDH23、COL11A2、DSPP、GJA1、GJB2、GJB6、KCNQ4、MT-TS1、MYH9、MYO7A、POU3F4、PRPS1、SLC26A4、STRC、TBC1D24、TECTA、WFS1、ADCY1、BDP1、CABP2、CCDC50、CEACAM16、CIB2、CLDN14、CLIC5、COCH、COL4A6、CRYM、DCDC2、DIABLO、DIAPH1、ELMOD3、EPS8、ESPN、ESRRB、EYA4、GIPC3、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSDME、HGF、HOMER2、ILDR1、KARS1、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MET、MIR96、MSRB3、MT-CO1、MT-RNR1、MYH14、MYO15A、MYO3A、MYO6、NARS2、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PCDH15、PJVK、PNPT1、POU4F3、PTPRQ、RDX、RIPOR2、SERPINB6、SLC17A8、SLC26A5、SMPX、SYNE4、TJP2、TMC1、TMEM132E、TMIE、TMPRSS3、TNC、TPRN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、及WHRN、或拮抗其功能/表达的药剂。

19.如权利要求18所述的rAAV病毒颗粒，其中所述感兴趣的基因与转录调控盒可操作地连接，所述转录调控盒包含启动子，例如组成型启动子、或毛细胞特异性启动子(例如，Myo15启动子、肌凝蛋白7A(Myo7A)启动子、肌凝蛋白6(Myo6)启动子、POU 4类同源盒3(POU4F3)启动子、OTOF启动子、FGF8启动子、VGLUT3启动子、其突变体、截短体或衍生物)，以及任选地，调节从所述组成型启动子或所述毛细胞特异性启动子转录的增强子。

20.如权利要求12-19中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述被包封的多核苷酸进一步包含：

1)增强子；

2)促进所述GOI表达的内含子或外显子；

3)WPRE序列；

4)5’UTR编码序列；

5)3’UTR编码序列；

6)miRNA脱靶序列；和/或

7)聚A信号序列。

21.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-11中任一项所述的经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白、或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的多核苷酸序列。

22.如权利要求19所述的多核苷酸，其经密码子优化用于哺乳动物表达。

23.一种载体，所述载体包含权利要求21或22所述的多核苷酸。

24.如权利要求23所述的载体，所述载体是质粒或病毒载体。

25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1-11中任一项所述的经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白、权利要求12-20中任一项所述的rAAV病毒颗粒、权利要求21或22所述的多核苷酸、或权利要求23或24所述的载体。

26.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-11中任一项所述的经修饰腺相关病毒(mAAV)衣壳蛋白、权利要求12-20中任一项所述的rAAV病毒颗粒、权利要求21或22所述的多核苷酸、或权利要求23或24所述的载体。

27.一种在有需要的受试者中治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求12-15中任一项所述的rAAV。

28.如权利要求27所述的方法，其中与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，所述rAAV病毒颗粒的所述感兴趣的基因优先在视网膜细胞中表达。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述视网膜细胞选自：光感受器(例如，视杆细胞；视锥细胞)、视网膜神经节细胞(RGC)、米勒细胞(米勒神经胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、或视网膜色素上皮(RPE)细胞。

30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述眼部疾病或病症是选自以下中的一种或多种：干眼综合征(例如，DES、慢性干眼症、干燥性角膜炎；干眼症；干性角结膜炎)、干燥综合征、葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎(虹膜炎)、脉络膜视网膜炎、后葡萄膜炎、结膜炎、过敏性结膜炎、角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎(VKC)、特应性角结膜炎、全身性免疫介导的疾病(例如瘢痕性结膜炎及眼表的其他自身免疫紊乱)、睑缘炎、巩膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病黄斑水肿(DME)、眼部新生血管、老年性黄斑变性(ARMD)、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、巨细胞病毒(CMV)视网膜炎、视神经炎、球后视神经炎、及黄斑皱褶。

31.一种在有需要的受试者中治疗中枢神经系统(CNS)疾病或紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求12、13、16、及17中任一项所述的rAAV。

32.如权利要求31所述的方法，其中与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，所述rAAV的感兴趣的基因优先在CNS细胞中表达。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述CNS细胞选自：神经元、神经胶质细胞、及血管细胞。

34.如权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述CNS疾病或紊乱选自：脑或脊髓损伤、贝耳氏麻痹、颈椎病、腕管综合征、脑或脊髓肿瘤、外周神经病变、格林-巴利综合征、头痛、癫痫、眩晕、及神经痛。

35.一种产生rAAV的方法，其中所述rAAV包含权利要求1-11中任一项所述的mAAV衣壳蛋白，所述方法包括将编码感兴趣的基因的rAAV载体引入到表达权利要求1-11中任一项所述的mAAV衣壳蛋白的生产或包装细胞系中。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述生产或包装细胞系经编码权利要求1-11中任一项所述的mAAV衣壳蛋白的载体感染。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述生产或包装细胞系是HEK293、HEK293T、sf9(昆虫细胞)、A549、或海拉细胞。

38.一种重靶向肽，所述重靶向肽包含SEQ ID NO:4、例如SEQ ID NO:1-3中的任何一个，基本上由其组成，或由其组成。

39.如权利要求36所述的重靶向肽，其中当所述重靶向肽被引入AAV9的VP1、VP2、和/或VP3衣壳蛋白的GH环的亚结构域VIII中时，所述重靶向肽赋予对视网膜组织/细胞及CNS的向性。

40.一种在有需要的受试者中治疗听觉疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求12、13、18及19中任一项所述的rAAV病毒颗粒。

41.如权利要求40所述的方法，其中与具有野生型AAV9衣壳的其他方面相同的参考rAAV病毒颗粒相比，所述rAAV病毒颗粒的感兴趣的基因优先在毛细胞中表达。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述毛细胞选自：内毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈内毛细胞；及外毛细胞，例如顶圈、中圈、或底圈外毛细胞。

43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述听觉疾病或病症是与选自以下中的一种或多种基因相关联的听觉疾病或病症：ACTG1、BSND、CDH23、COL11A2、DSPP、GJA1、GJB2、GJB6、KCNQ4、MT-TS1、MYH9、MYO7A、POU3F4、PRPS1、SLC26A4、STRC、TBC1D24、TECTA、WFS1、ADCY1、BDP1、CABP2、CCDC50、CEACAM16、CIB2、CLDN14、CLIC5、COCH、COL4A6、CRYM、DCDC2、DIABLO、DIAPH1、ELMOD3、EPS8、ESPN、ESRRB、EYA4、GIPC3、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSDME、HGF、HOMER2、ILDR1、KARS1、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MET、MIR96、MSRB3、MT-CO1、MT-RNR1、MYH14、MYO15A、MYO3A、MYO6、NARS2、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PCDH15、PJVK、PNPT1、POU4F3、PTPRQ、RDX、RIPOR2、SERPINB6、SLC17A8、SLC26A5、SMPX、SYNE4、TJP2、TMC1、TMEM132E、TMIE、TMPRSS3、TNC、TPRN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、及WHRN。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述听觉疾病或病症是与GJB2、MYO6、或OTOF相关联的听觉疾病或病症。