JP6795530B2 - 大きな核酸をクローニングするためのアデノウイルスベクターを作製する手段 - Google Patents
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Description
分子の組合せ、第2および第3の核酸分子の組合せ、第4の核酸分子、第5の核酸分子、
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法、核酸配列のライブラリーを作製す
るための方法、複数の第4の核酸分子、複数の第5の核酸分子、複数の個々のアデノウイ
ルス、およびこれらの核酸分子のうち少なくとも1種を含有するキットに関する。
にin vivoでの遺伝子発現ベクターとしてのその幅広い適用につながった。ウイル
スまたは非ウイルス発現ライブラリーを使用する、低分子干渉RNAなどの非コーディン
グ核酸を含めた多数の遺伝子のクローニングおよび発現は、機能ゲノム科学において最も
強力なツールとして認識されており、すでに、新たな薬物標的遺伝子の発見および検証に
つながっている。ウイルスベースの発現ライブラリーの作製には、好ましくは、陽性の組
換え体をスクリーニングすることおよび増幅の際のDNAベースの構築物におけるウイル
スゲノムの安定性を確実にすることを必要としない、多数の的確なクローンをもたらすク
ローニング手順が必要である。
ルスベクターの構築は、種々の手段によって達成され得る。文献において提供される第1
のプロトコールは、許容細胞、通常は293細胞または911細胞などの遺伝子補完細胞
株の、典型的にはE1領域が外来DNAで置換されたウイルスゲノムの左末端を含有する
シャトルプラスミドとの同時トランスフェクションを含み、単離されたウイルスDNAは
、適当な制限酵素によってゲノムの左末端付近で切断される。相同組換えが、シャトルプ
ラスミドとアデノウイルスDNAの重複配列間でin vivoで起こり、複製可能な組
み換えられたウイルスゲノムが得られる。ベクター構築のためのこの技術の適応性は、大
きな単離されたウイルスDNA断片の非効率的なトランスフェクションによって限定され
、さらに、アデノウイルスDNAの部分的にすぎない消化のために、ベクター調製物に野
生型アデノウイルスが混入する場合もある。
ない2つのプラスミドの使用を含み、これらが、相同組換えによって複製可能なウイルス
DNAを製造するために、補完性製造細胞株へ同時トランスフェクトされる。この方法は
、詳細に記載されている(Bettら J.Virol.67:5921〜5921頁、
1993年)。wt−ウイルス混入とも呼ばれる野生型ウイルス混入の不利点もまた、こ
の変法によって克服された。しかし、多数の組換えアデノウイルスベクターを作製するた
めのこの方法の使用は、293などのプロデューサー細胞における大きなベクターDNA
の低い組換え効率およびトランスフェクション効率によって限定される。一般に、E1が
欠失したアデノウイルスの複製を支援する、真核細胞における2種のDNA実体間の相同
組換えによるアデノウイルスベクター構築は、時間のかかるものであり、プラーク精製に
よる個々のウイルスクローンのスクリーニングおよび精製を必要とする。
ンドヌクレアーゼおよびリガーゼの特性の両方を有し、複数の生物中に存在するタンパク
質である。これらのリコンビナーゼは、DNA中の塩基の特異的配列を認識し、それらの
セグメントのそれぞれの両端に位置するDNAセグメントを交換する。このように得られ
た組換え生成物は、第2の核酸への第1の核酸の挿入物としてなる。このような場合には
、プラスミドは、各核酸上に1つのリコンビナーゼ認識配列を含有する環状プラスミドで
ある。あるいは、同一核酸上の2つのリコンビナーゼ認識配列間における核酸断片の切除
、または各核酸上に存在する2つの認識部位間において交換される核酸の各々を有する2
つの核酸間の核酸の一部の交換がある。各々1つのloxPまたは例えば、Frtリコン
ビナーゼ認識部位などのその他のリコンビナーゼ結合部位を有する2つのプラスミドが、
単量体、二量体、三量体などの生成物の混合物を形成する。種々の生物に由来する多数の
組換え系が記載されている。(Landy A.、Curr Opin Genet D
ev.3:699〜707頁、1993年;Hoess RH.ら Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 79:3398〜3402頁、1982年;Abrems
kiら、J Biol Chem 261:391〜396頁、1986年;Espos
ito D、Scocca JJ、Nucl Acids Res 25:3605〜3
614頁、1997年)。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーの最も研究された
メンバーとして、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系(Landy
A.、Current Opinions in Genetics and Deve
l.3:699〜707頁、19934、バクテリオファージP1由来のCre/lox
P系(Nucleic Acids and Molecular Biology、第
4巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin−Heidelberg:
Springer−Verlag;90〜109頁中の、Hoess RH、Abrem
ski K.「The Cre−lox Recombination System」
、(1990年)ならびにサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae) 2.mu.環状プラスミド由来のFlp/FRT系(Broa
ch JR.ら、Cell 29:227〜234頁、1982年)がある。バクテリオ
ファージP1由来のCreによって媒介される部位特異的組換えによるアデノウイルスベ
クターの構築のための系が開発された(Hardyら、J.Virol.71:1842
〜1849頁、1997年)。この方法は、Cre発現細胞における2つのloxP部位
間の分子内組換えによる、遺伝子形質導入単位および1つのloxP部位を含有するシャ
トルプラスミドと、そのパッケージングシグナルについて欠失しているヘルパーアデノウ
イルスベクター間の組換えの際に、この領域中に外来DNAが挿入されたE1置換アデノ
ウイルスを作製する手段を提供する。293Cre細胞における2つのプラスミド間のC
re−lox媒介性部位特異的組換えによる組換えアデノウイルスの構築のためのこの方
法の適用は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第6,379
,943号において開示された。
3/0054555)は、ドナーベクターと、遺伝子が欠失したアデノウイルスゲノムを
コードするアクセプターベクターとの間のCre−lox媒介性部位特異的組換えを使用
して組換えアデノウイルスベクターを作製するための方法を記載している。先行技術のこ
の方法に記載されているベクターとしての高コピープラスミドの使用は、非アデノウイル
ス5型「血清型」組換えアデノウイルス発現ベクターの特定の型の作製を可能にしない。
アデノウイルス19a型のゲノムが、プラスミドにクローニングされ、大腸菌において増
殖された場合に、ゲノムの不安定性が観察された。アデノウイルスゲノムをBACにクロ
ーニングすることによって溶液が提供され、プラスミドが関連するゲノムの不安定性を伴
わない、細菌における増幅およびゲノム修飾が可能となった(Ruzsics Zら J
.Virol.80:8100〜8113頁、2006年)。FarmerおよびQui
nnはまた、両ITRを含み、293細胞などの補完性細胞株において補完され、増殖さ
れ得る、遺伝子が欠失している(E領域について欠失している)アデノウイルスゲノムを
コードするアクセプターベクターの使用を記載している。ドナーおよびアクセプターベク
ター間の部位特異的組換えの際に、得られた組換え生成物は、ドナーベクターの挿入核酸
を含有する。組換えアデノウイルスゲノムの構築のために提供された先行技術のこの方法
では、これらの2つの配列間の組換えを可能にするように配置されている、2つの配列特
異的組換え標的部位を含有するドナープラスミドが使用される。アクセプタープラスミド
は、1つの配列特異的組換え部位を含有する。ドナー構築物およびアクセプター構築物は
、in vitroまたは宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼを用いて反応さ
せ、組換えアデノウイルスゲノム構築物である得られた組換え生成物は、所望のドナー断
片を含有する。さらなる実施形態では、選択マーカー(すなわち、sacB)が、ドナー
およびアクセプターベクター間で分割されており、マーカーの第1の部分がアクセプター
ベクター上に存在し、選択マーカーの第2の部分がドナーベクター上に存在する。部位特
異的リコンビナーゼ(Creリコンビナーゼ)の発現によって媒介される部位特異的組換
えの際に、両部分が、得られた組換え構築物において機能的選択マーカーを形成する。選
択マーカーの生成によって、反応生成物の選択が可能となる。Cre媒介性組換え反応は
、両反応、すなわち切り出しおよび挿入を同時に触媒し、最終的に、反応生成物の混合物
