JP4744771B2 - 副作用を軽減した新規な組換えアデノウイルスベクター - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、遺伝子治療用の組換えアデノウイルスベクター及びその製造方法などに関する。具体的には、本発明は、アデノウイルスゲノム中に挿入された外来プロモーターによるアデノウイルス遺伝子の発現誘導を抑制することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症を軽減した新規な組換えアデノウイルスベクター及びその製造方法、前記組換えアデノウイルスベクターの製造に用いる細胞株、あるいは前記組換えアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療方法などに関する。
背景技術
アデノウイルスベクターは、遺伝子導入効率の高さ、非分裂細胞にも遺伝子導入できること、高力価のウイルス液の調製の容易さなどの利点から、動物細胞への優れた遺伝子導入用ベクターであり、遺伝子治療用のベクターとして臨床応用が試みられている。現在、広く用いられているアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの増殖および全てのアデノウイルスタンパク質の発現に必須のＥ１遺伝子を欠失させた非増殖型のベクターで、このベクターは第一世代アデノウイルスベクターとも呼ばれている（さらにＥ３遺伝子の欠失を含む場合もある）。
第一世代アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子を欠失しているため、ヒト細胞などＥ１遺伝子を発現していない通常の細胞では、一切のアデノウイルスタンパク質は発現しないと考えられていた。しかし最近の研究により、第一世代アデノウイルスベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子導入を行うと、導入遺伝子の発現は一過的であり、しかも遺伝子導入した部位に炎症反応の生じることが明らかとなってきた（Ｙａｎｇ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９１，４４０７−４４１１，（１９９４）、およびＷｉｌｍｏｔｔ Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．７，３０１−３１８．（１９９６））。
その原因の説明として、次の仮説が提唱された。第一世代アデノウイルスベクターを感染させた細胞では、まず細胞由来の転写因子によりＥ２Ａ遺伝子などのアデノウイルス初期遺伝子が微量に発現し、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を活性化する。次いで、主要後期タンパク質が発現し、それに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、ＣＴＬにより外来遺伝子導入細胞が排除される。すなわち、アデノウイルス初期タンパク質の発現を介した後期タンパク質の発現が、炎症反応および導入遺伝子の発現が持続しない原因であるとの説である（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｊ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９１，６１９６−６２００．（１９９４）、およびＹａｎｇ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｎｅｎｔ．，Ｖｏｌ．７，３６２−３６８．（１９９４））。
この仮説に基づき、Ｅ１遺伝子以外のアデノウイルスの増殖に必須の遺伝子も欠失させ、その遺伝子にコードされるタンパク質をウイルス産生細胞から補うことによりウイルスの増殖を可能とした、種々の改良型アデノウイルスベクターが構築された。その例として、Ｅ２Ａ遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクター（Ｚｈｏｕ Ｈ．ｅｔ，ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７０，７０３０−７０３８．（１９９６）、およびＧｏｒｚｉｇｌｉａ Ｍ．Ｉ．ｅｔ，ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７０，４１７３−４１７８．（１９９６））、Ｅ２Ａ遺伝子と同じく初期遺伝子であるＥ４遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクター（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．６，１５７５−１５８６．（１９９５）、およびＷａｎｇ Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．２，７７５−７８３．（１９９５）、Ｙｅｈ Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７０，５５９−５６５．（１９９６））などが報告されている。しかしながら、Ｅ２Ａ遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の発現期間の延長や炎症反応の低下などのベクターの改良の効果はほとんど認められていない（Ｍｏｒｒａｌ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．８，１２７５−１２８６．（１９９７）、およびＬｕｓｋｙ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７２，２０２２−２０３２．（１９９８）、およびＯ’ｎｅａｌ Ｗ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，１５８７−１５９８．（１９９８））。またＥ４遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクターでは、若干の改良効果が認められたものの不十分であったことが報告されている（Ｇａｏ Ｇ−Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７０，８９３４−８９４３．（１９９６）、Ｗａｎｇ Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．４，３９３−４００．（１９９７）、およびＤｅｄｉｅｕ Ｊ−Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，４６２６−４６３７．（１９９７））。
そこで、さらなる改良型ベクターとして、逆方向反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ：ＩＴＲ）とパッケージング配列のみを残し、他のアデノウイルス遺伝子全てを欠失し、そしてヘルパーウイルスに依存して増殖する、ヘルパー依存型アデノウイルスベクター（ＨＤベクター）が考案された（Ｋｏｃｈａｎｅｋ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，５７３１−５７３６．（１９９６）、およびＰａｒｋｓ Ｒ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３５６５−１３５７０．（１９９６））。このＨＤベクターは、ガッティド（ｇｕｔｔｅｄ）ベクターまたはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）ベクターとも呼ばれている。当該ＨＤベクターでは、導入遺伝子の発現期間の延長や炎症反応の低下など、ベクターの改良の効果が現れたことが報告されている（Ｍｏｒｓｙ Ｍ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５，７８６６−７８７１．（１９９８）、およびＳｃｈｉｅｄｎｅｒ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｎｅｎｔ．，Ｖｏｌ．１８，１８０−１８３．（１９９８）、およびＭｏｒｒａｌ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，２７０９−２７１６．（１９９８））。
しかし、このＨＤベクターを医薬品として臨床応用する場合、ベクターの生産性の低さという大きな問題点がある。その理由は次の通りである。まずＨＤベクター産生時において、ＨＤベクターは増殖に必要なタンパク質全ての供給をヘルパーアデノウイルスに依存している。そして、ヘルパーウイルスを常に一定割合以下に保ちながらＨＤベクターを増殖させるという生産原理から、報告された単位細胞当たりのＨＤベクターの産生量は、第一世代アデノウイルスベクターに較べると明らかに低い（Ｍｏｒｓｙ Ｍ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５，７８６６−７８７１．（１９９８）、およびＳｃｈｉｅｄｎｅｒ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｎｅｎｔ．，Ｖｏｌ．１８，１８０−１８３．（１９９８））。また目的のＨＤベクターには産生に用いたヘルパーウイルスが常に混入しているため、両ウイルスの比重の微妙な差に基づいた超遠心法により両ウイルスを分離し、ヘルパーウイルスを除去しなければならない。第一世代アデノウイルスベクターも超遠心法により精製を行う場合があるが、その目的はアデノウイルス粒子から挟雑タンパク質を除くことにある。一方、ＨＤベクターの精製においては、挟雑タンパク質を除くと共に、前記のようにヘルパーウイルスを分離する必要があるため、一度の超遠心で精製できる量は第一世代アデノウイルスベクターよりも少ない。もし、ヘルパーウイルスが十分に除去されていなければ、ベクターの安全性自体が懸念される。さらに、第一世代アデノウイルスベクターは、超遠心法よりも大量のウイルスを扱えるカラム法（Ｈｕｙｇｈｅ Ｂ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．６，１４０３−１４１６．（１９９５））による精製も可能であるが、ＨＤベクターにおいてはヘルパーウイルスの除去の必要性から、現在の技術水準ではカラム法は適用できない。以上の理由から、ＨＤベクターは培養細胞での産生時及びその後の精製過程の両方において、第一世代アデノウイルスベクターよりも生産性が明らかに低い。従って、臨床に必要な十分量のＨＤベクターを製造することは極めて困難であり、非現実的であると考えられる。
さらに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターやラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのウイルス由来プロモーターは、プロモーター活性が高いためアデノウイルスベクターをはじめとする遺伝子治療用のベクターに汎用されているが、ｉｎ ｖｉｖｏでこれらのプロモーターから目的遺伝子を長期間発現させるためには、アデノウイルスＥ４遺伝子にコードされるタンパク質が必要であると報告されている（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，２４０８−２４１６．（１９９７）、およびＢｒｏｕｇｈ Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，９２０６−９２１３．（１９９７））。このようなプロモーター活性の持続の観点からも、高活性なウイルス由来プロモーターを挿入したアデノウイルスベクターは、第一世代アデノウイルスベクターに近い構造のベクターを用いる必要がある。
発明の開示
本発明の目的は、ヘルパーウイルスに依存せず増殖することができるアデノウイルスベクターであって、かつｉｎ ｖｉｖｏでアデノウイルスタンパク質がほとんど発現せず、その結果炎症反応を誘導せず導入遺伝子の発現期間を持続させることができるという性質を有した、新たなアデノウイルスベクターを提供することにある。さらに、かかるアデノウイルスベクターを遺伝子治療に提供することにある。
本発明者らは、Ｅ１遺伝子を欠失した第一世代アデノウイルスベクターを動物個体に投与した際に炎症反応が起きる原因を鋭意検討した。その結果、Ｅ１タンパク質が存在しない細胞に第一世代アデノウイルスベクターを感染させた際にアデノウイルスタンパク質が発現する機構は、従来の仮説とは全く異なることを発見した。すなわち本発明者らは、アデノウイルスタンパク質の発現の引き金となるのは、従来言われていた初期遺伝子の発現によるものではなく、アデノウイルスベクターに挿入した外来プロモーターによるものであることを明らかにした。具体的には、外来プロモーター中の特定の構成成分（エンハンサーなど）が当該プロモーター近傍に存在するアデノウイルスプロモーターに作用し、その結果、アデノウイルス遺伝子が発現するという新たな機構を解明した。しかも、主に発現するアデノウイルス遺伝子は、従来言われていた、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に制御され、ヘキソンなどをコードする主要後期遺伝子ではなく、独立したプロモーターを持つタンパク質ＩＸ遺伝子であることを発見した。
タンパク質ＩＸはアデノウイルスの増殖に必須のタンパク質ではないが、完全なアデノウイルス粒子を構成するために必要なタンパク質である。従って、第一世代アデノウイルスベクターから単にタンパク質ＩＸ遺伝子を欠失させるだけでは、本発明者らが目的とする正常なアデノウイルスベクターは得られない。そこで、本発明者らはさらに鋭意検討し、次の２種類の方法により当該課題を解決できることを見出した。一つは、当該アデノウイルスベクターのタンパク質ＩＸ遺伝子を、正常な位置から外来プロモーターの影響を受けない位置に再配置する方法である（タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターと称する）。もう一つは、当該アデノウイルスベクターからタンパク質ＩＸ遺伝子を欠失させ、タンパク質ＩＸを産生する新たな細胞株を作製し、当該細胞株によりタンパク質ＩＸ遺伝子を欠失したアデノウイルスベクターを製造する方法である（タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクター）。
さらに、本発明者らの検討から、外来プロモーターの影響を受け発現が誘導されるアデノウイルス遺伝子は、主にはタンパク質ＩＸ遺伝子であるが、タンパク質ＩＶａ２遺伝子ならびにＬ１遺伝子も発現誘導される可能性があることも明らかになった。従って、タンパク質ＩＶａ２ならびにＬ１遺伝子のプロモーターを外来プロモーターの影響を受けないように改変したアデノウイルスベクターも、それ単独もしくはタンパク質ＩＸ遺伝子の改変と組み合わせることにより、アデノウイルスタンパク質が発現せず炎症を誘導しにくいベクターとして用いることができる。
本発明は、以上のような知見に基き完成するに至ったものである。
即ち本発明は、
１． 以下の（１）〜（４）の特徴を有する、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症が軽減される組換えアデノウイルスベクター：
（１）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（２）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（３）以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）の特徴を有する；
（Ａ）外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウイルスゲノムの遺伝子が、正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されているか、又は欠失している；
（Ｂ）外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウイルスゲノム遺伝子のプロモーターの塩基配列が、外来プロモーターの作用を受けないように置換されている；
（４）アデノウイルス野性株と同等の性質を有する正常なウイルス粒子を形成している、
２． アデノウイルスゲノムのプロモーターがＭＬＰ及び／又はＩＶａ２遺伝子プロモーターである、前記１．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３． 以下の（５）〜（８）の特徴を有する、前記１．又は２．記載の組換えアデノウイルスベクター：
（５）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（６）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（７）アデノウイルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子が、正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されている；
（８）アデノウイルス野性株と同等のタンパク質ＩＸを含有し、正常なウイルス粒子を形成している、
４． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位に、外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている、前記１．〜３．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
５． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記１．〜４．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
６． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子、ならびにタンパク質ＩＸ遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記３．〜５．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
７． アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記１．〜６．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
８． アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記１．〜７．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
９． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子の少なくとも１つのＯＲＦを保持する、前記１．〜８．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
１０． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３を保持する、前記９．記載の組換えアデノウイルスベクター、
１１． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３以外の他のＯＲＦの全部又は一部が欠失した、前記１０．記載の組換えアデノウイルスベクター、
１２． 外来プロモーターから１８ｋｂ以上離れた位置にタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された、前記３．〜１１．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
１３． アデノウイルスゲノムのＬ３遺伝子とＥ２Ａ遺伝子の間にタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された、前記１２．記載の組換えアデノウイルスベクター、
１４． 外来プロモーターから２４ｋｂ以上離れた位置にタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された、前記３．〜１１．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
１５． アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子欠失部位にタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された、前記１４．記載の組換えアデノウイルスベクター、
１６． 外来プロモーターから３０ｋｂ以上離れた位置にタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された、前記３．〜１１．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
１７． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子上流領域と３’ＩＴＲとの間にタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された、前記１６．記載の組換えアデノウイルスベクター、
１８． 外来プロモーターが哺乳動物由来及び／又は動物ウイルス由来の成分を含む、前記１．〜１７．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
１９． 外来プロモーターがＣＭＶエンハンサーを含む、前記１８．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２０． 外来プロモーターがＣＭＶプロモーターである、前記１９．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２１． 外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、前記１９．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２２． 外来プロモーターがＲＳＶプロモーター又はＳＲαプロモーターである、前記１８．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２３． アデノウイルスがヒトアデノウイルスであることを特徴とする、前記１．〜２２．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
２４． アデノウイルスが２型又は５型のアデノウイルスであることを特徴とする、前記２３．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２５． 以下の（９）〜（１１）の特徴を有する、前記１．又は２．記載の組換えアデノウイルスベクター：
（９）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子、ならびにタンパク質ＩＸ遺伝子が欠失している；
（１０）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（１１）アデノウイルス野生株と同等のタンパク質ＩＸを含有し、正常なウイルス粒子を形成している、
２６． アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記２５．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２７． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位、又はＥ３遺伝子欠失部位に、外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている、前記２５．又は２６．記載の組換えアデノウイルスベクター、
２８． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子、Ｅ３遺伝子、ならびにタンパク質ＩＸ遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記２５．〜２７．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
２９． アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子の全部又は一部が欠失した、前記２５．〜２８．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
３０． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子の少なくとも１つのＯＲＦを保持する、前記２５．〜２９．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
３１． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３を保持する、前記３０．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３２． アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３以外の他のＯＲＦの全部又は一部が欠失した、前記３１．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３３． 外来プロモーターが哺乳動物由来及び／又は動物ウイルス由来の成分を含む、前記２５．〜３２．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
３４． 外来プロモーターがＣＭＶエンハンサーを含む、前記３３．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３５． 外来プロモーターがＣＭＶプロモーターである、前記３４．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３６． 外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、前記３４．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３７． 外来プロモーターがＲＳＶプロモーター又はＳＲαプロモーターである、前記３３．記載の組換えアデノウイルスベクター、
３８． アデノウイルスがヒトアデノウイルスであることを特徴とする、前記２５．〜３７．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
３９． アデノウイルスが２型又は５型のアデノウイルスであることを特徴とする、前記３８．記載の組換えアデノウイルスベクター、
４０． 以下の（１２）及び（１３）の特徴を有する、哺乳動物由来の細胞：
（１２）アデノウイルスのＥ１遺伝子及びタンパク質ＩＸ遺伝子を発現する；
（１３）前記２５．〜３９．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクターを増殖できる、
４１． アデノウイルスのタンパク質ＩＸ遺伝子が、当該遺伝子の本来のプロモーター以外の外来プロモーターにより発現制御されている、前記４０．記載の細胞、
４２． アデノウイルスのＥ１遺伝子及びタンパク質ＩＸ遺伝子以外の少なくとも１つ以上のアデノウイルスの遺伝子をさらに発現する、前記４０．又は４１．記載の細胞、
４３． アデノウイルスのＥ１遺伝子、タンパク質ＩＸ遺伝子、及びＥ２Ａ遺伝子を発現する、前記４２．記載の細胞、
