CN109055428A

CN109055428A - 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109055428A
Application number: CN201811094124.5A
Authority: CN
Inventors: 罗学廷; 孙晓东; 高敏
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明涉及一种重组腺相关病毒载体，包含激活型的(constitutively active)人类Nrf2(Nrf2(CA))、CMV启动子/增强子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等，本发明还涉及上述重组腺相关病毒载体的制备方法，及上述重组腺相关病毒载体或包含上述重组腺相关病毒载体的组合物在制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。本发明的重组腺相关病毒载体能显著降低小鼠眼压，增加小鼠RGCs的存活率，有效的治疗青光眼视网膜神经节细胞病变。

Description

一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。

背景技术

青光眼(glaucoma)是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压增高是其主要危险因素。目前已经认识到，青光眼属于一种神经变性性疾病，其病理特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglioncell,RGC)的凋亡及其轴突的变性，以及伴随而来的视功能进行性丧失。RGC负责向大脑输出由视网膜捕捉到的视觉信号，由于高眼压、多种遗传因素或神经退行性病变等引起的RGC持续变性或凋亡，可导致视神经乳头病变、视野缺失，进而发展为青光眼。

青光眼病理机制复杂，有遗传和环境等因素参与，但其确切分子机制尚不明确。部分青光眼患者表现为高眼压，在临床可采取降眼压等对症治疗手段，但在长期无法逆转或延缓青光眼的发展。有研究发现，氧化应激损伤是青光眼高眼压损伤发生发展的一个重要病理机制，近年来研究认为Nrf2-ARE通路可能是RGCs细胞的重要抗氧化保护信号通路，RGCs细胞内Nrf2的表达受到复杂信号分子网络调控，包括Keap1、PI3K/AKT、P63、miRNA-141等。目前研究中被广泛肯定的是，在氧化应激环境下，Nrf2表达水平上调，并与Keap1亲和力下降，进而向细胞核内转移增加，与小maf形成二聚体，结合于调控抗氧化元件ARE，增加细胞内过氧化氢酶、SOD、硫氧还蛋白合成相关酶、GSH、HO-1、NQO-1等多种抗氧化分子，激活细胞抗氧化应激适应性反应，而且抑制氧化应激引起的炎症及自噬反应，保护RGCs细胞免受氧化损伤。Nrf2信号通路在正常RGC中处于静默状态，而轴突损伤后大部分RGC无法自主激活Nrf2通路而最终凋亡，有研究证实激活Nrf2通路可促进RGC在轴突损伤后存活，提示Nrf2通路对RGC在轴突损伤后存活很关键。因此，在各种视神经变性疾病中，增强RGC中Nrf2信号通路可能是防止RGC变性，促进RGC存活及轴突再生的有效治疗措施。

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。但重组腺相关病毒(rAAV)仍然存在一些不足，如重组病毒不稳定，病毒滴度低，接纳治疗基因的容量仍然有限(一般仅能插入的外源性基因片段最大约2000碱基对(bp)，否则rAAV的稳定性将被破坏)。因此，需要设计合理的重组腺相关病毒(rAAV)载体，以满足实际应用的需要。

中国专利文献CN108379597A公开了一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物，所述基因载体包含显性抑制型(dominant negative)人类Fas-associatedprotein with death domain(FADD-DN)、增强子/启动子、增加基因表达的β-globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等，还公开了上述基因载体或包含上述基因载体的组合物在制备治疗视网膜神经节细胞变性的药物中的应用；其优点表现在：上述基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼等引起的视网膜神经节细胞病变。中国专利文献CN105087648B公开了一种携带MAGE-A3抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用，该rAAV是在腺相关病毒载体中已经被删除的腺相关病毒结构基因位置处插入MAGE-A3抗原基因得到；该发明的rAAV可将其携带的MAGE-A3抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞，实验证明，被该发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制MAGE-A3抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。但是关于本发明中表达Nrf2蛋白的腺相关病毒载体及其制备方法与在治疗青光眼视网膜神经节细胞变性方面的应用，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种重组腺相关病毒载体。

本发明的第二个目的是，提供一种所述重组腺相关病毒载体的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供一种药物组合物。

本发明的第四个目的是，提供一种所述重组腺相关病毒载体的应用。

本发明的第五个目的是，提供一种治疗青光眼的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种重组腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列，Nrf2(CA)蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列选自与SEQ ID NO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述增强子/启动子为CMV，选自与SEQ ID NO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述增强子/启动子为CMV的序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述腺相关病毒可以选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45，AAV2或AAV5。

