KR102628234B1 - 알부민-결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면 상에 알부민-결합 모이어티를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 헥손 단백질 코딩 서열의 과가변부 1 (HVR1)에 삽입된 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하는 종양분해성 아데노바이러스 및 이의 암 예방 및/또는 치료에서의 용도에 관한 것이다.

Description

알부민-결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스 {ADENOVIRUS COMPRISING AN ALBUMIN-BINDING MOIETY}
본 발명은 질병 테라피 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면 상에 알부민-결합 모이어티를 포함하는, 유전자 테라피 또는 바이로테라피 (virotherapy)를 위한 재조합 아데노바이러스, 구체적으로는 알부민-결합 모이어티를 포함하는 종양분해성 (oncolytic) 아데노바이러스 및 이의 암 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다. 이들 아데노바이러스는 혈류에 존재하는 중화 항체로부터 보호되므로, 전신 투여에 특히 적합하다.
아데노바이러스는 유전자 테라피를 위한 유전자 전달 벡터로서 뿐 아니라 암 치료를 위한 종양분해제 (oncolytic agent)로서 널리 사용되어 왔다. 아데노바이러스는 이러한 용도에 적합한 몇가지 특징들을 나타낸다. 즉, 아데노바이러스의 구조와 생물학적 특성은 널리 연구되어 있어, 이들의 게놈을 용이하게 변형시킬 수 있으며, 이들 바이러스는 복제성 세포 및 복제불가 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 임상적으로 사용하기에 높은 역가 (titer)로 쉽게 생산될 수 있다. 아데노바이러스는, 안전성 측면에서, 인간에게서 생명을 위협하는 질병을 유발하지 않으며, 그 바이러스 게놈은 삽입 돌연변이가 방지되는 비-삽입형 (non-integrative)이다. 아데노바이러스계 벡터를 이용한 임상 실험들은, 이 바이러스가, 전신 투여의 경우에는 효능 개선의 필요성이 아직 남아있긴 하지만, 양호한 독성 및 안전성 프로파일을 가진 것으로 보고되고 있다.
유전자 테라피 분야에서, 전신 투여, 즉 정맥내 또는 동맥내 혈류로의 주입은, 다수 장기들과 파종성 세포 (disseminated cell)들에 도달하기 위해 필요할 수도 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 및 종양분해성 아데노바이러스를 이용한 암 테라피에서, 진행된 상태이거나 전이성 상태의 파종성 종양들을 치료하기 위해서는 전신 투여가 필수적이다. 그러나, 아데노바이러스는 혈류로의 주입시 테라피 효과를 떨어뜨리는 상당한 한계를 보인다. 아데노바이러스 타입 5 (Ad5)는 혈류에서 바이러스의 생체이용성을 급격하게 떨어뜨리는 여러가지 중화성 상호작용 (neutralizing interaction)을 겪게 된다. 주입된 투여량의 >90%가 간, 주로 쿠퍼 세포로 지칭되는 간 대식세포와, 또한 간의 LSEC (liver sinusoidal endothelial cell) 및 간 세포에 체류하기 때문에, 이 테라피의 가장 큰 문제점은 간 격리이다. 혈액 세포 및 단백질과의 직접적인 상호작용 역시 주요한 장애가 된다. Ad5는 CAR 수용체를 통해 적혈구 등의 혈액 세포에 직접 결합하며, 인테그린을 통해 혈소판에 결합할 수 있다. 항체는 바이러스를 직접 중화시킬 뿐만 아니라 보체 활성화 및 단핵세포와 호중구의 Fc 수용체에 바이러스 입자를 도킹 (docking)시킴으로써 선천적인 면역 반응을 촉발시킬 수도 있다. 또한, 바이러스 재-투여는 항-Ad 중화 항체 (NAb)의 농도를 증가시키며, 따라서, 바이러스 중화도 강화된다. 항체 및 보체에 의한 아데노바이러스의 옵소닌 작용 (opsonization) 역시 쿠퍼 세포에 의한 제거 (clearance)를 강화할 수 있다. 전체적으로, 이들 상호작용은 마우스 및 인간에서 혈중 Ad의 반감기를 약 수분으로 크게 단축시키는 결과를 발생시킨다.
아데노바이러스의 전신 투여시 항체 및 면역 세포에 의한 중화를 회피하기 위한 상당한 노력들이 행해져왔다.
아데노바이러스 캡시드를 폴리머 (폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 (HPMA))를 이용하여 화학적으로 변형시키는 방법이 시도되어 왔다. 바이러스 표면 상의 폴리머 접합은, 바이러스가 항체 및 면역 세포에 의한 중화를 회피하게 할 수 있을 뿐만 아니라, CAR, 인테그린 및 FX-결합을 없앨 수 있다. 그러나, 캡시드에 접합된 폴리머는 바이러스 후대로 유전되지 않으며, 임상적인 사용을 위한 대규모 GMP 생산의 복잡성을 가중시킨다.
WO 2011/129468 A9는 중화 항체의 면역 인지를 회피할 수 있는 키메라 아데노바이러스를 개시하였다. 이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 캡시드를 유전적으로 변형시켜 수득된 것으로서, 헥손 단백질을 코딩하는 유전자가 시미안 아데노바이러스 혈청형 19 유래 헥손 유전자로 치환되어 있다. 제조된 이 키메라 아데노바이러스는 유전자 변형되지 않은 동일한 아데노바이러스 보다 우수한 항-종양 활성을 나타내었다.
알부민 단백질에 의해 보호된 아데노바이러스를 수득하기 위한 몇가지 시도들이 수행되어 왔다 (WO 2007/050128 A2). 그러나, 실험적인 증거에 따르면, 알부민-결합 도메인을 포함하는 변형된 캡시드를 가진 아데노바이러스는 중화 항체로부터 보호되지 못하는 것으로, 확인된 바 있다 (Hedley S.J. et al. 2009. The Open Gene Therapy Journal, 2:1-11).
따라서, 전신 투여에 적합하며 중화 항체를 회피할 수 있는 또 다른 유전자 변형된 아데노바이러스가 여전히 요구되고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은, 헥손 단백질의 과가변부 1 (HVR1)의 코딩 영역에 삽입된 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열이 헥손 단백질과 알부민-결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 발현하며, 헥손 단백질이 아데노바이러스 캡시드에 조립될 때 알부민-결합 모이어티가 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 게놈에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 아데노바이러스 게놈을 가진 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 치료학적인 유효량의 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 포유류에서 암 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 아데노바이러스는 게놈에 삽입된 암 테라피에 사용되는 유전자를 포함하는 종양분해성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스이다.
도 1. ICOVIR15-ABD에서 알부민-결합 도메인 (ABD) 삽입을 도시한 개략도. 스트렙토코커스의 단백질 G 유래 ABD 3 (서열번호 1)는 2개의 GSGS (서열번호 2) 링커 사이에 위치되며, 종양분해성 아데노바이러스 ICOVIR15의 헥손의 과가변부 1 (HVR1)의 중간에 위치됨으로써, ICOVIR15-ABD가 구축된다. LITR/RITR, 좌 및 우 인버티드 말단 리피트 (inverted terminal repeat); MLP, 주요 후기 프로모터; E1Ap, 변형된 E1A 프로모터; E1A-Δ24, 폴리펩타이드 체인의 아미노산 121-129가 제거된 E1A 단백질의 변형 버전; L1 - L5, 후기 유전자들; 섬유 RGD, 섬유의 H1-루프내 RGD 펩타이드 삽입에 의해 RGD-변형된 섬유.
도 2. 헥손에 삽입된 알부민 결합 도메인 (ABD)을 포함하는 아데노바이러스의 도해도. 비-변형된 아데노바이러스 ICOVIR15 (좌)와 비교해, ABD-변형된 바이러스 ICOVIR-15-ABD (우)는 혈중에 존재하는 알부민으로 피복되어, 중화 항체로부터 바이러스를 보호한다.
도 3. ICOVIR15-ABD 및 ICOVIR15의 바이러스 생산 카이네틱스. 컨플루언트 A549 세포를 세포 당 바이러스 입자 (vp) 800개로 감염시켰다. 감염 4시간 (h) 후, 바이러스를 제거하고, 세포를 PBS로 3번 세척한 다음, 바이러스-무함유 배지에서 인큐베이션하였다. 감염한 지 4, 24, 48 및 72시간 후 세포 추출물을 수집하고, 항-헥손 염색 방법으로 역가를 측정하였다. 샘플을 3세트로 평가하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 표시한다 (오차 막대는 값이 작아 식별하기 어려움). TU/mL, 형질도입 단위/mL. * ICOVIR15 그룹 대비 통계적 유의성 (p≤0.05).
도 4. 인간 혈청 알부민 (HSA)의 존재 또는 부재 하의 ICOVIR15 및 ICOVIR15-ABD의 시험관내 세포독성 비교. A549, Sk-mel28, HEK293 및 MCF-7 세포를, 표시된 바이러스 10000 내지 0.0001 바이러스 입자 (vp)/세포로 감염시켰다. 감염 후 7일째 IC50 값 (세포 배양물의 생존성을 50%로 감소시킬 수 있는 vp 값/세포)을 나타낸다. 각 세포주에서 서로 다른 3종의 리플리케이트를 정량하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. MOI, 감염 다중도 (multiplicity of infection).
도 5. ICOVIR15-ABD는 ELISA에 의한 검출에 따르면 인간 및 마우스 알부민에 결합한다. A) 웰을 인간 또는 소 혈청 알부민 (ABD에 각각 결합 또는 결합되지 않는 HSA 또는 BSA)으로 코팅하였다. 결합 검출을 위해 바이러스 단백질을 3가지 용량 (0.25, 2.5 및 25 ng)으로 평가하였다. 알부민-코팅된 웰에 대한 ICOVIR15 및 ICOVIR15-ABD 아데노바이러스의 결합을 항-헥손 항체 및 퍼옥시다제-표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션한 후 비색 분석을 통해 검출하였다. 샘플을 3세트로 평가하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. OD, 광학 밀도. * 다른 그룹 대비 통계학적 유의성 (p≤0.05). B) 웰을 소, 인간 또는 마우스 혈청 알부민 (BSA, HSA 또는 MSA)으로 코팅하였다. 바이러스 단백질의 시험량은 25 ng이었다. 알부민-코팅된 웰에 대한 아데노바이러스의 결합을 항-헥손 항체 및 퍼옥시다제-표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션한 후 비색 분석을 통해 검출하였다. 아데노바이러스 무첨가한 대조군 모의군도 포함시켰다. 샘플을 3세트로 평가하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. OD, 광학 밀도. * 다른 그룹 대비 통계학적 유의성 (p≤0.05).
도 6. 알부민-결합은 시험관내에서 아데노바이러스를 중화 항체로부터 보호한다. 인간 혈청 알부민 (HSA)로 피복 또는 비-피복된 AdGL 및 AdGL-ABD 아데노바이러스를, 37℃에서 1시간 동안 중화 항체 Ab6982의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 그런 후 HEK293 세포를 첨가하여, 감염 다중도 0.5 TU (transducing unit)/세포를 수득하였다. 감염한 지 24시간 후에, 세포의 형질도입을 루시퍼라제 발현으로 분석하였다. 100% 감염율을 수득하기 위해 항체 (Ab) 무첨가 대조군 ("no Ab" 대조군)을 포함시켰다. 샘플을 3세트로 평가하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다.
도 7. ICOVIR15-ABD는 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 보호되는 경우 중화 항체의 존재 시 시험관내 세포독성 증가를 나타낸다. ICOVIR15 및 ICOVIR15-ABD를 중화항체 Ab6982 (Nab, 시판 다클론 anti-HAd5) 연속 희석물과 함께 1시간 동안 인간 혈청 알부민 (HSA)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. A549 세포를 첨가하여, 세포 당 바이러스 입자 (vp) 600의 감염 다중도를 달성하였다. 생존 세포 비율 (웰내 단백질 함량)을 감염 4일째에 측정하였다. 샘플을 3세트로 평가하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다.
도 8. ABD는 아데노바이러스 혈장 반감기를 증가시킨다. 누드 마우스에, 1:1 비율의 ICOVIR15 및 ICOVIR15-ABD 혼합물을 주사하였으며, 총 용량은 5 x 1010 바이러스 입자 (vp)/마우스 (n=5)였다. 혈액 샘플을 투여 후 5분, 15분, 1시간, 4시간 및 24시간째에 채혈하고, 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 아데노바이러스 헥손의 과가변부 1 (HVR1)에 대해 PCR 증폭을 수행하였으며, 전기영동을 통해 샘플을 분석하였다. ABD 삽입은 HVR1의 크기를 299에서 361 bp로 증가시킨다. 겔은 표준 물질과 함께 여러가지 비율의 ICOVIR15-ABD: ICOVIR15 게놈 (0.2, 1, 5, 10 및 50), 주입 전 대조군 (t0), PCR의 물 음성 대조군 (water negative-control) (H2O) 및 혈청 샘플들의 PCR (#1 - #5)을 보여준다.
도 9. 생체내 전신 투여 후 ICOVIR15-ABD의 항-종양 활성. 피하 흑색종 (Sk-mel28) 이종이식체를 가진 누드 마우스에, 포스페이트-완충화된 염수 (PBS), ICOVIR15 또는 ICOVIR15-ABD (5 x 1010 바이러스 입자 (vp)/마우스)를 1회 정맥내 용량으로 주입하였다. 종양 체적 ± SEM을 그래프로 작성하였다 (n=10-12). * PBS 군 대비 통계학적 유의성 (p≤0.05).
도 10. 헥손 HVR1에서 알부민 결합 도메인으로 변형된 아데노바이러스 벡터를 이용한 생체내 간 및 종양 형질도입은 아데노바이러스-예비 면역 마우스에서 보존된다. 피하 흑색종 (B16-CAR) 이종이식체를 가진 C57BL/6 마우스에, hAd5wt (2 x 1010 바이러스 입자 (vp)/마우스) 또는 비히클을 복막내 주입하여 면역화하고, 7일 후 AdGL (GFP-루시퍼라제 벡터) 또는 AdGL-ABD (3x1010 vp/마우스)을 정맥내 주사하였다. 3일 후, 간과 종양에서 루시퍼라제 활성을 생발광 이미지 측정 (IVIS)에 의해 분석하였다. 평균 ± SEM을 그래프로 도시하였다 (간 n=4-6, 종양 n=8-12). sec: 초; sr: 스테라디안 (steradian).
도 11. 과가변부 5에 ABD 삽입은 바이러스 생존에 영향을 미치지 않는다. HEK293 세포에 pAdZGL-H5-ABD 플라스미드를 형질감염시켜, AdGL-H5-ABD 바이러스를 구축하였다. 1주일 후, 세포 및 상층물을 회수하고, 3번의 냉동-해동 사이클을 통해 세포를 분해 (lysis)시켰다. 바이러스가 포함된 세포 추출물을 플라그 분석에 의해 HEK293 세포에서 역가를 측정하였다. 바이러스 증식을 의미하는 플라그가 확인된, 희석물 1E6, 1E7 및 1E8에 해당되는 웰들을 도시한다.
도 12. HVR5에 삽입된 알부민-결합 도메인은, HVR1에 삽입된 동일한 도메인과는 대조적으로, 아데노바이러스를 중화 항체로부터 보호하지 않는다. HEK293 및 Sk-mel28 세포에서, AdGL, AdGL-H1-ABD 및 AdGL-H5-ABD를 비교하여, 시험관내 중화 실험을 수행하였다. 아데노바이러스를, 인간 혈청 알부민 (HSA)의 존재 또는 부재 하에 중화 항체 Ab6982 연속 희석물과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 첨가하여, 감염 다중도 10 바이러스 입자 (vp)/세포 (HEK293) 및 40 vp/세포 (Sk-mel28)를 수득하였다. 감염한 지 24시간 후, 세포의 형질도입을 루시퍼라제 발현을 통해 분석하였다. 항체 (Ab) 무첨가 대조군 ("no Ab" 대조군)을 포함시켜, 100% 감염 값을 달성하였다. 샘플을 3세트로 평가하였다. 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다
본 발명의 발명자들은, 캡시드의 외표면 상에, 구체적으로 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면 상에 알부민-결합 모이어티를 가지는 유전자 변형된 아데노바이러스가 알부민 보호막을 획득하여, 전신 투여 후 바이러스가 중화 항체를 피하여 혈중 존속성 (blood persistence)을 증가시킬 수 있다는 것을, 발견하게 되었다. 아데노바이러스를 알부민-결합 도메인으로 변형시키는 이전의 시도들은 중화 항체로부터 아데노바이러스 보호 증진에 실패하였기 때문에 (Hedley S.J. et al. 2009. The Open Gene Therapy Journal, 2:1-11), 이런 결과는 예상되지 못한 일이다.
부가적으로, 재조합 아데노바이러스가 종양분해성 아데노바이러스인 경우, 알부민-결합 모이어티의 삽입은 항-종양 활성을 개선시킨다. 이런 의미에서, 상기한 유전자 변형된 아데노바이러스는 전신 투여와 관련된 제한을 극복하며, 특히 암 치료에 잠재적 가치를 가진다.
