KR20240003051A

KR20240003051A - Cd55 및 cd59를 동시 발현하는 항암 바이러스

Info

Publication number: KR20240003051A
Application number: KR1020220080056A
Authority: KR
Inventors: 오근희; 이남희; 이송이
Original assignee: 신라젠(주)
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2024-01-08
Also published as: WO2024005250A1

Abstract

본 발명은 보체 조절 단백질인 CD55 및 CD59를 동시 발현하는 항암 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 항암 바이러스는 정맥 주사 시에도 효능이 유지되므로, 표재성 고형암 외 다양한 고형암종과 전이암의 치료에도 적용이 가능하다. 또한, 본 발명의 항암 바이러스는 보체 조절 단백질을 바이러스 표면에 발현함으로써 체내 보체 시스템의 공격에 대한 저항성을 획득하여 혈액 내에서 안정하며, 정맥 주사 시 안정적인 항암 활성을 유지하므로, 상기 바이러스의 투여량을 감소시켜 항암제 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항암 바이러스는 암 예방 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CD55 및 CD59를 동시 발현하는 항암 바이러스 {Oncolytic Virus co-expressing CD55 and CD59}

본 발명은 보체 조절 단백질인 CD55 및 CD59를 동시 발현하는 항암 바이러스에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 주요 사망요인이 되고 있으며, 개인적, 사회적으로 막대한 부담을 지움에 따라 혁신적인 항암 치료제 개발에 대한 중요성은 날로 높아지고 있으며, 이에 따라 분자생물학적 발전에 따른 다양한 접근이 시도되고 있는 실정이다.

최근 각광받고 있는 항암 치료제인 항암바이러스(Oncolytic virus)는 복제가 가능하고 감염력이 있는 바이러스로서 야생형(Wild-type) 혹은 약독화된 바이러스에 특정 유전자를 삽입하여 암 치료에 사용하는 바이러스이다. 이러한 유전자 조작된 항암바이러스는 바이러스의 복제 후 세포 용해와 함께 조직을 통해 확산되며, 바이러스의 확산은 암세포와 암세포 주변 혈관 내에서 선택적으로 일어난다. 대표적인 항암 바이러스로는 2015년 10월 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)로부터 흑색종(Melanoma) 치료제로 승인을 받은 미국 암젠(Amgen)의 임리직(lmlygic, talimogene laherparepvec)이 있다.

한편, 의약품의 정맥 주사는 경구투여가 불가능한 약물을 전신으로 빠르게 전달하기에 용이한 방법이고, 투약이 간편하여 가장 선호되는 형태의 투약법 중 하나이다. 그러나 항암 바이러스 제제는 정맥주사시 체내 면역 체계에 의해 빠르게 제거되기 때문에, 정맥주사를 통해 투여하면 그 효능이 떨어진다는 한계가 있다. 따라서 항암 바이러스 제제는 바이러스가 종양에 도달하는 확률을 높이기 위해 정맥 주사가 아닌 표적 종양으로 직접 주사하는 방식이 일반적으로 사용되고 있다.

종양 내 주사 방식은 흑색종, 유방암, 두경부암 등 접근이 용이한 표재성 암에서 대체로 유효하게 적용될 수 있으나, 심부 고형암과 같은 암종에서는 유효 용량의 투여가 시술자인 의사의 기술적 역량에 의존적이라는 단점이 있으며, 종양 내 주사는 시술과정이 매우 침습적이기 때문에 반복 치료 방법으로 사용하기에는 정맥 주사에 비해 용이하지 않다.

정맥 주사의 장점에도 불구하고, 항암 바이러스가 정맥 주사 형태로 투여되기 어려운 이유는 혈액 내로 투여된 외래물질(즉, 바이러스)이 인체의 방어 기전에 의하여 점진적으로 제거되어 항암 바이러스의 활성이 감소되기 때문이다. 즉, 바이러스가 혈관을 타고 체내를 이동하는 경우 인체는 이를 적으로 인식하고 선천 면역을 활성화시켜 중화·제거하게 된다.

인체가 외부에서 침입한 세균이나 바이러스에 노출되면 선천 면역 시스템(innate immune system)의 최전방에 있는 방어 기전인 보체 시스템(complement system)이 가장 먼저 작용한다. 보체(complement)는 혈액 내 존재하는 단백질로, 외래 미생물의 표면을 둘러싸 대식세포나 호중구의 식균작용을 용이하게 만드는 역할을 한다. 구체적으로, 혈액 내로 바이러스가 침투하는 경우, 먼저 바이러스 표면의 단백질이 보체와 결합하여 서로 응집(Aggregation)하고 보체가 활성화된다. 활성화된 보체들은 바이러스 표면을 둘러싸서 식세포의 탐식작용을 용이하게 하고(옵소닌 작용, Opsonization), 바이러스 표면에 구멍을 뚫어 바이러스를 용해(lysis)시킨다. 이렇게 용해된 바이러스 잔해들은 대식세포의 포식작용(phagocytosis)에 의해 완전히 제거된다.

인체는 과도한 보체시스템의 활성화로 인한 주변 정상세포의 손상을 방어하기 위해, CD55, CD46, CD59 등의 보체 조절 단백질을 세포 표면에 발현하여 과도한 보체의 작용을 조절한다.

숙주세포 내에서 증식된 항암 바이러스의 일부(약 5 내지 20%)는 감염된 세포의 세포막에 둘러싸인 방식으로 생산되는 '세포외피막 바이러스'(Extracellular Enveloped Virus, EEV) 형태를 띄는 특징이 있다. 이러한 EEV는 보체의 활성화를 피해서 혈중 생존 기간이 긴 것으로 알려져 있고, 그 기전은 바이러스가 싸고 나온 숙주세포의 세포막에 발현하는 CD55, CD46, CD59 등의 보체조절 단백질에 의한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 생산된 항암 백시니아 바이러스는 대부분'세포내성숙 바이러스'(Intracellular Mature Virus, IMV)의 형태이며 이는 표면에 보체조절 단백질을 발현하지 않아 보체에 의해 활성이 크게 감소하게 된다. 이로 인해, 항암 바이러스의 정맥주사 시 항암 활성 개선을 위한 연구개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0088917호

본 발명의 목적은 신규한 항암 바이러스를 제공하는 것으로, 구체적으로, CD55 및 CD59를 동시 발현하는 항암 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD55 및 CD59를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 발현을 위해 프로모터와 작동가능하게 연결된, 항암 바이러스에 삽입을 위한 유전자 구조체(construct)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 CD55 및 CD59를 동시 발현하는 항암 바이러스를 제공한다.