更优选地，所述腺相关病毒为AAV2。

更优选地，所述腺相关病毒为单链AAV2。

优选地，所述的重组腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQ ID NO:5有至少90％同源性的核苷酸序列。

优选地，所述重组腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、表达Nrf2(CA)的基因序列、β-globin内含子、hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。

更优选地，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述L-ITR序列如SEQ ID NO:3所示，所述CMV增强子/启动子序列SEQ ID NO:4所示，所述β-globin内含子序列如SEQ ID NO:5所示，所述hGHpA序列如SEQ ID NO:7所示，所述R-ITR序列如SEQ IDNO:8所示，所述Ampicillin序列如SEQ ID NO:9所示，所述f1ori序列如SEQ ID NO:11所示。

优选地，所述的重组腺相关病毒载体序列含有SEQ ID NO:10。

更优选地，所述的重组腺相关病毒载体序列如SEQ ID NO:12所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种如上任一所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

1)构建重组质粒AAV_Nrf2(CA)，主要元件包括CMV增强子/启动子及Nrf2(CA)基因序列；

2)将含有AAV外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_Nrf2(CA)质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体；

3)将上述重组腺相关病毒载体经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化；

4)之后用pH＝8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集；

5)收集的液体通过浓缩器后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩，用DNase I消化掉浓缩液中病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度；

6)最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80℃储存。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物组合物，所述的药物组合物含有如上任一所述的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体，所述的药物组合物表达Nrf2(CA)蛋白。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的腺相关病毒载体在制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗青光眼的方法，将如上任一所述的腺相关病毒载体给予需要治疗的个体。

优选地，给药方法为眼内注射。

更优选地，所述的眼内注射为视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

本发明优点在于：

本发明对人Nrf2(CA)基因序列进行了优化，选择了合适的载体和相关元件，构建了重组腺相关病毒载体构建AAV_Nrf2(CA)。动物实验表明，AAV_Nrf2(CA)在小鼠细胞内的感染效果优异，且在细胞核内稳定表达，是一种稳定的重组腺相关病毒载体，能显著降低小鼠眼压，增加小鼠RGCs的存活率，因此可用于制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物，具有广泛的市场前景。

附图说明

附图1是病毒载体AAV_Nrf2(CA)的特征图谱及各元件的起止位点。

附图2是C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_Nrf2(CA)两周后视网膜铺片，免疫荧光染色图。

附图3是C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_Nrf2(CA)或AAV-GFP，并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼，分别于2周、4周、8周后视网膜铺片的免疫荧光染色图。

附图4是C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_Nrf2(CA)或AAV-GFP并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼，分别于2周、4周、8周后视网膜铺片，图示为其免疫荧光染色后进行RGC计数和存活率分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明人经过研究，提供一种重组腺相关病毒载体及其用于治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的相关药物、药物组合物等。

药物组合物及药盒

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，即这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明；在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、BBS(BalancedSaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂等。

基因治疗载体

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体，根据本发明，病毒表达载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45，AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV 2载体。

本发明的AAV载体为单链AAV，可根据标准技术生产重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷～10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰～1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体可以是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1重组腺相关病毒载体的构建和分离纯化

基因序列

SEQ ID NO:1所示的是剪切后的Nrf2(CA)序列，

SEQ ID NO:2所示的是剪切后人Nrf2(CA)氨基酸序列，

SEQ ID NO:3所示的是Left ITR序列，

SEQ ID NO:4所示的是CMV序列，

SEQ ID NO:5所示的是humanβ-globin intron序列，

SEQ ID NO:6所示的是MCS序列，

SEQ ID NO:7所示的是hGHpA序列，

SEQ ID NO:8所示的是Right ITR序列，

SEQ ID NO:9所示的是Ampicillin Resistance序列，

SEQ ID NO:10所示的是全核苷酸序列，

SEQ ID NO:11所示的是f1ori序列，

SEQ ID NO:12所示的是重组序列，

SEQ ID NO:13所示的是Nrf2(CA)’序列。

质粒AAV_Nrf2(CA)的构建、特征图谱及各元件的起止位点如图1所示，主要元件包括CMV增强子/启动子(SEQ ID NO:4)及Nrf2(CA)序列(SEQ ID NO:1)，CMV增强子可以增强转入基因的表达，目的基因之后紧接着是hGHpA(SEQ ID NO:7)，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)，即病毒载体包括L-ITR(SEQ ID NO:3)，R-ITR(SEQ ID NO:8)，病毒载体还包括Ampicillin(SEQ ID NO:9)和f1ori(SEQ ID NO:11)。