본 발명의 실시예들에 제시된 결과들은, 헥손 단백질 코딩 서열의 과가변부 1 (HVR1)에 삽입된 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유래된 알부민-결합 도메인 (ABD)을 코딩하는 서열을 포함하는 복제-선택적인 종양분해성 아데노바이러스 (ICOVIR15-ABD)가, 이 도메인을 캡시드 상에 노출시켜 알부민 결합을 촉매하고, 아데노바이러스를 중화 항체로부터 보호하고, 혈장 반감기를 증가시키고, 이의 항-종양 효능을 향상시킬 수 있다는 것을, 명확하게 보여준다. 본 발명에 제공된 실험예들은, 또한, 복제-결핍 아데노바이러스 (AdGL-ABD)의 헥손 단백질의 HVR1에 스트렙토코커스 단백질 G 유래 ABD의 삽입시, 중화 항체로부터 아데노바이러스가 보호된다는 것을, 보여준다 (도 6). 따라서, 이들 결과는, 아데노바이러스의 알부민-피복이 바이러스 단백질을 숨기고 혈중 복수의 부적절한 상호작용 (중화 항체, 혈액-세포 흡수 및 간 흡수)을 회피하기 위한 보호막으로서 작용하여, 약동학적 특성을 개선시킴을 입증해준다. 이는 특히 유전자 테라피용 아데노바이러스 벡터, 백신 또는 종양분해성 아데노바이러스를 재-투여하는 경우에 중요하다. 따라서, 본 발명의 유전자 변형된 아데노바이러스는 전신 투여에 적합하다.
본 발명의 아데노바이러스
본 발명에서 수득되는 결과들은, 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면 상에 알부민-결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스가 알부민으로 피복될 수 있으며, 이로써 자신을 혈류에 존재하는 중화 항체로부터 보호할 수 있다는 것을, 보여준다. 이러한 보호 효과는 복제가능 (ICOVIR15-ABD) 및 복제불가 (AdGL-ABD) 아데노바이러스 모두에서 관찰된다.
일 측면에서, 본 발명은, 헥손 단백질의 과가변부 1 (HVR1)의 코딩부에 삽입된 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하며, 헥손 단백질과 알부민-결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 발현시키며, 헥손 단백질이 아데노바이러스 캡시드에 조립되었을 때 알부민-결합 모이어티가 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 게놈을 가진 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
본원에서, "아데노바이러스"라는 용어는 아데노바이러스로 분류될 수 있는 임의의 바이러스, 즉 이중 가닥 DNA 게놈을 함유한 정20면체 뉴클레오캡시드를 가진 비-외막형 바이러스로 특정되는 아데노비리대 (Adenoviridae) 과에 속하는 임의의 바이러스를 지칭한다. 이 용어는, 표적 세포를 감염시키기 위한 수용체로서 CAR을 이용하는 모든 그룹, 서브그룹 및 혈청형을 비롯해, 인간 또는 동물을 감염시킬 수 있는 임의의 아데노바이러스를 포함한다. 본 발명의 아데노바이러스는, 비제한적인 예로, 조류, 개, 말, 소, 양, 돼지, 인간 또는 개구리 아데노바이러스를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스, 즉, 인간을 감염시킬 수 있는 아데노바이러스이다. 본 발명에 따르면, "혈청형"은 아데노바이러스의 면역학적으로 서로 다른 각각의 타입이다. 인간 아데노바이러스의 경우 몇가지 서브그룹 (A에서 G)으로 분류되는 혈청형은 적어도 57종이다. 본 발명은, 비제한적인 예로, 표 1에 정의된 임의의 혈청형 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 아데노바이러스 혈청형의 사용을 포함한다.
표 1. 본 발명에서 사용하기 적합한 아데노바이러스 서브그룹 및 혈청형에 대한 몇가지 예.
서브그룹 혈청형
A 12, 18, 31
B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55
C 1, 2, 5, 6, 57
D 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 51, 53, 54, 56
E 4
F 40,41
G 52
바람직한 구현예에서, 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 1 - 57로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스는 서브그룹 C에 속하며, 더 바람직하게는 혈청형 5이다.
인간 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5)는 경미한 호흡 감염과 관련있다. 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 유전자 서열은 GenBank: AY339865.1 (version of 13th August, 2007)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 본원에서, "재조합"이라는 용어는 천연적으로는 생성되지 않는 아데노바이러스를 지칭한다. 이러한 재조합 아데노바이러스는 아생형과 비교해 하나 이상의 변형을 포함한다. 이러한 변형으로는, 비제한적으로, 감염성 바이러스를 만들기 위해 입자 안에 패킹되는 아데노바이러스 게놈에 대한 변형을 포함한다. 그외 변형들로, 복제에 중요한 유전자를 바이러스 게놈에서 제거함으로써 복제-결핍 바이러스 (즉, 재생산할 수 없는 바이러스)를 수득할 수 있다. 변형의 예로는, E1a, E1b, E2a, E2b, E3 또는 E4 코딩 영역들 중 하나 이상의 결손 등의 당해 기술 분야에 공지된 결손을 포함한다. 그외 예시적인 변형으로는 아데노바이러스 게놈의 코딩 영역 전체의 결손을 포함한다. 이런 아데노바이러스를 "gutless" 아데노바이러스라고 한다. 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 인자들을 조합하여 제조된 키메라 아데노바이러스도 포함된다.
용어 "재조합"은 또한 특정 타입의 세포 또는 조직에서 선호적으로 복제하지만, 다른 타입들에서도 약간 복제하거나 또는 전혀 복제하지 않는, 복제-조건부 (replication-conditional) 아데노바이러스를 포함한다. 예를 들어, 본원에 제시된 아데노바이러스들 중, 고형 종양 및 그외 신생물 등과 같이 비정상적으로 증식하는 조직에서 복제하는 아데노바이러스이다. 이러한 것으로는 미국 특허 5,998,205 및 미국 특허 5,801,029에 언급된 바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스는 때때로 "세포용해성" 또는 "세포변성 (cytopathic)" 바이러스 (또는 벡터)라 지칭되며, 이것이 신생물 세포에 그러한 효과를 가지는 경우 "종양분해성" 바이러스 (또는 벡터)라 한다.
일 구현예에서, 아데노바이러스는 복제가능 아데노바이러스, 특히 종양분해성 아데노바이러스이다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스는 복제불가 아데노바이러스 또는 복제-결핍 아데노바이러스이다. 복제-결핍 아데노바이러스 또는 복제불가 아데노바이러스는, 세포 안에서 치료 유전자를 발현하고 세포는 분해시키지 않는 것을 목적으로 하기 때문에, 표겟 세포로의 유전자 캐리어로서 유전자 테라피에서 사용되는, 표적 세포에서 복제할 수 없는 아데노바이러스이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면 상에 이종의 서열을 삽입함으로써 변형된다. 구체적으로, 이종 서열은 알부민-결합 모이어티를 코딩하다.
아데노바이러스 입자는 바이러스 DNA를 봉입하는 캡시드로 구성된다. 본원에서, 용어 "캡시드는 5각형 또는 6각형일 수 있는 캡소머로 지칭되는 서브유닛들에 의해 형성된 바이러스 단백질 셸이다. 아데노바이러스 캡시드는 20개의 등변 삼각면을 가진 정 20면체 형태를 취한다. 캡시드 대부분은 헥손 단백질에 의해 형성되고, 각 꼭지점은 펜톤 베이스와 섬유 단백질로 형성된 복합체이다.
본원에서, 용어 "아데노바이러스 헥손 단백질" 또는 "헥손 단백질 "(종래에는 "단백질 II"로 지칭됨)은, 자가-조립하여, 각각이 6각형 형상인 트리머를 형성하는, 아데노바이러스에서 발견되는 캡시드 주요 구조 단백질을 지칭하다. 240개의 헥손 트리머가 조립하여, 아데노바이러스 캡시드가 된다. 헥손 단백질은 바이러스 캡시드 조립, 캡시드의 20면체 대칭 결정 및 캡시드의 완전성에 필수적이다. 헥손 단백질의 주요한 구조적 특징들은 아데노바이러스 혈청형들 간에 공통되지만, 헥손 단백질의 크기와 면역학적 특성은 혈청형들 간에 차이가 있다. 본 발명에서, 용어 "헥손 단백질"은 비제한적인 예로, 인간 아데노바이러스 C 혈청형 5의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P04133의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 인간 아데노바이러스 C 혈청형 2의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P03277의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 조류 아데노바이러스 gal1 (strain Phelps)의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P42671의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질; 및 인간 아데노바이러스 F 혈청형 40의 헥손 단백질에 해당하는, 2014년 2월 19일에 등록된 수탁 번호 P11819의 UniProt 데이타베이스의 서열로 정의되는 단백질 등의, 임의의 아데노바이러스의 헥손 단백질을 포괄한다. 이 표현은 다른 서브그룹 또는 혈청형에서 천연적으로 발생하는 헥손 단백질의 모든 천연 변이체들을 포괄한다.
본 발명에서, "헥손 단백질의 외표면"이라는 표현은, 헥손 단백질의 캡시드의 표면 상에 노출되는 영역을 지칭한다. 본 발명의 알부민-결합 모이어티가 아데노바이러스 헥손 단백질의 내부 파트 또는 외표면으로 도입되었는지를 확인하기 위해서는, 인간 혈청 알부민와의 결합성을 검출하는 분석을 본 특허 출원의 실험 부분에 기술된 바와 같이 (예, ELISA 분석) 또는 시험관내 중화 분석으로 수행할 수 있다. 인간 혈청 알부민이 아데노바이러스에 결합할 수 있다면, 알부민-결합 모이어티는 아데노바이러스 헥손 단백질의 외표면에 도입된 것이다.
헥손 단백질의 Loop 1 (L1) 및 Loop 2 (L2)는 바이러스 캡소미어 구조의 외면 상에 노출되는 것으로 보고되어 있다. L1은 과가변부 (HVR) 6개, 즉 HVR1에서 HVR6를 포함하며, L2는 7번째 과가변부 (HVR7)를 포함한다.
본원에서, "과가변부" 또는 "HVR"이라는 용어는, 표면 노출된 루프들에서 아데노바이러스의 혈청형을 결정하는 길이 및 서열 간에 차이가 있는 영역을 지칭한다. 트리머의 각각 서브유닛에는 아데노바이러스 헥손의 과가변부 7개가 존재한다 (Biere B and Schweiger B. J Clin Virol 2010; 47(4):366-371). 본 발명의 맥락에서, HVR에 사용되는 명칭은 Crawford-Miksza 및 Schnurr (Crawford-Miksza and Schnurr. 1996. Virology, 224(2):357-367)에 언급된 바와 같다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, HVR은 HVR1이다. HCR 영역에 특정 잔기를 삽입하면, 아데노바이러스 벡터 당 삽입체 240 x 3 또는 720개가 만들어진다. 바람직한 구현예에서, 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열은, 제조되는 융합 단백질이, 인간 아데노바이러스 혈청형 5 유래 헥손 단백질에 해당되는 2008년 6월 14일자 GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링에 따라, 헥손 단백질의 D150 아미노산 다음에 알부민-결합 모이어티를 포함하도록, 삽입된다. 보다 바람직한 구현예에서, HVR1 (ABD-HVR1)에 삽입된 ABD를 가진 변형된 아데노바이러스의 전체 헥손 (complete modified adenoviral hexon)의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3이다. 본 발명자들은, 다른 HVR (구체적으로, HVR5)에 알부민-결합 도메인을 삽입하면 살아있는 바이러스는 생산되지만, 아데노바이러스를 중화 항체로부터 보호하진 못한다 것을 확인한 바 있다. 본 발명을 적용한 실시예들서, 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열이, 제조되는 융합 단백질이 인간 아데노바이러스 혈청형 5 유래 헥손 단백질에 해당되는 2008년 6월 14일자 GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링에 따라, 헥손 단백질의 A274 아미노산 다음에 알부민-결합 모이어티를 포함하도록, HVR5에 삽입되었음을 확인하였다. HVR5 (ABD-HVR5)에 삽입된 ABD를 가진 변형된 아데노바이러스의 전체 헥손의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이다. 도 12는, 알부민-결합 도메인은 HVR5가 아닌 HVR1에 삽입되었을 때 기능함을 보여준다.
알부민-결합 모이어티는 헥손 단백질에 직접 부착될 수 있으며, 즉, 알부민-결합 모이어티의 N- 및 C-말단이 헥손 단백질에 직접 연결된다. 그러나, 알부민-결합 모이어티는 링커 서열을 통한 헥손 단백질과의 연결도 가능하다. 따라서, 다른 구현예에서, 알부민-결합 모이어티의 N- 및/또는 C-말단은 링커 서열을 통해 헥손 단백질과 연결된다.
본원에서, 용어 "링커 서열"은 헥손 단백질과 알부민-결합 모이어티 사이에 힌지부로서 작용하여 2개의 인자 사이에 스페이스를 제공하여, 헥손 단백질의 2차 구조가 ABD 모이어티의 존재에 영향을 받지 않으며 그 반대도 가능한, 아미노산 서열을 지칭한다. 링커 서열은, 개개 인자들의 3차 구조 형태를 유지하면서 2개의 인자가 서로 독립적으로 움직일 수 있는 임의의 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 길이 31개 미만인 유연한 링커 펩타이드이다. 더 바람직하게는, 링커 서열은 아미노산을 10개 미만으로, 5개 미만, 4개 미만 또는 2개 미만으로 포함한다. 일 구현예에서, 링커 서열은 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 2개 이상 포함한다. 다른 구현예에서, 링커는 폴리글리신 링커이다. 링커 서열에 대한 예시적인, 비-제한적인 예로는 SGGTSGSTSGTGST (서열번호 　5), AGSSTGSSTGPGSTT (서열번호 6), GGSGGAP (서열번호 7) 및 GGGVEGGG (서열번호 8)가 있다. 이들 서열은 다른 단백질에 대해 설계된 코일드 코일 (designed coiled coil) 결합용으로 사용되고 있다 (Muller, K.M. et al. Meth. Enzymology, 2000, 328:261-281). 바람직하게는, 링커 서열은 서열 GSGS (서열번호 2)를 포함한다. 당해 기술 분야에 공지된 그외 링커도 대안적으로 사용될 수 있다 (Reddy Chichili, VP., Kumar, V., and Sivaraman, J. (2013). Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Science 22(2):153-67).
따라서, 본 발명의 아데노바이러스는 헥손 단백질의 외표면 상에 알부민-결합 모이어티를 가지고 있어, 아데노바이러스의 캡시드는 알부민으로 덮히게 된다.
본원에서, 용어 "알부민"은 수용성 구상 단백질 (globular protein)로, 진한 염 용액에 보통 수준으로 용해되며, 열 변성을 겪는, 알부민 패밀리 단백질에 속하는 구성원을 지칭한다. 알부민은 혈장에서 일반적으로 발견된다. 혈청 알부민은 간에서 생산되며, 혈장에 용해되며, 포유류에서 가장 풍부한 혈액 단백질이다. 특히, "혈청 알부민"이라는 용어는 인간의 ALB 유전자 (UniGene Hs. 418167)로부터 코딩되는 구상 단백질을 지칭한다. 인간 혈청 알부민 단백질은 2014년 3월 19일에 등록된 수탁 번호 P02768의 Uniprot 데이타베이스 서열로 정의되는 단백질이다.
본원에서, 용어 "알부민-결합 모이어티"는, 알부민에 결합할 수 있는, 즉, 알부민 결합 친화성을 가진 임의의 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 혈청 알부민, 더 바람직하게는 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 용어 "알부민-결합 모이어티"로는, 비제한적인 예로, 천연 알부민-결합 도메인 (예, 박테리아 단백질에 존재하는 ABD) 및 합성 펩타이드 유래 알부민-결합 서열이 있다. 바람직한 구현예에서, 알부민-결합 모이어티는 스트렙토코커스 단백질 G 유래의 알부민-결합 도메인, 펩토스트렙토코커스 마그누스 (Peptostreptococcus magnus) 단백질 PAB 유래 알부민-결합 도메인, 코어 서열 DICLPRWGCLW (서열번호 9)를 가진 알부민-결합 펩타이드 및 이들의 기능적 등가 변이체로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서, 알부민-결합 도메인은 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유래된다.
용어 "알부민 결합 도메인"은 중화 항체로부터의 보호를 보장하기 위해 충분한 특이성으로 알부민에 결합할 수 있는 천연 단백질로부터 유래되는 임의 영역을 지칭한다.
본원에서, 용어 "스트렙토코커스 단백질 G 유래 알부민-결합 도메인" 또는 "스트렙토코커스 단백질 G 유래 ABD"는 3중-나선 번들을 형성하는 아미노산 잔기 46개로 이루어지며 (Kraulis P.J. et al. FEBS Lett, 1996; 378:190-4), 고 친화성으로 인간 및 마우스 알부민에 결합하지만 소 알부민에는 결합하지 않는 (Konig T. and Skerra A. J Immunol Methods, 1998; 218:73-83), 도메인을 지칭한다. 스트렙토코커스 단백질 G에는 알부민-결합 도메인이 여러개 존재한다. 바람직한 도메인에서, 알부민-결합 모이어티는 스트렙토코커스 단백질 G 유래의 알부민-결합 도메인 3이다. 바람직하게는, 스트렙토코커스 단백질 G 유래 알부민-결합 도메인 3의 서열은 서열번호 1이다.
