KR102662049B1 - 암 치료용 보체 불활성화 내성의 외피 바이러스 - Google Patents

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Abstract

재조합 융합 단백질이 개시된다. 융합 단백질은 (a) CD55 펩타이드 서열, (b) 상기 CD55 서열 C-말단의 링커 서열, (c) 상기 링커 서열 C-말단의 막관통 도메인, 및 (d) 상기 막관통 도메인 C-말단의 세포내 도메인을 포함한다. 상기 융합 단백질은 GPI 앵커를 함유하지 않는다. 융합 단백질은 N-말단 분비 신호 펩타이드를 이용하여 발현될 수 있으며, 그것은 절단되어 세포주 또는 외피 바이러스의 표면 상에 성숙한 단백질을 산출한다. 융합 단백질을 발현하는 종양 살상 바이러스는 보체 불활성화에 내성을 가지며 암 치료에 사용될 수 있다.

Description

암 치료용 보체 불활성화 내성의 외피 바이러스
본 발명은 암 치료용 보체 불활성화 내성의 외피 바이러스에 관한 것이다. 부록 C/ST.25 텍스트 파일의 형태로 전자적으로 제출된 서열 목록과 관련 파일 참조 21003-PCT는 본 발명의 일부이다.
종양살상 바이러스(oncolytic virus)는 종양 세포를 감염시키고 파괴시킴으로써 암을 치료하는 작용제로서 시험되어 왔다. 이러한 종양 살상 바이러스에는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 우두 바이러스(Vaccinia virus), 헤르페스 바이러스(Herpes virus) 등이 포함된다. 뉴캐슬병 바이러스(NDV)는, 종양 세포에서의 우선적 복제(preferential replication)와 종양 세포의 용해의 그 독특한 특성 때문에 암 환자에서 종양을 수축시키는데 큰 잠재력을 나타내었고, 이것은 아마도 대부분의 종양 세포가 결핍된 인터페론 경로를 갖는다는 사실 때문일 것이다(Pecora et al., 2002; Laurie et al., 2006; Lorence et al., 2007). 예비적인 유망한 임상 결과에도 불구하고, 암 치료제로서의 NDV는 단점이 있다: 필연적으로 NDV 입자의 대부분은 일단 바이러스가 환자의 몸에 들어가면 환자의 내재된 면역계인, 대체 보체 경로(alternative complement pathway)에 의해 파괴될 것이다.
보체 경로는 내재되고 적응된 면역 체계이다(reviewed by Volanakis, J.E., 1998. Chapter 2. In The Human Complement System in Health and Disease. Edited by J. E. Volanakis, and M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32). 보체는 미생물 살상과, 면역 복합체의 수송과 제거에 중요한 역할을 한다. 보체 시스템의 많은 활성화 생성물은 또한 전염증성(proinflammatory) 또는 면역조절 기능과 관련이 있다. 보체 시스템은 3개의 효소-활성화 케스케이드(cascade)로 구성된 혈장 및 막-관련 단백질로 구성된다: 고전(classical) 경로, 렉틴 경로, 대체 경로. 3개 경로 모두 말단 보체 복합체/막 공격 복합체(TCC/MAC) 및 생물학적 활성 생성물의 배열을 형성할 수 있다.
인간의 세포와 기관은 상동 보체-매개 용해(homologous complement-mediated lysis)에서 그들을 보호하기 위해 막-결합 보체 조절 단백질의 군을 갖는다. 이러한 보체 조절 단백질은 CD55(붕괴 촉진 인자(decay-accelerating factor), DAF), CD46(막 공인자 단백질(membrane cofactor protein), MCP), CD35 (보체 수용체 1, CR1) 및 CD59 (반응성 용해의 막 억제제)를 포함한다(Carroll et al. Rey-Campos et al., 1988; Lublin et al., 1989; Morgan et al., 1994; Kim and Song, 2006).