４４． 前記４０．〜４３．いずれか記載の細胞を用いることを特徴とする、前記２５．〜３９．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクターの製造方法、
４５． 以下の（１４）及び（１５）の特徴を有する、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症が軽減される組換えアデノウイルスベクター：
（１４）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（１５）アデノウイルスゲノムに、アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーターが挿入されている、
４６． 以下の（１６）〜（１８）の特徴を有する、前記４５．記載の組換えアデノウイルスベクター：
（１６）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（１７）アデノウイルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子を本来の位置に保持している；
（１８）アデノウイルスゲノムに、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーターが挿入されている、
４７． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位に、外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている、前記４５．又は４６．記載の組換えアデノウイルスベクター、
４８． 外来プロモーターがＣＭＶエンハンサーを含まないことを特徴とする、前記４５．〜４７．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
４９． 外来プロモーターを含む外来遺伝子が左向きに挿入されている、前記４５．〜４８．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
５０． 外来プロモーターがＥＦ１αプロモーターである、前記４５．〜４９．いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
５１． 以下の（１９）〜（２１）の特徴を有する、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症が軽減される組換えアデノウイルスベクター：
（１９）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（２０）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（２１）外来プロモーターとアデノウイルス遺伝子との間に、外来プロモーターによるアデノウイルス遺伝子の発現誘導を抑制する性質を有する塩基配列が挿入されている、
５２． アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位に、外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている、前記５１．記載の組換えアデノウイルスベクター、
５３． 外来プロモーターがＣＭＶエンハンサーを含むことを特徴とする、前記５１．又は５２．記載の組換えアデノウイルスベクター、
５４． 前記１．〜３９．及び前記４５．〜５３．より選択される組換えアデノウイルスベクターを有効成分として含有する、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない医薬組成物、
５５． 前記１．〜３９．及び前記４５．〜５３．より選択される組換えアデノウイルスベクターを哺乳動物に投与することからなる、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症を軽減する方法、
５６． 前記１．〜３９．及び前記４５．〜５３．より選択される組換えアデノウイルスベクターを哺乳動物に投与することからなる、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症が軽減される遺伝子治療方法、
５７． ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない医薬組成物を製造するための前記１．〜３９．及び前記４５．〜５３．より選択される組換えアデノウイルスベクターの使用、ならびに
５８． ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない遺伝子治療用医薬組成物を製造するための前記１．〜３９．及び前記４５．〜５３．より選択される組換えアデノウイルスベクターの使用、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明においては、組換えアデノウイルスベクターをｉｎ ｖｉｖｏ投与した際に生じる炎症の原因が、外来プロモーターに起因することを初めて明らかにした。具体的には、本来発現しないはずのアデノウイルスゲノムの遺伝子が、外来プロモーターの作用により発現し、そしてこの発現したアデノウイルス由来のタンパク質が炎症の原因となることを初めて明らかにした。
従って、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症を軽減するためには、外来プロモーターの作用を受けないように、組換えアデノウイルスベクターのゲノム構造を適宜改変すれば良いことは明らかである。このように、外来プロモーターの作用を受けないように組換えアデノウイルスベクターのゲノム構造を改変することは、当業者であれば、通常の遺伝子組換え技術を用いることにより行うことができる。
本発明においては、以上のような外来プロモーターの作用を受けないように組換えアデノウイルスベクターのゲノム構造を改変したものであれば、いかなる構造を有するものであっても、本発明の組換えアデノウイルスベクターの範疇に含まれる。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの代表的な形態として、以下の（１）〜（４）の特徴を有するものが挙げられる。
（１）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（２）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（３）以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）の特徴を有する；
（Ａ）外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウイルスゲノムの遺伝子が、正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されているか、又は欠失している；
（Ｂ）外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウイルスゲノム遺伝子のプロモーターの塩基配列が、外来プロモーターの作用を受けないように置換されている；
（４）アデノウイルス野性株と同等の性質を有する正常なウイルス粒子を形成している。
ここで、本発明の組換えアデノウイルスベクターを作製するために用いられるアデノウイルスは、動物を自然宿主とするウイルスであり、特にヒトを宿主とするヒトアデノウイルスが好適に用いられ、さらに好適にはヒトアデノウイルス２型や５型などＣ亜群のヒトアデノウイルスが用いられる。本明細書ではアデノウイルスゲノムでの遺伝子の位置を示すため、マップ単位（ｍａｐ ｕｎｉｔｓ、以後ｍ．ｕ．と略す、１ｍ．ｕ．は約３６０塩基対）を使用することがあるが、その値はアデノウイルス５型を基準にしたものを用いている。当該アデノウイルスのゲノム構造は周知であり、例えばヒトアデノウイルス２型ゲノムの全塩基配列はジーンバンク（アクセス番号Ｊ０１９４９）に、またヒトアデノウイルス５型ゲノムの全塩基配列はジーンバンク（アクセス番号Ｍ７３２６０）に登録されている。
前記（１）においてアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が欠失しているとは、両遺伝子の全てもしくは一部の塩基配列が存在しないことであり、機能的なＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質が産生されないような欠失であれば、欠失する範囲に特に制限はない。また、Ｅ１Ｂ遺伝子の一部と完全に重複する位置にタンパク質ＩＸ遺伝子が存在するが、通常Ｅ１Ｂ遺伝子の欠失にはタンパク質ＩＸ遺伝子の欠失は含まれない。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失の例として、アデノウイルス５型の１．３−９．３ｍ．ｕ．の欠失（Ｅ１Ａ遺伝子の全てとＥ１Ｂ遺伝子の大半を欠失；Ｔｒａｐｎｅｌｌ Ｂ．Ｃ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．１２，１８５−１９９．（１９９３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．）が挙げられる。当該欠失は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等の基本書に基いて、当業者ならば容易に行うことができる。
本発明において、Ｅ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子とを合わせて、単にＥ１遺伝子もしくはＥ１領域と呼ぶことがある。
前記（２）において外来プロモーターとは、アデノウイルスの本来のプロモーター以外のプロモーターのことであり、また外来遺伝子とは、プロモーター、タンパク質などをコードする遺伝子、及びポリＡ配列などから成る転写を行うための塩基配列を指す。当該外来遺伝子とは、遺伝子治療を目的とする場合には、通常、対象疾患を治療するためのタンパク質などを発現させる遺伝子を指す。外来遺伝子は、市販されている種々の発現ベクターに所望のタンパク質をコードする遺伝子を挿入することなどにより、容易に作製することができる。また、作製された外来遺伝子をアデノウイルスゲノムへ挿入することも、文献等に記載された公知の技術（Ｇｒａｈａｍ Ｆ．Ｌ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９１，８８０２−８８０６．（１９９４）、およびＭｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ，９３，１３２０−１３２４．（１９９６）など）に基づき容易に行うことができる。なお、外来遺伝子は、前記Ｅ１遺伝子欠失部位に挿入されることが好ましい。
前記（３）において、外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウイルスゲノムの遺伝子とは、外来プロモーター中の特定の構成成分の作用により遺伝子の転写が生じるような、アデノウイルスゲノムの遺伝子を指す。具体的には、タンパク質ＩＸ遺伝子、タンパク質ＩＶａ２遺伝子、Ｌ１遺伝子が挙げられる。
前記（３）の（Ａ）においては、このような外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウイルスゲノムの遺伝子を、正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置するか、又は当該遺伝子を欠失させることにより、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時の当該遺伝子の発現を阻止することができる。その具体例として、タンパク質ＩＸ遺伝子が挙げられる。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症が軽減されるという、本発明の目的を達成することができる。なお、前記において遺伝子を欠失させた場合には、正常なウイルス粒子を形成させるために、組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、あらかじめ欠失させた遺伝子を導入し、発現させておく必要がある。
以上のような遺伝子の再配置及び欠失の具体例については後に詳しく述べるが、基本的には、種々の再配置又は欠失を施した組換えアデノウイルスベクターを作製し、実施例５に記載のｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症の有無の検討や、実施例６に記載のノザンブロット解析等を行うことにより、どのような再配置や欠失であれば本発明の目的にかなうものであるかを評価することができる。
前記（３）の（Ｂ）における遺伝子の具体例としては、ＭＬＰ（Ｍａｊｏｒ Ｌａｔｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及び／又はＩＶａ２遺伝子プロモーターが挙げられる。これらアデノウイルスゲノムのプロモーターの塩基配列を、本来の機能を損なわない範囲で外来プロモーターの作用を受けないように置換することにより、前記アデノウイルスゲノムのプロモーターの支配下にある遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ投与時の発現を阻止することができる。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症が軽減されるという、本発明の目的を達成することができる。なお、具体的な置換等に関しては、後述の実施例を参考にして当業者であれば適宜行うことができる。すなわち、種々の置換を施した組換えアデノウイルスベクターを作製し、実施例５に記載のｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症の有無の検討や、実施例６に記載のノザンブロット解析等を行うことにより、如何なる置換であれば本発明の目的にかなうものであるかを評価することができる。
以上の（３）の（Ａ）及び（Ｂ）に記載のアデノウイルス遺伝子の再配置、欠失および置換の具体的な操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等の基本書や、公知の組換えアデノウイルス作製技術（Ｇｒａｈａｍ Ｆ．Ｌ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９１，８８０２−８８０６．（１９９４）、およびＭｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６）など）に基いて、当業者ならば容易に行うことができる。
前記（４）においてアデノウイルス野性株と同等の性質を有するとは、タンパク質等のウイルス粒子の構成成分の比率やウイルス粒子の物理化学的性質、ならびに細胞への感染性を保持するという観点において、野生株とほぼ同じ性質を有することを言う。
以上のような本発明の組換えアデノウイルスベクターにおいては、前記Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子以外の少なくとも一つのアデノウイルスゲノムの遺伝子の全部又は一部を、さらに欠失させることも可能である。具体的には、Ｅ３遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、及び／又はＥ４遺伝子の、全部又は一部を欠失させることが可能である。ここでＥ４遺伝子を欠失させる場合には、Ｅ４遺伝子の少なくとも１つのＯＲＦを保持した欠失が好ましい。特に、少なくともＯＲＦ３を保持した欠失が好ましい。これらの欠失に関しては後に詳述する。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの好適な形態としては、以下の（５）〜（８）の特徴を有するものが挙げられる。
（５）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（６）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（７）アデノウイルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子が、正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されている；
（８）アデノウイルス野性株と同等のタンパク質ＩＸを含有し、正常なウイルス粒子を形成している。
以下、これらの特徴を有する組換えアデノウイルスベクターを例にとり、本発明を詳しく説明する。
前記（６）における外来遺伝子は、Ｅ１遺伝子欠失部位に挿入されていることが好ましい。さらに好ましくは、ウイルスゲノムの１．３−１１．２ｍ．ｕ．が欠失した部位、すなわちＥ１遺伝子の全ておよびタンパク質ＩＸ遺伝子が欠失（再配置による）した部位に、外来遺伝子が挿入されていることが望ましい。
前記（７）のアデノウイルスタンパク質ＩＸ（以下、ｐＩＸと呼ぶこともある）は、アデノウイルス粒子のキャプシド中の９個群ヘキソン（ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｎｉｎｅ ｈｅｘｏｎｓ）を構成する少量の成分であり、ビリオンの熱安定性、およびパッケージングできるウイルスゲノムのサイズに関与している。タンパク質ＩＸはアデノウイルスの増殖に必須の成分ではないが、タンパク質ＩＸを欠失したビリオンは熱に対して不安定となり（Ｃｏｌｂｙ Ｗ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．３９，９７７−９８０．（１９８１））、また野生株の９０％のサイズのゲノムＤＮＡしかパッケージングできない（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ，６，１７３３−１７３９．（１９８７））。従って、正常のウイルス粒子を形成するためにはタンパク質ＩＸが必要である。
前記（７）において、アデノウイルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子が正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されていることとは、野生型アデノウイルスゲノムにおいてタンパク質ＩＸ遺伝子が本来存在する位置、すなわちヒトアデノウイルス５型ゲノムにおいては９．７−１１．２ｍ．ｕ．の位置（Ｍａａｔ Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０，２７−３８．（１９８０））にはタンパク質ＩＸ遺伝子が存在せず、アデノウイルスゲノムの他の任意の位置にタンパク質ＩＸ遺伝子が存在することである。また、タンパク質ＩＸ遺伝子が外来プロモーターによる発現誘導を受けないとは、外来プロモーターによりタンパク質ＩＸ遺伝子の転写が誘導されないことを示す。以後、このタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置されたアデノウイルスベクターを、「タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクター」と呼ぶこともある。
前記（７）において、タンパク質ＩＸ遺伝子を再配置する位置としては、タンパク質ＩＸ遺伝子が外来プロモーターによる発現誘導を受けず、かつベクターの増殖サイクルにおいてタンパク質ＩＸの発現が著しく抑制されない限り、特に制限はない。しかし、外来プロモーターから十数ｋｂ以上離れた位置で、しかも外来遺伝子のクローニングが容易な位置に再配置することが望ましい。そのような位置の好適な例としては、外来プロモーターから１８ｋｂ以上離れた位置が挙げられ、その具体例としては、アデノウイルスゲノムのＬ３遺伝子とＥ２Ａ遺伝子との間（特開平８−３０８５８５）の位置が挙げられる。また、別の好適な例としては、外来プロモーターから２４ｋｂ以上離れた位置が挙げられ、その具体例としては、アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子の欠失部位が挙げられる。さらに、別の好適な例としては、外来プロモーターから３０ｋｂ以上離れた位置が挙げられ、その具体例としては、アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲ（逆方向反復配列）との間の位置（Ｓａｉｔｏ Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５４，７１１−７１９．（１９８５））が挙げられる。タンパク質ＩＸ遺伝子の正常な位置からの欠失、及び、前記の位置への再配置は、通常の遺伝子組換え技術や前述した公知の組換えアデノウイルス作製技術に基づき容易に行うことができる。また、作製されたタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターが本発明の目的にかなうものであるかどうかは、実施例５に記載のｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症の有無の検討や、実施例６に記載のノザンブロット解析等を行うことにより、評価することができる。
前記（８）において、アデノウイルス野生株と同等のタンパク質ＩＸを含有するウイルス粒子とは、野生型アデノウイルス粒子に含まれるタンパク質ＩＸとほぼ同じ比率のタンパク質ＩＸを含むアデノウイルス粒子のことである。また正常のウイルス粒子とは、細胞への感染性を保持し、熱安定性およびパッケージングできるゲノムＤＮＡのサイズなどが、野生型アデノウイルスとほぼ同様の性質を示すアデノウイルス粒子のことである。
前記タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターにおいては、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を欠失させ、タンパク質ＩＸ遺伝子を再配置し、さらに、それ以外のアデノウイルスゲノムの遺伝子の全部又は一部を欠失させることができる。具体的には、Ｅ３遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、及び／又はＥ４遺伝子の全部又は一部を欠失させることなどが可能である。ここで「全部又は一部」の長さとしては、機能的なウイルスタンパク質が産生されないような欠失であれば、欠失する範囲に特に制限はない。また、前記Ｅ３遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、及びＥ４遺伝子等のアデノウイルスゲノムの塩基配列は、例えば文献（Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｈ．Ｓ．編集、１９８４，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されており、当業者であれば、これらの遺伝子をアデノウイルスベクターから欠失させる操作を容易に行うことができる。
前記遺伝子のうち、Ｅ３遺伝子の全部又は一部を欠失させることにより、より長いサイズの外来遺伝子の挿入が可能となる。当該Ｅ３遺伝子の全部または一部を欠失させた場合は、組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、当該Ｅ３遺伝子を発現させる必要ない。一方、Ｅ２Ａ遺伝子やＥ４遺伝子の全部又は一部を欠失させた場合は、正常なウイルス粒子を形成させるために、組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、あらかじめ欠失させた遺伝子を導入し、発現させておく必要がある。
Ｅ４遺伝子を欠失させる場合には、Ｅ４遺伝子の少なくとも１つのＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）を保持することが望ましい。特に、Ｅ４遺伝子のＯＲＦ３を保持していることが望ましい。５型や２型のアデノウイルスにおいて、Ｅ４遺伝子には転写後のＲＮＡのスプライシングの違いにより７種類のポリペプチドがコードされており、ＯＲＦ３はそのポリペプチドの一つである。ＯＲＦ３は、アデノウイルスの増殖サイクルにおいて、ウイルス遺伝子の発現ならびにＤＮＡ複製を促進する機能を有している。一方、後述するＣＭＶプロモーターなどの一部の外来プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏでそのプロモーター活性を長期間維持するには、Ｅ４遺伝子のＯＲＦ３が必要だとされている（Ｌｕｓｋｙ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７３，８３０８−８３１９．（１９９９）、およびＹｅｗ Ｎ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．１０，１８３３−１８４３．（１９９９））。以上の理由により、当該ＯＲＦ３を保持することが望ましい。
本発明のタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターを生産する細胞株は、ヒト胎児腎由来２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）のように、Ｅ１遺伝子を発現し組換えアデノウイルスベクターの生産に適した細胞株であれば特に制限はない。ただし、細胞株の染色体にインテグレーションされたアデノウイルスＤＮＡとベクターのゲノムとの間に相同なＤＮＡ配列が存在すると、相同組換えにより目的としないアデノウイルスが生成する可能性がある。そこで、当該アデノウイルスベクターの生産には、ベクターのゲノムと細胞株の染色体との間に重複するＤＮＡ配列が極力存在しないよう、Ｅ１遺伝子の必要最低限の部分のみを含む細胞株を使用するのが好ましい。その例として、ヒト胎児網膜（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｒｅｔｉｎａ：ＨＥＲ）細胞由来のＰＥＲ細胞株（Ｆａｌｌａｕｘ Ｆ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，１９０９−１９１７．（１９９８））が挙げられる。また、Ｅ１遺伝子に加え、必要に応じてＥ２Ａ遺伝子など他のアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株も用いることができる。当該他のアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株は、例えば適当な発現ベクターに当該アデノウイルス遺伝子を組み込んで作製した発現ベクターを、常法により前記Ｅ１遺伝子発現細胞に導入することにより、作製することができる。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの他の好適な形態としては、アデノウイルスゲノムからはＥ１遺伝子およびタンパク質ＩＸ遺伝子が欠失しているが、当該ウイルス粒子には正常量のタンパク質ＩＸを含むアデノウイルスベクターが挙げられる。すなわち、以下の（９）〜（１１）の特徴を有する組換えアデノウイルスベクターが挙げられる。
（９）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子、ならびにタンパク質ＩＸ遺伝子が欠失している；
（１０）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（１１）アデノウイルス野生株と同等のタンパク質ＩＸを含有し、正常なウイルス粒子を形成している。
以後、このベクターを「タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクター」と呼ぶこともある。