본원에서, 용어 "펩토스트렙토코커스 마그누스 단백질 PAB 유래의 알부민-결합 도메인"은, 알부민에 결합할 수 있는 "GA 모듈"로 알려진 피네골디아 마그나 (Finegoldia magna, 종래에는 펩토스트렙토코커스 마그누스로 지칭됨)의 단백질 PAB 유래의 알부민-결합 도메인을 지칭한다 (Lejon S et al. 2004. J Biol Chem 279:42924-42928). 피네골디아 마그나의 단백질 PAB는 2004년 9월 9일에 등록된 수탁 번호 CAA54857.1의 GenBank 데이타베이스 서열로 정의되는 단백질이다.
본원에서, 용어 "코어 서열 DICLPRWGCLW (서열번호 9)를 가진 알부민-결합 펩타이드"는, Dennis MS et al. (J Biol Chem. 2002. 277:35035-35043)에 개시된 바와 같이 파지 클론 RA 및 SA로부터 유래된, 알부민에 결합하는 펩타이드를 지칭한다.
또한, 본 발명은 상기한 알부민-결합 모이어티의 기능적인 등가 변이체를 포함한다. 본원에서, 용어 "기능적으로 등가 변이체"는 하나 이상의 잔기의 삽입, 결손 또는 치환에 의해 알부민-결합 모이어티로부터 파생되며, 상기와 같이 결정된 바와 같이 알부민과 상호작용하는 능력을 실질적으로 유지하는, 임의의 폴펩트를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가, 서열번호 1의 알부민-결합 도메인의 알부민 결합력의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 알부민 결합력을 보인다면, 이 폴리펩타이드는 알부민-결합 모이어티의 기능적인 등가 변이체로 간주된다. 바람직하게는, 폴리펩타이드가, 서열번호 1의 알부민-결합 도메인과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효율로 항체를 중화할 수 있다면, 이 폴리펩타이드는 알부민-결합 모이어티의 기능적인 등가 변이체로 간주된다.
적합한 기능 변이체들은, 본 발명에 개시된 알부민-결합 도메인 또는 알부민-결합 서열에 대해, 적어도 25%의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성 수준을 나타내는 것이다. 2가지 폴리펩타이드 간의 동일성 수준은 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]을 이용해 결정되지만, 다른 유사한 알고리즘도 사용될 수 있다. BLAST 및 BLAST 2.0을 본원에 언급된 파라미터를 적용해 이용하여, 서열 동일성 %를 결정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다.
알부민-결합 모이어티의 기능적 등가 변이체는 알부민-결합 도메인 및 알부민-결합 서열의 유도체일 수 있다. 용어 "유도체"는, 비제한적인 예로, Johansson MU. et al. (J Biol Chem. 2002. 277:8114-8120), Jonsson A. et al. (Protein Eng Des Sel. 2008. 21: 515-527) 및 Linhult M. et al. (Protein Sci. 2002. 11:206-213)에 언급된 바와 같이, 알부민에 대한 친화성을 높이기 위해 변형된 박테리아 유래 알부민-결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 유도체는 Jonsson A. et al. (Protein Eng Des Sel. 2008. 21: 515-527)에 언급된 변형된 스트렙토코커스 G ABD ABD035일 수 있다.
재조합 아데노바이러스는 당해 기술 분야에 공지된 표준 분자 생물 기법을 통해 수득할 수 있다 (Chillon and Bosch. Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014)).
본 발명의 알부민-결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스는 Chillon 및 Bosch Adenovirus. Methods and Protocols. 3rd edition. Methods in Molecular Biology, vol. 1089. Springer Protocols. Humana Press. (2014); 및 Alemany R, Zhang W. Oncolytic adenoviral vectors. Totowa, NJ.: Humana Press, 1999에 언급된 바와 같이, 아데노바이러스 벡터 분야에서 표준적인 방법에 따라 증식 및 증폭된다. 유전자 테라피 및 바이로테라피 분야에서 일반적으로 사용되는 세포주는 HEK-293 세포주와 A549 세포주이다. 바람직한 증식 방법은 아데노바이러스의 복제를 허용하는 세포주에 감염시키는 것이다. 폐 선암종 A549 세포주가 그러한 세포주의 일 예이다. 증식은, 예를 들어, 다음과 같이 수행된다: A549 세포를 플라스틱 세포 배양 플레이트에 접종하고, 세포 당 바이러스 입자 100개를 감염시킨다. 2일 후, 세포가 탈착되어 "포도처럼" 클러스터를 형성할 때, 세포 변성 작용은 바이러스 생산을 입증한다. 세포를 시험관에서 회수한다. 이를 5분간 1000 g로 원심분리한 후, 세포 펠렛을 3번 냉동 및 해동하여, 세포를 파괴한다. 수득된 세포 추출물을 5분간 1000 g로 원심분리하고, 바이러스가 함유된 상층액 위에 세슘 클로라이드 농도 구배를 적층하여 1시간 동안 35000 g로 원심분리한다. 농도 구배에 의해 수득되는 바이러스 밴드를 수집하여, PBS-10% 글리세롤로 투석한다. 투석한 바이러스를 분액하여 -80℃에 보관한다. 바이러스 입자 수와 플라그-형성 단위를 표준 프로토콜에 따라 정량한다. 5% 글리세롤이 첨가된 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)는 아데노바이러스를 저장하는데 사용되는 표준 제형이다. 그러나, 바이러스의 안정성을 향상시키는 다른 제형도 개시되어 있다.
암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 알부민-결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스의 정제 방법은 암의 바이로테라피와 유전자 테라피에 사용되는 다른 아데노바이러스와 아데노바이러스 벡터에 대해서도 동일하게 적용된다.
아데노바이러스는 비정상 세포, 예를 들어 생체내에서 유해하거나 또는 원치않은 임의의 세포를 표적하는데 사용될 수 있다. 광범위한 예로는 자가면역 질환, 재협착증 및 흉터 조직 형성을 야기하는 세포가 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 생체내에서 소정의 조직에 선택적으로 분산될 수 있어, 비-표적 또는 비-종양 조직에서의 발현을 회피하거나 또는 현저하게 줄일 수 있다.
본 발명의 복제 아데노바이러스는 세포에 선택적인 복제를 부여하는 변형을 게놈 서열에 가질 수 있다. 아데노바이러스의 발현이 필요한 조직 또는 치료할 종양 조직에 아데노바이러스의 발현을 인가하기 위해, 본 발명의 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 아데노바이러스는 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함한다.
바람직한 구현예에서, 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터는, E1a, E1b, E2 및 E4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위한 프로모터 서열이다. 바람직하게는, 프로모터는 E1a의 발현을 조절한다.
본원에서, 용어 "프로모터"는 당업계에서 이해되는 의미에 따라 사용된다. 이는 RNA 중합효소에 결합하여 효소를 올바른 전사 개시 사이트로 향하게 하는, 유전자의 코딩 서열의 통상 상류에 위치한 DNA 영역을 의미하는 것으로 의도된다. 프로모터는 복제를 개시하는 바이러스 유전자를 제어한다.
용어 "조직-특이"는, 복제에 필수적인 유전자가 작동가능하게 연결된 프로모터가 조직 특이적으로 기능하여 조직에서 복제를 진행한다는 의미로 의도된다. 이는 프로모터를 활성화하는 파지티브 전사 인자가 그 조직에 존재하고 비-표적 조직에는 존재하지 않음으로써, 발생할 수 있다. 또한, 이는 비-표적 조직에서 정상적으로 형성되어 프로모터의 결과로서 전사를 방지하는, 전사 저해 인자의 부재로 인해 발생할 수 있다. 따라서, 전사가 이루어질 때, 표적 조직에서 벡터의 복제 및 이의 수반 기능이 이루어지도록, 복제에 필수적인 유전자 쪽으로 향하게 된다.
조직 특이성은 특히 조직의 정상적인 대응체 (counterpart)는 회피하면서 특정 조직의 비정상적인 대응체를 표적화하거나, 또는 비정상 조직을 치료하면서 비정상 조직 이외의 다른 타입의 주변 조직을 회피하는 것과 관련있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 "종양-특이적"이며, 이는 프로모터가 종양 조직에서 특이적으로 기능한다는 의미이다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 간으로의 전이를 치료하는데 유용하다. 구체적인 일 예는 간으로 종종 전이되는 대장암이다. 대장암이 간으로 전이되는 경우, CEA 프로모터는 전이 세포에서는 활성이지만, 정상적인 간 세포에서는 그렇지 않은 것으로 확인된 바 있다. 그에 따라, 정상적인 인간 성체의 간은 대장암 CEA-특이적 프로모터에 연결된 복제에 필수적인 바이러스 유전자를 가진 바이러스의 복제를 지원하지 못할 것이다. 복제는 원발성 암 세포에서 이루어져야 한다. 다른 예는 간세포암에서만 활성을 가지는 알파페토프로테인 프로모터이다. 다른 예는 흑색종에서만 활성을 나타내고 정상 피부에서는 활성을 나타내지 않는 티로시나제 프로모터이다. 각 경우에, 복제는 비정상 세포에서는 예상되며, 정상에서는 그렇지 않다.
조직-특이적 프로모터의 예로는, 비제한적으로, 알파페토프로테인 프로모터, DE3 프로모터, 티로시나제 프로모터, 암태아성 항원 (CEA) 프로모터, 계면활성제 단백질 프로모터, E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, COX-2 프로모터, 알부민 유전자 프로모터, 간염 바이러스의 코어 프로모터, 티록신 및 ErbB2 프로모터에 결합하는 글로불린-결합 단백질의 프로모터가 있다.
바람직한 구현예에서, 프로모터는 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, 알파페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 아데노바이러스는 특히 암 치료에 유용하다. 모든 종양은 본 발명의 아데노바이러스를 이용한 치료로 잠재적으로 치료가능하다. 종양 타입으로는, 비제한적으로, 조혈, 췌장, 신경, 간, 위장관, 내분비, 담관, 동폐성 (sinopulmonary), 두경부, 연조직 육종 및 암종, 피부, 생식기 등이 있다. 바람직한 치료 종양은 정상 조직에 비해 세포분열 지수 (mitotic index)가 높은 종양, 바람직하게는 고형 종양이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이다.
본원에서, 용어 "종양분해성 아데노바이러스"는, 심지어 선택성 없이, 종양에서 복제-가능 (replication-competent)하거나 또는 복제할 수 있는 임의의 아데노바이러스를 지칭한다. 종양분해성 아데노바이러스의 치료 작용은 복제하여 소거할 종양 세포를 세포 분해하는 능력에 기초한다. 종양 세포의 사멸은 생존 세포의 수 측정, 세포변성 효과, 종양 세포의 세포자살, 종양 세포에서의 (예, 대사 표지, 바이러스 단백질의 웨스턴 블롯 또는 복제에 필요한 바이러스 유전자의 역 전사를 이용한 PCR) 바이러스 단백질 합성 또는 종양 크기 축소 등의, 임의의 최신 방법에 의해 검출할 수 있다.
종양에서 선택적인 복제를 달성하기 위한 또 다른 전략은, 종양 세포엔 필요하진 않지만 정상 세포에서는 복제에 필수적인 바이러스 기능을 없애는 것이다. 이는, 예를 들어, 망막모세포종 (pRB)의 경로를 차단하는 초기 E1A 기능의 결손을 포함한다. 이러한 돌연변이의 선택적인 복제는 몇가지 종래 문헌들에서 확인된 바 있다. E4 및 E4orf6/7 등의 pRB와 직접 상호작용하는 그외 바이러스 유전자가 종양 세포에서 선택적인 복제를 달성하기 위해 제거될 후보 인자이다.
종양에서 선택적인 복제를 달성하기 위해 언급되는 또 다른 변형은 바이러스-조합 RNA (VA-RNA)를 코딩하는 아데노바이러스 유전자의 결손이다. 이들 RNA는 인터페론의 항바이러스 활성을 차단하므로, 이의 결손으로 아데노바이러스는 인터페론 저해에 민감하게 된다. 종양 세포에서는 인터페론 경로의 특징적인 끊김으로 인해, 이들 아데노바이러스는 종양에서 정상적으로 복제한다.
따라서, 다른 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는, 종양에서 선택적인 복제를 달성하기 위해, E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 더 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 E1a에서의 돌연변이이다. 바람직한 구현예에서, E1a에서의 돌연변이는 E1A와 pRB의 상호작용에 영향을 미치는 E1A 단백질의 일부 아미노산, 바람직하게는 폴리펩타이드 체인의 아미노산 121-129의 결손 (Δ24 결손)이다.
본원에서, "선택적인 복제"라는 표현은, 아데노바이러스가 정상 세포 보다 종양 세포에서 더 높은 복제 효율을 가진다는 것을 의미한다 (예, 정상 세포에 비해 1000배 높음).
본원에서, 용어 "복제"는 감염성 바이러스 입자 수준에서 또는 핵산 수준에서 이루어지는 아데노바이러스 벡터의 복사를 지칭한다. DNA 바이러스의 경우, 헥산 수준에서의 복제는 DNA 복제이다. 그러나, 복제는 또한 감염성 DNA 바이러스 입자의 형성을 포함한다.
아데노바이러스의 복제는 널리 공지된 기법으로 평가할 수 있다. 세포에서 아데노바이러스 벡터의 복제에 대한 평가는 일반적으로 폴리뉴클레오티드, 비리온 또는 감염성 바이러스의 검출을 수반한다. 이런 목적으로 사용될 수 있는 널리-공지된 다양한 방법들은 소정의 기간 동안 세포에서 폴리뉴클레오티드에 병합된 표지된 물질의 정량화를 수반한다.
복제가 DNA 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 경우, 3H-티미딘은 종종 표지된 물질로서 사용된다. 이 경우, 복제 정도는 다량의 세포 DNA로부터 벡터 DNA를 분리하고, 벡터 DNA에 특이적으로 병합된 삼중 수소의 양을 측정함으로써 결정된다.
또한, 폴리뉴클레오티드 벡터의 복제는, 세포를 세포분해하거나 또는 투과화 (permeating)하여 폴리뉴클레오티드를 방출시킨 다음 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 회수되는 DNA 또는 RNA를 직접 정량함으로써, 검출할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 복제는 분석하는 폴리뉴클레오티드에 특이적인 프라이머를 이용한 정량적인 PCR에 의해 검출할 수 있다.
비리온은, 당업계에 널리 공지된 전자 현미경 카운팅 기법에 의해, 비리온을 단리하여 단백질 및 핵산 함량을 측정함으로써, 그리고 바이러스 게놈 폴리뉴클레오티드 또는 비리온 단백질을 표지하고 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 양으로부터 비리온의 양을 측정함으로써, 분석할 수 있다.
종양 세포에 대한 아데노바이러스의 선택성을 달성하기 위한 또 다른 전략은, 아데노바이러스가 종양 세포에 존재하는 수용체를 표적하도록 숙주 세포의 감염과 관련된 바이러스의 캡시드 단백질을 변형하는 것이다. 세포 감염을 위해 바이러스가 이용하는 캡시드 단백질을 변형하는 방법은, 또한, 아데노바이러스의 감염성을 높이기 위해 (즉, 세포내 바이러스의 유입을 증가시키기 위해) 적용할 수 있다. 아데노바이러스의 종양 표적화는, 또한 한쪽 말단은 바이러스에 결합하고 다른 말단은 종양 수용체에 결합하는 이중 기능성의 리간드로 달성될 수 있다.
따라서, 다른 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 종양 세포에 존재하는 수용체로 이를 표적화하거나 또는 감염성을 높이기 위한 캡시드 변형을 더 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 캡시드의 변형은 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프내 RGD 모티프 (아르기닌-글리신-아스파라긴 모티프)의 삽입이다. 이 삽입은, 아데노바이러스가 인테그린을 이용해 세포에 도킹하게 할 뿐만 아니라 야생형 아데노바이러스의 사례에서와 같이 내재화될 수 있게 한다. 인테그린을 바이러스의 세포 수용체로서 사용하면 감염성과 종양분해 효과가 증가한다. 다른 구현예에서, 종양분해성 아데노바이러스는, 아데노바이러스의 KKTK (서열번호 10) 헤파란 설페이트 결합 도메인의 도메인 RGDK (서열번호 11)로의 치환에 의해 변형된 캡시드를 가진다 (N. Bayo et al. Human Gene Therapy 2009, 20:1214-21). 아데노바이러스를 이용해 표적 세포의 감염성을 높이는 또 다른 전략은 다른 혈청형으로부터 유래된 상동적인 영역으로 섬유 부분을 치환하는 것이다. 통상적으로 혈청형 5로부터 유래된 인간 아데노바이러스의 섬유 샤프트 (fiber shaft) 및 노브 (knob)는 인간 혈청형 3 또는 35 아데노바이러스의 섬유 샤프트 및 노브로 치환된 바 있다. 다른 혈청형으로부터 유래된 게놈을 가진 제조된 재조합 아데노바이러스는 키메라 아데노바이러스로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 키메라 캡시드를 더 포함한다. 바람직한 다른 구현예에서, 캡시드의 변형은 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 상동적인 부분으로 섬유 유전자의 부분을 변형시켜, 키메라 아데노바이러스를 제조하는 것이다.