특히, 본 발명에서는, 일 예로, 이러한 항암 바이러스 자체의 막단백질에 있는 세포막관통도메인(transmembrane domain)을 CD55 유전자와 연결하고, 항암 바이러스 자체의 막단백질을 CD59 유전자와 연결하여 CD55 및 CD59 단백질이 '세포내성숙 바이러스'(IMV) 표면에 발현하도록 하였으며, 이를 통해 인체의 보체시스템으로부터 저항력을 가지고 정맥주사 시 안정적인 항암 활성을 유지할 뿐만 아니라, 항암 바이러스 투여량을 감소시켜 치료 부작용을 최소화하도록 하였다.

본 발명의 용어 "항암 바이러스(Oncolytic vaccinia virus)"는 "종양용해성 바이러스"로 언급될 수 있으며, 이는 내재 유전자의 전부 또는 일부 결실, 외래 유전자의 도입을 통하여 엔지니어링된 "재조합 바이러스"를 포함한다. 이러한 항암 바이러스는 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스, 레트로 바이러스, 레오 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 콕사키 바이러스, 엔테로 바이러스 또는 헤르페스 바이러스 등 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항암 바이러스는 티미딘 키나제 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "티미딘 키나제(TK, thymidine kinase)"는 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소이다. 상기 TK 유전자에 의해 코딩된 티미딘 키나제는 ATP의 감마(γ) 위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 바이러스 DNA를 구성하는 뉴클레오티드들을 만들 수 있다. 상기 TK는 GenBank: AAR17937.1 또는 AY313847.1 등의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 TK 또는 이의 유전자는 GenBank: AAR17937.1의 아미노산 서열 또는 GenBank: AY313847.1의 염기 서열로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 TK 또는 이의 유전자는 GenBank: AAR17937.1의 아미노산 서열 또는 GenBank: AY313847.1의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 용어 "보체 조절 단백질"은 보체활성화경로를 생체 내에서 교묘하게 조절하는 단백질이다. 혈청형(수용성) 조절단백질군과 막결합성 조절단백질군으로 대별한다. 혈청형으로는 C4b결합 단백질, H인자, SGP120, 프로페르딘(P) 등이 있고 막형으로는 CRI(CD35), CR2(CD21), CR3(CD11b/CD18), CR4(CD11c/CD18), DAF(CD55), 막보도인자단백질(MCP, CD46), CD59가 있다. 이 중에서 P만은 보체활성을 강하게 하는 방향으로 작용하지만 다른 것은 감약시키는 방향으로 작용한다. 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스에 포함되는 상기 보체 조절 단백질은 CD35, CD21, CD18, CD55, CD46, 또는 CD59일 수 있고, 구체적으로 CD55 및/또는 CD59일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 CD55의 유전자는 Genbank: NM_000574.3의 염기서열로 구성되거나 상기 서열의 일부일 수 있으며, 상기 CD55의 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_000574.3의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 CD55는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 CD59의 유전자는 Genbank: NM_203331.3의 염기서열로 구성되거나 상기 염기 서열의 일부일 수 있으며, 상기 CD59의 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_203331.3의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 CD59는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "세포막 관통 도메인(transmembrane domain)"은 막관통영역 또는 막횡단영역으로도 불리며, 막단백질(membrane protein)의 지질이중막(lipid bilayer)을 관통하여 횡단하는 영역을 말한다.

본 발명에 따른 항암 바이러스는 항암 바이러스 막단백질 또는 이의 세포막 관통 도메인을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 일 예로, 상기 CD55 및/또는 CD59는 세포막 관통 도메인을 코딩하는 유전자와 독립적으로 별개로 발현될 수도 있고, 연결된 융합(fusion)형태로 조작되어 발현될 수 있다.

본 발명에 있어서, 일 예로, 상기 항암 바이러스 막단백질을 코딩하는 유전자는 CD59를 코딩하는 유전자와 링커를 통해 연결될 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 링커는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 (G4S)₃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 백시니아 바이러스의 막단백질은 H3L, A27L, D8L, A16L, F9L, G9R, L1R, A9L, A13L, A21L, A28L, E10R, G3L, H2R, I2L, J5L, L5R 또는 O3L일 수 있고, 상기 막단백질 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것일 수 있으며, 일 예시로 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