病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_Nrf2(CA)质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体；经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化，使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)；之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集；收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩；再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度；最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80℃储存。

实施例2重组腺相关病毒载体对青光眼模型小鼠的治疗

1实验材料

1.1实验动物

正常C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，光照周期为12h光照-12h黑暗，自由采食，自由饮水，所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。

1.2实验试剂及耗材

生理盐水(浙江天瑞药业有限公司)，一次性注射针头(美国Becton DickinsonandCompany公司)，Nrf2抗体(Abcam)，TUJ1(Abcam)，二抗山羊抗兔IgG(JacksonImmuno)，山羊血清(Sigma)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma)，多聚甲醛(Sigma)。

1.3实验仪器

眼科实验手术显微镜(日本Nikon公司)；眼科显微器械(苏州明仁医疗器械有限公司)；微量进样器(美国Hamilton公司)；共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。

2小鼠青光眼模型的构建

磁性微珠悬浮溶液制备：因磁性微珠表面覆盖有环氧基，使用前应先除去，即将1ml磁性微珠迅速混入50ml新鲜配置的0.02M氢氧化钠(NaOH，MW 39.997g/mol)的10×Tris缓冲液的混合液中，室温振荡混匀24小时，利用磁力将磁珠微粒收集在试管底部。试管平放以确保所有微粒都被磁力所吸附。室温下混匀4小时。用移液器小心除去上层液体，小心地将磁珠团混入50ml 10×Tris溶液中，混匀并使所有微粒悬浮，磁珠微粒在无菌平衡液中的浓缩和悬浮：实验用超纯水振荡清洗微粒3次。在超净台中，加入500ml BBS吹打混匀3次。加入250ml BBS吹打混匀，使微粒重悬浮。确保溶液尽量均匀，并快速将25μl悬液移入0.5ml无菌管中。所得到的微粒溶液最终浓度为1.6×10⁶个/μl，4℃保存。

预先准备好注射用毛细针管，针管顶端呈椭圆形，且存在20度的内向夹角，并准备好已除去表面环氧基团的磁珠微粒悬液(1.6×10⁶个/μl)。选取6-8周雄性小鼠进行腹腔注射麻醉，侧放在操作台上，造模眼需水平朝上且需预先扩瞳。手术前将事先准备好的磁性微粒悬液再次吹打混匀，并迅速在毛细针管中吸取1.5μl磁性微粒悬液。毛细针管与角膜缘呈45°夹角，并在另一侧与之呈90°处用塑胶显微镊固定眼球。小心刺入毛细针管，需保证针管未进入前方深处，且过程中禁止触及虹膜和晶体。在注射点对侧角巩缘处放置一磁极，后缓慢注射1.5μl磁性微粒悬液，注射过程需保证在15至30秒内完成，注射过程中需保证磁极位置不变。注射完成后迅速移出毛细针管，后磁极位置保持不变，维持30至60秒以保证所有微粒未附着在角膜缘内测。之后眼角巩缘环绕眼球移动磁极，是磁性微粒均匀分散在角膜、虹膜夹角处并形成磁性微粒环。造模结束后小鼠需侧放在热毯上复苏，复苏过程需保持造模眼朝上。

3处理方法

3.1玻璃体腔注射

使用玻璃制毛细针，于视网膜边缘、角膜巩膜交界靠后处进针，使用微量注射器注射，注射时需注意进针角度和深度，注意避免损伤晶体或其他眼内组织。

3.2组织处理

动物先经由PBS进行全身灌注，后继续用4％多聚甲醛(PFA)灌注，灌注速度为5mL/分钟。眼球及视神经取出后在4％PFA溶液中浸泡约2小时。组织染色铺片前需在0.1M PBS中4℃储存；组织冰冻切片前需在30％蔗糖溶液中浸泡过夜。

4表达Nrf2蛋白的腺相关病毒感染及检测

造模成功的小鼠玻璃体腔注射AAV_Nrf2(CA)两周后，据前述组织处理方法进行眼球的前处理，后使用显微镊夹住眼球底部向上提起，用剪刀剪断眼球周围的结膜和肌肉组织，保持眼球组织完整，剪去角膜、虹膜和晶状体做成眼杯，并分离视网膜和脉络膜复合体。

