JP2023528139A

JP2023528139A - ヒト核因子ｅ２関連因子２の発現ベクター及び発現ベクターの適用

Info

Publication number: JP2023528139A
Application number: JP2022559360A
Authority: JP
Inventors: ▲劉▼▲ティン▼; 李斌
Original assignee: Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Co
Current assignee: Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Co
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2023-07-04
Also published as: MX2022012209A; CN115279906A; KR20230015891A; EP4163375A4; US20240209391A1; AU2020440834A1; CA3173999A1; EP4163375A1; BR112022018193A2; WO2021195876A1

Abstract

ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする核酸及びその核酸のヌクレオチド配列が提供される。その核酸を含む組換え発現ベクター及びその核酸を宿主に導入する形質転換体も提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、生物学的調製物の分野に関し、具体的には、ヒト核因子Ｅ２関連因子２の発現ベクター及びその適用に関する。

視神経は、網膜の神経節細胞層に由来し、中枢神経系の一部であり、網膜によって得られた視覚情報は、視神経を介して脳に伝達される。緑内障、虚血性視神経症、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＤＯＡ）などを含む視神経損傷に関連する多くの疾患が存在する。神経節細胞及びそれらの軸索への損傷は不可逆的であり、患者の視力低下、さらには失明の主な原因である。現在、視神経損傷に対する有効な薬剤は市場に存在しない。視神経保護のための薬物研究は、神経細胞の成長を促進し、かつ損傷した視神経を修復することが作用機序であるＢＤＮＦ、ＣＮＴＦなどの神経栄養因子薬に主に焦点を当てているが、治療効果は理想的ではない。

したがって、当該技術分野において、良好な治療効果を有する視神経損傷などの視神経関連疾患を治療するための方法を開発することが急務である。

本発明の第１の目的は、良好な治療効果を有する視神経損傷などの視神経関連疾患を治療するための方法を提供することである。

本発明の第２の目的は、先行技術の欠陥に狙いを定めて、眼疾患を長時間にわたって治療することができるヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供することである。

本発明の第３の目的は、ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルスベクターを提供することである。

本発明の第４の目的は、急性または慢性視神経関連疾患の治療におけるヌクレオチド、アデノ随伴ウイルスベクター、及びプラスミドのうちのいずれかの使用を提供することであり、ここで、好ましくは、疾患は、緑内障、ＤＯＡ、ＬＨＯＮ、虚血性視神経症などである。

本発明の第５の目的は、ベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬調製物を提供することである。

本発明の第６の目的は、医薬調製物の送達方法を提供することであり、ここで、医薬調製物が眼内注射され、より好ましくは、眼内注射が硝子体内注射である。

本発明の第１の態様は、ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、及び
（ｂ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を提供する。

別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、またはｍＲＮＡ配列を含む。

別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、一本鎖配列及び二本鎖配列を含む。

別の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。

本発明は、本発明の第１の態様に記載のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、核酸配列に作動可能に連結された１つ以上のプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製起点、選択可能なマーカー、核酸制限部位、及び／または相同組換え部位を含む。

別の好ましい実施形態では、プロモーターは、ＳＹＮ、ＣＭＶ、ＣＡＧ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターからなる群から選択される。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、ベクターはＡＡＶベクターである。

別の好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、ＤＮＡウイルス及びレトロウイルスベクターを含む。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むか、またはそれが挿入されたＡＡＶベクターであり、好ましくは、ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ２、またはｐＡＡＶ－２Ａｎｅｏである。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を発現するために使用される。

本発明の第３の態様は、宿主細胞であって、本発明の第２の態様に記載のベクターを含むか、またはその染色体に組み込まれた本発明の第１の態様に記載の外因性ヌクレオチド配列を有する、宿主細胞を提供する。

別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞であり、哺乳動物には、ヒト及び非ヒト哺乳動物が含まれる。

別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞、光受容細胞（錐体細胞及び／または桿体細胞を含む）、他の視細胞（双極細胞など）、（視）神経細胞、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、桿体細胞、錐体細胞、オン双極細胞、オフ双極細胞、水平細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、宿主細胞は、（網膜）神経節細胞である。

本発明の第４の態様は、視神経関連疾患を治療するための調製物または組成物の調製における本発明の第２の態様に記載のベクターの使用を提供する。

別の好ましい実施形態では、調製物または組成物は、
（ａ）細胞の抗炎症反応または抗酸化反応を活性化すること、
（ｂ）神経節細胞の生存率を高めること、
（ｃ）神経節細胞のアポトーシスを防止するまたは遅延させること、
（ｄ）網膜神経節細胞におけるＮｒｆ２遺伝子の安定した高い発現を引き起こすこと、及び
（ｅ）疾患細胞からフリーラジカルを除去すること
からなる群から選択される１つ以上の項目のためにも使用される。

別の好ましい実施形態では、神経関連疾患には、視神経損傷が含まれる。

別の好ましい実施形態では、神経関連疾患には、急性視神経損傷及び慢性視神経損傷が含まれる。

別の好ましい実施形態では、視神経関連疾患は、緑内障、常染色体優性視神経萎縮症（ＤＯＡ）、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、虚血性視神経症、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本発明の第５の態様は、（ａ）本発明の第２の態様に記載のベクターと、（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬調製物を提供する。

別の好ましい実施形態では、医薬調製物の剤形は、凍結乾燥調製物、液体調製物、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい実施形態では、医薬調製物中のベクターの量は、１×１０^９～１×１０^１６ウイルス／ｍｌ、好ましくは１×１０^１０～１×１０^１２ウイルス／ｍｌである。

別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、視神経関連疾患を治療するために使用される。

本発明の第６の態様は、本発明の第２の態様に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、それを必要とする対象の眼に導入される。

別の好ましい実施形態では、それを必要とする対象には、ヒト及び非ヒト哺乳動物が含まれる。

別の好ましい実施形態では、治療方法は、視神経関連疾患を治療するための方法である。

別の好ましい実施形態では、投与は、眼内注射を含む。

別の好ましい実施形態では、投与は、硝子体内注射を含む。

本発明の第７の態様は、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を調製する方法であって、本発明の第３の態様に記載の宿主細胞を培養して、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を得るステップを含む、方法を提供する。