막 단백질	구분	서열	서열번호
H3L	아미노산	LFDINVIGLIVILFIMFMLIFNVKSKLLWFLTGTFVTAFI	9
H3L	DNA	ttgtttgatattaatgttataggtttgattgtaattttgtttattatgtttatgctcatctttaacgttaaatctaagctgttatggttccttacaggaacattcgttaccgcatttatc	10
A27L	아미노산	MDGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKKPEAKREAIVKADEDDNEETLKQRLTNLEKKITNVTTKFEQIEKCCKRNDEVLFRLENHAETLRAAMIS LAKKIDVQTGRRPYE	11
A27L	DNA	atggacggaactcttttccccggagatgacgatcttgcaattccagcaactgaatttttttctacaaaggctgctaaaaagccagaggctaaacgcgaagcaattgttaaagccg atgaagacgacaatgaggaaactctcaaacaacggctaactaatttggaaaaaaagattactaatgtaacaacaaagtttgaacaaatagaaaagtgttgtaaacgcaacga tgaagttctatttaggttggaaaatcacgctgaaactctaagagcggctatgatatctctggctaaaaagattgatgttcagactggacggcgtccatatgag	12
D8L	아미노산	FAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN	13
D8L	DNA	ttcgcaattattgccatagtattcgtgtttatacttaccgctattctcttttttatgagtcgacgatattcgcgagaaaaacaaaac	14
A16L	아미노산	LGAAITLVVISVIFYFISIYSRPKIKTNDINVRRR	15
A16L	DNA	ttgggcgcggccataacattggttgtaatatctgttattttctattttatatctatttattcgcgtactaaaattaaaacaaatgatataaatgttcgtagacga	16
F9L	아미노산	PWFLVGVAIILVIFTVAICSIRRNLALKYRYGTFLYV	17
F9L	DNA	ccgtggtttctagtgggtgtagcaattattctagttatttttactgtagctatttgttctattagacgaaatctggctcttaaatacagatacggaacgtttttatacgtt	18
G9R	아미노산	LKLHLISLLSLLVIWILIVAI	19
G9R	DNA	ctaaaattgcatttgatcagtttattatctctcttggtaatatggatactaattgtagctatt	20
L1R	아미노산	VQFYMIVIGVIILAALFMYYAKRMLFTSTNDKIKLILANKENVHWTTYMDTFFRTSPMVIATTDMQN	21
L1R	DNA	gttcagttttatatgattgttatcggtgttataatattggcagcgttgtttatgtactatgccaagcgtatgttgttcacatccaccaatgataaaatcaaacttattttagccaataaggaaaacgtccattggactacttacatggacacattctttagaacttctccgatggttattgctaccacggatatgcaaaac	22
A9L	아미노산	FVVVRAIASMIMYLVLGIALL	23
A9L	DNA	ttcgtcgttgttagagccattgcgagcatgataatgtatttagtattaggtatagcattgctg	24
A13L	아미노산	MIGILLLIGICVAVTVAILYA	25
A13L	DNA	atgattggtattcttttgttgatcggtatttgcgtagcagttaccgtcgccatcctatatgcg	26
A21L	아미노산	MITLFLILCYFILIFNIIVPA	27
A21L	DNA	atgataactttatttttaatcctatgttatttcattcttatttttaatattatagtacctgca	28
A28L	아미노산	MNSLSIFFIVVATAAVCLLFI	29
A28L	DNA	atgaactctctatcaattttttttattgtggtagcgacggctgcggtgtgtttactttttatc	30
E10R	아미노산	AVWTIIFIVLSQAGLDG	31
E10R	DNA	gccgtatggaccattatttttatagtactttcgcaagcgggtttagacggc	32
G3L	아미노산	MASLLYLILFLLFVCISYYFT	33
G3L	DNA	atggcatctttattatatcttattttatttttgttattcgtatgtatttcttattattttaca	34
H2R	아미노산	TSTLIFFVIILAISALLLWFQ	35
H2R	DNA	acatcaacacttatattctttgttattatattggcaattagtgcgctattactctggtttcag	36
I2L	아미노산	YWLIIIFFIVLILLLLIYLYL	37
I2L	DNA	tattggttaattattattttttttatagttcttattctactactattgatatatttgtattta	38
J5L	아미노산	IIDIKWLPIGLLALAILILAF	39
J5L	DNA	attatagatatcaaatggcttccgattggattactagcgttagctattttaatattagcattt	40
L5R	아미노산	IVLFEVFVVFILIYVFFRSEL	41
L5R	DNA	atagttttatttgaagtattcgttgtattcattctaatatatgtattttttagatctgaatta	42
O3L	아미노산	LVVIMFFIAFAFCSWLSYSYL	43
O3L	DNA	ctcgtcgtaattatgttttttatagcgtttgccttctgtagttggctatcatatagctatctg	44

이때, CD55 및/또는 CD59와 항암 바이러스 단백질 또는 이의 세포막 관통 도메인은 유전자 조작 과정을 통해 전부 또는 일부의 유전자를 포함하도록 설계될 수 있다. 구체적으로, 항암 바이러스 중, 백시니아 바이러스 막단백질의 세포막 관통 도메인은 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19또는 서열번호 21의 아미노산 서열 또는 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 22의 염기 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전자의 발현 억제 또는 유전자 불활성화란, 유전자 일부 또는 전부의 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입됨으로써, 유전자가 발현되지 않거나, 유전자의 일부만 발현되어 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 나타나지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자를 결실시키거나, 외래 유전자를 삽입하는 방법은 통상의 기술분야에서 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, Methods described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hiliar O Kangro (1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son (1998), Chapter 16에 개시되어 있는 외래 유전자를 삽입하는 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 티미딘 키나제 유전자의 발현이 억제되는 것은 티미딘 키나제 J2R 영역의 일부 또는 전부에 외래 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 T-Blunt^TM PCR Cloning Kit (Solgent, Korea Cat No. SOT01-K020)를 이용하여 외래 유전자를 삽입하였다.

본 발명의 항암 바이러스에 포함된 CD55 및/또는 CD59는 각각　후기(late)-초기(early) VACV p7.5 프로모터, 백시니아 합성 초기-후기 프로모터(pSEL), 백시니아 합성 후기 프로모터(pSL), 백시니아 변형된 H5(mH5) 프로모터, 백시니아 짧은 합성 초기-후기 pS 프로모터, pLEO160 프로모터, pLEO38 프로모터, pLate 프로모터, pC11R 프로모터, pF11L 프로모터, psFJ1-10 합성 초기 프로모터, pHyb 합성 초기 프로모터, 임의의 천연 백시니아 초기 프로모터, 또는 후기-초기 최적화된 (LEO) 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예시로, 상기 보체 조절 단백질 CD55또는 CD59는 pLEO160 또는 pLEO38 프로모터 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 CD55는 서열번호 5의 pLEO160 프로모터, 상기 CD59는 서열번호 6의 pLEO38의 제어 하에 발현될 수 있다.

본 발명의 항암 바이러스는 암 치료 효능을 상승시킬 수 있는 유전자를 더 포함할 수 있다. 이러한 유전자에 제한됨은 없으나, 예를 들어, 항암 치료 유전자, 각종 면역 조절인자, 종양 내 섬유질 등 구조물 분해인자 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, CCL3, CCL5, CXCR4, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 인터루킨 과작용제(interleukin superagonist; IL-2 superagonist, IL-15 superagonist), TGF-β차단제(blockade), TLR-2 작용제(agonist), TLR-3 작용제, TLR-7 작용제, STAT-3 저해제(inhibitor), PTENα, p53, p63, p73, 아데노신 디아미나제-2(adenosine deaminase-2), 암-특이적 항원(cancer-specific antigen), 암-연관 항원(cancer-associated antigen), 히알루로니다제(Hyaluronidase), 콜라게나제(Collagenase), 프로테아제(Protease) 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 항암 바이러스는, 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스, 레트로 바이러스, 레오 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 콕사키 바이러스, 엔테로 바이러스, 헤르페스 바이러스 등을 포함하고, 일 예로, 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), 와이어쓰 (Wyeth), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 스트레인(strain)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 용어 "암(또는 종양)"은 원발암 또는 전이암을 구분하지 않고, 모두를 포함한다. 본 발명에서 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 신장암, 골육종, 육종, 연골육종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 혈액암은 림프종, 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "전이암"은 암 세포가 원발 장기를 떠나 다른 장기로 이동하여 증식되어 발생된 암을 의미한다. 상기 전이암은 원발암에서 암 조직이 성장하여 직접적으로 주위 장기를 침습하는 것, 그리고 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격 전이를 하는 것을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 통해 암의 발명을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 용어 "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써 암이 호전 또는 완화되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 항암 바이러스를 포함하는 약학적 조성물의 구체적인 투여량은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 통상의 기술자에 의해 다양하게 선택될 수 있으며, 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 10⁵　내지 약 10¹³　pfu(플라크 형성 단위)의　항암 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 투여 경로에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