を含有する平衡状態に至る。アクセプターベクターおよびドナーベクターを使用する先行
技術のこの方法を適用することによって、80%の所望の組換え生成物が得られ、提供さ
れた例において分析された合計10個のクローンが、組換えアデノウイルスベクターであ
った。特に、アクセプターベクターおよびドナーベクター間の部位特異的組換えの数を、
正確に1に制限する機序が全く適用されないので、本明細書に記載された先行技術のこの
方法は、複数の反応生成物を作製しやすい。しかし、これは、未解決の技術的問題であり
、個々のクローンの配列決定および特徴付けを必要とせずに、純粋な、複雑なアデノウイ
ルスベクター発現ライブラリーを作製するための必須条件である。
(Parksら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:1356
5〜13570頁、1996年)、米国特許第6,379,943号において「High
−efficiency Cre/loxP based system for co
nstruction of adenovirus vectors」のための方法と
して開示された。しかし、LoxP部位がその両端に位置するアデノウイルス(AdV)
AdVゲノム中に組み込まれた遺伝エレメントは、アデノウイルスベクターの増殖の間に
自然切り出しの対象となる。(Anton M.およびGraham F.L.、「J.
Virol.69:4600〜4606頁、1995年)。別の適用では、Cre媒介性
組換えを使用して、2連続組換え事象および組換え後にそのパッケージングシグナルにつ
いて欠失しているアデノウイルスに対する陰性選択後に、アデノウイルスベクターを作製
した(Hardy Sら、J.Virol.71:1842〜1849頁、1997年)
。
2種の核酸間でCre媒介性組換えを使用する方法は、安定な、不偏性ライブラリーを作
製できない。Cre−リコンビナーゼの、両方向において反応を触媒する能力は、組換え
されていない親アデノウイルスが依然として混入されている可能性があるアデノウイルス
調製物をもたらす。さらに、2つの機序が、ゲノムライブラリーの構築のためのCre/
loxP部位特異的組換えの使用を制限する。Creリコンビナーゼによって認識される
配列の大きさが小さいために、Cre発現のために誘導可能な系が使用される場合でさえ
、ゲノム中に潜在性のloxP部位が存在し、適合する部位間の組換えを誘導するか、ま
たは一本鎖もしくは二本鎖の切断を導入し、Creを発現する大腸菌株において、lox
P部位を含有するBAC、PAC、CosmidまたはFosmidを増殖および修飾す
る能力に影響を及ぼす(Semprini Sら Nucleic Acids Res
.35:1402〜1410頁、1997年)。このプロセスはまた、哺乳類細胞および
生物において生じ、マウスおよびヒトのゲノム内の潜在性(偽性)loxP部位間のその
組換え事象が、非正統的染色体再編成を誘導するゲノム不安定性につながる(Schmi
dt EEら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:13702
〜13707頁、2000年;SauerB.J.Mol.Biol.223:911〜
928頁、1992年)。したがって、部位特異的Cre媒介性相同組換えによって構築
されたアデノウイルスベクターゲノムのライブラリーは、相当な程度の混入の対象となっ
ている可能性があり、単一クローンを得るための集中的な細胞培養作業およびウイルス学
的方法を必要とする。
23により本明細書の一部をなすものとするGrahamら、米国特許第7,132,2
90号においてさらに洗練され、記載された。293などのプロデューサー細胞にトラン
スフェクトされた場合の、アデノウイルスをコードする核酸の低い感染力と関連する制限
を克服するために、DNA−TP複合体の使用が前記特許において具体化された。当業者
には、DNA−TP複合体が、プラスミド由来のDNAの代わりに使用される場合には、
アデノウイルスDNAの感染力が100倍増強されることは公知である。ウイルスDNA
は、二本鎖アデノウイルスの各鎖の5’末端と結合している末端タンパク質が、無傷のま
まであるように精製される。Creリコンビナーゼの存在下での部位特異的組換えの際に
、loxP部位を第2のプラスミド生成複製コンピテントアデノウイルスDNAとともに
保有するDNA−TP複合体の同時トランスフェクションは、トランスフェクトされたウ
イルスDNA1μgあたりに生じるウイルスプラークの数を、大幅に増大し得る(Sha
rp PAら、Virology75:442〜456頁、1976年;Chinnad
urai Gら、J.Virol.26:195〜199頁、1978年)。DNA−T
P複合体(DNA−TPC)の使用には、制限消化によってDNA−TP複合体が由来す
る親の感染性アデノウイルスDNA形態が混入するリスクがある。
デノウイルスゲノムの構築が、ライブラリー効率を有する陽性選択と組み合わせてさらに
使用された(Elahi SMら、Gene Ther.9:1238〜1246頁、2
002年);この方法の特許出願が出願されており、読者には、技術の詳細については米
国特許出願第2006210965号が紹介される。ここで、左末端ITRおよびアデノ
ウイルスプロテアーゼ発現カセットを有するプラスミドの、アデノウイルスプロテアーゼ
遺伝子について欠失しているウイルスDNA−TPCと一緒の同時トランスフェクション
によって、多量の組換えウイルスベクターが得られた。しかし、293細胞における部位
特異的または相同組換えによって構築されたアデノウイルスベクターゲノムのライブラリ
ーは、可変の増殖特性を有するウイルス突然変異体の選択によって相当な程度の偏りを受
ける可能性があり(例えば、cDNAの発現が、増殖利点または不利点を付与するcDN
A発現ライブラリーの場合において)、したがって、ライブラリー集団中で過剰または過
少提示される。このようなライブラリーの増殖は重大であり、単一クローンを得るための
集中的な細胞培養作業およびウイルス学的方法をさらに必要とする。
伴わない組換えアデノウイルスの構築が可能となる。組換えアデノウイルスの構築のため
のDNA断片のアデノウイルスゲノムとの直接連結を使用する方法が、早い時期に開発さ
れている(Ballay Aら、EMBO J.30:3861〜5頁、1985年)。
しかし、大きな断片の連結は、効率的ではなく、独特の制限部位の不足が、ウイルスゲノ
ムライブラリーを構築するためのこの方法の使用を制限する。
必要とせずにアデノウイルスベクターを構築できる。AdEasy(登録商標)システム
として市販されている適用では(He T−Cら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.95:2509〜2514頁、1998年)、BJ5183細菌において、
同時トランスフェクトされたスーパーコイルアデノウイルスゲノムおよびシャトルプラス
ミド間の組換えが起こる。この細菌株は、アデノウイルスゲノムの遺伝的安定性の維持に
とって好ましい特性を有する。製造者のマニュアルによって与えられる情報によれば、コ
ロニーの20%超が正しい組換え生成物である。Chartierら(Chartier
Cら、J.Virol.70:4805〜4810頁、1996年)によって記載され
た別の方法では、2つの相同性アームの長さの増大によって、組換え効率が高まる。この
方法の改善は、Crouzetら.Proc.Natl.Acad.Sci USA、9
4:1414〜1419頁、1997年によって記載された。これでは、陰性選択マーカ
ーを導入することによってバックグラウンドコロニーの数が減少した。しかし、直列反復
または反復DNA配列を有する、プラスミドベクターにクローニングされたDNA配列が
遺伝的不安定性を抱えているので、系の効率および遺伝的安定性は、大きなライブラリー
作製にとって十分ではない。これは、大腸菌において高コピー数で複製するプラスミドベ
クターに特に当てはまる。組換えアデノウイルスの構築のためにこの方法を使用するため
の別の成功した試みでは、酵母における相同組換えを確立した。しかし、この方法は、同
一配列間の組換えを誘導するためにDNAの直線化に頼るものである。大規模(通常、5
00ml)酵母スフェロプラスト(spheroblast)培養から得られる低いYA
C DNA収率に加えて、アデノウイルスゲノムにおける独特の制限部位の不足が、この
適用を制限する。
ステムは、宿主細胞において選択可能である第3の核酸を生成する核酸間のin vit
roでの組換えに部位特異的組換えを使用する。技術的詳細については、両方とも参照す
ることにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第7,282,326号(In
vitrogen Corp.)および米国特許第5,888,732号(Life T
echnologies)が参照される。この系は、高効率および正確性で組換えプラス
ミドをもたらし、非組換えプラスミドベクターに由来するバックグラウンドがなく、大腸
菌宿主における組換えの際に生じる予測不可能な組換え事象を回避する。組換えアデノウ
イルスゲノム、(ViralPower(商標)として市販されている)は、高い有効性
で作製され得る、この方法を使用して通常90%超の正しく組換えられたウイルスゲノム
(自身の観察結果およびマニュアルによって)。