바람직한 구현예에서, 종양분해성 아데노바이러스는 E1a와 pRB의 상호작용에 영향을 미치는 폴리펩타이드의 아미노산 121-129가 결손된 (Δ24 결손) E1A 단백질의 돌연변이 버전, E1a의 발현을 조절하기 위한 E1a의 내인성 프로모터내 4개의 E2F 결합 사이트와 1개의 Sp1 결합 사이트의 삽입 및 마지막으로 바이러스의 감염성을 높이기 위한 아데노바이러스 섬유내 RGD 펩타이드의 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양-선택적인 복제성 아데노바이러스이다. ICOVIR15-ABD는 본 발명의 바람직한 구현예이다. 상기한 변형은 동일한 아데노바이러스에 조합하여 존재하거나 또는 각각 분리되어 존재할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 종양분해성 아데노바이러스는 E1A와 pRB의 상호작용에 영향을 미치는 E1A 단백질의 일부 아미노산 결손, 바람직하게는 폴리펩타이드의 아미노산 121-129의 결손 (Δ24 결손)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양-선택적인 복제성 아데노바이러스이다.
바람직한 다른 구현예에서, 종양분해성 아데노바이러스는, E1a의 발현을 조절하기 위해 E1a의 내인성 프로모터에 4개의 E2F 결합 사이트와 1개의 Sp1 결합 사이트의 포함을 특징으로 하는, 종양-선택적인 복제성 아데노바이러스이다.
바람직한 다른 구현예에서, 종양분해성 아데노바이러스는, 바이러스의 감염성을 높이기 위해 아데노바이러스 섬유내 RGD 펩타이드의 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양-선택적인 복제성 아데노바이러스이다.
또한, 아데노바이러스의 게놈은, 이종의 유전자가 감염된 세포에서 발현되도록 치료 단백질을 코딩하는 이종의 유전자를 포함할 수 있다. 본원에서, 치료 단백질은 주어진 세포에서 발현되었을 때 일부 치료학적 이점을 제공하는 것으로 예상되는 단백질을 지칭한다. 상기한 이종의 유전자 산물은 복제성 또는 복제불가 아데노바이러스에 포함될 수 있다. 삽입되는 치료 유전자는 유전자 테라피 또는 백신면역화에 사용되는 임의의 유전자일 수 있다. 바람직하게는, 이종의 유전자는 암 유전자 테라피에 사용된다. 종양분해성 아데노바이러스의 게놈에 치료 유전자를 삽입하면, 종양 세포에 대한 종양분해성 아데노바이러스의 세포독성을 증가시킨 "무장한 종양분해성 아데노바이러스"가 만들어진다. 예를 들어, 상기한 이종의 유전자는 특히 종양 세포의 사멸을 발생시키고, 혈관신생을 저해하고, 세포외 기질을 없애고, 세포자살을 유도할 수 있다. 이러한 경우에, 치료 유전자의 발현 방식과 시기는 치료학적 접근의 최종 결과에 중요할 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 아데노바이러스는 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자 (non-adenoviral gene)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 그 유전자는 유전자 테라피 또는 백신면역화에 사용되는 유전자이다. 더 바람직한 구현예에서, 그 유전자는 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자이다. 바람직하게는, 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자는 적어도 프로드럭-활성화 유전자, 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자이다.
본원에서, 용어 "비-아데노바이러스성 유전자"는 야생형 아데노바이러스의 게놈에 존재하지 않는 이종의 유전자를 지칭한다.
본원에서, 용어 "유전자 테라피에 사용되는 유전자"는 치료 DNA를 환자의 세포로 전달함으로써 유전성 또는 후천성 질환 또는 병증을 예방 또는 치료하기 위한 약물로서 사용될 수 있는 유전자를 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 유전자 테라피는 치료 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하거나 또는 돌연변이된 유전자를 치환하기 위해 기능성 치료 유전자를 코딩하는 DNA를 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어, DNA는 치료학적인 가치가 있는 효소, 호르몬, 수용체 또는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 유전자 테라피에 의한 치료에 적합한 질환의 치료에 사용될 수 있는 임의의 유전자가 본 발명의 아데노바이러스의 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 유전자 테라피에 사용되는 유전자는, 비제한적인 예로, 효소 코딩 유전자, 혈액 유도체, 호르몬, 인터루킨, 인터페론, TNF, 성장인자, 신경전달물질 또는 이들의 전구체 또는 합성 효소, 영양성 인자 (trophic factor), 즉 BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포지단백질 (apolipoprotein), 즉 ApoAI, ApoAIV, ApoE 등; 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (minidystrophin); 종양-억제인자 유전자, 즉, p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev; 응고에 참여하는 인자의 코딩 유전자, 즉, 인자 VII, VIII, IX; 프로드럭-활성화 유전자, 즉, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제; 천연 또는 인공 면역글로불린 (Fab, ScFv 등) 전체 또는 일부일 수 있다. 또한, 치료 유전자는, 표적 세포에서 발현되어 세포성 mRNA의 발현 또는 전사를 제어할 수 있는, 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다.
본원에서, 용어 "백신면역화에 사용되는 유전자"는 예방 또는 치료 백신의 제조 목적으로, 인간 또는 동물에서 면역반응을 일으킬 수 있는, 항원성 펩타이드를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 이러한 항원성 펩타이드는, 비제한적인 예로, 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스, 슈도광견병 바이러스 및 종양-특이 펩타이드에 특이적인 것일 수 있다.
본원에서, 용어 "프로드럭-활성화 유전자"는 무독성 프로드럭에 작용하여 무독성 프로드럭을 표적 조직에 독성인 형태로 변환시키는 산물의 코딩 유전자를 지칭한다. 바람직하게는, 독소는 항-종양 활성을 가지거나 또는 세포 증식을 중단시킨다.
프로드럭-활성화 유전자의 예로는, 비제한적인 예로, 티미딘 키나제 유전자를 포함한다. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제는 간시클로비르를 인산화하여, 뉴클레오티드 독소인 간시클로비르 포스페이트를 만든다. 이 화합물은 체인 종결자 (chain terminator) 및 DNA 중합효소 저해제로서 기능하여, DNA 합성을 방지하며, 따라서 세포독성이다. 일 구현예에서, 프로드럭-활성화 유전자는 티미딘 키나제 유전자이며, 바람직하게는, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제, 사이토메갈로바이러스의 티미딘 키나제 및 바리셀라-조스터 (varicella-zoster) 바이러스의 티미딘 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스의 티미딘 키나제이다. 바이러스 티미딘 키나제가 사용되는 경우, 상호작용제 또는 화학요법제는, 바람직하게는 뉴클레오시드 유사체이며, 예를 들어, 간시클로비르, 어시클로비르 및 1-2-데옥시-2-플루오로-D-아라비노푸라노실-5-요오도우라실 (FIAU)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이다. 이러한 상호작용제는 기질로서 바이러스 티미딘 키나제에 의해 효율적으로 이용되며, 따라서 이러한 상호작용제는 바이러스 티미딘 키나제를 발현하는 종양 세포의 DNA에 치사 수준으로 병합되어, 표적 세포의 사멸을 야기한다. 다른 구현예에서, 프로드럭-활성화 유전자는 시토신 데아미나제이다. 시토신 데아미나제는 5'-플루오로시토신을 세포독성이 높은 항암제 5'-플루오로우라실로 변환한다. 따라서, 시토신 데아미나제 유전자를 발현하는 표적 세포는 5-플루오로시토신을 5-플루오로우라실로 변환하게 되며, 따라서 죽게된다. 이러한 "자살" 유전자에 대한 내용은 Blaese, R. M. et al., Eur. J. Cancer 30A:1190-1193 (1994)을 참조한다.
본원에서, 용어 "종양-억제인자 유전자"는 세포가 암으로 가는 경로에서 한 단계를 방지하는 항암 유전자 또는 유전자를 지칭한다. 이들 유전자들 중 하나가 기능 소실 또는 감소를 유발하도록 돌연변이되면, 세포는 통상적으로 다른 유전자적 변화와 조합되어 암으로 진행할 수 있다.
종양-억제인자 유전자에 대한 예로는, 비제한적인 예로, TP53 유전자, PTEN, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7 및 ST14에 의해 코딩되는 p53 종양-억제인자 단백질이 있다.
본원에서, 용어 "항종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자"는 종양을 치료하기에 치료학적으로 유용한 RAN 분자, 즉 siRNA를 코딩하는 유전자를 지칭한다 (Dorsett and Tuschl (2004) Nature Rev Drug Disc 3:318-329). 일부 사례에, 이 유전자는 단핵세포/대식세포 계통의 세포를 박멸하는 아데노아비러스의 능력을 추가로 강화하기 위해, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 병합시킬 수 있지만, 세포 자체에는 어떠한 직접적인 영향을 미치지 않는다. 이러한 것으로는, MHC 클래스 I 제시를 어렵게 할 수 있는 인자들의 활성화 저해, 보체 차단, IFN 및 IFN-유발성 기전, 케모카인 및 사이토카인의 저해, NK 세포성 사멸, 면역 반응 (예, IL-10, TGF-Beta)과 메탈로프로테아제를 하향 조절하여 세포외 기질의 파괴, 종양내 바이러스의 전파 강화를 수행할 수 있는, siRNA를 코딩하는 유전자가 있다.
본원에서, 용어 "면역자극성 유전자"는 면역계를 종양에 대해 활성화하는 유전자를 지칭한다. 이종의 유전자 또는 그 단편에 대한 추가적인 예로는, 사이토카인 또는 케모카인 등의 면역조절 단백질을 코딩하는 것이 있다. 그 예로는 미국 특허 4,738,927 또는 5,641,665의 인터루킨 2; 미국 특허 4,965,195 또는 5,328,988의 인터루킨 7; 및 미국 특허 5,457,038의 인터루킨 12; 미국 특허 4,677,063 또는 5,773,582의 종양 괴사 인자 alpha; 미국 특허 4,727,138 또는 4,762,791의 인터페론 gamma; 또는 미국 특허 5,393,870 또는 5,391,485의 GM CSF (Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8:119-128) 등이 있다.
아데노바이러스의 게놈내 변형들은 서로를 배제하지 않는다.
본 발명의 아데노바이러스 게놈
또한, 본 발명은 아데노바이러스의 게놈에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 헥손 단백질의 과가변부 1 (HVR1)의 코딩 영역에 삽입된 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하며, 헥손 단백질과 알부민-결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질의 발현을 야기하며, 알부민-결합 모이어티가 헥손 단백질이 아데노바이러스 캡시드로 조립될 때 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 게놈에 관한 것이다.
본원에서, "아데노바이러스 게놈"이라는 표현은, 적절한 단백질의 존재 하에 패킹되어 완전한 아데노바이러스 입자를 구축할 수 있는 이중 가닥의 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 패킹이 이루어지기 위해서는, 서열은 일부 조건들을 충족하여야 하는데, 다음과 같이 요약할 수 있다:
- 양 말단 각각에 하나의 분리된 아데노바이러스 ITR 존재;
- ITR과 천연적으로 이들 사이에 존재하는 서열내 패킹 신호 사이에 서열의 도입은 아데노바이러스 게놈의 패킹 능력을 떨어뜨려, 심지어 패킹에 필요한 시간에 유의한 변화가 없더라도 수득되는 아데노바이러스 입자의 총 수의 감소를 유발하기 때문에, 패킹 신호 Psi의 5' 말단과 이와 가장 가까운 ITR의 3' 말단 사이의 거리가 천연 아데노바이러스의 패킹을 방해하는 거리, 인간 혈청형 5 아데노바이러스의 경우에 200 bp 거리이며, 다른 혈청형의 경우에는 유사하게 대략 동일한 것으로 추정되는 거리를 넘지 않는 방식으로 위치되는, 양쪽 ITR 사이에 패킹 신호 Psi를 포함함;
- 양쪽 ITR 말단 사이 거리는, 캡시드를 형성하게 될 단백질이 천연적으로 존재하는 아데노바이러스 게놈 크기 보다 105%를 넘지 않아야 함.
아데노바이러스 게놈은 바람직하게는 바이러스 복제에 필요한 한가지 이상의 유전자 기능에 결핍을 가지고 있어, "복제-결핍성 (replication-deficient)" 아데노바이러스 벡터가 된다. "복제-결핍성"은, 아데노바이러스 벡터에 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능이 결핍된 (즉, 아데노바이러스 벡터가, 전형적인 숙주 세포, 특히 본 발명에 따른 치료시 아데노바이러스 벡터에 감염될 수 있는 인간 환자의 숙주 세포에서는 복제되지 않음) 아데노바이러스 게놈을 포함한다.
더 바람직하게는, 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 아데노바이러스 게놈 영역의 한가지 이상의 복제-필수 유전자 기능이 결핍된 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 이런 점에서, 아데노바이러스 벡터는, 바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 게놈의 E4 영역 또는 E1 영역의 한가지 이상의 필수 유전자 기능에 결핍이 존재한다. E1 영역에서의 결핍 외에도, 재조합 아데노바이러스는 또한 주요 후기 프로모터 (MLP)에 돌연변이를 가질 수 있다. 더 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역과 적어도 일부 E3 영역 (예, E3 영역의 XbaI 결손)의 한가지 이상의 필수 유전자 기능에 결핍이 존재한다. E1 영역과 관련하여, 아데노바이러스 벡터는 적어도 일부 E1a 영역과 적어도 일부 E1b 영역에 결핍 (예, 결손)이 존재할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E3 영역의 일부와 전체 E1 영역 (즉, 뉴클레오티드 355에서 3,511 및 28,593에서 30,470)에 결손이 존재할 수 있다. 단독-결핍성 아데노바이러스 벡터 (singly-deficient adenoviral vector)는 (아데노바이러스 혈청형 5의 게놈을 기준으로) 뉴클레오티드 약 356에서 3,329와 28,594에서 30,469가 결손될 수 있다. 다른 예로, 아데노바이러스 벡터 게놈은 (아데노바이러스 혈청형 5 게놈을 기준으로) 대략적으로 뉴클레오티드 356에서 3,510 및 28,593에서 30,470이 결손되어, 아데노바이러스 게놈의 E1, E3 및 E4 영역이 제거된 아데노바이러스 벡터가 구축될 수 있다.
본원에서, 유전자, 유전자 기능 또는 유전자 또는 게놈 영역에서 결핍 (deficiency)은, 전부 또는 일부 제거된 핵산 서열을 가진 유전자의 기능을 손상시키거나 또는 없애기 위해 바이러스 게놈의 충분한 유전자 물질을 제거하는 것으로서 정의된다. 흔히 전체 유전자 영역의 제거가 복제-필수 유전자 기능을 파괴하기 위해 필요한 것은 아니다. 그러나, 하나 이상의 트랜스유전자에 대한 충분한 공간을 아데노바이러스 게놈에 제공할 목적으로, 유전자 영역 대부분의 제거가 바람직할 수 있다. 유전자 물질의 제거가 바람직하지만, 부가 또는 치환에 의한 유전자 물질의 돌연변이 또한 유전자의 기능을 파괴하는데 적절하다. 복제-필수 유전자 기능은 복제 (예, 증폭)에 필수적인 유전자 기능이며, 예를 들어 아데노바이러스 초기 영역 (예, E1, E2 및 E4 영역), 후기 영역 (예, L1-L5 영역), 바이러스 패킹에 참여하는 유전자 (예, IVa2 유전자) 및 바이러스-관련 RNA (예, NA-RNA-1 및/또는 NA-RNA-2)에 의해 코딩된다.
또한, 아데노바이러스 벡터는, 기본적으로, ITR 및 패킹 서열을 제외하고, 전체 아데노바이러스 게놈이 제거될 수 있다. 이러한 벡터들은 gutless 또는 헬퍼-의존적인 아데노바이러스 벡터로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이 경우, 알부민 결합 모이어티를 포함하도록 변형된 헥손 서열은 헬퍼 아데노바이러스에 의해 공급된다. ITR 및 패킹 서열을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 5' 또는 3' 영역은, 바이러스 게놈의 나머지 부분과 동일한 아데노바이러스 혈청형으로부터 기원하여야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 아데노바이러스 혈청형 5 게놈의 5' 영역 (즉, 아데노바이러스 E1 영역의 5' 게놈 영역)은 아데노바이러스 혈청형 2 게놈의 대응되는 영역으로 치환될 수 있다 (예, 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 5' Ad5 게놈 영역은 Ad2 게놈의 뉴클레오티드 1-456으로 치환됨). 그러나, 본 발명의 방법에 따른 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 게놈의 결핍은 바람직하게는 아데노바이러스 게놈의 초기 영역에 의해 코딩되는 복제-필수 유전자 기능으로 한정된다.
본 발명에서, 인버티드 말단 리피트 (inverted terminal repeat) 또는 ITR은, 아데노바이러스의 선형 게놈의 양측에 위치하며 아데노바이러스 게놈의 복제에 필수적인, 약 100 bp의 서열로서 이해된다 (Stow, N.D., 1982, Nucl. Acid. Res, 10:5105-5109).
