JPH08308585A - 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法 - Google Patents
組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法Info
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- JPH08308585A JPH08308585A JP7276335A JP27633595A JPH08308585A JP H08308585 A JPH08308585 A JP H08308585A JP 7276335 A JP7276335 A JP 7276335A JP 27633595 A JP27633595 A JP 27633595A JP H08308585 A JPH08308585 A JP H08308585A
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- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】外来遺伝子および外来遺伝子の発現を制御
するプロモーターを有する、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完全
に欠失した、動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルス、
及びＥ２Ａ遺伝子領域の両側に位置する同方向を向いた
二つのリコンビナーゼ認識配列を有する動物細胞感染用
の組換えＤＮＡウイルス、並びにこれらの動物細胞感染
用の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 【効果】本発明により、広範な動物細胞に外来遺伝子を
安定な形で導入することのできる組換えＤＮＡウイルス
を提供することができる。また、本発明はこの組換えＤ
ＮＡウイルスの簡易な製造方法を提供する。特に、本発
明の組換えアデノウイルスは遺伝病の治療に有用であ
る。
するプロモーターを有する、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完全
に欠失した、動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルス、
及びＥ２Ａ遺伝子領域の両側に位置する同方向を向いた
二つのリコンビナーゼ認識配列を有する動物細胞感染用
の組換えＤＮＡウイルス、並びにこれらの動物細胞感染
用の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 【効果】本発明により、広範な動物細胞に外来遺伝子を
安定な形で導入することのできる組換えＤＮＡウイルス
を提供することができる。また、本発明はこの組換えＤ
ＮＡウイルスの簡易な製造方法を提供する。特に、本発
明の組換えアデノウイルスは遺伝病の治療に有用であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は動物細胞感染用の組
換えＤＮＡウイルスおよびその製造方法に関する。さら
に、該組換えＤＮＡウイルスの製造に用いられる、リコ
ンビナーゼの認識配列をコードするＤＮＡ配列を含む組
換えＤＮＡウイルスベクターに関する。
換えＤＮＡウイルスおよびその製造方法に関する。さら
に、該組換えＤＮＡウイルスの製造に用いられる、リコ
ンビナーゼの認識配列をコードするＤＮＡ配列を含む組
換えＤＮＡウイルスベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】これまで
遺伝子導入のウイルスベクターとしてレトロウイルスが
良く用いられたが、このウイルスは分裂している細胞に
しか導入できないことや宿主細胞の染色体に組み込まれ
てしまうことにより、特に遺伝子治療においてはその安
全性の観点より問題があり、その応用範囲は限られてい
ると考えられている。アデノウイルスベクターは、種々
の動物培養細胞で１００％近い導入効率を示すこと、ま
たレトロウイルスと異なり積極的な染色体組み込みの機
構を持たないこと、さらに、休止期の細胞でも遺伝子導
入出来るという利点もあり、外来遺伝子導入実験のベク
ターとしての応用範囲は極めて広く、近い将来は遺伝子
治療の主要技術の一つとして確立するであろうと考えら
れている。
遺伝子導入のウイルスベクターとしてレトロウイルスが
良く用いられたが、このウイルスは分裂している細胞に
しか導入できないことや宿主細胞の染色体に組み込まれ
てしまうことにより、特に遺伝子治療においてはその安
全性の観点より問題があり、その応用範囲は限られてい
ると考えられている。アデノウイルスベクターは、種々
の動物培養細胞で１００％近い導入効率を示すこと、ま
たレトロウイルスと異なり積極的な染色体組み込みの機
構を持たないこと、さらに、休止期の細胞でも遺伝子導
入出来るという利点もあり、外来遺伝子導入実験のベク
ターとしての応用範囲は極めて広く、近い将来は遺伝子
治療の主要技術の一つとして確立するであろうと考えら
れている。
【０００３】アデノウイルスベクターの利用は遺伝子治
療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝
子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ
直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接
欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo遺伝子治療の
方法として研究が精力的に進められている。既に嚢胞性
繊維症では、米国で５グループが実際に患者への実験治
療を認められており、筋ジストロフィー症、家族性高コ
レステロール血症、また脳腫瘍等に対して活発に研究さ
れるようになった。一方でアデノウイルスベクターは休
止期の細胞へも遺伝子導入が可能であり、分化した細胞
や、特に神経系への遺伝子導入方法として、初代培養や
動物個体への遺伝子導入実験が注目されている。以上よ
り、アデノウイルスベクターは、神経系を含む多くの分
化、未分化細胞への遺伝子治療導入だけでなく、動物個
体への直接注入・投与による遺伝子発現が可能であるこ
とから、特に遺伝子治療への応用が期待されている。
療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝
子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ
直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接
欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo遺伝子治療の
方法として研究が精力的に進められている。既に嚢胞性
繊維症では、米国で５グループが実際に患者への実験治
療を認められており、筋ジストロフィー症、家族性高コ
レステロール血症、また脳腫瘍等に対して活発に研究さ
れるようになった。一方でアデノウイルスベクターは休
止期の細胞へも遺伝子導入が可能であり、分化した細胞
や、特に神経系への遺伝子導入方法として、初代培養や
動物個体への遺伝子導入実験が注目されている。以上よ
り、アデノウイルスベクターは、神経系を含む多くの分
化、未分化細胞への遺伝子治療導入だけでなく、動物個
体への直接注入・投与による遺伝子発現が可能であるこ
とから、特に遺伝子治療への応用が期待されている。
【０００４】しかし、アデノウイルスはレトロウイルス
と異なり、積極的な染色体組み込みの機構を持たないこ
とから、発現が一時的である。その期間は１〜２週間か
ら、長くても２ヶ月程度である。そのため治療効果を継
続させる必要がある場合には、なるべく長期間細胞内で
アデノウイルスが安定に存在し、アデノウイルス中に挿
入された外来遺伝子の発現産物を産生し続けることが望
ましい。そして、最近、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ
遺伝子領域の存在がアデノウイルスの細胞内安定性に悪
影響を及ぼしていることが分かってきた。従って、本発
明の目的は、動物細胞内に導入されたアデノウイルスベ
クターが、細胞内でより安定に存在し、外来遺伝子産物
を産生し続け得る組換えアデノウイルスベクターの系を
構築することにあり、さらに、かかる系を遺伝子治療用
に提供することにある。
と異なり、積極的な染色体組み込みの機構を持たないこ
とから、発現が一時的である。その期間は１〜２週間か
ら、長くても２ヶ月程度である。そのため治療効果を継
続させる必要がある場合には、なるべく長期間細胞内で
アデノウイルスが安定に存在し、アデノウイルス中に挿
入された外来遺伝子の発現産物を産生し続けることが望
ましい。そして、最近、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ
遺伝子領域の存在がアデノウイルスの細胞内安定性に悪
影響を及ぼしていることが分かってきた。従って、本発
明の目的は、動物細胞内に導入されたアデノウイルスベ
クターが、細胞内でより安定に存在し、外来遺伝子産物
を産生し続け得る組換えアデノウイルスベクターの系を
構築することにあり、さらに、かかる系を遺伝子治療用
に提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記の問題を解決するために鋭意検討し、アデノウイル
スＥ２Ａ遺伝子領域とＬ３遺伝子領域の間に外来ヌクレ
オチドを導入し得る領域が存在することを発見した。こ
の領域には常法によりそのまま外来ヌクレオチドを導入
することができるが、一旦適当なリンカーを常法により
導入して必要な制限酵素部位を導入した後外来ヌクレオ
チドを導入してもよい。外来ヌクレオチドとしては、動
物細胞に感染させた後その細胞内で発現することが望ま
れるポリペプチドをコードする外来遺伝子でもよく、ま
たその外来ヌクレオチドがそのまま細胞中に共存する酵
素の基質となるものであってもよい。さらに、本発明者
らは、上記の領域に外来ヌクレオチドとしてリコンビナ
ーゼの認識配列を導入することにより、動物細胞内で発
現しうるリコンビナーゼ遺伝子を挿入した動物細胞感染
用の組換えＤＮＡウイルスベクターと併用すれば動物細
胞内でアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域を欠失
させることができるようなアデノウイルスベクターの系
を動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターとして構築
できることを見い出した。
上記の問題を解決するために鋭意検討し、アデノウイル
スＥ２Ａ遺伝子領域とＬ３遺伝子領域の間に外来ヌクレ
オチドを導入し得る領域が存在することを発見した。こ
の領域には常法によりそのまま外来ヌクレオチドを導入
することができるが、一旦適当なリンカーを常法により
導入して必要な制限酵素部位を導入した後外来ヌクレオ
チドを導入してもよい。外来ヌクレオチドとしては、動
物細胞に感染させた後その細胞内で発現することが望ま
れるポリペプチドをコードする外来遺伝子でもよく、ま
たその外来ヌクレオチドがそのまま細胞中に共存する酵
素の基質となるものであってもよい。さらに、本発明者
らは、上記の領域に外来ヌクレオチドとしてリコンビナ
ーゼの認識配列を導入することにより、動物細胞内で発
現しうるリコンビナーゼ遺伝子を挿入した動物細胞感染
用の組換えＤＮＡウイルスベクターと併用すれば動物細
胞内でアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域を欠失
させることができるようなアデノウイルスベクターの系
を動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターとして構築
できることを見い出した。
【０００６】ここに、リコンビナーゼとは、特異的なＤ
ＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配
列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結
合の全行程を行う。そこで、この酵素を発現する組換え
アデノウイルスベクターと、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に
この認識配列を同じ向きに２コピーを持つ組換えアデノ
ウイルスベクターを作製し、両方を細胞に共感染させる
と、発現したリコンビナーゼにより２つの認識配列間の
再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出さ
れる。従って、こうして得られるＥ２Ａ遺伝子領域を欠
失したアデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ遺伝子領域を
含むアデノウイルスベクターに比して顕著に安定にな
り、遺伝子治療に有利に使用できると期待できる。
ＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配
列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結
合の全行程を行う。そこで、この酵素を発現する組換え
アデノウイルスベクターと、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に
この認識配列を同じ向きに２コピーを持つ組換えアデノ
ウイルスベクターを作製し、両方を細胞に共感染させる
と、発現したリコンビナーゼにより２つの認識配列間の
再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出さ
れる。従って、こうして得られるＥ２Ａ遺伝子領域を欠
失したアデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ遺伝子領域を
含むアデノウイルスベクターに比して顕著に安定にな
り、遺伝子治療に有利に使用できると期待できる。
【０００７】しかし、従来はＥ２Ａ遺伝子領域の右側
（図１参照）すなわちＥ３領域内には外来ＤＮＡ配列を
導入できることが知られていたが、Ｅ２Ａ遺伝子領域の
左側には外来ＤＮＡ配列を挿入できる部位の存在は知ら
れていなかった。今回本発明者らにより、Ｅ２Ａ遺伝子
の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンとの間に外来Ｄ
ＮＡ配列を導入できる部位が存在することが発見され
た。これにより、初めてＥ２Ａ遺伝子の機能を損なわず
またアデノウイルスの増殖の機能を保持したままＥ２Ａ
遺伝子領域を挟んでリコンビナーゼ認識配列を導入でき
ることが明らかにされたのである。本発明は、かかる知
見に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったも
のである。
（図１参照）すなわちＥ３領域内には外来ＤＮＡ配列を
導入できることが知られていたが、Ｅ２Ａ遺伝子領域の
左側には外来ＤＮＡ配列を挿入できる部位の存在は知ら
れていなかった。今回本発明者らにより、Ｅ２Ａ遺伝子
の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンとの間に外来Ｄ
ＮＡ配列を導入できる部位が存在することが発見され
た。これにより、初めてＥ２Ａ遺伝子の機能を損なわず
またアデノウイルスの増殖の機能を保持したままＥ２Ａ
遺伝子領域を挟んでリコンビナーゼ認識配列を導入でき
ることが明らかにされたのである。本発明は、かかる知
見に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったも
のである。
【０００８】即ち、本発明の要旨は、（１） 外来遺伝
子及び外来遺伝子の発現を制御するプロモーターを有す
る、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完全に欠失した動物細胞感染
用の組換えＤＮＡウイルス、（２） ＤＮＡウイルスが
アデノウイルスである前記（１）記載の組換えＤＮＡウ
イルス、（３） Ｅ２Ａ遺伝子領域の一部または全部を
欠失した前記（１）または（２）記載の組換えＤＮＡウ
イルス、（４） 外来遺伝子及び外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターが左向き（本来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺
伝子の転写の向きと逆向きをいう。）に組み込まれてい
ることを特徴とする前記（１）ないし（３）いずれか記
載の組換えＤＮＡウイルス、（５） アデノウイルスゲ
ノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含む１．３〜９．３％断片を
欠失していることを特徴とする前記（２）ないし（４）
いずれか記載の組換えＤＮＡウイルス、（６） Ｅ１Ａ
遺伝子領域の欠失部位に外来遺伝子および外来遺伝子の
発現を制御するプロモーターが挿入されていることを特
徴とする前記（５）記載の組換えＤＮＡウイルス、
（７） アデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺伝子領域
を含む７９．６〜８４．８％断片を欠失していることを
特徴とする前記（６）記載の組換えＤＮＡウイルス、
（８） 外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが、
サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アク
チンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシング
アクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプ
ロモーター（ＣＡＧプロモーター）であることを特徴と
する前記（１）ないし（７）いずれか記載の組換えＤＮ
Ａウイルス、（９） Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に位置す
る同方向を向いた二つのリコンビナーゼ認識配列を有す
る動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルス、（１０）
ＤＮＡウイルスがアデノウイルスである前記（９）記載
の組換えＤＮＡウイルス、（１１） 二つのリコンビナ
ーゼ認識配列の挿入部位の一方が、Ｅ２Ａ遺伝子の終止
コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間であって、両遺伝
子のポリＡ付加シグナルの機能を欠失しない範囲である
ことを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の組換え
ＤＮＡウイルス、（１２） もう一方のリコンビナーゼ
認識配列の挿入部位が、アデノウイルスゲノムの７９．
６〜８４．４％の範囲であることを特徴とする前記（１
１）記載の組換えＤＮＡウイルス、（１３） リコンビ
ナーゼが大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒ
ｅである前記（９）ないし（１２）いずれか記載の組換
えＤＮＡウイルス、（１４） リコンビナーゼ認識配列
がリコンビナーゼＣｒｅの基質となる下記ｌｏｘＰのＤ
ＮＡ配列（配列番号：１） 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' 3'-TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA-5' である前記（９）ないし（１３）いずれか記載の組換え
ＤＮＡウイルス、（１５） 外来遺伝子を有することを
特徴とする前記（９）ないし（１４）いずれか記載の組
換えＤＮＡウイルス、（１６） 外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターを有することを特徴とする前記（１
５）記載の組換えＤＮＡウイルス、（１７） 外来遺伝
子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが左
向き（本来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子の転写の向きと逆向
きをいう。）に組み込まれていることを特徴とする前記
（１６）記載の組換えＤＮＡウイルス、（１８） アデ
ノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含む１．３〜
９．３％断片を欠失していることを特徴とする前記（１
０）ないし（１７）いずれか記載の組換えＤＮＡウイル
ス、（１９） Ｅ１Ａ遺伝子領域の欠失部位に外来遺伝
子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが挿
入されていることを特徴とする前記（１８）記載の組換
えＤＮＡウイルス、（２０） アデノウイルスゲノムが
さらにＥ３遺伝子領域を含む７９．６〜８４．８％断片
を欠失していることを特徴とする前記（１９）記載の組
換えＤＮＡウイルス、（２１） 外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターが、サイトメガロウイルスエンハン
サー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグ
ロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列
からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）であることを特徴とする前記（１６）ないし（２
０）いずれか記載の組換えＤＮＡウイルス、（２２）
プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列
を組み込んだベクター（ａ）と、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両
側に位置する同方向を向いた２つのリコンビナーゼ認識
配列を有する組換えＤＮＡウイルス（ｂ）とを、動物細
胞株へ導入し、２つのリコンビナーゼ認識配列間に存す
るＥ２Ａ遺伝子領域を切除することからなる、Ｅ２Ａ遺
伝子の機能が完全に欠失した組換えＤＮＡウイルスの製
造方法、（２３） ＤＮＡウイルス（ｂ）がアデノウイ
ルスである前記（２２）記載の組換えＤＮＡウイルスの
製造方法、（２４） さらにベクター（ａ）がアデノウ
イルスである前記（２３）記載の組換えＤＮＡウイルス
の製造方法、（２５） ２つのリコンビナーゼ認識配列
の挿入部位の一方が、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３
遺伝子の終止コドンの間であって、両遺伝子のポリＡ付
加シグナルの機能を欠失しない範囲であることを特徴と
する前記（２２）ないし（２４）いずれか記載の組換え
ＤＮＡウイルスの製造方法、（２６） リコンビナーゼ
が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅであ
る前記（２２）ないし（２５）いずれか記載の組換えＤ
ＮＡウイルスの製造方法、（２７） リコンビナーゼ認
識配列がリコンビナーゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰの
ＤＮＡ配列（配列番号：１）である前記（２２）ないし
（２６）いずれか記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方
法、（２８） ＤＮＡウイルス（ｂ）が外来遺伝子を有
することを特徴とする前記（２２）ないし（２７）いず
れか記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、（２９）
ＤＮＡウイルス（ｂ）がさらに外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターを有することを特徴とする前記（２
８）記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、（３０）
外来遺伝子および外来遺伝子の発現を制御するプロモ
ーターが左向き（本来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子の転写の
向きと逆向きをいう。）に組み込まれていることを特徴
とする前記（２９）記載の組換えＤＮＡウイルスの製造
方法、（３１） ベクター（ａ）およびＤＮＡウイルス
（ｂ）のアデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含
む１．３〜９．３％断片を欠失していることを特徴とす
る前記（２４）ないし（３０）いずれか記載の組換えＤ
ＮＡウイルスの製造方法、（３２） ＤＮＡウイルス
（ｂ）のＥ１Ａ遺伝子領域の欠失している部位に、外来
遺伝子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーター
が挿入されていることを特徴とする前記（３１）記載の
組換えＤＮＡウイルスの製造方法、（３３） ＤＮＡウ
イルス（ｂ）のアデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺伝
子領域を含む７９．６〜８４．８％断片を欠失している
ことを特徴とする前記（３２）記載の組換えＤＮＡウイ
ルスの製造方法、（３４） 外来遺伝子の発現を制御す
るプロモーターが、サイトメガロウイルスエンハンサ
ー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロ
ビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列か
らなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）であることを特徴とする前記（２９）ないし（３
３）いずれか記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、
（３５） ベクター（ａ）およびＤＮＡウイルス（ｂ）
のＥ１Ａ遺伝子の機能が欠失され、動物細胞株がＥ１Ａ
遺伝子を発現している動物細胞株である、前記（２２）
記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、並びに（３
６） Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コ
ドンの間に、外来遺伝子が挿入されたことを特徴とする
動物細胞感染用の組換えアデノウイルス、に関する。
子及び外来遺伝子の発現を制御するプロモーターを有す
る、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完全に欠失した動物細胞感染
用の組換えＤＮＡウイルス、（２） ＤＮＡウイルスが
アデノウイルスである前記（１）記載の組換えＤＮＡウ
イルス、（３） Ｅ２Ａ遺伝子領域の一部または全部を
欠失した前記（１）または（２）記載の組換えＤＮＡウ
イルス、（４） 外来遺伝子及び外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターが左向き（本来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺
伝子の転写の向きと逆向きをいう。）に組み込まれてい
ることを特徴とする前記（１）ないし（３）いずれか記
載の組換えＤＮＡウイルス、（５） アデノウイルスゲ
ノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含む１．３〜９．３％断片を
欠失していることを特徴とする前記（２）ないし（４）
いずれか記載の組換えＤＮＡウイルス、（６） Ｅ１Ａ
遺伝子領域の欠失部位に外来遺伝子および外来遺伝子の
発現を制御するプロモーターが挿入されていることを特
徴とする前記（５）記載の組換えＤＮＡウイルス、
（７） アデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺伝子領域
を含む７９．６〜８４．８％断片を欠失していることを
特徴とする前記（６）記載の組換えＤＮＡウイルス、
（８） 外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが、
サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アク
チンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシング
アクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプ
ロモーター（ＣＡＧプロモーター）であることを特徴と
する前記（１）ないし（７）いずれか記載の組換えＤＮ
Ａウイルス、（９） Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に位置す
る同方向を向いた二つのリコンビナーゼ認識配列を有す
る動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルス、（１０）
ＤＮＡウイルスがアデノウイルスである前記（９）記載
の組換えＤＮＡウイルス、（１１） 二つのリコンビナ
ーゼ認識配列の挿入部位の一方が、Ｅ２Ａ遺伝子の終止
コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間であって、両遺伝
子のポリＡ付加シグナルの機能を欠失しない範囲である
ことを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の組換え
ＤＮＡウイルス、（１２） もう一方のリコンビナーゼ
認識配列の挿入部位が、アデノウイルスゲノムの７９．
６〜８４．４％の範囲であることを特徴とする前記（１
１）記載の組換えＤＮＡウイルス、（１３） リコンビ
ナーゼが大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒ
ｅである前記（９）ないし（１２）いずれか記載の組換
えＤＮＡウイルス、（１４） リコンビナーゼ認識配列
がリコンビナーゼＣｒｅの基質となる下記ｌｏｘＰのＤ
ＮＡ配列（配列番号：１） 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' 3'-TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA-5' である前記（９）ないし（１３）いずれか記載の組換え
ＤＮＡウイルス、（１５） 外来遺伝子を有することを
特徴とする前記（９）ないし（１４）いずれか記載の組
換えＤＮＡウイルス、（１６） 外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターを有することを特徴とする前記（１
５）記載の組換えＤＮＡウイルス、（１７） 外来遺伝
子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが左
向き（本来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子の転写の向きと逆向
きをいう。）に組み込まれていることを特徴とする前記
（１６）記載の組換えＤＮＡウイルス、（１８） アデ
ノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含む１．３〜
９．３％断片を欠失していることを特徴とする前記（１
０）ないし（１７）いずれか記載の組換えＤＮＡウイル
ス、（１９） Ｅ１Ａ遺伝子領域の欠失部位に外来遺伝
子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが挿
入されていることを特徴とする前記（１８）記載の組換
えＤＮＡウイルス、（２０） アデノウイルスゲノムが
さらにＥ３遺伝子領域を含む７９．６〜８４．８％断片
を欠失していることを特徴とする前記（１９）記載の組
換えＤＮＡウイルス、（２１） 外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターが、サイトメガロウイルスエンハン
サー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグ
ロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列
からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）であることを特徴とする前記（１６）ないし（２
０）いずれか記載の組換えＤＮＡウイルス、（２２）
プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列
を組み込んだベクター（ａ）と、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両
側に位置する同方向を向いた２つのリコンビナーゼ認識
配列を有する組換えＤＮＡウイルス（ｂ）とを、動物細
胞株へ導入し、２つのリコンビナーゼ認識配列間に存す
るＥ２Ａ遺伝子領域を切除することからなる、Ｅ２Ａ遺
伝子の機能が完全に欠失した組換えＤＮＡウイルスの製
造方法、（２３） ＤＮＡウイルス（ｂ）がアデノウイ
ルスである前記（２２）記載の組換えＤＮＡウイルスの
製造方法、（２４） さらにベクター（ａ）がアデノウ
イルスである前記（２３）記載の組換えＤＮＡウイルス
の製造方法、（２５） ２つのリコンビナーゼ認識配列
の挿入部位の一方が、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３
遺伝子の終止コドンの間であって、両遺伝子のポリＡ付
加シグナルの機能を欠失しない範囲であることを特徴と
する前記（２２）ないし（２４）いずれか記載の組換え
ＤＮＡウイルスの製造方法、（２６） リコンビナーゼ
が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅであ
る前記（２２）ないし（２５）いずれか記載の組換えＤ
ＮＡウイルスの製造方法、（２７） リコンビナーゼ認
識配列がリコンビナーゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰの
ＤＮＡ配列（配列番号：１）である前記（２２）ないし
（２６）いずれか記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方
法、（２８） ＤＮＡウイルス（ｂ）が外来遺伝子を有
することを特徴とする前記（２２）ないし（２７）いず
れか記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、（２９）
ＤＮＡウイルス（ｂ）がさらに外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターを有することを特徴とする前記（２
８）記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、（３０）
外来遺伝子および外来遺伝子の発現を制御するプロモ
ーターが左向き（本来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子の転写の
向きと逆向きをいう。）に組み込まれていることを特徴
とする前記（２９）記載の組換えＤＮＡウイルスの製造
方法、（３１） ベクター（ａ）およびＤＮＡウイルス
（ｂ）のアデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含
む１．３〜９．３％断片を欠失していることを特徴とす
る前記（２４）ないし（３０）いずれか記載の組換えＤ
ＮＡウイルスの製造方法、（３２） ＤＮＡウイルス
（ｂ）のＥ１Ａ遺伝子領域の欠失している部位に、外来
遺伝子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーター
が挿入されていることを特徴とする前記（３１）記載の
組換えＤＮＡウイルスの製造方法、（３３） ＤＮＡウ
イルス（ｂ）のアデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺伝
子領域を含む７９．６〜８４．８％断片を欠失している
ことを特徴とする前記（３２）記載の組換えＤＮＡウイ
ルスの製造方法、（３４） 外来遺伝子の発現を制御す
るプロモーターが、サイトメガロウイルスエンハンサ
ー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロ
ビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列か
らなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）であることを特徴とする前記（２９）ないし（３
３）いずれか記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、
（３５） ベクター（ａ）およびＤＮＡウイルス（ｂ）
のＥ１Ａ遺伝子の機能が欠失され、動物細胞株がＥ１Ａ
遺伝子を発現している動物細胞株である、前記（２２）
記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法、並びに（３
６） Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コ
ドンの間に、外来遺伝子が挿入されたことを特徴とする
動物細胞感染用の組換えアデノウイルス、に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本発明における動物細胞感染用のＤＮＡウイルス
ベクターは、アデノウイルスのように細胞に感染後染色
体外でしか存在し得ないようなＤＮＡウイルス由来のベ