本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴及び以下に具体的に説明される技術的特徴（例えば、実施例）が互いに組み合わせられて、新たなまたは好ましい技術的解決策を生み出すことができることを理解されたい。簡潔にするために、繰り返しの説明は本明細書では提供されない。

マウス網膜をｒＡＡＶ２／２－ＮＲＦ２＿天然ウイルス及びｒＡＡＶ２／２－ＮＲＦ２＿最適化ウイルスに感染させた後のＮｒｆ２タンパク質の発現レベルの比較である。マウス網膜をｒＡＡＶ２／２－ＮＲＦ２＿天然ウイルス及びｒＡＡＶ２／２－ＮＲＦ２＿最適化ウイルスに感染させた後のＮｒｆ２下流標的遺伝子ｎｑｏｌの転写レベルの比較である。正常群におけるマウスの網膜のＴＵＪ１染色の結果である（２０倍）。対照群におけるマウスの網膜のＴＵＪ１染色の結果である。ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿天然群におけるマウスの網膜伸長調製物のＴＵＪ１染色の結果である。ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿最適化群におけるマウスの網膜伸長調製物のＴＵＪ１染色の結果である。各群におけるマウスの網膜神経節細胞密度の統計的結果である。正常群におけるマウスの網膜のＢｒｎ３ａ染色の結果である（２０倍）。モデル群におけるマウスの網膜のＢｒｎ３ａ染色の結果である。モデル＋ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化群におけるマウスの網膜のＢｒｎ３ａ染色の結果である。モデル＋ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化群におけるマウスの網膜のＢｒｎ３ａ染色の結果である。各群におけるマウスの網膜神経節細胞密度の統計的結果である。モデル＋ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化群におけるマウスの眼球切片の蛍光写真である。モデル＋ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化群におけるマウスの眼球切片の蛍光写真である。対照群におけるウサギの眼底の写真である。実験群Ａにおけるウサギの眼底の写真である。実験群Ｂにおけるウサギの眼底の写真である。対照群におけるウサギの眼球切片のＨ＆Ｅ染色である。実験群Ａにおけるウサギの眼球切片のＨ＆Ｅ染色である。実験群Ｂにおけるウサギの眼球切片のＨ＆Ｅ染色である。エンハンサー／プロモーター、遺伝子配列、ポリＡ、ウイルスパッケージングＩＴＲ配列を含む各エレメントの開始－終止部位を示すプラスミドのプロファイルであり、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｒｆ２－天然プラスミドのプロファイルである。エンハンサー／プロモーター、遺伝子配列、ポリＡ、ウイルスパッケージングＩＴＲ配列を含む各エレメントの開始－終止部位を示すプラスミドのプロファイルであり、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｒｆ２＿最適化プラスミドのプロファイルである。エンハンサー／プロモーター、遺伝子配列、ポリＡ、ウイルスパッケージングＩＴＲ配列を含む各エレメントの開始－終止部位を示すプラスミドのプロファイルであり、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化プラスミドのプロファイルである。エンハンサー／プロモーター、遺伝子配列、ポリＡ、ウイルスパッケージングＩＴＲ配列を含む各エレメントの開始－終止部位を示すプラスミドのプロファイルであり、ｐＡＡＶ－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化プラスミドのプロファイルである。

本発明者らは、広範かつ徹底的な研究により、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質のコード配列の標的最適化及び設計を行い、それにより、哺乳類（ヒトなど）細胞におけるＮｒｆ２タンパク質の効率的な転写及び発現に特に好適なヌクレオチド配列を得て、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質の組換え発現ベクターを構築した。特異的に最適化されたＮｒｆ２コード配列（配列番号１）の転写効率及び翻訳効率が有意に改善され、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質の発現量が５倍以上増加した。これに基づいて、本発明者らは、本発明を完了させた。

用語
本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書で別途明確に記載されない限り、以下の用語は各々、以下に付与される意味を有する。他の定義は、本出願を通じて記載される。

「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成の許容される誤差範囲内の値または組成を指すことができ、値または組成がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９～１０１のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書で使用される場合、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））」という用語は、オープン、セミクローズド、及びクローズドとすることができる。言い換えると、この用語は、「～から本質的になる」または「～からなる」も含む。

配列同一性は、所定の比較ウィンドウ（参照ヌクレオチド配列またはタンパク質の長さの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る）に沿って２つの整列させた配列を比較し、かつ同一の残基が生じる位置の数を決定することによって決定される。典型的には、これは、パーセンテージで表される。ヌクレオチド配列の配列同一性の測定は、当業者に周知の方法である。

本明細書で使用される場合、「対象」、「それを必要とする対象」という用語は、任意の哺乳動物または非哺乳動物を指す。哺乳動物には、ヒト、脊椎動物、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。

「ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質」、「Ｎｒｆ２（タンパク質）」、「ポリペプチド」、「本発明のポリペプチド」、及び「本発明のタンパク質」という用語は、互換的に使用される。

アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）、別名、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のディペンドウイルス属に属し、これまでに発見された最も単純な構造を有する一本鎖ＤＮＡ欠損ウイルスのクラスであり、その複製にはヘルパーウイルス（通常、アデノウイルス）の関与が必要である。これは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）におけるｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子をコードする。ＩＴＲは、ウイルス複製及びパッケージングにおいて決定的な役割を果たす。ｃａｐ遺伝子はウイルスカプシドタンパク質をコードし、ｒｅｐ遺伝子はウイルスの複製及び組み込みに関与する。ＡＡＶは、様々な細胞に感染することができる。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、非病原性野生型アデノ随伴ウイルスに由来し、最も有望な遺伝子導入ベクターのうちの１つとみなされており、それらが、良好な安全性、広範囲の宿主細胞（分裂細胞及び非分裂細胞）、低免疫原性、及びインビボにおける外来遺伝子の長期発現などの特徴を有するため、遺伝子治療及びワクチン研究において世界中で広く使用されている。１０年を超える研究を経て、組換えアデノ随伴ウイルスの生物学的特徴が深く理解されており、特に様々な細胞、組織、及びインビボ実験への適用の効果に関して多くのデータが蓄積されている。医学研究では、ｒＡＡＶは、様々な疾患の遺伝子治療の研究（インビボ実験及びインビトロ実験を含む）に使用されており、特徴的な遺伝子導入ベクターとして、遺伝子機能の研究、疾患モデルの構築、及び遺伝子ノックアウトマウスの調製などにも広く使用されている。