atzen, F.Gateway(登録商標)組換えクローニング: a biolo
gical operating system.Expert Opinion Dr
ug Discovery 2:571〜589頁、2007年)、アデノウイルスゲノ
ムの場合には、適当な大腸菌宿主細胞の形質転換後に得られたコロニーの結果として得ら
れた数は、小さいDNA分子間のin vitro組換えと比較した場合には数倍減少し
、したがって、大きな大きさのDNAライブラリーの構築のためのGatewayシステ
ムの使用を制限する。さらに、ここで、ライブラリー構築の制限因子である細菌形質転換
の効率は、細菌株依存的な方法で形質転換されるDNAの大きさに伴って低下する(Sh
eng Yら、Nucleic Acids Res.23:1990〜1996頁、1
995年)。
ミドベクターにクローニングされるゲノム配列の不安定性が回避される。例は、プラスミ
ドベクターにクローニングされる大きなウイルスゲノム(Bzymek MおよびLov
ett ST、Proc Natl Acad Sci U S A.98:8319〜
8325頁、2001年;およびその他のサブグループに由来するアデノウイルスベクタ
ーゲノム(Ruzsics Zら、J.Virol.80:8100〜8113頁、20
06年)に当てはまる。ウイルスベクターは、大腸菌宿主においてプラスミドベクターで
増殖された場合には不安定であり、細菌人工染色体(BAC)プラスミドでの安定なゲノ
ムとしての増殖を必要とする。ゲノムは、BACにおいて維持および操作され得るが、選
択手順は複数のステップを含み、このようなゲノムの大きなライブラリーの構築のために
利用可能な方法はまだない。
日まで観察されていない。したがって、ここでは、この系が、ゲノムライブラリー構築の
ために本発明において使用される。2種の同一でないFrt部位が使用される場合には、
Flp媒介性部位特異的組換えの使用によって、2種の核酸間の核酸の部分の標的とされ
る交換が達成され得る。真核細胞のゲノムの標的とされる修飾の方法は、参照することに
より本明細書の一部をなすものとするPCT特許出願WO1999/025854におい
て特許請求されている。ゲノムライブラリーの構築のためのこの系の適応は、選択マーカ
ーおよび遺伝子導入単位の交換を必要とする。しかし、gatewayシステムと同様に
、この反応の効率は、交換される核酸断片の大きさに伴って低下し、100%信頼できる
ものではなく、したがって、得られたライブラリーの詳細な特徴付けを必要にする。Cr
e媒介性部位特異的相同組換えを使用するアデノウイルスベクターゲノムのライブラリー
の構築は、真核細胞においてただ達成されただけであって、したがって、相当な程度の混
入にさらされ、単一クローンを得るための集中的な細胞培養作業およびウイルス学的方法
を必要とする。大腸菌におけるCre媒介性部位特異的組換えの使用は、ゲノムの不安定
性と関連しており、最先端の高コピープラスミドシステムとともに使用され得ない。特に
、ウイルスライブラリーが、真核細胞において構築される場合には、可変の増殖特性を有
するウイルス突然変異体の選択によって相当な程度の偏りが生じ、過剰または過少提示さ
れたウイルスを有するライブラリーにつながる。このようなライブラリーの安定な増殖は
重大であり、単一クローンを得るための集中的な細胞培養作業およびウイルス学的方法を
さらに必要とする。さらに、ウイルスDNAの感染力を増強するためのDNA−TPC断
片の使用には、制限消化によってDNA−TP複合体が由来する親の感染性アデノウイル
スDNAで混入されるリスクがある。ゲノムライブラリー構築のための2種の同一でない
組換え部位間の核酸配列の部位特異的組換え媒介性二重相互交換を含む方法の使用は、反
応の効率および忠実度によって限定され、得られたライブラリーの詳細なスクリーニング
および特徴付けを必要にする。in vitro部位特異的組換えを使用する代替システ
ムは、特に、大きなプラスミドが使用される場合には、組換え反応の効率によって限定さ
れ、さらに、大腸菌中の得られた大きなプラスミドの形質転換効率の低下に見舞われる。
点を克服すること、および改善されたそれぞれの方法、およびこのような方法を実施する
ための手段を提供することである。
クローニングすることを可能にする方法およびこのような方法を実施するための手段を提
供することである。
れる。好ましい実施形態は、従属クレームからとられ得る。
、
(1)以下のエレメント:
(a)部位特異的組換え部位、好ましくは、正確に1つの部位特異的組換え部位と、
(b)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(c)ウイルスのゲノムの第1の部分と、
(d)転写単位と、
(e)場合により第1の制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号1および/もしくは配列番号15によるヌクレオチド配列を含む核酸分
子、または
(3)ブダペスト条約に従って受託番号DSM23753でDSMZに寄託された生物
に含有される核酸分子と類似もしくは同一である核酸分子であって、好ましくは、生物に
含有される核酸分子は、異種核酸分子である核酸分子
を含む第1の核酸分子によって解決され、
第1の核酸分子は、環状または直鎖分子のいずれかである。
、第1の核酸分子は、パッケージングシグナルを含む。
施形態では、ウイルスのゲノムの第1の部分は、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノム
の、好ましくは、該ウイルスのゲノムの末端配列を含む。
あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの末端配列は、あるウイルスまたは該ウイルスの
ゲノムの末端反復、好ましくは、ウイルスの逆方向末端反復を含む。
様の第5の実施形態では、第1の制限部位は、あるウイルスまたは該ウイルスゲノムの第
1の部分および転写単位中に存在しない。
1の態様の第6の実施形態では、第1の制限部位は、AbsI、BstBI、PacI、
PsrI、SgrDIおよびSwaIを含む群から選択される。
る第1の態様の第7の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
でもある、第1の態様の第8の実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルス5型であ
るか、またはウイルスは、ヒトアデノウイルス19a型である。
施形態でもある、第1の態様の第9の実施形態では、エレメント(a)〜(e)は、5’
→3’方向に配置される。
は、末端反復は、ウイルス末端反復、好ましくは、左側ウイルス末端反復である。
施形態でもある、第1の態様の第11の実施形態では、第1の核酸分子は、直鎖分子であ
り、ここで、エレメント(a)〜(d)は、好ましくは、第1の制限部位で認識および切
断する第1の制限酵素を用いて、第1の核酸分子の環状分子を切断する際に、以下の順序
で5’→3’方向に配置される。
1.ウイルスのゲノムの第1の部分、
2.転写単位、
3.部位特異的組換え部位、
4.(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、
5.場合により、第1の制限部位と呼ばれる制限部位
では、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、ウイルスのゲノムの末端配
列、好ましくは、ウイルスのゲノムの末端反復配列、より好ましくは、ウイルスのゲノム
の逆方向末端反復配列を含む。
では、ウイルスのゲノムの末端配列は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末端反復
、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の左側
末端反復を含み、より好ましくは、末端配列は、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの
第1の左側逆方向末端反復である。
1、第12および第13の実施形態の一実施形態でもある、第1の態様の第14の実施形
態では、逆方向末端反復は、アデノウイルスの逆方向末端配列であり、好ましくは、約1
8〜103塩基対の任意の長さを有する。
12、第13および第14の実施形態の一実施形態でもある、第1の態様の第15の実施
形態では、好ましくは、第1の態様の第9の実施形態を直接的または間接的に参照する限
り、パッキングシグナルは、アデノウイルスのパッキングシグナルである。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第1の態様
の第16の実施形態では、転写単位は、プロモーター、場合により、発現させる核酸配列
および終結シグナルを含み、好ましくは、プロモーターおよび発現させる核酸が互いに作
動可能に連結している、より好ましくは、プロモーター、核酸および終結シグナルが互い
に作動可能に連結している。
は、プロモーターは、真核細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、RNAポリメラー
ゼIIによって認識されるプロモーターおよびRNAポリメラーゼIIIによって認識さ
れるプロモーターを含む群から選択され、ここで、好ましくは、RNAポリメラーゼII