免疫荧光染色：选取视网膜，在20％山羊血清溶液中封闭1h，后一抗孵育过夜，抗体分别为TUJ1、HA，PBS清洗三次，每次10min，后二抗孵育1h，PBS清洗三次，每次10min后封片；使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照。

结果：

小鼠注射AAV_Nrf2(CA)两周后，进行视网膜免疫荧光染色铺片，可见大量AAV_Nrf2(CA)，且定位在细胞核内表达，与DAPI重合，为RGC细胞(TUJ1免疫荧光染色)，显示AAV_Nrf2(CA)的感染效果优异(图2)。

5RGC存活率检测

8周龄小鼠单侧眼玻璃体腔注射AAV_Nrf2(CA)(实验组)、AAV_GFP(对照组)，同时在注射眼进行前房磁珠微粒注射，分别于2周、4周、8周据上述组织处理方法处理眼球及视网膜，进行免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照，每个眼球选取5个视野计数RGC(比例尺：20μm)，并计算RGC存活率。

结果：

定量分析证明前房微珠注射后RGC在2W、4W、8W时逐渐凋亡，且数量减少显著(实验组)；与之对比，注射AAV_Nrf2(CA)小鼠RGC凋亡不显著，显示AAV_Nrf2(CA)对RGC具有保护作用(图3、图4)。

实施例3重组腺相关病毒载体对青光眼模型大鼠的治疗

1实验药物

实验组：实施例1中制备得到的重组腺相关病毒载体AAV_Nrf2(CA)。

对照组：质粒AAV_Nrf2(CA)’，其中Nrf2(CA)基因序列(SEQ ID NO:1)变为Nrf2(CA)’(SEQ ID NO:13)，其他元件及重组腺相关病毒载体AAV_Nrf2(CA)’的制备方法同实施例1。

2大鼠青光眼模型的构建及给药

SPF级健康成年雄性Wistar大鼠，无眼部疾患，体重200～270g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，光照周期为12h光照-12h黑暗，自由采食，自由饮水，所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。

大鼠青光眼模型的构建方法同实施例2。

取15只造模成功的大鼠，随机分为三组，分别为模型组，对照组以及实验组，另取5只未造模健康成年雄性Wistar大鼠，作为空白组；实验组和对照组大鼠左侧眼玻璃体腔注射AAV_Nrf2(CA)(实验组)、AAV_Nrf2(CA)’(对照组)，空白组及模型组注射等量0.9％生理盐水，每天一次，持续两周。

3检测及结果

3.1检测指标及方法

术前、给药2周后、停药2周后分别用Tono-Lab弹性眼压计进行眼压测量，其中：术前为术前24小时内，给药2周后即末次给药当日，停药2周后即停止给药后的第14天。

停药两周并测量眼压(mmHg)后，将大鼠用颈椎脱臼法处死，立即摘取左侧眼球，进行视网膜铺片Nissl染色和象限及视野划分，每个标本划分4个象限，每个象限划分为3个视野，即每个标本12个视野，使用共聚焦显微镜计数每个视野的视网膜神经节细胞(retinalganglion cells,RGCs)数目(每个标本取12个视野的均值作为代表值)。

3.2检测结果

各组大鼠平均眼内压及视网膜节细胞数目见下表。

由上表可见，术前4组大鼠眼压经统计学检验，无统计学差异(P>0.05)；给药2周后及停药两周后，与空白组相比，模型组、对照组以及实验组眼压升高，具有统计学差异(P<0.05)，与模型组相比，对照组和实验组眼压明显降低，结果具有统计学差异(P<0.05)，与对照组相比，实验组眼压降低，结果具有统计学差异(P<0.05)，且实验组停药两周后眼压明显低于给药两周后，表明停药的两周内，大鼠眼压在持续降低；停药两周后，与空白组相比，模型组、对照组以及实验组RGCs数目减少，具有统计学差异(P<0.05)，与模型组相比，对照组和实验组RGCs显著数目增加，结果具有统计学差异(P<0.05)，与对照组相比，实验组RGCs数目增加，结果具有统计学差异(P<0.05)。

由上述实验可见，本发明的重组腺相关病毒AAV_Nrf2(CA)能显著降低小鼠眼压，增加小鼠RGCs的存活率，有效的治疗青光眼，效果优于AAV_Nrf2(CA)’。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第一人民医院