CD55는 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol, GPI)-고정 단백질로, 그것의 C-말단의 당지질 모이어티(GPI 앵커)을 통해 세포 플라스마 막에 부착한다. CD55와 같은 GPI 고정 단백질은 세포 플라스마 막으로부터 흡수되거나(endocytosed) 분해되거나 절단되어 방출될 수 있다(Censullo and Davitz, 1994a, 1994b, Turner 1994). 예를 들어, CD55를 포함한 GPI-고정 단백질은 GPI-특이적 포스포리파아제 C 및 D의 작용에 의해 세포 표면으로부터 방출될 수 있다(Turner 1994). 이러한 효소 활성은 GPI-고정 단백질의 분해대사(catabolism)를 제어하고 이들 단백질의 세포 표면 발현을 조절할 가능성이 있다(Censullo and Davitz, 1994b).
본 발명은 다음의 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질은 GPI를 함유하지 않는다: (a) CD55 펩타이드 서열; (b) 상기 CD55 서열 C-말단 측의 링커 서열; (c) 상기 링커 서열 C-말단 측의 막관통 도메인; 및 (d) 상기 막관통 도메인 C-말단 측의 세포내 도메인(intracellular domain). 본 발명은 또한 상기 단백질을 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 상기 단백질을 발현하는 세포, 바이러스 막에 상기 단백질을 포함하는 외피 바이러스, 본 발명의 단백질 포함 바이러스를 포함하는 약학적 조성물, 및 치료 방법 및 상기 바이러스의 용도를 제공한다.
본 발명은, 본 발명에 따른 융합 단백질을 발현하는 바이러스가, 융합 단백질을 발현하지 않는 바이러스와 비교하여 더 높은 회수율에 의해 입증되는 바와 같이, 정상 인간 혈청에 의한 불활성화에 대한 내성을 갖는다는 발견에 부분적으로 기초한다. 바이러스 막 상에 재조합 융합 단백질의 형태로 보체 억제제를 혼입시킨 본 발명의 조작된 세포에 의해 생성된 종양 살상 외피 바이러스는 보다 우수한 암 치료제이며, 바이러스 막 상에 보체 억제제가 결핍된 상응하는 바이러스와 비교하여 암 환자에 대한 더 나은 임상 결과를 제공하는데, 이것은 그것이 종양에 들어가기 전에 인간 혈청 순환(human serum circulation)에서의 생존 능력 때문이다. 그 이점은 다음의 세 가지 측면이 있다. 1) 종양 살상 바이러스는 바이오 리액터(bio-reactor)의 세포 배양 시스템에서 생산될 수 있다. 2) 닭 계란에서 생산된 부모 종양 살상 바이러스와 비교하여 동일한 치료 효능을 얻기 위해 필요한 바이러스 입자가 더 적다. 3) 암 환자에게 바이러스 입자를 적게 주입하여 사이토 카인 폭풍이나 불순물 관련 효과와 같은 다량의 바이러스 입자와 관련된 부작용을 줄일 수 있다.
뉴캐슬병 바이러스(NDV)의 보호에 대한 보체 조절 단백질 CD55의 효과를 연구한 다른 사람들(Biswas et al., 2012; Rangaswamy et al., 2016)은 천연(native)의 비변형된 CD55를 사용하였고, 이것은 글리코실포스파티딜-이노시톨(glycosylphosphatidyl-inositol, GPI) 앵커를 포함한다. 대조적으로, 본 발명의 융합 단백질은 GPI 앵커를 생략한다. 이론에 얽매이지 않고서, GPI 앵커를 생략하면 세포 표면의 CD55의 대사 동역학이 변화된다고 여겨진다. 본 발명의 융합 단백질은 비스워즈(Biswas) 및 랑가스워미(Rangaswamy)에 의해 사용된 것보다 더 엄격한 불활성화 조건을 견딜 수 있었다. 불활성화 분석에서 비스워즈(Biswas)는 5 ~ 10% 정상 인간 혈청을 사용했으며 랑가스워미(Rangaswamy)는 0.3 ~ 5% 정상 인간 혈청을 사용했다. 아래의 예는 재조합 융합 단백질이 도입된 NDV에서 불활성화 분석을 수행하기 위해 40% 정상 인간 혈청을 사용했다.