によって認識されるプロモーターは、PGKプロモーターおよびCMVプロモーターを含
む群から選択され、ここで、好ましくは、RNAポリメラーゼによって認識されるプロモ
ーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーターおよびアデノウ
イルスVAプロモーターを含む群から選択される。
8の実施形態では、発現させる配列は、ペプチドをコードする核酸、ポリペプチドをコー
ドする核酸、タンパク質をコードする核酸、非コーディングRNA、siRNA、マイク
ロRNAを含む群から選択される配列である。
様の第19の実施形態では、終結シグナルは、真核細胞の終結シグナル、ウイルスの終結
シグナルおよびRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターの終結シグナルを含む群か
ら選択され、好ましくは、終結シグナルは、ポリAシグナルである。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施形態
の一実施形態でもある、第1の態様の第20の実施形態では、部位特異的組換え部位は、
Flpリコンビナーゼの組換え部位を含む群から選択される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第20の
実施形態の一実施形態でもある、第1の態様の第21の実施形態では、条件付き複製のた
めの細菌配列は、複製起点を含む。
では、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列は、複製起点を含み、好ましくは、複
製起点は、ファージgR6Kの最小の起点である。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1および第22の実施形態の一実施形態でもある、第1の態様の第23の実施形態では、
第1の選択マーカーを提供する配列は、酵素をコードするこのような核酸配列を有する宿
主細胞に耐性を付与する酵素をコードする核酸配列である。
では、耐性は、薬剤に対する耐性、好ましくは、抗生物質に対する耐性であり、より好ま
しくは、このような薬剤は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニ
コール、アンピシリン、テトラサイクリンを含む。
では、耐性を付与する遺伝子は、bla、ant(3’’)−Ia、aph(3’)−I
I、aph(3’)−II、cmlA、ble、aadA、aadB、sacBおよびt
etAを含む群から選択される。
、
(1)以下のエレメント:
(a)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(b)部位特異的組換え部位、好ましくは正確に1つの部位特異的組換え部位と、
(c)ウイルスのゲノムの第2の部分と、
(d)場合により、第2の制限部位と呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号2および/もしくは配列番号13および/もしくは配列番号14による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)ブダペスト条約に従って受託番号DSM24298および/もしくはDSM24
299でDSMZに寄託された生物に含有される核酸分子と類似もしくは同一である核酸
分子であって、好ましくは、生物に含有される核酸分子は、異種核酸分子である核酸分子
を含む第2の核酸分子によって解決され、
第2の核酸分子は、環状または直鎖分子のいずれかである。
、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの第2の部分は、あるウイルスまたは該ウイル
スのあるゲノムまたは該ゲノムの1種または数種のその他の部分と組み合わせた場合には
複製能力のある完全なゲノムをもたらす。
形態では、部位特異的組換え部位は、Flpリコンビナーゼの組換え部位を含む群から選
択される。
の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
様の第5の実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス5型ゲノムまたはヒト
アデノウイルス19a型ゲノムである。
2の態様の第6の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの第2の部分は
、あるウイルスのゲノムの、好ましくは、該ウイルスのゲノムの末端配列を含む。
、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの配列は、末端反復、好ましくは、ウイルスの
末端配列、より好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスの末端反復、さらにより好ま
しくは、あるウイルスまたは該ウイルスの逆方向末端反復、なおさらにより好ましくは、
あるウイルスまたは該ウイルスの右側逆方向末端反復を含む。
でもある、第2の態様の第8の実施形態では、第2の制限部位は、ゲノムの第2の部分中
に存在しない。
施形態でもある、第2の態様の第9の実施形態では、第2の制限部位は、制限酵素Abs
I、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaIの制限部位を含む群か
ら選択され、ウイルスは、好ましくはヒトアデノウイルス5型である。
の一実施形態でもある、第2の態様の第10の実施形態では、複製、好ましくは、単一コ
ピー複製のための細菌ヌクレオチド配列は、原核生物宿主細胞における単一コピー維持の
ための複製起点を含む。
では、複製起点は、f−エピソーム因子またはP1複製起点に由来する単一コピー起点で
ある。
第11の実施形態の一実施形態でもある、第2の態様の第12の実施形態では、第2の核
酸分子は、直鎖分子であり、ここで、エレメント(a)〜(d)は、好ましくは、第2の
制限部位で認識および切断する第2の制限酵素を用いて、第2の核酸分子の環状分子を切
断する際に、以下の順序で5’→3’方向に配置される。
1.(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、
2.部位特異的組換え部位、好ましくは、正確に1つの部位特異的組換え部位、
3.ウイルスのゲノムの第2の部分、ならびに
4.場合により、第2の制限部位と呼ばれる制限部位。
1および第12の実施形態の一実施形態でもある、第2の態様の第13の実施形態では、
第2の選択マーカーを提供する核酸配列は、酵素をコードするこのような核酸配列を有す
る宿主細胞に対する耐性を付与する酵素をコードする核酸配列である。
では、耐性は、ゲンタマイシン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、アン
ピシリンおよびストレプトマイシンを含む陽性選択マーカーの群から選択される薬剤に対
する耐性である。
5の実施形態では、耐性を付与する遺伝子は、bla、ant(3’’)−Ia、aph
(3’)−II、aph(3’)−II、cmlA、ble、aadAおよびaadBを
含む群から選択される。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第2の態様
の第16の実施形態では、第2の核酸分子は、直鎖分子であり、ここで、エレメント(a
)〜(c)は、好ましくは、第2の制限部位で認識および切断する第2の制限酵素を用い
て、第2の核酸分子の環状分子を切断する際に、5’→3’方向に配置される
(1)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列とを含む細菌ヌクレオチド配列単位、
(2)部位特異的組換え部位、ならびに
(3)ウイルスのゲノムの第2の部分。
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分は、ある
ウイルスまたは該ウイルスのゲノムの、好ましくは、該ウイルスのゲノムの末端配列を含
む。
では、あるウイルスまたは該ウイルスの末端配列は、あるウイルスまたは該ウイルスの末
端反復、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスの右側末端反復を含む。
様の第19の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の第2の部分は、パッケージングシグナルを含む。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施形態
の一実施形態でもある、第2の態様の第20の実施形態では、第2の核酸分子は、BAC
である。
1の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、
第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、
第22、第23、第24および第25の実施形態のいずれかによる第1の核酸分子と、第
2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、
第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20の実施形態
のいずれかによる第2の核酸分子との組合せによって解決される。