クターであれば、特に制限されることなく用いることが
できる。例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニア
ウイルスベクター、パポパウイルスベクター等が挙げら
れる。以下、リコンビナーゼ遺伝子又はリコンビナーゼ
認識配列をもつ動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクタ
ーの好適な例として、アデノウイルスベクターを用いて
本発明を説明する。
する。本発明における動物細胞感染用のＤＮＡウイルス
ベクターは、アデノウイルスのように細胞に感染後染色
体外でしか存在し得ないようなＤＮＡウイルス由来のベ
クターであれば、特に制限されることなく用いることが
できる。例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニア
ウイルスベクター、パポパウイルスベクター等が挙げら
れる。以下、リコンビナーゼ遺伝子又はリコンビナーゼ
認識配列をもつ動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクタ
ーの好適な例として、アデノウイルスベクターを用いて
本発明を説明する。
【００１０】本発明に用いられるアデノウイルスは、動
物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とする
ヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウ
イルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡで
あって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆
方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端
にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパ
ク質が共有結合しているという特異な構造をしている。
物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とする
ヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウ
イルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡで
あって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆
方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端
にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパ
ク質が共有結合しているという特異な構造をしている。
【００１１】本発明に用いられるアデノウイルスのゲノ
ムは、Ｅ１遺伝子領域特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失して
いることが好ましい。これは、アデノウイルスの細胞ガ
ン化活性に関与するＥ１Ａ遺伝子領域を欠失させること
により、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み込
んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。必
ずしもＥ１Ａ遺伝子領域の全てを欠失させる必要はない
が、例えば１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的
は達成される。また、本発明に用いられるアデノウイル
スのゲノムは、Ｅ３遺伝子領域を欠失させてもよい。特
に、Ｅ３遺伝子領域の７９．６〜８４．８％を欠失させ
たものが好ましい。アデノウイルスの複製には不要であ
るからである。したがってＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続
的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）
を除き、宿主細胞内で増殖することができないという特
徴を有する。
ムは、Ｅ１遺伝子領域特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失して
いることが好ましい。これは、アデノウイルスの細胞ガ
ン化活性に関与するＥ１Ａ遺伝子領域を欠失させること
により、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み込
んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。必
ずしもＥ１Ａ遺伝子領域の全てを欠失させる必要はない
が、例えば１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的
は達成される。また、本発明に用いられるアデノウイル
スのゲノムは、Ｅ３遺伝子領域を欠失させてもよい。特
に、Ｅ３遺伝子領域の７９．６〜８４．８％を欠失させ
たものが好ましい。アデノウイルスの複製には不要であ
るからである。したがってＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続
的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）
を除き、宿主細胞内で増殖することができないという特
徴を有する。
【００１２】しかしながら、実際にヒトや動物に投与し
た場合、Ｅ１Ａ蛋白と同様の機能を有する蛋白が細胞中
に存在し、これによりわずかにアデノウイルス蛋白が発
現する。これが細胞免疫を引起し、ウイルスＤＮＡを保
持する細胞が攻撃を受け排除されることがわかってい
る。現在使用されているＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠損型アデノウ
イルスベクターによる遺伝子発現が短期間である原因は
ここにある。これを防ぐためには、Ｅ２Ａ遺伝子の機能
を欠失させることが有効であることがＹａｎｇらにより
明らかにされた（Nature Genetics, vol.7, 362-369, 1
993)。これは、温度感受性のＥ２Ａ遺伝子変異株を利用
したものであるが、動物に投与した場合、Ｅ２Ａ遺伝子
の機能発現が抑制されるものの機能発現を完全に止める
ことができない。Ｅ２Ａ遺伝子の機能発現を完全に止め
る手段としてはＥ２Ａ遺伝子領域を欠失させることが考
えられるが、Ｅ２Ａ遺伝子産物はアデノウイルスゲノム
の複製に必須であるため、Ｅ２Ａ遺伝子を欠失したアデ
ノウイルス自身は２９３細胞においても増殖できない。
本発明は、Ｅ２Ａ遺伝子の両端にリコンビナーゼ認識配
列を配置した組換えアデノウイルスとリコンビナーゼ発
現用アデノウイルスを動物培養細胞に共感染させ、細胞
内で発現したリコンビナーゼによりＥ２Ａ遺伝子欠失型
感染性ウイルス粒子を作製するというものである。Ｅ２
Ａ遺伝子産物は少なくともリコンビナーゼ発現用アデノ
ウイルスから十分量補充される。得られるＥ２Ａ遺伝子
欠失型ウイルスはＥ２Ａ遺伝子の発現が皆無であるた
め、目的とする遺伝子の発現期間が大幅に延長すること
は間違いない。
た場合、Ｅ１Ａ蛋白と同様の機能を有する蛋白が細胞中
に存在し、これによりわずかにアデノウイルス蛋白が発
現する。これが細胞免疫を引起し、ウイルスＤＮＡを保
持する細胞が攻撃を受け排除されることがわかってい
る。現在使用されているＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠損型アデノウ
イルスベクターによる遺伝子発現が短期間である原因は
ここにある。これを防ぐためには、Ｅ２Ａ遺伝子の機能
を欠失させることが有効であることがＹａｎｇらにより
明らかにされた（Nature Genetics, vol.7, 362-369, 1
993)。これは、温度感受性のＥ２Ａ遺伝子変異株を利用
したものであるが、動物に投与した場合、Ｅ２Ａ遺伝子
の機能発現が抑制されるものの機能発現を完全に止める
ことができない。Ｅ２Ａ遺伝子の機能発現を完全に止め
る手段としてはＥ２Ａ遺伝子領域を欠失させることが考
えられるが、Ｅ２Ａ遺伝子産物はアデノウイルスゲノム
の複製に必須であるため、Ｅ２Ａ遺伝子を欠失したアデ
ノウイルス自身は２９３細胞においても増殖できない。
本発明は、Ｅ２Ａ遺伝子の両端にリコンビナーゼ認識配
列を配置した組換えアデノウイルスとリコンビナーゼ発
現用アデノウイルスを動物培養細胞に共感染させ、細胞
内で発現したリコンビナーゼによりＥ２Ａ遺伝子欠失型
感染性ウイルス粒子を作製するというものである。Ｅ２
Ａ遺伝子産物は少なくともリコンビナーゼ発現用アデノ
ウイルスから十分量補充される。得られるＥ２Ａ遺伝子
欠失型ウイルスはＥ２Ａ遺伝子の発現が皆無であるた
め、目的とする遺伝子の発現期間が大幅に延長すること
は間違いない。
【００１３】リコンビナーゼの認識配列の挿入位置は、
Ｅ２Ａ遺伝子領域の右側には従来から知られている領域
があるが、Ｅ２Ａ遺伝子領域の左側については、Ｅ２Ａ
遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間であ
って、得られる組換えアデノウイルスの増殖を阻害しな
い部位が選択される。Ｅ２Ａ遺伝子領域やＬ３遺伝子領
域の一部欠失あるいはポリＡ付加シグナル領域が一部欠
失することになると、得られる組換えアデノウイルスの
増殖が阻害されるため好ましくない。
Ｅ２Ａ遺伝子領域の右側には従来から知られている領域
があるが、Ｅ２Ａ遺伝子領域の左側については、Ｅ２Ａ
遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子の終止コドンの間であ
って、得られる組換えアデノウイルスの増殖を阻害しな
い部位が選択される。Ｅ２Ａ遺伝子領域やＬ３遺伝子領
域の一部欠失あるいはポリＡ付加シグナル領域が一部欠
失することになると、得られる組換えアデノウイルスの
増殖が阻害されるため好ましくない。
【００１４】本発明に用いられるプロモーターとして
は、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺
伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ
４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝
子プロモーター等があり、また、後者の例としては、チ
ミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン
遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモータ
ー等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーターが
特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からなる
ハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターとし
て特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。そ
の調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平
３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および
２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，Ｈｉ
ｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発明
に利用することができる。
は、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺
伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ
４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝
子プロモーター等があり、また、後者の例としては、チ
ミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン
遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモータ
ー等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーターが
特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からなる
ハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターとし
て特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。そ
の調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平
３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および
２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，Ｈｉ
ｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発明
に利用することができる。
【００１５】本発明に用いられるリコンビナーゼは、特
異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、
この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全行程を
行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファー
ジＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）があ
る。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abre
mskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoe
ssら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質と
する。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認
識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の
２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコン
ビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、2
9、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイ
イのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これ
はＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular
and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これら
の中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが
本発明に特に好適である。
異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、
この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全行程を
行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファー
ジＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）があ
る。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abre
mskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoe
ssら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質と
する。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認
識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の
２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコン
ビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、2
9、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイ
イのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これ
はＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular
and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これら
の中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが
本発明に特に好適である。
【００１６】リコンビナーゼ遺伝子は、例えば、リコン
ビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ
１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分を
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を
用いて増幅して本発明に使用することができる。その他
のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用い
て調製することができる。この場合に使用するプライマ
ーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるよ
うに選択され、さらに組換えアデノウイルスベクターの
構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限酵
素切断配列を付加したものを使用することが好ましい。
ビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ
１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分を
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を
用いて増幅して本発明に使用することができる。その他
のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用い
て調製することができる。この場合に使用するプライマ
ーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるよ
うに選択され、さらに組換えアデノウイルスベクターの
構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限酵
素切断配列を付加したものを使用することが好ましい。
【００１７】上記のリコンビナーゼの認識配列（基質と
なる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３
４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Ab
remskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および H
oessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法によ
り化学合成して本発明に使用することができる。
なる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３
４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Ab
remskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および H
oessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法によ
り化学合成して本発明に使用することができる。
【００１８】本発明に用いられるポリＡ配列としては、
特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来の
ものが特に好ましい。
特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来の
ものが特に好ましい。
【００１９】本発明においては、リコンビナーゼ遺伝子
をアデノウイルスベクターに組み込む場合に、同時に核
移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。例えば、
ＳＶ４０の核移行シグナルが利用できる。これは、アデ
ノウイルスベクターにより感染細胞の細胞質内で発現し
たリコンビナーゼがその認識配列を有するアデノウイル
スベクターに作用するには、核内に移行する必要があ
り、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel Kal
deron ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からである。
をアデノウイルスベクターに組み込む場合に、同時に核
移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。例えば、
ＳＶ４０の核移行シグナルが利用できる。これは、アデ
ノウイルスベクターにより感染細胞の細胞質内で発現し
たリコンビナーゼがその認識配列を有するアデノウイル
スベクターに作用するには、核内に移行する必要があ
り、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel Kal
deron ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からである。
【００２０】本発明に使用される外来遺伝子としては、
上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）あるいはその他のプロモーターにより発現すること
ができる遺伝子であれば、特に限定されるものではな
く、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正
常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジス
トロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチ
トリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガ
ラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例
えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−
α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリ
ン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、
非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ
７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配
列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−
１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等
のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシ
ンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙
げられる。
上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）あるいはその他のプロモーターにより発現すること
ができる遺伝子であれば、特に限定されるものではな
く、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正
常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジス
トロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチ
トリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガ
ラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例
えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−
α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリ
ン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、
非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ
７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配
列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−
１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等
のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシ
ンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙
げられる。
【００２１】本発明の組換えアデノウイルスベクターに
組み込まれるプロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配
列は上流からこの順に配向していても逆の順に配向して
いてもよい。
組み込まれるプロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配
列は上流からこの順に配向していても逆の順に配向して
いてもよい。
【００２２】次に、本発明の組換えアデノウイルスの製
造方法について説明する。 （１） まず、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側にある同方向を
向いた二つのリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、
外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイ
ルスベクターの製造方法について述べる。便宜上、リコ
ンビナーゼとしてはリコンビナーゼＣｒｅを、その認識
配列としてはｌｏｘＰを、プロモーターおよびポリＡ配
列としては前記のＣＡＧプロモーターを、外来遺伝子と
してはＬａｃＺ遺伝子を使用する場合について述べる
が、その他のリコンビナーゼ、その認識配列、プロモー
ターおよびポリＡ配列を使用する場合も実質的に同様の
手法を利用することができる。
造方法について説明する。 （１） まず、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側にある同方向を
向いた二つのリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、
外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイ
ルスベクターの製造方法について述べる。便宜上、リコ
ンビナーゼとしてはリコンビナーゼＣｒｅを、その認識
配列としてはｌｏｘＰを、プロモーターおよびポリＡ配
列としては前記のＣＡＧプロモーターを、外来遺伝子と
してはＬａｃＺ遺伝子を使用する場合について述べる
が、その他のリコンビナーゼ、その認識配列、プロモー
ターおよびポリＡ配列を使用する場合も実質的に同様の
手法を利用することができる。
【００２３】（ａ）（ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔの構築） ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行う。次に、得られたプラ
スミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
う。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した
後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリンカ
ーとのリガーゼ反応を行い、ＣＡＧプロモーターを含む
プラスミドｐＣＭｗＣＨ３１を取得する。元の制限酵素
部位の消失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の
後、アガロースゲル電気泳動により確認する。
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行う。次に、得られたプラ
スミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
う。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した
後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリンカ
ーとのリガーゼ反応を行い、ＣＡＧプロモーターを含む
プラスミドｐＣＭｗＣＨ３１を取得する。元の制限酵素
部位の消失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の
後、アガロースゲル電気泳動により確認する。
【００２４】 ｐＡｄｅｘ１ｃの構築 実施例１（ｉ）〜（vi）に記載の方法により構築す
る。その概要は以下のとおりである。Ｅ１遺伝子領域を
欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％を含む
プラスミド（ｐＵＡＦ０−１７Ｄ）、５型アデノウイル
スＤＮＡにＢａｍＨリンカーを結合させた後ＨｉｎｄII
I 消化して得られるフラグメント（２．８ｋｂ、アデノ
ウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）をｐＵＣ１
９に挿入して得られるプラスミド（ｐＵＡＦ０−８）、
およびアデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄIII 消化して得
られる３．４ｋｂフラグメント（アデノウイルスゲノム
の左側末端の８−１７％に当たる）をｐＵＣ１９のＨｉ
ｎｄIII 部位へ挿入して得られるプラスミド（ｐＵＡＦ
８−１７）とを調製し、ついでｐＵＡＦ０−８由来の４
５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵ
ＡＦ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −Ｃｌａ
Ｉフラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈ
ｉｎｄIII 部位へ挿入してｐＵＡＦ０−１７Ｄを得る。
る。その概要は以下のとおりである。Ｅ１遺伝子領域を
欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％を含む
プラスミド（ｐＵＡＦ０−１７Ｄ）、５型アデノウイル
スＤＮＡにＢａｍＨリンカーを結合させた後ＨｉｎｄII
I 消化して得られるフラグメント（２．８ｋｂ、アデノ
ウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）をｐＵＣ１
９に挿入して得られるプラスミド（ｐＵＡＦ０−８）、
およびアデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄIII 消化して得
られる３．４ｋｂフラグメント（アデノウイルスゲノム
の左側末端の８−１７％に当たる）をｐＵＣ１９のＨｉ
ｎｄIII 部位へ挿入して得られるプラスミド（ｐＵＡＦ
８−１７）とを調製し、ついでｐＵＡＦ０−８由来の４
５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵ
ＡＦ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −Ｃｌａ
Ｉフラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈ
ｉｎｄIII 部位へ挿入してｐＵＡＦ０−１７Ｄを得る。
【００２５】さらに、５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓ
ｔ１１０７とＥｃｏＲＩで消化し２１．６ｋｂのフラグ
メントを得る。また、アデノウイルスゲノム由来のｐＸ
２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋ
ｂ）を調製する。一方、charomid９−１１(I. Saito &
G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83,
p8664-8668, 1986) をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーショ
ンする。ついでそのＥｃｏＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカ
ーを挿入し、シャロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１を調製
する。
ｔ１１０７とＥｃｏＲＩで消化し２１．６ｋｂのフラグ
メントを得る。また、アデノウイルスゲノム由来のｐＸ
２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋ
ｂ）を調製する。一方、charomid９−１１(I. Saito &
G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83,
p8664-8668, 1986) をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーショ
ンする。ついでそのＥｃｏＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカ
ーを挿入し、シャロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１を調製
する。
【００２６】上記のｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−
Ｂｓｔ１１０７フラグメント（２．９ｋｂ）とアデノウ
イルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（２１．６ｋｂ）とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩ
フラグメント（６．５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６
Ｉで消化したｃｈｄＲＢＲ７−１１とライゲーションす
る。その後、in vitroパッケージングし、ＤＨ５αへ感
染させる。形質転換株から目的のフラグメントをもつも
のを単離し、ｐＡｄｅｘ１ｃと名づける。
Ｂｓｔ１１０７フラグメント（２．９ｋｂ）とアデノウ
イルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（２１．６ｋｂ）とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩ
フラグメント（６．５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６
Ｉで消化したｃｈｄＲＢＲ７−１１とライゲーションす
る。その後、in vitroパッケージングし、ＤＨ５αへ感
染させる。形質転換株から目的のフラグメントをもつも
のを単離し、ｐＡｄｅｘ１ｃと名づける。
【００２７】 カセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの
構築 ＣｌａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
Ａｄｅｘ１ｃと、５’末端リン酸化を施した下記の合成
リンカー（１）（配列番号：２）（ＳｗａＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩで消化する。