本発明の好ましい実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、それらが安定した部位特異的な様式で感染する細胞のゲノムに組み込まれ得る比較的小さいＤＮＡウイルスである。これらは、細胞の成長、形態、または分化に何ら影響を及ぼすことなく幅広い細胞に感染することができ、ヒト病理に関与していないようである。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、配列決定され、特徴付けられている。ＡＡＶは、およそ４７００個の塩基と、両端に約１４５個の塩基を有するウイルスの複製起点となる逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域とを含む。残りのゲノムは、封入機能を有する２つの重要な領域に分けられ、ゲノムの左部分がウイルス複製及びウイルス遺伝子発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右部分がウイルスカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。

ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準の方法を使用して調製することができる。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが好適である。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、同第６，９８９，２６４号、及び同第６，９９５，００６号で見つけることができ、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。インビトロ及びインビボでの遺伝子導入のためのＡＡＶ由来のベクターの使用が記載されている（例えば、すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ９１／１８０８８号及び同第ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、及び同第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０，４８８，５２８号を参照のこと）。これらの特許公報は、ｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子が欠失しており、かつ目的とする遺伝子によって置き換えられている様々なＡＡＶ由来の構築物、ならびにインビトロ（培養細胞に）またはインビボ（生物に直接）での目的とする遺伝子の導入におけるこれらの構築物の使用を記載している。複製欠損組換えＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞株へのプラスミド（２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する目的とする核酸配列を含むプラスミド及びＡＡＶ封入遺伝子（ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子）を有するプラスミド）の共トランスフェクションによって調製することができる。その後、結果として得られたＡＡＶ組換え体が標準の技法によって精製される。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ－ＤＪのＡＡＶウイルス粒子を含むが、これらに限定されない）に封入される。したがって、本開示は、本明細書に記載のベクターのうちのいずれかを含む組換えウイルス粒子（組換えポリヌクレオチドを含むため、それらは組換え体である）を含む。かかる粒子を生成する方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されている。

核酸コード配列
本発明によって解決されるべき技術的課題は、先行技術における核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質のトランスフェクション効率の低さ及び治療効果の低さという技術的欠陥を克服することである。本発明は、核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質ならびにその調製方法及び適用を提供する。本発明の最適化されたＮｒｆ２遺伝子配列（配列番号１）がＮｒｆ２タンパク質の発現をより効率的にし、それにより、より多くのＮｒｆ２タンパク質が患者の視神経節細胞において生理的役割を果たすことが研究により見出される。

本発明に記載のヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１に記載される。ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする核酸は、１８１８ｂｐの全長を有する。本発明では、ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする核酸は、Ｎｒｆ２最適化遺伝子またはＮｒｆ２最適化核酸とも称される。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であってもよい。別の好ましい実施形態では、ヌクレオチドは、ＤＮＡである。ＤＮＡの形態には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または人工的に合成されたＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは、一本鎖とすることも二本鎖とすることもできる。ＤＮＡは、コード鎖とすることも非コード鎖とすることもできる。

本発明の全長ヌクレオチド配列またはその断片は、典型的には、ＰＣＲ増幅、組換え法、または人工合成などの方法によって得ることができる。ＰＣＲ増幅の場合、公開されている関連ヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に従ってプライマーを設計することができ、市販のｃＤＮＡライブラリまたは当業者に既知の従来の方法によって調製されたｃＤＮＡライブラリを増幅のための鋳型として使用して、関連配列を得ることができる。配列が長い場合、多くの場合、２回以上のＰＣＲ増幅を行い、その後、各ラウンドの増幅断片を正しい順序で一緒にスプライシングする必要がある。現在、本発明のポリペプチド（またはその断片もしくはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、完全に化学合成によって得ることができる。その後、このＤＮＡ配列は、当該技術分野で既知の様々な既存のＤＮＡ分子（または例えば、ベクター）及び細胞に導入することができる。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに本発明のベクターまたはポリペプチドコード配列を遺伝子操作することによって産生される宿主細胞にも関する。上記のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、単離され得る。

本明細書で使用される場合、「単離される」とは、物質をその元の環境から分離することを指す（天然物質の場合、元の環境は天然環境である）。例えば、生細胞における天然状態のポリヌクレオチド及びポリペプチドは単離及び精製されていないが、天然状態で存在する他の物質から分離される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離及び精製されている。

本発明の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載される。

関連配列が得られた時点で、組換え法を使用して、関連配列を一括して得ることができる。これは、通常、従来の方法によって、関連配列をベクターにクローニングし、ベクターを細胞に導入し、かつ関連配列を増殖した宿主細胞から単離することによって行われる。

加えて、特に断片の長さが短い場合、人工合成法を使用して、関連配列を合成することもできる。非常に長い配列を有する断片は、典型的には、複数の小さい断片を合成し、続いて、ライゲーションすることによって得ることができる。

本発明の遺伝子を得るために、ＰＣＲ技術を使用してＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法が好ましい。ＰＣＲ用プライマーは、本明細書に開示される本発明の配列情報に従って適切に選択することができ、従来の方法によって合成することができる。増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ断片は、ゲル電気泳動などの従来の方法によって単離及び精製することができる。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに本発明のベクターまたはタンパク質コード配列を遺伝子操作することによって産生される宿主細胞、ならびに宿主細胞を使用して組換え技法によってＮｒｆ２タンパク質を発現する方法にも関する。

従来の組換えＤＮＡ技法により、本発明のＮｒｆ２タンパク質を発現する宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）を、本発明のポリヌクレオチド配列を使用することによって得ることができる。一般に、これは、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドまたは本発明の第２の態様のベクターを宿主細胞に形質導入するステップを含む。