본 발명에서, 아데노바이러스 패킹 신호 ψ는, 약 160 bp 길이의 서열로서 이해되는데, 혈청형 2 및 5의 아데노바이러스의 경우에는 게놈의 190번 위치에서 350번 위치까지 연장되는 길이의 서열로 이해된다. 아데노바이러스 게놈의 서열 제거는, 바이러스의 증폭 중에 형성되는 DNA 분자가 최근에 생긴 캡시드에 효율적으로 병합되지 않도록 방지하지만 (Hearing, P. et al., 1987, J. Virol., 61:2555-2558), ITR의 제거와는 다르게, 패킹 중인 세포에서의 상기 게놈의 복제는 방지하진 못한다.
본 발명의 아데노바이러스에 대해 개시된 모든 구현예들은 본 발명의 아데노바이러스 게놈에 적용가능한다.
특히, 일 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 인간 아데노바이러스로부터, 바람직하게는 인간 아데노바이러스 혈청형 1 - 57로부터, 더 바람직하게는 혈청형 5로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 알부민-결합 모이어티는 스트렙토코커스 단백질 G 유래 알부민-결합 도메인, 펩토스크렙토코커스 마그누스 단백질 PAB 유래 알부민-결합 도메인, 코어 핵산 서열 DICLPRWGCLW (서열번호 9)를 가진 알부민-결합 펩타이드 및 이들의 기능적 등가 변이체로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서, 알부민-결합 모이어티는 스트렙토코커스 단백질 G 유래의 알부민-결합 도메인 3, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 가지는 알부민-결합 도메인 3이다.
다른 구현예에서, 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열은, 제조되는 융합 단백질이 GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링에 따른 헥손 단백질의 D150 아미노산 다음에 알부민-결합 모이어티를 포함하도록, 삽입된다. 바람직한 구현예에서, HVR1에 삽입된 ABD (ABD-HVR1)를 가진 완전한 변형된 아데노바이러스 헥손의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3이다.
다른 구현예에서, 알부민-결합 모이어티의 N- 및/또는 C-말단은 링커 서열, 바람직하게는 서열 GSGS (서열번호 2)를 포함하는 링커 서열을 통해 헥손 단백질에 연결된다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함한다. 바람직한 구현예에서, 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터는 E1a, E1b, E2 및 E4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위한 프로모터 서열; 더 바람직하게는 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, alpha-페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터이다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이며, 바람직하게는 아데노바이러스 게놈이 종양에서의 선택적인 복제를 달성하기 위해 E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 더 포함하는, 아데노바이러스이다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은, 아데노바이러스 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위해 캡시드 변형을 더 포함한다. 바람직하게는, 캡시드의 변형은 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프에 RGD 모티프를 삽입하는 것이다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은, 다른 혈청형 유래 게놈의 상동적인 영역으로 치환된 게놈의 단편 또는 영역을 포함하는, 하나의 소정의 혈청형으로부터 유래되는 키메라 아데노바이러스 게놈이다. 바람직하게는, 이러한 키메라 아데노바이러스는, 다른 혈청형, 바람직하게는 인간 아데노바이러스 3 또는 인간 아데노바이러스 35로부터 유래되는 상동적인 영역으로 치환된 섬유 유전자의 일부를 포함하는, 혈청형 5로부터 파생되는 인간 아데노바이러스이다. 바람직한 구현예에서, 캡시드의 변형은, 섬유 유전자의 일부를 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여, 키메라 아데노바이러스를 형성하는 것이다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 그 게놈에 삽입되는 추가의 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 유전자는 유전자 테라피 또는 백신면역화에 사용된다. 바람직하게는, 상기 유전자는 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자이며, 더 바람직하게는 적어도 프로드럭-활성화 유전자, 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자이다.
본 발명의 조성물
본 발명의 재조합 아데노바이러스를 사용해 약학적 조성물을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스를 치료학적인 유효량으로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "약학적 조성물"이라는 표현은, 세포, 세포 그룹, 장기, 조직 또는 유기체에 하나 또는 수종의 치료학적으로 유용한 물질을 소정의 양으로 투여하는데 적합한 제형을 지칭한다.
재조합 아데노바이러스는 유효량으로 투여된다. "치료학적인 유효량"은 치료학적 효능을 제공할 수 있는 양으로 이해되며, 이는 통상적으로 사용되는 수단을 통해 당해 기술 분야의 당업자가 결정할 수 있다. 유효량은 치료 중인 구체적인 병태, 치료 중인 개체의 연령과 신체 상태, 병태의 중증도, 치료 기간, (만약 존재한다면) 병용 또는 조합 치료의 특성, 구체적인 투여 경로 및 건강한 실무자의 상식 및 전문 지식 범위내에서의 유사 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 최고 용량으로, 즉 유효한 의학적 평가에 따른 최고 안전 용량으로 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 개체가 암에 걸린 경우, 유효량은 (예, 종양 이미징에 의해 측정되는) 종양 체적 또는 로드 (load)를 줄이는 양일 수 있다. 유효량은 또한 혈중 또는 기타 체액 또는 조직 (예, 생검)에서 암 세포의 존재 및/또는 빈도에 의해 평가할 수 있다. 종양이 조직 또는 장기의 정상적인 기능에 영향을 미친다면, 유효량은 그 조직 또는는 장기의 정상적인 기능 발휘를 측정함으로써 평가할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 투여량을 또한 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 and from Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493의 지침에 따라 결정할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 약리학적/독성학적 관점에서 환자에게, 그리고 조성물, 제형, 안정성, 환자 수용성 및 생체이용성과 관련된 물리적/화학적 관점에서 의약품 조제 화학자에게 허용가능한 임의 타입의 무-독성, 불활성 고체, 반고체 또는 액체의 충진제, 희석제, 캡슐화제 또는 제형 보조제를 의미한다. Remington's Pharmaceutical Sciences. Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, Pa., 1995는 약학적 조성물의 제형화에 사용되는 다양한 담체들과 이의 조제를 위한 공지된 기법들을 기술하고 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있는 물질에 대한 일부 예로는, 비제한적으로, 락토스, 글루코스 및 슈크로스 등의 당; 옥수수 전분 및 감자 전분 등의 전분; 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트 등의 셀룰로스 및 이의 유도체; 트라가칸트 분말; 몰트 (malt); 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩 오일, 면실유; 홍화 오일; 참깨 오일; 올리브 오일; 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜, 예로, 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 디터전트 (detergent), 예컨대 TWEEN™ 80; 완충화제, 예컨대, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 발열원 제거 수 (pyrogen-free water); 등장성 염수; 링거액; 에틸 알코올; 및 포스페이트 완충제 용액이 있으며, 아울러 그외 무독성의 혼용가능한 윤활제, 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 및 착색제, 이형제 (releasing agent), 코팅제, 감미제, 향미료 및 향제, 보존제 및 항산화제 역시 조제자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다. 여과 또는 그외 최종 멸균 방법이 실행불능가하다면, 제형은 무균 조건 하에 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 경로 및 비경구 경로 등의 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 주입 (예, 정맥내, 피하, 근육내 또는 복막내 주입)에 의해 투여할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 이를 필요로 하는 개체에게 전신으로, 예를 들어 IV 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 주사용 조제물, 예를 들어, 무균 주사용 수성 또는 유성 현탁제는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용해 당업계에 공지된 바에 따라 제형화할 수 있다. 또한, 무균 주사용 조제물은 무독성의 비경구 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 무균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있으며, 예를 들어 1,3-부탄다이올 중의 용액일 수 있다. 특히 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거액, U.S.P., 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이다. 아울러, 무균성 비휘발성 오일 (fixed oil)은 통례적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적으로, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드 등의 임의 블랜드의 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 아울러, 올레산 등의 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 일 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 1 % (w/v) 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 및 0.1% (v/v) TWEEN™ 80을 포함하는 담체 유체 중에 현탁된다. 주사용 제형은, 예를 들어, 세균-체류 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 전에 무균수 또는 기타 무균 주사용 매질 중에 용해 또는 분산시킬 수 있는 무균 고체 조성물 형태에 살균제를 첨가함으로써, 살균할 수 있다.
조성물은 단독 제제로서 또는 다른 치료 제제와 조합하여 재조합 아데노바이러스를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 조성물은, 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 암 유전자 테라피에 사용되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 또는 종양분해성 아데노바이러스를 포함한다. 이러한 특정한 경우에, 조성물은, 이 아데노바이러스를, 항-종양을 위한 단일 물질로서, 또는 화학요법제 또는 삽입된 치료 유전자를 가진 벡터 등의 다른 치료학적 제제와 조합하여, 포함할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스의 치료학적 용도
유전자 테라피 분야 및 백신면역화 분야에서는 복제-결핍성 및 복제-가능 (replication-competent) 아데노바이러스의 사용과 관련된 상당한 경험이 축적되어 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 의학에 사용하기 위한 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아데노바이러스는 이러한 아데노바이러스를 혈류로 투여하는데 필요한 임의 타입의 질환을 치료하도록 고안될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 아데노바이러스가 암 치료에 특히 유용하다는 것을 확인하였다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유류에서 암 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것으로서, 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이거나, 또는 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 암 유전자 테라피에 사용되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 아데노바이러스이다.
다른 예로, 본 발명은 포유류에서 암 예방 및/또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도에 관한 것으로서, 아데노바이러스는 종양분해성 아데노바이러스이거나, 또는 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 암 유전자 테라피에 사용되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 아데노바이러스이다.
다른 예로, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하며, 아데노바이러스가 종양분해성 아데노바이러스이거나, 또는 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 암 유전자 테라피에 사용되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 아데노바이러스인, 포유류에서 암 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "예방"은, 아데노바이러스를 질환의 첫 단계 또는 초기 단계에 (즉, 종양의 전악성 단계)에 투여하는, 예방학적 또는 예방적 방법을 지칭하거나, 또는 이의 개시를 방지하는 것을 의미한다.
아데노바이러스 벡터는 통상적으로 병원체의 단백질에 대해 면역성을 발휘하는 백신을 제조하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 재조합 아데노바이러스 백신은 특히 HIV, 광견병 바이러스, 뎅기 바이러스 (dengue virus), 에볼라 바이러스 (ebola virus), 중증급성호흡기 증후군 코로나바이러스 (sars coronavirus), 인간 파필로마바이러스 (human papillomavirus), C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 로타바이러스 (rotavirus), 홍역 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 심플렉스 2 바이러스 (herpes simplex 2 virus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein barr virus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) 및 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)에 대해 공개적으로 공지되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유류에서 감염성 질환의 예방에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은 포유류에서 감염성 질환을 예방하기 위한, 약제, 바람직하게는 백신을 제조함에 있어, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 감염성 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본원에서, "감염성 질환" 또는 "감염"이라는 표현은, 바이러스, 바이로이드 (viroid) 및 프리온 등의 감염성 또는 병원성 물질; 박테리아 등의 미생물; 선충 (회충 및 요충 포함), 절지 동물, 예컨대 진드기 류 (tick, mite), 벼룩 및 이 등의 기생 동물; 진균 및 원생 동물에 의한 숙주 유기체의 침입으로 유발되는 질환을 지칭한다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 임의 타입의 감염성 질환을 예방하기 위한 백신의 제조에 적합할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 감염성 질환은 HIV, 광견병 바이러스, 뎅기 바이러스, 에볼라 바이러스, 중증급성호흡기 증후군 코로나바이러스, 인간 파필로마바이러스, C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 심플렉스 2 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) 및 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 물질에 의해 유발된다.
용어 "치료한다" 또는 "치료"는 임상 신호가 나타나기 전 또는 나타난 후 질환의 진행을 제어하는 것을 목표로 하는, 치료학적 치료를 지칭한다. 질환의 진행 제어는, 비제한적으로, 증상 감소, 질환의 지속 기간 단축, 병원성 증상의 안정화 (구체적으로, 부가적인 손상 방지), 질환의 진행 지연, 병리학적 증상의 (일부 및 완전한) 개선 및 관해 (remission)를 포함하는, 유익한 또는 바람직한 임상 성과로서 이해된다. 또한, 질환의 진행 제어는 치료를 적용하지 않았을 때 예상되는 생존 대비 생존의 연장을 포함한다.
예를 들어, 암 치료의 경우에, 반응은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 관찰함으로서 모니터링할 수 있다: (1) (i) 서행, (ii) 혈관신생 저해 및 (iii) 완전한 증식 정지 등의, 종양 증식의 다소 저해; (2) 종양 세포의 수 감소; (3) 종양 크기 유지; (4) 종양 크기 감소; (5) 종양 세포의 말초 장기로의 침윤 (i) 감소, (ii) 서행 또는 (iii) 완전한 방지 등의 저해; (6) 전이의, (i) 감소, (ii) 서행 또는 (iii) 완전한 방지 등의, 저해; (7) (i) 종양 크기 유지, (ii) 종양 크기 감소, (iii) 종양 증식 서행, (iv) 침습 감소, 서행 또는 방지를 일으킬 수 있는, 항-종양 면역 반응의 강화; 및/또는 (8) 장애와 관련된 한가지 이상의 증상의 중증도 또는 빈도의 다소 완화.
용어 "암"은, 통제되지 않은 세포 분열 (또는 생존 증가 또는 세포자살 저항성 증가), 다른 이웃한 조직으로의 세포의 침투력 (침입), 또는 세포가 정상적으로는 위치하지 않는 신체의 다른 영역으로의 림프관 및 혈관을 통한 전파 (전이)를 특징으로 하는, 질환을 지칭한다. 본원에서, 용어 암은, 다음과 같은 타입의 암을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다: 유방암; 담관암; 방광암; 뇌암, 예를 들어, 교모세포종 및 수모세포종; 자궁경부암; 융모암; 대장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 조혈 신생물, 예를 들어 급성 림프구성 및 골수성 백혈병; T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종; 모상세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종; AIDS-관련 백혈병 및 성체 T-세포 백혈병/림프종; 상피내 신생물, 예를 들어, 보웬 질환 및 파제트 질환; 간암; 폐암; 림프종, 예를 들어 호지킨스 질환 및 림프구성 림프종; 신경모세포종; 입암, 예를 들어, 편평 세포암; 난소암, 예를 들어, 상피 세포, 기질 세포, 생식 세포 (germ cell) 및 간엽 세포에서 기원한 암; 췌장암; 전립선 암; 직장암; 육종, 예를 들어, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종 및 골육종; 피부암, 예를 들어, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 카포시 육종, 기저 세포 암종 및 편평세포암; 고환암, 예를 들어, 생식성 종양 (germinal tumour), 예로, 정상피종, 비-정상피종 (기형종, 융모암), 기질 종양 및 생식 세포 종양; 갑상선암, 예를 들어, 갑상선 선암종 및 수질 암종 (medullar carcinoma); 및 신장암, 예를 들어, 선암종 및 윌름 종양. 일 구현예에서, 암은 유방암이다. 다른 구현예에서, 암은 흑색종이다. 다른 암들도 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있을 것이다.
본 발명의 아데노바이러스는 포유류에 투여될 수 있다. 본원에서, 용어 "포유류"는, 비제한적인 예로, 가축 및 농장 동물 (소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류), 영장류 및 인간 등의, 임의의 포유류 종을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다. 본 발명의 맥락에서, 포유류는 암을 앓고 있거나 또는 암 발병 위험이 있는 포유류이다.
동물 모델 또는 환자에서 종양을 치료하기 위해, 아데노바이러스를 종양내 또는 강내 주입을 통한 국부 또는 국지 투여에 의해 또는 혈류로의 주입에 의해 전신으로 전달할 수 있다. 또한, 바이러스는 종양의 맥관 구조에 투여할 수 있다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 혈류에 존재하는 중화 항체로부터 보호받기 때문에, 전신 투여에 특히 적합하다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스는 전신으로 투여된다. 본원에서, "전신으로 투여된다"라는 표현은, 신체 전체에 작용하도록 순환계로의 투여 경로를 지칭한다. 바람직하게는, 투여는 비경구 (통상적으로, 동맥내 또는 정맥내 주사, 주입 또는 이식)이다.
본 발명의 아데노바이러스는 이상적으로는 혈청 알부민이 결합되기 전에 투여되며, 치료받은 개체의 혈류에서 알부민이 결합된다. 그러나, 파종성 종양 결절로의 도달 가능성을 높이기 위해, 아데노바이러스의 혈류 존속성을 높이도록, 캡시드는 아데노바이러스를 투여하기 전에 알부민으로 피복될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스를 이용한 종양 치료는, 종양분해성 아데노바이러스 분야에서 이미 알려진 바와 같이, 화학요법 또는 방사선치료와 같이, 다른 치료학적 용법과 조합하여 사용될 수 있다.
암을 치료하기 위한 본 발명에 언급된 아데노바이러스의 사용 프로토콜은 아데노바이러스를 이용한 바이로테라피 및 유전자 테라피 분야에서 사용되는 동일한 과정이다.
또한, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[1]. 헥손 단백질의 과가변부 (HVR)의 코딩 영역에 삽입된 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열이 헥손 단백질 및 알부민-결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 발현하며, 헥손 단백질이 아데노바이러스 캡시드로 조립될 때 알부민-결합 모이어티가 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 게놈.