この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＳｗａ
Ｉ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造
のコスミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ
ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、リ
ンカー由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
でライゲーションを行い、セルフアニーリングによる環
状化を行う。ついでイン・ビトロ・パッケージングを行
い、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢ
ａｍＨＩおよびＮｒｕＩ同時消化により確認する。目的
とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入
された場合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認によ
り目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図
１）を取得する。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
構築 ＣｌａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
Ａｄｅｘ１ｃと、５’末端リン酸化を施した下記の合成
リンカー（１）（配列番号：２）（ＳｗａＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩで消化する。
この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＳｗａ
Ｉ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造
のコスミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ
ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、リ
ンカー由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
でライゲーションを行い、セルフアニーリングによる環
状化を行う。ついでイン・ビトロ・パッケージングを行
い、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢ
ａｍＨＩおよびＮｒｕＩ同時消化により確認する。目的
とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入
された場合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認によ
り目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図
１）を取得する。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
【００２８】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡ
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのライゲーションを行う。リガーゼを熱失活させた
後、Ｐｓｐ１４０６Ｉで消化する。この切断はリンカー
が複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を切
り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個連
結した構造の断片を得るために行う。このあと、反応液
をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣｌａ
Ｉで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍ
ｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤＮＡ
断片と前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼでライゲーションさせる。リガーゼを熱失活させた
後、ＣｌａＩを添加し、セルフアニーリングにより生じ
た環状コスミドを切断する。ついで、イン・ビトロ・パ
ッケージングに用いる。更に、各コロニーから調製した
コスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ同時
消化により確認する。目的とする方向に挿入された場合
４８３ｂｐと４．８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、
２．７及び２．５ｋｂの断片を生じる。この確認により
目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取
得する。
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのライゲーションを行う。リガーゼを熱失活させた
後、Ｐｓｐ１４０６Ｉで消化する。この切断はリンカー
が複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を切
り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個連
結した構造の断片を得るために行う。このあと、反応液
をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣｌａ
Ｉで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍ
ｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤＮＡ
断片と前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼでライゲーションさせる。リガーゼを熱失活させた
後、ＣｌａＩを添加し、セルフアニーリングにより生じ
た環状コスミドを切断する。ついで、イン・ビトロ・パ
ッケージングに用いる。更に、各コロニーから調製した
コスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ同時
消化により確認する。目的とする方向に挿入された場合
４８３ｂｐと４．８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、
２．７及び２．５ｋｂの断片を生じる。この確認により
目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取
得する。
【００２９】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
ＡｄｅｘｌｐＣＡｗを、5'末端リン酸化を施した下記の
合成リンカー（２）（配列番号：３）（ＣｌａＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を
含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反
応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、
ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させる。この
切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰａｃＩ断
片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコ
スミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃ
ｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー
由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む
反応液中で一晩結合させ、セルフアニーリングによる環
状化を行う。リガーゼを熱失活させた後、イン・ビトロ
・パッケージングに用いる。次に、各コロニーから調製
したコスミドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同
時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場
合５５２ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの
断片を生じる。これを確認することにより目的とするカ
セットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得す
る。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
ＡｄｅｘｌｐＣＡｗを、5'末端リン酸化を施した下記の
合成リンカー（２）（配列番号：３）（ＣｌａＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を
含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反
応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、
ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させる。この
切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰａｃＩ断
片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコ
スミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃ
ｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー
由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む
反応液中で一晩結合させ、セルフアニーリングによる環
状化を行う。リガーゼを熱失活させた後、イン・ビトロ
・パッケージングに用いる。次に、各コロニーから調製
したコスミドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同
時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場
合５５２ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの
断片を生じる。これを確認することにより目的とするカ
セットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得す
る。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
【００３０】（ｂ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その
１）ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製 ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔをＢａｍＨＩで切断した後、熱処
理によりＢａｍＨＩを失活させる。次にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより一晩結合させる。次いでこの反応混液を用い
て大腸菌ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得る。
１）ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製 ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔをＢａｍＨＩで切断した後、熱処
理によりＢａｍＨＩを失活させる。次にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより一晩結合させる。次いでこの反応混液を用い
て大腸菌ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得る。
【００３１】 ｐＡ６０Ｘ９９の作製（アデノウイル
ス以外のＸｂａＩ部位の除去） ｐＡ６０Ｘ９９ＸをＸｂａＩ処理し、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位のうち１ヶ
所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲ
ルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回
収する。次に、この断片をＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造
製）で両末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製する。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩ
およびＸｂａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片すなわ
ちプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図３）を得る。
ス以外のＸｂａＩ部位の除去） ｐＡ６０Ｘ９９ＸをＸｂａＩ処理し、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位のうち１ヶ
所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲ
ルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回
収する。次に、この断片をＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造
製）で両末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製する。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩ
およびＸｂａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片すなわ
ちプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図３）を得る。
【００３２】 ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の作製（ＢｓｒＧ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏｌで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵
素（宝酒造製）で両末端を平滑化する。その後フェノー
ル：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノー
ル沈澱する。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ６０
μｌに溶解する。これと５’末端リン酸化ＫｐｎＩリン
カー（宝酒造製）、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを
含むリガーゼ反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合
させる。次に、Ａｓｐ７１８（ベーリンガー製）で消化
する。反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰ
を含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電
気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏｌで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵
素（宝酒造製）で両末端を平滑化する。その後フェノー
ル：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノー
ル沈澱する。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ６０
μｌに溶解する。これと５’末端リン酸化ＫｐｎＩリン
カー（宝酒造製）、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを
含むリガーゼ反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合
させる。次に、Ａｓｐ７１８（ベーリンガー製）で消化
する。反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰ
を含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電
気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
【００３３】なお、上記のｐＵＬＬ２ｒは以下のように
して調製する。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得る。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
して調製する。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得る。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
【００３４】一方、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９（１０μ
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。このＤ
ＮＡ断片と前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断
片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反
応液中で一晩結合させる。これに滅菌水、ＢｓｒＧＩ反
応ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で１０分間インキュベー
トすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＢｓｒＧ
Ｉで処理してセルフアニーリングにより生じた環状のｐ
Ａ６０Ｘ９９を切断する。次いでこの反応混液１０μｌ
を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製する。
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。このＤ
ＮＡ断片と前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断
片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反
応液中で一晩結合させる。これに滅菌水、ＢｓｒＧＩ反
応ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で１０分間インキュベー
トすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＢｓｒＧ
Ｉで処理してセルフアニーリングにより生じた環状のｐ
Ａ６０Ｘ９９を切断する。次いでこの反応混液１０μｌ
を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製する。
【００３５】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得す
る。
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得す
る。
【００３６】 ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の作製（Ｘｂａ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏＩを含む反応系１００μｌ中で切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平
滑化する。ついで、フェノール：クロロホルム（１：
１）処理を施した後、エタノール沈澱する。沈澱物を遠
心分離により取得し、ＴＥに溶解する。これと５’末端
リン酸化ＳｐｅＩリンカー（宝酒造製）、ＡＴＰおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。
さらに、ＳｐｅＩを加え消化した後、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏＩを含む反応系１００μｌ中で切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平
滑化する。ついで、フェノール：クロロホルム（１：
１）処理を施した後、エタノール沈澱する。沈澱物を遠
心分離により取得し、ＴＥに溶解する。これと５’末端
リン酸化ＳｐｅＩリンカー（宝酒造製）、ＡＴＰおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。
さらに、ＳｐｅＩを加え消化した後、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。
【００３７】一方、ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を、ＸｂａＩで
切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２
３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳
動によりゲルからＤＮＡを回収する。このＤＮＡ断片と
前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片、ＡＴＰお
よびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させ、ついでこれをＸｂａＩで処
理し、セルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ
６０Ｘ９９を切断する。この反応混液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを調製する。
切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２
３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳
動によりゲルからＤＮＡを回収する。このＤＮＡ断片と
前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片、ＡＴＰお
よびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させ、ついでこれをＸｂａＩで処
理し、セルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ
６０Ｘ９９を切断する。この反応混液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを調製する。
【００３８】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得する。
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得する。
【００３９】 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを、Ｃｓｐ４５Ｉ（東洋紡製）で
切断し、次いで、同反応液中でＢａｍＨＩ、さらにＥｃ
ｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によるチ
ェックを行う。２１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り
出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
なお、Ｃｓｐ４５１およびＥｃｏＲＩによる切断は２１
ｋｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収する際、他の断片が
混入するのを防ぐためである。
切断し、次いで、同反応液中でＢａｍＨＩ、さらにＥｃ
ｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によるチ
ェックを行う。２１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り
出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
なお、Ｃｓｐ４５１およびＥｃｏＲＩによる切断は２１
ｋｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収する際、他の断片が
混入するのを防ぐためである。
【００４０】ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩで切断
した後、フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過する。回収したＤＮＡ断片と前述の２１ｋ
ｂのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含
む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた
後、これをイン・ビトロ・パッケージングに用いる。
した後、フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過する。回収したＤＮＡ断片と前述の２１ｋ
ｂのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含
む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた
後、これをイン・ビトロ・パッケージングに用いる。
【００４１】即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージ
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ製）を用い、残りは−８０℃に凍結する。ギガバック
ＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低い
のでインサートが入って大きくなったコスミドをある程
度選択することができる。本発明では、１０個のコロニ
ーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的のクロ
ーン（ウイルスゲノムが正しく連結されたクローン）を
容易に得ることができる。コスミドの扱い方について
は、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：183-187, 1989)
に従って行う。
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ製）を用い、残りは−８０℃に凍結する。ギガバック
ＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低い
のでインサートが入って大きくなったコスミドをある程
度選択することができる。本発明では、１０個のコロニ
ーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的のクロ
ーン（ウイルスゲノムが正しく連結されたクローン）を
容易に得ることができる。コスミドの扱い方について
は、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：183-187, 1989)
に従って行う。
【００４２】パッケージングされたコスミドを大腸菌Ｄ
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）に感染させる。即ち、Ａ
ｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートとＡｐ+ ＬＢ
（ｐｏｏｌ）に各種の濃度で接種し、一晩培養する。ｐ
ｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制限
酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの割
合を調べる。コロニーは丸ごと寒天ごと取りＡｐ+ ＬＢ
で一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製する。次
に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＤ
ｒａＩ切断により確認する。目的とする方向に挿入され
た場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入された場合１．４ｋｂ
の断片を生じる。これにより目的とするカセットコスミ
ドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得する。
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）に感染させる。即ち、Ａ
ｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートとＡｐ+ ＬＢ
（ｐｏｏｌ）に各種の濃度で接種し、一晩培養する。ｐ
ｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制限
酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの割
合を調べる。コロニーは丸ごと寒天ごと取りＡｐ+ ＬＢ
で一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製する。次
に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＤ
ｒａＩ切断により確認する。目的とする方向に挿入され
た場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入された場合１．４ｋｂ
の断片を生じる。これにより目的とするカセットコスミ
ドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得する。
【００４３】（ｃ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その
２）ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＵＣＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。同
様の操作によりｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
により切断し、２．７ｋｂの断片を回収する。次に両断
片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次い
でこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、
得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目
的とするプラスミドｐＵＣＡ６０６５を得る。
２）ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＵＣＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。同
様の操作によりｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
により切断し、２．７ｋｂの断片を回収する。次に両断
片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次い
でこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、
得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目
的とするプラスミドｐＵＣＡ６０６５を得る。
【００４４】 ｐ２ＬＡ６０６５の作製 ｐＵＣＡ６０６５をＢａｍＨＩおよびＡｆｌIII で切断
し、７８０ｂｐの断片を調製し、また、同プラスミドを
ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで切断し、３．６ｋｂの断
片を調製する。これら両断片とｌｏｘＰ配列を含む下記
のリンカーＤＮＡ（配列番号：１１）を混合しリガーゼ
反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液
を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤＮＡが
１つ挿入された、目的とするプラスミドｐ２ＬＡ６０６
５を得る。 5'-CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT 3'-ATTAAA TTTAGAGCTC TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATATGCGCA ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT-3' TAAATTTACA TTTTTATTAC ATGATCTCTG TGAAAGTTAT TTCCGTTTAC GAAAATAAAC ATG-5'
し、７８０ｂｐの断片を調製し、また、同プラスミドを
ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで切断し、３．６ｋｂの断
片を調製する。これら両断片とｌｏｘＰ配列を含む下記
のリンカーＤＮＡ（配列番号：１１）を混合しリガーゼ
反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液
を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤＮＡが
１つ挿入された、目的とするプラスミドｐ２ＬＡ６０６
５を得る。 5'-CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT 3'-ATTAAA TTTAGAGCTC TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATATGCGCA ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT-3' TAAATTTACA TTTTTATTAC ATGATCTCTG TGAAAGTTAT TTCCGTTTAC GAAAATAAAC ATG-5'
【００４５】 ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９の作製 ｐ２ＬＡ６０６５をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ（あるい
はＢｇｌＩ）により切断し、１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９を得
る。
はＢｇｌＩ）により切断し、１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９を得
る。
【００４６】 ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ作製の際のと同様の操作
により、ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔを作製する。
により、ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔを作製する。
【００４７】（ｄ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その
３）ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＨＳＧＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。ｐ
ＨＳＧ２９９（宝酒造）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩに
より切断し、同様の操作により２．７ｋｂの断片を回収