当業者に周知の方法を使用して、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、適切な転写／翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技法、ＤＮＡ合成技法、インビボ組換え技法などが含まれる。ＤＮＡ配列は、発現ベクター内の適切なプロモーターに効果的に連結されて、ｍＲＮＡ合成を指示することができる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含む。

加えて、発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養の場合にジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはＥ．ｃｏｌｉの場合にテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。

上述の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換することができ、これにより、細胞がポリペプチドを発現できるようになる。

宿主細胞は、原核細胞、または下等真核細胞もしくは高等真核細胞、例えば、哺乳類細胞（ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む）とすることができる。代表的な例には、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＣＯＳ７、または２９３細胞などの動物細胞が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞、光受容細胞（錐体細胞及び／または桿体細胞を含む）、他の視細胞（双極細胞など）、及び神経細胞が宿主細胞として選択される。別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、桿体細胞、錐体細胞、オン双極細胞、オフ双極細胞、水平細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、宿主細胞は、（網膜）神経節細胞である。

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技法を使用して行うことができる。宿主がＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を指数増殖期後に採取し、ＣａＣｌ_２法で処理することができ、使用される手順は当該技術分野で周知である。別の方法は、ＭｇＣｌ_２を使用することである。所望の場合、形質転換をエレクトロポレーションによって行うこともできる。宿主が真核生物である場合、次のＤＮＡトランスフェクション方法：リン酸カルシウム共沈殿、従来の機械的方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどを選択することができる。

得られた形質転換体は、本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するための従来の方法によって培養することができる。培養に使用される培地は、使用される宿主細胞に応じて、様々な従来の培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の成長に好適な条件下で行われる。宿主細胞が適切な細胞密度に成長した後、最適なプロモーターが適切な方法（例えば、温度切り替えまたは化学的誘導）によって誘導され、細胞がさらなる期間にわたって培養される。

上記の方法におけるポリペプチドは、細胞内もしくは細胞膜上で発現され得るか、または細胞外に分泌され得る。所望の場合、タンパク質は、その物理的特性、化学的特性、及び他の特性を使用した様々な分離法によって単離及び精製され得る。これらの方法は、当業者に周知である。これらの方法の例には、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、細菌の浸透圧的破壊、超処理（ｕｌｔｒａｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、超遠心分離、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び様々な他の液体クロマトグラフィー技法、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

配列最適化
本発明は、Ｎｒｆ２ヌクレオチド配列の最適化（配列番号１に記載のもの、本発明では最適化Ｎｒｆ２遺伝子／核酸と称される）を行い、この配列は特別に最適化され、それ故に、図１ａに示されるように、転写効率及び翻訳効率が著しく改善され、ここで、最適化Ｎｒｆ２配列と非最適化Ｎｒｆ２配列の相同性は７５％である。

本発明では、配列番号１に記載の核コドンバイアスのために最適化された組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質の配列が提供される。

本明細書で使用される場合、「最適化Ｎｒｆ２コード配列」及び「最適化Ｎｒｆ２コード遺伝子」はいずれも、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードするためのヌクレオチド配列を指し、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３に記載される。

発現ベクター及び宿主細胞
本発明は、本発明の最適化Ｎｒｆ２コード配列を含むＮｒｆ２タンパク質の発現ベクターも提供する。

配列情報が提供されると、当業者であれば、利用可能なクローニング技法を使用して、細胞への形質導入に好適な核酸配列またはベクターを生成することができる。

好ましくは、Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸配列は、ベクター、好ましくは発現ベクターとして提供される。好ましくは、これは、好ましくは標的網膜細胞における形質導入及び発現に好適な遺伝子治療ベクターとして提供される。ベクターは、ウイルスとすることも非ウイルス（例えば、プラスミド）とすることもできる。ウイルスベクターには、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含むアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＭＬＶ、ＧａＬＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ、ポックスウイルス、及びＳＶ４０に由来するものが含まれる。好ましくは、ウイルスベクターは、複製欠損型、複製可能型、または条件付き複製可能型であり得ると想定されるが、複製欠損型である。ウイルスベクターは、一般に、標的網膜細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で留まることができる。Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸配列を標的網膜細胞に導入するための好ましいウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、例えば、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。選択的標的化は、特定のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型２～ＡＡＶ血清型１２、ＡＡＶ－ＤＪ）またはこれらの血清型のうちのいずれかの修飾バージョン（ＡＡＶ４ＹＦ及びＡＡＶ７ｍ８ベクターを含む）を使用して達成することができる。

ウイルスベクターは、任意の非必須配列を欠失させるように修飾することができる。例えば、ＡＡＶでは、ウイルスは、ＩＸ遺伝子、Ｅｌａ遺伝子、及び／またはＥｌｂ遺伝子のすべてまたは一部を欠失させるように修飾することができる。野生型ＡＡＶの場合、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスの不在下では、複製は非常に非効率的である。組換えアデノ随伴ウイルスの場合、好ましくは、複製遺伝子及びカプシド遺伝子がトランスで（ｐＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド内に）提供され、ＡＡＶゲノムの２ＩＴＲのみが保持され、ビリオンにパッケージングされる一方で、必要なアデノウイルス遺伝子がアデノウイルスまたは別のプラスミドによって提供される。同様の修飾がレンチウイルスベクターにも行うことができる。

ウイルスベクターは、細胞に入る能力を有する。しかしながら、プラスミドなどの非ウイルスベクターは、標的細胞によるウイルスベクターの取り込みを促進するための薬剤と複合体化することができる。かかる薬剤には、ポリカチオン剤が含まれる。任意選択的に、リポソームベースの送達系などの送達系を使用することができる。本発明における使用のためのベクターは、好ましくはインビボまたはインビトロでの使用に好適であり、好ましくはヒトにおける使用に好適である。プラスミドは、好ましくは、ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ２、またはｐＡＡＶ－２Ａｎｅｏである。

ベクターは、好ましくは、標的網膜細胞における核酸配列の発現を指示するための１つ以上の調節配列を含む。調節配列は、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製起点、核酸制限部位、及び相同組換え部位を含むことができる。ベクターは、例えば、成長系（例えば、細菌細胞）または標的網膜細胞におけるベクターの発現を決定するために、選択可能なマーカーも含み得る。