<120> 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用

<130> \

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggcccagc acatccagtc agaaaccagt ggatctgcca actactccca ggttgcccac 60

attcccaaat cagatgcttt gtactttgat gactgcatgc agcttttggc gcagacattc 120

ccgtttgtag atgacaatga ggtttcttcg gctacgtttc agtcacttgt tcctgatatt 180

cccggtcaca tcgagagccc agtcttcatt gctactaatc aggctcagtc acctgaaact 240

tctgttgctc aggtagcccc tgttgattta gacggtatgc aacaggacat tgagcaagtt 300

tgggaggagc tattatccat tcctgagtta cagtgtctta atattgaaaa tgacaagctg 360

gttgagacta ccatggttcc aagtccagaa gccaaactga cagaagttga caattatcat 420

ttttactcat ctataccctc aatggaaaaa gaagtaggta actgtagtcc acattttctt 480

aatgcttttg aggattcctt cagcagcatc ctctccacag aagaccccaa ccagttgaca 540

gtgaactcat taaattcaga tgccacagtc aacacagatt ttggtgatga attttattct 600

gctttcatag ctgagcccag tatcagcaac agcatgccct cacctgctac tttaagccat 660

tcactctctg aacttctaaa tgggcccatt gatgtttctg atctatcact ttgcaaagct 720

ttcaaccaaa accaccctga aagcacagca gaattcaatg attctgactc cggcatttca 780

ctaaacacaa gtcccagtgt ggcatcacca gaacactcag tggaatcttc cagctatgga 840

gacacactac ttggcctcag tgattctgaa gtggaagagc tagatagtgc ccctggaagt 900

gtcaaacaga atggtcctaa aacaccagta cattcttctg gggatatggt acaacccttg 960

tcaccatctc aggggcagag cactcacgtg catgatgccc aatgtgagaa cacaccagag 1020

aaagaattgc ctgtaagtcc tggtcatcgg aaaaccccat tcacaaaaga caaacattca 1080

agccgcttgg aggctcatct cacaagagat gaacttaggg caaaagctct ccatatccca 1140

ttccctgtag aaaaaatcat taacctccct gttgttgact tcaacgaaat gatgtccaaa 1200

gagcagttca atgaagctca acttgcatta attcgggata tacgtaggag gggtaagaat 1260

aaagtggctg ctcagaattg cagaaaaaga aaactggaaa atatagtaga actagagcaa 1320

gatttagatc atttgaaaga tgaaaaagaa aaattgctca aagaaaaagg agaaaatgac 1380

aaaagccttc acctactgaa aaaacaactc agcaccttat atctcgaagt tttcagcatg 1440

ctacgtgatg aagatggaaa accttattct cctagtgaat actccctgca gcaaacaaga 1500

gatggcaatg ttttccttgt tcccaaaagt aagaagccag atgttaagaa aaactag 1557

<210> 2

<211> 518

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Gln His Ile Gln Ser Glu Thr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Ser

1 5 10 15

Gln Val Ala His Ile Pro Lys Ser Asp Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Cys

20 25 30

Met Gln Leu Leu Ala Gln Thr Phe Pro Phe Val Asp Asp Asn Glu Val

35 40 45

Ser Ser Ala Thr Phe Gln Ser Leu Val Pro Asp Ile Pro Gly His Ile

50 55 60

Glu Ser Pro Val Phe Ile Ala Thr Asn Gln Ala Gln Ser Pro Glu Thr

65 70 75 80

Ser Val Ala Gln Val Ala Pro Val Asp Leu Asp Gly Met Gln Gln Asp

85 90 95

Ile Glu Gln Val Trp Glu Glu Leu Leu Ser Ile Pro Glu Leu Gln Cys

100 105 110

Leu Asn Ile Glu Asn Asp Lys Leu Val Glu Thr Thr Met Val Pro Ser

115 120 125

Pro Glu Ala Lys Leu Thr Glu Val Asp Asn Tyr His Phe Tyr Ser Ser

130 135 140

Ile Pro Ser Met Glu Lys Glu Val Gly Asn Cys Ser Pro His Phe Leu

145 150 155 160

Asn Ala Phe Glu Asp Ser Phe Ser Ser Ile Leu Ser Thr Glu Asp Pro

165 170 175

Asn Gln Leu Thr Val Asn Ser Leu Asn Ser Asp Ala Thr Val Asn Thr

180 185 190

Asp Phe Gly Asp Glu Phe Tyr Ser Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ser Ile