する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加
え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、目的とするプラスミドｐＨＳＧＡ６０６５
を得る。
３）ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＨＳＧＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。ｐ
ＨＳＧ２９９（宝酒造）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩに
より切断し、同様の操作により２．７ｋｂの断片を回収
する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加
え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、目的とするプラスミドｐＨＳＧＡ６０６５
を得る。
【００４８】 ｐ２ＬＤ６０６５の作製 ｐＨＳＧＡ６０６５をＢｓｒＧＩおよびＤｒａＩで切断
し４．４ｋｂの断片を調製し、これとｌｏｘＰ配列を含
む下記のリンカーＤＮＡ（配列番号：１２）を混合し、
リガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの
反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られ
た形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカー
ＤＮＡが１つ挿入された目的とするプラスミドｐ２ＬＤ
６０６５を得る。 5'-GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA 3'-TGAGAG CCCACTAATA AATGGGGGTG GGAACGGCAG ACGCGGCTAA ATTTAGAGCT GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT-3' CTATTGAAGC ATATTACATA CGATATGCTT CAATATGCGC ATAAATTTAG GCAAA-5'
し４．４ｋｂの断片を調製し、これとｌｏｘＰ配列を含
む下記のリンカーＤＮＡ（配列番号：１２）を混合し、
リガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの
反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られ
た形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカー
ＤＮＡが１つ挿入された目的とするプラスミドｐ２ＬＤ
６０６５を得る。 5'-GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA 3'-TGAGAG CCCACTAATA AATGGGGGTG GGAACGGCAG ACGCGGCTAA ATTTAGAGCT GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT-3' CTATTGAAGC ATATTACATA CGATATGCTT CAATATGCGC ATAAATTTAG GCAAA-5'
【００４９】 ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９の作製 ｐ２ＬＤ６０６５をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ（あるい
はＢｇｌＩ）により切断し１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９を得
る。
はＢｇｌＩ）により切断し１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９を得
る。
【００５０】 ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ作製の際のと同様の操作
により、ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔを作製する。
により、ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔを作製する。
【００５１】（ｅ）アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複
合体（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５
ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）に、Ａ
ｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染さ
せ、培養を行う。即ち、Ａｄ５−ｄｌＸまたはＡｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍ
ｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はが
れた細胞を遠心分離により集める。アデノウイルス粒子
のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるの
で感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。（以
下の操作は非無菌的に行う。）
合体（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５
ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）に、Ａ
ｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染さ
せ、培養を行う。即ち、Ａｄ５−ｄｌＸまたはＡｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍ
ｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はが
れた細胞を遠心分離により集める。アデノウイルス粒子
のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるの
で感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。（以
下の操作は非無菌的に行う。）
【００５２】 得られた細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）に懸濁し、密封型ソニケーターを用いて細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させる。 得られた破砕物を遠心分離により沈澱を除いた後、
超遠心分離機 ＳＷ２８チューブに塩化セシウム溶液
（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッ
ション遠心による濃縮を行う。 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移
す。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層
とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取する。同時にも
う一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たす。
これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけた。
次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配がで
きたチューブに乗せ替える。さらに、３５ｋｒｐｍ、４
℃４時間以上超遠心にかける。
Ｈ８．０）に懸濁し、密封型ソニケーターを用いて細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させる。 得られた破砕物を遠心分離により沈澱を除いた後、
超遠心分離機 ＳＷ２８チューブに塩化セシウム溶液
（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッ
ション遠心による濃縮を行う。 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移
す。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層
とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取する。同時にも
う一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たす。
これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけた。
次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配がで
きたチューブに乗せ替える。さらに、３５ｋｒｐｍ、４
℃４時間以上超遠心にかける。
【００５３】 白いウイルスのバンドを分取し、等量
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たす。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を受
けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出される。
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たす。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を受
けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出される。
【００５４】 上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認する。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
る。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−
ＴＰＣまたはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰ
Ｃの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出する。 得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｄ
ｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺＤＮＡ−ＴＰＣを、次のステップ
のｌｏｘＰ挿入組換えアデノウイルス作成のため、充分
量のＡｇｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２
５カラムでゲル濾過後、−８０℃に保存する。
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認する。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
る。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−
ＴＰＣまたはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰ
Ｃの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出する。 得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｄ
ｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺＤＮＡ−ＴＰＣを、次のステップ
のｌｏｘＰ挿入組換えアデノウイルス作成のため、充分
量のＡｇｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２
５カラムでゲル濾過後、−８０℃に保存する。
【００５５】（ｆ）ｌｏｘＰ挿入組み換えアデノウイル
スの作製 なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端にＳ
Ｖ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。 −１．（Ａｄ５ｄｌＸ２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３
ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇｅ
Ｉで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇ
ｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−Ｔ
ＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャー
レのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続け
る。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換
し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍
希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各
プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０
ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
スの作製 なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端にＳ
Ｖ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。 −１．（Ａｄ５ｄｌＸ２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３
ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇｅ
Ｉで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇ
ｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−Ｔ
ＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャー
レのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続け
る。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換
し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍
希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各
プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０
ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
【００５６】−２．（Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３Ｌまたは
Ａｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャー
レのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続け
る。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換
し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍
希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各
プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０
ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
Ａｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャー
レのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続け
る。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換
し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍
希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各
プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０
ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
【００５７】−３．（Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌまたは
Ａｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャー
レのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続け
る。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換
し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍
希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各
プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０
ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
Ａｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。６ｃｍシャー
レのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続け
る。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換
し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍
希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直す。細胞数が各
プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０
ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播く。
【００５８】 ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエ
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加える。２９
３細胞がやせてきたら早めに加える。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れる。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存する。 １５〜２５日で判定は終了する。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心して得ら
れた上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０
℃に保存する。早めにウイルス増殖が起こったウエルは
複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからであ
る。
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加える。２９
３細胞がやせてきたら早めに加える。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れる。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存する。 １５〜２５日で判定は終了する。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心して得ら
れた上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０
℃に保存する。早めにウイルス増殖が起こったウエルは
複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからであ
る。
【００５９】 ２４穴プレートに２９３細胞を用意
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加する。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存する。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００
ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０
℃に保存する（セルパック）。１０種類のウイルス株の
セルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮ
Ａを抽出する。セルパックには、４００μｌのcell DNA
用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDT
A)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10
%SDSを加える。
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加する。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存する。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００
ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０
℃に保存する（セルパック）。１０種類のウイルス株の
セルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮ
Ａを抽出する。セルパックには、４００μｌのcell DNA
用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDT
A)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10
%SDSを加える。
【００６０】 ５０℃で１時間処理した後、フェノー
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かす。その１５
μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にＣ
Ｇを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミドカ
セットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガ
ロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較す
る。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があ
るので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示す
クローンを選択する。説明できないバンドが薄く見える
クローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があ
るので廃棄する。
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かす。その１５
μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にＣ
Ｇを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミドカ
セットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガ
ロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較す
る。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があ
るので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示す
クローンを選択する。説明できないバンドが薄く見える
クローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があ
るので廃棄する。
【００６１】ここで得られるｌｏｘＰ挿入組換えアデノ
ウイルスＡｄ５ｄｌＸ２Ｌ３Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３
Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌ等と、目的の外来遺伝子発
現ユニットを含むコスミドを用いて、公知の組換えアデ
ノウイルス作製方法、例えばＣＯＳ−ＴＰＣ法（「実験
医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入と
発現・解析法、４３〜５８頁）に従って、目的の外来遺
伝子発現ユニットとｌｏｘＰが挿入された組換えアデノ
ウイルスを作製することができる。
ウイルスＡｄ５ｄｌＸ２Ｌ３Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３
Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌ等と、目的の外来遺伝子発
現ユニットを含むコスミドを用いて、公知の組換えアデ
ノウイルス作製方法、例えばＣＯＳ−ＴＰＣ法（「実験
医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入と
発現・解析法、４３〜５８頁）に従って、目的の外来遺
伝子発現ユニットとｌｏｘＰが挿入された組換えアデノ
ウイルスを作製することができる。
【００６２】（ｇ）Ｅ２Ａ遺伝子欠損アデノウイルスの
作製と構造確認 組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃ
ＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１
０および３で２９３細胞に感染させ、培養を行う。４日
目に細胞を回収し、前述の方法によりＤＮＡを調製す
る。ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が
切り出された構造を有するＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａ
ｃＺの生成を２つの方法で確認する。なお、Ａｄｅｘ２
ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡ
ＮＬａｃＺに関しても同様の操作により構造が確認でき
る。
作製と構造確認 組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃ
ＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１
０および３で２９３細胞に感染させ、培養を行う。４日
目に細胞を回収し、前述の方法によりＤＮＡを調製す
る。ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が
切り出された構造を有するＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａ
ｃＺの生成を２つの方法で確認する。なお、Ａｄｅｘ２
ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡ
ＮＬａｃＺに関しても同様の操作により構造が確認でき
る。
【００６３】１．ＳｍａＩ消化 ＳｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動した結果、ｌｏｘＰで
挟まれた領域が切り出されて生ずる４．７ｋｂの断片が
認められる。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａ
ｃＺ、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅ、およびＡｄｅｘｄｌ２
３ＣＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋ
ｂのバンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウ
イルス中の約何％がＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺで
あるかが分かる。
挟まれた領域が切り出されて生ずる４．７ｋｂの断片が
認められる。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａ
ｃＺ、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅ、およびＡｄｅｘｄｌ２
３ＣＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋ
ｂのバンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウ
イルス中の約何％がＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺで
あるかが分かる。
【００６４】２．ＰＣＲによる確認 調製したＤＮＡ０．１ｎｇをテンプレートとし、通常の
条件でＰＣＲを行い、生成物をアガロースゲル電気泳動
により分析する。用いるプライマーは、下記に示すオリ
ゴヌクレオチド（１）（配列番号：５）、オリゴヌクレ
オチド（２）（配列番号：６）、オリゴヌクレオチド
（３）（配列番号：７）およびオリゴヌクレオチド
（４）（配列番号：８）が好ましい。 (1) 5'−ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣ
ＣＣＡＧＧＴＡＣＡ−3' (2) 5'−ＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＣＧ
ＧＣＡＡＧ−3' (3) 5'−ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧ
−3' (4) 5'−ＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴ
ＧＣＡＡＧＴＴＡＡＣ−3' ＰＣＲ反応液組成は、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）中、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、０．２ｍＭのｄＮＴＰ mixture および各０．２
μＭのプライマー、０．１ｎｇのテンプレートＤＮＡお
よび０．５ｕｎｉｔのＴａｑ ポリメラーゼを含むもの
が好ましい。ＰＣＲ反応条件としては、二本鎖解離を９
５℃で１．５分、アニーリングを６４℃で１．０分、伸
長反応を７０℃で１．０分、反応サイクル３０回、が好
ましい１例である。プライマーとして（１）と（４）を
用いた場合、３９３ｂｐと推定されるバンドが検出さ
れ、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失したＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬ
ａｃＺの存在が明らかとなり、また、（２）と（３）を
用いた場合、２２１ｂｐと推定されるバンドが検出さ
れ、Ｃｒｅ遺伝子産物により切り出された環状のＥ２Ａ
遺伝子の存在も裏付けられ、Ａｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬ
ａｃＺからｌｏｘＰではさまれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を
含む）が切り出されたＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺ
の生成が明らかになる（図６）。
条件でＰＣＲを行い、生成物をアガロースゲル電気泳動
により分析する。用いるプライマーは、下記に示すオリ
ゴヌクレオチド（１）（配列番号：５）、オリゴヌクレ
オチド（２）（配列番号：６）、オリゴヌクレオチド
（３）（配列番号：７）およびオリゴヌクレオチド
（４）（配列番号：８）が好ましい。 (1) 5'−ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣ
ＣＣＡＧＧＴＡＣＡ−3' (2) 5'−ＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＣＧ
ＧＣＡＡＧ−3' (3) 5'−ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧ
−3' (4) 5'−ＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴ
ＧＣＡＡＧＴＴＡＡＣ−3' ＰＣＲ反応液組成は、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）中、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、０．２ｍＭのｄＮＴＰ mixture および各０．２
μＭのプライマー、０．１ｎｇのテンプレートＤＮＡお
よび０．５ｕｎｉｔのＴａｑ ポリメラーゼを含むもの
が好ましい。ＰＣＲ反応条件としては、二本鎖解離を９
５℃で１．５分、アニーリングを６４℃で１．０分、伸
長反応を７０℃で１．０分、反応サイクル３０回、が好
ましい１例である。プライマーとして（１）と（４）を
用いた場合、３９３ｂｐと推定されるバンドが検出さ
れ、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失したＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬ
ａｃＺの存在が明らかとなり、また、（２）と（３）を
用いた場合、２２１ｂｐと推定されるバンドが検出さ
れ、Ｃｒｅ遺伝子産物により切り出された環状のＥ２Ａ
遺伝子の存在も裏付けられ、Ａｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬ
ａｃＺからｌｏｘＰではさまれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を
含む）が切り出されたＡｄｅｘｄｌ２３ＣＡＮＬａｃＺ
の生成が明らかになる（図６）。
【００６５】（２） 次に、プロモーター、リコンビナ
ーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイ
ルスベクターの製造方法について説明する。以下に、リ
コンビナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子
を使用した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ
遺伝子の場合もほぼ同様である。
ーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイ
ルスベクターの製造方法について説明する。以下に、リ
コンビナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子
を使用した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ
遺伝子の場合もほぼ同様である。
【００６６】 ＰＣＲ法で調製したリコンビナーゼＣ
ｒｅ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）と
をそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａ
Ｉ（宝酒造製）で同時消化したのち混合・ライゲーショ
ンし、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれたプラ
スミドｐＵＣＣｒｅを得る。 ＣＡＧプロモーターを含むカセットコスミドｐＡｄ