前記（９）において、タンパク質ＩＸ遺伝子を欠失させる範囲に特に制限はなく、タンパク質ＩＸの部分ペプチドやタンパク質ＩＸ遺伝子に由来するペプチドが発現しないような欠失であれば、特に制限されない。少なくともタンパク質ＩＸ遺伝子のコーディング領域は全て欠失させることが好ましい。さらに、ウイルスゲノムの１．３−１１．２ｍ．ｕ．を欠失させ、Ｅ１遺伝子およびタンパク質ＩＸ遺伝子の全てを欠失させるのがより好ましい。これらの欠失は、通常の遺伝子組換え技術により容易に行うことができる。
なお、タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを生産するためにはタンパク質ＩＸを発現する細胞株が必要であるが、当該細胞株については後述する。
前記（１０）における外来遺伝子は、Ｅ１遺伝子欠失部位に挿入されていることが好ましい。さらに好ましくは、ウイルスゲノムの１．３−１１．２ｍ．ｕ．が欠失した部位、すなわちＥ１遺伝子の全ておよびタンパク質ＩＸ遺伝子が欠失した部位に、外来遺伝子が挿入されていることが望ましい。また、前記タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターと同様に、タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターにおいてもアデノウイルスＥ３遺伝子の全部又は一部を欠失させることが可能であるが、このＥ３遺伝子欠失部位に、外来遺伝子を挿入することも可能である。
前記（１１）において、アデノウイルス野生株と同等のタンパク質ＩＸを含有するウイルス粒子とは、野生型アデノウイルス粒子に含まれるタンパク質ＩＸとほぼ同じ比率のタンパク質ＩＸを含むアデノウイルス粒子のことである。また正常のウイルス粒子とは、細胞への感染性を保持し、熱安定性およびパッケージングできるゲノムＤＮＡのサイズなどが、野生型アデノウイルスとほぼ同様の性質を示すアデノウイルス粒子のことである。当該ウイルス粒子は、タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを、タンパク質ＩＸを発現する細胞株に感染させ、増殖させることにより、作製することができる。
本発明のタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子、ならびにタンパク質ＩＸ遺伝子を欠失させ、さらに、それ以外のアデノウイルスゲノムの遺伝子の全部又は一部を欠失させることができる。具体的な欠失は、前述のタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターの場合と同様であり、Ｅ３遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、及び／又はＥ４遺伝子の全部又は一部を欠失させることなどが可能である。ここで「全部又は一部」の長さとしては、機能的なウイルスタンパク質が産生されないような欠失であれば、欠失する範囲に特に制限はない。また、前記Ｅ３遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、及びＥ４遺伝子等のアデノウイルスゲノムの塩基配列は、例えば文献（Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｈ．Ｓ．編集、１９８４，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されており、当業者であれば、これらの遺伝子をアデノウイルスベクターから欠失させる操作を容易に行うことができる。
前記遺伝子のうち、Ｅ３遺伝子の全部又は一部を欠失させることにより、より長いサイズの外来遺伝子の挿入が可能となる。当該Ｅ３遺伝子を欠失させた場合は、組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、当該Ｅ３遺伝子を発現させる必要はない。一方、Ｅ２Ａ遺伝子やＥ４遺伝子の全部又は一部を欠失させた場合は、組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、あらかじめ欠失させた遺伝子を導入し、発現させておく必要がある。
Ｅ４遺伝子を欠失させる場合には、Ｅ４遺伝子の少なくとも１つのＯＲＦを保持することが望ましい。特に、Ｅ４遺伝子のＯＲＦ３を保持していることが望ましい。ＯＲＦ３を保持する利点については、前記タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターの項を参照されたい。
本発明のタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターおよびタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターで代表される、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、治療用遺伝子などの目的の外来遺伝子を発現させるための外来プロモーターが必要である。外来プロモーターは、哺乳動物細胞で機能し目的の遺伝子を所望する量発現させることができるプロモーターであれば、動物ウイルス由来プロモーターや哺乳動物細胞由来プロモーター、または両者のハイブリッドプロモーターなど、特に制限なく用いることができる。外来プロモーターの例としては、多くの場合、治療用遺伝子の発現量は高いほど望ましいため、ＣＭＶプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ Ｍ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４５，１０１−１０５．（１９８６））やＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ Ｈ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０８，１９３−２００．（１９９１））など、特に高発現とされているプロモーターを用いるのが好ましい。ＣＭＶプロモーターはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のエンハンサーおよびプロモーターから成り、ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶのＩＥエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビンのスプライスアクセプターおよびポリＡ配列からなる。このように、ＣＭＶプロモーター及びＣＡＧプロモーターは、共にＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ，４１，５２１−５３０．（１９８５））を含む。本明細書においては、このＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーを、単に「ＣＭＶエンハンサー」と称することもある。
後述の実施例で示されるように、ＣＭＶエンハンサーを有するプロモーターであるＣＭＶプロモーター及びＣＡＧプロモーターのいずれを用いた場合にも、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現誘導が認められた。一方、ＣＭＶエンハンサーを含まないプロモーターであるＥＦ−１αプロモーターを用いた場合は、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現誘導は認められなかった。従って、前記ＣＭＶプロモーター及びＣＡＧプロモーターが共通に有しているＣＭＶエンハンサーが、タンパク質ＩＸ等のアデノウイルス遺伝子の発現誘導を引き起こす原因であると理解される。すなわち、ＣＭＶエンハンサーがタンパク質ＩＸ遺伝子等のプロモーターに作用し、その結果、タンパク質ＩＸ等が発現すると理解される。
プロモーター活性の強さから、現在、臨床開発されつつあるほとんどのアデノウイルスベクターにおいては、ＣＭＶプロモーター若しくはＣＭＶエンハンサーを含むハイブリッドプロモーターが用いられている。従って、臨床への適用に当たり、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症が軽減される本発明の組換えアデノウイルスベクターが、極めて有効に用いられる。
なお、上記のＣＭＶエンハンサーを含むプロモーターのみならず、同じウイルス性のプロモーターであるＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（Ｔａｋｅｂｅ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８，４６６−４７２．（１９８８））なども、用いることができる。
本発明のアデノウイルスベクターに挿入する外来遺伝子には特に制限はなく、サイトカイン、酵素、レセプター、ウイルスの構造タンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子や、アンチセンスＲＮＡやリボザイムをコードする遺伝子などを用いることができる。
前記本発明のタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターは、ヒト胎児腎由来２９３細胞のようにＥ１遺伝子は発現するがタンパク質ＩＸは発現しない細胞株でも増殖することができる。しかし、このようなタンパク質ＩＸを発現しない細胞株で製造したタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターは、ウイルス粒子に所望の量のタンパク質ＩＸが含まれないため、本発明で目的とする性質を有するアデノウイルスベクターは得られない。従って、本発明のタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを製造するためには、少なくともＥ１遺伝子およびタンパク質ＩＸを発現する特別な細胞株が必要である。すなわち本発明のタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを増殖させる際には、以下の（１２）及び（１３）の特徴を有する哺乳動物由来の細胞が用いられる。
（１２）アデノウイルスのＥ１遺伝子及びタンパク質ＩＸ遺伝子を発現する；
（１３）タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを増殖できる。
タンパク質ＩＸを発現する細胞株の作製方法は、ヒト胎児腎由来２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）のように既にＥ１遺伝子を発現している細胞株をさらにタンパク質ＩＸ遺伝子を含む発現ベクターで形質転換してもよいし、Ｅ１遺伝子を発現していない細胞をＥ１遺伝子およびタンパク質ＩＸ遺伝子を含む発現ベクターで順次あるいは同時に形質転換してもよい。ただし、１．３−１１．２ｍ．ｕ．のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、タンパク質ＩＸ遺伝子全てを含むＤＮＡ断片で細胞を形質転換してもタンパク質ＩＸを発現する細胞株は得られないので、タンパク質ＩＸ遺伝子の上流に適当なプロモーターを付加したＤＮＡ断片で細胞を形質転換する必要がある。なぜならば、２９３細胞には、タンパク質ＩＸ遺伝子の全長を含むヒトアデノウイルス５型の１−４３４４番目の塩基が挿入されている（Ｌｏｕｉｓ Ｎ．，Ｖｉｒｏｌｇｙ，Ｖｏｌ．２３３，４２３−４２９．（１９９７））にもかかわらず、タンパク質ＩＸはほとんど発現していない（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．６，１５７５−１５８６．（１９９５））ことや、また他の細胞株でも、タンパク質ＩＸ遺伝子の全長を含むＥ１遺伝子が挿入されているにもかかわらずタンパク質ＩＸはほとんど発現してない（Ｆａｌｌａｕｘ Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，１９０９−１９１７．（１９９８））ことなどが報告されているからである。これらの細胞株でタンパク質ＩＸが発現していない理由は、タンパク質ＩＸ遺伝子のプロモーターを貫いてＥ１Ｂ遺伝子の転写が起こっている時は、タンパク質ＩＸ遺伝子の転写が抑制される（Ｖａｌｅｓ Ｌ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．３，４９−５９．（１９８９））ためであると考えられている。
本発明のタンパク質ＩＸを発現する細胞株において、タンパク質ＩＸの発現に用いるプロモーターには特に制限はなく、外来プロモーターであってもタンパク質ＩＸ遺伝子の本来のプロモーターでもよい。外来プロモーターを用いる場合は、目的の細胞株が樹立・維持でき、さらには当該細胞株で増殖・生産したタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターが正常量のタンパク質ＩＸを含むウイルス粒子を形成する限りは、恒常的に発現するプロモーターであってもよいし、また誘導型のプロモーターでもよい。恒常型プロモーターの例として、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）などが挙げられる。また、誘導型のプロモーターの例としては、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどが挙げられる。さらに、テトラサイクリンやエクダイソンにより恒常型プロモーターの発現が誘導されるシステムを用いてもよい。以上のようなプロモーターを有する発現ベクター及びその発現誘導システムは、いずれも市販されているか、あるいは公的な機関から入手できる。市販されている場合は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社などから購入することができる。
以上のようなタンパク質ＩＸを発現する細胞株は、タンパク質ＩＸ遺伝子のコーディング領域をＰＣＲ法によりクローニングし、これを市販の発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に挿入した後に、常法によりヒト胎児腎由来２９３細胞に導入し、発現させること等により、作製することができる。詳しくは後述の実施例等を参照されたい。
さらに、アデノウイルスＥ１遺伝子及びタンパク質ＩＸ遺伝子以外のアデノウイルスの遺伝子をさらに欠失させた、タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを増殖させる場合には、当該欠失させた遺伝子をさらに発現する細胞株が必要となる場合がある。例えば、アデノウイルスのＥ１遺伝子、タンパク質ＩＸ遺伝子、及びＥ２Ａ遺伝子を欠失させた場合には、これらの３つの遺伝子を発現する細胞株が用いられる。Ｅ２Ａ遺伝子は、前記タンパク質ＩＸ遺伝子と同様の手法にて細胞内に導入・発現させることができる。
以上のような細胞株を用いて組換えアデノウイルスベクターを製造する方法は当業者に周知の手法であり、例えばＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））などを用いて製造することができる。
以上、本発明の組換えアデノウイルスベクターの代表的な形態として、前記（１）〜（４）の特徴を有する組換えアデノウイルスベクターを挙げ、その好ましい形態として、タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクター及びタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを例にとり説明した。以上のような組換えアデノウイルスベクター以外の他の形態としては、外来プロモーター自身を、アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない形に改変したり、または、アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しないような外来プロモーターを使用した組換えアデノウイルスベクターが挙げられる。すなわち本発明の組換えアデノウイルスベクターの他の形態として、以下の（１４）及び（１５）の特徴を有する組換えアデノウイルスベクターが挙げられる。
（１４）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（１５）アデノウイルスゲノムに、アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーターが挿入されている。
ここで「アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーター」とは、少なくともタンパク質ＩＸ遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーターであれば、如何なるプロモーターであっても良い。このような外来プロモーターを用いた場合は、タンパク質ＩＸ遺伝子は、前記のような再配置・欠失を行う必要は無く、アデノウイルスゲノム中の本来の位置に保持されていれば良い。どのような外来プロモーターであればタンパク質ＩＸの発現を誘導しないかに関しては、種々の外来プロモーターを含む外来遺伝子を挿入した組換えアデノウイルスベクターを作製し、例えば実施例５に記載のｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症の有無の検討や、実施例６に記載のノザンブロット解析等を行うことにより、評価することができる。当該外来プロモーターは、少なくともＣＭＶエンハンサーを含まないものであり、具体的には、ＥＦ−１αプロモーター（Ｋｉｍ Ｄ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．９１，２１７−２２３．（１９９０））等が挙げられる。なお、当該ＥＦ−１αプロモーターがタンパク質ＩＸの発現を誘導しないこと、そして炎症を誘導しないことに関しては、後述の実施例８及び９を参照されたい。 さらに、当該ＥＦ−１αプロモーター等のタンパク質ＩＸの発現を誘導しない外来プロモーターを含む発現単位は、左向き（Ｅ１遺伝子の転写方向の逆向き）に挿入されていることが望ましい。なぜならば、発現単位を右向きに挿入した場合、外来プロモーターからの転写が一部正規の部位で終了せず、タンパク質ＩＸ遺伝子まで転写されることが懸念されるからである。
さらに、本発明の組換えアデノウイルスベクターの他の一つの形態として、以下の（１９）〜（２１）の特徴を有する組換えアデノウイルスベクターが挙げられる。
（１９）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
（２０）アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている；
（２１）外来プロモーターとアデノウイルス遺伝子との間に、外来プロモーターによるアデノウイルス遺伝子の発現誘導を抑制する性質を有する塩基配列が挿入されている。
ここで「外来プロモーターによるアデノウイルス遺伝子の発現誘導を抑制する性質を有する塩基配列」とは、外来プロモーター内に存在するエンハンサーがアデノウイルス遺伝子のプロモーターを活性化するのを抑制する作用を持つＤＮＡ配列のことを言う。その例として、当初ショウジョバエで発見された「ｓｃｓ」や「ｇｙｐｓｙ」などに代表されるインシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ）が挙げられる。インシュレーターとは、エンハンサーとプロモーターとの間に位置するとき、エンハンサーによるプロモーターの活性化を阻止するＤＮＡ配列のことである（Ｃｈｕｎｇ Ｊ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４，５７５−５８０．（１９９７）およびＢｅｌｌ Ａ．Ｃ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ，Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．９，１９１−１９８．（１９９９））。
従って、Ｅ１遺伝子欠失部に挿入した外来遺伝子（エンハンサー／プロモーターを含む）の右側（ＭＬＰ側）にインシュレーターを挿入したアデノウイルスベクターは、タンパク質ＩＸ遺伝子がアデノウイルスゲノムの本来の位置に存在しても、タンパク質ＩＸをはじめとするアデノウイルスタンパク質が発現せず、炎症も誘導しない。
インシュレーターの具体例としては、前述した「ｓｃｓ」や「ｇｙｐｓｙ」以外に、ニワトリβ−グロビン遺伝子座の５’ＨＳ４部位の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃｈｕｎｇ Ｊ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４，５７５−５８０．（１９９７））やヒトＴ細胞レセプターα／δ遺伝子座のＢＥＡＤ−１（Ｂｅｌｌ Ａ．Ｃ，ｅｔ，ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．９，１９１−１９８．（１９９９））などが挙げられる。本発明のアデノウイルスベクターに挿入するインシュレーターには特に制限はなく、外来エンハンサー／プロモーターがアデノウイルス遺伝子発現を誘導しないような作用を持つインシュレーターであれば、その由来、用いるＤＮＡ断片のサイズ等に制限はない。インシュレーターを挿入したアデノウイルスベクターとして、前述したニワトリβ−グロビンインシュレーターと誘導型プロモーターとを挿入したアデノウイルスベクター（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ Ｄ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．７，５５６−５６７．（２０００））や、ウシ成長ホルモンの転写終了シグナル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔｏｐ ｓｉｇｎａｌ）内のインシュレーターと組織特異的プロモーターとを挿入したアデノウイルスベクター（Ｖａｓｓｕｘ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．６，１１９２−１１９７．（１９９９））などが報告されている。しかし、両報告とも、外来エンハンサー／プロモーターによるアデノウイルス遺伝子発現を抑制するのが目的ではなく、アデノウイルスのエンハンサーにより外来プロモーターが活性化されるのを抑制することが目的である。従って、両報告のアデノウイルスベクターにおいて、外来エンハンサー／プロモーターからのアデノウイルス遺伝子発現が抑制されている証拠は無く、アデノウイルス遺伝子の発現と炎症の誘導を抑制するためにインシュレーターを挿入した本発明と両報告とは本質的に異なるものである。
次に、本発明の組換えアデノウイルスベクターの発明を完成するに至った経緯につき説明する。すなわち、本発明の根幹をなす発見、すなわち第一世代アデノウイルスベクターで炎症が起きる原因は外来プロモーターによるアデノウイルス遺伝子の発現誘導に起因する、との発見に至った経緯について説明する。
本明細書において第一世代アデノウイルスベクターとは、アデノウイルスＥ１遺伝子を欠失した非増殖型アデノウイルスベクターのことを言う。第一世代アデノウイルスベクターは、２９３細胞のようにＥ１遺伝子を発現している細胞株でのみ増殖可能である。なお、第一世代アデノウイルスベクターにおいてＥ３遺伝子の欠失は任意である。
「従来の技術」の項でも述べたが、「第一世代アデノウイルスベクターで炎症が起こる原因は、アデノウイルス初期遺伝子であるＥ２Ａ遺伝子の発現が引き金となる」との従来の仮説を検証するため、本発明者らもＥ２Ａ遺伝子を欠失したアデノウイルスベクターを作製した。本発明者らのＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターの作製法の詳細は特開平８−３０８５８５公報に開示しているので、本明細書では作製法の概略のみを以下に説明する。まず、アデノウイルスＬ３遺伝子とＥ２Ａ遺伝子との間（６１．５ｍ．ｕ．）およびＥ３遺伝子の欠失部位（７８．０ｍ．ｕ．）の二ヶケ所に、Ｐ１ファージのリコンビナーゼＣｒｅの認識配列であるｌｏｘＰ配列（Ａｂｒｅｍｓｋｉ Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５９，１５０９−１５１４．（１９８４）、およびＨｏｅｓｓ Ｒ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，１０２６−１０２９．（１９８４））を挿入した第一世代アデノウイルスベクター（図１、Ａｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨ）を作製した。このＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨとリコンビナーゼＣｒｅ発現第一世代アデノウイルスベクター（図１、ＡｘＣＡＮＣｒｅ）とを２９３細胞に同時感染することにより、二つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＥ２Ａ遺伝子およびＬ４遺伝子が除かれたＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクター（図１、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ）を生成させた。次いで、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法により、各ウイルスをそれぞれのウイルス粒子の比重に応じて分離し、Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターを９７〜９８％の純度で精製した。なお、このＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨには、前述したＣＡＧプロモーターの制御下にレポーター遺伝子としてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現するように、その発現単位を挿入した。また、Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターのコントロールベクターとして、同じ発現単位を持つ第一世代アデノウイルスベクター（図１、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ）も作製した。
次に、このようにして作製したＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターではＥ２Ａ遺伝子が確かに欠失していることを確認した。すなわち、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨもしくはＡｘ１ＣＡＨＧＨを感染させたＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞株）でのＥ２Ａ遺伝子にコードされるタンパク質ＤＢＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現量を蛍光抗体法により比較し、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞ではＤＢＰの発現が明らかに低下していたことによりＥ２Ａ遺伝子の欠失を確認した。さらに、後期遺伝子であるＬ３遺伝子にコードされ、ウイルス粒子の主要な構成タンパク質であるヘキソンの発現量を、同様に蛍光抗体法により比較したところ、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞ではヘキソンの発現が明らかに低下していた。この結果は、「微量発現したＥ２Ａ遺伝子がアデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を活性化し、主要後期タンパク質が発現する。」との従来の仮説は、この箇所においては正しいことを示していた。