195 200 205

Ser Asn Ser Met Pro Ser Pro Ala Thr Leu Ser His Ser Leu Ser Glu

210 215 220

Leu Leu Asn Gly Pro Ile Asp Val Ser Asp Leu Ser Leu Cys Lys Ala

225 230 235 240

Phe Asn Gln Asn His Pro Glu Ser Thr Ala Glu Phe Asn Asp Ser Asp

245 250 255

Ser Gly Ile Ser Leu Asn Thr Ser Pro Ser Val Ala Ser Pro Glu His

260 265 270

Ser Val Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asp Thr Leu Leu Gly Leu Ser Asp

275 280 285

Ser Glu Val Glu Glu Leu Asp Ser Ala Pro Gly Ser Val Lys Gln Asn

290 295 300

Gly Pro Lys Thr Pro Val His Ser Ser Gly Asp Met Val Gln Pro Leu

305 310 315 320

Ser Pro Ser Gln Gly Gln Ser Thr His Val His Asp Ala Gln Cys Glu

325 330 335

Asn Thr Pro Glu Lys Glu Leu Pro Val Ser Pro Gly His Arg Lys Thr

340 345 350

Pro Phe Thr Lys Asp Lys His Ser Ser Arg Leu Glu Ala His Leu Thr

355 360 365

Arg Asp Glu Leu Arg Ala Lys Ala Leu His Ile Pro Phe Pro Val Glu

370 375 380

Lys Ile Ile Asn Leu Pro Val Val Asp Phe Asn Glu Met Met Ser Lys

385 390 395 400

Glu Gln Phe Asn Glu Ala Gln Leu Ala Leu Ile Arg Asp Ile Arg Arg

405 410 415

Arg Gly Lys Asn Lys Val Ala Ala Gln Asn Cys Arg Lys Arg Lys Leu

420 425 430

Glu Asn Ile Val Glu Leu Glu Gln Asp Leu Asp His Leu Lys Asp Glu

435 440 445

Lys Glu Lys Leu Leu Lys Glu Lys Gly Glu Asn Asp Lys Ser Leu His

450 455 460

Leu Leu Lys Lys Gln Leu Ser Thr Leu Tyr Leu Glu Val Phe Ser Met

465 470 475 480

Leu Arg Asp Glu Asp Gly Lys Pro Tyr Ser Pro Ser Glu Tyr Ser Leu

485 490 495

Gln Gln Thr Arg Asp Gly Asn Val Phe Leu Val Pro Lys Ser Lys Lys

500 505 510

Pro Asp Val Lys Lys Asn

515 518

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

<210> 4

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgcgtggaa ttcgctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgt caatagggac 180

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360

agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420

gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480

caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 540

ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 600

atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc 660

agc 663

<210> 5

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gattcgaatc ccggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc caagagtgac 60

gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acaaaaaatg ctttcttctt ttaatatact 120

tttttgttta tcttatttct aatactttcc ctaatctctt tctttcaggg caataatgat 180

acaatgtatc atgcctcttt gcaccattct aaagaataac agtgataatt tctgggttaa 240

ggcaatagca atatttctgc atataaatat ttctgcatat aaattgtaac tgatgtaaga 300

ggtttcatat tgctaatagc agctacaatc cagctaccat tctgctttta ttttatggtt 360

gggataaggc tggattattc tgagtccaag ctaggccctt ttgctaatca tgttcatacc 420

tcttatcttc ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc tgtgtgctgg cccatcactt 480

tggcaaagaa ttg 493

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcgattgaa ttccccgggg atcctctaga gtcgacctgc agaagcttgc ctcgagcagc 60