ｅｘ１ＣＡｗｔを制限酵素ＳｗａＩ（Boehringer製）で
処理したものと、ｐＵＣＣｒｅを制限酵素ＰｓｔＩ（宝
酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）で同時消化したの
ちＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両端を平滑化したも
のとを混合する。ついでカセットコスミドを沈澱させ、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合させ、リコンビナーゼＣｒ
ｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドを得る。
ｒｅ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）と
をそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａ
Ｉ（宝酒造製）で同時消化したのち混合・ライゲーショ
ンし、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれたプラ
スミドｐＵＣＣｒｅを得る。 ＣＡＧプロモーターを含むカセットコスミドｐＡｄ
ｅｘ１ＣＡｗｔを制限酵素ＳｗａＩ（Boehringer製）で
処理したものと、ｐＵＣＣｒｅを制限酵素ＰｓｔＩ（宝
酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）で同時消化したの
ちＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両端を平滑化したも
のとを混合する。ついでカセットコスミドを沈澱させ、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合させ、リコンビナーゼＣｒ
ｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドを得る。
【００６７】ＣＡＧプロモーター以外のプロモーターを
使用する場合は、まず、アデノウイルスゲノム（３６ｋ
ｂ）の全長のうち、複製に不要なＥ３領域（１．９ｋ
ｂ）とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ領域（２．９ｋｂ）を欠失させた
約３１ｋｂのゲノムＤＮＡをもつカセットコスミドを作
成し、他方、使用しようとするプロモーター、リコンビ
ナーゼＣｒｅ遺伝子およびポリＡ配列を含むプラスミド
を作製し、適当な制限酵素で処理してアデノウイルスゲ
ノムのＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位にリコンビナーゼＣｒｅ
遺伝子発現ユニットを組み込んだカセットコスミドを得
る。 次に、得られたカセットコスミドを、ラムダ・イン
ビトロ・パッケージングキットであるギガパックＸＬ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いて、インビトロ・パ
ッケージングを行う。
使用する場合は、まず、アデノウイルスゲノム（３６ｋ
ｂ）の全長のうち、複製に不要なＥ３領域（１．９ｋ
ｂ）とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ領域（２．９ｋｂ）を欠失させた
約３１ｋｂのゲノムＤＮＡをもつカセットコスミドを作
成し、他方、使用しようとするプロモーター、リコンビ
ナーゼＣｒｅ遺伝子およびポリＡ配列を含むプラスミド
を作製し、適当な制限酵素で処理してアデノウイルスゲ
ノムのＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位にリコンビナーゼＣｒｅ
遺伝子発現ユニットを組み込んだカセットコスミドを得
る。 次に、得られたカセットコスミドを、ラムダ・イン
ビトロ・パッケージングキットであるギガパックＸＬ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いて、インビトロ・パ
ッケージングを行う。
【００６８】 一方、アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋
白複合体（Ａｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製す
る。アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ｄｌＸ（I.
Saitoet al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985)
）を用い、Ａｄ５ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ瓶
１０本分）に感染させ、培養を行う。ウイルス粒子を回
収し、塩酸グアニジン処理・超遠心によりＤＮＡ−ＴＰ
Ｃを分離・回収する。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ
ＤＮＡ−ＴＰＣを次のステップの組換えアデノウイルス
作製のため充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで処理する。
白複合体（Ａｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製す
る。アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ｄｌＸ（I.
Saitoet al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985)
）を用い、Ａｄ５ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ瓶
１０本分）に感染させ、培養を行う。ウイルス粒子を回
収し、塩酸グアニジン処理・超遠心によりＤＮＡ−ＴＰ
Ｃを分離・回収する。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ
ＤＮＡ−ＴＰＣを次のステップの組換えアデノウイルス
作製のため充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで処理する。
【００６９】 最後のステップとして、リコンビナー
ゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドとＥｃｏ
Ｔ２２Ｉで処理したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣを混
合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて
リン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。ウ
イルスの増殖のため細胞が死滅したものからウイルス液
を回収しプロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポ
リＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを得
る。
ゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドとＥｃｏ
Ｔ２２Ｉで処理したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣを混
合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用いて
リン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。ウ
イルスの増殖のため細胞が死滅したものからウイルス液
を回収しプロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポ
リＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを得
る。
【００７０】本発明の方法により上記のようにして得ら
れる、目的の外来遺伝子発現ユニットを有し、Ｅ２Ａ遺
伝子の機能が完全に欠失した本発明の組換えアデノウイ
ルスの高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入
（中枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投
与、経気道投与、経皮投与等の投与方法により共感染さ
せ、遺伝病を含む各種疾患の治療に用いることができ
る。
れる、目的の外来遺伝子発現ユニットを有し、Ｅ２Ａ遺
伝子の機能が完全に欠失した本発明の組換えアデノウイ
ルスの高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入
（中枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投
与、経気道投与、経皮投与等の投与方法により共感染さ
せ、遺伝病を含む各種疾患の治療に用いることができ
る。
【００７１】
【実施例】以下、実施例、参考例により本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。なお、実施例中のファー
ジ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞
などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら
編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laborat
ory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限
酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指
示書に従って使用した。
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。なお、実施例中のファー
ジ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞
などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら
編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laborat
ory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限
酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指
示書に従って使用した。
【００７２】実施例１（ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔの構築） ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行った。次に、得られたプ
ラスミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素に
より平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
った。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断し
た後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリン
カーとのリガーゼ反応を行った。元の制限酵素部位の消
失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行った。次に、得られたプ
ラスミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素に
より平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
った。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断し
た後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリン
カーとのリガーゼ反応を行った。元の制限酵素部位の消
失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。
【００７３】 ｐＡｄｅｘ１ｃの構築 （ｉ）Ｅ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム
左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７
Ｄ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＳ１処理して平滑末端と
し、その平滑末端にＢａｍＨリンカーを結合させ、その
後ＨｉｎｄIII 消化し、目的のフラグメント（２．８ｋ
ｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）
をアガロースゲル電気泳動で分離・回収し、ＢａｍＨＩ
／ＨｉｎｄIII 消化したｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られた目的のプラスミドを
ｐＵＡＦ０−８と名づけた。
左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７
Ｄ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＳ１処理して平滑末端と
し、その平滑末端にＢａｍＨリンカーを結合させ、その
後ＨｉｎｄIII 消化し、目的のフラグメント（２．８ｋ
ｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）
をアガロースゲル電気泳動で分離・回収し、ＢａｍＨＩ
／ＨｉｎｄIII 消化したｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られた目的のプラスミドを
ｐＵＡＦ０−８と名づけた。
【００７４】（ii）アデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄII
I 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、目的の
３．４ｋｂのフラグメント（アデノウイルスゲノムの左
側末端の８−１７％に当たる）をゲルから回収し、ｐＵ
Ｃ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入した（ｐＵＡＦ８−１
７と命名）。ｐＵＡＦ０−８の塩基番号（ここでいう塩
基番号はアデノウイルスＤＮＡ由来）４５４番目のＰｖ
ｕII部位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変
換した。そして、このプラスミドをＢａｍＨＩ／Ｃｌａ
Ｉ消化し、４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ８
−１７の塩基番号３３２８番目のＢｇｌII部位をＣｌａ
Ｉリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そしてこ
のプラスミドをＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ消化し、２．９
ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ０−８由来の４５
４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡ
Ｆ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩ
フラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られたプラスミドをｐＵＡ
Ｆ０−１７Ｄと命名した。このプラスミドはＥ１遺伝子
領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％
を含む。
I 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、目的の
３．４ｋｂのフラグメント（アデノウイルスゲノムの左
側末端の８−１７％に当たる）をゲルから回収し、ｐＵ
Ｃ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入した（ｐＵＡＦ８−１
７と命名）。ｐＵＡＦ０−８の塩基番号（ここでいう塩
基番号はアデノウイルスＤＮＡ由来）４５４番目のＰｖ
ｕII部位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変
換した。そして、このプラスミドをＢａｍＨＩ／Ｃｌａ
Ｉ消化し、４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ８
−１７の塩基番号３３２８番目のＢｇｌII部位をＣｌａ
Ｉリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そしてこ
のプラスミドをＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ消化し、２．９
ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ０−８由来の４５
４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡ
Ｆ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩ
フラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られたプラスミドをｐＵＡ
Ｆ０−１７Ｄと命名した。このプラスミドはＥ１遺伝子
領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％
を含む。
【００７５】（iii)アデノウイルスゲノムのＢｓｔ１１
０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目
的の２１．６ｋｂのフラグメントを回収した。
０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目
的の２１．６ｋｂのフラグメントを回収した。
【００７６】（iv）アデノウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ
−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）の調製 ｐＸ２Ｓ（I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 5
4, p711-719, 1985)のＳａｌＩ部位をＳｗａＩリンカー
（メーカー名）を用いてＳｗａＩ部位へ変換しｐＸ２Ｗ
を得た。ｐＸ２ＷをＥｃｏＲＩとＳｗａＩで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、目的の６．５ｋｂ
のフラグメントを回収した。
−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）の調製 ｐＸ２Ｓ（I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 5
4, p711-719, 1985)のＳａｌＩ部位をＳｗａＩリンカー
（メーカー名）を用いてＳｗａＩ部位へ変換しｐＸ２Ｗ
を得た。ｐＸ２ＷをＥｃｏＲＩとＳｗａＩで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、目的の６．５ｋｂ
のフラグメントを回収した。
【００７７】（ｖ）シャロミド（ｃｈｄＲＢＲ７−１
１）の調製 charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のＫ
ｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを除くため、charomid９
−１１をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーションした。これ
を用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、char
omid６−１１と名づけた。charomid６−１１のＥｃｏＲ
Ｉ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、得られたシャロ
ミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１と名づけた。
１）の調製 charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のＫ
ｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを除くため、charomid９
−１１をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーションした。これ
を用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、char
omid６−１１と名づけた。charomid６−１１のＥｃｏＲ
Ｉ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、得られたシャロ
ミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１と名づけた。
【００７８】（vi）ｐＡｄｅｘ１ｃの調製 ｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−Ｂｓｔ１１０７フラ
グメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓ
ｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）
とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．
５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄ
ＲＢＲ７−１１とライゲーションした。その後、in vit
roパッケージングし、大腸菌ＤＨ５αへ感染させた。形
質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、
ｐＡｄｅｘ１ｃと名づけた。
グメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓ
ｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）
とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．
５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄ
ＲＢＲ７−１１とライゲーションした。その後、in vit
roパッケージングし、大腸菌ＤＨ５αへ感染させた。形
質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、
ｐＡｄｅｘ１ｃと名づけた。
【００７９】 カセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの
構築 ＣｌａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘ１ｃ（１μｇ）と、５’末端
リン酸化を施した下記の合成リンカー（１）（配列番
号：２）０．０１μｇ（ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩
結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすること
によりリガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩ（２０ｕｎ
ｉｔ）を添加し、反応させた。この切断はリンカーが複
数個挿入されたものからＳｗａＩ断片を切り出し、リン
カーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために
行った。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除
去した後、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させ、セルフアニー
リングにより環状化を行った。７０℃で１０分間インキ
ュベートすることによりリガーゼを熱失活させ、１μｌ
をイン・ビトロ・パッケージングに用いた。次に、各コ
ロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩ
およびＮｒｕＩ同時消化により確認した。目的とする方
向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入された場
合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認により目的と
するカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図１）を取得
した。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
構築 ＣｌａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘ１ｃ（１μｇ）と、５’末端
リン酸化を施した下記の合成リンカー（１）（配列番
号：２）０．０１μｇ（ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩
結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすること
によりリガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩ（２０ｕｎ
ｉｔ）を添加し、反応させた。この切断はリンカーが複
数個挿入されたものからＳｗａＩ断片を切り出し、リン
カーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために
行った。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除
去した後、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させ、セルフアニー
リングにより環状化を行った。７０℃で１０分間インキ
ュベートすることによりリガーゼを熱失活させ、１μｌ
をイン・ビトロ・パッケージングに用いた。次に、各コ
ロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩ
およびＮｒｕＩ同時消化により確認した。目的とする方
向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入された場
合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認により目的と
するカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図１）を取得
した。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
【００８０】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡ
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのリガーゼ反応を行った。７０℃で１０分間インキュ
ベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、Ｐｓ
ｐ１４０６Ｉを添加し、反応させた。この切断はリンカ
ーが複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を
切り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個
連結した構造の断片を得るために行った。このあと、反
応液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルか
らＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣ
ｌａＩで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌ
ｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤ
ＮＡ断片１μｇと前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片０．１
μｇをＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終
容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間
インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた
後、これの１／４量にＣｌａＩを添加し（最終容量２０
μｌ）、セルフアニーリングにより生じた環状コスミド
を切断した。１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに
用いた。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡ
の構造をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ同時消化により確認し
た。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐと４．
８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７および２．５
ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とするカセッ
トコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得した。
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのリガーゼ反応を行った。７０℃で１０分間インキュ
ベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、Ｐｓ
ｐ１４０６Ｉを添加し、反応させた。この切断はリンカ
ーが複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を
切り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個
連結した構造の断片を得るために行った。このあと、反
応液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルか
らＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣ
ｌａＩで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌ
ｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤ
ＮＡ断片１μｇと前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片０．１
μｇをＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終
容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間
インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた
後、これの１／４量にＣｌａＩを添加し（最終容量２０
μｌ）、セルフアニーリングにより生じた環状コスミド
を切断した。１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに
用いた。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡ
の構造をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ同時消化により確認し
た。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐと４．
８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７および２．５
ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とするカセッ
トコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得した。
【００８１】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗ（１μｇ）と、5'
末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（２）（配列
番号：３）（０．０１μｇ）（ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を含む）を
混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最
終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分
間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させ
た後、ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させ
た。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰ
ａｃＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された
構造のコスミドを得るために行った。次に、反応液をＳ
ｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にか
け、リンカー由来の小断片を除去した後、ＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で
一晩結合させ、セルフアニーリングによる環状化を行っ
た。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリ
ガーゼを熱失活させた１μｌをイン・ビトロ・パッケー
ジングに用いた。次に、各コロニーから調製したコスミ
ドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同時消化によ
り確認した。目的とする方向に挿入された場合５５２ｂ
ｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの断片を生じ
る。これを確認することにより目的とするカセットコス
ミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得した。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗ（１μｇ）と、5'
末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（２）（配列
番号：３）（０．０１μｇ）（ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を含む）を
混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最
終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分
間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させ
た後、ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させ
た。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰ
ａｃＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された
構造のコスミドを得るために行った。次に、反応液をＳ
ｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にか
け、リンカー由来の小断片を除去した後、ＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で
一晩結合させ、セルフアニーリングによる環状化を行っ
た。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリ
ガーゼを熱失活させた１μｌをイン・ビトロ・パッケー
ジングに用いた。次に、各コロニーから調製したコスミ
ドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同時消化によ
り確認した。目的とする方向に挿入された場合５５２ｂ
ｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの断片を生じ
る。これを確認することにより目的とするカセットコス
ミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得した。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
【００８２】実施例２（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築） ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製 ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（０．５μｇ）をＢａｍＨＩ（１
５ｕｎｉｔ）を含む反応系２０μｌ中で切断した後、熱
処理（７０℃、１５分間）によりＢａｍＨＩを失活させ
た。次にその１／４量を用いリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ
中でＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量２０
μｌで一晩結合させた。次いでこの反応混液１０μｌを
用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミ
ドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得た。
５ｕｎｉｔ）を含む反応系２０μｌ中で切断した後、熱
処理（７０℃、１５分間）によりＢａｍＨＩを失活させ
た。次にその１／４量を用いリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ
中でＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量２０
μｌで一晩結合させた。次いでこの反応混液１０μｌを
用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミ
ドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得た。
【００８３】 ｐＡ６０Ｘ９９の作製（アデノウイル
ス以外のＸｂａＩ部位を除去する） ｐＡ６０Ｘ９９Ｘ（５μｇ）をＸｂａＩ（１０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系５０μｌ中で５分間反応させ、反応混
液をアガロースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位
のうち１ヶ所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮ
Ａ断片を回収した。次に、この断片０．２μｇをＫｌｅ
ｎｏｗ酵素（宝酒造製）５ｕｎｉｔを含む反応系５０μ
ｌ中で反応させ両末端を平滑化し、さらに、これの１／
５量、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量２０μｌ）中で一晩結合させた。次いでこの
反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し
た。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩおよびＸｂ
ａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片を生じる、すなわ
ち図１の構造を有するプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図
３）を得た。
ス以外のＸｂａＩ部位を除去する） ｐＡ６０Ｘ９９Ｘ（５μｇ）をＸｂａＩ（１０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系５０μｌ中で５分間反応させ、反応混
液をアガロースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位
のうち１ヶ所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮ
Ａ断片を回収した。次に、この断片０．２μｇをＫｌｅ
ｎｏｗ酵素（宝酒造製）５ｕｎｉｔを含む反応系５０μ
ｌ中で反応させ両末端を平滑化し、さらに、これの１／
５量、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量２０μｌ）中で一晩結合させた。次いでこの
反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し
た。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩおよびＸｂ
ａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片を生じる、すなわ
ち図１の構造を有するプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図
３）を得た。
【００８４】 ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の作製（ＢｓｒＧ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（３０μｇ）をＸｈｏｌ（１５０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１２５μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）１２ｕｎｉｔを含む
反応系中で両末端を平滑化し、その後フェノール：クロ
ロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱し
た。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液
（ＴＥ）６０μｌに溶解した。次に、これの１／２量と
５’末端リン酸化ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）０．２
μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ
反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させた。次
に、熱処理（７０℃、１５分間）によりリガーゼを失活
させた後、Ａｓｐ７１８（１００ｕｎｉｔ）を含む反応
系８０μｌ中で消化した。反応混液をアガロースゲル電
気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含む
ゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を
回収した。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（３０μｇ）をＸｈｏｌ（１５０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１２５μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）１２ｕｎｉｔを含む
反応系中で両末端を平滑化し、その後フェノール：クロ
ロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱し
た。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液
（ＴＥ）６０μｌに溶解した。次に、これの１／２量と
５’末端リン酸化ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）０．２
μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ
反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させた。次
に、熱処理（７０℃、１５分間）によりリガーゼを失活
させた後、Ａｓｐ７１８（１００ｕｎｉｔ）を含む反応
系８０μｌ中で消化した。反応混液をアガロースゲル電
気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含む
ゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を
回収した。
【００８５】なお、上記のｐＵＬＬ２ｒは以下のように
して調製した。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得た。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
して調製した。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得た。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
【００８６】一方、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９（１０μ
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量２５μｌ）中で
一晩結合させた。これの１／２量に滅菌水、ＢｓｒＧＩ
反応ｂｕｆｆｅｒを加えて１８μｌとしてから、７０℃
で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱
失活させた。さらに、２０ｕｎｉｔのＢｓｒＧＩを加え
（最終容量２０μｌ）３７℃で１時間反応させることに
よりセルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ６０Ｘ
９９を切断した。次いでこの反応混液１０μｌを用いて
大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製した。
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量２５μｌ）中で
一晩結合させた。これの１／２量に滅菌水、ＢｓｒＧＩ
反応ｂｕｆｆｅｒを加えて１８μｌとしてから、７０℃
で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱
失活させた。さらに、２０ｕｎｉｔのＢｓｒＧＩを加え
（最終容量２０μｌ）３７℃で１時間反応させることに
よりセルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ６０Ｘ
９９を切断した。次いでこの反応混液１０μｌを用いて
大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製した。
【００８７】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得し
た。
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得し
た。
【００８８】 ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の作製（Ｘｂａ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（２０μｇ）をＸｈｏＩ（１００ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）８ｕｎｉｔを含む反
応系において両末端を平滑化し、その後フェノール：ク
ロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱
した。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ３０μｌに
溶解した。これの全量と５’末端リン酸化ＳｐｅＩリン
カー（宝酒造製）０．４μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結
合させ、７０℃で１０分間インキュベートすることによ
りリガーゼを熱失活させた。さらに、ＳｐｅＩ（５４ｕ
ｎｉｔ）を加え消化した後、反応混液をアガロースゲル
電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含
むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片
を回収した。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（２０μｇ）をＸｈｏＩ（１００ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）８ｕｎｉｔを含む反
応系において両末端を平滑化し、その後フェノール：ク
ロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱
した。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ３０μｌに
溶解した。これの全量と５’末端リン酸化ＳｐｅＩリン
カー（宝酒造製）０．４μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結
合させ、７０℃で１０分間インキュベートすることによ
りリガーゼを熱失活させた。さらに、ＳｐｅＩ（５４ｕ
ｎｉｔ）を加え消化した後、反応混液をアガロースゲル
電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含
むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片
を回収した。
【００８９】一方、ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（１０μｇ）
を、ＸｂａＩ（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ
において切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳
動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡを回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含む反応液（最終容量１６μｌ）中で一晩結合
させた。これに５倍希釈したＴＥ１４μｌを加え、７０
℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを
熱失活させた。次いでこれの１／４量に２０ｕｎｉｔの
ＸｂａＩを添加し（最終容量２０μｌ）、セルフアニー
リングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を切断し
た。この反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製した。
を、ＸｂａＩ（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ
において切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳
動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡを回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含む反応液（最終容量１６μｌ）中で一晩結合
させた。これに５倍希釈したＴＥ１４μｌを加え、７０
℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを
熱失活させた。次いでこれの１／４量に２０ｕｎｉｔの
ＸｂａＩを添加し（最終容量２０μｌ）、セルフアニー
リングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を切断し
た。この反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製した。
【００９０】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得した。
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得した。
【００９１】 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔ（１０μｇ）を、Ｃｓｐ４５Ｉ
（４０ｕｎｉｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断し、
次いで、同反応液中にＢａｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）、さ
らにＥｃｏＲＩ（４０ｕｎｉｔ）を順次添加した。２１
ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によ
りゲルからＤＮＡ断片を回収した。なお、Ｃｓｐ４５１
およびＥｃｏＲＩによる切断は２１ｋｂのＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片を回収する際、他の断片が混入するのを防ぐた
めである。
（４０ｕｎｉｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断し、
次いで、同反応液中にＢａｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）、さ
らにＥｃｏＲＩ（４０ｕｎｉｔ）を順次添加した。２１
ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によ
りゲルからＤＮＡ断片を回収した。なお、Ｃｓｐ４５１
およびＥｃｏＲＩによる切断は２１ｋｂのＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片を回収する際、他の断片が混入するのを防ぐた
めである。
【００９２】ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（５μｇ）を、Ｂａ
ｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断
した後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過した。回収したＤＮＡ断片０．５μｇと前
述の２１ｋｂのＤＮＡ断片０．５μｇ、ＡＴＰおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中
で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートす
ることによりリガーゼを熱失活させた後、１μｌをイン
・ビトロ・パッケージングに用いた。
ｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断
した後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過した。回収したＤＮＡ断片０．５μｇと前
述の２１ｋｂのＤＮＡ断片０．５μｇ、ＡＴＰおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中
で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートす
ることによりリガーゼを熱失活させた後、１μｌをイン
・ビトロ・パッケージングに用いた。
【００９３】即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージ
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍
結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパ
ッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなっ
たコスミドをある程度選択することができる。本実験で
は、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含ん
でおり、目的のクローン（ウイルスゲノムが正しく連結
されたクローン）を容易に得ることができた。コスミド
の扱い方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：
７：183-187, 1989)に従って行った。
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍
結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパ
ッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなっ
たコスミドをある程度選択することができる。本実験で
は、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含ん
でおり、目的のクローン（ウイルスゲノムが正しく連結
されたクローン）を容易に得ることができた。コスミド
の扱い方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：
７：183-187, 1989)に従って行った。
【００９４】パッケージングされたコスミドを大腸菌Ｄ
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に感染させた。即ち、３枚
のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌの
Ａｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／
２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制
限酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの
割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍ
ｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮ
Ａを調製した。次に、各コロニーから調製したコスミド
ＤＮＡの構造をＤｒａＩ切断により確認した。目的とす
る方向に挿入された場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合１．４ｋｂの断片を生じる。これにより目的とす
るカセットコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得
した。
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に感染させた。即ち、３枚
のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌの
Ａｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／
２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制
限酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの
割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍ
ｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮ
Ａを調製した。次に、各コロニーから調製したコスミド
ＤＮＡの構造をＤｒａＩ切断により確認した。目的とす
る方向に挿入された場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合１．４ｋｂの断片を生じる。これにより目的とす
るカセットコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得
した。
【００９５】実施例３ （アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体（Ａｄ５ ｄ
ｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ
ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製） アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５
ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）にまた
Ａｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染
させ、培養を行った。即ち、Ａｄ５−ｄｌＸまたはＡｄ
ｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／
ｍｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、は
がれた細胞を遠心分離により集めた。アデノウイルス粒
子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいる
ので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。
（以下の操作は非無菌的に行う。）
ｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ
ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製） アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５
ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）にまた
Ａｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染
させ、培養を行った。即ち、Ａｄ５−ｄｌＸまたはＡｄ
ｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／
ｍｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、は
がれた細胞を遠心分離により集めた。アデノウイルス粒
子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいる
ので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。
（以下の操作は非無菌的に行う。）
【００９６】 得られた細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）に懸濁し、密封型ソニケーターを用いて細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。 得られた破砕物を遠心分離により沈澱を除いた後、
超遠心分離機 ＳＷ２８チューブに塩化セシウム溶液
（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッ
ション遠心による濃縮を行った。
Ｈ８．０）に懸濁し、密封型ソニケーターを用いて細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。 得られた破砕物を遠心分離により沈澱を除いた後、
超遠心分離機 ＳＷ２８チューブに塩化セシウム溶液
（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッ
ション遠心による濃縮を行った。
【００９７】 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１
チューブに移した。界面直下のウイルス層は通常目視で
き、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取
した。同時にもう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３
４）を満たした。これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩
超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取
し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、
３５ｋｒｐｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
チューブに移した。界面直下のウイルス層は通常目視で
き、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取
した。同時にもう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３
４）を満たした。これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩
超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取
し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、
３５ｋｒｐｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
【００９８】 白いウイルスのバンドを分取し、等量
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を
受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を
受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。
【００９９】 上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認する。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
た。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸおよびＡｄ
ｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣの量をＯＤ260
から通常のＤＮＡと同様に算出した。 得られたＡｄ５ｄｌＸおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａ
ｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ステップの組換えアデノ
ウイルス作成のため、充分量のＡｇｅＩで２時間切断
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムでゲル濾過後、−
８０℃に保存した。
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認する。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
た。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸおよびＡｄ
ｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣの量をＯＤ260
から通常のＤＮＡと同様に算出した。 得られたＡｄ５ｄｌＸおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａ
ｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ステップの組換えアデノ
ウイルス作成のため、充分量のＡｇｅＩで２時間切断
し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムでゲル濾過後、−
８０℃に保存した。
【０１００】なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできない。濃縮法は塩化セシウム
平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。１０
Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ−Ｔ
ＰＣを得ることができた。 一部を分取し、泳動用ＢＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０
μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白
を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル
電気泳動で分離し、完全切断を確認した。ＡｇｅＩ切断
ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル
濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存した。
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできない。濃縮法は塩化セシウム
平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。１０
Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ−Ｔ
ＰＣを得ることができた。 一部を分取し、泳動用ＢＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０
μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白
を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル
電気泳動で分離し、完全切断を確認した。ＡｇｅＩ切断
ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル
濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存した。
【０１０１】実施例４ （ｌｏｘＰ挿入組み換えアデノウイルス（Ａｄ５ｄｌＸ
２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ）の作
製）なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端
にＳＶ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコス
ミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡ
ｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたは
ＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ
−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシ
ア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カ
ルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシ
ャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続
けた。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交
換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０
倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が
各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１
０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播い
た。
２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ）の作
製）なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端
にＳＶ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコス
ミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡ
ｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたは
ＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ
−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシ
ア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カ
ルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシ
ャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続
けた。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交
換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０
倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が
各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１
０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播い
た。
【０１０２】 ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエ
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９
３細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れた。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存した。 １５〜２５日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心分離して
得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−
８０℃に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエ
ルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからで
ある。
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９
３細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れた。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存した。 １５〜２５日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心分離して
得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−
８０℃に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエ
ルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからで
ある。
【０１０３】 ２４穴プレートに２９３細胞を用意
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００
ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０
℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス株の
セルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮ
Ａを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell DNA
用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDT
A)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10
%SDSを加えた。
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００
ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０
℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス株の
セルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮ
Ａを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell DNA
用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDT
A)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10
%SDSを加えた。
【０１０４】 ５０℃で１時間処理した後、フェノー
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があ
るので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示す
クローンを選択する。説明できないバンドが薄く見える
クローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があ
るので廃棄した。
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があ
るので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示す
クローンを選択する。説明できないバンドが薄く見える
クローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があ
るので廃棄した。
【０１０５】実施例５ （Ｅ２Ａ遺伝子欠損アデノウイルスの作製と構造確認）
組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃ
ＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１
０および３で２９３細胞に感染させ、培養を行った。な
お、ＮＣｒｅは、ＮＬａｃＺと同様、ＳＶ４０の核移行
シグナルをＣｒｅのＮ末端に付加したものである。４日
目に細胞を回収し、前述の方法によりＤＮＡを調製し
た。ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が
切り出された構造を有するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａ
ｃＺの生成を２つの方法で確認した。
組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃ
ＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１
０および３で２９３細胞に感染させ、培養を行った。な
お、ＮＣｒｅは、ＮＬａｃＺと同様、ＳＶ４０の核移行
シグナルをＣｒｅのＮ末端に付加したものである。４日
目に細胞を回収し、前述の方法によりＤＮＡを調製し
た。ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が
切り出された構造を有するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａ
ｃＺの生成を２つの方法で確認した。
【０１０６】１．ＳｍａＩ消化 ＳｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動した結果、ｌｏｘＰで
挟まれた領域が切り出されて生じる４．７ｋｂの断片が
認められた。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａ
ｃＺ、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅ、およびＡｄｅｘｄ１２
３ＣＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋ
ｂのバンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウ
イルス中の約３０％がＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺ
であることが分かった。
挟まれた領域が切り出されて生じる４．７ｋｂの断片が
認められた。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａ
ｃＺ、Ａｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅ、およびＡｄｅｘｄ１２
３ＣＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋ
ｂのバンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウ
イルス中の約３０％がＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺ
であることが分かった。
【０１０７】２．ＰＣＲによる確認 調製したＤＮＡ０．１ｎｇをテンプレートとし、下記の
条件でＰＣＲを行い、生成物をアガロースゲル電気泳動
により分析した。用いたプライマーは、下記に示すオリ
ゴヌクレオチド（１）（配列番号：５）、オリゴヌクレ
オチド（２）（配列番号：６）、オリゴヌクレオチド
（３）（配列番号：７）およびオリゴヌクレオチド
（４）（配列番号：８）である。 (1) 5'−ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣ
ＣＣＡＧＧＴＡＣＡ−3' (2) 5'−ＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＣＧ
ＧＣＡＡＧ−3' (3) 5'−ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧ
−3' (4) 5'−ＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴ
ＧＣＡＡＧＴＴＡＡＣ−3' ＰＣＲ反応液組成（総容量２０μｌ） Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ ｍＭ ＫＣｌ ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ｄＮＴＰ mixture ０．２ｍＭ プライマー 各０．２μＭ テンプレートＤＮＡ ０．１ｎｇ Ｔａｑ polymerase ０．５ｕｎｉｔ ＰＣＲ反応条件 二本鎖解離 ： ９５℃ １．５分 アニーリング： ６４℃ １．０分 伸長反応 ： ７０℃ １．０分 反応サイクル： ３０回 その結果を図６に示す。プライマーとして（１）と
（４）を用いた場合、３９３ｂｐと推定されるバンドが
検出され、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失したＡｄｅｘｄ１２３Ｃ
ＡＮＬａｃＺの存在が明らかとなった（図６、レーン
１）。また、（２）と（３）を用いた場合、２２１ｂｐ
と推定されるバンドが検出され、Ｃｒｅ遺伝子産物によ
り切り出された環状のＥ２Ａ遺伝子の存在が裏付けられ
た（図６、レーン２）。以上、１および２の結果から、
Ａｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺからｌｏｘＰではさま
れた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が除去されたＡｄｅｘ
ｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの生成が明らかになった。
条件でＰＣＲを行い、生成物をアガロースゲル電気泳動
により分析した。用いたプライマーは、下記に示すオリ
ゴヌクレオチド（１）（配列番号：５）、オリゴヌクレ
オチド（２）（配列番号：６）、オリゴヌクレオチド
（３）（配列番号：７）およびオリゴヌクレオチド
（４）（配列番号：８）である。 (1) 5'−ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣ
ＣＣＡＧＧＴＡＣＡ−3' (2) 5'−ＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＣＡＧＡＣＧ
ＧＣＡＡＧ−3' (3) 5'−ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧ
−3' (4) 5'−ＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴ
ＧＣＡＡＧＴＴＡＡＣ−3' ＰＣＲ反応液組成（総容量２０μｌ） Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ ｍＭ ＫＣｌ ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ｄＮＴＰ mixture ０．２ｍＭ プライマー 各０．２μＭ テンプレートＤＮＡ ０．１ｎｇ Ｔａｑ polymerase ０．５ｕｎｉｔ ＰＣＲ反応条件 二本鎖解離 ： ９５℃ １．５分 アニーリング： ６４℃ １．０分 伸長反応 ： ７０℃ １．０分 反応サイクル： ３０回 その結果を図６に示す。プライマーとして（１）と
（４）を用いた場合、３９３ｂｐと推定されるバンドが
検出され、Ｅ２Ａ遺伝子が欠失したＡｄｅｘｄ１２３Ｃ
ＡＮＬａｃＺの存在が明らかとなった（図６、レーン
１）。また、（２）と（３）を用いた場合、２２１ｂｐ
と推定されるバンドが検出され、Ｃｒｅ遺伝子産物によ
り切り出された環状のＥ２Ａ遺伝子の存在が裏付けられ
た（図６、レーン２）。以上、１および２の結果から、
Ａｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺからｌｏｘＰではさま
れた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が除去されたＡｄｅｘ
ｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの生成が明らかになった。
【０１０８】参考例１ ＜リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびＣＡＧプロモータ
ーを有する組換えアデノウイルスベクターの作製＞ （１）リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現用カセットコス
ミドの作製 リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む大腸菌ファージ
Ｐ１ＤＮＡ（ＡＴＣＣ１１３０３−Ｂ２３）をテンプレ
ートとし、５’−プライマーとして下記の（配列番号：
９）のオリゴヌクレオチドを、３’−プライマーとして
下記の（配列番号：１０）のオリゴヌクレオチドを、耐
熱性ポリメラーゼとしてＮＥＢ社製のＶｅｎｔR を用
い、以下の条件でＰＣＲ反応を行い、生成物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１ｋｂのバンドを切り出し、
リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。 5'-CGT CTGCAG TGCA TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3' PstI BspHI 3'-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT TCGCGAGATCT CGG-5' Aor51HI;XbaI （下線部分は、制限酵素の認識部位である。）
ーを有する組換えアデノウイルスベクターの作製＞ （１）リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現用カセットコス
ミドの作製 リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む大腸菌ファージ
Ｐ１ＤＮＡ（ＡＴＣＣ１１３０３−Ｂ２３）をテンプレ
ートとし、５’−プライマーとして下記の（配列番号：
９）のオリゴヌクレオチドを、３’−プライマーとして
下記の（配列番号：１０）のオリゴヌクレオチドを、耐
熱性ポリメラーゼとしてＮＥＢ社製のＶｅｎｔR を用
い、以下の条件でＰＣＲ反応を行い、生成物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ、約１ｋｂのバンドを切り出し、
リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。 5'-CGT CTGCAG TGCA TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3' PstI BspHI 3'-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT TCGCGAGATCT CGG-5' Aor51HI;XbaI （下線部分は、制限酵素の認識部位である。）
【０１０９】ＰＣＲ反応条件 緩衝液： １０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、
２ｍＭのＭｇＳＯ4 、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００（ＮＥＢ社添付の緩衝液を使用） 耐熱性ポリメラーゼ： ２ユニット ｄＮＴＰ： ４００μＭ プライマー： １μＭ Ｐ１ファージＤＮＡ： １ｎｇ ２本鎖解離温度： ９５℃ １．５分間 アニーリング温度： ６０℃ １．５分間 伸長反応温度： ７４℃ ２．０分間 反応サイクル： ２０回
Ｃｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、
２ｍＭのＭｇＳＯ4 、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００（ＮＥＢ社添付の緩衝液を使用） 耐熱性ポリメラーゼ： ２ユニット ｄＮＴＰ： ４００μＭ プライマー： １μＭ Ｐ１ファージＤＮＡ： １ｎｇ ２本鎖解離温度： ９５℃ １．５分間 アニーリング温度： ６０℃ １．５分間 伸長反応温度： ７４℃ ２．０分間 反応サイクル： ２０回
【０１１０】この断片およびｐＵＣ１９（宝酒造製）を
それぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ
（宝酒造製）により同時消化したのち、回収し、モル比
が約３：１になるように混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造製）を用いてligation反応を行った。さらに、
この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５
３３２３）を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ
／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換株を
拾い、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含むプラスミドｐ
ＵＣＣｒｅを得た。
それぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ
（宝酒造製）により同時消化したのち、回収し、モル比
が約３：１になるように混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造製）を用いてligation反応を行った。さらに、
この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５
３３２３）を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ
／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換株を
拾い、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含むプラスミドｐ
ＵＣＣｒｅを得た。
【０１１１】次に、ＣＡＧプロモーターを含むカセット
コスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔをＳｗａＩで切断したも
の１μｇと、ｐＵＣＣｒｅをＰｓｔＩおよびＸｂａＩに
より同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）
により両端を平滑化して得た約１ｋｂの断片０．１μｇ
とを混合した。
コスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔをＳｗａＩで切断したも
の１μｇと、ｐＵＣＣｒｅをＰｓｔＩおよびＸｂａＩに
より同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）
により両端を平滑化して得た約１ｋｂの断片０．１μｇ
とを混合した。
【０１１２】 次に、混合液にエタノールを加えてコ
スミドを沈澱させた。沈澱物を遠心分離により取得し、
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴ
Ａを添加した溶液（ＴＥ）の５倍希釈液に溶解した。 得られたコスミドをリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中で
ＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量７μｌで
一晩結合させた。ついで滅菌水、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆ
ｅｒを加えて４８μｌとしてから７０℃１０分でリガー
ゼを熱失活させた。この際、プラズミドと異なり、コス
ミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合した巨大
分子が効率よくパッケージされる。
スミドを沈澱させた。沈澱物を遠心分離により取得し、
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴ
Ａを添加した溶液（ＴＥ）の５倍希釈液に溶解した。 得られたコスミドをリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中で
ＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量７μｌで
一晩結合させた。ついで滅菌水、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆ
ｅｒを加えて４８μｌとしてから７０℃１０分でリガー
ゼを熱失活させた。この際、プラズミドと異なり、コス
ミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合した巨大
分子が効率よくパッケージされる。
【０１１３】 ２μｌのＳｗａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ製）を加え、２５℃で１時間切断した。ＳｗａＩ切
断を行う意味は、カセットコスミドが発現ユニットをく
わえ込むことなく再結合するとＳｗａｌ認識配列が再生
されるため、このステップで発現ユニットの組み込まれ
ていないコスミドを再切断し、コロニーを作らなくする
ためである。この方法はインサートをもつカセットコス
ミドだけを選択する強力な方法である。 常法（Molecular Cloning vol.3 E.34）に従い、カ
セットコスミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲ
ル濾過を行った。 再度、Ｓｗａｌ切断を行った。即ち、ＳｗａＩ反応
ｂｕｆｆｅｒ中、５μｌのＳｗａＩを加え、２５℃で２
時間切断した。その理由は上記の通りである。
ｅｒ製）を加え、２５℃で１時間切断した。ＳｗａＩ切
断を行う意味は、カセットコスミドが発現ユニットをく
わえ込むことなく再結合するとＳｗａｌ認識配列が再生
されるため、このステップで発現ユニットの組み込まれ
ていないコスミドを再切断し、コロニーを作らなくする
ためである。この方法はインサートをもつカセットコス
ミドだけを選択する強力な方法である。 常法（Molecular Cloning vol.3 E.34）に従い、カ
セットコスミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲ
ル濾過を行った。 再度、Ｓｗａｌ切断を行った。即ち、ＳｗａＩ反応
ｂｕｆｆｅｒ中、５μｌのＳｗａＩを加え、２５℃で２
時間切断した。その理由は上記の通りである。
【０１１４】 得られたコスミドの１μｌについてイ
ン・ビトロ・パッケージングを行った。即ち、ラムダ・
イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバック
ＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を１／４スケールで用
い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４２
ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサ
ートが入って大きくなったコスミドをある程度選択する
ことができる。本実験では、１０個のコロニーを拾えば
大半はインサートを含んでおり、目的の向き（左向き）
のクローンを容易に得ることができた。コスミドの扱い
方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：183-
187, 1989)に従って行った。
ン・ビトロ・パッケージングを行った。即ち、ラムダ・
イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバック
ＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を１／４スケールで用
い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４２
ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサ
ートが入って大きくなったコスミドをある程度選択する
ことができる。本実験では、１０個のコロニーを拾えば
大半はインサートを含んでおり、目的の向き（左向き）
のクローンを容易に得ることができた。コスミドの扱い
方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：183-
187, 1989)に従って行った。
【０１１５】 パッケージングされたコスミドを大腸
菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）に感染させた。即ち、
３枚のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍ
ｌのＡｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、
１／２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養し
た。ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製
し、全酵素切断によりインサートが入ったものの割合を
調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍｌのＡ
ｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調
製した。 次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと
構造を確認した。なお、ＮｒｕＩとリガーゼを用いて、
発現単位を含むが大部分のアデノウイルスＤＮＡを欠失
したプラスミドを作製し、ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡ
クローン化の最終確認をした。
菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）に感染させた。即ち、
３枚のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍ
ｌのＡｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、
１／２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養し
た。ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製
し、全酵素切断によりインサートが入ったものの割合を
調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍｌのＡ
ｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調
製した。 次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと
構造を確認した。なお、ＮｒｕＩとリガーゼを用いて、
発現単位を含むが大部分のアデノウイルスＤＮＡを欠失
したプラスミドを作製し、ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡ
クローン化の最終確認をした。
【０１１６】（２）アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複
合体（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))を用いた。Ａｄ５ ｄｌＸを２９３細胞（Ｒｏｕｘ
１０本分）に感染させ、培養を行った。即ち、Ａｄ５
−ｄｌＸのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍｌ）を０．
２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細胞を
１５００ｒｐｍ、５分にて遠心分離して集めた。アデノ
ウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の
核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点
がある。（以下の操作は非無菌的に行った。）
合体（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ
（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (19
85))を用いた。Ａｄ５ ｄｌＸを２９３細胞（Ｒｏｕｘ
１０本分）に感染させ、培養を行った。即ち、Ａｄ５
−ｄｌＸのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍｌ）を０．
２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細胞を
１５００ｒｐｍ、５分にて遠心分離して集めた。アデノ
ウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の
核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点
がある。（以下の操作は非無菌的に行った。）
【０１１７】 得られた細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の２０ｍｌに懸濁し、密封型ソニ
ケーターを用い、２００Ｗ、２分（３０秒×４）で細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。ウイルス
を細胞内から放出させるには５ｍｌ以下なら凍結融解５
回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利
である。ただし、必ず密封型（専用カップのあるもの）
を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネッ
トの中でも危険性がある。
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の２０ｍｌに懸濁し、密封型ソニ
ケーターを用い、２００Ｗ、２分（３０秒×４）で細胞
を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。ウイルス
を細胞内から放出させるには５ｍｌ以下なら凍結融解５
回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利
である。ただし、必ず密封型（専用カップのあるもの）
を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネッ
トの中でも危険性がある。
【０１１８】 得られた破砕物を遠心分離（１０ｋｒ
ｐｍ、１０分）により沈澱を除いた後、超遠心機 ＳＷ
２８チューブに１５ｍｌの塩化セシウム溶液（比重１．
４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心
（２５ｋｒｐｍ、１時間、４℃）による濃縮を行った。 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移
した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス
層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時に
もう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たし
た。これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけ
た。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配
ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐ
ｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
ｐｍ、１０分）により沈澱を除いた後、超遠心機 ＳＷ
２８チューブに１５ｍｌの塩化セシウム溶液（比重１．
４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心
（２５ｋｒｐｍ、１時間、４℃）による濃縮を行った。 界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移
した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス
層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時に
もう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たし
た。これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけ
た。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配
ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐ
ｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
【０１１９】 白いウイルスのバンドを分取し、等量
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を
受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。エチジウ
ムブロミドは後で除く方法が確立されていないため利用
できなかった。
の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニ
ジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満
たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を
受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。エチジウ
ムブロミドは後で除く方法が確立されていないため利用
できなかった。
【０１２０】 上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認した。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
た。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−
ＴＰＣの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出し
た。
５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その
１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液
２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有