도 1. 분비 신호 펩타이드, CD55의 4개의 짧은 컨센서스 반복 단위(SCR), 플렉서블 링커, CD8 막관통 도메인 및 잘린(truncated) CD8 세포내 도메인, 이어서 IRES-네오 선택적 마커 및 합성 폴리아데닐화 신호(poly A)으로 이루어진 재조합 보체 억제 융합 단백질을 인코딩하는 포유동물 세포 발현 구조 맵 서열.
도 2. 조작된 DF1 세포막 또는 변형된 NDV 멤브레인 상의 성숙한 보체 억제 융합 단백질의 방향성을 설명하는 도면.
도 3. 재조합 보체 억제 융합 단백질의 세포 표면 발현. CD55 특이적 항체에 의한 융합 단백질 발현을 위한 유동세포 분석법. 왼쪽의 막대 그래프는 음성 대조군으로서 생(naive) DF1 세포를 나타낸다. 오른쪽 막대 그래프는 서열번호 2를 안정하게 발현하는 DF1 세포(세포 클론 번호 8)를 나타낸다.
도 4. 종양 세포주에서 보체 억제 융합 단백질과 결합된 조작된 DF1 세포(클론 번호 8)에 의해 생성된 NDV의 세포 독성 분석.
도 5. 분비 신호 펩타이드, CD55의 4개의 짧은 컨센서스 반복 단위(SCR), 플렉서블 링커, CD8 막관통 도메인 및 잘린 CD8 세포 내 도메인으로 구성된 재조합 보체 억제 융합 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2).
이중선(=)은 분비 신호 펩타이드를 가리킨다.
일반 형태는 CD55의 SCR을 가리킨다.
밑줄(-)은 (G4S1)3 링커를 가리킨다.
볼드는 CD8 막관통 도메인을 가리킨다.
이태리체는 잘린 CD8 세포내 도메인을 가리킨다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 임의의 CD55 펩타이드 서열이 서열 (a)에 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, CD55 펩타이드 서열은 인간 CD55 펩타이드 서열이다. CD55 펩타이드 서열은 바람직하게는 CD55의 4 개의 짧은 컨센서스 반복 단위(SCR)를 포함한다. 임의의 플렉서블 링커가 서열 (b)에 이용될 수 있고, 예를 들어 당해 분야에서 공지된 종래의 플렉스블 링커이다. 일 실시형태에서에서, G4S1 링커가 이용되고, 바람직하게는 (G4S1)3 링커이다. 임의의 막관통 도메인은 서열 (c)에 이용될 수 있고, 예를 들어 당해 분야에서 공지된 통상의 막관통 도메인이다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이다. 임의의 세포내 도메인은 서열 (d)에 이용될 수 있고, 예를 들어 종래 세포내 도메인이다. 일 실시형태에서에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이고, 바람직하게는 잘린 CD8 막관통 도메인이다.
본 발명의 융합 단백질은 서열 (a)의 N- 말단 쪽에 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법에 따르면, 융합 단백질은 초기에 신호 펩티드를 이용하여 발현된다. 신호 펩타이드는 새로 합성된 융합 단백질을 소포체(ER)로 유도하는데, 신호 펩티드는 신호 펩티다제에 의해 절단된다. 서열번호 2는 N-말단 신호 펩타이드를 갖는 본 발명의 예시적인 융합 단백질이다. 서열번호 3은 N-말단 신호 펩타이드를 갖지 않는 본 발명의 예시적인 융합 단백질이다.
