JP4288259B2 - 動物細胞感染用の組換えdnaウイルスベクター - Google Patents
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アデノウイルスベクターは、種々の動物培養細胞で100%近い導入効率を示すこと、またレトロウイルスと異なり積極的な染色体組み込みの機構を持たないこと、さらに、休止期の細胞でも遺伝子導入出来るという利点もあり、外来遺伝子導入実験のベクターとしての応用範囲は極めて広く、近い将来は遺伝子治療の主要技術の一つとして確立するであろうと考えられている。
従って、本発明の目的は、アデノウイルスベクターによって動物細胞内に導入された外来遺伝子が、細胞内で自律複製可能な形に変換し得るような組換えアデノウイルスベクターの系を構築することにあり、さらに、かかる系を遺伝子治療用に提供することにある。
(1) プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリA配列を有する組換えアデノウイルスベクターを、アデノウイルスE1A遺伝子を発現する細胞に感染させ増殖させる工程を含む、動物細胞感染用の組換えアデノウイルスベクターの製造方法、
に関する。
本発明は、かかる知見に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったものである。
本発明における動物細胞感染用のDNAウイルスベクターは、アデノウイルスのように細胞に感染後染色体外でしか存在し得ないようなDNAウイルス由来のベクターであれば、特に制限されることなく用いることができる。例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、パポパウイルスベクター等が挙げられる。以下、リコンビナーゼ遺伝子又はリコンビナーゼ認識配列をもつ動物細胞感染用のDNAウイルスベクターの好適な例として、アデノウイルスベクターを用いて本発明を説明する。
また、本発明に用いられるアデノウイルスのゲノムは、E3領域も欠失させてもよい。特に、E3領域の79.6〜84.8%を欠失させたものが好ましい。アデノウイルスの複製には不要であるからである。
したがってE1A、E1B遺伝子を持続的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株(293細胞)を除き、宿主細胞内で増殖することができないという特徴を有する。
そこで、本発明では、かかる組換えアデノウイルス外来遺伝子として後述のリコンビナーゼ遺伝子を組み込んだ新規組換えアデノウイルスを作製し、他方、このリコンビナーゼの基質となる塩基配列(認識配列)2ヶ所に挟まれた目的の外来遺伝子を組み込んだ別の新規組換えアデノウイルスを作製し、これら両者を動物細胞に感染させ、リコンビナーゼ遺伝子の発現により生ずるリコンビナーゼの作用によって他方の組換えアデノウイルスを切断し、切り出された部分が環状分子となり、細胞内で自律複製できるように他方の組換えアデノウイルスを構築する。
これらの複製起点が本発明の組換えアデノウイルスベクターに組み込まれるのは、リコンビナーゼで切り出された環状分子が細胞内で自律複製できるようにするためである。
しかし、外来遺伝子、ポリA配列、複製起点およびプロモーターが上流からこの順に配向していてもよい。環状分子になれば上記の配列と同一になるからである。
リコンビナーゼ発現可能な本発明の組換えアデノウイルスベクターは細胞内で一定期間発現を続け、リコンビナーゼが産生される。そして、このリコンビナーゼは、共感染させた他方の組換えアデノウイルスベクターすなわち二つのリコンビナーゼ認識配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターに作用し、二つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれた部分を切り出し環状分子化する。この環状分子には動物細胞で働く複製起点が組み込まれているので、細胞内で自律複製する。従って、1回の共感染により、治療効果をほぼ永続的に持続させることができる。このように、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子治療に極めて有用性が高いと考えられる。
このような動物細胞としては、ヒトまたは哺乳動物の高度に分化した神経系、筋系、肝細胞から未分化な上皮細胞、繊維芽細胞に至る広範囲の細胞が挙げられる。
(1) まず、プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリA配列を有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法について説明する。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの作成は、前述のとおりウイルスゲノムの両端にタンパク質が共有結合しているため、一般に極めて困難である。
そこで本発明においては、以下の方法を用いる。リコンビナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼCre遺伝子を使用した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ遺伝子の場合もほぼ同様である。
(ii) 細胞工学、13、760−763(1994)に記載の方法により調製したCAGプロモーターを含むカセットコスミドpAdex1CAwtを制限酵素SwaI(Boehringer社製)で処理したものと、pUCCreを制限酵素PstI(宝酒造製)およびXbaI(宝酒造製)で同時消化したのちKlenow酵素(宝酒造製)で両端を平滑化したものとを混合する。ついでカセットコスミドを沈澱させ、T4 DNAリガーゼで結合させ、リコンビナーゼCre遺伝子を組み込んだカセットコスミドを得る。