無を確認した。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集め
た。 ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃
に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−
ＴＰＣの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出し
た。
【０１２１】 得られたＡｄ５ｄ１Ｘ ＤＮＡ−ＴＰ
Ｃを、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のた
め、充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで２時間切断した後、−８
０℃に保存した。
Ｃを、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のた
め、充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで２時間切断した後、−８
０℃に保存した。
【０１２２】なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシ
ウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。
１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ
−ＴＰＣを得ることができた。 一部を分取し、泳動用ＢＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０
μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白
を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル
電気泳動で分離し、完全切断を確認した。ＥｃｏＴ２２
Ｉ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠
心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存し
た。
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシ
ウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。
１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ
−ＴＰＣを得ることができた。 一部を分取し、泳動用ＢＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０
μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ
／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白
を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル
電気泳動で分離し、完全切断を確認した。ＥｃｏＴ２２
Ｉ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠
心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存し
た。
【０１２３】（３）組換えウイルスの分離と高力価ウイ
ルス液の作製 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｐＡｄｅｘ１ｗ ＤＮＡ
の８μｇ（３〜９μｇが適当である）とＥｃｏＴ２２Ｉ
で切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混
合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用い
て、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトラン
スフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウム
の上から混合液を滴下し、培養を続けた。一晩培養（約
１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラー
ゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希
釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり
０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく
違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２
９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。
ルス液の作製 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｐＡｄｅｘ１ｗ ＤＮＡ
の８μｇ（３〜９μｇが適当である）とＥｃｏＴ２２Ｉ
で切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混
合し、セルフェクト（ファルマシア製）キットを用い
て、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトラン
スフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウム
の上から混合液を滴下し、培養を続けた。一晩培養（約
１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラー
ゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希
釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり
０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく
違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２
９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。
【０１２４】 ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエ
ルに５０μｌの５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９３
細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し細
胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れた。ウエル
の細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペット
で培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチューブ
に無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃に
保存した。 １５〜１８日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、凍結融解６回後、５ｋｒｐｍ１０分遠心して得られ
た上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃
に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエルは複
数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
ルに５０μｌの５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９３
細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し細
胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れた。ウエル
の細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペット
で培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチューブ
に無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃に
保存した。 １５〜１８日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、凍結融解６回後、５ｋｒｐｍ１０分遠心して得られ
た上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃
に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエルは複
数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
【０１２５】 ２４穴プレートに２９３細胞を用意
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に６回の凍結融解と遠心で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。２次ウイルス液の力価は１０7 〜１０8
ＰＦＵ／ｍｌ程度であった。他の１ウエルの死滅した細
胞を５ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけ
を−８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイ
ルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞
の全ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌの
cell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10
mMEDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μ
ｌの10%SDSを加えた。
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に６回の凍結融解と遠心で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。２次ウイルス液の力価は１０7 〜１０8
ＰＦＵ／ｍｌ程度であった。他の１ウエルの死滅した細
胞を５ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけ
を−８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイ
ルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞
の全ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌの
cell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10
mMEDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μ
ｌの10%SDSを加えた。
【０１２６】 ５０℃で１時間処理した後、フェノー
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノム
の左端までのバンドが正確に出現しているものを選択し
た。また、説明できないバンドが薄く見えるクローン
は、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃
棄した。アデノウイルスＤＮＡは細胞あたり１０，００
０コピーに増殖するので、細胞ＤＮＡと一緒に全ＤＮＡ
を抽出し制限酵素切断によりウイルスＤＮＡのバンドを
みることができる。Ｘｈｏｌなどのように認識配列にＣ
Ｇを含む酵素は、細胞ＤＮＡを切断しないので、パター
ンが見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染
２９３細胞ＤＮＡをコントロールにおくことが必要であ
った。（ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現し
た）。
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノム
の左端までのバンドが正確に出現しているものを選択し
た。また、説明できないバンドが薄く見えるクローン
は、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃
棄した。アデノウイルスＤＮＡは細胞あたり１０，００
０コピーに増殖するので、細胞ＤＮＡと一緒に全ＤＮＡ
を抽出し制限酵素切断によりウイルスＤＮＡのバンドを
みることができる。Ｘｈｏｌなどのように認識配列にＣ
Ｇを含む酵素は、細胞ＤＮＡを切断しないので、パター
ンが見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染
２９３細胞ＤＮＡをコントロールにおくことが必要であ
った。（ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現し
た）。
【０１２７】 Ｘｈｏｌ切断で同定された目的のウイ
ルス株の２次ウイルス液の０．１ｍｌを、コラーゲンコ
ートした１５０ｃｍ2 ボトル（培地は２５ｍｌ）の２９
３細胞へ感染させた。３日後に細胞が死滅したら、死細
胞ごと２５ｍｌの培地を無菌的に密閉型ソニケーター２
００ｗ最高出力２分（３０秒×４回）で破砕してウイル
スを遊離させた。３ｋｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して
沈澱を除去し、５ｍｌ凍結用チューブに２ｍｌずつ１３
本に分注し、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存
し、３次ウイルス液を調製した。３次ウイルス液は本発
明の組換えアデノウイルスを含む液であり、１０9 ＰＦ
Ｕ／ｍｌ程度の高力価のものであった。なお、３次ウイ
ルス液５μｌを２４穴プレートの２９３細胞１ウエルに
感染し、増殖したウイルスＤＮＡの酵素切断パターンを
上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親
ウイルスとの混合物であることが疑われたら、２次ウイ
ルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルス
が増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての
３次シードを廃棄して、別の２次ウイルス液から改めて
やり直すか、その１次ウイルス液から限界希釈法によ
り、目的のウイルスを純化した。
ルス株の２次ウイルス液の０．１ｍｌを、コラーゲンコ
ートした１５０ｃｍ2 ボトル（培地は２５ｍｌ）の２９
３細胞へ感染させた。３日後に細胞が死滅したら、死細
胞ごと２５ｍｌの培地を無菌的に密閉型ソニケーター２
００ｗ最高出力２分（３０秒×４回）で破砕してウイル
スを遊離させた。３ｋｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して
沈澱を除去し、５ｍｌ凍結用チューブに２ｍｌずつ１３
本に分注し、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存
し、３次ウイルス液を調製した。３次ウイルス液は本発
明の組換えアデノウイルスを含む液であり、１０9 ＰＦ
Ｕ／ｍｌ程度の高力価のものであった。なお、３次ウイ
ルス液５μｌを２４穴プレートの２９３細胞１ウエルに
感染し、増殖したウイルスＤＮＡの酵素切断パターンを
上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親
ウイルスとの混合物であることが疑われたら、２次ウイ
ルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルス
が増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての
３次シードを廃棄して、別の２次ウイルス液から改めて
やり直すか、その１次ウイルス液から限界希釈法によ
り、目的のウイルスを純化した。
【０１２８】
【発明の効果】本発明により、広範な動物細胞に外来遺
伝子を安定な形で導入することのできる組換えＤＮＡウ
イルスを提供することができる。また、本発明はこの組
換えＤＮＡウイルスの簡易な製造方法を提供する。特
に、本発明の組換えアデノウイルスは遺伝病の治療に有
用である。
伝子を安定な形で導入することのできる組換えＤＮＡウ
イルスを提供することができる。また、本発明はこの組
換えＤＮＡウイルスの簡易な製造方法を提供する。特
に、本発明の組換えアデノウイルスは遺伝病の治療に有
用である。
【０１２９】
配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTAT 34
【０１３０】配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成された任意のＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGATTTAAAT CGATTGTCGA CTCGCGA 27
【０１３１】配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成された任意のＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATCGATTCTA GACTAGTTTA ATTAATTTAA ATCGAT 36
【０１３２】配列番号：４ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 52
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 52
【０１３３】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CAACTCCATG CTCAACAGTC CCCAGGTACA 30
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CAACTCCATG CTCAACAGTC CCCAGGTACA 30
【０１３４】配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GATTTTTAAA CGGCGCAGAC GGCAAG 26
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GATTTTTAAA CGGCGCAGAC GGCAAG 26
【０１３５】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTGAGCTTAG AAAACCCTTA G 21
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTGAGCTTAG AAAACCCTTA G 21
【０１３６】配列番号：８ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGATACCCCT TTTGCACTGG TGCAAGTTAA C 31
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGATACCCCT TTTGCACTGG TGCAAGTTAA C 31
【０１３７】配列番号：９ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC TGC 53
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC TGC 53
【０１３８】配列番号：１０ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAG 38
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAG 38
【０１３９】配列番号：１１ 配列の長さ：１１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT 60 ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT 119
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT 60 ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT 119
【０１４０】配列番号：１２ 配列の長さ：１１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA 60 GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT 115
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA 60 GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT 115
【図１】図１は、コスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの構造を示
す概念図である。
す概念図である。
【図２】図２は、コスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔの構造
を示す概念図である。
を示す概念図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９の構造を示
す概念図である。
す概念図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の構造
を示す概念図である。
を示す概念図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の構
造を示す概念図である。
造を示す概念図である。
【図６】図６は、組換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３
ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅを２９
３細胞に共感染させた後に回収した細胞からＤＮＡを抽
出し、これをテンプレートとしてＰＣＲを行った結果を
示す図である。レーン１はプライマー（１）と（４）を
用いた場合、レーン２はプライマー（２）と（３）を用
いた場合の電気泳動図をそれぞれ示す。
ＬＣＡＮＬａｃＺおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＣｒｅを２９
３細胞に共感染させた後に回収した細胞からＤＮＡを抽
出し、これをテンプレートとしてＰＣＲを行った結果を
示す図である。レーン１はプライマー（１）と（４）を
用いた場合、レーン２はプライマー（２）と（３）を用
いた場合の電気泳動図をそれぞれ示す。
Claims (36)
- 【請求項１】 外来遺伝子および外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターを有する、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完
全に欠失した、動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイル
ス。 - 【請求項２】 ＤＮＡウイルスがアデノウイルスである
請求項１記載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項３】 Ｅ２Ａ遺伝子領域の一部または全部を欠
失した請求項１または請求項２記載の組換えＤＮＡウイ
ルス。 - 【請求項４】 外来遺伝子および外来遺伝子の発現を制
御するプロモーターが左向きに組み込まれていることを
特徴とする請求項１ないし請求項３いずれか１項記載の
組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項５】 アデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領
域を含む１．３〜９．３％断片を欠失していることを特
徴とする請求項２ないし請求項４いずれか１項記載の組
換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項６】 Ｅ１Ａ遺伝子領域の欠失部位に外来遺伝
子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが挿
入されていることを特徴とする請求項５記載の組換えＤ
ＮＡウイルス。 - 【請求項７】 アデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺伝
子領域を含む７９．６〜８４．８％断片を欠失している
ことを特徴とする請求項６記載の組換えＤＮＡウイル
ス。 - 【請求項８】 外来遺伝子の発現を制御するプロモータ
ーが、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ
−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライ
シングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリ
ッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）であることを
特徴とする請求項１ないし請求項７いずれか１項記載の
組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項９】 Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に位置する同方
向を向いた二つのリコンビナーゼ認識配列を有する動物
細胞感染用の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１０】 ＤＮＡウイルスがアデノウイルスであ
る請求項９記載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１１】 二つのリコンビナーゼ認識配列の挿入
部位の一方が、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子
の終止コドンの間であって、両遺伝子のポリＡ付加シグ
ナルの機能を欠失しない範囲であることを特徴とする請
求項９又は１０記載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１２】 もう一方のリコンビナーゼ認識配列の
挿入部位が、アデノウイルスゲノムの７９．６〜８４．
４％の範囲であることを特徴とする請求項１１記載の組
換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１３】 リコンビナーゼが大腸菌Ｐ１ファージ
由来のリコンビナーゼＣｒｅである請求項９ないし請求
項１２いずれか記載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１４】 リコンビナーゼ認識配列がリコンビナ
ーゼＣｒｅの基質となる下記ｌｏｘＰのＤＮＡ配列（配
列番号：１） 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' 3'-TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA-5' である請求項９ないし請求項１３いずれか１項記載の組
換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１５】 外来遺伝子を有することを特徴とする
請求項９ないし請求項１４いずれか１項記載の組換えＤ
ＮＡウイルス。 - 【請求項１６】 外来遺伝子の発現を制御するプロモー
ターを有することを特徴とする請求項１５記載の組換え
ＤＮＡウイルス。 - 【請求項１７】 外来遺伝子および外来遺伝子の発現を
制御するプロモーターが左向きに組み込まれていること
を特徴とする請求項１６記載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１８】 アデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子
領域を含む１．３〜９．３％断片を欠失していることを
特徴とする請求項１０ないし請求項１７いずれか１項記
載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項１９】 Ｅ１Ａ遺伝子領域の欠失部位に外来遺
伝子および外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが
挿入されていることを特徴とする請求項１８記載の組換
えＤＮＡウイルス。 - 【請求項２０】 アデノウイルスゲノムがさらにＥ３遺
伝子領域を含む７９．６〜８４．８％断片を欠失してい
ることを特徴とする請求項１９記載の組換えＤＮＡウイ
ルス。 - 【請求項２１】 外来遺伝子の発現を制御するプロモー
ターが、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリ
β−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプラ
イシングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブ
リッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）であること
を特徴とする請求項１６ないし請求項２０いずれか１項
記載の組換えＤＮＡウイルス。 - 【請求項２２】 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子
およびポリＡ配列を組み込んだベクター（ａ）と、Ｅ２
Ａ遺伝子領域の両側に位置する同方向を向いた２つのリ
コンビナーゼ認識配列を有する組換えＤＮＡウイルス
（ｂ）とを、動物細胞株へ導入し、２つのリコンビナー
ゼ認識配列間に存するＥ２Ａ遺伝子領域を切除すること
からなる、Ｅ２Ａ遺伝子の機能が完全に欠失した組換え
ＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項２３】 ＤＮＡウイルス（ｂ）がアデノウイル
スである請求項２２記載の組換えＤＮＡウイルスの製造
方法。 - 【請求項２４】 さらにベクター（ａ）がアデノウイル
スである請求項２３記載の組換えＤＮＡウイルスの製造
方法。 - 【請求項２５】 ２つのリコンビナーゼ認識配列の挿入
部位の一方が、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝子
の終止コドンの間であって、両遺伝子のポリＡ付加シグ
ナルの機能を欠失しない範囲であることを特徴とする請
求項２２ないし請求項２４いずれか１項記載の組換えＤ
ＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項２６】 リコンビナーゼが大腸菌Ｐ１ファージ
由来のリコンビナーゼＣｒｅである請求項２２ないし請
求項２５いずれか１項記載の組換えＤＮＡウイルスの製
造方法。 - 【請求項２７】 リコンビナーゼ認識配列がリコンビナ
ーゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰのＤＮＡ配列（配列番
号：１）である請求項２２ないし請求項２６いずれか１
項記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項２８】 ＤＮＡウイルス（ｂ）が外来遺伝子を
有することを特徴とする請求項２２ないし請求項２７い
ずれか１項記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項２９】 ＤＮＡウイルス（ｂ）がさらに外来遺
伝子の発現を制御するプロモーターを有することを特徴
とする請求項２８記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方
法。 - 【請求項３０】 外来遺伝子および外来遺伝子の発現を
制御するプロモーターが左向きに組み込まれていること
を特徴とする請求項２９記載の組換えＤＮＡウイルスの
製造方法。 - 【請求項３１】 ベクター（ａ）およびＤＮＡウイルス
（ｂ）のアデノウイルスゲノムがＥ１Ａ遺伝子領域を含
む１．３〜９．３％断片を欠失していることを特徴とす
る請求項２４ないし請求項３０いずれか１項記載の組換
えＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項３２】 ＤＮＡウイルス（ｂ）のＥ１Ａ遺伝子
領域の欠失している部位に、外来遺伝子および外来遺伝
子の発現を制御するプロモーターが挿入されていること
を特徴とする請求項３１記載の組換えＤＮＡウイルスの
製造方法。 - 【請求項３３】 ＤＮＡウイルス（ｂ）のアデノウイル
スゲノムがさらにＥ３遺伝子領域を含む７９．６〜８
４．８％断片を欠失していることを特徴とする請求項３
２記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項３４】 外来遺伝子の発現を制御するプロモー
ターが、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリ
β−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプラ
イシングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブ
リッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）であること
を特徴とする請求項２９ないし請求項３３いずれか１項
記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項３５】 ベクター（ａ）およびＤＮＡウイルス
（ｂ）のＥ１Ａ遺伝子の機能が欠失され、動物細胞株が
Ｅ１Ａ遺伝子を発現している動物細胞株である、請求項
２２記載の組換えＤＮＡウイルスの製造方法。 - 【請求項３６】 Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンとＬ３遺伝
子の終止コドンの間に、外来遺伝子が挿入されたことを
特徴とする動物細胞感染用の組換えアデノウイルス。
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|---|---|---|---|
| JP27633595A JP3770333B2 (ja) | 1995-03-15 | 1995-09-29 | 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法 |
| CA002171368A CA2171368A1 (en) | 1995-03-15 | 1996-03-08 | Recombinant dna virus and method for preparation thereof |
| NZ286154A NZ286154A (en) | 1995-03-15 | 1996-03-11 | Recombinant dna virus bearing a foreign gene and a promoter for regulating expression of the gene where the function of e2a gene is deleted |
| US08/615,048 US5700470A (en) | 1995-03-15 | 1996-03-12 | Recombinant adenovirus with removed EZA gene and method of preparation |
| AU48031/96A AU704608B2 (en) | 1995-03-15 | 1996-03-13 | Recombinant DNA virus and method for preparation thereof |
| CN96107281A CN1141340A (zh) | 1995-03-15 | 1996-03-14 | 重组dna病毒和其制备方法 |
| KR1019960006901A KR960034419A (ko) | 1995-03-15 | 1996-03-14 | 재조합 dna 바이러스 및 이의 제조방법 |
| EP96301766A EP0732405A1 (en) | 1995-03-15 | 1996-03-14 | Recombinant DNA virus and method for preparation thereof |
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| JP7-84891 | 1995-03-15 | ||
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