본 발명의 융합 단백질에 따라, N-말단 신호 펩타이드와 서열 (a) 사이, 서열 (a)와 서열 (b) 사이, 서열 (b)와 서열 (c) 사이, 서열 (c)와 서열 (d) 사이, 그것들 중 임의의 2개 사이, 그것들 중 임의의 3개 사이, 또는 그것들 중 4개 모두 사이에 하나 이상의 아미노산의 스페이서가 선택적으로 존재할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, N-말단 신호 펩타이드와 서열 (a) 사이에 스페이서가 없거나, 즉 N-말단 신호 펩타이드는 단일 펩타이드 결합에 의해 서열 (a)에 공유 결합된다. 또 다른 실시형태에서, N-말단 신호 펩타이드와 서열 (a) 사이에는 스페이서가 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 서열 (a)와 서열 (b) 사이에는 스페이서가 없거나, 즉 단일 펩타이드 결합에 의해 서열 (a)가 서열 (b)에 공유 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 서열 (a)와 서열 (b) 사이에는 스페이서가 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 서열 (b)와 서열 (c) 사이에는 스페이서가 없거나, 즉 단일 펩타이드 결합에 의해 서열 (b)가 서열 (c)에 공유 결합된다. 또 다른 실시형태에서 서열 (b)와 서열 (c) 사이에는 스페이서가 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 서열 (c)와 서열 (d) 사이에는 스페이서가 없거나, 즉 단일 펩타이드 결합에 의해 서열 (c)가 서열 (d)에 공유 결합된다. 또 다른 실시형태에서 서열 (c)와 서열 (d) 사이에는 스페이서가 있다. 원칙적으로 스페이서의 크기에는 제한이 없다.
CD55는 4개의 세포외(extracelluar) 짧은 컨센서스 반복 단위(SCR), Ser/Thr/Pro(STP)-풍부 영역 및 GPI-고정 도메인을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질에 따르면, GPI-고정 도메인은 생략된다. STP-풍부 도메인은 존재할 수도 있고 없을 수도 있다. 본 발명의 융합 단백질 코딩 서열의 일 실시형태는 제3 펩타이드 서열 코딩 서열 C-말단 쪽에 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)를 추가로 포함한다. 폴리아데닐화 신호(Poly A)는 임의의 PolyA일 수 있다.
본 발명은 상기 기술된 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 그것은 신호 펩타이드를 코딩하는 서열과 서열 (a) 사이, 서열 (a)와 서열 (b) 사이, 서열 (b)와 서열 (c) 사이, 서열 (c)와 서열 (d) 사이 또는 다른 곳에, 하나 이상의 인트론을 선택적으로 함유할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 핵산은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 갖는 단백질을 인코딩한다. 서열번호 1은 서열번호 2의 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산의 일례이다. 상이한 핵산 코돈 트리플렛(triplets)이, 유전자 코딩의 퇴행(degeneracy)으로 알려진 관계인, 동일한 아미노산을 코딩하기 때문에, 서열번호 2의 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 많은 다른 핵산 서열이 쉽게 구상될 수 있고 본 발명에 포함된다.
본 발명의 실시형태는 제어 서열, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전술한 핵산을 포함하는 발현 벡터이다. 융합 단백질을 구동하는 프로모터는 임의의 프로모터일 수 있으며, CMV 프로모터에 한정되지 않는다. 프로모터와 융합 단백질 코딩 서열(fusion protein coding sequence) 사이에 인트론이 존재할 때, 임의의 적절한 종래의 인트론이 이용될 수 있다. 예를 들어 β-글로빈 인트론이 적절하다.
본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 세포 표면에 안정적으로 발현하는 세포주를 제공한다. 단백질 발현을 위한 임의의 종래 세포주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, 세포주는 비 포유동물 세포주, 예를 들어 DF-1 닭 배아 섬유아세포 세포주이다.
본 발명은 상기 기술된 융합 단백질을 바이러스 막에 도입한 외피 바이러스를 제공한다. 본 발명에 따라 임의의 외피 바이러스가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 바이러스는 종양 살상 바이러스, 예를 들어 뉴캐슬병 바이러스(NDV)와 같은 파라믹소 바이러스(paramyxovirus)이다. 실시예에서, 재조합 융합 단백질 형태의 보체 억제제를 NDV 입자 외피 상에 혼입시켰다. 본 발명의 재조합 융합 단백질은 NDV 이외의 종양 살상 바이러스에 사용될 수 있으며, 이는 숙주 보체 불활성화에 보다 내성을 갖는 종양 살상 바이러스 입자의 생성을 유도한다. 융합 단백질 형태의 신규 한 재조합 보체 억제제는 종양 살상 바이러스를 생성하기 위해 HeLa 세포와 같은 임의의 다른 포유동물 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다. 종양 살상 바이러스는 국제공개특허 제WO2000/062735호에 기재되어 있으며, 그 내용은 참조로 포함된다. 아래에 그 결과가 제시된 실험에서 사용된 NDV는 제WO2000/062735호에 기술된 PPMK107이었다.