、第1の核酸分子および第2の核酸分子の両方が、環状の閉じた核酸分子として存在する
。
施形態では、第1の核酸分子および第2の核酸分子は、別個の分子として存在する。
4の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
様の第5の実施形態では、第1の制限部位および第2の制限部位は、第1の核酸分子およ
び第2の核酸分子の両方上で同一である。
、第1および第2の制限部位は、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrD
IおよびSwaIの制限部位を含む群から選択される。
る、第3の態様の第7の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまた
は該ゲノムの第1の部分およびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノ
ムの第2の部分は、一緒になると、完全なウイルスゲノムを形成する。
でもある第3の態様の第8の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノム
または該ゲノムの第1の部分およびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該
ゲノムの第2の部分は、一緒になると、許容細胞において複製能力のある、あるウイルス
または該ウイルスのゲノムを形成する。
施形態でもある、第3の態様の第9の実施形態では、第1の選択マーカーおよび第2の選
択マーカーは、抗生物質に対する耐性を付与する酵素であり、このような抗生物質は、カ
ナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、アンピシリン、ゼ
オシン、ゲンタマイシンおよびクロラムフェニコールを含む群から選択され、第1の選択
マーカーは、第2の選択マーカーとは異なる。
施形態でもある、第3の態様の第10の実施形態では、第1の選択マーカーは、カナマイ
シンに対する耐性を付与する酵素であり、第2の選択マーカーは、クロラムフェニコール
に対する耐性を付与する酵素である。
実施形態の一実施形態でもある、第3の態様の第11の実施形態では、パッキングシグナ
ルが、第1または第2の核酸分子のいずれかによって提供される。
第11の実施形態の一実施形態でもある、第3の態様の第12の実施形態では、1つの末
端反復が第1の核酸分子によって提供され、1つの末端反復が、第2の核酸分子によって
提供される。
1および第12の実施形態の一実施形態でもある、第3の態様の第13の実施形態では、
第1の核酸が、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分
、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末端配列お
よびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分、好ましく
は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末端配列の両方を提供
し、第2の核酸分子は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第
1の部分、好ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの末
端配列も、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分、好
ましくは、あるウイルスまたは該ウイルスのある末端反復または該末端反復のあるゲノム
または該ゲノムの末端配列も提供しない。
1、第12および第13の実施形態の一実施形態でもある、第3の態様の第14の実施形
態では、第1の核酸は、2種の逆方向末端反復を提供し、第2の核酸分子は、いずれの逆
方向末端反復も提供しないか、または第2の核酸分子は、少なくとも1つの逆方向末端反
復を提供する。
1、第12、第13および第14の実施形態の一実施形態でもある、第3の態様の第15
の実施形態では、第1の制限部位および第2の制限部位は、転写単位中、あるゲノムまた
は該ゲノムの第1および第2の部分中に存在しない。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第3の態様
の第16の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、より好ましくはヒトアデノウイ
ルス血清型5である。
て、a)第1の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10
、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20
、第21、第22、第23、第24および第25の実施形態のいずれかによる第1の核酸
分子を用意するステップ、
b)第2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第2
0の実施形態のいずれかによる第2の核酸分子を用意するステップ、または
c)第3の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15および第16の実施形態のいずれかによる組合
せを用意するステップ、
d)第1の核酸分子および第2の核酸分子を、部位特異的組換えが生じるよう反応させ
るステップであって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され
、部位特異的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムのコ
ピー、好ましくは単一コピーを含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全な
ゲノムであり、補完された完全なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステッ
プ、
e)場合により、組換え生成物を選択するステップ、ならびに
f)場合により、組換え生成物を第1の制限酵素または第2の制限酵素を用いて切断す
るステップまたは第1および第2の制限酵素の両方を用いて切断するステップ
を含む、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法によって解決される。
、第1の核酸分子および第2の核酸分子を、原核生物宿主細胞において反応させ、組換え
生成物が選択され、好ましくは、原核生物宿主細胞は大腸菌であり、より好ましくは、宿
主細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM23743および/またはDSM23
742でDSMZに寄託されている生物またはこのような生物と類似の生物である。
施形態では、宿主細胞は、F因子を欠き、第1および第2の選択マーカーに対して感受性
である大腸菌株の群から選択される。
4の実施形態では、宿主細胞は大腸菌K12由来型、好ましくは、DH10Bである。
、第1の核酸分子および第2の核酸分子を、部位特異的リコンビナーゼの存在下で、真核
細胞宿主細胞において反応させ、より好ましくは、宿主細胞は、ブダペスト条約に従って
受託番号DSM ACC3077mまたはDSM ACC3077でDSMZに寄託され
ている生物またはこのような生物と類似の生物であり、組換え生成物を選択するステップ
は存在せず、好ましくは、真核細胞宿主細胞は、許容宿主細胞である。
、部位特異的リコンビナーゼが提供され、許容宿主細胞は、293細胞、911細胞、P
ER.C6細胞およびCAP細胞を含む群から選択される細胞である。
る、第4の態様の第7の実施形態では、第1の選択マーカーは、カナマイシンであり、第
2の選択マーカーは、クロラムフェニコールである。
でもある、第4の態様の第8の実施形態では、第1の核酸分子および第2の核酸分子は、
リコンビナーゼの存在下で反応させる。
施形態でもある、第4の態様の第9の実施形態では、リコンビナーゼは、第1の核酸分子
によって提供される部位特異的組換え部位および第2の核酸分子によって提供される部位
特異的組換え部位と相互作用する。
実施形態では、リコンビナーゼは、Flpリコンビナーゼである。
実施形態の一実施形態でもある、第4の態様の第11の実施形態では、リコンビナーゼは
、第1の核酸分子または第2の核酸分子のいずれかによってコードされる。
実施形態の一実施形態でもある、第4の態様の第12の実施形態では、リコンビナーゼは
、原核生物宿主細胞または真核細胞宿主細胞によって提供または製造される。
1および第12の実施形態の一実施形態でもある、第4の態様の第13の実施形態では、
組換え、好ましくは、部位特異的組換え後に、リコンビナーゼは不活化される。
は、リコンビナーゼ、好ましくは、Flpリコンビナーゼは、誘導性プロモーターまたは
温度感受性レプレッサーによって制御される。
1、第12、第13および第14の実施形態の一実施形態でもある、第4の態様の第15
の実施形態では、制限酵素は、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDI
およびSwaIを含む群から選択される。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第4の態様
の第16の実施形態では、方法は、さらなるステップとして、あるウイルスまたは該ウイ
ルスの補完されたゲノム、好ましくは、複製可能なウイルスゲノムを許容宿主細胞にトラ
ンスフェクトするステップを含む。
1、第12、第13、第14、第15および第16の実施形態の一実施形態でもある、第
4の態様の第17の実施形態では、リコンビナーゼの発現は、温度感受性複製起点によっ
て制御される。
1、第12、第13、第14、第15、第16および第17の実施形態の一実施形態でも
ある、第4の態様の第18の実施形態では、遺伝子導入、ワクチンまたは治療用途のため
のベクターの構築において、方法が使用される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17および第18の実施形態の一実施
形態でもある、第4の態様の第19の実施形態では、ウイルスゲノムのライブラリーの構
築において、方法が使用される。
(1)以下のエレメント:
(a)場合によりウイルスのゲノムの第1の部分と、
(b)ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
(c)原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
(d)部位特異的組換え部位、好ましくは正確に1つの部位特異的組換え部位と、
(e)陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
(f)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(g)場合により第1の制限部位と
を含み、原核生物における調節活性、部位特異的組換え部位および陰性選択マーカーを提
供するヌクレオチド配列を有する細菌ヌクレオチド配列が5’から3’方向に配置される
核酸分子、または
(2)配列番号6によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)ブダペスト条約に従って受託番号DSM 23754でDSMZに寄託された生
物に含有される核酸分子と類似または同一である核酸分子であって、好ましくは、生物に
含有される核酸分子が異種核酸分子である核酸分子
を含む第3の核酸分子によって解決され、
第3の核酸分子は、直鎖または環状分子のいずれかである。
、第3の核酸分子は、直鎖分子であり、ここで、エレメント(a)〜(f)は、好ましく
は、第1の制限部位を認識および切断する第1の制限酵素を用いて、第3の核酸分子の環
状分子を切断する際に、5’→3’方向に以下の順序で以下:
1.場合によりウイルスのゲノムの第1の部分、
2.ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位、
3.原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、
4.部位特異的組換え部位、
5.陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、ならびに
6.(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位
のとおり配置される。
施形態では、第3の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第1の部分をさらに含み、ここで、
好ましくは、第1の部分は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の1つまたは複数の末端配列を含む。
、ウイルスのゲノムの第1の部分は、許容細胞におけるあるウイルスまたは該ウイルスの
複製および/またはパッケージングを媒介するか、または必要とする。
様の第5の実施形態では、転写単位は、核酸配列の転写単位であり、このような核酸配列
は、異種核酸配列である。
5の態様の第6の実施形態では、第3の核酸分子は、細菌プラスミドまたは細菌人工染色
体である。
る、第5の態様の第7の実施形態では、第3の核酸分子は、第1の制限部位をさらに含む
。
でもある、第5の態様の第8の実施形態では、第3の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第
1の部分をさらに含む。
、ウイルスのゲノムの第1の部分は、パッケージングシグナルを含む。
は、パッケージングシグナルは、アデノウイルスゲノムに由来し、好ましくは、パッケー
ジングシグナルは、ヒトアデノウイルス5型に由来するパッケージングシグナルΨ5であ
る。
第11の実施形態では、ウイルスのゲノムの第1の部分は、あるウイルスまたは該ウイル
スのあるゲノムまたは該ゲノムの末端配列または末端配列の1つもしくはいくつかの部分
を含む。
では、あるウイルスまたは該ウイルスの末端配列は、あるウイルスまたは該ウイルスのあ
るゲノムまたは該ゲノムの1つまたはいくつかの末端反復を含む。
る、第5の態様の第13の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムま
たは該ゲノムの第1の部分は、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルスのゲノム
の第1の部分であり、より好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型、最
も好ましくは、E1転写単位のTATAボックスの上流のアデノウイルス5型の左側末端
全体またはその1つもしくはいくつかの部分である。
様の第14の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の末端配列または末端配列の1つもしくはいくつかの部分は、逆方向末端反復を含み、こ
こで、好ましくは、逆方向末端反復は、アデノウイルスの逆方向末端反復であり、より好
ましくは、逆方向末端反復は、ヒトアデノウイルス5型の左側末端に由来する。
では、逆方向末端反復は、約18〜103塩基対の任意の長さを含む。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第5の態様
の第16の実施形態では、第1の制限部位は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノ
ムまたは該ゲノムの第1の部分および転写単位の両方に存在しない。
1、第12、第13、第14、第15および第16の実施形態の一実施形態でもある、第
5の態様の第17の実施形態では、制限部位は、アデノウイルスゲノムに存在しない。
8の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス、より
好ましくはヒトアデノウイルス5型である。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17および第18の実施形態の一実施
形態でもある、第5の態様の第19の実施形態では、制限部位は、制限酵素の制限部位で
あり、制限酵素は、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSw
aIを含む群から選択される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、および第19の実施形
態の一実施形態でもある、第5の態様の第20の実施形態では、第3の核酸分子は、好ま
しくは、5’→3’方向で、
1.原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
2.部位特異的組換え部位と、
3.陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
4.(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
5.第1の制限部位と、
6.あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分と、
7.転写単位と
を含む。
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、末端
反復を含み、好ましくは、前記末端反復は、左側末端反復であり、より好ましくは、左側
末端反復は、アデノウイルスゲノムの右側逆方向末端反復である。
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、ウイ
ルスゲノムの末端反復、好ましくは逆方向末端反復、より好ましくは右側末端反復、さら
により好ましくはアデノウイルスの右側末端反復を含む。
では、アデノウイルスの右側末端反復は、ヒトアデノウイルス5型ウイルスゲノムのゲノ
ムの少なくとも103のヌクレオチドを含む。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施形態
の一実施形態でもある、第5の態様の第24の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイ
ルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、パッケージングシグナルを含み、好ま
しくは、パッケージングシグナルは、アデノウイルスパッケージングシグナルであり、よ