gctgctcgag agatct 76

<210> 7

<211> 479

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 9

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840

tcactgatta agcattggta a 861

<210> 10

<211> 4654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 300

tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 540

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 600

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 660

gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 720

taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 780

acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840

cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc 900

tataggccca caaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 960

atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 1020

caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080

tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 1140

gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200

gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 1260

cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tgggattcga 1320

acatcgattg aattccccgg ggatcctcta gagtcgacct gcagaagctt gcctcgagca 1380

gcgctgctcg agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg 1440

ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca 1500

ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca 1560

aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga 1620

gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc 1680

tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt 1740

tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat 1800

ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg 1860

ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga 1920

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1980

gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2040

gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 2100

ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 2160

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 2220

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 2280

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 2340

cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 2400

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 2460

aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 2520

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 2580

acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 2640

cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 2700

tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 2760

ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 2820

ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2880

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2940

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 3000

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 3060

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 3120

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 3180

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 3240

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 3300

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 3360

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 3420

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 3480

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 3540

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 3600

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 3660

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 3720

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3780

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3840

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3900

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3960

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4020

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4080

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4140

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4200

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4260

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4320

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4380

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4440

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4500

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 4560

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 4620

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgt 4654

<210> 11

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 60

gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 120

aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 180

cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 240

acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 300

tattgg 306

<210> 12

<211> 6175

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 300

tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 540

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 600

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 660

gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 720

taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 780

acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840

cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc 900

tataggccca caaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 960

atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 1020

caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080

tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 1140

gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200

gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 1260

cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tgggattcga 1320

acatcgattg aattccacca tgatggccca gcacatccag tcagaaacca gtggatctgc 1380

caactactcc caggttgccc acattcccaa atcagatgct ttgtactttg atgactgcat 1440

gcagcttttg gcgcagacat tcccgtttgt agatgacaat gaggtttctt cggctacgtt 1500

tcagtcactt gttcctgata ttcccggtca catcgagagc ccagtcttca ttgctactaa 1560

tcaggctcag tcacctgaaa cttctgttgc tcaggtagcc cctgttgatt tagacggtat 1620

gcaacaggac attgagcaag tttgggagga gctattatcc attcctgagt tacagtgtct 1680

taatattgaa aatgacaagc tggttgagac taccatggtt ccaagtccag aagccaaact 1740

gacagaagtt gacaattatc atttttactc atctataccc tcaatggaaa aagaagtagg 1800

taactgtagt ccacattttc ttaatgcttt tgaggattcc ttcagcagca tcctctccac 1860

agaagacccc aaccagttga cagtgaactc attaaattca gatgccacag tcaacacaga 1920

ttttggtgat gaattttatt ctgctttcat agctgagccc agtatcagca acagcatgcc 1980

ctcacctgct actttaagcc attcactctc tgaacttcta aatgggccca ttgatgtttc 2040

tgatctatca ctttgcaaag ctttcaacca aaaccaccct gaaagcacag cagaattcaa 2100

tgattctgac tccggcattt cactaaacac aagtcccagt gtggcatcac cagaacactc 2160

agtggaatct tccagctatg gagacacact acttggcctc agtgattctg aagtggaaga 2220

gctagatagt gcccctggaa gtgtcaaaca gaatggtcct aaaacaccag tacattcttc 2280

tggggatatg gtacaaccct tgtcaccatc tcaggggcag agcactcacg tgcatgatgc 2340

ccaatgtgag aacacaccag agaaagaatt gcctgtaagt cctggtcatc ggaaaacccc 2400

attcacaaaa gacaaacatt caagccgctt ggaggctcat ctcacaagag atgaacttag 2460

ggcaaaagct ctccatatcc cattccctgt agaaaaaatc attaacctcc ctgttgttga 2520

cttcaacgaa atgatgtcca aagagcagtt caatgaagct caacttgcat taattcggga 2580

tatacgtagg aggggtaaga ataaagtggc tgctcagaat tgcagaaaaa gaaaactgga 2640

aaatatagta gaactagagc aagatttaga tcatttgaaa gatgaaaaag aaaaattgct 2700

caaagaaaaa ggagaaaatg acaaaagcct tcacctactg aaaaaacaac tcagcacctt 2760

atatctcgaa gttttcagca tgctacgtga tgaagatgga aaaccttatt ctcctagtga 2820

atactccctg cagcaaacaa gagatggcaa tgttttcctt gttcccaaaa gtaagaagcc 2880

agatgttaag aaaaactagc agcgctgctc gagagatcta cgggtggcat ccctgtgacc 2940

cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc 3000

taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat attatggggt 3060

ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg 3120

tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca atctccgcct 3180

cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca 3240

tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc atattggcca 3300

ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg 3360

gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttct gattttgtag gtaaccacgt 3420