바이러스는 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명은 포유동물 대상에서 종양 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 종양 질환을 치료하는데 유효량의 상기 기술된 바이러스를 대상에 투여하는 것을 포함한다. 암 치료를 위해, 바이러스는 임의의 통상적인 경로를 통해 환자에게 투여될 수 있는데, 예를 들어 하나 이상의 종양 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 종양 내 투여의 경우, 용량 범위는 1x107 내지 5x1012 pfu/종양일 수 있다. 정맥 내 투여의 경우, 용량 범위는 1x107 내지 1x1013 pfu/m2 일 수있다( 'Pfu'는 '플라크 형성 단위'의 약자이다).
본 발명에 따른 종양 살상 바이러스는 또한 종양 살상 바이러스의 효능을 향상시키기 위해 GMCSF와 같은 다른 분자가 혼입되도록 조작될 수 있다. 또한, 종양 살상 바이러스는 항-PD1 또는 항-PDL1 분자와 같은 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)와 함께 병용 암 치료법의 일부가 될 수 있다. 또한, 종양 살상 바이러스는 다른 화학 요법제와 함께 병용 암 치료법의 일부가 될 수 있다. 화학 요법제는 캄토테신 화합물, 예를 들어, 이리노테칸 또는 토포테칸일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 여기에 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함된다. 또한, 상기 언급된 간행물, 특허 및 특허 출원 중 어느 하나와 함께 발행된 보충 정보(supplemental information)가 참조로 포함된다. 예를 들어, 일부 저널 기사는 온라인에서 일반적으로 제공되는 보충 정보와 함께 공개된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조함으로써 더 잘 이해 될 것이며, 하기 실시 예는 본원에 기술된 본 발명을 예시하지만 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1:
분비 신호 펩타이드의 하류에서 CD55의 4 개의 짧은 컨센서스 반복 단위(SCR), 다음으로 플렉서블 링커(3xG4S1) 및 CD8 막관통 및 잘린 CD8 세포내 도메인을 갖는 재조합 CD55의 변형된 형태가 제조되었다(도 1). 코딩 서열은 재조합 단백질 발현을 구동하는 합성 인트론인 CMV 프로모터를 갖는 포유동물 발현 구조물 내로 클로닝되었다. 발현 카세트는 또한 IRES의 하류에 약물 선택적 마커인 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 함유하였다. 유전자 발현 카세트는 합성 폴리아데닐화 신호로 끝났다. 서열번호 1은 포유동물 세포 발현 구조물의 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 2는 발현된 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 닭 배아 섬유아세포 DF1 세포 표면에서 발현되거나 바이러스 막 상에 혼입될 때, 신호 펩타이드는 절단되어 성숙한 재조합 융합 단백질(서열번호 3)을 산출하며, 이는 CD55 SCR이 세포 외부 또는 바이러스 멤브레인 상에 있도록 구성/방향성을 갖고, 세포 또는 바이러스 막에 인접한 플렉서블 링커는 CD55의 SCR이 생물학적 기능을 발휘할 수 있도록, 즉 보체 경로의 중심 조절제인 C3 전환효소(convertase)를 불능화시키도록, 최대한의 유연성을 제공해야 한다. 플렉서블 링커 다음에는 CD8 막관통 도메인과 잘린 CD8 세포내 도메인이 있다.