そこで、次にＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターではｉｎ ｖｉｖｏでの炎症反応も低下しているかどうかを検討した。ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨまたはＡｘ１ＣＡＨＧＨをマウスに静脈投与し、血中の肝逸脱酵素ＧＰＴ（グルタミン酸−ピルビン酸−トランスアミナーゼ）値を炎症の指標として測定した。まず、各アデノウイルスベクターの感染効率を確認するため、アデノウイルスベクター投与３日目の血中のｈＧＨ濃度を測定した。両アデノウイルスベクター投与群間で血中ｈＧＨ濃度に有意の差がなかったことにより、両アデノウイルスベクターの動物個体内での感染効率に差がないことを確認した。そこで、血中ＧＰＴ値を指標にＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターを評価したが、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ投与マウスでもＡｘ１ＣＡＨＧＨ投与マウスと同程度に血中ＧＰＴ値は増加した。この結果より、Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターには炎症を軽減する効果は全く認められないことが明らかになった。また、一部のマウスでは、アデノウイルスベクター投与後、一定期間ごとに肝臓切片を作製し病理組織学的解析を行った。Ａｘ１ＣＡＨＧＨを投与したマウスでは、投与５日後以降、肝臓のＴ細胞を含む白血球の浸潤、肝細胞のアポトーシスなどの炎症像が認められたが、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨを投与したマウスでも同様の炎症像が認められた。すなわち、両アデノウイルスベクター投与マウス間で、病理組織学的にも差はなかった。
以上の結果は、Ｅ２Ａ遺伝子の欠失は炎症の軽減に効果がないことを示している。このようにＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターと第一世代アデノウイルスベクターとで炎症の惹起作用に差がなかった原因として、次の４つの可能性が考えられた。
▲１▼Ｅ４遺伝子などのＥ２Ａ遺伝子以外のアデノウイルス遺伝子が、細胞由来の因子により直接活性化され、発現したアデノウイルスタンパク質そのものが細胞性免疫を誘導するか、あるいはさらに別のアデノウイルスタンパク質の発現を誘導し、そのアデノウイルスタンパク質が細胞性免疫を誘導し炎症が生じる。
▲２▼レポーター遺伝子として用いたｈＧＨタンパク質が細胞性免疫を誘導し炎症が生じる。
▲３▼ベクターに挿入した外来プロモーター（ＣＡＧプロモーター）がアデノウイルスプロモーターにエンハンサー的に作用し、アデノウイルスタンパク質が発現し、そのアデノウイルスタンパク質が細胞性免疫を誘導し炎症が生じる。
▲４▼ベクターが感染した細胞でｄｅ ｎｏｖｏに合成されたタンパク質ではなく、感染により細胞内に侵入したアデノウイルス粒子を構成するタンパク質そのものが細胞性免疫を誘導し炎症が生じる。もしくは、アデノウイルス粒子が細胞に侵入すること自体が刺激となり、例えば炎症性サイトカインの産生を誘導するなどして炎症が起きる。
そこで、Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターで炎症の惹起作用が低下しなかった原因が上記▲１▼〜▲４▼のどの可能性であるかを明らかにするため、次の４種類のアデノウイルスベクターを用いて炎症の原因を検討した。
（ａ）ｈＧＨ発現一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨ：陽性対照）
（ｂ）ｈＧＨ ｃＤＮＡを有さずＣＡＧプロモーターのみが挿入された第一世代アデノウイルスベクター（図１、ＡｘＣＡｗｔ：ポリＡ配列も挿入）
（ｃ）プロモーター等の外来遺伝子が挿入されていない第一世代アデノウイルスベクター（図１、Ａｘ１ｗ１）
（ｄ）ＵＶ不活化アデノウイルス粒子（Ａｘ１ＣＡＨＧＨを不活化）
これら４種類のベクターをマウスに静脈内投与し、血清ＧＰＴ値を測定した。なお、（ｄ）のＵＶ不活化アデノウイルス粒子の定義および調製法の詳細は既存の文献（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ Ｍ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，６０９４−６０９８．（１９９２）、Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ Ｍ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ，２０５，２５４−２６１．（１９９４））に記載されているが、その定義を以下に簡単に述べる。ＵＶ不活化アデノウイルス粒子とは、細胞への感染性は保持しており細胞内に侵入できるが、不活化前のアデノウイルスの増殖が許容される細胞においても増殖することができず、また挿入された外来遺伝子の発現も起こらない状態に不活化されたアデノウイルス粒子のことである。
結果を概略すると、ＵＶ不活化アデノウイルス粒子投与マウス及び外来遺伝子が挿入されていないＡｘ１ｗ１投与マウスでは、血清ＧＰＴ値は全く上昇しなかった。一方、ＣＡＧプロモーターのみが挿入されたＡｘＣＡｗｔ投与マウスは、ｈＧＨを発現するＡｘ１ＣＡＨＧＨ投与マウスとほぼ同程度、血清ＧＰＴ値が増加した。ＡｘＣＡｗｔ投与マウスでも炎症が生じたことより、▲２▼のｈＧＨタンパク質が原因である可能性は否定された。また、ＵＶ不活化アデノウイルス粒子を投与したマウスでは全く炎症が起こらなかったことより、▲４▼のアデノウイルス粒子自体が炎症の原因である可能性も否定された。さらに、Ａｘ１ｗ１投与マウスでは炎症が起こらなかったことから、▲１▼の原因単独で炎症が起こる可能性も否定された。結局、ＡｘＣＡｗｔ投与マウスではＡｘ１ＣＡＨＧＨ投与マウスと同程度の炎症が起こり、Ａｘ１ｗ１投与マウスでは全く炎症が起こらなかったことより、ＡｘＣＡｗｔとＡｘ１ｗ１との構造の差異はＣＡＧプロモーターの有無だけであるので、第一世代アデノウイルスベクターで炎症が起こる原因は、▲３▼のベクターに挿入したＣＡＧプロモーターに起因することが明らかになった。
そこで次に、ＣＡＧプロモーターにより発現が誘導されるアデノウイルス遺伝子、すなわち炎症に関与しているアデノウイルス遺伝子の同定を行った。Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター（ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ）または前記（ａ）から（ｃ）の３種類の第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨ、ＡｘＣＡｗｔ、Ａｘ１ｗ１）をＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞株）またはＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）に高ｍｏｉ（重複感染度）で感染させ、２４時間後に発現しているアデノウイルス遺伝子をノザンブロットにより解析した。発現を検討したアデノウイルス遺伝子は、次の８種類である。初期遺伝子：Ｅ２Ａ、Ｅ４、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）支配の主要後期遺伝子：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、遅延初期（ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ）遺伝子：タンパク質ＩＸ、ＩＶａ２。目的とするアデノウイルス遺伝子、すなわちＣＡＧプロモーターより発現が誘導され炎症に関与しているアデノウイルス遺伝子の定義とは、ＣＡＧプロモーターを有していれば、Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター（ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ）感染細胞でも第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨおよびＡｘＣＡｗｔ）感染細胞とほぼ同程度発現するが、ＣＡＧプロモーターが無い第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ｗ１）感染細胞ではほとんど発現しない遺伝子である。
まず、Ｅ２Ａ遺伝子の発現を検討したところ、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞ではほとんど発現せず、他の３種類の第一世代アデノウイルスベクター感染細胞では、ＣＡＧプロモーターの有無にかかわらずＥ２Ａ遺伝子はほぼ同程度発現していたことより、本発明で用いたＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ遺伝子が完全に欠失していることが再度確認できた。同時に、Ｅ２Ａ遺伝子の発現はＣＡＧプロモーターにより誘導されないことも明らかになった。他の初期遺伝子であるＥ４遺伝子は、４種類のアデノウイルスベクター感染細胞全てでほぼ同程度発現しており、Ｅ４遺伝子の発現もＣＡＧプロモーターにより誘導されないことが明らかとなった。
次に、ＭＬＰに支配される主要後期遺伝子の発現を検討した。主要後期遺伝子のうちＬ２、Ｌ３およびＬ５の３種類の遺伝子は、ＨｅｐＧ２細胞ではΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞でのみ発現が低下しており、Ａ５４９細胞ではΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨおよびＡｘ１ｗ１感染細胞での発現が明らかに低下していた。従って、前述したタンパク質レベルだけでなく遺伝子レベルでも、『Ｅ２Ａ遺伝子が主要後期遺伝子の発現を誘導する』という従来の仮説が確認できたものの、これらの主要後期遺伝子はＣＡＧプロモーターにより発現は誘導されないことが明らかになった。また、Ｌ１遺伝子の発現は、用いた細胞株により異なる結果となった。ＨｅｐＧ２細胞ではΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞でのみＬ１遺伝子の発現が低下し、ＣＡＧプロモーターによる発現誘導は認められなかった。一方、Ａ５４９細胞ではＡｘ１ｗ１感染細胞でのみＬ１遺伝子の発現が低下し、ＣＡＧプロモーターによる発現誘導が認められた。
最後に、独自のプロモーターを有するＩＶａ２遺伝子とタンパク質ＩＸ遺伝子の二つの遅延初期遺伝子の発現を検討した。ＩＶａ２遺伝子の発現パターンは、Ｌ１遺伝子と同様に用いた細胞株により異なる結果となった。すなわち、ＨｅｐＧ２細胞では４種類のアデノウイルスベクター感染細胞全てでＩＶａ２遺伝子はほぼ同程度発現しており、ＣＡＧプロモーターによる発現誘導は認められなかった。それに対し、Ａ５４９細胞ではＡｘ１ｗ１感染細胞でのみＩＶａ２遺伝子の発現が低下しており、ＣＡＧプロモーターによる発現誘導が認められた。
一方、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現は両細胞株とも同じ結果となり、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ、Ａｘ１ＣＡＨＧＨおよびＡｘＣＡｗｔ感染細胞ではタンパク質ＩＸ遺伝子はほぼ同程度発現していたが、Ａｘ１ｗ１感染細胞ではほとんど発現していなかった。すなわち、タンパク質ＩＸ遺伝子は、ＣＡＧプロモーターによる発現誘導が明確に認められた。
以上の結果より、ＣＡＧプロモーターにより明らかに発現誘導されるアデノウイルス遺伝子は、主にタンパク質ＩＸ遺伝子であることが示された。従って、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現が第一世代アデノウイルスベクターをｉｎ ｖｉｖｏで投与した際の炎症の原因となっていることが強く示唆された。
また、前述した結果より、タンパク質ＩＶａ２遺伝子およびＬ１遺伝子も、細胞の種類によってはＣＡＧプロモーターにより発現が誘導されることも明らかになった。タンパク質ＩＶａ２遺伝子は独立したプロモーターを有するので、ＣＡＧプロモーターにより直接活性化されることは容易に推測できる。しかし、Ｌ１遺伝子は主要後期遺伝子の一つであり、Ｌ３やＬ５遺伝子などの他の後期遺伝子と共通のプロモーターであるＭＬＰに制御されているので、ＣＡＧプロモーターによりＬ１遺伝子のみが発現誘導されることは推測し難い。しかし、Ｌ２〜Ｌ５遺伝子は感染後期にしか発現しないが、Ｌ１遺伝子は感染初期にも発現することが知られているので（Ｓｈａｗ Ａ．Ｒ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２２，９０５−９１６．（１９８０））、Ｌ１遺伝子のみがＣＡＧプロモーターにより発現誘導されるのは、この初期と後期における遺伝子発現機構の差異に基づいている可能性がある。さらに、タンパク質ＩＸおよびタンパク質ＩＶａ２ともＭＬＰを活性化する作用があることが報告されているので（Ｌｕｔｚ Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７１，５１０２−５１０９．（１９９７）、Ｔｒｉｂｏｕｌｅｙ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，４４５０−４４５７．（１９９４））、ＣＡＧプロモーターがＭＬＰを直接活性化しているのではなく、タンパク質ＩＸもしくはタンパク質ＩＶａ２を介して間接的にＭＬＰが活性化されている可能性もある。これらタンパク質ＩＶａ２遺伝子およびＬ１遺伝子のＣＡＧプロモーターによる発現誘導の程度は、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現誘導に較べると弱いが、タンパク質ＩＸと相加的に作用し炎症を誘導している可能性があると考えられる。
次に、ＣＡＧプロモーターのどの構成成分が、タンパク質ＩＸ遺伝子をはじめとするアデノウイルス遺伝子の発現を誘導するかについて検討した。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶのＩＥエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビンのスプライスアクセプターおよびポリＡ配列から構成されている。本発明で用いたアデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子の欠失部位（１．３−９．２ｍ．ｕ．）にＣＡＧプロモーターが左向き（Ｅ１の転写方向の逆向き）に挿入されており、右向きに転写されるタンパク質ＩＸ遺伝子（９．７−１１．２ｍ．ｕ．）とはプロモーターの挿入方向が逆向きである。従って、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現を誘導しているのはβ−アクチンプロモーターではなく、ＣＭＶのＩＥエンハンサーである可能性が強いと考えられた。そこで、ＣＡＧプロモーターとはＣＭＶのＩＥエンハンサー部分のみが共通なＣＭＶプロモーターを挿入したアデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶｌａｃＺ）を用いて、タンパク質ＩＸ遺伝子の発現を検討した。その結果、ＡｄＣＭＶｌａｃＺ感染Ａ５４９細胞では、ＣＡＧプロモーターのみが挿入されたＡｘＣＡｗｔ感染細胞とほぼ同程度タンパク質ＩＸ遺伝子が発現していたという結果が得られたことにより、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー（ＣＭＶエンハンサー）がタンパク質ＩＸ遺伝子をはじめとするアデノウイルス遺伝子の発現を誘導していることが確認された。
このことをより確実なものとするため、ＣＭＶエンハンサーを含まないプロモーターであるＥＦ−１αプロモーターを挿入したアデノウイルスベクター（ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ）を用いて、タンパク質ＩＸの発現を検討したところ、ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ感染細胞ではタンパク質ＩＸ遺伝子は全く発現しなかった。さらに、ＣＡＧプロモーターとｌａｃＺ遺伝子とを挿入したアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌ）を陽性対照として、マウスに静脈投与した際の血清ＧＰＴ値を指標に、ＡｄＣＭＶｌａｃＺとＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌとの炎症の程度を比較検討した。その結果、ＡｄＣＭＶｌａｃＺ投与マウスはＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌと同等かそれ以上に血清ＧＰＴ値が上昇したが、ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ投与マウスでは、血清ＧＰＴ値はほとんど上昇しないことが確認された。従って、ＣＭＶエンハンサーを含まないＥＦ−１αプロモーターはタンパク質ＩＸの発現を誘導せず、タンパク質ＩＸの発現を誘導しないアデノウイルスベクターでは炎症が起きないことが示された。
以上の一連の結果をまとめると、第一世代アデノウイルスベクターにより炎症が生じる原因は、ＣＭＶエンハンサーがアデノウイルス遺伝子の発現を誘導することに起因するという、従来は知られていなかった非常に重要な新たな機構が本発明者らにより発見されたことになる。
ＣＭＶプロモーターをはじめとするＣＭＶエンハンサーを含むプロモーターは、そのプロモーター活性が高いため、現在臨床試験が行われている数多くのアデノウイルスベクターに用いられている。その例を挙げると、ＣＭＶプロモーターそのものを用いたベクターの例としては、癌抑制遺伝子ｐ５３発現アデノウイルスベクター（Ｃｌａｙｍａｎ Ｇ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１６，２２２１−２２３２．（１９９８）、およびＳｗｉｓｈｅｒ Ｓ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，Ｖｏｌ．９１，７６３−７７１．（１９９９））、インターロイキン２発現アデノウイルスベクター（Ｓｔｅｗａｒｔ Ａ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．６，３５０−３６３．（１９９９））、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ１２１発現アデノウイルスベクター（Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ Ｔ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１００，４６８−４７４．（１９９９））などがあり、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーを含むハイブリッドプロモーターを用いたアデノウイルスベクターの例としては、嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白（ＣＦＴＲ）発現アデノウイルスベクター（Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｍ．Ｒ．ｅｔ，ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３３３，８２３−８３１．（１９９５）、およびＺｕｃｋｅｒｍａｎ Ｊ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．１０，２９７３−２９８５．（１９９９））が挙げられる。
従って、外来プロモーターがアデノウイルス遺伝子の発現を誘導し炎症が起きるという本発明者らの発見は、単にＣＡＧプロモーターを有する組換えアデノウイルスベクターに限定された現象ではなく、実際に臨床試験で用いられているアデノウイルスベクターの多くに当てはまる普遍的な現象である。それ故、かかる知見に基づき、外来プロモーターによりアデノウイルス遺伝子の発現が誘導されないように改良したアデノウイルスベクターは、投与時の炎症が軽減され治療用遺伝子の発現が持続することが期待でき、実用上の価値が大変高いものである。 さらに、外来プロモーターがアデノウイルス遺伝子の発現を誘導するという本発明の発見は、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーのみでなく他のウイルスプロモーターを有するアデノウイルスベクターでも当てはまる可能性がある。そのようなプロモーターの例として、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーを含むプロモーター、あるいはＳＲαプロモーターなどが挙げられる。
次に、本発明の好ましい形態であるタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクター及びタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを例にとり、本発明の実施方法を具体的に説明する。
まず、タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターの作製方法の例について述べる。タンパク質ＩＸ遺伝子の塩基配列や位置は、文献（Ｍａａｔ Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０，２７−３８．（１９８０））に記載されている。再配置するタンパク質ＩＸ遺伝子の調製法に特に制限は無く、タンパク質ＩＸ遺伝子を含むプラスミドやコスミド（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））などから制限酵素消化により切り出してもよいが、その後の構築の利便性からＰＣＲ法により増幅することが望ましい。増幅するタンパク質ＩＸ遺伝子の範囲は、タンパク質ＩＸのコーディング領域のみでなくタンパク質ＩＸ遺伝子の５’ならびに３’非翻訳領域を含むことが望ましい。５’非翻訳領域としては、タンパク質ＩＸ遺伝子のプロモーター領域を含むことが望ましく、その例としてアデノウイルス５型の塩基配列で少なくとも３５２５番目以降の配列を含むことが望ましく、さらには３２１３番目以降を含むのがより望ましい。３’非翻訳領域の範囲は、タンパク質ＩＸ遺伝子の終止コドンまでの塩基配列を含みさえすれば特に制限はなく、終止コドンのすぐ後ろに他の遺伝子のポリＡ配列を付加してもよいし、またタンパク質ＩＸ遺伝子本来のポリＡ配列を用いてもよい。後者の例として、タンパク質ＩＸ遺伝子のポリＡ付加シグナルおよび実際にポリＡが付加するとされている部位を含む４０７０番目までの塩基配列を含むことが望ましく、さらには４０７６番目までを含むのがより望ましい。ＰＣＲのプライマーの塩基配列は、前述した範囲のタンパク質ＩＸ遺伝子を増幅できる配列である限り特に制限はないが、増幅後のタンパク質ＩＸ遺伝子を含むＤＮＡ断片のプラスミドへのクローニングを容易に行うため、適当な制限酵素認識配列を含むことが望ましい。
ＰＣＲにより増幅したタンパク質ＩＸ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、アデノウイルスゲノムの所望の位置に直接挿入しても良いが、ＰＣＲ反応中に塩基配列の変異が起きていないことを確認するため、まず増幅断片を適当なプラスミド等にクローニングし、その塩基配列を確認してから用いるのが望ましい。増幅断片をクローニングするプラスミド等に特に制限はなく、その例としてプラスミドｐＵＣ１９などが挙げられる。
タンパク質ＩＸ遺伝子を再配置する部位としては、前述したようにＬ３遺伝子とＥ２Ａ遺伝子との間、Ｅ３遺伝子の欠失部位などが挙げられるが、より好ましい例として、Ｅ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間への再配置の方法について以下に具体的に述べる。当該部位にタンパク質ＩＸ遺伝子を再配置したアデノウイルスベクターを作製する手順として、タンパク質ＩＸ遺伝子を本来の位置（９．７−１１．２ｍ．ｕ．）からは欠失させ、かつＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間にタンパク質ＩＸ遺伝子が挿入された構造のアデノウイルスゲノムを含むプラスミドやコスミドベクターで２９３細胞などの細胞株を形質転換し、目的の組換えアデノウイルスを一段階で得ることも可能である。しかし、その代替法として、タンパク質ＩＸ遺伝子を本来の位置に保有し、かつＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間にもタンパク質ＩＸ遺伝子が挿入された組換えアデノウイルスをまず作製し、次いで本来の位置のタンパク質ＩＸ遺伝子を欠失させることにより、タンパク質ＩＸ遺伝子を再配置したアデノウイルスベクターを作製するという二段階の手順で行うこともできる。後者の方法は手順は多いが、目的の組換えアデノウイルスを確実に得ることができるため望ましい方法であり、以下はこの２段階の作製方法について詳細に説明する。なお、以下に示す組換えアデノウイルスベクターの作製方法は、アデノウイルスゲノムの大部分を含むコスミドベクターと、末端タンパク質−アデノウイルスＤＮＡ複合体（ＤＮＡ−ＴＰＣ）を制限酵素消化したＤＮＡとで２９３細胞などの細胞を形質転換し、コスミドベクターとアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣとの間の相同組換えにより目的の組換えアデノウイルスを得る方法で、その原理ならびに操作方法の詳細は既存の文献（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））および特許（特開平７−２９８８７７）に開示されている。
コスミドベクターｐＡｘ４ｗは、アデノウイルス５型ゲノムの２．６−９８．０ｍ．ｕ（Ｅ３遺伝子は欠失）とアデノウイルス２型ゲノムの９８．０−１００ｍ．ｕ．を含み、かつＥ４遺伝子のプロモーターの上流域と３’側ＩＴＲとの間（９９．３ｍ．ｕ．）にクローニング部位である制限酵素ＳｗａＩ部位を有するベクターである（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６）、当該文献中ではｐＡｘ４ｗをｐＡｄｅｘ４ｗと記載）。このｐＡｘ４ｗのＳｗａＩ部位に、前述したＰＣＲ法などにより調製したタンパク質ＩＸ遺伝子を挿入し、コスミドベクターｐＡｘ４ｐＩＸを得る。一方、組換えアデノウイルスベクターＡｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬは、アデノウイルス５型由来で（Ｅ１Ａ・Ｅ１Ｂ・Ｅ３遺伝子を欠失）、かつｐＡｘ４ｗと同じ９９．３ｍ．ｕ．の位置に大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の発現単位が挿入された非増殖型アデノウイルスベクターである。このＡｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬから調製したアデノウイルスゲノムＤＮＡを、ゲノム右半分に複数の認識部位が存在する制限酵素ＡｓｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドベクターｐＡｘ４ｐＩＸとで２９３細胞を形質転換することにより、Ａｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬの大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の発現単位がタンパク質ＩＸ遺伝子に置換された組換えアデノウイルスＡｘ４ｐＩＸを得ることができる。Ａｘ４ｐＩＸは、タンパク質ＩＸ遺伝子の本来の位置およびＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間の二ヶ所に、タンパク質ＩＸ遺伝子を有する組換えアデノウイルスである。