본 발명의 약학적 조성물은 종양내, 혈관내, 근육내 또는 복강내로 투여용일 수 있으며, 일 예로 정맥 또는 동맥 투여용일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 동맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예로, 본 발명의 항암 바이러스는 인체의 보체시스템으로부터 저항력을 가지고 정맥주사 시 안정적인 항암 활성을 유지할 뿐만 아니라, 항암 바이러스 투여량을 감소시켜 치료 효능을 극대화하므로, 정맥 투여로도 충분한 치료 효능을 나타낼 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 CD55 및 CD59를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 발현을 위해 프로모터와 작동가능하게 연결된, 항암 바이러스에 삽입을 위한 유전자 구조체(construct) 및 이를 함유하는 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조체 (또는 유전자 작제물)은 항암 바이러스의 불활성화된 티미딘 키나제 유전자 영역에 삽입을 위한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 불활성화된 티미딘 키나제 유전자 영역은 티미딘 키나제 유전자의 전부 또는 일부가 결실된 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조체는 항암 바이러스 내 J1R 영역 및 J3R 영역 사이에 위치하는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조체는 도 1에 예시된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 유전자의 발현 조절을 위한 다양한 프로모터, 조절 서열을 작동가능하게 연결된 형태로 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "세포막 관통 도메인", "CD55"및 "CD59"는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 상기 유전자 구조체는 백시니아 바이러스의 티미딘 키나제의 전부 또는 일부에 삽입을 위한 것이며, 구체적으로, 티미딘 키나제 J2R 영역의 전부 또는 일부에 삽입하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

상기 항암보조제는 항암제의 항암효과를 증대시키거나 항암제의 부작용을 억제 또는 개선시키기 위한 모든 형태를 의미한다. 본 발명의 항암보조제는 다양한 종류의 항암제 또는 항암보조제와 병용투여될 수 있으며, 병용투여시 통상적인 항암제의 투여량보다 낮은 수준으로 항암제를 투여하더라도 동등한 수준의 항암치료효과를 나타낼 수 있으므로 보다 안전한 항암치료를 수행할 수 있다.

상기 항암보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항암보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 항암보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 항암보조제는 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 항암보조제로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 항암치료 보조제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항암보조제는 비경구 투여를 위한 제제일 수 있으며, 제제에 대한 설명은 상기 약학적 조성물의 제제에 대한 기재로 대신한다.

또한, 본 기술분야에 개시된 항암 보조제라면 크게 제한없이 본 발명에 적용가능하다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 항암제는 화학치료제, 생물학적 치료제, 방사선치료 요법, 면역치료요법, 호르몬 치료제, 항-혈관 치료제, 냉동치료제, 독소 치료제 중 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "암", "예방" 및 "치료"는 전술한 바와 같다.

상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 구체적으로 인간, 소, 양, 염소, 말, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회 또는 1일 수회일 수 있으며, 적절한 주기로 반복하여 투여될 수 있다.

상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 개체에게 10⁵　내지 약 10¹³　pfu(플라크 형성 단위)를 투여하는 것일 수 있고, 상기 범위 사이의 다양한 수치 또는 범위를 포함할 수 있다.

본 발명의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 경구 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여할 수 있으며 경우에 따라, 목적에 따라 다른 경로로도 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 암 치료 방법은 종래 알려진 항암제 및 항암 요법과의 병용 투여를 통한 치료 방법을 포함한다.

본 발명의 항암 바이러스는 정맥 주사 시에도 효능이 유지되므로, 표재성 고형암 외 다양한 고형암종, 혈액암 및 전이암의 치료에도 적용이 가능하다. 또한, 본 발명의 항암 바이러스는 보체 조절 단백질을 발현함으로써 체내 보체 시스템으로부터 저항성을 가지고 특히나 정맥 주사 시 안정적인 항암 활성을 유지하므로, 상기 바이러스의 투여량을 감소시켜 항암제 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항암 바이러스는 암의 예방 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TK 유전자가 결실되고, 보체 조절 단백질 CD55 및 CD59가 도입된 본 발명의 항암 바이러스인 재조합 백시니아 바이러스를 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(SJ-640)가 CD55 및 CD59를 발현하는지 여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(SJ-640)로 감염시킨 골육종 세포에서 CD55가 발현되는지 여부를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(SJ-640)로 감염시킨 골육종 세포에서 CD59가 발현되는지 여부를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 5는 투과전자현미경을 이용하여 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(SJ-640)에서의 CD55 및 CD59 발현을 확인한 결과이다.
도 6은 20% active human serum에서 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스(SJ-640)의 혈청 내 안정성을 확인한 결과이다.
도 7은 MDA-MB-231 유방암 이종이식모델에서 SJ-640의 항종양 효능을 종양 부피 변화를 통해 확인한 결과이다.
도 8은 MDA-MB-231 유방암 이종이식모델에 SJ-610 및 SJ-640 투여 후 기간 경과에 따른 몸무게 변화를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 인간 CD55 및 인간 CD59 유전자가 삽입된 벡터를 제작하였으며, 상기 벡터와 백시니아 바이러스의 상동 재조합에 의해 상기 유전자들의 발현이 유도된 재조합 벡시니아 바이러스를 제조하여 항암 물질로써의 특징을 확인하였다.

제조예 : TK가 결실되고 CD55 및 CD59를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640의 제조

도 1에 나타난 바와 같이, 백시니아 바이러스 중 와이어쓰 균주에 티미딘 키나제 영역 중 J2R 영역을 완전히 결실시키고, 이 자리에 CD55와 CD59를 삽입하였다. 또한, 상기 CD55를 바이러스의 외피막에 발현시키기 위하여, hCD55의 GPI anchor 영역을 삭제한 유전자와 백시니아 바이러스 막단백질의 세포막 관통도메인을 융합시켰으며, 발현을 위한 프로모터는 pLEO160을 사용하였다. 아울러, 상기 CD59를 바이러스 외피막에 발현시키기 위하여, hCD59의 GPI anchor 영역을 삭제한 유전자와 백시니아 바이러스 막단백질을 링커를 이용하여 연결시켰으며, 발현을 위한 프로모터는 pLEO38을 사용하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다.