실시예 2:
포유류 발현 구조물을 PEI 25K(폴리에틸렌이민, 선형 25 kDa, Polysciences, Cat. No. 23966) 매개 형질 감염(transfection)을 통해 닭 배아 섬유아세포 DF1 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 72 시간 후, 형질감염된 세포를 300㎍/mL G418 (Geneticin®, 아미노글리코시드 항생제(aminoglycoside antibiotic))에서 선택하여, 서열번호 2를 본질적으로 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다. 성숙한 인간 CD55에 특이적인 단일 클론 항체(R & D Systems, Catalog No. MAB20091)에 의해 검출된 바와 같이, 안정한 세포주는 그의 세포 표면 상에 서열번호 3을 본질적으로 발현했다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 재조합 융합 단백질은 유동 세포 분석법에 의해 분석된 재조합 융합 단백질을 인코딩하는 구조물로 안정하게 형질감염된 DF1 세포 상에 발현되었다(도 3, 오른쪽 막대 그래프). 생(naive) DF1 세포는 음성 대조군으로 사용되었다(도 3, 왼쪽 막대 그래프).
실시예 3:
세포 표면에 서열번호 3을 발현하는 안정한 세포주를 부화(embryonated) 닭 계란에서 생산된 야생형 NDV로 감염시켰다. 이어서 바이러스는 인간 종양 세포주 HT1080에서 적정되었다. 동등한 양의 바이러스(PFU로 측정)를 각각 40% 정상 인간 혈청(NHS) 및 40% 열-불활성화 정상 인간 혈청(iNHS)로 배양시켰다. 이어서 인간 혈청과 함께 배양한 후에도 살아있는 바이러스를 플라크 분석법으로 HT1080 세포에 대해 기록했다. NHS 대 iNHS의 배양 후 회수된 바이러스의 비율을 계산하였다. 표 1에서 볼 수 있듯이, 부화 닭 계란에서 생산된 바이러스의 회수율은 0.5%였고, 닭 계란에서 생산된 NDV 입자의 대다수가 인간 대체 보체 경로에 의해 대부분 불활성화될 수 있었다. 마찬가지로, 부모 닭 배아 섬유아세포 DF1 세포에 의해 생성된 바이러스에 대한 회수율은 0.5%이었다. 놀랍게도, 세포 표면에서 서열번호 3을 안정하게 발현하는 벌크 비-클론 DF1 세포로부터 생성된 바이러스에 대한 회수율은 5.8%로서, 야생형 바이러스보다 10배 이상 높았다. 서열번호 3을 발현하는 DF1 세포의 총 11개의 클론 개체군을 조사한 결과, 회수율은 0.8% 내지 20%였고 5개의 클론은 낮은 회수율을 나타내고 6개의 클론은 벌크 비-클론 세포주보다 더 높은 회수율을 나타냈다(표 1). 클론 번호 8에 의해 생성된 바이러스는 10%의 회수율을 가졌으며, 이것은 부화 닭 계란 또는 부모 DF1 세포에 의해 생성된 바이러스보다 20배 더 높았다. 클론 번호 40에 의해 생성된 바이러스는 20%의 회수율을 가졌으며, 이것은 부화 닭 계란 또는 부모 DF1 세포에 의해 생성된 바이러스보다 40배 더 높았다. 이러한 데이터는 정상 인간 혈청에 존재하는 보체 활성이 부화 닭 계란 또는 부모 닭 배아 섬유아세포 DF1 세포에 의해 생성된 NDV 입자를 빠르게 파괴한다는 것을 강하게 시사한다. 그러나, 세포 표면에서 재조합 보체 억제제를 안정하게 발현시킨 DF-1 세포에 의해 생성된 새로운 NDV 입자는, 동일한 실험 조건 하에서 40% 정상 인간 혈청으로 배양한 후 닭 계란 또는 부모 DF1 세포에 의해 생성된 바이러스에 비해 최대 40배의 현저한 회수율을 보였다.