[2]. 게놈이 인간 아데노바이러스 유래인, [1]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[3]. 인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 혈청형 1 - 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, [2]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[4]. 인간 아데노바이러스가 혈청형 5인, [3]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[5]. 알부민-결합 모이어티가 스트렙토코커스 단백질 G 유래 알부민-결합 도메인, 펩토스크렙토코커스 마그누스 단백질 PAB 유래 알부민-결합 도메인, 코어 서열 DICLPRWGCLW (서열번호 9)을 가진 알부민-결합 펩타이드 및 이들의 기능적 등가 변이체로부터 선택되는, [1], [2], [3] 또는 [4]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[6]. 알부민-결합 모이어티가 스트렙토코커스 단백질 G 유래의 알부민-결합 도메인 3인, [5]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[7]. 스트렙토코커스 단백질 G 유래의 알부민-결합 도메인 3의 서열이 서열번호 1인, [6]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[8]. 헥손 단백질의 HVR이 HVR1, HVR2, HVR3, HVR4, HVR5, HVR6 및 HVR7으로 이루어진 군으로부터 선택되는, [1], [2], [3], [4], [5], [6] 또는 [7]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[9]. 헥손 단백질의 HVR이 HVR1인, [8]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[10]. 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열은, 제조되는 융합 단백질이, GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링에 따라 헥손 단백질의 D150아미노산 다음에 알부민-결합 모이어티를 포함하도록, 삽입되는, [9]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[11]. 헥손 단백질의 HVR이 HVR5인, [8]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[12]. 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열은, 제조되는 융합 단백질이, GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링에 따라 헥손 단백질의 A274 아미노산 다음에 알부민-결합 모이어티를 포함하도록, 삽입되는, [11]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[13]. 알부민-결합 모이어티의 N-말단 및/또는 C-말단이 링커 서열을 통해 헥손 단백질에 연결되는, [1] 내지 [12] 중 어느 한 항목에 따른 아데노바이러스 게놈.
[14]. 링커 서열이 서열 GSGS (서열번호 2)를 포함하는, [13]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[15]. 아데노바이러스 게놈이 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함하는, [1] 내지 [14] 중 어느 한 항목에 따른 아데노바이러스 게놈.
[16]. 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터가 E1a, E1b, E2 및 E4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위한 프로모터 서열인, [15]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[17]. 프로모터가 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, alpha-페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, [16]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[18]. 아데노바이러스가 종양분해성 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus)인, [1] 내지 [17] 중 어느 한 항목에 따른 아데노바이러스 게놈.
[19]. 아데노 게놈이, 종양내에서의 선택적인 복제를 달성하기 위해, E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 더 포함하는, [18]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[20]. 아데노바이러스 게놈이 아데노바이러스 감염성을 증가시키거나 또는 이의 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위한 캡시드 변형을 더 포함하는, [1] 내지 [19] 중 어느 한 항목에 따른 아데노바이러스 게놈.
[21]. 캡시드의 변형이 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프내로의 RGD 모티프의 삽입인, [20]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[22]. 아데노바이러스 게놈은 게놈에 삽입된 하나 이상의 추가 유전자를 포함하는, [1] 내지 [21] 중 어느 한 항목에 따른 아데노바이러스 게놈.
[23]. 추가 유전자가 유전자 테라피 또는 백신면역화 (vaccination)에 사용되는 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자 (non-adenoviral gene)인, [22]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[24]. 상기 유전자가 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자인, [23]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[25]. 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자가 적어도 프로드럭-활성화 유전자, 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 DNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자인, [24]에 따른 아데노바이러스 게놈.
[26]. [1] 내지 [25] 중 어느 한 항목에 따른 아데노바이러스 게놈을 가진 재조합 아데노바이러스.
[27]. [26]에 따른 재조합 아데노바이러스를 치료학적인 유효량으로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 약학적 조성물.
[28]. 의학제 사용하기 위한 [26]에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 [27]에 따른 약학적 조성물.
[29]. 포유류에서 암 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 [26]에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 [27]에 따른 약학적 조성물로서, 아데노바이러스가 종양분해성 아데노바이러스 또는 [24] 또는 [25]에 따른 아데노바이러스 게놈을 가지는 아데노바이러스.
[30]. 포유류가 인간인, [28] 또는 [29]에 따라 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스.
[31]. 아데노바이러스가 전신으로 투여되는, [28], [29] 또는 [30]에 따른 재조합 아데노바이러스.
아래 실시예들은 주로 예시로서 제공되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예
재료 및 방법
세포주. HEK293 (인간 배아 신장), A549 (인간 폐 선암종), Sk-mel28 (흑색종) 및 MCF7 (인간 유방 선암종) 세포를 ATCC (the American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 입수하였다. MCF7을 제외한 종양 세포주들은 모두 5% 소 태아 혈청이 첨가된 둘베토의 변형된 이글스 배지에서 37℃, 5% CO2 하에 유지시켰다. MCF7 세포는 10% 소 태아 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다. 세포주들은 모두 마이코플라스마의 존재 여부를 일상적으로 검사하였다.
바이러스 구축. ICOVIR15 종양분해성 아데노바이러스는 종래에 언급된 바 있다 (Rojas JJ, et al. Minimal RB-responsive E1A promoter modification to attain potency, selectivity, and transgene-arming capacity in oncolytic adenovirus. Mol Ther 2010; 18 (11):1960-71). AdGL은 pEGFPLuc (Clontech) 사의 EGFP-루시퍼라제 융합 단백질 카세트를 발현하는 E1-결손된 1세대 벡터이다. E1 영역을 치환하는 CMV 프로모터-EGFPLuc-polyA 카세트의 삽입은, 양성-음성 선택을 이용한 박테리아에서의 상동성 재조합을 토대로, Stanton et al. (Stanton RJ, et al. Re-engineering adenovirus vector systems to enable high-throughput analyses of gene function. Biotechniques 2008; 45(6):659-62, 664-8)로부터 수정된 재조합 프로토콜에 따라 수행하였다. E1 상동성 영역이 측면에 위치한 CMV-GFPLuc 카세트를 사용해, E1-결손된 아데노바이러스 벡터 구축에 통상적으로 사용되는, pAd5-CV5-E3+의 양성-음성 선택 마커로 치환하였다. ICOVIR15는 A549 세포에서 증폭시켰으며, 복제-결함성 AdGL는 HEK293 세포에서 증폭시켰다.
ICOVIR15-ABD 및 AdGL-ABD는, D150 아미노산 다음에 아데노바이러스 헥손의 과가변부 1 (HVR1)에 2개의 링커 (GSGS) (서열번호 2)가 양쪽 측면에 위치된 알부민-결합 도메인 (ABD)을 삽입함으로써, 구축하였다. HVR1 (ABD-HVR1)에 삽입된 ABD를 가진 변형된 헥손의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3이다. 모든 변형은 RpsL-Neo 카세트를 이용한 양성-음성 선택으로 박테리아의 상동적인 재조합을 토대로 Stanton et al. (Stanton RJ, et al. Re-engineering adenovirus vector systems to enable high-throughput analyses of gene function. Biotechniques 2008; 45(6):659-62, 664-8)로부터 수정된 재조합 프로토콜에 따라 수행하였다.
먼저, rpsLNeo 카세트를, 올리고뉴클레오티드 HVR1rpsLF 5'- GCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGGCCTGGTGATGATGGC-3' (서열번호 12) 및 HVR1rpsLR 5'- GTAATATTTATACCAGAATAAGGCGCCTGCCCAAATACGTGAGTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3' (서열번호 13)을 사용해, pJet1.2/blunt (Genscript, Wheelock House, Hong Kong)에 클로닝된 rpsLneo 양성-음성 선택 마커를 포함하는 플라스미드 pJetRpsLNeo로부터 PCR하여 증폭시켰다. 이 카세트를 pAdZICOVIR15 및 pAdZGL 플라스미드의 HVR1에 삽입하여, pAdZICOVIR15-H1-rpsLNeo와 pAdZGL-H1-rpsLNeo를 구축하였다. 그런 후, 아래 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR을 통해 링커-ABD-링커 단편을 제작하였다.
올리고뉴클레오티드 서열 서열번호
ABDH1F 5'-CCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACC
TAGAAGAAGAGGACGGCAGCGGATCCCTG-3'		 14
ABDR1 5'-CCCGGTTCGCAAGCACCTTAGCCTCGGCCAGGGATCCGCTGCCCCATTC-3 15
ABDF2 5'-GCTTGCGAACCGGGAACTAGACAAATACGGTGTTTCTGATTATTACAAG-3 16
ABDR2 5'-CGACGGTTTTGGCATTGTTAATCAAATTCTTGTAATAATCAGAAACACCG-3' 17
ABDF3 5'-ATGCCAAAACCGTCGAGGGCGTAAAGGCTCTGATCGACGAAATACTTGCG-3' 18
ABDR3 5'-ATACGTGAGTGCTACCAGACCCGGGTAGGGCCGCAAGTATTTCGTCGATC-3' 19
ABDH1R 5'-CAGAATAAGGCGCCTGCCCAAATACGTGAGTTTTTTGCTGCTCAGCTTGCTCGTCTACTTCG
TCTTCGTTGTCATCGCTACCAGACCCGGG-3'		 20
이 단편을 이용해, 상기한 2개의 플라스미드에서 rpsLNeo 카세트를 치환하여, pAdZICOVIR15-H1-ABD와 pAdZGL-H1-ABD를 구축하였다.
또한, ABD를 A274 아미노산 다음에 과가변부 5에 삽입하였다. HVR5에 삽입된 ABD (ABD-HVR5)를 가진 변형된 헥손의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이다. 이를 위해, rpsLNeo 카세트를 하기 올리고뉴클레오티드 H5rpsLF와 H5rpsLR을 사용해 pJetRpsLNeo로부터 PCR하여 증폭시키고,
올리고뉴클레오티드 서열 서열번호
H5rpsLF 5'-gaaagctagaaagtcaagtggaaatgcaatttttctcaactggcctggtgatgatggc-3' 21
H5rpsLR 5'-gtttctatatctacatcttcactgtacaataccactttaggtcagaagaactcgtcaa
gaag-3'		 22
pAdZGL 플라스미드에 삽입하여, pAdZGL-H5-rpsLNeo를 구축하였다. 2번째 재조합 단계에서는, 링커-ABD-링커 단편을 하기 올리고뉴클레오티드 ABDH5F와 ABDH5R을 사용해 pAdZICOVIR15-H1-ABD로부터 PCR하여 증폭시켰다.
올리고뉴클레오티드 서열 서열번호
ABDH5F 5'- ctggccgaggctaaggtgcttgcgaaccgggaactagacaaatacggtgtttctgattatt
acaagaatttgattaacaatgccaaaaccgtcgagggcgtaaaggctctgatcgacgaaatactt
gcggccctaccc-3'		 23
ABDH5R 5'- ctggccgaggctaaggtgcttgcgaaccgggaactagacaaatacggtgtttctgattatt
acaagaatttgattaacaatgccaaaaccgtcgagggcgtaaaggctctgatcgacgaaatactt
gcggccctaccc-3'		 24
이 단편을 사용해, pAdZGL-H5-rpsLNeo의 rpsLNeo를 치환함으로써, pAdZGL-H5-ABD를 구축하였다.
아울러, 도메인은 헥손 단백질의 임의 과가변부에 삽입할 수 있다. 이를 위해, rpsLNeo를 원하는 영역에 삽입시킨 다음, PCR에 의해 제조된 상동성 팔 (arm)을 가진 ABD 단편으로 치환하여, 특정 과가변부 루프에 재조합하여야 한다.
ICOVIR15-ABD (HVR1에 ABD 포함), AdGL-ABD (HVR1에 ABD 포함) 및 AdGL-H5-ABD (HVR5에 ABD 포함)는, 제조된 플라스미드를 HEK293 세포에 칼슘 포스페이트 표준 프로토콜을 이용해 형질감염시켜, 구축하였다. 종양분해성 아데노바이러스 ICOVIR15-ABD를 플라그-정제하고, A549 세포에서 추가로 증폭시켰다. 아데노바이러스 벡터 AdGL-ABD 역시 플라그-정제하고, HEK293 세포에서 추가로 증폭시켰다. 이들 바이러스 2종은 표준 기법에 따라 세슘 클로라이드 더블-농도구배를 이용해 정제하였다.
바이러스와 인간 혈청 알부민 (HSA)의 인큐베이션을 실온에서 1시간 동안 HSA 1 mg/ml이 첨가된 배지에서 수행하였다.
바이러스 생산 분석. A549 세포에 각 바이러스를 800 vp (viral particle)/세포로 감염시켜, 80-100%의 감염율을 달성하였다. 세포 감염 후 4시간 후 PBS로 3번 헹군 다음, 신선한 배지에서 인큐베이션하였다. 지정된 시기에, 세포를 수집하여, 3번 냉동-해동를 반복한 다음 세포 추출물을 수득하였다. 항-헥손 염색에 기반한 방법을 통해 HEK293 세포에서 바이러스 역가를 수득하였다 (Cascallo M, et al. Systemic toxicity-efficacy profile of ICOVIR-5, a potent and selective oncolytic adenovirus based on the pRB pathway. Mol Ther 2007; 15:1607-15).
시험관내 세포독성 분석. 세포독성 분석은, 96웰 플레이트에서 웰 당 10,000 HEK293, 30,000 A549, 10,000 Sk-mel28 및 20,000 MCF-7 세포를 접종하여 수행하였다. 감염시키기 전에, 바이러스를 1시간 동안 실온에서 배지 또는 1 mg/ml 인간 혈청 알부민 (HSA)이 함유된 배지에서 인큐베이션하였다. 정상 배지 또는 알부민-함유 배지에서, 10,000 vp/세포에서 시작하여 연속 희석물 (HEK293, Sk-mel28 및 MCF-7 세포는 1/3, A549 세포는 1/5임)을 사용해, 세포에 감염시켰다. 감염 후 7일째에, 플레이트를 PBS로 헹구고, 총 단백질 함량 (비신코닌산 분석; Pierce Biotechnology, Rockford, IL) 측정을 위해 염색하고, 흡광도를 측정하였다. 증식을 50% 저해하는데 필요한 vp/세포 (IC50)를 수정된 Hill 등식을 이용한 표준 비-선형 회귀에 의해 용량-반응 그래프로부터 결정하였다 (GraFit; Erithacus Software, Horley, UK).
인간 및 마우스 혈청 알부민에 대한 결합 검출. 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 마우스 혈청 알부민 (MSA)에 대한 결합 검출은 Konig 및 Skerra (Konig T, Skerra A. Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J Immunol Methods 1998; 218:73-83)로부터 수정된 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음 0.1% Tween20이 첨가된 PBS 200 ㎕로 3번 헹구었으며, 이 용액은 바이러스와 항체의 희석시 사용되는 완충제이다.
96웰 플레이트를 PBS에서 2 mg/mL로 희석시킨 HSA 또는 BSA (Sigma) 200 ㎕로 코팅하였다. 플라스틱 표면의 남아있는 결합 사이트는 0.5% Tween20 함유 PBS에서 희석한 2 mg/mL BSA로 차단하였다. 다음 단계로, 정제된 바이러스를 부피 50 ㎕로 첨가하였다. 결합을 검출하기 위해 단백질을 3가지 함량으로 검사하였다 (바이러스 단백질 25, 2.5 및 0.25 ng) (도 5A). 정제된 바이러스 샘플의 바이러스 단백질 농도를 Bio Rad 단백질 분석으로 정량하였다. 바이러스의 검출은 2Hx-2 하이브리도마 (ATCC® HB-8117™) 상층액 (50 ㎕/웰, 희석비 1/5)에서 수득되는 항-헥손 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제가 접합된 다클론 염소 항-마우스 항체 (50 ㎕/웰, 희석비 1/2000)를 사용해 수행하였다. 금방 혼합한 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 퍼옥시다제 기질 용액을 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하여 웰을 염색하고, 15분간 교반하면서 인큐베이션하였다. 2N 황산 100 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
동일한 실험을 수행하여, PBS에 2 mg/ml로 희석한 BSA, HSA 또는 MSA (Sigma) 200 ㎕로 96웰 플레이트를 코팅하고, 바이러스 단백질 25 ng을 사용해 결합 검출을 수행하였다. 바이러스를 첨가하지 않은 대조군 모의군도 포함시켰다 (도 5B).
시험관내 항체-매개 중화 분석. 항체-매개 중화를 감염 (루시퍼라제-GFP 리포터 아데노바이러스의 형질감염) 및 복제 (복제-가능 아데노바이러스에 의해 매개되는 세포독성) 수준에서 분석하였다. 시판 항체 Ab6982 (Anti-Ad5 토끼 다클론 항체, Abcam)를 중화 항체로 사용하였다. 감염성 분석을 위해, 항체 원액의 1/100 희석에서 시작하여, 96웰 플레이트에서 항체의 1/6 연속 희석을 여러가지 아데노바이러스 (AdGL 또는 AdGL-ABD)를 포함하는 배지에서 수행하였다.