「作動可能に連結された」とは、核酸配列が作動可能に連結された配列と機能的に関連しており、これにより、それらが互いの発現または機能に影響を及ぼす様式で連結されるようになることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された核酸配列は、プロモーターの影響を受ける発現パターンを有することになる。

プロモーターは、それが連結している核酸配列の発現を媒介する。プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。プロモーターは、内側網膜細胞における遍在的発現、またはニューロン特異的発現を指示することができる。後者の場合、プロモーターは、例えば、視神経節細胞に対して細胞型特異的発現を指示し得る。好適なプロモーターは、当業者に既知であろう。例えば、好適なプロモーターは、ＣＡＧ、ＳＹＮ、Ｌ７、ｔｈｙ－１、レストリン、カルビンジン、ヒトＣＭＶ、ＧＡＤ－６７、ニワトリベータアクチン、ｈＳｙｎ、Ｇｒｍ６、Ｇｒｍ６エンハンサーＳＶ４０融合タンパク質からなる群から選択することができる。標的化は、細胞特異的プロモーター、例えば、視神経細胞を選択的に標的化するためのＧｒｍ６－ＳＶ４０を使用して達成することができる。Ｇｒｍ６プロモーターは、Ｇｒｍ６遺伝子の２００ｂｐのエンハンサー配列と、ＳＶ４０真核生物プロモーターとの融合物であり、Ｇｒｍ６遺伝子が視神経細胞特異的代謝型グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ６をコードする。Ｇｒｍ６遺伝子は、マウス及びヒト由来が好ましい。遍在的発現は、汎神経細胞プロモーターを使用して達成することができ、その例は当該技術分野で既知であり、かつ入手可能である。かかる例の１つがＣＡＧである。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶ初期エンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターとの融合物である。

好適なプロモーターの例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。プロモーター配列は、それに作動可能に連結されたいずれのポリヌクレオチド配列の高レベル発現も駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター（アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどであるが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、かかる発現が所望される場合に誘導性プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができ、または発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態では、本発明のプロモーターには、ＣＡＧプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、及びＣＭＶプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態では、ＣＡＧプロモーターの配列は、配列番号４に記載される。

好ましい実施形態では、ＳＹＮ１プロモーターの配列は、配列番号５に記載される。

好ましい実施形態では、ＣＭＶプロモーターの配列は、配列番号６に記載される。

哺乳類細胞（好ましくはヒト、より好ましくはヒト視神経細胞または光受容細胞）においてＮｒｆ２タンパク質を発現するために多くの発現ベクターを使用することができる。本発明では、アデノ随伴ウイルスが発現ベクターとして使用されることが好ましい。

本発明は、Ｎｒｆ２タンパク質を発現するための宿主細胞も提供する。好ましくは、宿主細胞は、哺乳類細胞（好ましくはヒト、より好ましくはヒト視神経細胞または光受容細胞）であり、Ｎｒｆ２タンパク質の発現レベルを増加させる。

本発明は、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を調製する方法であって、上記の宿主細胞を培養して、組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を得るステップを含む、方法も提供する。

本発明は、ベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法も提供する。

別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、ベクターは、ＡＡＶベクターである。

調製物及び組成物
本発明は、（ａ）請求項２に記載のベクターと、（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む調製物または組成物を提供する。

別の好ましい実施形態では、医薬調製物中のベクターの含有量は、１×１０^９～１×１０^１６ウイルス／ｍｌ、好ましくは１×１０^９～１×１０^１２ウイルス／ｍｌである。

別の好ましい実施形態では、医薬調製物は、
（ａ）細胞の抗炎症反応または抗酸化反応を活性化すること、
（ｂ）神経節細胞の生存率を高めること、
（ｃ）神経節細胞のアポトーシスを防止するまたは遅延させること、
（ｄ）網膜神経節細胞におけるＮｒｆ２遺伝子の安定した高い発現を引き起こすこと、及び
（ｅ）疾患細胞からフリーラジカルを除去すること
からなる群から選択される１つ以上の項目のために使用される。

本発明の医薬組成物中の「活性成分」とは、本発明のベクター、例えば、ウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスベクターを含む）を指す。本発明の「活性成分」、調製物、及び／または組成物を使用して、視神経関連疾患を治療することができる。「安全かつ有効な量」とは、重篤な副作用を引き起こすことなく、状態または症状を有意に改善するのに十分な活性成分の量を指す。「薬学的に許容される担体または賦形剤」とは、ヒトでの使用に好適であり、かつ十分な純度及び十分な低毒性でなければならない１つ以上の適合性固体または液体充填剤またはゲル化物質を指す。本明細書で使用される「適合性」とは、組成物の成分を本発明の活性成分とブレンドすることができ、かつ互いに活性成分の有効性を有意に低下させないことを指す。

組成物は、液体または固体、例えば、粉末、ゲル、またはペーストとすることができる。好ましくは、組成物は、液体、好ましくは注射用液体である。好適な賦形剤は、当業者に既知であろう。

本発明では、担体は、網膜下投与または硝子体内投与により眼に投与することができる。いずれの投与様式でも、担体が注射用液体として提供されることが好ましい。好ましくは、注射用液体は、カプセルまたはシリンジとして提供される。

薬学的に許容される担体のいくつかの例には、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、酢酸セルロースなど）、ゼラチン、タルク、固体滑沢剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど）、硫酸カルシウム、植物油（大豆油、ゴマ油、ピーナッツ油、オリーブ油など）、ポリオール（プロピレングリコール、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど）、乳化剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）など）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、着色剤、香味料、安定剤、抗酸化剤、防腐剤、発熱物質除去水などが挙げられる。

組成物は、生理学的に許容される水性または非水性滅菌溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、及び滅菌注射用溶液または分散液に再構成される滅菌粉末を含み得る。好適な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒、または賦形剤には、水、エタノール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物が含まれる。