다음에서 생성된 종양 살상 NDV 인간 혈청으로 배양 후 회수율 %
부화 닭 계란 0.5
부모 DF1 세포 0.5
서열번호 3을 발현하는 비-클론 DF1세포 5.8
서열번호 3을 발현하는 클론 #1 DF1 4.3
서열번호 3을 발현하는 클론 #2 DF1 5.2
서열번호 3을 발현하는 클론 #3 DF1 0.8
서열번호 3을 발현하는 클론 #4 DF1 6.8
서열번호 3을 발현하는 클론 #5 DF1 3.6
서열번호 3을 발현하는 클론 #6 DF1 1.5
서열번호 3을 발현하는 클론 #7 DF1 7.1
서열번호 3을 발현하는 클론 #8 DF1 10.0
서열번호 3을 발현하는 클론 #10 DF1 6.1
서열번호 3을 발현하는 클론 #11 DF1 6.0
서열번호 3을 발현하는 클론 #40 DF1 20.0
실시예 4:
세포 표면에 보체 억제 융합 단백질을 안정하게 발현하는 DF1 세포로부터 생산된 NDV(클론 번호 8)의 광범위한 스펙트럼 종양 살상 활성을 CellTiter96® AQueous One Solution을 사용하여 평가하였다. 이 솔루션(solution)은 MTT(즉, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석법과 유사하고, 여기서 대사 활성 세포는 시약(reagent) 중의 MTS 테트라졸륨(즉, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨))을 용해성 발색성 포르마잔(soluble chromogenic formazan)으로 바이오-환원시킬 수 있다. 간략하게, 3개의 상이한 종양 세포주 HT1080(섬유육종), PANC-1(췌장 상피 암종) 및 OV-CAR3(난소 선암종)이 분리되어 96 웰 플레이트에서 성장하였다. 다음날, NDV 바이러스의 순차 희석물을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 5% CO2의 37℃ 인큐베이터에서 6일 동안 배양하였다. 6일째, 각 플레이트 상의 모든 웰의 흡광도를 분광 광도계를 사용하여 490 nm에서 측정하였다. IC50은 각 세포주에 대해 4가지 파라미터 로지스틱 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산하였다. 이것은 HT1080, OV-CAR-3 및 PANC-1 세포주 각각에 대해 255, 120 및 47 pfu/웰의 최종 IC50 값을 산출했다(도 4). 이러한 결과는 세포 표면에 재조합 보체 억제제를 안정하게 발현하는 DF-1 세포에 의해 생성된 NDV 입자가 다양한 종양 세포주를 용량 의존적으로 용해시키는 능력을 보유함을 나타낸다.
참고문헌
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agtaagagaa ttatgcagtg 5280 ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 5340 cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 5400 gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 5460 caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 5520 aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 5580 ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 5640 tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 5700 ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 5760 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 5820 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 5880 tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 5940 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 6000 taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 6060 gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 6120 acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 6180 ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 6240 ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 6300 cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 6360 aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 6420 gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 6480 gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 6540 gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atggctcgac 6600 agatct 6606 <210> 2 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(34) <223> Secretory signal peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (35)..(352) <223> SCR of CD55 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (353)..(367) <223> (G4S1)3 linker <220> <221> TRANSMEM <222> (368)..(388) <223> CD8 transmembrane domain <220> <221> DOMAIN <222> (389)..(399) <223> Truncated CD8 intracellular domain <400> 2 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val 20 25 30 Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala 35 40 45 Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys 50 55 60 Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile 65 70 75 80 Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg 85 90 95 Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro 100 105 110 Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys 145 150 155 160 Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val 165 170 175 Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr 180 185 190 Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly 195 200 205 Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg 225 230 235 240 Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly 245 250 255 Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp 260 265 270 Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu 275 280 285 Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val 290 295 300 Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr 305 310 315 320 Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr 325 330 335 Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr 340 345 350 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile 355 360 365 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 370 375 380 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val 385 390 395 <210> 3 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature fusion protein (after cleavage of signal peptide). <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(318) <223> SCR of CD55 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (319)..