실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 웰 당 1E5 HEK293 또는 3E4 Sk-mel28 세포를 첨가하여, 원하는 감염 다중도를 달성하였다 (HEK293 세포의 경우 0.5 TU/세포 또는 10 vp/세포, 및 Sk-mel28 세포의 경우 40 vp/세포). 감염 후 24시간 후에 배지를 제거하고, 세포 분해 시약 (Promega, Madison, Wi) 50 ㎕를 첨가하여 세포를 분해한 다음 냉동-해동을 1회 실시하였다. 세포분해물을 4℃에서 5분간 13,000g에서 원심분리하고, 상층액의 루시퍼라제 효소 활성을 루시퍼라제 분석 시약 (Promega)을 사용해 발광측정계 (Berthold Junior, Berthold GmbH&Co, KG, Germany)에서 측정하였다.
복제를 분석하기 위해, 항체의 1/2 연속 희속을 항원 원액의 1/100 희석에서 시작해 수행하였다. 이 연속 희석은 ICOVIR15 또는 ICOVIR15-ABD를 포함하는 배지를 이용해 수행하였다. 항체와 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 웰 당 3E5 A549 세포를 첨가하여, 감염 다중도 600 vp/세포를 만들었다. 감염 후 4일째에, 상기 "시험관내 세포독성 분석" 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 전체 단백질 함유물을 염색하여, 세포 생존을 분석하였다.
생체내 혈액 제거 (blood clearance). 생체내 실험을 ICO-IDIBELL facility (Barcelona, Spain) AAALAC unit 1155에서 수행하였으며, IDIBELL의 동물 실험 윤리 위원회로부터 허가 받았다. Balb/C nu/nu 암컷 마우스에, ICOVIR15 및 ICOVIR15-ABD (비율 1:1) 혼합물을, PBS 중에 10 ml/kg 부피로, 총 용량 5 x 1010 vp로 정맥내 주사하였다. 투여 후 5분, 15분, 1시간, 4시간 및 24시간째에, 혈액 샘플을 꼬리 정맥에서 채혈하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 5분간 5000g로 원심분리하여, 세포 분획을 분리하여 혈청을 수집하였다. 혈청 샘플 샘플을 프로테나제 K 및 SDS로 54℃에서 45분간 효소 분해시킨 후 10분간 90℃에 두어 캡시드를 단백질분해시키고, 바이러스 DNA를 분리시켰다. 효소 분해된 샘플을, 헥손 HVR1-측면 올리고뉴클레오티드 Ad19121F 5'-CTGGACATGGCTTCCACGTA-3' (서열번호 25) 및 Ad19300R 5-'GCTCGTCTACTTCGTCTTCG-3' (서열번호 26)를 사용한 PCR로 증폭하고, 1% 아가로스 겔 상에서의 전기영동에 의해 분석하였다. ICOVIR15-ABD는 HVR1의 중앙에 ABD 삽입체를 가지고 있어 PCR 산물의 크기는 더 길 것이며; ICOVIR15-ABD에서 예상되는 PCR 산물은 ICOVIR15에서 199 bp인 것과 비교해 361 bp이다.
생체내 항종양 효능. 6주령의 암컷 Balb/C nu/nu 마우스의 옆구리에 Sk-mel28 세포 1 x 107개를 주사하여, 피하 흑색종 이종이식 종양을 확립하였다. 종양의 크기가 150 mm3에 도달하면 (실험 0일), 마우스를 무작위로 분류하고 (n = 동물 10 내지 12마리/그룹), 꼬리 정맥을 통해, PBS 중의 부피 10 ml/kg으로 ICOVIR15 또는 ICOVIR15-ABD 5x1010 또는 PBS를 1회 정맥내 투여하여 주사하였다. 종양의 크기와 마우스의 상태를 주당 3회 모니터링하였다. 종양의 체적을 디지탈 캘리퍼를 사용해 측정하고, 식 V(mm3) = π/6 x W2 x L로 계산하였는데, 이때 W 및 L은 각각 종양의 폭과 길이이다. 처리군 간의 종양 크기 차이에 대한 통계학적 유의성을 양측 스튜던트 독립 t-검정 (two-tailed Student's unpaired t-test)으로 평가하였다.
생체내 형질도입. 1 x 106개의 B16-CAR 세포를 6주령의 암컷 C57BL6 마우스의 양쪽 옆구리에 피하 이식하여, 흑색종 종양을 확립하였다 (n = 동물 4-6마리/그룹). 종양의 크기가 100 mm3에 도달하면, PBS (나이브 (naive) 그룹) 또는 hAd5wt 2 x 1010 vp (예비-면역 그룹)를 복막내 주사하였다. 면역화한 지 7일 후, 마우스에 PBS, 또는 마우스 당 바이러스 입자 3 x 1010의 투여량으로 AdGL 또는 AdGL-ABD를 정맥내 1회 주사하였다. 벡터 주사 후 3일째에, 마우스의 복막에 D-루시페린 (15 mg/mL; Biosynth, Staad, Switzerland) 250 ㎕를 복막내 주사하고, 마우스를 안락사시켜 생발광 이미지 측정 (IVIS)을 위해 간 및 종양을 적출하였다. 장기는 IVIS Lumina XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)에서 촬영하고, Living Image v4.0 소프트웨어로 발광을 정량하였다.
결과
ICOVIR15-ABD 제조 및 특성 규명. 알부민-결합 아데노바이러스를 구축하기 위해, 스트렙토코커스 박테리아의 단백질 G로부터 유래된 알부민-결합 도메인 3 (서열번호 1)을 ICOVIR15 헥손의 HVR1에 삽입하여 종양분해성 아데노바이러스 ICOVIR15-ABD (도 1 및 2)를 제작하였다. 이 도메인은, 헥손 서열의 결손없이, D150 아미노산 다음에 HVR1 가운에 양측에 링커 (GSGS) (서열번호 2)를 포함한 상태로 삽입된다 (도 1).
바이러스 복제에 ABD 삽입이 미치는 영향을 분석하기 위해, A549 세포에서 ICOVIR15와 ICOVIR15-ABD의 복제 카이네틱스를 비교하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 양 바이러스의 생산 카이네틱스는 유사하였지만, ICOVIR15-ABD에서 전체 생산 수율 감소가 관찰되었다. 또한, 바이러스의 시험관내 암 세포 사멸력을 분석하였다. 세포독성 실험을 HEK293, A549, Sk-mel28 및 MCF-7 세포들에서, HSA의 존재 또는 부재 조건 하에 수행하였다. IC50 값들은 평가한 4종의 세포주들 중 3종에서 바이러스들 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났으며, MCF-7 세포에서는 ICOVIR15-ABD가 ICOVIR15와 비교해 IC50 값이 3배 증가하였는데, 이는 이 세포주에서 세포독성이 어느 정도 소실됨을 의미한다 (도 4). HSA의 첨가는 어느 경우에도 세포독성에 영향을 미치지 않았다.
ELISA 실험을 수행하여, ICOVIR15-ABD의 HSA 및 MSA 결합성을 확인하였다. 웰을 MSA, HSA 또는 BSA (ABD는 MSA와 HSA에 결합하지만, BSA는 결합 안함)로 코팅하고, 바이러스 ICOVIR15 또는 ICOVIR15-ABD의 결합성을 분석하였다. HSA-코팅 웰 (도 5A)과 MSA-코팅 웰 (도 5B)에 ICOVIR15-ABD를 투입하였을 때 양성 신호가 수득되었으며, 신호의 세기는 사용된 바이러스의 양에 따라 증가하였다 (도 5A). BSA를 HSA 또는 MSA 대신 사용한 경우에는, 바이러스 첨가량에 상관없이 신호는 관찰되지 않았는데, 이는 바이러스가 인간 및 뮤라인 알부민에는 결합하지만, 소 알부민에는 결합할 수 없다는 것을 시사해준다. 예상한 바와 같이, 어떤 경우에도 ICOVIR15 바이러스에서는 결합이 검출되지 않았다.
알부민-결합은 시험관내에서 중화 항체로부터 아데노바이러스를 보호한다. 인간 알부민에 대한 ICOVIR15-ABD의 결합성이 입증된 바, 본 발명자들은 이 결합이 바이러스를 중화 항체 (NAb)로부터 시험관내에서 보호할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해, 헥손에 ABD를 가지도록 변형된 GFP-루시퍼라제 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터, 즉 AdGL-ABD를 구축하였다. 시판 중화 항체 Ab6982 (Ad5에 대한 토끼 다클론 항체)의 연속 희석물과 HSA의 존재 및 부재 하에 인큐베이션한 후, HEK293 세포에서 AdGL-ABD의 형질도입 효율을 조사하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 알부민 인큐베이션과는 무관하게, 비-변형된 AdGL에서 비슷한 수준의 형질도입이 달성되었다. 반면, HSA는 AdGL-ABD를 중화로부터 보호하였다. 흥미롭게도, 알부민과 인큐베이션하지 않았을 때에도, AdGL-ABD는 비-변형 벡터 AdGL 보다 덜 중화되었는데, 이는 HVR1의 ABD로의 변형이 이미 일부 NAb의 결합을 배제시킨다는 것을 의미한다.
또한, 중화 항체 존재 하에 바이러스의 암 세포 사멸력을 분석하였다. 이를 위해, A549 세포를, HSA 존재 및 부재 하에 중화 항체 Ab6982의 연속 희석물과 이미 인큐베이션된 ICOVIR15 또는 ICOVIR15-ABD로 감염시키고, 감염 4일 후 세포 생존을 분석하였다. 인간 알부민 존재 시, 이들 2종의 바이러스는 유사한 종양 세포 사멸력을 나타내었으며 (도 7), ICOVIR15-ABD에서는 아마도 형질도입시 관찰된 중화 항체의 일부 침입으로 인해 약간의 세포 독성 증가가 관찰되었다 (도 6). 중요하게도, 인간 알부민을 배지에 첨가하였을 때에는 ICOVIR15-ABD의 세포 독성이 변형되지 않은 ICOVIR15의 세포독성 보다 현저하게 증강되었다.
ICOVIR15-ABD는 혈장 반감기 증가를 나타낸다. 알부민-결합이 혈액내 아데노바이러스의 신속한 제거를 저하할 수 있는지를 조사하기 위해, 생체내 전신 투여 후 ICOVIR15-ABD의 약동학적 특성을 조사하였다. 마우스에, ICOVIR15 및 ICOVIR15-ABD 1:1 비율의 혼합물을 마우스 당 총 용량 5 x 1010 vp (바이러스 입자)로 주사하고, 여러 시기에 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈청 샘플에서 PCR로 헥손 HVR1을 증폭시켰다. ABD 삽입으로 인해, ICOVIR15-ABD에서는 361 bp 밴드가 수득되는 반면, ICOVIR15에서는 밴드의 크기가 199 bp에 불과하다. 그래서, 각 시간별 밴드의 상대적인 밀도를 비교함으로써, 어느 바이러스가 혈류에서 더 오래 존속하는지를 확인할 수 있었다. 도 8은 여러가지 비율의 ICOVIR15-ABD: ICOVIR15 (0.2, 1, 5, 10 및 50) 표준 물질과 물 음성 대조군을 비롯한 샘플들 전체의 PCR 반응 결과를 전기영동한 것이다. 주사 전 대조군과 주사 후 5분째에는 동일한 밀도의 밴드가 나타났다. 그 다음부터 밴드의 세기의 변화는 ICOVIR15-ABD에 해당되는 밴드가 ICOVIR15 보다 점점 더 진해지는 것을 볼 수 있다. 주사 후 1시간째에, ICOVIR15-ABD에 우호적인 양쪽 바이러스의 차별적인 존속성이 명확하게 확인된다. 이들 데이타는, ICOVIR15가 주사 후 5분째에 ICOVIR15-ABD 보다 훨씬 빨리 혈류에서 제거됨을 보여주는데, 이는 ABD-변형 바이러스의 약동학적 특성 개선을 의미한다.
생체내 전신 투여 후 ICOVIR15-ABD의 항-종양 활성. ICOVIR15-ABD의 혈장 반감기 증가가 확인된 바, 전신 투여 후 항-종양 효능 증가로 해석될 수 있는지를 조사하였다. Sk-mel28 (흑색종) 이종이식 종양을 가지고 있는 마우스에, 포스페이트-완충화된 염수 (PBS) 또는 5x1010 바이러스 입자/마우스 수준의 ICOVIR15 또는 ICOVIR15-ABD를 1회 정맥내 주사하였다. 처리 후 38일째에, PBS-처리 종양의 크기가 커져서 동물을 안락사시켰다. 2종의 바이러스는 PBS와 비교해 종양 증식을 현저하게 감소시킬 수 있었다 (도 9). 그러나, ICOVIR15-ABD 처리는 처리 종료시까지 21일까지 종양 증식에 대한 통계학적인 감소를 나타낸 반면, ICOVIR15는 35일까지 통계학적으로 종양 증식을 통제할 수 없었다. 동물을 안락사시킨 38일에는, ICOVIR15는 1.4배 감소를 나타낸 반면, ICOVIR15-ABD는 2배 감소를 나타내었다.
알부민-결합은 생체내에서 아데노바이러스를 항-HAd5 예비-면역으로부터 보호한다. B16-CAR 흑색종 종양을 가진 면역적격 (immunocompetent) C57BL6 마우스에, hAd5wt 2 x 1010 vp (바이러스 입자) 또는 PBS (예비면역화된 그룹 또는 나이브 그룹)를 복막내 주사하여 면역화하였다. 7일 후, 마우스에 3x1010 바이러스 입자/마우스로 AdGL 또는 AdGL-ABD를, 또는 PBS를 1회 정맥내 주사하였다. 벡터 주사 후 3일째에, 마우스를 안락사시키고, 간과 종양을 생체내 생발광 이미지 측정 (IVIS)을 위해 회수하였다. 나이브 동물에서는 간 및 종양 형질도입에 대한 유의한 차이가 벡터들 간에 관찰되지 않았다 (도 10). 특히, 동물이 예비-면역화된 경우에는, 비-변형된 AdGL 벡터는 간 및 종양에서의 형질도입이 완전히 없어져 완전한 중화를 겪게 되었다. 반면, AdGL-ABD는 간 및 종양에서 동일한 수준의 형질도입을 유지할 수 있었으며, 이는 항-HAd5 예비-면역으로부터 보호됨을 의미한다.
과가변부 5에 ABD 삽입. 삽입이 헥손의 다른 과가변부에 행해질 수 있는지를 조사하기 위해, AdGL-H5-ABD 벡터를 구축하였다. HEK293 세포를 pAdZGL-H5-ABD 플라스미드로 형질감염시켜, AdGL-H5-ABD 바이러스를 제작하였다. 형질감염 후 1주일 후, 세포 및 상층액을 회수하여, 3번의 냉동-해동 사이클로 세포분해를 수행하였다. 바이러스가 함유된 세포 추출물을 플라그 분석으로 HEK293 세포에서 타이트레이션하였다. 희석물 1E6, 1E7 및 1E8에 해당되는 웰들을 도 11에 도시하며, 여기서 바이러스 증식을 입증하는 플라그가 확인된다. HVR5내 ABD 삽입은 바이러스 게놈의 서열을 분석하여 검증하였다. 이는 바이러스의 생존에 영향을 미치지 않으면서 ABD를 다른 과가변부에 삽입할 수 있는 가능성을 입증해준다.
과가변부 5내 ABD 삽입은 아데노바이러스를 중화 항체로부터 보호하지 못한다. 과가변후 5에 삽입된 ABD 역시 아데노바이러스를 중화 항체로부터 보호할 수 있는지를 확인하기 위해, HEK293 및 Sk-mel28 세포에서 HSA 첨가 또는 무-첨가 하에, Ab6982 NAb 연속 희석물과 함께 인큐베이션한 후, AdGL, AdGL-H1-ABD 및 AdGL-H5-ABD 벡터들의 형질도입 효율을 비교하였다. 도 6에서 관찰되는 바와 같이, HSA와의 인큐베이션이 상기한 2종의 세포주내 AdGL-H1-ABD의 형질도입에 명백하게 유리한 반면, 비-변형된 벡터 AdGL에서는 주요한 효과가 없었다 (도 12). 놀랍게도, 인간 알부민의 첨가는 AdGL-H5-ABD의 형질도입 수준을 높이지 않았다. 이는, ABD가 HVR1에 삽입되었을 때만 작동하고, HVR5에서는 그렇지 않다는 것을 시사해준다.