次に、タンパク質ＩＸ遺伝子の本来の位置の欠失させるべき塩基配列の範囲について説明する。タンパク質ＩＸ遺伝子は右向きに転写されるが、その３’非翻訳領域は左向きに転写されるＩＶａ２遺伝子およびＥ２Ｂ遺伝子の３’非翻訳領域と一部重複しているため、タンパク質ＩＸ遺伝子の欠失範囲は、ＩＶａ２遺伝子およびＥ２Ｂ遺伝子の機能に影響を及ぼさない範囲でなければならない。ＩＶａ２遺伝子およびＥ２Ｂ遺伝子のポリＡ付加部位は、アデノウイルス５型を例とすると４０６０番目の塩基とされているので、欠失範囲はこれよりも左側まででなければならない。この条件を満たし、かつタンパク質ＩＸが発現しない限り、欠失範囲に特に制限は無いが、その例として、アデノウイルス５型のＰｖｕＩＩ部位（Ａｄ５：４５２−４５７）からＡ１ｗＮＩ部位（Ａｄ５：４０４８−４０５６）の欠失が挙げられる。当該範囲を欠失したアデノウイルスゲノムを含むベクターは、コスミドベクターｐＡｘｃｗ（特開平８−３０８５８５号公報、１５頁、ｐＡｄｅｘ１ｃｗはｐＡｘｃｗと同一である）から、容易に構築することができる。ｐＡｘｃｗは、Ｅ１遺伝子を欠失した（Δ４５４−３３２８）アデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むコスミドベクターであり、ｐＡｘｃｗを主発材料として数段階の構築により、ＰｖｕＩＩ部位からＡ１ｗＮＩ部位間を欠失したアデノウイルスゲノムを含むコスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗを得ることができる。ｐＡｘΔｐＩＸｃｗは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂおよびタンパク質ＩＸ遺伝子を欠失し（Δ４５４−４０５３）、その欠失部位に外来遺伝子のクローニング部位（ＣｌａＩおよびＳｗａＩ部位）が挿入されたベクターである。
前述した組換えアデノウイルスＡｘ４ｐＩＸから調製したゲノムＤＮＡをそのゲノム左側に複数箇所の認識部位を有する制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉなどで消化したＤＮＡ−ＴＰＣと、前述のコスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗとで２９３細胞を形質転換することにより、目的とするタンパク質ＩＸ遺伝子が再配置された組換えアデノウイルスベクターＡｘＲｐＩＸｃｗを得ることができる。このＡｘＲｐＩＸｃｗにはプロモーター等の外来遺伝子は挿入されていないが、ＡｘＲｐＩＸｃｗのゲノムＤＮＡをＥｃｏＴ２２Ｉ消化したＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗのＳｗａＩ部位もしくはＣｌａＩ部位に外来遺伝子を挿入したコスミドベクターとの相同組換えにより、任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターを容易に得ることができる。または、Ａｘ４ｐＩＸのゲノムＤＮＡをＥｃｏＴ２２Ｉ消化したＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗのＳｗａＩ部位もしくはＣｌａＩ部位に外来遺伝子を挿入したコスミドベクターとの相同組換えによっても、任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターを得ることができる。
以上、アデノウイルス５型を例としてタンパク質ＩＸ再配置アデノウイルスベクターの作製法を説明したが、再配置するタンパク質ＩＸ遺伝子は必ずしも同じ血清型アデノウイルス由来の遺伝子を用いる必要はなく、当該アデノウイルスの増殖サイクルにおいてタンパク質ＩＸが十分に機能しさえすれば、他の血清型のタンパク質ＩＸ遺伝子を用いてもよい。その例として、アデノウイルス５型の基本骨格に２型のタンパク質ＩＸ遺伝子を再配置したベクターや、その逆にアデノウイルス２型の基本骨格に５型のタンパク質ＩＸ遺伝子を再配置したベクターなどが挙げられる。
次にタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターの作製法を説明する。当該ベクターを作製するには、タンパク質ＩＸ発現細胞株が必要であるので、まずタンパク質ＩＸ発現細胞株の作製法について説明する。細胞に導入するタンパク質ＩＸ遺伝子の範囲は、タンパク質ＩＸのコーディング領域を含んでいる限り特に制限はない。タンパク質ＩＸのコーディング領域を含むＤＮＡ断片は、当該遺伝子を含むプラスミド等から制限酵素消化により切り出すこともできるし、またＰＣＲ法により調製してもよい。タンパク質ＩＸを発現させるためのプロモーターに特に制限はなく、動物細胞で恒常的に機能するプロモーターを用いてもよいし、誘導型プロモーターを用いてもよい。また、タンパク質ＩＸ遺伝子の本来のプロモーターを用いてもよい。タンパク質ＩＸを発現する細胞株は、任意の細胞をタンパク質ＩＸ遺伝子の発現単位を含むプラスミド等で形質転換することにより得ることができるが、当該細胞株の作製に用いる細胞は、アデノウイルスＥ１遺伝子を発現する細胞であって、かつＥ１遺伝子を欠失している第一世代アデノウイルスベクターを効率よく産生できる細胞であることが望ましい。そのような細胞の例として、２９３細胞が挙げられる。さらに、ベクターゲノムと細胞のゲノム間での相同組換えにより増殖能を有するアデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＲＣＡ）が出現するのを防ぐため、Ｅ１遺伝子の必要最低限の領域のみが導入された細胞株を用いて、タンパク質ＩＸ発現細胞株を作製するのがより望ましい。また、Ｅ１遺伝子を発現していない細胞から、まずタンパク質ＩＸ発現細胞株を作製し、その後当該細胞株をＥ１遺伝子で形質転換することによっても所望の細胞株を得ることができる。細胞の形質転換法および目的細胞株の選択法に特に制限はなく、タンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターに十分量のタンパク質ＩＸを供給できる細胞株であればよい。
次いでタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターの作製法を、より具体的に説明する。タンパク質ＩＸ遺伝子を欠失させる範囲は、タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターと同様、ＩＶａ２遺伝子およびＥ２Ｂ遺伝子の機能に影響を及ぼさず、かつタンパク質ＩＸが発現しなければよく、その例として既に述べたＰｖｕＩＩ部位（Ａｄ５：４５２−４５７）からＡ１ｗＮＩ部位（Ａｄ５：４０４８−４０５６）の欠失が挙げられる。前述したコスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗは当該範囲のアデノウイルスゲノムの欠失に対応したベクターである。このｐＡｘΔｐＩＸｃｗと、任意の第一世代アデノウイルスベクター、例えばＡｘＣＡｗｔやＡｘ１ｗ１のゲノムＤＮＡをＥｃｏＴ２２Ｉなどの制限酵素で消化したＤＮＡ−ＴＰＣとで、前述したタンパク質ＩＸ発現細胞株を形質転換することにより、目的のタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを得ることができる。このようにして作製したタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターＡｘΔｐＩＸｃｗにはプロモーター等の外来遺伝子は挿入されていない。しかし、タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターの場合と同様、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗのＳｗａＩ部位もしくはＣｌａＩ部位に外来遺伝子を挿入したコスミドベクターと、ＡｘΔｐＩＸｃｗのゲノムＤＮＡをＥｃｏＴ２２Ｉなどの制限酵素で消化したＤＮＡ−ＴＰＣとの相同組換えにより、任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを容易に得ることができる。または、任意の第一世代アデノウイルスベクター、例えばＡｘＣＡｗｔやＡｘ１ｗ１のゲノムＤＮＡをＥｃｏＴ２２Ｉ消化したＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗのＳｗａＩ部位もしくはＣｌａＩ部位に外来遺伝子を挿入したコスミドベクターとの相同組換えによっても、任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを得ることができる。
以上、タンパク質ＩＸ再配置型アデノウイルスベクターおよびタンパク質ＩＸ欠失型アデノウイルスベクターの作製法は、主にアデノウイルス５型を例として説明したが、本発明はアデノウイルス５型に限定されるものでなく、アデノウイルス２型をはじめとするその他の血清型のアデノウイルスを基本骨格とする任意のアデノウイルスベクターに適用することができる。
次に、本発明の組換えアデノウイルスベクターを有効成分とする医薬組成物、及び炎症が軽減された遺伝子治療方法につき説明する。上記のようにして得られた本発明の組換えアデノウイルスベクターは、ヒトに投与した際の炎症が軽減された安全性の高いベクターであり、医薬組成物の有効成分として種々の疾患の遺伝子治療に用いることができる。本発明の組換えアデノウイルスベクターを医薬組成物として用いる場合、治療目的の疾患および標的臓器などに応じて、ｉｖ ｖｉｖｏ法、ｅｘ ｖｉｖｏ法のいずれかの方法を適宜選択して適用することができる。ここでｉｎ ｖｉｖｏ法とは、遺伝子治療用の医薬組成物を直接患者の体内に導入する手法であり、またｅｘ ｖｉｖｏ法とは、患者からある種の細胞を取り出して、体外で前記医薬組成物を該細胞に導入し、その後細胞を体内に戻す手法である。
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏ法の投与経路に特に制限はなく、例えば、静脈投与、動脈投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与や、肝臓、肺、腎臓、脳などの対象臓器へ直接投与することもできる。また、ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合の製剤形態にも制限はなく、例えば注射剤として用いる場合、当該注射剤は常法により調製することができる。すなわち、例えば本発明の組換えアデノウイルスベクターを、無菌的に適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該製剤には必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。
本発明のアデノウイルスベクターをｅｘ ｖｉｖｏ法に適用する場合、用いる細胞に制限はなく、リンパ球などの白血球や患者由来の種々のガン細胞など、目的に応じた細胞を用いることができる。
前記本発明の医薬組成物の患者への投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調製することができる。通常、本発明の組換えアデノウイルスベクター１０^６〜１０^１４（ＰＦＵ）、好ましくは１０^８〜１０^１２（ＰＦＵ）程度を、１回投与、もしくは数日間連続投与、あるいは月に１回程度投与するのが好ましい。
前記したように、現在臨床試験が進められているアデノウイルスベクターとしては、癌抑制遺伝子ｐ５３発現ベクター、インターロイキン２発現ベクター、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ１２１発現ベクター、嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白（ＣＦＴＲ）発現ベクター等が知られているが、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、これら従来のアデノウイルスベクターを使用した際に生じる炎症を軽減したベクターとして、従来のアデノウイルスベクターの代わりに用いることができる。
例えば、癌抑制遺伝子ｐ５３発現ベクターを用いた臨床試験のプロトコール等は、文献（Ｒｏｔｈ Ｊ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．７，１０１３−１０３０．（１９９６））に記載されており、従って、当該プロトコールに従って、本発明の遺伝子治療方法を実施することが可能である。
本発明の組換えアデノウイルスベクターは、医薬品としてヒトの遺伝子治療に用いるだけでなく、動物個体に遺伝子導入するためのベクターとしても用いることができる。その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｅｘ ｖｉｖｏ法など前述したヒトへの遺伝子治療の方法に準じて行うことができる。
また、既に公知の多くの文献や、後述の実施例を参照して行うこともできる。炎症が軽減されたベクターという本発明のアデノウイルスベクターの特徴は、動物個体に用いる場合においても、疾患モデル動物の作製、ヒトの疾患の治療モデル、任意の遺伝子の機能解析など様々な目的において、炎症などベクターに由来する副反応を考慮する必要がなく、従来のアデノウイルスベクターには無い大きな利点がある。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞等を取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」に記載の方法に準じて行った。
本実施例で用いたコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２３，３８１６−３８２１（１９９５））およびｐＡｘｃｗ（特開平８−３０８５８５号公報、１５頁、ｐＡｄｅｘ１ｃｗはｐＡｘｃｗと同一である）は、アデノウイルスＥ１およびＥ３遺伝子以外のアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むベクターである。また、ｐＡｘＣＡｗｔは、Ｅ１遺伝子欠失部位にＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ Ｈ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０８，１９３−２００（１９９１）および日本特許第２８２４４３４号）が導入され、かつプロモーターとポリＡ配列との間にクローニング部位が存在する。ｐＡｘｃｗは、Ｅ１遺伝子欠失部位にＣｌａＩおよびＳｗａＩ部位のみが挿入されている。これらコスミドベクターとアデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白質複合体とで２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）を形質転換し、相同組換えにより組換えアデノウイルスベクターを作製する方法（ＣＯＳ／ＴＰＣ法）は、既存の文献（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））および特許（特開平７−２９８８７７）に開示されている方法に準じた。さらに、超遠心法によるアデノウイルスベクターの精製法（Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４７，１５７−１６６．（１９９４））、および２９３細胞を用いた限界希釈法によるウイルス力価測定法（特開平７−２９８８７７）も、特に断りがない限り既存の方法に準じた。
実施例１
ヒト成長ホルモン発現アデノウイルスベクターの作製
（１）ヒト成長ホルモンｃＤＮＡのクローニング
ＰＣＲ法によりヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ｃＤＮＡをクローニングするため、以下の操作を行った。
市販ヒト脳下垂体アデノーマ由来ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）からファージＤＮＡを調製し、これをＰＣＲのテンプレートＤＮＡとした。ＰＣＲのプライマーは両末端に制限酵素の認識部位を付加するように設計し、５’側プライマーは開始コドンならびにＮｈｅＩ認識部位を含み、３’側プライマーは終止コドンならびにＳｐｈＩ認識部位を含む。各々のプライマーの配列を以下に示した。

前述したｃＤＮＡライブラリー由来ＤＮＡをテンプレートとし、ポリメラーゼｐｆｕ（宝酒造）を用いて常法によりＰＣＲ反応を行い、ｈＧＨ ｃＤＮＡを含む約７００ｂｐの増幅断片を得た。この増幅断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、プラスミドｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣＨＧＨ（３．４ｋｂ）を得た。ｐＵＣＨＧＨのｈＧＨ ｃＤＮＡ部分の塩基配列を解読し、その配列が文献（Ｃｈｅｎ Ｅ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｏｌ，４，４７９−４９７．（１９８９））記載の配列と同一であることを確認した。
（２）ヒト成長ホルモン発現組換えアデノウイルスベクターの作製
ｐＵＣＨＧＨをＮｈｅＩおよびＢｇｌＩで消化し、さらに末端を平滑化し、ｈＧＨ ｃＤＮＡのコード領域を含む約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのプロモーターとポリＡ配列との間のＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドｐＡｘ１ＣＡＨＧＨを得た。
コスミドｐＡｘ１ＣＡＨＧＨにｈＧＨの発現単位が正確に組み込まれていることを確認するため、ｐＡｘ１ＣＡＨＧＨからｈＧＨの発現単位を含むプラスミドを構築し、ＣＯＳ７細胞（サル腎臓由来細胞株）でｈＧＨ蛋白を一過的に発現させた。すなわち、まずｐＡｘ１ＣＡＨＧＨをＮｒｕＩ消化後自己ライゲーションさせ、アデノウイルスＤＮＡの大部分を除いた（左端約０．４ｋｂは含む）ｈＧＨ発現プラスミド、Ｐｘ１ＣＡＨＧＨを得た。次いでＰｘ１ＣＡＨＧＨにてＣＯＳ７細胞をＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法で形質転換し、２日後の培養上清中のｈＧＨ濃度をＥＬＩＳＡ法（ピコイア^ＴＭＨＧＨプレート：住友製薬）で測定した。プラスミドを導入していないＣＯＳ７細胞の培養上清中のｈＧＨ濃度は検出限界以下であったが、Ｐｘ１ＣＡＨＧＨで形質転換したＣＯＳ７細胞の培養上清中には１ｎｇ／ｍｌ以上のｈＧＨが検出された。この結果より、コスミドｐＡｘ１ＣＡＨＧＨにはｈＧＨの発現単位が正確に組み込まれていることが確認できた。 最後に、前述したＣＯＳ／ＴＰＣ法により、コスミドｐＡｘ１ＣＡＨＧＨとアデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白質複合体とで２９３細胞を形質転換し、ｈＧＨ発現組換えアデノウイルスＡｘ１ＣＡＨＧＨ（図１、Ｅ１及びＥ３遺伝子欠失）を得た。
実施例２
ｈＧＨを発現するＥ２Ａ遺伝子欠損アデノウイルスベクターの作製
（１）Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター作製用の組換えアデノウイルスの作製
コスミドベクターｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔ（特開平８−３０８５８５公報１９頁のｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔはｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔと同一である）は、前述したコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔの誘導体である。ｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔは、ｐＡｘＣＡｗｔのアデノウイルスＬ３遺伝子とＥ２Ａ遺伝子との間（６１．５マップ単位）、ならびにＥ３遺伝子の欠失部位（７８．０マップ単位）にそれぞれｌｏｘＰ配列が挿入されたコスミドで、ｌｏｘＰ挿入部以外の塩基配列はｐＡｘＣＡｗｔと同じである。
実施例１で作製したプラスミドｐＵＣＨＧＨをＮｈｅＩおよびＢｇｌＩで消化後、末端を平滑化し、ｈＧＨ ｃＤＮＡのコード領域を含む約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、コスミドベクターｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔのプロモーターとポリＡ配列との間のＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨを得た。
アデノウイルスベクターＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺ（図１、特開平８−３０８５８５公報２１頁）は、コスミドベクターｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔと同じ位置に二つのｌｏｘＰ配列が挿入され、大腸菌β−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルスである。
Ａｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺの挿入遺伝子を、ｌａｃＺからｈＧＨに置換した組換えアデノウイルスを作るため、既存の方法（特開平７−２９８８７７）に従い以下の操作を行った。まず、Ａｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺからアデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白質複合体を調製し、次いでＥｃｏＴ２２Ｉ消化した。このＤＮＡ−末端蛋白質複合体とコスミドｐＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨとで２９３細胞を形質転換し、ｈＧＨ発現単位および二つのｌｏｘＰ配列を有する組換えアデノウイルスＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨ（図１）を得た。このＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨは、ｌｏｘＰ挿入部以外の構造は実施例１で作製したアデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨと同一であり、また発現単位以外の構造はアデノウイルスベクターＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺと同一である。
（２）Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターの作製
リコンビナーゼＣｒｅの作用により、アデノウイルスベクターＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨから二つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＥ２Ａ遺伝子およびＬ４遺伝子を欠損させた組換えアデノウイルス（Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター）を作製するため、以下の操作を行った。
まず、アデノウイルスベクターＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨおよびリコンビナーゼＣｒｅ発現アデノウイルスベクターＡｘＣＡＮＣｒｅ（図１、Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２３，３８１６−３８２１．（１９９５））を超遠心法（前出）にて精製し、２９３細胞を用いた限界希釈法（前出）によりそれぞれのウイルスの力価を測定した。
次に、コラーゲンコートした２２５ｃｍ^２の培養フラスコにほぼコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）となった２９３細胞に、３．０ｘ１０^７ＰＦＵ／ｍｌのＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨ（ｍｏｉ ２）と１．５ｘ１０^７ＰＦＵ／ｍｌのＡｘＣＡＮＣｒｅ（ｍｏｉ １）とを含む培地（５％ＦＣＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地：ＤＭＥＭ培地）４ｍｌを加え、両ウイルスを３７℃で１時間感染させた。感染終了後、５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地２１ｍｌを加え、５％ＣＯ_２の存在下３７℃で培養した。２日後、フラスコ底面に付着している細胞をセルスクレーパーで剥がし、培養上清を含む細胞縣濁液を５０ｍｌ容量の遠心管に入れ、２５００ｒｐｍ（１１３０ｘｇ）、４℃、５分間遠心後、上澄を捨て細胞画分を−８０℃で凍結保存した。
（３）Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターの精製
前記Ａｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨとＡｘＣＡＮＣｒｅとを同時感染させた２９３細胞中では、目的とするｈＧＨ発現Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター（ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ：２８．１ｋｂ）が生成しているが、同時にＡｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨ（３４．４ｋｂ）およびＡｘＣＡＮＣｒｅ（３４．７ｋｂ）も存在し、これら３種類のアデノウイルスが混在している（括弧内は各ウイルスのゲノムサイズ）。そこで、ウイルスの比重の差に基づきΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨを単離するため、以下に示す塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心法により、Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスの精製を行った。なお、精製に用いたＣｓＣｌ溶液は全て５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．４）で調製し、遠心および超遠心は全て４℃で行った。