本発明によって提供されるＮｒｆ２をコードする核酸または融合核酸は、インビトロまたはインビボでＮｒｆ２タンパク質を産生することができ、このタンパク質またはこのタンパク質を含む調製物を使用して、視神経関連疾患を治療するための薬物を調製することができる。

ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードする最適化核酸は、より高い発現レベルを有し、それにより、より多くのＮｒｆ２タンパク質を翻訳する。最適化Ｎｒｆ２核酸を含む薬剤をウサギの眼の硝子体腔に注入し、ここで、薬剤が硝子体腔内で存続可能なままであり、核酸を視神経細胞にトランスフェクトした。最適化Ｎｒｆ２核酸は、より高いトランスフェクション効率で先行技術よりも多くのＮｒｆ２タンパク質をコードして、より良い方法で視神経関連疾患を治療する。

先行技術と比較して、本発明は、主に以下の利点を有する。
１．本発明の組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質のコード遺伝子配列は、特別に最適化されている。Ｎｒｆ２の非最適化ＤＮＡコード配列と比較して、転写効率及び翻訳効率が有意に改善され、コドン使用がより効率的になり、最適化配列のＮｒｆ２タンパク質発現レベルが有意に改善され、生物学的活性が高い。

２．本発明の最適化Ｎｒｆ２コード遺伝子（配列番号１）は、高い安全性で非常に効果的に視神経関連疾患を治療することができる。

３．本発明は、ヒトの体内でＮｒｆ２タンパク質を発現することができるアデノウイルス関連ベクターを提供し、マウスにおける急性損傷モデルは、アデノウイルス関連ベクターが網膜に効率的に感染し、大量の標的遺伝子を発現することができ、それにより、細胞の抗炎症性反応及び抗酸化反応を活性化し、マウスＲＧＣの生存率を効果的に増加させることを示す。したがって、これは、視神経損傷及び緑内障などの急性または慢性視神経関連疾患の治療に使用することができる。

４．本発明の最適化配列は、インビボでより高い発現レベル及びより安定した発現を有し、それにより、薬物の治療効果を改善する。

本発明は、具体的な実施例と併せて以下にさらに説明される。これらの実施例が本発明の範囲を限定するのではなく本発明を説明するためにのみ使用されていることを理解されたい。以下の実施例に示される特定の条件を有しない実験方法は、通常、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載の条件、または製造業者が推奨する条件に従う。別途指示されない限り、パーセンテージ及び部は重量に基づく。

別途特定されない限り、実施例の材料及び試薬はすべて市販の製品である。

実施例１：ｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２ベクターの構築方法
１．１ベクターの構築
ヒトＮｒｆ２ヌクレオチド配列（配列番号２に記載のもの）を得た後、Ｎｒｆ２ヌクレオチド配列最適化（配列番号１に記載のもの）を行った。核酸配列最適化には、コドン使用バイアス、発現を助長しない二次構造（ヘアピン構造など）の排除、ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ｍＲＮＡ二次構造、潜在スプライス部位、初期ポリアデニル化部位、内部リボソーム進入及び結合部位、ネガティブＣｐＧアイランド、ＲＮＡ不安定性領域、反復（直接反復、逆方向反復など）、ならびにクローニングに影響を及ぼし得る制限部位の変化が含まれる。最適化配列（配列番号１）にＣｌａＩ及びＸｂａＩの２つの制限部位を付加するか、または新規遺伝子及びｐＡＡＶプラスミドベクターに設計したプライマーでのＰＣＲ増幅によって生成された生成物を、それぞれ、ＣｌａＩ及びＸｂａＩ二重酵素消化に供し、その後、消化産物を回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩ライゲーションし、その後、ライゲーション産物をコンピテント細胞に形質転換して、組換えｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２を得た。細菌液体シーケンシングのために単一のクローンを選択し、シーケンシングによって得た配列を配列アラインメント分析に供して、エンハンサー／プロモーター、遺伝子配列、ポリＡ、及びウイルスパッケージングＩＴＲ配列を含む、図７に示される、正しい配列を有する組換えアデノ随伴ウイルスプラスミドｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２の取得に成功した。図７ａ、図７ｂ、図７ｃ、及び図７ｄは、それぞれ、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｒｆ２＿天然プラスミド、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｒｆ２＿最適化プラスミド、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化プラスミド、及びｐＡＡＶ－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化プラスミドのプロファイルである。

１．２ｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２組換えアデノ随伴ウイルスのコーティング
ｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミド、ｐＡＡＶ－ｒ２ｃ５プラスミド、ｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし（２２５ｃｍ^２の細胞培養フラスコに播種）、細胞を４８時間後に採取した。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、３回凍結融解した。

１．３ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２ウイルスの精製及び濃縮
クロロホルム処理－ＰＥＧ／ＮａＣｌ析出－クロロホルム抽出の３つのステップを使用してｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２ウイルスを単離し、濃縮し、精製した。全回収率＝最終生成物中のウイルス粒子の数／出発材料中のウイルス粒子の数。

１．４ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２の物理的力価を検出するための蛍光定量ＰＣＲ法
実験材料：ＳＹＢＲＩＩ（ｔａｋａｒａ）、標的断片プライマー（２０ｕＭ）、ウイルスをパッケージングするための標的プラスミド（既知の濃度）、試験するウイルス、８チューブＰＣＲストリップ（Ｂｉｏ－ｒｅｄ）。

ＰＣＲ反応条件：前変性：９５℃で１０分、サイクル：９５℃で１５秒及び６０℃で１分。

ゲノムの力価が１×１０^１２ｖｇ／ｍＬであると最終的に決定した。

他のベクターの調製方法は、上記と同じである。

実施例２：マウスにおけるｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿天然及びｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿最適化の発現レベル及び生物学的活性の比較
２．１マウスの眼の硝子体への組換えアデノ随伴ウイルスの注射
マウスを５％抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔し、マウスを麻酔した後、マウスの眼の外側及び眼球を洗浄し、消毒した。インスリン針を使用してマウスの強角膜縁の下に穴を開け、組換えアデノ随伴ウイルスベクター及び薬学的に許容される担体または賦形剤からなる１～２μｌの組換えアデノ随伴ウイルス調製物をマイクロシリンジで硝子体内注射した。マウスを、自由に食餌させた標準環境で維持し、マウスの眼の状態を毎日観察した。