1. hCD55 및 hCD59 유전자의 발현이 유도된 플라스미드 벡터 제작

백시니아 바이러스 J2R 영역을 결실시키기 위하여 T-blunt^TM 벡터 (Solgent)에 J2R 영역 좌우 flanking 영역인 J1R과 J3R 유전자를 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit (NEW ENGLAND BioLabs, Catalog No. E2621)로 클로닝하였다. J1R과 J3R DNA는 JX-594(Pexastimogene Devacirepvec, Pexa-Vec, 펙사벡)의 해당 위치를 PCR 증폭하여 사용하였다. 상기 J1R은 백시니아 바이러스 Acambis2000 균주의 J1R(Protein id=AAR17936.1)의 아미노산 1 내지 154 위치 영역과 동일하나 이중 아미노산 118번이 알라닌(Alanine)에서 세린(Serine)으로 치환되어 있다. J3R(Protein id=AAR17938.1)은 아미노산 1 내지 145 위치 영역이다. 이 벡터에 다시 pLEO160 프로모터로 발현하는 보체 조절 단백질 hCD55 유전자(GenBank: NM_000574.3), 백시니아 바이러스 막단백질 H3L의 세포막 관통 도메인 영역, pLE038 프로모터로 발현하는 보체 조절 단백질 hCD59 유전자(Genbank: NM_203331.3), 상기 hCD59와 백시니아 바이러스 막단백질을 연결하는 (G4S)₃링커(서열번호 8) 및 백시니아 바이러스 막단백질 A27L을 암호화하는 유전자를 클로닝하여 shuttle vector를 완성하였다. 사용한 hCD55의 아미노산 서열 및 염기서열을 각각 서열번호 1 및 2에 나타내었으며, hCD59의 아미노산 서열 및 염기서열을 각각 서열번호 3 및 4에 나타내었다.

hCD55는 pCMV3 플라스미드에 클로닝된(Sinobio, Catalog No. HG10101-UT) 벡터에서 PCR 증폭하였다. hCD55(GenBank: NM_000574.3)는 전체 아미노산 서열 중 GPI anchor 영역을 삭제한, 아미노산 1 내지 352 위치 영역을 사용하였으며 발현을 위한 프로모터는 pLEO160 (ttttattttttttttttggaatataaatatccggtaaaattgaaaaaatatacactaattagcgtctcgtttcagacgctagccggtaccccgggttcgaaatcgataagcttggatccggagagctcccaacctcgaggaattcggtaccccgggttcgaaatcgataagcttggatccggagagctcccaacctcgagctagctcgag, 서열번호 5, Macrogen에 합성 의뢰)이다. hCD55 유전자의 3'end는 백시니아 바이러스 H3L의 세포막관통도메인 영역과 연결하여 CD55가 바이러스의 외피막에 발현하도록 하였으며, 사용한 H3L의 세포막 관통 도메인 영역에 대한 정보 및 염기서열은 표 2 및 표 3에 나타내었다.

바이러스	막 단백질	세포막 관통 도메인 영역
바이러스	막 단백질	위치	transmembrane	intravirion
SJ-640	H3L	279-318	279-299	300-318

막 단백질		서열	서열번호
H3L	아미노산	LFDINVIGLIVILFIMFMLIFNVKSKLLWFLTGTFVTAFI	서열번호 9
H3L	DNA	ttgtttgatattaatgttataggtttgattgtaattttgtttattatgtttatgctcatctttaacgttaaatctaagctgttatggttccttacaggaacattcgttaccgcatttatc	서열번호 10

hCD59는 사람 자궁경부암 세포 HeLa의 cDNA에서 PCR 증폭하였다. hCD59(GenBank: NM_203331.3)는 전체 아미노산 서열 중 GPI anchor 영역을 삭제한, 아미노산 1 내지 101 위치 영역을 사용하였으며 발현을 위한 프로모터는 pLEO38(ttttattttttttttttggaatataaatatccggtaaaattgaaaaaatatacactaattagcgtctcgtttcagacgctagctcgag, 서열번호 6, Macrogen에 합성의뢰)이다. hCD59 유전자의 3'end는 백시니아 바이러스 A27L을 암호화하는 유전자와 (G4S)₃링커로 연결하여 CD59가 바이러스의 외피막에 발현하도록 하였으며, 사용한 A27L 및 링커의 서열은 표 4에 나타내었다.

구분		서열	서열번호
A27L	아미노산	MDGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKKPEAKREAIVKADEDDNEETLKQRLTNLEKKITNVTTKFEQIEKCCKRNDEVLFRLENHAETLRAAMIS LAKKIDVQTGRRPYE	서열번호 11
A27L	DNA	atggacggaactcttttccccggagatgacgatcttgcaattccagcaactgaatttttttctacaaaggctgctaaaaagccagaggctaaacgcgaagcaattgttaaagccg atgaagacgacaatgaggaaactctcaaacaacggctaactaatttggaaaaaaagattactaatgtaacaacaaagtttgaacaaatagaaaagtgttgtaaacgcaacga tgaagttctatttaggttggaaaatcacgctgaaactctaagagcggctatgatatctctggctaaaaagattgatgttcagactggacggcgtccatatgag	서열번호 12
(G4S)₃	아미노산	GGGGSGGGGSGGGGS	서열번호 7
(G4S)₃	DNA	ggtggtggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg	서열번호 8

2. 상동 재조합에 의한 SJ-640 재조합 백시니아 바이러스 제조

SJ-640 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 와이어쓰 균주와 앞서 제작된 hCD55 및 hCD59 유전자의 발현이 유도된 플라스미드 벡터를 상동 재조합 방식으로 재조합하여 제조하였다.

야생형 와이어쓰 균주는 JX-594 (Pexastimogene Devacirepvec, Pexa-Vec, 펙사벡)의 불활성화된 J2R 영역(TK 영역)에 백시니아 바이러스 웨스턴리저브(Western Reserve, WR) 균주(ATCC, Catalog No. VR-1354)의 J2R 영역유전자를 삽입하여 준비하였다. 웨스턴리저브 균주의 J2R(Protein id = YP_232976.1)은 아미노산 1 내지 178 위치영역이다. 웨스턴리저브 균주의 J2R 영역 유전자는 PCR로 증폭하였고 이 PCR product와 JX-594를 상동 재조합하여 야생형 와이어쓰 균주를 완성하였다.