gcggaccgag cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 3480

tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 3540

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 3600

ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 3660

tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 3720

gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 3780

ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 3840

cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 3900

tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 3960

ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 4020

ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 4080

tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 4140

gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 4200

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 4260

cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 4320

tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 4380

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 4440

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 4500

attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 4560

gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 4620

ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 4680

cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 4740

gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 4800

tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 4860

gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 4920

ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 4980

tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 5040

gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 5100

caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 5160

cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 5220

atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 5280

gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 5340

attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 5400

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 5460

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 5520

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 5580

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 5640

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 5700

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 5760

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 5820

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 5880

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 5940

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 6000

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 6060

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 6120

agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 6175

<210> 13

<211> 1818

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

atgatggact tggagctgcc gccgccggga ctcccgtccc agcaggacat ggatttgatt 60

gacatacttt ggaggcaaga tatagatctt ggagtaagtc gagaagtatt tgacttcagt 120

cagcgacgga aagagtatga gctggaaaaa cagaaaaaac ttgaaaagga aagacaagaa 180

caactccaaa aggagcaaga gaaagccttt ttcgctcagt tacaactaga tgaagagaca 240

ggtgaatttc tcccaattca gccagcccag cacatccagt cagaaaccag tggatctgcc 300

aactactccc aggttgccca cattcccaaa tcagatgctt tgtactttga tgactgcatg 360

cagcttttgg cgcagacatt cccgtttgta gatgacaatg aggtttcttc ggctacgttt 420

cagtcacttg ttcctgatat tcccggtcac atcgagagcc cagtcttcat tgctactaat 480

caggctcagt cacctgaaac ttctgttgct caggtagccc ctgttgattt agacggtatg 540

caacaggaca ttgagcaagt ttgggaggag ctattatcca ttcctgagtt acagtgtctt 600

aatattgaaa atgacaagct ggttgagact accatggttc caagtccaga agccaaactg 660

acagaagttg acaattatca tttttactca tctataccct caatggaaaa agaagtaggt 720

aactgtagtc cacattttct taatgctttt gaggattcct tcagcagcat cctctccaca 780

gaagacccca accagttgac agtgaactca ttaaattcag atgccacagt caacacagat 840

tttggtgatg aattttattc tgctttcata gctgagccca gtatcagcaa cagcatgccc 900

tcacctgcta ctttaagcca ttcactctct gaacttctaa atgggcccat tgatgtttct 960

gatctatcac tttgcaaagc tttcaaccaa aaccaccctg aaagcacagc agaattcaat 1020

gattctgact ccggcatttc actaaacaca agtcccagtg tggcatcacc agaacactca 1080

gtggaatctt ccagctatgg agacacacta cttggcctca gtgattctga agtggaagag 1140

ctagatagtg cccctggaag tgtcaaacag aatggtccta aaacaccagt acattcttct 1200

ggggatatgg tacaaccctt gtcaccatct caggggcaga gcactcacgt gcatgatgcc 1260

caatgtgaga acacaccaga gaaagaattg cctgtaagtc ctggtcatcg gaaaacccca 1320

ttcacaaaag acaaacattc aagccgcttg gaggctcatc tcacaagaga tgaacttagg 1380

gcaaaagctc tccatatccc attccctgta gaaaaaatca ttaacctccc tgttgttgac 1440

ttcaacgaaa tgatgtccaa agagcagttc aatgaagctc aacttgcatt aattcgggat 1500

atacgtagga ggggtaagaa taaagtggct gctcagaatt gcagaaaaag aaaactggaa 1560

aatatagtag aactagagca agatttagat catttgaaag atgaaaaaga aaaattgctc 1620

aaagaaaaag gagaaaatga caaaagcctt cacctactga aaaaacaact cagcacctta 1680

tatctcgaag ttttcagcat gctacgtgat gaagatggaa aaccttattc tcctagtgaa 1740

tactccctgc agcaaacaag agatggcaat gttttccttg ttcccaaaag taagaagcca 1800

gatgttaaga aaaactag 1818

Claims

1.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的重组腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列，Nrf2(CA)蛋白的序列如SEQ IDNO:2所示。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述增强子/启动子为CMV。

4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒为单链AAV2。

5.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列、β-globin内含子、hGHpA、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。

6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述表达Nrf2(CA)蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示，L-ITR序列如SEQ ID NO:3所示，CMV增强子/启动子序列如SEQ ID NO:4所示，β-globin内含子序列如SEQ ID NO:5所示，hGHpA序列如SEQ ID NO:7所示，R-ITR序列如SEQ ID NO:8所示，Ampicillin序列如SEQ ID NO:9所示，f1ori序列如SEQID NO:11所示。

7.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体序列如SEQ ID NO:12所示。

8.权利要求1-7任一所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括下述步骤：

9.一种治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-7任一所述的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体，所述的药物组合物表达Nrf2(CA)蛋白。

10.权利要求1-7任一所述的重组腺相关病毒载体在制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性药物中的应用。