２．２マウスの網膜における発現レベル及び生物学的活性の比較
投薬の３週間後、眼球を取り出した状態で脊椎を折ることによってマウスを屠殺し、網膜を氷上で速やかに剥離し、液体窒素下で保存した。ＲＩＰＡ緩衝液で網膜組織を溶解した後、Ｎｒｆ２タンパク質の発現レベルをＷＢ実験によって検出した。図１ａは、ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿天然ウイルス及びｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿最適化ウイルスがマウスの網膜に感染した後のタンパク質レベルの比較であり、配列最適化後のベクターのタンパク質発現レベルは、最適化前の５倍以上高い。

同時に、ＲＮＡをマウスの網膜から抽出し、その後、Ｎｒｆ２調節下流標的遺伝子ｎｑｏ１の転写レベルをｑＰＣＲ実験によって検出した。図１ｂは、ｒＡＡＶ２／２－ＮＲＦ＿天然ウイルス及びｒＡＡＶ２／２－ＮＲＦ＿最適化ウイルスがマウスの網膜に感染した後のＮｒｆ２下流標的遺伝子の転写レベルの比較であり、これらの結果は、配列最適化後のベクタータンパク質によって活性化された下流遺伝子の転写レベルが最適化前よりも約４倍高いことを示す。これは、配列最適化後のベクターがより強力な生物学的活性を有することを示す。

実施例３：急性視神経損傷モデルにおける視神経に対する保護効果
３．１マウス急性視神経損傷モデル
成体ＢＬ６／Ｃ５７マウスを５％抱水クロラールの腹腔内注射によって麻酔した。マウスを動物手術台上に固定し、眼皮膚をヨードフォアで消毒した。眼球の結膜組織を強角膜縁から強膜に沿って切断し、眼球と結膜との間で鈍的後方分離（ｂｌｕｎｔｌｙｂａｃｋｗａｒｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を行い、脊椎筋肉を露出させた。この分離により視神経が完全に露出し、その後、視神経を、鉗子の終端を幅１ｍｍに保った状態で逆自動ロック式エルボー鉗子を用いて、眼球の２ｍｍ後方で１０秒間保持した。術後観察を行い、眼軟膏を使用して、眼底出血、水晶体損傷、及び眼内炎症を有するマウスを除外した。

３．２実験的群分け及び硝子体内注射
５匹の非モデル化マウスを正常群として使用した。モデル化に成功したマウスを、硝子体内注射のために３つの群に分けた。対照群にｒＡＡＶ２／２－ｍＣｈｅｒｒｙウイルスを注射し（ｎ＝７）、実験群ＡにｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿天然ウイルスを注射し（ｎ＝８）、実験群ＢにｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿最適化ウイルスを注射した（ｎ＝８）。

３．３網膜神経節細胞の免疫蛍光染色及びＲＧＣ細胞計数
脊椎を折ることによってマウスを屠殺し、眼球を取り出し、固定剤で２０分間固定し、その後、網膜を剥離し、４枚の花弁状の花びらに切断し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。得られた材料を１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で２時間穿孔し、ブロッキング溶液で１時間ブロックした。その後、得られた材料を、一次抗体としてＴＵＪ１抗体（神経節細胞特異的抗体）と４℃で一晩インキュベートし、二次抗体と室温で２時間インキュベートした。核をＤＡＰＩで１５分間染色した後、載置した。

蛍光顕微鏡下で、網膜側頭四分円、上四分円、鼻四分円、及び下四分円の２つの周辺視野（視神経乳頭から３ｍｍ）及び１つの中心視野（視神経乳頭から１ｍｍ）を撮影及び計数のために選択した。網膜当たり１２の視野画像を収集し、それから平均値を計算し、その後、単位面積当たりの網膜神経節細胞数を計算した。

図２に示される結果は、ＯＮＣモデル化群（３２２±４６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図２ｂ）における生存神経節細胞の密度が正常群（１４９６±５３ＲＧＣ／ｍｍ^２、図２ａ）よりも有意に低かったことを示し（Ｐ＜０．００５）、モデル化の成功を示した。ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿天然薬物群（４７９±４６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図２ｃ）における神経節細胞の密度及びｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿最適化薬物群（８０２±１６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図２ｄ）における神経節細胞の密度はいずれも、対照群（３２２±４６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図２ｂ）よりも有意に高く、薬物群のモデル化マウスにおける網膜神経節細胞に対する保護効果を示した。本明細書では、ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿最適化薬物群のマウスにおける生存神経節細胞数は、ｒＡＡＶ２／２－Ｎｒｆ２＿天然薬物群よりも有意に高く（Ｐ＜０．０５）、配列最適化後の薬物の神経節細胞に対する保護効果が天然配列を有する薬物の保護効果よりも良好であることを示した。図２ｅは、各群におけるマウスの単位網膜面積当たりのＲＧＣ細胞数の統計的結果を示す。

実施例４：緑内障マウスモデルにおける視神経に対する保護効果
４．１ＤＢＡ／２Ｊマウスの硝子体内注射
７ヶ月齢のＤＢＡ／２Ｊマウス（眼内圧＞１８ｍｍＨｇ）を３つの群に分け、６匹のマウスにモデル群としてＰＢＳを注射し、他の２つの群に、それぞれ、ｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化ウイルス（ｎ＝７）及びｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化ウイルス（ｎ＝７）を単眼硝子体内注射した。同じ月齢の５匹のＣ５７／ＢＬ６マウスを正常群として使用した。

４．２マウスの眼内圧検査及び眼底検査
眼底検査及び眼内圧検査を術後３～５日毎に行った。すべてのマウスの眼に明らかな異常は認められず、結膜充血、分泌、眼内炎、または眼内圧の明らかな変化は認められなかった。