(333) <223> (G4S1)3 linker <220> <221> TRANSMEM <222> (334)..(354) <223> CD8 transmembrane domain <220> <221> DOMAIN <222> (355)..(365) <223> Trunated CD8 intracellular domain <400> 3 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val 20 25 30 Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala 35 40 45 Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys 50 55 60 Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile 65 70 75 80 Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg 85 90 95 Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro 100 105 110 Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys 145 150 155 160 Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val 165 170 175 Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr 180 185 190 Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly 195 200 205 Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg 225 230 235 240 Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly 245 250 255 Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp 260 265 270 Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu 275 280 285 Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val 290 295 300 Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr 305 310 315 320 Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr 325 330 335 Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr 340 345 350 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile 355 360 365 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 370 375 380 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val 385 390 395

Claims (34)

  1. 융합 단백질로서, (a) CD55의 4개의 짧은 컨센서스 반복 단위(SCR)를 포함하는 CD55 펩타이드 서열; (b) 상기 CD55 서열 C-말단 측의 (G4S1)3 링커 서열; (c) 상기 링커 서열의 C-말단 측의 CD8 막관통 도메인; 및 (d) 상기 막관통 도메인 C-말단 측의 CD8 세포내 도메인을 포함하고, 상기 융합 단백질은 GPI 앵커를 함유하지 않는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD55 펩타이드 서열은 인간 CD55 펩타이드 서열인, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 CD55 펩타이드 서열은 단일 펩타이드 결합에 의해 상기 (b)의 (G4S1)3 링커 서열과 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 CD55 펩타이드 서열은 스페이서에 의해 상기 (b)의 (G4S1)3 링커 서열과 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 (G4S1)3 링커 서열은 단일 펩타이드 결합에 의해 상기 (c)의 CD8 막관통 도메인과 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 (G4S1)3 링커 서열은 스페이서에 의해 상기 (c)의 CD8 막관통 도메인과 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c)의 CD8 막관통 도메인은 단일 펩타이드 결합에 의해 상기 (d)의 CD8 세포내 도메인과 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c)의 CD8 막관통 도메인은 스페이서에 의해 상기 (d)의 CD8 세포내 도메인과 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 (a)의 CD55 펩타이드 서열의 N-말단 쪽에 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 분비 신호 펩타이드는 CD55의 분비 신호 펩타이드인, 융합 단백질.
  11. 제9항에 있어서, 상기 분비 신호 펩타이드는 단일 펩타이드에 의해 상기 (a)의 CD55 펩타이드 서열에 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  12. 제9항에 있어서, 상기 분비 신호 펩타이드는 스페이서에 의해 상기 (a)의 CD55 펩타이드 서열에 공유 결합된 것인, 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질을 인코딩하는 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 DNA인, 핵산.
  17. 제16항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하고, 상기 인트론은 상기 (a)의 CD55 펩타이드 서열과 상기 (b)의 (G4S1)3 링커 서열 사이, 상기 (b)의 (G4S1)3 링커 서열과 상기 (c)의 CD8 막관통 도메인 사이, 또는 상기 (c)의 CD8 막관통 도메인과 상기 (d)의 CD8 세포내 도메인 사이에 위치하는, 핵산.
  18. 제15항에 있어서, 서열번호 2의 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는, 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 서열번호 1의 서열을 포함하는, 핵산.
  20. 제15항의 핵산을 포함하는 발현 벡터로서, 제어 서열과 작동적으로 링크된 것인, 발현 벡터.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질을 세포 표면에서 안정적으로 발현하는 세포주.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포주는 포유동물 세포주인, 세포주.
  23. 제21항에 있어서, 상기 세포주는 DF-1 닭 배아 섬유아세포 세포주인, 세포주.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질을 바이러스 막에 도입한 뉴캐슬병 바이러스.
  25. 제24항의 뉴캐슬병 바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 질환 치료용 약학적 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 포유동물 대상에서 종양 질환을 치료하기 위한 용도를 갖는 뉴캐슬병 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 상기 뉴캐슬병 바이러스는 대상의 종양 내 투여되는 것인, 뉴캐슬병 바이러스.
  28. 제26항에 있어서, 상기 뉴캐슬병 바이러스는 대상의 정맥 내 투여되는 것인, 뉴캐슬병 바이러스.

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