SJ-640을 재조합하기 위하여 143B 골육종 세포(Creative Bioarray)에 상기 야생형 와이어쓰 균주를 감염시키고 hCD55와 hCD59를 발현하는 플라스미드 벡터를 형질주입하였다. TK 영역이 결실된 재조합 바이러스 SJ-640 플라크를 선별하기 위하여 143B 골육종 세포에 백시니아 바이러스 감염 및 플라스미드 벡터를 형질주입한 세포 용해물을 TK 결실 선별 시약 5-Bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)을 처리하여 배양하였다. 선별된 재조합 바이러스 플라크는 다시 143B 세포에서 2회 추가 계대 배양하여 정제된 단일 클론 SJ-640을 얻었다. SJ-640의 재조합 부위의 염기서열은 시퀀싱을 통하여 최종 확인하였다.

실시예 1: SJ-640의 CD55 및 CD59 발현 확인

상기 제조예에서 제조한 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640을 용해하여 웨스턴 블랏 기법으로 단백질 발현을 확인하였다. CD55 및 CD59를 발현하지 않는 바이러스(JX-594)를 대조군으로 사용하였다.

구체적으로 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640을 HeLa 세포에 약 26 시간 동안 감염시켜 증식시키고 감염된 세포를 원심분리하여 배양액을 제거한 후 세포 용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물에는 Benzonase를 처리하여 세포 유래의 DNA를 제거하고 Cellulose Acetate 필터로 여과하여 세포 부산물을 제거하였다. 여과액은 36% sucrose cushion 원심분리법을 사용하여 농축하였다.

정제된 바이러스에 존재하는 단백질을 분리하기 위하여 원심분리한 바이러스 침전물을 RIPA lysis buffer(Thermo scientific, Catalog No. 89900)로 용해하고 단백질의 양을 BCA protein assay(Thermo scientific, Catalog No. 23227)로 정량하였다. 각 바이러스에서 얻은 단백질은 loading buffer(Biosesang, Catalog No. S2002)에 희석하여 lane 당 2.5ug 혹은 5ug을 loading하도록 준비하고 SDS-PAGE gel(BIO-RAD, Catalog No. 4561083)에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동한 gel은 다시 Nitrocellulose membrane(BIO-RAD, Catalog No. 1704270)에 transfer하였다. Membrane은 목적하는 단백질의 검출을 위하여 5% skim milk(Difco, Catalog No. 232100)로 1시간 동안 blocking하고 항 hCD55 항체(SantaCruz, Catalog No. sc-51733), 항 hCD59 항체(SantaCruz, Catalog No. sc-133171)와 4℃에서 overnight하여 처리하였다. 다음 날 membrane을 1X TBST로 3-4회 세척하고 HRP와 결합한 2차 항체를 처리한 후 hydrogen peroxide와 luminol substrate를 처리하고 화학발광을 검출기로 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, SJ-640에서 CD55(약 70 내지 75 kDa) 및 CD59(약 35 kDa)가 발현됨을 확인하였다.

아울러, 상기 제조예에서 제조한 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640으로 골육종 세포인 U-2 OS를 감염시키고, 10시간 후 면역형광염색법으로 CD55 및 CD59의 발현 여부를 각각 확인하였다. Negative control로 TK가 결실되고 CD55 및 CD 59를 발현하지 않는 SJ-610을 사용하였다.

구체적으로 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640 혹은 음성 대조군 SJ-610을 U-2 OS에 감염시키고 감염 10시간째 바이러스에 감염된 세포를 4% paraformaldehye로 고정시켰다. 고정한 감염 세포는 다시 0.1% Triton X-100을 처리하여 세포막을 투과시키고 3% Bovine Serum Albumin을 처리하여 blocking하였다. 목적하는 단백질의 면역형광염색을 위하여 항 hCD55 항체 (invitrogen, Catalog No. MA1-82066), 항 hCD59 항체(invitrogen, Catalog No. MA1-19133), 항 vaccinia virus A27 항체(abcam, Catalog No. ab35219) 와 4℃에서 overnight하여 처리하였다. 다음 날 1차 항체를 PBS로 세척하고 각 1차 항체과 결합하는 AlexaFluor488 혹은 AlexaFluor594와 결합한 2차 항체와 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 처리하고 감염된 세포에서 발현하는 백시니아 바이러스 A27 단백질, CD55, CD59, 그리고 DAPI의 발현을 공초점 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, SJ-640 바이러스로 감염된 세포에서 CD55가 발현됨을 확인하였으며, 도 4에 나타낸 바와 같이, SJ-640 바이러스로 감염된 세포에서 CD59가 발현됨을 확인하였다. 대조군으로 사용한 SJ-610에서는 CD55와 CD59의 발현이 관찰되지 않았다.

또한 상기 제조예에서 제조한 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640에 CD55 또는 CD59에 특이적인 항체를 binding시킨 후 면역금표지 (immunogold labeling)하여 CD55와 CD59의 존재 여부, 발현 위치와 분포를 관찰하였다.

이를 위하여 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640을 HeLa 세포에 약 28-30 시간 동안 감염시켜 증식시키고 감염된 세포를 원심분리하여 배양액을 제거한 후 세포 용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물에는 Benzonase를 처리하여 세포 유래의 DNA를 제거하고 Cellulose Acetate 필터로 여과하여 세포 부산물을 제거하였다. 여과액은 36% sucrose cushion 원심분리법을 사용하여 농축하였다. 농축한 바이러스는 이온교환 크로마토그래피 membrane에 통과시켜 바이러스만 흡착하고 불순물을 제거한 후 바이러스를 용출하여 최종 정제하였다.

정제한 바이러스는 nickel grid에 흡착시키고 3% Bovine Serum Albumin으로 blocking하였다. 목적하는 단백질과 결합하는 항 hCD55 항체 (SantaCruz, Catalog No. sc-51733) 혹은 항 hCD59 항체(invitrogen, Catalog No. MA1-19133)를 상온에서 2시간 반응시킨 후 항체를 PBS로 세척하고 12 nm Colloidal Gold 입자와 결합한 2차 항체(Jacksonimmuno, Catalog No. 115-205-166)과 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 투과전자현미경 관찰을 위하여 준비한 시료를 음성 염색하고 금표지된 CD55와 CD59 발현을 평가하였다.