(iii) 次に、得られたカセットコスミドを、ラムダ・インビトロ・パッケージングキットであるギガパックXL(Stratagene社)を用いて、インビトロ・パッケージングを行う。
こうして得られたAd5dlX DNA−TPCを次のステップの組換えアデノウイルス作製のため充分量のEcoT22Iで処理する。
(i) CAGプロモーターを含むプラスミドpCAGGS(Niwaら、Gene、108 、193-200 (1990)) のクローン化部位にSwaIリンカーを挿入することにより得たpCAWGをSwaIで切断し、アルカリホスファターゼで処理する。ついで目的の外来遺伝子とpCAWGを混合し、リガーゼで処理し、大腸菌DHI株(ATCC33849)を形質転換し、CAGプロモーターの制御下に発現し得る方向に外来遺伝子が挿入されたプラスミドを得る。
このプラスミドを、制限酵素NruIで切断し、アルカリホスファターゼで処理した後、(ii)で得られたプラスミドを制限酵素SalIおよびEcl136IIで同時消化し、平滑化して得られたDNA断片とリガーゼにより結合して、外来遺伝子発現ユニットおよびSV40の複製起点を含むDNA断片の両端にloxP部位を有する断片を含むプラスミドを得る。
さらに、上記(1)の(iii)〜(v)と同様な操作を行うことにより、SV40の複製起点、目的の外来遺伝子発現ユニットおよびその両端にloxP配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。
本発明の好ましい態様の具体的な例としては、
〔1〕 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリA配列を有する動物細胞感染用の組換えDNAウイルスベクター、
〔2〕 DNAウイルスベクターがアデノウイルスベクターである前記〔1〕記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔3〕 リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌P1ファージ由来のリコンビナーゼCreの遺伝子である前記〔2〕記載のDNAウイルスベクター、
〔4〕 二つのリコンビナーゼ認識配列並びにその間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリA配列を有する動物細胞感染用の組換えDNAウイルスベクター、
〔5〕 DNAウイルスベクターがアデノウイルスベクターである前記〔4〕記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔6〕 動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリA配列が上流からこの順に配向している前記〔5〕記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔7〕 外来遺伝子、ポリA配列、動物細胞で働く複製起点およびプロモーターが上流からこの順に配向している前記〔5〕記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔8〕 リコンビナーゼ認識配列がリコンビナーゼCreの基質となるloxPのDNA配列である前記〔4〕から前記〔7〕のいずれか1つに記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔9〕 動物細胞で働く複製起点がウイルス由来又は動物細胞由来のものである前記〔4〕から前記〔8〕のいずれか1つに記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔10〕 動物細胞で働く複製起点がパポバウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、及びパルボウイルス由来のものからなる群より選ばれるものである前記〔9〕記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔11〕 プロモーターおよびポリAが、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリA配列からなるハイブリッドプロモーター(CAGプロモーター)である前記〔1〕〜前記〔10〕のいずれか1つに記載の組換えDNAウイルスベクター、
〔12〕 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリA配列を有する動物細胞感染用の組換えDNAウイルスベクター、並びに二つのリコンビナーゼ認識配列及びその間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリA配列を有する動物細胞感染用の組換えDNAウイルスベクターを動物細胞に感染させ、二つのリコンビナーゼ認識配列間に存する動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリA配列を環状分子として切り出し、細胞内で自律複製させることによる外来遺伝子の細胞内導入法、
〔13〕 DNAウイルスベクターがいずれもアデノウイルスベクターである前記〔12〕に記載の外来遺伝子の細胞内導入法、並びに
〔14〕 遺伝子治療に際して、前記〔12〕又は〔13〕記載の細胞内導入法を用いることを特徴とするヒト遺伝子の細胞内導入法、
が挙げられる。
なお、実施例中のファージ、プラスミド、DNA、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら編、第2版(1989 )、Cold Spring Harbor Laboratory 」に記載の方法に準じて行った。また、DNA制限酵素および修飾酵素は、宝酒造、New England Biolabs(NEB)社、Stratagene社又はBoehringer社から購入し、製造者指示書に従って使用した。