４．３網膜神経節細胞の染色及び計数
投薬の５ヶ月後、脊椎を折ることによってマウスを屠殺し、網膜を神経節細胞の免疫蛍光染色及び計数のために採取した。図３に示される結果は、モデル群のマウスにおける生存神経節細胞の密度（９７１±１４６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｂ）が正常群（１５０６±１５２ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ａ）よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）ことを示す。ｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化群（１４２６±１７９ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｃ）及びｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化群（１３８４±８８ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｄ）における神経節細胞の密度は、モデル群（１５０６±１５２ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｂ）と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、薬物群のモデル化マウスにおける網膜神経節細胞に対する保護効果を示した。しかしながら、ｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化群とｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化群との間に有意差はなかった。図３ｅは、各群におけるマウスの単位網膜面積当たりのＲＧＣ細胞数の統計的結果を示す。

４．４網膜発現レベル
眼球を、凍結切片及びＮｒｆ２抗体での免疫蛍光染色を行うために採取した。網膜におけるｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化及びｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化の発現レベルを検出した。図４に示される結果は、マウスの網膜をｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化に感染させた後、Ｎｒｆ２タンパク質が網膜神経節細胞のみならず、双極細胞及びアマクリン細胞でも強く発現したことを示す（図４ａ）。しかしながら、Ｎｒｆ２タンパク質は、ｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化による網膜感染後では、網膜神経節細胞で主に発現し（図４ｂ）、より高い特異性を有した。

実施例５：ウサギ網膜におけるｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化及びｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化の発現ならびに安全性検出
５．１ウサギ眼への硝子体内注射
２７匹のニュージーランド白ウサギを、ＰＢＳ群、実験群Ａ、及び実験群Ｂを含む３つの群に分け、その後、５０ｕＬの１×１０^１２ｖｇ／ｍｌのｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化及びｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化を、それぞれ、角膜縁から３ｍｍに位置する毛様体扁平部を穿刺した後に硝子体内注射して、硝子体腔に入れた。

５．２細隙灯、眼内圧、及び眼底撮影による検査
３つの群のウサギを、術後１、３、７、及び３０日目に細隙灯及び眼内圧に関して検査した。すべてのウサギに明らかな異常は認められず、結膜充血、分泌、眼内炎、または眼内圧の増加は認められなかった。術後１ヶ月のウサギの眼底写真の結果を図５に示す。対照群におけるウサギの眼底（図５ａ）と比較して、実験群Ａ（図５ｂ）及び実験群Ｂ（図５ｃ）におけるウサギの網膜血管及び視神経に明らかな合併症または損傷はなく、通常の標準硝子体内注射が明らかな炎症反応または他の合併症を引き起こさないことを示した。

５．３眼球パラフィン切片のＨ＆Ｅ染色
ウサギ眼球切片のＨ＆Ｅ染色の結果は、実験群Ａ（図６ｂ）、実験群Ｂ（図６ｃ）、及び対照群（図６ａ）における網膜神経節細胞数が基本的に同じであり、かつ階層構造が完全であることを示し、Ｎｒｆ２＿最適化組換え遺伝子が安全であり、網膜に損傷を与えないことを示した。

本発明で言及されるすべての文書は、各文書が参照により個別に組み込まれるかのように、参照により本出願に組み込まれる。加えて、本発明の上記の教示を読んだ後、当業者であれば、本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲に含まれることを理解されたい。

１．２ｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２組換えアデノ随伴ウイルスのコーティング
ｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミド、ｐＡＡＶ－ｒ２ｃ２プラスミド、ｐＡＡＶ－Ｎｒｆ２プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし（２２５ｃｍ^２の細胞培養フラスコに播種）、細胞を４８時間後に採取した。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、３回凍結融解した。

４．３網膜神経節細胞の染色及び計数
投薬の５ヶ月後、脊椎を折ることによってマウスを屠殺し、網膜を神経節細胞の免疫蛍光染色及び計数のために採取した。図３に示される結果は、モデル群のマウスにおける生存神経節細胞の密度（９７１±１４６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｂ）が正常群（１５０６±１５２ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ａ）よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）ことを示す。ｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化群（１４２６±１７９ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｃ）及びｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化群（１３８４±８８ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｄ）における神経節細胞の密度は、モデル群（９７１±１４６ＲＧＣ／ｍｍ^２、図３ｂ）と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、薬物群のモデル化マウスにおける網膜神経節細胞に対する保護効果を示した。しかしながら、ｒＡＡＶ２／２－ＣＡＧ－Ｎｒｆ２＿最適化群とｒＡＡＶ２／２－ＳＹＮ－Ｎｒｆ２＿最適化群との間に有意差はなかった。図３ｅは、各群におけるマウスの単位網膜面積当たりのＲＧＣ細胞数の統計的結果を示す。

Claims

ヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、及び
（ｂ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
からなる群から選択される、前記ヌクレオチド配列。
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
宿主細胞であって、請求項２に記載のベクターを含むか、またはその染色体に組み込まれた請求項１に記載の外因性ヌクレオチド配列を有する、前記宿主細胞。
視神経関連疾患の治療のための調製物または組成物の調製における、請求項２に記載のベクターの使用。
前記調製物または組成物が、
（ａ）細胞の抗炎症反応または抗酸化反応を活性化すること、
（ｂ）神経節細胞の生存率を高めること、
（ｃ）神経節細胞のアポトーシスを防止するまたは遅延させること、
（ｄ）網膜神経節細胞におけるＮｒｆ２遺伝子の安定した高い発現を引き起こすこと、及び
（ｅ）疾患細胞からフリーラジカルを除去すること
からなる群から選択される１つ以上の項目のためにも使用される、請求項４に記載の使用。
前記視神経関連疾患が視神経損傷を含む、請求項４に記載の使用。
前記視神経関連疾患が、緑内障、常染色体優性視神経萎縮症（ＤＯＡ）、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、虚血性視神経症、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
（ａ）請求項２に記載のベクターと、（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬調製物。
前記医薬調製物中の前記ベクターの含有量が１×１０^９～１×１０^１６ウイルス／ｍｌ、好ましくは１×１０^１０～１×１０^１２ウイルス／ｍｌである、請求項８に記載の医薬調製物。
組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を調製する方法であって、請求項３に記載の宿主細胞を培養して、前記組換えヒト核因子Ｅ２関連因子２（Ｎｒｆ２）タンパク質を得るステップを含む、前記方法。