그 결과, SJ-640에서 CD55와 CD59의 발현이 확인되었으며, 성숙 비리온(Mature Virion, MV)의 외피막(outer membrane)에 다수 분포하는 것을 확인하였다(도 5). 대조군 바이러스로 사용한 JX-594에서는 CD55와 CD59의 발현이 관찰되지 않았다.

실시예 2: SJ-640의 혈청 내 바이러스 안정성 확인

SJ-640 바이러스가 혈청 내에서 활성이 잘 유지하는지 확인하기 위하여, 혈청에서의 안정성을 측정하였다.

구체적으로, U-2 OS 골육종세포를 12-well tissue culture plate에 well 당 2.5 x 10⁵ cell로 seeding하고 overnight하여 배양하였다. 다음 날 세포가 거의 100% confluency가 되었을 때, 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640을 혈청을 포함하지 않는 DMEM 배지로 희석하여 well 당 약 80~100 PFU가 되도록 희석하였다. 희석된 바이러스에 다시 normal human serum을 전체 용량의 20%가 되도록 첨가하고 U-2 OS 세포가 배양된 plate에 2시간 동안 처리하였다. 대조군은 normal human serum 대신 혈청을 포함하지 않는 DMEM 배지를 사용하였다. 2시간 후 바이러스를 12-well plate에서 제거하고 1.5% carboxymethyl cellulose 용액을 처리하였다. 12-well plate는 37℃에서 72시간 동안 배양하고 형성된 플라크를 0.1% crystal violet 용액으로 염색하여 계수하였다. 혈청을 포함하지 않는 경우에 생성된 플라크 수를 100%로 하였을 때 normal human serum을 20% 처리하여 배양한 재조합 바이러스에서 생성된 플라크 수의 계산하여 재조합 바이러스 SJ-640의 혈청 내 안정성을 음성 대조군 JX-594와 비교하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군인 JX-549의 경우 바이러스의 활성이 30%로 감소한 반면, 본 발명의 SJ-640 바이러스는 활성이 87%까지 유지됨을 확인하였다.

실시예 3: 유방암 이식모델에서의 항종양 효능 평가

MDA-MB-231 사람 유방암 세포를 NSG 면역결핍마우스에 이식하여 이종이식 마우스 종양모델을 확립하였다. 종양 크기가 120 mm³에 도달하였을 때, SJ-640 또는 대조군인 SJ-610 1 x 10⁶ pfu를 단회 정맥 투여하고 종양성장 억제 효능을 비교하였다.

종양 크기는 모든 그룹에서 일주일에 2-3회 caliper를 이용하여 장축과 단축을 측정하였다. 종양의 크기는 (단축 x 단축 x 장축)÷2로 산출하였다. 또한 마우스의 몸무게를 평가하기 위하여 매 종양 크기를 측정하는 시점마다 무게를 측정하였다. 종양의 크기가 1,500~2,000mm³ 이상에 도달하였을 때 실험을 종료하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스인 SJ-640은 치료하지 않은 대조군(PBS) 대비 52.9%의 종양 성장 억제 효능을 나타내었으며 SJ-610의 종양 성장 억제 효능은 23.6%로 나타나, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스 SJ-640이 현저히 우수한 항종양 효과를 가짐을 확인하였다.

아울러 도 8에 나타낸 바와 같이 모든 실험군에서 마우스 몸무게 변화에 통계학적으로 유의미한 차이는 없었으며, 임상적 독성은 관찰되지 않았다.