<リコンビナーゼCre遺伝子およびCAGプロモーターを有する組換えアデノウイルスベクターの作製>
(1)リコンビナーゼCre遺伝子発現用カセットコスミドの作製
(i) リコンビナーゼCre遺伝子を含む大腸菌ファージP1DNA(ATCC11303−B23)をテンプレートとし、5’−プライマーとして下記の(配列番号:1)のオリゴヌクレオチドを、3’−プライマーとして下記の(配列番号:2)のオリゴヌクレオチドを、耐熱性ポリメラーゼとしてNEB社製のVentR を用い、以下の条件でPCR反応を行い、生成物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約1kbのバンドを切り出し、リコンビナーゼCre遺伝子を含む約1kbのDNA断片を得た。
5'-CGT CTGCAG TGCA TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3'
PstI BspHI
3'-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT TCGCGAGATCT CGG-5'
Aor51HI;XbaI
(下線部分は、制限酵素の認識部位である。)
緩衝液: 10mMのKCl、20mMのTris−HCl(pH8.8)、10mMの(NH4 )2 SO4 、2mMのMgSO4 、0.1%のTriton X−100(NEB社添付の緩衝液を使用)
耐熱性ポリメラーゼ: 2ユニット
dNTP: 400μM
プライマー: 1μM
P1ファージDNA: 1ng
2本鎖解離温度: 1.5分間
アニーリング温度: 1.5分間
伸長反応温度: 2.0分間
反応サイクル: 20回
ここに、CAGプロモーターとは、高発現ベクターとして特開平3−168087号公報に開示されているものであり、その調製は、同公報に記載されているpCAGGS(特開平3−168087、13頁20行〜20頁14行および22頁1行〜25頁6行)から制限酵素SalI,HindIII で切り出すことにより行うことができ、本発明に利用することができる。
(iii) 得られたコスミドをリガーゼ反応buffer中でATP,T4DNAリガーゼを加え、最終容量7μlで一晩結合させた。ついで滅菌水、SwaI反応bufferを加えて48μlとしてから70℃10分でリガーゼを熱失活させた。
この際、プラズミドと異なり、コスミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合した巨大分子が効率よくパッケージされる。
SwaI切断を行う意味は、カセットコスミドが発現ユニットをくわえ込むことなく再結合するとSwal認識配列が再生されるため、このステップで発現ユニットの組み込まれていないコスミドを再切断し、コロニーを作らなくするためである。この方法はインサートをもつカセットコスミドだけを選択する強力な方法である。
(v) 常法(Molecular Cloning vol.3 E.34)に従い、カセットコスミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲル濾過を行った。
(vi) 再度、Swal切断を行った。即ち、SwaI反応buffer中、5μlのSwaIを加え、25℃で2時間切断した。その理由は上記の通りである。
即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバックXL(Stratagene社製)を1/4スケールで用い、残りは−80℃に凍結した。ギガバックXLは42kb以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなったコスミドをある程度選択することができる。本実験では、10個のコロニーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的の向き(左向き)のクローンを容易に得ることができた。
コスミドの扱い方については、常法(斎藤 泉他、実験医学:7:183-187, 1989)に従って行った。
即ち、3枚のAp+ (アンピシリン添加)寒天プレートと5mlのAp+ LB(pool)にそれぞれ1/200量、1/20量、1/2量、残り全量を接種し、一晩培養した。
poolのminiprepDNAを抽出・調製し、全酵素切断によりインサートが入ったものの割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り1.5mlのAp+ LBで、一晩培養し、miniprepDNAを調製した。
(ix) 次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと構造を確認した。
なお、NruIとリガーゼを用いて、発現単位を含むが大部分のアデノウイルスDNAを欠失したプラスミドを作製し、DNAを調製して、cDNAクローン化の最終確認をした。
(i) アデノウイルスDNAとしては、Ad5 dlX(I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))を用いた。Ad5 dlXをHeLa細胞(Roux 10本分)に感染させ、培養を行った。
即ち、Ad5−dlXのウイルス液(〜109 PFU/ml)を0.2ml/Roux感染させ、3日後に、はがれた細胞を1500rpm、5分にて遠心分離して集めた。アデノウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。(以下の操作は非無菌的に行った。)