▲１▼−８０℃で凍結保存していたΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨを含む２９３細胞の細胞画分を融解し、２２５ｃｍ^２フラスコ８本分の細胞当たり２５ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．４）に縣濁した。次いで、細胞縣濁液を２００ｍｌ容量のソニケーターカップに入れ、密閉式超音波破砕装置（コスモバイオ社製、ＵＣＤ−２００Ｔ型）で超音波破砕した（２００Ｗ、３分（３０秒ｘ６回）、４℃）。細胞破砕液を３０ｍｌ容量の遠心管に移し、１０，０００ｒｐｍ（１１，８５０ｘｇ）で１０分間遠心した。遠心後の上澄を次に示す３段階の超遠心法に供した。
▲２▼細胞破砕液中のアデノウイルスを濃縮するため、ベックマン社スイングローターＳＷ２８用の超遠心チューブに比重１．４３のＣｓＣｌ溶液８ｍｌを入れ、その上に▲１▼で調製した上澄約２５ｍｌを重層し、２３，０００ｒｐｍ（９５，４００ｘｇ）で約１．５時間超遠心した。遠心後、水相とＣｓＣｌ相との界面付近のアデノウイルスを含むバンドを回収し（チューブ当たり約２．５ｍｌ）、回収したウイルス液と等量の飽和ＣｓＣｌ溶液を加えた。
▲３▼ベックマン社スイングローターＳＷ４１用の超遠心チューブに、下から順に次の溶液を重層した。▲２▼で調製したウイルス液（約５ｍｌ）／比重１．３２のＣｓＣｌ溶液（４．５ｍｌ）／比重１．２５のＣｓＣｌ溶液（２．５ｍｌ）。これを３５，０００ｒｐｍ（２１０，０００ｘｇ）で３時間超遠心した。この超遠心により、蛋白質は比重１．２５と１．３２のＣｓＣｌ溶液の界面付近でブロードなバンドに、ウイルスは比重１．３２のＣｓＣｌ溶液の中ほどでシャープなバンドとなるので、蛋白質のバンドを含まないようにウイルスのバンドを回収し（チューブ当たり約１．５ｍｌ）、回収したウイルス液と等量の比重１．３６のＣｓＣｌ溶液を加えた。
▲４▼ＳＷ４１用の超遠心チューブに、▲３▼で調製したウイルス液約２ｍｌと比重１．３４のＣｓＣｌ溶液約１０ｍｌを入れ、よく混合後、３０，０００ｒｐｍ（１５４，０００ｘｇ）で約１９時間超遠心した。この超遠心により、各ウイルスの比重に応じて、それぞれのウイルスのバンドが分離する。Ａｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨ（３４．４ｋｂ）とＡｘＣＡＮＣｒｅ（３４．７ｋｂ）とはゲノムサイズがほぼ等しいのでウイルスの比重もほぼ等しく、超遠心後のウイルスバンドは重なっていたが、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（２８．１ｋｂ）はこれら両ウイルスよりも比重が小さいため、超遠心によりチューブの上側にバンドを生じた。超遠心チューブの側面に注射針で穴を開け、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨのバンドを回収した。
▲５▼最後にウイルス液からＣｓＣｌを除くため、１０％グリセロールを含むＰＢＳ（−）で一晩透析し、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨの最終精製品を得た。透析後のウイルスは、分注後−８０℃で凍結保存した。
（４）Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターの感染力価ならびに純度測定
▲１▼感染力価測定
Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスは２９３細胞では増殖しないため、第一世代アデノウイルスベクター（Ｅ１遺伝子を欠失）のように、２９３細胞での増殖を指標とした通常の方法では力価を測定できない。そこで、レポーター遺伝子であるｈＧＨの産生量を指標に、力価が既知のｈＧＨ発現第一世代アデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨとΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨとのｈＧＨ産生量を比較することにより、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨの相対的な力価（感染力価）を測定した。
被験アデノウイルスベクターを２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈後、その５０μｌを９６穴マイクロプレートで培養したＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞株）に添加し、３７℃で１時間感染させた。次いでウイルス液を除き、培地で一度洗浄後、２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地１００μｌを添加し２日間培養した。培養終了後、上清中のｈＧＨ量をＥＬＩＳＡ法（ピコイア^ＴＭＨＧＨプレート：住友製薬）で測定した。
まず、第一世代アデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨを用いて予備検討を行い、ウイルス感染時のｍｏｉ ０．０１〜１の範囲では添加したウイルス量とｈＧＨ産生量がほぼ比例したことより、ｈＧＨ産生量がウイルス量を反映することを確認した。
そこで、力価が既知のＡｘ１ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．Ｂ、力価３．０ｘ１０^１０ＰＦＵ／ｍｌ）を対照ウイルスとして、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の感染力価を測定した。感染時の各ウイルスの希釈倍率を、３０，０００、９０，０００、２７０，０００倍希釈とし、２日後のｈＧＨ産生量を比較した。いずれの希釈倍率とも、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）よりＡｘ１ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ，Ｂ）の方がｈＧＨ産生量は高く、その平均は約１．１倍であった。従って、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の力価は、３．０ｘ１０^１０ＰＦＵ／ｍｌ ｘ１／１．１＝２．７×１０^１０ＰＦＵ／ｍｌ（相当）と算出した。
この値を元にΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の総収量を計算すると、２２５ｃｍ^２フフスコ４８本分の２９３細胞から４．７ｘ１０^１０ＰＦＵ（相当）のウイルスが得られた。さらに、精製ウイルスの２６０ｎｍの吸光度の測定から、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の粒子数（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）／プラーク形成単位（ＰＦＵ）比は６３であった。
また、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨの別ロットについても同様の測定を行い、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．２）の総収量は２２５ｃｍ^２フラスコ２０本分の２９３細胞あたり１．９ｘ１０^１０ＰＦＵ（相当）、粒子数／プラーク形成単位比は４７であった。
▲２▼純度測定
Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターは超遠心法により精製しているが、精製時に除去できなかった第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ２ＬＤ３ＬＣＡＨＧＨおよびＡｘＣＡＮＣｒｅ）が若干混入している。これら混入している第一世代アデノウイルスベクターは２９３細胞で増殖できるので、２９３細胞を用いた通常の方法（限界希釈法）で測定した力価は、混入している第一世代アデノウイルスベクターの量を反映している。そこで、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の純度を求めるため、２９３細胞を用いた限界希釈法により力価を測定した。ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の力価は７．８ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍｌ、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．Ｂ）の力価は４．４ｘ１０^１０ＰＦＵ／ｍｌで、その比は１．８％であった。▲１▼の結果から、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．Ｂ）はΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の１．１倍の感染力価であることより、この値を補正し、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）の純度は、（１−０．０１８ｘ１．１）ｘ１００≒９８％と算出した。
また、同様の測定から別ロットΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．２）の純度は９７％であった。
（５）Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターのアデノウイルス蛋白の発現低下の確認
Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター感染細胞では、Ｅ２Ａ遺伝子にコードされるＤＢＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびアデノウイルス粒子の主要な構成蛋白質であるヘキソンの発現が低下しているかどうかを蛍光抗体法により検討した。
コラーゲンコートされた８ウェルカルチャースライド（ＢＥＣＫＴＯＮ ＤＩＫＩＮＳＯＮ社、＃４０６３０）でコンフルエントとなったＡ５４９細胞（約１．５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ）に、ｍｏｉ １００またはｍｏｉ １０となるように５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈したΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨまたはＡｘ１ＣＡＨＧＨを含むウイルス液１００μｌを添加し、３７℃で１時間感染させた。感染後、ウイルス液を除き５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地０．３ｍｌを添加し２日間培養した。２日後、培地を除き細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（−）を０．４ｍｌ加え、室温で１０分間細胞を固定し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。さらに、１ｍｇ／ｍｌのサポニンにより膜透過処理（室温、３０分）を行った後、ＤＢＰもしくはヘキソンの検出に供した。
ＤＢＰの検出は、スライドグラスを１０％正常ヤギ血清でブロッキング後、ウサギ抗ＤＢＰペプチド（ＲＰＰＴＭＥＤＶＳＳＰＳＰＳＰＰＰＰＲＡＰＰＫＫＲ：ＤＢＰの２２−４６番目のアミノ酸残基に相当）抗体、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ社、＃１１１−０９６−００３）を順次反応させた後、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌ−ｉｎｄｏｌｅ）溶液で核染色を行い、落射式蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ−５０）にて観察した。
ヘキソンの検出は、スライドグラスを１０％正常ウサギ血清でブロッキング後、ヤギ抗ヘキソン抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社、ＡＢ−１０５６）、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＦＩ−５０００）を順次反応させた後、ＤＡＰＩで核染色を行い、落射式蛍光顕微鏡にて観察した。
ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞では、ＤＢＰおよびヘキソンとも発現量が明らかに減少し、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨをｍｏｉ １００で感染させた細胞でのＤＢＰおよびヘキソン陽性細胞の割合は、Ａｘ１ＣＡＨＧＨをｍｏｉ １０で感染させた細胞とほぼ同じであった。従って、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨは当初の目的通りアデノウイルス遺伝子の発現が低下していることが確認できた。
実施例３
Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスの炎症惹起作用の検討
アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子を欠失させることにより炎症惹起作用が低下するかどうかを明らかにするため、ｈＧＨ発現Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクター（ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ）またはｈＧＨ発現第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨ）をマウスに投与し、血中ＧＰＴ（グルタミン酸−ピルビン酸−トランスアミナーゼ）値を指標に、両アデノウイルスベクターの炎症惹起作用を比較した。以下に方法及び結果を示す。
（１）方法
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、雌）を用いた。またアデノウイルスベクターは、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．３）又はＡｘ１ＣＡＨＧＨ（Ｌｏｔ．Ｃ）を用いた。アデノウイルスベクター投与量は１ｘ１０^９ＰＦＵ、３ｘ１０^８ＰＦＵ又は１ｘ１０^８ＰＦＵ（一群５匹）とし、生理食塩水で希釈したアデノウイルスベクターを、マウス１匹当たり０．２ｍｌずつ尾静脈より投与した。アデノウイルスベクター投与３日前および投与３、５、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、及び６３日後に、エーテル麻酔下、ヘパリン処理ヘマトクリット管を用いて眼窩静脈より部分採血した。血液を１０，０００回転、５分遠心し、血清を分離し、使用まで−２０℃で保存した。血清中のＧＰＴ値は、トランスアミナーゼＣＨ−テストワコー（和光純薬）を用い、ＰＯＰ−ＴＯＯＳ法にて測定した。
（２）結果
アデノウイルスベクターをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与後、経日的に測定した血清ＧＰＴ値の平均値を図２に示した。それぞれの投与群のベクターの投与効率を確認するため、アデノウイルスベクター投与３日後および５日後の血清のｈＧＨ濃度も測定した。アデノウイルスベクター投与量が同じ群では、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ投与群とΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ投与群での血中ｈＧＨ濃度には有意の差はなく、両ベクターは同じ効率で投与されたことを確認した。
次いで、血清ＧＰＴ値の測定を行った。ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ投与マウスにおいても、アデノウイルスベクター投与量に応じて血清ＧＰＴ値は上昇し、第一世代アデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨ投与マウスと差は無かった。この結果より、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子を欠損させても炎症惹起作用を軽減できないことが示された。
実施例４
ＵＶ不活化アデノウイルス粒子の調製
アデノウイルスベクターをマウスに投与した際に生じる炎症の原因が、アデノウイルス粒子自体に起因するか否かを明らかにする目的に使用するため、以下の操作によりＵＶ不活化アデノウイルス粒子の調製を行った。
実施例２−（２）に記載した方法で精製したｈＧＨ発現アデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨ（３．０ｘ１０^１０ＰＦＵ／ｍｌ、１．４ｘ１０^１２ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）１．８ｍｌに、３３ｍｇ／ｍｌの濃度の８−ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ（８−ＭＯＰ）１８μｌを添加し（８−ＭＯＰの終濃度３３０μｇ／ｍｌ）、その０．６ｍｌずつを直径３５ｍｍの組織培養用シャーレ（住友ベークライト、型番ＭＳ−１０３５０）３枚に分注した。次いで、シャーレを氷上に置き、シャーレのフタをしたまま、波長３６５ｎｍのＵＶランプを装着した（８ワット、５本）ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ^ＴＭＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ １８００ ｍｏｄｅｌ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＵＶランプ下５ｃｍの位置においた。そして、１０分おきにシャーレの位置を変えながら、１時間ＵＶを照射した（ＵＶ強度約１．８ｍＷ）。ＵＶ照射後、シャーレからウイルス液を回収し、８−ＭＯＰを除くために１０％グリセロール含有ＰＢＳ（−）で一晩透析した。最終的に粒子濃度１．１ｘ１０^１２ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのウイルス液を約１．７ｍｌ回収し、−８０℃で凍結保存した。
上記処理によりアデノウイルスベクターが不活化されたことは、ｈＧＨ産生量と力価測定の二つの方法で確認した。ｈＧＨ産生量の測定は、実施例２−（４）に示した方法で行った。ただし、異なる点として、アデノウイルスベクター感染１日後のｈＧＨ濃度を測定した。ＵＶ不活化処理前のアデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨを１ｘ１０^５ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌで感染させた場合のｈＧＨ産生量は約０．２ｎｇ／ｍｌ、１ｘ１０^１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌで感染させた場合は約２８μｇ／ｍｌであった。一方、上記不活化処理を行ったアデノウイルスベクターは、１ｘ１０^１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌで感染させた場合でもｈＧＨ産生量は０．４ｎｇ／ｍｌであった。従って、ｈＧＨ産生量から計算すると、アデノウイルスベクターの感染性は、不活化処理により１０^５分の１に低下していることが確認された。また、２９３細胞を用いた通常の方法での力価測定も行った。不活化処理前のウイルス力価は約３ｘ１０^１０ＰＦＵ／ｍｌであったが、不活化処理後の力価は２ｘ１０^３ＰＦＵ／ｍｌ未満であり、ウイルス力価は１０^７分の１以下に低下していた。
以上の結果より、本方法によりＵＶ照射処理を行ったウイルス（ＵＶ不活化アデノウイルス粒子）は、十分に不活化されていることを確認した。
実施例５
第一世代アデノウイルスベクター投与時の炎症の原因の検討
実施例３でＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクターをマウスに投与しても、第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨ）を投与した場合に較べて血清ＧＰＴ値が低下しない、すなわち炎症が軽減されなかったことを示した。この結果の解釈として、以下の４つの可能性が考えられた。▲１▼Ｅ２Ａ遺伝子の発現は炎症には関与しない。▲２▼レポーターとして用いたｈＧＨ蛋白質が細胞性免疫の抗原となり炎症が起きる。▲３▼外来プロモーター（ＣＡＧプロモーター）により発現が誘導されたウイルス遺伝子産物が細胞性免疫の抗原となる。▲４▼感染した動物個体内で新たに合成されるウイルス蛋白ではなく、ウイルス感染時に細胞内に持ち込まれたウイルス粒子構成蛋白質が細胞性免疫の抗原となる。
そこで、種々の構造のアデノウイルスをマウスに投与し、血清ＧＰＴ値を炎症の指標として、第一世代アデノウイルスベクター投与時の炎症の原因の検討を行った。以下に、用いたアデノウイルスベクター、実験方法及び結果を示す。
（１）アデノウイルスベクター
用いたアデノウイルスベクターを以下に示す。全て第一世代アデノウイルスベクターである。
・ｈＧＨ発現アデノウイルスベクター：Ａｘ１ＣＡＨＧＨ
・ｈＧＨ ｃＤＮＡを有さずＣＡＧプロモーターのみが挿入されたアデノウイルスベクター：ＡｘＣＡｗｔ（図１：ポリＡ配列も挿入）（Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２３，３８１６−３８２１．（１９９５））
・プロモーター等の外来遺伝子が挿入されていないアデノウイルスベクター（制限酵素ＳｗａＩ部位のみが挿入）：Ａｘ１ｗ１（図１、Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６）、なお本文献中ではＡｄｅｘ１ｗと記載）
・Ａｘ１ＣＡＨＧＨをＵＶ照射により不活化したウイルス：ＵＶ不活化粒子（実施例４参照）
（２）方法
方法の大部分は実施例３に示した方法と同じである。以下、相違点のみを記載する。
ベクター投与量は、１ｘ１０^９ＰＦＵ、３ｘ１０^８ＰＦＵ、１ｘ１０^８ＰＦＵ又は３ｘ１０^７ＰＦＵ（一群５匹）で行った。なおＵＶ不活化粒子はＰＦＵ換算では投与量が決められないので、粒子数換算でＡｘ１ＣＡＨＧＨと同量になるよう投与した。
採血は、ベクター投与３日前および投与３、５、７、１０（又は１１）、１４、２１、２８日後に行った。
（３）結果
実験は２回に分けて行った。１回目は、Ａｘ１ＣＡＨＧＨとＡｘＣＡｗｔとを比較した（図３、上段）。２回目は、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ、Ａｘ１ｗ１及びＵＶ不活化粒子を比較した（図３、下段）。両実験とも陰性対照としてベクターの希釈に用いた生理食塩水のみを投与した群を設定した。図３において、生理食塩水投与群のデータは１回目の実験の結果のみを示すが、２回目の実験の結果も同様であった。
ＣＡＧプロモーターの制御下にｈＧＨを発現するアデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨ）投与群と、ＣＡＧプロモーターのみを有するアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡｗｔ）投与群との間には、血清ＧＰＴ値の上昇の程度にほとんど差が無かった。従って、レポーター遺伝子であるｈＧＨの発現は炎症に関与していないことが示された。一方、外来遺伝子が挿入されていないアデノウイルスベクター（Ａｘ１ｗ１）投与群およびＵＶ不活化粒子投与群では、血清ＧＰＴ値は全く上昇しなかった。ＡｘＣＡｗｔとＡｘ１ｗ１との構造の違いはＣＡＧプロモーター及びポリＡ配列の有無だけであるので、血清ＧＰＴ値の上昇の原因、すなわち炎症の原因は、主にＣＡＧプロモーターに起因することが示された。
実施例６
ＣＡＧプロモーターにより発現が誘導されるアデノウイルス遺伝子の同定
第一世代アデノウイルスベクターにおいて、ＣＡＧプロモーターにより発現が誘導され炎症の原因となるアデノウイルス遺伝子を同定するため、以下に示す種々のアデノウイルスベクターを、第一世代アデノウイルスベクターが増殖できない細胞株（Ａ５４９細胞またはＨｅｐＧ２細胞）に感染させ、発現するアデノウイルス遺伝子をノザンブロットにより解析した。検討に用いたアデノウイルスベクターは、ＣＡＧプロモーターを有する第一世代アデノウイルスベクター（Ａｘ１ＣＡＨＧＨ、ＡｘＣＡｗｔ）、外来プロモーターが存在しない第一世代ベクター（Ａｘ１ｗ１）およびＣＡＧプロモーターを有するＥ２Ａ欠損アデノウイルスベクター（ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ）である。なお、目的のアデノウイルス遺伝子、すなわちＣＡＧプロモーターにより発現誘導される遺伝子とは、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ、ＡｘＣＡｗｔ、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨの３種のベクター感染細胞では同程度発現するが、Ａｘ１ｗ１感染細胞ではほとんど発現しないアデノウイルス遺伝子である。以下に、方法及び結果を示す。
（１）方法
２５ｃｍ^２の培養フラスコにほぼコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）となった（約５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ）Ａ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞株）もしくはＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）に、５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈した各アデノウイルスベクター０．３ｍｌを加え１時間感染させた（ｍｏｉ １００）。感染後、ウイルス液を除き５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地５ｍｌを加え２４時間培養した。２４時間後、培地を除き細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い、その使用説明書に従い各ウイルス感染細胞からＲＮＡを調製した。
ノザンブロットに用いたプローブは、コスミドベクターｐＡｘｃｗ（前出）をテンプレートとしてＰＣＲにより増幅したＤＮＡを、ＢｃａＢＥＳＴ^ＴＭＬａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を以下に示す（括弧内の数値は、アデノウイルス５型の塩基番号及び配列番号）。

ＲＮＡ各５μｇを１％アガロースゲル電気泳動後、キャピラリートランスファー法でナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にブロッティングし、ＵＶクロスリンクを行った。フィルターを０．０２％メチレンブルー溶液で染色し２８Ｓおよび１８ＳのＲＮＡの位置を確認した後、バッファーＡ（０．５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）／７％ＳＤＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０ｍｌを加え６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、フィルターに^３２Ｐ標識プローブ１２．５ｎｇを含む５０ｍｌのバッファーＡを加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。さらに、バッファーＢ（４０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）／１％ＳＤＳ）２００ｍｌを加え、フィルターを６５℃で２回洗浄した後、オートラジオグラムに供した。