り好ましくは、アデノウイルスパッケージングシグナルは、ヒトアデノウイルス5型の左
側末端のΨ5である。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23および第24の実施形態の、好ましくは、第5の態様の第20、第2
1、第22、第23および第24の実施形態の一実施形態でもある、第5の態様の第25
の実施形態では、転写単位は、プロモーター、発現させる核酸および終結シグナルを含む
。
では、プロモーターは真核細胞において活性であり、好ましくは、プロモーターは、真核
生物または原核生物プロモーターを含む群から選択される。
7の実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識されるもので
あり、このようなプロモーターは、好ましくは、PGKプロモーターおよびCMVプロモ
ーターを含む群から選択される。
8の実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIによって認識されるもの
であり、このようなプロモーターは、好ましくは、U6プロモーター、H1プロモーター
、tRNAプロモーター、アデノウイルスVAプロモーターを含む群から選択される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27および第28の実施形態の、好ま
しくは、第5の態様の第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第2
7および第28の実施形態の一実施形態でもある、第5の態様の第29の実施形態では、
発現させる核酸は、コーディング核酸および非コーディング核酸配列を含む群から選択さ
れる。
では、発現させる核酸は、コーディング核酸であり、コーディング核酸は、タンパク質、
ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
では、発現させる核酸は、非コーディングRNAであり、好ましくは、発現させる核酸は
、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)またはshRNAである。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30および
第31の実施形態の、好ましくは、第5の態様の第20、第21、第22、第23、第2
4、第25、第26、第27、第28、第29、第30および第31の実施形態のいずれ
かの一実施形態でもある、第5の態様の第32の実施形態では、終結シグナルは、真核生
物またはウイルス遺伝子の終結シグナルであり、好ましくは、終結シグナルは、RNA
Pol III転写される遺伝子のpolyA シグナルおよび終結シグナルを含む群か
ら選択される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第3
1および第32の実施形態の、好ましくは、第5の態様の第20、第21、第22、第2
3、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第31および第32の
実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第5の態様の第33の実施形態では、部位特
異的組換え部位は、Flpリコンビナーゼの部位である。
では、Flpリコンビナーゼの部位は、野生型部位またはその誘導体であり、その誘導体
は、Flpリコンビナーゼと結合するのに適している。
では、Flpリコンビナーゼの部位の誘導体は、34ヌクレオチドの長さを有し、野生型
FRT部位のR2、UおよびR3エレメントを含む最小組換え部位である。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第3
1、第32、第33、第34および第35の実施形態の、好ましくは、第5の態様の第2
0、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第3
0、第31、第32、第33、第34および第35の実施形態のいずれかの一実施形態で
もある、第5の態様の第36の実施形態では、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配
列は、複製起点を含み、好ましくは、複製起点は、ファージgR6Kの最小起点である。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第3
1、第32、第33、第34、第35および第36の実施形態の、好ましくは、第5の態
様の第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第2
9、第30、第31、第32、第33、第34、第35および第36の実施形態のいずれ
かの一実施形態でもある、第5の態様の第37の実施形態では、陽性選択マーカーは、選
択薬剤に対する耐性を媒介している。
では、選択薬剤は、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、
カナマイシン、ネオマイシンおよびピューロマイシンを含む群から選択される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第3
1、第32、第33、第34、第35、第36、第37および第38の実施形態の、好ま
しくは、第5の態様の第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第2
7、第28、第29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第36、第3
7および第38の実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第5の態様の第39の実施
形態では、陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列は、bla、ant(3’’)
−Ia、aph(3’)−II、aph(3’)−II、bleおよびcmlAを含む遺
伝子の群から選択される遺伝子である。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第3
1、第32、第33、第34、第35、第36、第37、第38および第39の実施形態
の、好ましくは、第5の態様の第20、第21、第22、第23、第24、第25、第2
6、第27、第28、第29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第3
6、第37、第38および第39の実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第5の態
様の第40の実施形態では、原核生物において調節活性を有する調節配列は、原核生物に
おいて、好ましくは原核生物宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を指示する配列で
ある。
では、調節配列は、プロモーター、好ましくは、第5の態様の第40の実施形態に従って
、原核生物プロモーター、さらにより好ましくは、第5の態様の第40の実施形態に従っ
て、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーターである。
では、プロモーターは、誘導性プロモーター、好ましくは、誘導可能原核生物プロモータ
ーである。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第3
1、第32、第33、第34、第35、第36、第37、第38、第39、第40、第4
1および第42の実施形態の、好ましくは、第5の態様の第20、第21、第22、第2
3、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第31、第32、第3
3、第34、第35、第36、第37、第38、第39、第40、第41および第42の
実施形態のいずれかの一実施形態でもある、第5の態様の第43の実施形態では、陰性選
択マーカーまたは陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列の発現は、選択薬剤およ
び/または選択条件に対する感受性を媒介または付与する。
では、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列は、galK、tetAR、phe
S、thyA、lacy、ccdBおよびrpsL遺伝子を含む群から選択される遺伝子
である。
5の実施形態では、選択薬剤は、親油性化合物、スクロース、p−クロロフェニルアラニ
ン、トリメトプリム、t−o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドおよびスト
レプトマイシンを含む群から選択される。
2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、
第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第20の実施
形態のいずれかによる第2の核酸分子と、第5の態様の第1、第2、第3、第4、第5、