ウイルスを細胞内から放出させるには5ml以下なら凍結融解5回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利である。ただし、必ず密封型(専用カップのあるもの)を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネットの中でも危険性がある。
(iv) 界面直下のウイルス層をSW50.1チューブに移した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを5ml採取した。同時にもう一本に塩化セシウム溶液(比重1.34)を満たした。
これらを、35krpm、4℃で一晩超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、35krpm、4℃4時間以上超遠心にかけた。
(vii) 500mlのTEに一晩透析(2回)し、−80℃に保存した。こうして得られたAd5dlX DNA−TPCの量をOD260 から通常のDNAと同様に算出した。
(viii) 得られたAd5dlX DNA−TPCを、第3ステップの組換えアデノウイルス作成のため、充分量のEcoT22Iで2時間切断した後、−80℃に保存した。
(ix) 一部を分取し、泳動用BPB bufferを10μl加えた後に、1μlのプロテイナーゼK(10mg/ml)を加えて37℃で10分間反応させて末端蛋白を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル電気泳動で分離し、完全切断を確認した。
EcoT22I切断DNA−TPC中の制限酵素bufferを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注し−80℃に保存した。
(i) 10%FCS添加DMEで培養した293細胞の6cm、10cmシャーレ各1枚用意した。
(ii) 発現ユニットを組み込んだpAdex1w DNAの8μg(3〜9μgが適当である)とEcoT22Iで切断したAd5dlX DNA−TPCの1μgを混合し、セルフェクト(ファルマシア社製)キットを用いて、6cmシャーレ1枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。6cmシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続けた。
一晩培養(約16時間)し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート96穴3枚(原液・10倍希釈・100倍希釈)に、5%FCS添加DMEを用い、各ウエル当たり0.1mlでまき直した。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈2枚分には10cmシャーレの293細胞を1/3ずつ混ぜて播いた。
ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが7〜15日の間に現れた。ウエルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで培養液(死細胞ごと)を滅菌した1.5mlチューブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−80℃に保存した。
(iv) 15〜18日で判定は終了した。比較的遅く細胞が死んだウエルから回収した培養液チューブを約10個選び、凍結融解6回後、5krpm10分遠心して得られた上清を1次ウイルス液(first seed)として−80℃に保存した。
早めにウイルス増殖が起こったウエルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
(vi) 約3日で細胞が完全に死滅したら、1ウエルは1次ウイルス液作製と同様に6回の凍結融解と遠心で上清を得、これを2次ウイルス液(second seed) として−80℃に保存した。2次ウイルス液の力価は107 〜108 PFU/ml程度であった。他の1ウエルの死滅した細胞を5krpmで5分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−80℃に保存した(セルパック)。10種類のウイルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全DNAを抽出した。セルパックには、400μlのcell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)、4μlのproteinaseK (10mg/ml) および4μlの10%SDSを加えた。
その15μlを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にCGを含む酵素であるXhoIで切断し、発現コスミドカセットのXhoI切断と共に、15cm位の長さのアガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較した。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノムの左端までのバンドが正確に出現しているものを選択した。また、説明できないバンドが薄く見えるクローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃棄した。
アデノウイルスDNAは細胞あたり10,000コピーに増殖するので、細胞DNAと一緒に全DNAを抽出し制限酵素切断によりウイルスDNAのバンドをみることができる。Xholなどのように認識配列にCGを含む酵素は、細胞DNAを切断しないので、パターンが見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染293細胞DNAをコントロールにおくことが必要であった。(ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現した)。