<110> SillaJen, Inc. <120> Oncolytic Virus co-expressing CD55 and CD59 <130> KPA2022-165 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD55 <400> 1 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val 20 25 30 Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala 35 40 45 Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys 50 55 60 Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile 65 70 75 80 Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg 85 90 95 Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro 100 105 110 Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys 145 150 155 160 Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val 165 170 175 Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr 180 185 190 Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly 195 200 205 Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg 225 230 235 240 Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly 245 250 255 Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp 260 265 270 Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu 275 280 285 Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val 290 295 300 Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr 305 310 315 320 Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr 325 330 335 Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr 340 345 350 <210> 2 <211> 1055 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD55 <400> 2 tgaccgtcgc gcggccgagc gtgcccgcgg 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ttttgatgcg tgtctcatta ccaaagctgg gttacaagtg 180 tataacaagt gttggaagtt tgagcattgc aatttcaacg acgtcacaac ccgcttgagg 240 gaaaatgagc taacgtacta ctgctgcaag aaggacctgt gtaactttaa cgaacagctt 300 gaa 303 <210> 5 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLEO160 <400> 5 ttttattttt tttttttgga atataaatat ccggtaaaat tgaaaaaata tacactaatt 60 agcgtctcgt ttcagacgct agccggtacc ccgggttcga aatcgataag cttggatccg 120 gagagctccc aacctcgagg aattcggtac cccgggttcg aaatcgataa gcttggatcc 180 ggagagctcc caacctcgag ctagctcgag 210 <210> 6 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLEO38 <400> 6 ttttattttt tttttttgga atataaatat ccggtaaaat tgaaaaaata tacactaatt 60 agcgtctcgt ttcagacgct agctcgag 88 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3 <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3 <400> 8 ggtggtggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45 <210> 9 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Glu Asn His Ala Glu Thr Leu Arg Ala Ala Met Ile Ser Leu 85 90 95 Ala Lys Lys Ile Asp Val Gln Thr Gly Arg Arg Pro Tyr Glu 100 105 110 <210> 12 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A27L transmembrane domain <400> 12 atggacggaa ctcttttccc cggagatgac gatcttgcaa ttccagcaac tgaatttttt 60 tctacaaagg ctgctaaaaa gccagaggct aaacgcgaag caattgttaa agccgatgaa 120 gacgacaatg aggaaactct caaacaacgg ctaactaatt tggaaaaaaa gattactaat 180 gtaacaacaa agtttgaaca aatagaaaag tgttgtaaac gcaacgatga agttctattt 240 aggttggaaa atcacgctga aactctaaga gcggctatga tatctctggc taaaaagatt 300 gatgttcaga ctggacggcg tccatatgag 330 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D8L transmembrane domain <400> 13 Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr Ala Ile Leu 1 5 10 15 Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn 20 25 <210> 14 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8L transmembrane domain <400> 14 ttcgcaatta ttgccatagt attcgtgttt atacttaccg ctattctctt ttttatgagt 60 cgacgatatt cgcgagaaaa acaaaac 87 <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A16L transmembrane domain <400> 15 Leu Gly Ala Ala Ile Thr Leu Val Val Ile Ser Val Ile Phe Tyr Phe 1 5 10 15 Ile Ser Ile Tyr Ser Arg Pro Lys Ile Lys Thr Asn Asp Ile Asn Val 20 25 30 Arg Arg Arg 35 <210> 16 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A16L transmembrane domain <400> 16 ttgggcgcgg ccataacatt ggttgtaata tctgttattt tctattttat atctatttat 60 tcgcgtacta aaattaaaac aaatgatata aatgttcgta gacga 105 <210> 17 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F9L transmembrane domain <400> 17 Pro Trp Phe Leu Val Gly Val Ala Ile Ile Leu Val Ile Phe Thr Val 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ser Ile Arg Arg Asn Leu Ala Leu Lys Tyr Arg Tyr Gly 20 25 30 Thr Phe Leu Tyr Val 35 <210> 18 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F9L transmembrane domain <400> 18 ccgtggtttc tagtgggtgt agcaattatt ctagttattt ttactgtagc tatttgttct 60 attagacgaa 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domain <400> 27 Met Ile Thr Leu Phe Leu Ile Leu Cys Tyr Phe Ile Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Ile Ile Val Pro Ala 20 <210> 28 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A21L transmembrane domain <400> 28 atgataactt tatttttaat cctatgttat ttcattctta tttttaatat tatagtacct 60 gca 63 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A28L transmembrane domain <400> 29 Met Asn Ser Leu Ser Ile Phe Phe Ile Val Val Ala Thr Ala Ala Val 1 5 10 15 Cys Leu Leu Phe Ile 20 <210> 30 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A28L transmembrane domain <400> 30 atgaactctc tatcaatttt ttttattgtg gtagcgacgg ctgcggtgtg tttacttttt 60 atc 63 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E10R transmembrane domain <400> 31 Ala Val Trp Thr Ile Ile Phe Ile Val Leu Ser Gln Ala Gly Leu Asp 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E10R transmembrane domain <400> 32 gccgtatgga ccattatttt tatagtactt tcgcaagcgg gtttagacgg 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Sequence <220> <223> I2L transmembrane domain <400> 38 tattggttaa ttattatttt ttttatagtt cttattctac tactattgat atatttgtat 60 tta 63 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J5L transmembrane domain <400> 39 Ile Ile Asp Ile Lys Trp Leu Pro Ile Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ile 1 5 10 15 Leu Ile Leu Ala Phe 20 <210> 40 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J5L transmembrane domain <400> 40 attatagata tcaaatggct tccgattgga ttactagcgt tagctatttt aatattagca 60 ttt 63 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L5R transmembrane domain <400> 41 Ile Val Leu Phe Glu Val Phe Val Val Phe Ile Leu Ile Tyr Val Phe 1 5 10 15 Phe Arg Ser Glu Leu 20 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L5R transmembrane domain <400> 42 atagttttat ttgaagtatt cgttgtattc attctaatat atgtattttt tagatctgaa 60 tta 63 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O3L transmembrane domain <400> 43 Leu Val Val Ile Met Phe Phe Ile Ala Phe Ala Phe Cys Ser Trp Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Ser Tyr Leu 20 <210> 44 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O3L transmembrane domain <400> 44 ctcgtcgtaa ttatgttttt tatagcgttt gccttctgta gttggctatc atatagctat 60 ctg 63

Claims

CD55 및 CD59를 동시 발현하는 항암 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 항암 바이러스는 티미딘 키나제 유전자의 발현이 억제된 항암 바이러스.
제2항에 있어서,
상기 티미딘 키나제 유전자의 발현이 억제되는 것은 유전자의 일부 또는 전부의 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자 삽입에 의한 것인, 항암 바이러스.
제2항에 있어서,
상기 티미딘 키나제 J2R 영역의 일부 또는 전부에 외래 유전자가 삽입된 것인, 항암 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 CD55는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 항암 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 CD59는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 항암 바이러스.
제1항에 있어서,
항암 바이러스 막단백질 또는 이의 세포막 관통 도메인(transmembrane domain)을 코딩하는 유전자를 더 포함하는, 항암 바이러스.
제7항에 있어서,
상기 항암 바이러스 막단백질을 코딩하는 유전자는 상기 CD59를 코딩하는 유전자와 링커를 통해 연결된, 항암 바이러스.
제8항에 있어서,
상기 링커는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 항암 바이러스.
제7항에 있어서,
상기 항암 바이러스 막단백질의 세포막 관통 도메인을 코딩하는 유전자는 상기 CD55를 코딩하는 유전자와 융합된, 항암 바이러스.
제7항에 있어서,
상기 항암 바이러스의 막단백질은 H3L, A27L, D8L, A16L, F9L, G9R, L1R, A9L, A13L, A21L, A28L, E10R, G3L, H2R, I2L, J5L, L5R 또는 O3L인, 항암 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 CD55 및 CD59는　각각 후기(late)-초기(early) VACV p7.5 프로모터, 백시니아 합성 초기-후기 프로모터(pSEL), 백시니아 합성 후기 프로모터(pSL), 백시니아 변형된 H5(mH5) 프로모터, 백시니아 짧은 합성 초기-후기 pS 프로모터, pLEO160 프로모터, pLEO38 프로모터, pLate 프로모터, pC11R 프로모터, pF11L 프로모터, psFJ1-10 합성 초기 프로모터, pHyb 합성 초기 프로모터, 임의의 천연 백시니아 초기 프로모터, 또는 후기-초기 최적화된 (LEO) 프로모터의 제어 하에 발현되는, 항암 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 항암 바이러스는 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스, 레트로 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 콕사키 바이러스, 엔테로 바이러스 또는 헤르페스 바이러스인 것인, 항암 바이러스.
제13항에 있어서,
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), 와이어쓰 (Wyeth), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 스트레인(strain)인, 항암 바이러스.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 약학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 신장암, 골육종, 육종, 연골육종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 혈액암은 림프종, 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 종양내, 혈관내, 근육내 또는 복강내로 투여용인, 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 정맥 또는 동맥 투여용인, 약학적 조성물.
CD55 및 CD59를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 발현을 위해 프로모터와 작동가능하게 연결된, 항암 바이러스에 삽입을 위한 유전자 구조체(construct).
제21항에 있어서, 상기 유전자 구조체는 항암 바이러스의 불활성화된 티미딘 키나제 유전자 영역에 삽입을 위한 것인, 유전자 구조체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항암 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.