（３）結果
ノザンブロットの結果の例を図４Ａ〜Ｃに、また結果のまとめを表１に示した。アデノウイルス主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＭＬＰ）に支配される主要後期遺伝子、例えばヘキソンを含むＬ３遺伝子は、Ａ５４９細胞ではＡｘＣＡｗｔ感染細胞に較べＡｘ１ｗ１感染細胞での発現が明らかに低下していたが、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞でも同様に低下していた（図４Ａ）。さらに、ＨｅｐＧ２細胞では、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞でのみＬ３遺伝子の発現が低下していた。データは省略するが、他の主要後期遺伝子であるＬ２およびＬ５遺伝子でもＬ３遺伝子の場合と同様の結果であり、これらの後期遺伝子はＣＡＧプロモーターによる発現誘導は認められなかった。
Ｅ２Ａ遺伝子の発現は、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞では当然ながら低下していたが、Ａｘ１ｗ１感染細胞とＡｘＣＡｗｔ感染細胞との間で差はなく、両ウイルス感染細胞で同程度発現していた。Ｅ４遺伝子の発現は、全てのベクター感染細胞間で差は無く、いずれのウイルス感染細胞とも同程度発現していた（以上データ省略）。従って、Ｅ２Ａ遺伝子およびＥ４遺伝子ともＣＡＧプロモーターにより発現は誘導されないことが明らかとなった。
ＭＬＰに支配されない遅延初期（ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ）遺伝子であるＩＶａ２遺伝子の発現は、ＨｅｐＧ２細胞ではＡｘ１ｗ１感染細胞とＡｘＣＡｗｔ感染細胞との間で差はなく、同程度発現していた。一方、Ａ５４９細胞ではＡｘ１ｗ１感染細胞でのみ、ＩＶａ２遺伝子の発現が低下していた（図４Ｂ）。
また、ＭＬＰに支配される後期遺伝子の一つであるＬ１遺伝子の発現もＩＶａ２遺伝子と同様な傾向で、ＨｅｐＧ２細胞とＡ５４９細胞とでは異なる結果であった（表１参照）。
一方、ＩＶａ２遺伝子と同じくＭＬＰに支配されない遅延初期遺伝子であるタンパク質ＩＸ遺伝子（以下、ｐＩＸ遺伝子）の発現は、Ａ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞とも同じ結果であった。すなわち、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞ではｐＩＸ遺伝子の発現は低下せず、Ａｘ１ｗ１感染細胞でのみ、発現が明らかに低下していた（図４Ｃ）。
以上の結果より、Ａ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞の両方の細胞株で、血清ＧＰＴ値の変動と同様の発現パターン、すなわちＡｘＣＡｗｔ、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ、ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨ感染細胞ではほぼ同じでＡｘ１ｗ１で感染細胞でのみ発現が低下している遺伝子は、ｐＩＸ遺伝子のみであった。このことから、ＣＡＧプロモーターにより発現が誘導され炎症の原因となっているのはｐＩＸ遺伝子であることが示された。

実施例７
ＣＭＶプロモーターによるｐＩＸ遺伝子の発現誘導の確認
ＣＡＧプロモーターと同様にＣＭＶプロモーターでもｐＩＸ遺伝子の発現が誘導されるか否かについて検討した。ＣＭＶプロモーターが挿入された組換えアデノウイルスは、アデノウイルス５型のＥ１欠失部位にＣＭＶプロモーターと大腸菌ｌａｃＺ遺伝子とが右向けに挿入された組換えアデノウイルスＡｄＣＭＶｌａｃＺ（Ｏｓａｄａ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，Ｖｏｌ．５５，１２３４−１２４０．１９９９））を用いた。ＣＡＧプロモーターが挿入された対照ウイルスとしては、実施例６で示したＡｘＣＡｗｔを用いた。
ＡｄＣＭＶｌａｃＺもしくはＡｘＣＡｗｔを、実施例６に示したのと同様の方法によりＡ５４９細胞に感染させ、２４時間後にＲＮＡを回収した。ただし、感染時のｍｏｉは、ＡｄＣＭＶｌａｃＺはｍｏｉ ６またはｍｏｉ ２、ＡｘＣＡｗｔはｍｏｉ ３００またはｍｏｉ １００とした。ノザンブロットは、実施例６で示したｐＩＸプローブを用いて行った。
結果を図５に示す。ＡｄＣＭＶｌａｃＺをｍｏｉ ６で感染した細胞では、ＡｘＣＡｗｔをｍｏｉ １００で感染した細胞と同等かそれ以上のｐＩＸ遺伝子が発現していた。両ウイルス感染時のｍｏｉが異なること、およびプロモーターの挿入方向が異なりプロモーターからｐＩＸ遺伝子までの距離が異なるので、ＣＡＧプロモーターとＣＭＶプロモーターのｐＩＸ遺伝子の発現誘導の強さの程度を比較はできないが、ＣＭＶプロモーターを挿入したＡｄＣＭＶｌａｃＺ感染細胞の方がより低いｍｏｉでもｐＩＸ遺伝子を発現していたことより、ＣＭＶプロモーターでもｐＩＸ遺伝子の発現が誘導されることが明らかに示された。
実施例８
ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーターによるｐＩＸ遺伝子の発現誘導の有無の検討
ＣＭＶエンハンサーを含まない外来プロモーターにより、ｐＩＸ遺伝子の発現が誘導されるか否かについて検討した。検討に用いた外来プロモーターは、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８，４６６−４７２．（１９８８））及びＥＦ−１αプロモーター（Ｋｉｍ Ｄ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．９１，２１７−２２３．（１９９０））で、各々のプロモーターと大腸菌ｌａｃＺ遺伝子とが左向きに挿入されたアデノウイルスベクター（ＡｘＳＲＬａｃＺ−Ｌ及びＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ）を用いた。陽性対照として、ＣＡＧプロモーターのみが挿入されたアデノウイルスベクターＡｘＣＡｗｔ（実施例５参照）及びＣＡＧプロモーターと大腸菌ｌａｃＺ遺伝子とが左向きに挿入されたアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌ）を用いた。ＡｘＳＲＬａｃＺ−Ｌ、ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ及びＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌの作製方法は、斎藤らにより開示されており（特開平７−２９８８７７）、資料中のＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺ−ＬはＡｘＳＲＬａｃＺ−Ｌと、Ａｄｅｘ１ＥＦＬａｃＺ−ＬはＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌと、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ−ＬはＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌとそれぞれ同一である。また、陰性対照としては、外来プロモーターが挿入されていないアデノウイルスベクターＡｘ１ｗ１（実施例５参照）を用いた。さらに、実施例７で用いたＣＭＶプロモーターを有するアデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶｌａｃＺ）についても再度検討した。
前記６種類のアデノウイルスベクター（ＡｘＳＲＬａｃＺ−Ｌ、ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ、ＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌ、ＡｄＣＭＶｌａｃＺ、ＡｘＣＡｗｔ、Ａｘ１ｗ１）をＡ５４９細胞にｍｏｉ ３０またはｍｏｉ １００で感染させ、２４時間後にＲＮＡを回収し、ｐＩＸプローブを用いてノザンブロットを行った（方法の詳細は実施例６参照）。
結果を図６に示す。ＣＭＶプロモーターを有するアデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶｌａｃＺ）感染細胞では、やはりｐＩＸ遺伝子は明らかに発現しており、その発現量は陽性対照であるＣＡＧプロモーターを有するアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌ及びＡｘＣＡｗｔ）感染細胞と同等かそれ以上であった。
一方、ＥＦ−１αプロモーターを有するアデノウイルスベクター（ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ）感染細胞ではｐＩＸ遺伝子の発現は全く認められなかった。またＳＲαプロモーターを有するアデノウイルスベクター（ＡｘＳＲＬａｃＺ−Ｌ）感染細胞では、ｐＩＸ遺伝子の発現が認められた。
以上の結果から、外来プロモーターによるｐＩＸ遺伝子の発現はプロモーターによる特異性があり、例えばＥＦ−１αプロモーターのようにｐＩＸ遺伝子の発現を全く誘導しない外来プロモーターが存在することが示された。さらに、ＣＡＧプロモーターとＣＭＶプロモーターとの構造の共通部分はＣＭＶ ＩＥエンハンサーだけであるので、ｐＩＸ遺伝子の発現を誘導しているのは、主にＣＭＶ ＩＥエンハンサーであることが示された。
実施例９
異なるプロモーターを有するアデノウイルスベクターの炎症惹起能の検討
外来プロモーターによるｐＩＸ遺伝子の発現誘導とアデノウイルスベクターを動物に投与した際に生じる炎症とが相関していることを証明するために、実施例８で用いたアデノウイルスベクターのうち、ＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ、ＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌ、ＡｄＣＭＶｌａｃＺ、Ａｘ１ｗ１の４種のベクターをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、血清ＧＰＴ値を指標に炎症の程度を比較検討した。
アデノウイルスベクターは、１ｘ１０^９ＰＦＵ（ＡｄＣＭＶｌａｃＺ以外）、３ｘ１０^８ＰＦＵ、１ｘ１０^８ＰＦＵを尾静脈投与（一群５匹）し、投与３日前および投与３、５、７、１０、１４、２１、２８、３５日後に採血し、ＧＰＴ値を測定した。各々の方法の詳細は、実施例３に示した方法に準じた。
結果を図７に示す。ＣＭＶプロモーターを有するＡｄＣＭＶｌａｃＺ投与マウスでは、ＣＡＧプロモーターを有するＡｘＣＡＬａｃＺ−Ｌ投与マウスよりも血清ＧＰＴ値が上昇し、炎症の程度と実施例８で示したｐＩＸ遺伝子の発現量とが相関していた。一方、ＥＦ−１αプロモーターを有するＡｘＥＦＬａｃＺ−Ｌ投与マウスでは、血清ＧＰＴ値はほとんど上昇せず、外来プロモーターが挿入されていないＡｘ１ｗ１投与マウスと同レベルであった。
以上の結果より、ｐＩＸ遺伝子の発現とｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症とが正の相関をしていること、すなわち、ｐＩＸ遺伝子の発現を誘導しないプロモーターを有するアデノウイルスベクターは炎症を惹起しないことが示され、外来プロモーターからのｐＩＸ遺伝子の発現誘導が炎症の原因であることが示された。
実施例１０
抗タンパク質ＩＸ抗体の作製ならびにタンパク質ＩＸの検出
（１）タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）遺伝子のクローニング
ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）のｐＩＸ遺伝子のコーディング領域をＰＣＲ法によりクローニングするため、以下の操作を行った。前出のコスミドベクターｐＡｘｃｗをテンプレートとして、以下の配列のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。５’側プライマーは、Ａｄ５の３５８５−３６０５番目の塩基配列およびＥｃｏＲＩ認識部位を有するように、３’側プライマーはＡｄ５の４０３４−４０１５番目の塩基配列およびＸｈｏＩ認識部位を含むように各々設計した。

Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いてＰＣＲ反応を行い、ｐＩＸ遺伝子のコーディング領域を含む４７０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。市販発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）には、ＣＭＶプロモーター下流にマルチクローニングサイトが存在する。そこで、ＰＣＲで増幅した４７０ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで同時に消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入し、ｐＩＸ発現プラスミドｐＣＭＶ−ＩＸ（５．９ｋｂ）を得た。このｐＣＭＶ−ＩＸのｐＩＸ遺伝子のコーディング領域を含む部分の塩基配列を解読し、その配列が既存の配列（ジーンバンク：アクセス番号Ｍ７３２６０）と相違ないことを確認した。
（２）ｐＩＸ融合タンパク質の調製
抗ｐＩＸ抗体を得るための抗原として、ｐＩＸとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質（ＧＳＴ−ｐＩＸ）を調製した。
▲１▼ｐＩＸ融合タンパク質発現プラスミドの構築
まず、プラスミドｐＣＭＶ−ＩＸをＥｃｏＲ ＩおよびＸｈｏ Ｉで同時に消化し、ｐＩＸ遺伝子を含む４７０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。市販のＧＳＴ融合タンパク質大腸菌発現プラスミドベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１（アマシャム ファルマシア バイオテク社）には、ＧＳＴのＣ末側にマルチクローニングサイトが存在する。そこで、ｐＣＭＶ−ＩＸより得た４７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲ Ｉ部位とＸｈｏ Ｉ部位との間に挿入し、ＧＳＴ−ｐＩＸ発現プラスミドｐＧＳＴ−ＩＸ（５．４ｋｂ）を得た。
▲２▼ｐＩＸ融合タンパク質の調製
大腸菌ＪＭ １０９株をプラスミドｐＧＳＴ−ＩＸで形質転換した。形質転換体で発現したＧＳＴ−ｐＩＸは不溶性であったので、封入体タンパク質の精製法に準じてＧＳＴ−ｐＩＸを精製した。まず、形質転換した大腸菌を４０ｍｌのＬＢ培地で３７℃で一晩培養後、ＬＢ培地８００ｍｌを添加してさらに１時間培養し、次いでＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加（終濃度０．２ｍＭ）して６時間培養後、菌体を回収した。菌体をＰＢＳで洗浄後、リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を含むリシスバッファー（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭ ＮａＣｌ）２０ｍｌに縣濁し、室温で２０分インキュベーションし、１０％デオキシコール酸ナトリウムを含むリシスバッファー１ｍｌを添加し、溶菌した。次いで、１Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液１００μｌ、１Ｍ ＭｎＣｌ_２溶液１００μｌ及びＤＮａｓｅＩ（７０Ｕ／μｌ）溶液２０μｌを添加し、３７℃で１５分インキュベーション後、１５分間遠心（１１，８５０ｘｇ）した。遠心後、上澄を捨て、沈殿を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むリシスバッファー２０ｍｌで２回洗浄後、沈殿をＰＢＳ１ｍｌに縣濁した。この溶液に同量の６Ｍ尿素を添加し、室温で１時間インキュベーション後、１５分間遠心（１１，８５０ｘｇ）した。遠心後、上澄を捨て、沈殿をＰＢＳ２ｍｌに縣濁した。この溶液に、８Ｍグアニジン塩酸を６ｍｌ（終濃度６Ｍ）添加し、１５分間遠心（１１，８５０ｘｇ）後、その上澄を回収した。この上澄を精製ＧＳＴ−ｐＩＸとして、抗ｐＩＸ抗体の作製に用いた。
（３）抗ｐＩＸ抗体の作製
精製したＧＳＴ−ｐＩＸは、６Ｍグアニジン塩酸を含んだまま、ウサギ（日本白色種）に免疫した。
免疫、採血等は全て旭テクノグラス社に依頼した。０．２〜０．４ｍｇの抗原（ＧＳＴ−ｐＩＸ）を２羽のウサギに２週間おきに５回免疫した。４回目の免疫の１週間後に部分採血し、ＧＳＴ−ｐＩＸに対する抗体価が十分上がったことをＥＬＩＳＡ法にて確認した後、５回目の免疫の１週間後に全採血し、抗血清（＃１および＃２）を得た。
次に、これらの抗血清がｐＩＸと反応することをウェスタンブロットにより確認した。ｐＩＸを含む陽性対照として、次の二つのサンプルを用いた。一つは、Ｅ３遺伝子のみを欠失したアデノウイルス５型野生株由来ウイルス（Ａｄ５−ｄｌＸ：Ｓａｉｔｏ Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５４，７１１−７１９．（１９８５））をｍｏｉ １０でＡ５４９細胞に感染させ、約１日後に回収した細胞で、もう一つは精製したアデノウイルス粒子である。陰性対照としては、アデノウイルスを感染させていないＡ５４９細胞を用いた。
各サンプルを還元条件下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ、アマシャム ファルマシア バイオテク社）にブロッティングした。メンブレンを５％スキムミルクでブロッキングした後、１０００倍希釈した抗血清もしくは免疫前血清を添加し、４℃で一晩インキュベーションした。メンブレンを洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇ抗体Ｆ（ａｂ’）_２画分（アマシャム ファルマシア バイオテク社、Ｃａｔ．ＮＡ９３４０）を添加し、室温で１時間インキュベーションした。さらに、メンブレンを洗浄後、化学発光検出試薬（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ検出試薬、アマシャム ファルマシア バイオテク社）を添加し、Ｘ線フィルムに露光した。
２種類の抗血清のうち、例として抗血清＃１を用いた場合のウェスタンブロットの結果を図８に示す。免疫後の抗血清を用いた場合、Ａｄ５−ｄｌＸ感染細胞および精製ウイルス粒子をアプライしたレーンでは、ｐＩＸの分子量に一致する約１４ｋＤａのバンドが明らかに検出されたが、ウイルスを感染させていないＡ５４９細胞をアプライしたレーンでは、このバンドは検出されなかった。また、免疫前血清を用いた場合は、この１４ｋＤａのバンドはいずれのレーンにおいても全く検出されなかった。データは示さないが、＃２の抗血清も同様の結果であった。以上の結果より、これら抗血清で検出された１４ｋＤａのバンドはｐＩＸ由来であることが確認できた。そこで、これらの抗血清を抗ｐＩＸ抗体として、以後の実験に用いた。
（４）ＣＡＧプロモーターにより発現が誘導されたｐＩＸの検出
実施例６〜８で、ＣＡＧプロモーターによりｐＩＸ ＲＮＡの発現が誘導されることをノザンブロットにより示したが、ＲＮＡレベルだけでなくタンパク質レベルでもｐＩＸの発現が誘導されているかどうかをウェスタンブロットにより検討した。
ＣＡＧプロモーターのみが挿入されたアデノウイルスベクターＡｘＣＡｗｔ（実施例５参照）または外来プロモーターが挿入されていないアデノウイルスベクターＡｘ１ｗ１（実施例５参照）をＡ５４９細胞にｍｏｉ １００で感染させ、約１日後に細胞を回収した。陽性対照として、Ａｄ５−ｄｌＸをｍｏｉ １０で感染させ、約１日後に回収したＡ５４９細胞を用いた。前述した（３）と同様の方法でウェスタンブロットを行い、抗ｐＩＸ抗体（＃１）でｐＩＸを検出した。図９に示したように、ＡｘＣＡｗｔ感染細胞ではＡｄ５−ｄ１Ｘ感染細胞と同様、１４ｋＤａのｐＩＸが検出された。一方、Ａｘ１ｗ１感染細胞ではこの１４ｋＤａのバンドは全く認められなかった。このことから、ｐＩＸは、タンパク質レベルでもＣＡＧプロモーターにより発現が誘導されることが確認できた。
実施例１１
ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクターの作製
ｐＩＸ遺伝子を再配置したアデノウイルスベクターは、以下の（１）〜（３）の手順により作製した。
（１）Ｅ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間にｐＩＸ遺伝子を挿入した組換えアデノウイルスベクター（Ａｘ４ｐＩＸ）の作製
ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）のｐＩＸ遺伝子の全長を含む領域をＰＣＲ法によりクローニングするため、以下の操作を行った。Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子以外のアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むコスミドベクターｐＡｘｃｗ（前出）をテンプレートとして、以下の配列のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。各プライマーには、制限酵素認識部位を付加した。

ＰＣＲにより増幅したｐＩＸ遺伝子を含む約０．６ｋｂのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで同時に消化し、市販プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入し、プラスミドｐＵＣｆｐＩＸ（３．３ｋｂ）を得た。このｐＵＣｆｐＩＸのｐＩＸ遺伝子を含むインサート部分の塩基配列を解読し、その配列が既存の配列（ジーンバンク：アクセス番号Ｍ７３２６０）と相違ないことを確認した。
次に、ｐＩＸ遺伝子をＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間に挿入したコスミドベクターを作製するため、以下の操作を行った。コスミドベクターｐＡｘ４ｗは、アデノウイルス５型ゲノムの２．６−９８．０ｍ．ｕ（Ｅ３遺伝子は欠失）とアデノウイルス２型ゲノムの９８．０−１００ｍ．ｕ．を含み、かつＥ４遺伝子のプロモーターの上流域と３’側ＩＴＲとの間（９９．３ｍ．ｕ．）にクローニング部位である制限酵素ＳｗａＩ部位を有するベクターである（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６）、当該文献中ではｐＡｘ４ｗはｐＡｄｅｘ４ｗと記載）。プラスミドｐＵＣｆｐＩＸをＲｓａＩ消化し、ｐＩＸ遺伝子を含む約０．６ｋｐのＤＮＡ断片を得た。この０．６ｋｂのＤＮＡ断片をコスミドベクターｐＡｘ４ｗのＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドｐＡｘ４ｐＩＸＬ及びｐＡｘ４ｐＩＸＲを得た。ｐＡｘ４ｐＩＸＬはｐＩＸ遺伝子が左向きに、ｐＡｘ４ｐＩＸＲはｐＩＸ遺伝子が右向きに挿入されたベクターである。
最後に、ＣＯＳ／ＴＰＣ法により、Ｅ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間にｐＩＸ遺伝子が挿入された組換えアデノウイルスを作製するため、以下の操作を行った。組換えアデノウイルスベクターＡｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬ（Ｍｉｙａｋｅ Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ，９３，１３２０−１３２４．（１９９６）および図１０参照）は、アデノウイルス５型由来で（Ｅ１ＡおよびＥ３遺伝子を欠失）、かつｐＡｘ４ｗと同じ９９．３ｍ．ｕ．の位置に大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の発現単位が左向きに挿入された非増殖型アデノウイルスベクターである。Ａｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬからアデノウイルスＤＮＡ−末端タンパク質複合体（ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製し、次いでこのＤＮＡ−ＴＰＣを制限酵素ＡｓｅＩおよびＥｃｏＲＩで同時に消化した。Ａｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬのゲノムＤＮＡには、ｌａｃＺ遺伝子の発現単位を含むゲノム右半分に、ＡｓｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位が複数箇所存在するので、Ａｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬのＤＮＡ−ＴＰＣを両制限酵素で消化することにより、ゲノム右半分が消化されたＤＮＡ−ＴＰＣが得られる。この制限酵素消化ＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドｐＡｘ４ｐＩＸＬまたはｐＡｘ４ｐＩＸＲとで２９３細胞を形質転換した。出現した組換えアデノウイルスのゲノムＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＥＩ消化ならびにＰｍｌＩ消化することにより、目的ウイルスクローンを同定し、Ａｄｅｘ４ＳＲＬａｃＺＬの大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の発現単位がｐＩＸ遺伝子に置換された組換えアデノウイルスＡｘ４ｐＩＸＬまたはＡｘ４ｐＩＸＲ（図１０）を得た。Ａｘ４ｐＩＸＬおよびＡｘ４ｐＩＸＲは、ｐＩＸ遺伝子の本来の位置（９．７−１１．２ｍ．ｕ．）およびＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間の二ヶ所に、ｐＩＸ遺伝子を有する組換えアデノウイルスである。Ａｘ４ｐＩＸＬとＡｘ４ｐＩＸＲの構造の違いは、Ｅ４遺伝子とＩＴＲとの間のｐＩＸ遺伝子の挿入方向のみであり、Ａｘ４ｐＩＸＬはｐＩＸ遺伝子が左向きに、Ａｘ４ｐＩＸＲはｐＩＸ遺伝子が右向きに挿入された組換えアデノウイルスである。
（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ｐＩＸ遺伝子を欠失したアデノウイルスゲノムを有するコスミドベクター（ｐＡｘΔｐＩＸｃｗ）の作製
ｐＩＸ遺伝子を含むアデノウイルス５型ゲノムの左端１７％を含むプラスミドを調製するため、以下の操作を行った。前出のコスミドベクターｐＡｘｃｗ（図１１）は、Ｅ１遺伝子（Δ４５４−３３２８）およびＥ３遺伝子（Δ２８５９２−３０４７０）以外のアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むベクターである。ｐＡｘｃｗをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、次いでＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑化した後に自己ライゲーションさせ、プラスミドｐＡｘ１７ｃｗ（６．５ｋｂ：図１１）を得た。ｐＡｘ１７ｃｗは、Ｅ１遺伝子を除くアデノウイルス５型の左端約１７％（１−４５３、３３２９−６２４１）を含むプラスミドである。
ｐＡｘ１７ｃｗからｐＩＸ遺伝子を欠失させたプラスミドを作製するため、以下の（ａ）〜（ｃ）の３種のＤＮＡ断片を調製した。
（ａ）ｐＡｘ１７ｃｗをＳｗａＩおよびＸｈｏＩ消化した、ｐＩＸ遺伝子を含まない約４．０ｋｂのＤＮＡ断片。