3日後に細胞が死滅したら、死細胞ごと25mlの培地を無菌的に密閉型ソニケーター200w最高出力2分(30秒×4回)で破砕してウイルスを遊離させた。
3krpm、4℃で10分間遠心して沈澱を除去し、5ml凍結用チューブに2mlずつ13本に分注し、ドライアイスで急凍して−80℃に保存し、3次ウイルス液を調製した。3次ウイルス液は本発明の組換えアデノウイルスを含む液であり、109 PFU/ml程度の高力価のものであった。
なお、3次ウイルス液5μlを24穴プレートの293細胞1ウエルに感染し、増殖したウイルスDNAの酵素切断パターンを上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親ウイルスとの混合物であることが疑われたら、2次ウイルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルスが増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての3次シードを廃棄して、別の2次ウイルス液から改めてやり直すか、その1次ウイルス液から限界希釈法により、目的のウイルスを純化した。
<本発明の組換えアデノウイルスの簡便力価測定法>
本発明の組換えアデノウイルスは、以下の方法により、簡便に測定することができる。
(i) 293細胞を10cmシャーレ各1枚用意する。
組換えアデノウイルス液(3次ウイルス液)を5%FCS添加DMEを用いて10-1〜10-4まで段階希釈する。例えば0.9mlDME+0.1mlウイルス液。チップをすべて替える。
(ii) コラーゲンコート96穴各1枚のすべてのウエルに50μlずつ5%FCS添加DMEを入れる。
第1列目に、10-4に希釈した組換えウイルスを25μlずつ加える。
8ウエル用マルチチャンネルピペットを用いて25μlを2列目のウエルに移す。以下同じ操作を11列目まで繰り返し最後の25μlを捨てる。結果として3n の段階希釈列を311×10-4まで作製することができる。12列目は非感染細胞のコントロールとする。
この時用いるチップはその度に替える。
<二つのloxP配列、並びにその間にSV40の複製起点、CAGプロモーター、およびB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)を有する組換えアデノウイルスベクターの作製>
(1)B型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)発現用カセットコスミドの作製
(i) HBs cDNAを含むプラスミドpHBVadr4(Fujiyama et. al., Nucleic Acids Res., 11,4601-4610,1983)を制限酵素Psp1406IおよびXhoIで同時消化した後、さらにKlenow酵素により両端を平滑化し、アガロースゲル電気泳動により710bpの断片を回収した。
CAGプロモーターを含むプラスミドpCAGGS(Niwa et. al. Gene、 Vol. 108、 P193-200) のクローン化部位にSwaIリンカーを挿入することにより得たpCAWGをSwaIで切断しアルカリホスファターゼ処理を施した。次に、これとIで得た断片をモル比約1:3で混合しT4DNAリガーゼ反応を行い、反応混液により大腸菌DHI株(ATCC33849)を形質転換した。アンピシリンを添加したLB寒天プレートから形質転換体を拾い、CAGプロモーターの制御下でHBscDNAが発現する方向に断片が挿入されたプラスミドpCAG・HBsを得た。
pCAG・HBsを制限酵素SapIおよびSalIで同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により3.6kbの断片を回収した。制限酵素SmaIで切断した後アルカリホスファターゼ処理を施したpUC18(宝酒造製)と3.6kb断片をモル比約1:3で混合しligation反応を行い、目的とするプラスミドpUC18CAHBsSを得た。
pUC119(宝酒造製)を制限酵素Ecl136IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した後、末端にMluI部位およびXhoI部位を有しこれが連結するとNruI部位を生じるように設計されているloxP配列を含む下記の合成DNA断片(配列番号:3)とのligation反応を行い該合成DNA断片が2つ挿入されたプラスミドpULL2rを得た。
5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3'
3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5'
(下線部分の配列がloxP部位である。)
上記の(iii)で得られたpUC18CAHBsSを制限酵素SalIおよびEcl136IIで同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により3.6kbの断片を回収した。pULL2rを制限酵素NruIで切断しアルカリホスファターゼ処理を施した後、3.6kb断片とのligation反応を行い目的とするプラスミドpULCA・HBsSを得た。
(a)pULCA・HBsSを制限酵素SmaIおよびEcoRIで同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により回収した3.7kbの断片0.3μg。
(b)制限酵素SwaIで切断したpAdexlcw(細胞工学、13、760−763、(1994))1μg。
両者を混合し、実施例1の(1)(ii)〜(ix)と全く同様の操作により目的とする組換えコスミドを得た。