SEQUENCE LISTING <110> Institut d'Investigaci?Biom?ica de Bellvitge (IDIBELL) Institut Catal?d'Oncologia <120> ADENOVIRUS COMPRISING AN ALBUMIN-BINDING MOIETY <130> P10559PC00 <150> EP 14382162 <151> 2014-04-30 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 1 Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile Asn Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln Ala Glu Gln Gln 20 25 30 Lys Thr His Val 35 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 2 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 3 <211> 3021 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete modified adenoviral hexon having ABD inserted in HVR1 <400> 3 atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60 tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120 ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg 180 tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac 240 aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac 300 tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc 360 tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact 420 gctcttgaaa taaacctaga agaagaggac ggcagcggat ccctggccga ggctaaggtg 480 cttgcgaacc gggaactaga caaatacggt gtttctgatt attacaagaa tttgattaac 540 aatgccaaaa ccgtcgaggg cgtaaaggct ctgatcgacg aaatacttgc ggccctaccc 600 gggtctggta gcgatgacaa cgaagacgaa gtagacgagc aagctgagca gcaaaaaact 660 cacgtatttg ggcaggcgcc ttattctggt ataaatatta caaaggaggg tattcaaata 720 ggtgtcgaag gtcaaacacc taaatatgcc gataaaacat ttcaacctga acctcaaata 780 ggagaatctc agtggtacga aacagaaatt aatcatgcag ctgggagagt cctaaaaaag 840 actaccccaa tgaaaccatg ttacggttca tatgcaaaac ccacaaatga aaatggaggg 900 caaggcattc ttgtaaagca acaaaatgga aagctagaaa gtcaagtgga aatgcaattt 960 ttctcaacta ctgaggcagc cgcaggcaat ggtgataact tgactcctaa agtggtattg 1020 tacagtgaag atgtagatat agaaacccca gacactcata tttcttacat gcccactatt 1080 aaggaaggta actcacgaga actaatgggc caacaatcta tgcccaacag gcctaattac 1140 attgctttta gggacaattt tattggtcta atgtattaca acagcacggg taatatgggt 1200 gttctggcgg gccaagcatc gcagttgaat gctgttgtag atttgcaaga cagaaacaca 1260 gagctttcat accagctttt gcttgattcc attggtgata gaaccaggta cttttctatg 1320 tggaatcagg ctgttgacag ctatgatcca gatgttagaa ttattgaaaa tcatggaact 1380 gaagatgaac ttccaaatta ctgctttcca ctgggaggtg tgattaatac agagactctt 1440 accaaggtaa aacctaaaac aggtcaggaa aatggatggg aaaaagatgc tacagaattt 1500 tcagataaaa atgaaataag agttggaaat aattttgcca tggaaatcaa tctaaatgcc 1560 aacctgtgga gaaatttcct gtactccaac atagcgctgt atttgcccga caagctaaag 1620 tacagtcctt ccaacgtaaa aatttctgat aacccaaaca cctacgacta catgaacaag 1680 cgagtggtgg ctcccgggct agtggactgc tacattaacc ttggagcacg ctggtccctt 1740 gactatatgg acaacgtcaa cccatttaac caccaccgca atgctggcct gcgctaccgc 1800 tcaatgttgc tgggcaatgg tcgctatgtg cccttccaca tccaggtgcc tcagaagttc 1860 tttgccatta aaaacctcct tctcctgccg ggctcataca cctacgagtg gaacttcagg 1920 aaggatgtta acatggttct gcagagctcc ctaggaaatg acctaagggt tgacggagcc 1980 agcattaagt ttgatagcat ttgcctttac gccaccttct tccccatggc ccacaacacc 2040 gcctccacgc ttgaggccat gcttagaaac gacaccaacg accagtcctt taacgactat 2100 ctctccgccg ccaacatgct ctaccctata cccgccaacg ctaccaacgt gcccatatcc 2160 atcccctccc gcaactgggc ggctttccgc ggctgggcct tcacgcgcct taagactaag 2220 gaaaccccat cactgggctc gggctacgac ccttattaca cctactctgg ctctataccc 2280 tacctagatg gaacctttta cctcaaccac acctttaaga aggtggccat tacctttgac 2340 tcttctgtca gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc ccaacgagtt tgaaattaag 2400 cgctcagttg acggggaggg ttacaacgtt gcccagtgta acatgaccaa agactggttc 2460 ctggtacaaa tgctagctaa ctataacatt ggctaccagg gcttctatat cccagagagc 2520 tacaaggacc gcatgtactc cttctttaga aacttccagc ccatgagccg tcaggtggtg 2580 gatgatacta aatacaagga ctaccaacag gtgggcatcc tacaccaaca caacaactct 2640 ggatttgttg gctaccttgc ccccaccatg cgcgaaggac aggcctaccc tgctaacttc 2700 ccctatccgc ttataggcaa gaccgcagtt gacagcatta cccagaaaaa gtttctttgc 2760 gatcgcaccc tttggcgcat cccattctcc agtaacttta tgtccatggg cgcactcaca 2820 gacctgggcc aaaaccttct ctacgccaac tccgcccacg cgctagacat gacttttgag 2880 gtggatccca tggacgagcc cacccttctt tatgttttgt ttgaagtctt tgacgtggtc 2940 cgtgtgcacc agccgcaccg cggcgtcatc gaaaccgtgt acctgcgcac gcccttctcg 3000 gccggcaacg ccacaacata a 3021 <210> 4 <211> 3021 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complete modified adenoviral hexon having ABD inserted in HVR5 <400> 4 atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60 tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120 ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg 180 tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac 240 aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac 300 tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc 360 tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact 420 gctcttgaaa taaacctaga agaagaggac gatgacaacg aagacgaagt agacgagcaa 480 gctgagcagc aaaaaactca cgtatttggg caggcgcctt attctggtat aaatattaca 540 aaggagggta ttcaaatagg tgtcgaaggt caaacaccta aatatgccga taaaacattt 600 caacctgaac ctcaaatagg agaatctcag tggtacgaaa cagaaattaa tcatgcagct 660 gggagagtcc taaaaaagac taccccaatg aaaccatgtt acggttcata tgcaaaaccc 720 acaaatgaaa atggagggca aggcattctt gtaaagcaac aaaatggaaa gctagaaagt 780 caagtggaaa tgcaattttt ctcaactact gaggcagccg caggcagcgg atccctggcc 840 gaggctaagg tgcttgcgaa ccgggaacta gacaaatacg gtgtttctga ttattacaag 900 aatttgatta acaatgccaa aaccgtcgag ggcgtaaagg ctctgatcga cgaaatactt 960 gcggccctac ccgggtctgg tagcggcaat ggtgataact tgactcctaa agtggtattg 1020 tacagtgaag atgtagatat agaaacccca gacactcata tttcttacat gcccactatt 1080 aaggaaggta actcacgaga actaatgggc caacaatcta tgcccaacag gcctaattac 1140 attgctttta gggacaattt tattggtcta atgtattaca acagcacggg taatatgggt 1200 gttctggcgg gccaagcatc gcagttgaat gctgttgtag atttgcaaga cagaaacaca 1260 gagctttcat accagctttt gcttgattcc attggtgata gaaccaggta cttttctatg 1320 tggaatcagg ctgttgacag ctatgatcca gatgttagaa ttattgaaaa tcatggaact 1380 gaagatgaac ttccaaatta ctgctttcca ctgggaggtg tgattaatac agagactctt 1440 accaaggtaa aacctaaaac aggtcaggaa aatggatggg aaaaagatgc tacagaattt 1500 tcagataaaa atgaaataag agttggaaat aattttgcca tggaaatcaa tctaaatgcc 1560 aacctgtgga gaaatttcct gtactccaac atagcgctgt atttgcccga caagctaaag 1620 tacagtcctt ccaacgtaaa aatttctgat aacccaaaca cctacgacta catgaacaag 1680 cgagtggtgg ctcccgggct agtggactgc tacattaacc ttggagcacg ctggtccctt 1740 gactatatgg acaacgtcaa cccatttaac caccaccgca atgctggcct gcgctaccgc 1800 tcaatgttgc tgggcaatgg tcgctatgtg cccttccaca tccaggtgcc tcagaagttc 1860 tttgccatta aaaacctcct tctcctgccg ggctcataca cctacgagtg gaacttcagg 1920 aaggatgtta acatggttct gcagagctcc ctaggaaatg acctaagggt tgacggagcc 1980 agcattaagt ttgatagcat ttgcctttac gccaccttct tccccatggc ccacaacacc 2040 gcctccacgc ttgaggccat gcttagaaac gacaccaacg accagtcctt taacgactat 2100 ctctccgccg ccaacatgct ctaccctata cccgccaacg ctaccaacgt gcccatatcc 2160 atcccctccc gcaactgggc ggctttccgc ggctgggcct tcacgcgcct taagactaag 2220 gaaaccccat cactgggctc gggctacgac ccttattaca cctactctgg ctctataccc 2280 tacctagatg gaacctttta cctcaaccac acctttaaga aggtggccat tacctttgac 2340 tcttctgtca gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc ccaacgagtt tgaaattaag 2400 cgctcagttg acggggaggg ttacaacgtt gcccagtgta acatgaccaa agactggttc 2460 ctggtacaaa tgctagctaa ctataacatt ggctaccagg gcttctatat cccagagagc 2520 tacaaggacc gcatgtactc cttctttaga aacttccagc ccatgagccg tcaggtggtg 2580 gatgatacta aatacaagga ctaccaacag gtgggcatcc tacaccaaca caacaactct 2640 ggatttgttg gctaccttgc ccccaccatg cgcgaaggac aggcctaccc tgctaacttc 2700 ccctatccgc ttataggcaa gaccgcagtt gacagcatta cccagaaaaa gtttctttgc 2760 gatcgcaccc tttggcgcat cccattctcc agtaacttta tgtccatggg cgcactcaca 2820 gacctgggcc aaaaccttct ctacgccaac tccgcccacg cgctagacat gacttttgag 2880 gtggatccca tggacgagcc cacccttctt tatgttttgt ttgaagtctt tgacgtggtc 2940 cgtgtgcacc agccgcaccg cggcgtcatc gaaaccgtgt acctgcgcac gcccttctcg 3000 gccggcaacg ccacaacata a 3021 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 5 Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 6 Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 7 Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 8 Gly Gly Gly Val Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core sequence of an albumin-binding peptide <400> 9 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 10 Lys Lys Thr Lys 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified capsid domain <400> 11 Arg Gly Asp Lys 1 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide HVR1rpsLF <400> 12 gccctggctc ccaagggtgc cccaaatcct tgcgaatggg gcctggtgat gatggc 56 <210> 13 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide HVR1rpsLR <400> 13 gtaatattta taccagaata aggcgcctgc ccaaatacgt gagttcagaa gaactcgtca 60 agaag 65 <210> 14 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDH1F <400> 14 cccaagggtg ccccaaatcc ttgcgaatgg gatgaagctg ctactgctct tgaaataaac 60 ctagaagaag aggacggcag cggatccctg 90 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDR1 <400> 15 cccggttcgc aagcacctta gcctcggcca gggatccgct gccccattc 49 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDF2 <400> 16 gcttgcgaac cgggaactag acaaatacgg tgtttctgat tattacaag 49 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDR2 <400> 17 cgacggtttt ggcattgtta atcaaattct tgtaataatc agaaacaccg 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDF3 <400> 18 atgccaaaac cgtcgagggc gtaaaggctc tgatcgacga aatacttgcg 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDR3 <400> 19 atacgtgagt gctaccagac ccgggtaggg ccgcaagtat ttcgtcgatc 50 <210> 20 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDH1R <400> 20 cagaataagg cgcctgccca aatacgtgag ttttttgctg ctcagcttgc tcgtctactt 60 cgtcttcgtt gtcatcgcta ccagacccgg g 91 <210> 21 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide H5rpsLF <400> 21 gaaagctaga aagtcaagtg gaaatgcaat ttttctcaac tggcctggtg atgatggc 58 <210> 22 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide H5rpsLR <400> 22 gtttctatat ctacatcttc actgtacaat accactttag gtcagaagaa ctcgtcaaga 60 ag 62 <210> 23 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDH5F <400> 23 ctggccgagg ctaaggtgct tgcgaaccgg gaactagaca aatacggtgt ttctgattat 60 tacaagaatt tgattaacaa tgccaaaacc gtcgagggcg taaaggctct gatcgacgaa 120 atacttgcgg ccctaccc 138 <210> 24 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ABDH5R <400> 24 ctggccgagg ctaaggtgct tgcgaaccgg gaactagaca aatacggtgt ttctgattat 60 tacaagaatt tgattaacaa tgccaaaacc gtcgagggcg taaaggctct gatcgacgaa 120 atacttgcgg ccctaccc 138 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide Ad19121F <400> 25 ctggacatgg cttccacgta 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide Ad19300R <400> 26 gctcgtctac ttcgtcttcg 20

Claims (37)

  1. 아데노바이러스 게놈으로서,
    헥손 (hexon) 단백질의 과가변부 1 (HVR1)의 코딩 영역에 삽입된 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하며,
    상기 서열은 헥손 단백질과 알부민-결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 발현하며,
    상기 헥손 단백질이 아데노바이러스의 캡시드로 조립될 때, 상기 알부민-결합 모이어티가 상기 헥손 단백질의 외표면 상에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는, 아데노바이러스 게놈.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스인, 아데노바이러스 게놈.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 혈청형 1 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스 게놈.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 혈청형 5인, 아데노바이러스 게놈.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알부민-결합 모이어티가 스트렙토코커스 단백질 G 유래의 알부민-결합 도메인, 펩토스크렙토코커스 마그누스 (Peptostreptococcus magnus) 단백질 PAB 유래의 알부민-결합 도메인, 및 코어 서열 DICLPRWGCLW (서열번호 9)를 가진 알부민-결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스 게놈.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알부민-결합 모이어티가 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유래되는 알부민-결합 도메인 3인, 아데노바이러스 게놈.
  7. 제6항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유래되는 알부민-결합 도메인 3의 서열이 서열번호 1인, 아데노바이러스 게놈.
  8. 제1항에 있어서, 상기 알부민-결합 모이어티를 코딩하는 서열은, 제조되는 융합 단백질이 GenBank 수탁 번호 BAG48782.1의 헥손 단백질의 넘버링 (numbering)에 따라 헥손 단백질의 D150 아미노산 다음에 알부민-결합 모이어티를 포함하도록, 삽입되는, 아데노바이러스 게놈.
  9. 제1항에 있어서, 상기 알부민-결합 모이어티의 N-말단 및/또는 C-말단이 링커 서열을 통해 헥손 단백질과 연결되는, 아데노바이러스 게놈.
  10. 제9항에 있어서, 상기 링커 서열이 서열 GSGS (서열번호 2)로 이루어진, 아데노바이러스 게놈.
  11. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 조직-특이적 프로모터 또는 종양-특이적 프로모터를 더 포함하는, 아데노바이러스 게놈.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조직-특이적 프로모터 또는 상기 종양-특이적 프로모터가 E1a, E1b, E2 및 E4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위한 프로모터 서열인, 아데노바이러스 게놈.
  13. 제12항에 있어서, 상기 프로모터가 E2F 프로모터, 텔로머라제 hTERT 프로모터, 티로시나제 프로모터, 전립선-특이 항원 프로모터, alpha-페토프로테인 프로모터 및 COX-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스 게놈.
  14. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 종양분해성 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus)인, 아데노바이러스 게놈.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이, 종양에서 선택적인 복제를 달성하도록, E1a, E1b, E4 및 VA-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 돌연변이를 더 포함하는, 아데노바이러스 게놈.
  16. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈이 아데노바이러스의 감염성을 높이거나 또는 이를 종양 세포에 존재하는 수용체로 표적화하기 위한 캡시드 변형을 더 포함하는, 아데노바이러스 게놈.
  17. 제16항에 있어서, 상기 캡시드의 변형이 아데노바이러스 섬유 단백질의 H1 루프내 RGD 모티프의 삽입인, 아데노바이러스 게놈.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 캡시드의 변형이 섬유 유전자의 부분을 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래된 상동적인 부분으로 치환하여, 키메라 아데노바이러스를 형성하는, 아데노바이러스 게놈.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 게놈이 상기 게놈에 삽입되는 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자 (non-adenoviral gene)를 포함하며,
    상기 유전자가 유전자 테라피 또는 백신면역화 (vaccination)에 사용되는 유전자인, 아데노바이러스 게놈.
  20. 제19항에 있어서, 상기 유전자가 암 유전자 테라피에 사용되는 유전자인, 아데노바이러스 게놈.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암 유전자 테라피에 사용되는 상기 유전자가 프로드럭-활성화 유전자, 종양-억제인자 유전자, 항-종양성 간섭 RNA를 코딩하는 유전자 및 면역자극 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자인, 아데노바이러스 게놈.
  22. 제1항에 따른 아데노바이러스 게놈을 가진 재조합 아데노바이러스.
  23. 치료학적인 유효량의 제22항에 따른 재조합 아데노바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    포유류에서 암 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 아데노바이러스가, 아데노바이러스의 게놈에 삽입된 암 유전자 테라피에 사용되는 하나 이상의 비-아데노바이러스성 유전자를 포함하는 아데노바이러스 게놈을 가진 아데노바이러스 또는 종양분해성 아데노바이러스인, 약학적 조성물.
  24. 치료학적인 유효량의 제22항에 따른 재조합 아데노바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    포유류에서 감염성 질환의 예방에 사용하는 백신을 제조하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 아데노바이러스가, 아데노바이러스의 게놈에 삽입된, 백신면역화에 사용되는 하나 이상의 비-아데노바이러스 유전자를 포함하는 아데노바이러스 게놈을 가진 것인, 약학적 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 포유류가 인간인, 약학적 조성물.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 전신으로 투여되는, 약학적 조성물.
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