（ｂ）ｐＡｘ１７ｃｗをＡ１ｗＮＩおよびＸｈｏＩ消化した、アデノウイルス５型ゲノムの４０５４−５７８８番目に相当する約１．７ｋｂのＤＮＡ断片。
（ｃ）ＳｗａＩ消化断片−ＣｌａＩ認識部位−ＳａｌＩ認識部位−ＮｒｕＩ認識部位−Ａ１ｗＮＩ消化断片の配列を有するように設計した、以下に示す配列の合成ＤＮＡを、その５’末端をリン酸化後、アニーリングした二本鎖ＤＮＡ断片。

上記（ａ）（ｂ）（ｃ）の３断片をライゲーションし、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびｐＩＸ遺伝子を欠失した（Δ４５４−４０５３）プラスミドｐＡｘ１７ΔｐＩＸｃｗ（５．８ｋｂ：図１１）を得た。
次いで、コスミドベクターｐＡｘｃｗのＢａｍＨＩ部位からＢｓｔＺ１７Ｉ部位間の塩基配列を、プラスミドｐＡｘ１７ΔｐＩＸｃｗのＢａｍＨＩ部位からＢｓｔＺ１７Ｉ部位間の塩基配列と入れ換えたコスミドベクターを作製するため、以下の（ｄ）〜（ｆ）の３種のＤＮＡ断片を調製した。
（ｄ）ｐＡｘ１７ΔｐＩＸｃｗをＢａｍＨＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ消化した、ＳｗａＩ認識部位を含む約２．２ｋｂのＤＮＡ断片。
（ｅ）ｐＡｘｃｗをＢａｍＨＩおよびＣｓｐ４５Ｉ消化した、アデノウイルスゲノムＤＮＡを含まない約１０ｋｂのＤＮＡ断片。
（ｆ）ｐＡｘｃｗをＣｓｐ４５ＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ消化した、アデノウイルスゲノムＤＮＡを含む約３０ｋｂのＤＮＡ断片。
上記（ｄ）（ｅ）（ｆ）の３断片をライゲーションし、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ｐＩＸ遺伝子を欠失したアデノウイルスゲノムを有するコスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗ（４１．８ｋｂ：図１１）を得た。
最後に、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ｐＩＸ遺伝子欠失部位に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現単位を挿入したコスミドベクターを作製するため、以下の操作を行った。
ＣＡＧプロモーター下流にｈＧＨ ｃＤＮＡを連結したｈＧＨ発現単位を有するコスミドｐＡｘ１ＣＡＨＧＨ（実施例１）を制限酵素ＰｍｅＩで消化し、ｈＧＨ発現単位を含む約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗのＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨ（４４．８ｋｂ：図１１）を得た。
（３）ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクターの作製
（１）に示した組換えアデノウイルスＡｘ４ｐＩＸＬまたはＡｘ４ｐＩＸＲと、（２）で示したコスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨとの相同組換えにより、ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクターを作製するため、以下の操作を行った。Ａｘ４ｐＩＸＬおよびＡｘ４ｐＩＸＲからアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、次いで各々のＤＮＡ−ＴＰＣを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化した。Ａｘ４ｐＩＸＬならびにＡｘ４ｐＩＸＲのゲノムＤＮＡの左半分にはＥｃｏＴ２２Ｉ部位が複数箇所存在するので、ＥｃｏＴ２２Ｉ消化により、ゲノム左半分が消化されたＤＮＡ−ＴＰＣが得られる。ＥｃｏＴ２２Ｉ消化したＡｘ４ｐＩＸＲのＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨとで２９３細胞を形質転換した。出現した組換えアデノウイルスのゲノムＤＮＡを制限酵素消化（ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩ、ＢｓｐＥＩなど）することにより、目的ウイルスクローンを同定する。その結果、ｐＩＸ遺伝子の本来の位置（９．７−１１．２ｍ．ｕ．）にはｐＩＸ遺伝子が存在せず、ｐＩＸ遺伝子がＥ４遺伝子の上流域と３’側ＩＴＲとの間に再配置された、ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター（ＡｘＲｐＩＸＲＣＡＨＧＨ、図１０）が得られる。同様に、ＥｃｏＴ２２Ｉ消化したＡｘ４ｐＩＸＬのＤＮＡ−ＴＰＣと、コスミドｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨとで２９３細胞を形質転換することにより、ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター（ＡｘＲｐＩＸＬＣＡＨＧＨ、図１０）が得られる。ＡｘＲｐＩＸＲＣＡＨＧＨとＡｘＲｐＩＸＬＣＡＨＧＨとはｐＩＸ遺伝子の挿入方向のみが異なり、ＡｘＲｐＩＸＲＣＡＨＧＨはｐＩＸ遺伝子が右向きに、ＡｘＲｐＩＸＬＣＡＨＧＨはｐＩＸ遺伝子が左向きに挿入された組換えアデノウイルスである。
実施例１２
ｐＩＸ発現細胞株の作製
ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターの産生に用いるため、２９３細胞を形質転換しｐＩＸ発現細胞株を作製した。
実施例１０−（１）で作製したｐＩＸ発現プラスミドｐＣＭＶ−ＩＸを用い、リポフェクション法（ＦｕＧＥＮＥ^ＴＭ６トランスフェクション試薬：ロシュ・ダイアグノスティック社）により、２９３細胞を形質転換した。ｐＣＭＶ−ＩＸにはネオマイシン耐性遺伝子が挿入されているので、形質転換３日後に、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（ジェネティシン：ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を含む培地に交換し、形質転換細胞をさらに１３日間培養後、細胞をクローニングした。Ｇ４１８耐性細胞株のうち任意の１０クローンについて、ｐＩＸ遺伝子が発現しているかどうかをノザンブロットにより検討した。その結果、４クローン（＃２、＃５、＃６、＃１０）でｐＩＸ遺伝子が発現していることを確認した。そこで、これらの４クローンのｐＩＸ遺伝子の発現の安定性を検討するため、これら４クローンを３０継代まで継代し、その間５継代ごとにＲＮＡを調製し、ノザンブロットによりｐＩＸ遺伝子の発現を確認した（図１２）。その結果、クローンによりｐＩＸ遺伝子の発現量に差があるものの、４クローンとも少なくとも３０継代まではｐＩＸ遺伝子を安定に発現することが確認された。
さらに、２５継代目の細胞を用いて、実施例１０−（３）に示したウェスタンブロット法により、ｐＩＸの発現をタンパク質レベルでも確認した（図１３）。この実験および図１２の実験では、陽性対照として外来プロモーターが挿入されていないアデノウイルスベクターＡｘ１ｗ１を感染させた２９３細胞を用いた。Ａ５４９細胞などアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現していない細胞にＡｘ１ｗ１を感染させても、ｐＩＸはＲＮＡレベル（図４、図６）、タンパク質レベル（図９）ともほとんど発現しない。しかし、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現している２９３細胞にＡｘ１ｗ１を感染させた場合は、Ｅ１遺伝子を欠失した第一世代アデノウイルスベクターの通常の増殖サイクルに当てはまり、十分量のｐＩＸを発現する。図１３に示した結果より、Ａｘ１ｗ１感染２９３細胞のｐＩＸの発現量より、やや少ないものの、４クローンともタンパク質レベルでもｐＩＸを発現していることが確認できた。
以上の結果は、ｐＩＸを恒常的にかつ安定に発現するｐＩＸ発現細胞株が４クローン（＃２、＃５、＃６、＃１０）得られたことを明らかに示すものである。実施例１３
ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターの作製
実施例５で用いたアデノウイルスベクターＡｘＣＡｗｔと、実施例１０−（２）に示したｐＩＸ遺伝子欠失コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨとの相同組換えにより、ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを作製するため、以下の操作を行った。
ＡｘＣＡｗｔからアデノウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、次いでＥｃｏＴ２２Ｉ消化した。このＤＮＡ−ＴＰＣとコスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨとで、２９３細胞もしくは実施例１２に示したｐＩＸ発現細胞株を形質転換する。出現した組換えアデノウイルスのゲノムＤＮＡを制限酵素消化（ＣｌａＩ、ＮｒｕＩ、ＳａｌＩなど）することにより、目的ウイルスクローンを同定し、ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨ（図１０）を得る。ＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、ｐＩＸ遺伝子を欠失し（Δ４５４−４０５３）、かつＥ３遺伝子も欠失した（Δ２８５９２−３０４７０）、アデノウイルス５型由来の組換えアデノウイルスである。
ｐＩＸ発現細胞株を形質転換してｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを得た場合は、ウイルスの継代及び大量調製には引き続きｐＩＸ発現細胞株を用いる。一方、２９３細胞を形質転換してｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを得た場合、ｐＩＸ発現細胞株を用いてウイルスの大量調製を行う。
次いで、ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターを精製してウイルス粒子を調製し、抗ｐＩＸ抗体を用いたウェスタンブロッティング法により、ウイルス粒子には正常量のｐＩＸタンパク質が含まれていることを確認する。
実施例１４
ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター及びｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクター投与による炎症の有無の検討
ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター及びｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターは、炎症が軽減されていることを確認するため、実施例３及び５と同様に、血中ＧＰＴ値を炎症の指標としたｉｎ ｖｉｖｏ実験を行う。試験するアデノウイルスベクターを以下に示す。
・ｈＧＨ発現ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター：ＡｘＲｐＩＸＲＣＡＨＧＨ、ＡｘＲｐＩＸＬＣＡＨＧＨ（実施例１１）
・ｈＧＨ発現ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクター：ＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨ（実施例１３）
・ｈＧＨ発現第一世代アデノウイルスベクター：Ａｘ１ＣＡＨＧＨ（実施例５）・外来遺伝子が挿入されていない第一世代アデノウイルスベクター：Ａｘ１ｗ１（実施例５）
マウス系統、アデノウイルスベクターの投与量などの実験方法は、実施例３に示した方法で行う。
その結果、Ａｘ１ＣＡＨＧＨ投与マウスでは、実施例３及び５の場合と同様に、血清ＧＰＴ値は有意に上昇する。しかし、ＡｘＲｐＩＸＲＣＡＨＧＨ、ＡｘＲｐＩＸＬＣＡＨＧＨ及びＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨ投与マウスでは、Ａｘ１ｗ１投与マウスと同様、血清ＧＰＴ値は全く上昇しない。以上の結果より、ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター及びｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与しても炎症が殆ど起こらないことが示される。
産業上の利用の可能性
本発明により、ウイルスタンパク質の発現が抑制され、炎症が軽減した安全性の高い遺伝子治療用のアデノウイルスベクターを提供することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は実験に用いたアデノウイルスベクターの構造を示す模式図である。図中、ＣＡＧはＣＡＧプロモーターを、ｐＡはポリＡ配列を示し、その上の矢印は転写の方向を示す。また、Ａｄ５ ｇｅｎｏｍｅはヒトアデノウイルス５型ゲノムを、ｌａｃＺは大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を、ＣｒｅはリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を、ｈＧＨはヒト成長ホルモンｃＤＮＡを示す。
図２は、アデノウイルスベクターＡｘ１ＣＡＨＧＨまたはΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨを尾静脈投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清ＧＰＴ値の経日変化の平均値を示すグラフである（一群５匹）。図中、●は１ｘ１０^９ＰＦＵ、○は３ｘ１０^８ＰＦＵ、▲は１ｘ１０^８ＰＦＵのアデノウイルスベクターを投与した群を示す。
なお、実験は一群５匹で行ったが、Ａｘ１ＣＡＨＧＨの１ｘ１０^９ＰＦＵ投与群ならびにΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨの３ｘ１０^８ＰＦＵ投与群において、それぞれ各１匹のマウスの血中ｈＧＨ濃度が他の４匹より明らかに低かった（１０分の１以下、データ省略）ので、これら両群においては、平均値の計算時にそれぞれのマウスの値を除き、一群４匹でのＧＰＴ値の平均値を示した。
図３は、種々の構造のアデノウイルスベクターまたはＵＶ不活化アデノウイルス粒子を尾静脈投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清ＧＰＴ値の経日変化の平均値を示すグラフである（一群５匹）。図中、●は１ｘ１０^９ＰＦＵ、○は３ｘ１０^８ＰＦＵ、▲は１ｘ１０^８ＰＦＵ、△は３ｘ１０^７ＰＦＵのベクターを投与した群を示す。また、Ｓａｌｉｎｅは生理食塩水投与群、ＵＶ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄはＵＶ不活化アデノウイルス粒子を投与した群を示す。
図４はノザンブロットの結果を示す写真である。Ａ５４９細胞またはＨｅｐＧ２細胞に、以下に示した各アデノウイルスベクターをｍｏｉ １００で感染させ、２４時間後に細胞からＲＮＡを調製した。各々のＲＮＡ５μｇを電気泳動後、ノザンブロットを行い、（Ａ）Ｌ３ ＲＮＡ、（Ｂ）ＩＶａ２ ＲＮＡ、（Ｃ）ｐＩＸ ＲＮＡを検出した。ゲル上の略号は、Ｍｏｃｋ：モック感染、１ｗ１：Ａｘ１ｗ１、ＣＡｗｔ：ＡｘＣＡｗｔ、ＨＧＨ：Ａｘ１ＣＡＨＧＨ、ΔＥ２Ａ：ΔＥ２Ａ−ＣＡＨＧＨを示す。ゲル右側の矢印と数字は、目的のバンドの位置とそのサイズを示す。
また、Ａｄ５と記した右側３レーンは陽性対照である。Ｅ３遺伝子のみを欠失したアデノウイルス５型野生株由来ウイルス（Ａｄ５−ｄｌＸ：Ｓａｉｔｏ Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５４，７１１−７１９．（１９８５））を、ｍｏｉ １０でＨｅｐＧ２細胞に感染させ、２４時間後にＲＮＡを調製し、図中に示した量のＲＮＡを電気泳動に供した。
図５はタンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）遺伝子のノザンブロットの結果を示す写真である。ＡｘＣＡｗｔもしくはＡｄＣＭＶｌａｃＺを図中に示したｍｏｉでＡ５４９細胞に感染させ、２４時間後に細胞からＲＮＡを調製した。各々のＲＮＡ５μｇを電気泳動後、ノザンブロットを行い、ｐＩＸ ＲＮＡを検出した。図中の略号は、Ｍｏｃｋ：モック感染、ＣＡＧ：ＡｘＣＡｗｔ、ＣＭＶ：ＡｄＣＭＶｌａｃＺを示す。
また、Ａｄ５と記した右側３レーンは陽性対照で、Ａｄ５−ｄｌＸ（図４参照）をｍｏｉ １０でＡ５４９細胞に感染させ、２４時間後にＲＮＡを調製し、図中に示した量のＲＮＡを電気泳動に供した。
図６は、ｐＩＸ遺伝子のノザンブロットの結果を示す写真である。図中に示した各アデノウイルスベクターをｍｏｉ ３０またはｍｏｉ １００でＡ５４９細胞に感染させ、２４時間後にＲＮＡを回収した。各々のＲＮＡ５μｇを用いてノザンブロットを行い、ｐＩＸ ＲＮＡを検出した。
図７は、異なるプロモーターを有するアデノウイルスベクターを尾静脈投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清ＧＰＴ値の経日変化の平均値を示す（一群５匹）。図中、●は１ｘ１０^９ＰＦＵ、○は３ｘ１０^８ＰＦＵ、▲は１ｘ１０^８ＰＦＵのベクターを投与した群を示す。
図８は、ｐＩＸ融合タンパク質（ＧＳＴ−ｐＩＸ）に対する抗血清を用いたウェスタンブロットの結果を示す写真である。Ａｄ５−ｄｌＸ（図４参照）をｍｏｉ １０でＡ５４９細胞に感染させ、約１日後に細胞を回収し、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。この細胞溶解液、または精製ウイルス粒子（７．５×１０^７ＰＦＵ）を還元条件下、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、ウェスタンブロットを行い、抗ｐＩＸ血清＃１（Ａｎｔｉ−ｐＩＸ）または免疫前血清（Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）でｐＩＸを検出した。図中の略号は、Ｍｏｃｋ：非感染細胞、Ａｄ５：Ａｄ５−ｄｌＸ感染細胞、Ｖｉｒｉｏｎ：精製ウイルス粒子を示す。また、図右側の数字は、分子量マーカーの分子量を示す。なお、分子量マーカーとしては、着色分子量マーカー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７４８−０１０）を用いたが、その分子量は非着色分子量マーカー（ニューイングランドバイオラブズ社、型番Ｐ７７０２Ｓ）の移動度から補正した値を用いた。また、括弧付きの数値は、非着色分子量マーカーで補正していない値を用いた。
図９は、ｐＩＸのウェスタンブロットの結果を示す写真である。Ａ５４９細胞に、ＡｘＣＡｗｔ（ｍｏｉ １００）、Ａｗ１ｗ１（ｍｏｉ １００）またはＡｄ５−ｄｌＸ（ｍｏｉ １０）を感染させ、約１日後に細胞を回収し、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロットを行いｐＩＸを検出した。図中の略号は、Ａｄ５：Ａｄ５−ｄｌＸ感染細胞、ＣＡｗｔ：ＡｘＣＡｗｔ感染細胞、１ｗ１：Ａｗ１ｗ１感染細胞、Ｍｏｃｋ：非感染細胞を示す。図右側の数字は分子量を示す（図８参照）。
図１０は、ｐＩＸ再配置型アデノウイルスベクター、ｐＩＸ欠失型アデノウイルスベクターなどの構造を示す模式図である。図中、ｌａｃＺは大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の発現単位を、ｐＩＸはタンパク質ＩＸ遺伝子を、ｐｓｉはパッケージングシグナルを、ＣＡＧはＣＡＧプロモーターを、ｈＧＨはヒト成長ホルモンｃＤＮＡを、ｐＡはポリＡ配列を示す。矢印は、各々の遺伝子の転写方向を示す。
図１１は、コスミドベクターｐＡｘΔｐＩＸｃｗおよびｐＡｘΔｐＩＸＣＡＨＧＨの構築方法を示す模式図である。図中、白抜きの箱はヒトアデノウイルス５型ゲノムを、細線部は大腸菌由来ＤＮＡ配列を示す。制限酵素名上の数字は、ヒトアデノウイルス５型における各々の制限酵素認識部位の塩基番号を示す。また、Ａｐ^Ｒはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは大腸菌複製オリジンを、ＣＯＳはλファージのＣＯＳサイトを示す。
図１２は、ｐＩＸ発現細胞株のｐＩＸ遺伝子のノザンブロットの結果を示す写真である。ｐＩＸ発現細胞株４クローン（＃２、＃５、＃６、＃１０）を３０継代まで継代し、５継代ごとに細胞株からＲＮＡを調製しノザンブロットを行った。図中、Ｐ１、Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５、Ｐ２０、Ｐ２５、Ｐ３０は継代数を示す。また、左側３レーンは、陰性および陽性対照である。Ｍｏｃｋはウイルス非感染２９３細胞から調製したＲＮＡ、８ｈｒおよび２４ｈｒは、２９３細胞にＡｘ１ｗ１をｍｏｉ １０で感染させ、８時間後（８ｈｒ）および２４時間後（２４ｈｒ）に調製したＲＮＡを示す。
図１３は、ｐＩＸ発現細胞株のｐＩＸのウェスタンブロットの結果を示す写真である。ｐＩＸ発現細胞株４クローン（＃２、＃５、＃６、＃１０）を２５継代後、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロットを行いｐＩＸを検出した。右側３レーンは、陰性および陽性対照である。詳細は図１２参照。なお、分子量マーカーとしては、非着色分子量マーカー（ニューイングランドバイオラブズ社、型番Ｐ７７０２Ｓ）を用いた。

Claims (17)

1. ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症を軽減してもしくは誘導することなく、外来遺伝子を導入するための医薬組成物もしくは遺伝子導入剤であって、以下（１）から（３）の特徴または（４）から（８）の特徴を有する組換えアデノウィルスベクターを有効成分として含有する医薬組成物もしくは遺伝子導入剤：
   （１）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
   （２）アデノウィルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子を本来の位置に保持している；および
   （３）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位に、ＥＦ−１αプロモーターを含む外来遺伝子が左向きに挿入されている、
   または
   （４）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
   （５）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位に、外来プロモーターを含む外来遺伝子が左向きに挿入されている；
   （６）アデノウィルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子がＥ４遺伝子上流領域と３’ＩＴＲとの間に再配置されている；
   （７）アデノウイルス野性株と同等のタンパク質ＩＸを含有し、正常なウイルス粒子を形成している；および
   （８）アデノウィルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３を保持する。
2. （１）から（３）の特徴を有する組換えアデノウィルスベクターが、外来プロモーターがＣＭＶエンハンサーを含まないことを更に特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物もしくは遺伝子導入剤。
3. 請求項１または２に記載の組換えアデノウイルスベクターを非ヒト哺乳動物に投与することからなる、外来遺伝子の導入の際のｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症を軽減するもしくは誘導しない方法。
4. 請求項１または２に記載の組換えアデノウイルスベクターを非ヒト哺乳動物に投与することからなる、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時の炎症が軽減されもしくは誘導されない遺伝子導入方法。
5. ｉｎ ｖｉｖｏ投与時に炎症を軽減してもしくは誘導することなく、外来遺伝子を導入するための医薬組成物もしくは遺伝子導入剤を製造するための請求項１または２に記載の組換えアデノウイルスベクターの使用。
6. 以下（４）から（８）の特徴を有する組換えアデノウィルスベクター：
   （４）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子が欠失している；
   （５）アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子欠失部位に、外来プロモーターを含む外来遺伝子が左向きに挿入されている；
   （６）アデノウィルスゲノムのタンパク質ＩＸ遺伝子がＥ４遺伝子上流領域と３’ＩＴＲとの間に再配置されている；
   （７）アデノウイルス野性株と同等のタンパク質ＩＸを含有し、正常なウイルス粒子を形成している；および
   （８）アデノウィルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３を保持する。
7. アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子ならびにタンパク質ＩＸ遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部または一部が欠失した、請求項６に記載の組換えアデノウイルスベクター。
8. アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子の全部または一部が欠失した、請求項７に記載の組換えアデノウイルスベクター。
9. アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子の全部または一部が欠失した、請求項７または８に記載の組換えアデノウイルスベクター。
10. 更に、アデノウイルスゲノムのＥ４遺伝子のＯＲＦ３以外の他のＯＲＦの全部または一部が欠失した、請求項９に記載の組換えアデノウイルスベクター。
11. 外来プロモーターが哺乳動物由来及び／又は動物ウイルス由来の成分を含む、請求項６〜１０のいずれか記載の組換えアデノウイルスベクター。
12. 外来プロモーターがＣＭＶエンハンサーを含む、請求項１１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
13. 外来プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１２記載の組換えアデノウイルスベクター。
14. 外来プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項１２記載の組換えアデノウイルスベクター。
15. 外来プロモーターがＲＳＶプロモーター又はＳＲαプロモーターである、請求項１２記載の組換えアデノウイルスベクター。
16. アデノウイルスがヒトアデノウイルスであることを特徴とする、請求項６〜１５いずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
17. アデノウイルスが２型又は５型のアデノウイルスであることを特徴とする、請求項１６記載の組換えアデノウイルスベクター。

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