さらに実施例1の(2)〜(3)と同様な操作により、目的の、二つのloxP配列、並びにその間にSV40の複製起点、CAGプロモーター、およびB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)を有する組換えアデノウイルスベクターAdexlLCAHBsSLを得た。
COS−1細胞またはCV−1細胞を、6cmシャーレのほぼ底面を覆う程になるまで培養する。
実施例1および実施例2で得られたアデノウイルスベクターのそれぞれを、m.o.i.=5で下記のプロトコールに従って1時間吸着させた。
3日後にハーベストしてサザン解析した。
即ち、組換えアデノウイルスベクターAdexlLCAHBsSLは、約6.0kbのHindIII切断部位を有し、また、リコンビナーゼCreによりloxP部位で切断されると3.5kbの環状分子となる。この環状分子はHindIII切断部位を1箇所有するので、感染後ハーベストしたDNAをHindIIIで処理して電位泳動にかけ、サザンブロットを行った。プローブは、HBsフラグメント(710bp)を用いた。
その結果を図1に示す。
以上の結果は、実施例1および実施例2で得られた本発明のアデノウイルスベクターの組み合わせを用いて動物細胞に感染させることにより、二つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれた部分が細胞内で切り出され、環状分子を形成し、かつ細胞内で自律複製することを明らかに証拠づけるものである。
培地の血清がFCSでない場合(例えばCS)は、培養細胞を無血清の培地で2度を洗い培地を除く。
ウイルス液(無血清またはFCS添加の培地で希釈)を、以下の操作中に細胞面が乾いてしまわない程度に加える。96穴で30〜40μl、24穴で50〜70μl、10cmシャーレで100〜200μlくらいであるが、ウイルス液を加える前の培地を意図的に少し残しておき、ウイルス液を加えて、この程度の容量にする方が実際的である。
プレートを数回、シーソーのように数秒周期で振ることにより、ウイルス液を細胞にまんべんなくいきわたらせる。この操作を20分ごとに3回行う。この間、細胞はCO2 インキュベートにおく。
3回目の操作が終わった後に(感染1時間後)、培養液を通常量加えて、通常のように培養する。感染時間は通常1時間、長くても2時間程度で充分である。
配列番号:1
配列の長さ:53
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(一部Genomic DNA を含む任意のDNA)
ハイポセティカル配列:YES
アンチセンス:NO
起源:大腸菌ファージP1DNA
配列の特徴
特徴を決定した方法:S
配列
CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC TGC 53
配列の長さ:38
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(一部Genomic DNA を含む任意のDNA)
ハイポセティカル配列:YES
アンチセンス:NO
起源:大腸菌ファージP1DNA
配列の特徴
特徴を決定した方法:S
配列
GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAG 38
配列の長さ:52
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(一部Genomic DNA を含む任意のDNA)
ハイポセティカル配列:YES
アンチセンス:NO
起源:大腸菌ファージP1DNA
配列の特徴
特徴を決定した方法:S
配列
CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 52
1 CV−1細胞に、培地のみを添加した対象区
2 CV−1細胞に、E3、E1A、E1B領域を欠失させ、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベクターと実施例1で調製したリコンビナーゼCre遺伝子とCAGプロモーターとを組み込んだ組換えアデノウイルスベクターとを感染させた区
3 CV−1細胞に、Adex1LCAHBsSL(実施例2で調製したもの)とE3、E1A、E1B領域を欠失させ、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベクターとを感染させた区
4 CV−1細胞に、Adex1LCAHBsSL(実施例2で調製したもの)と実施例1で調製したリコンビナーゼCre遺伝子とCAGプロモーターとを組み込んだ組換えアデノウイルスベクターとを感染させた区
5 COS−1細胞に、1と同様な処理を施した区
6 COS−1細胞に、2と同様な処理を施した区
7 COS−1細胞に、3と同様な処理を施した区
8 COS−1細胞に、4と同様な処理を施した区
Claims (3)
- プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリA配列を有する組換えアデノウイルスベクターを、アデノウイルスE1A遺伝子を発現する細胞に感染させ増殖させる工程を含む、動物細胞感染用の組換えアデノウイルスベクターの製造方法。
- リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌P1ファージ由来のリコンビナーゼCreの遺伝子である請求項1記載の製造方法。
- プロモーターおよびポリA配列が、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリA配列からなるハイブリッドプロモーター(CAGプロモーター)である請求項1又は2記載の製造方法。
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