第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、
第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、
第27、第28、第29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第36、
第37、第38、第39、第40、第41、第42、第43、第44および第45の実施
形態のいずれかによる第3の核酸分子との組合せによって解決される。
、第3の核酸および第2の核酸は両方とも、環状の閉じた核酸分子として存在する。
施形態では、第2および第3の核酸分子は、別個の分子として各々存在する。
4の実施形態では、第3の核酸分子は、プラスミドであり、第2の核酸分子は、BACで
ある。
の第5の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスである。
6の態様の第6の実施形態では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲ
ノムの第1の部分およびあるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第
2の部分は、一緒になると、ウイルスの完全なゲノムを形成する。
、ウイルスは、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス、より好ましくはヒトア
デノウイルス5型である。
でもある、第6の態様の第8の実施形態では、完全なゲノムは、1つの、好ましくは、正
確に1つの形質導入単位を含有する。
施形態でもある、第6の態様の第9の実施形態では、第1の制限部位および第2の制限部
位は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分およびあ
るウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分の両方に存在せず
、好ましくは、ウイルスは、アデノウイルス、より好ましくはヒトアデノウイルス、さら
により好ましくはヒトアデノウイルス5型である。
の一実施形態でもある、第6の態様の第10の実施形態では、第1の制限酵素および第2
の制限酵素は、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaI
を含む群から選択される。
実施形態の一実施形態でもある、第6の態様の第11の実施形態では、完全なゲノムが、
第1および第2の制限酵素を用いる消化によって放出され得、好ましくは、第1の制限酵
素および第2の制限酵素は同一であり、より好ましくは、第1および第2の制限酵素は、
PacIである。
第11の実施形態の一実施形態でもある、第6の態様の第12の実施形態では、完全なゲ
ノムを含むウイルスは、許容宿主細胞、好ましくは、許容細胞株において、生存可能であ
り、複製能力がある。
1および第12の実施形態の一実施形態でもある、第6の態様の第13の実施形態では、
完全なゲノムは、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムの部分の欠失、好ましくは、1
つまたはいくつかの遺伝子またはコーディング領域の欠失を含む。
では、ウイルスは、アデノウイルスであり、欠失は、アデノウイルスゲノムの領域の欠失
であり、領域は、E1領域、E2領域、E3領域、E4領域およびそれらの組合せを含む
群から選択される。
1、第12、第13および第14の実施形態の一実施形態でもある、第6の態様の第15
の実施形態では、第3の核酸分子の陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付
与しており、第3の核酸分子の陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性
を付与しており、第2の核酸分子の第2の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対す
る耐性を付与している。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第6の態様
の第16の実施形態では、第3の核酸分子の陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する
耐性を付与しており、第3の核酸分子の陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対す
る感受性を付与しており、第2の核酸分子の第2の選択マーカーは、クロラムフェニコー
ルに対する耐性を付与するが、カナマイシンおよび/またはストレプトマイシンに対して
は付与しない。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第6の態様
の第17の実施形態では、第3の核酸分子の陽性選択マーカーは、第1の選択薬剤に対す
る耐性を付与しており、第3の核酸分子の陰性選択マーカーは、第2の選択薬剤に対する
感受性を付与しており、第2の核酸分子の第2の選択マーカーは、第3の選択薬剤に対す
る耐性を付与しており、ここで、第1の選択薬剤、第2の選択薬剤および第3の選択薬剤
は、互いに異なる。
1、第12、第13、第14、第15、第16および第17の実施形態の一実施形態でも
ある、第6の態様の第18の実施形態では、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配
列は、プロモーターの制御下、好ましくは原核生物プロモーターの制御下にある。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17および第18の実施形態の一実施
形態でもある、第6の態様の第19の実施形態では、第2の核酸分子は、単一コピー複製
のための細菌ヌクレオチド配列を含む。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施形態
の一実施形態でもある、第6の態様の第20の実施形態では、宿主細胞に導入された際の
組合せによって、第2の核酸分子の複製のみが可能となる。
では、条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列は、ファージgR6Kの最小起点を含
み、単一コピー複製のための配列は、複製のF因子起点またはその部分である因子をコー
ドするヌクレオチド配列を含む。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20および
第21の実施形態の一実施形態でもある、第6の態様の第22の実施形態では、第3の核
酸分子は、1つの末端反復を提供し、第2の核酸分子は1つの末端反復を提供する。
ましくは、第2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第1
0、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第20の
実施形態において定義される第2の核酸分子の以下のエレメント、すなわち、
(a)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(b)部位特異的組換え部位と、
(c)ウイルスのゲノムの第2の部分と、
(d)第2の制限部位と呼ばれる制限部位と、
好ましくは、第1の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、
第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、
第20、第21、第22、第23、第24および第25の実施形態において定義される第
1の核酸分子の以下のエレメント、すなわち、
(a)部位特異的組換え部位と、
(b)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(c)ウイルスのゲノムの第1の部分と、
(d)転写単位と、
(e)第1の制限部位と
を含む第4の核酸分子によって解決され、
ここで、第4の核酸分子は、好ましくは、環状分子であり、好ましくは、第4の核酸分
子は、第4の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施
形態のいずれかによる方法によって得られる。
、
a)第5の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、
第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、
第31、第32、第33、第34、第35、第36、第37、第38、第39、第40、
第41、第42、第43、第44および第45の実施形態のいずれかによる第3の核酸分
子を用意するステップ、
b)第2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第2
0の実施形態のいずれかによる第2の核酸分子を用意するステップ、または
c)第6の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第2
0、第21および第22の実施形態のいずれかによる組合せ、
d)部位特異的組換えが生じるように第3および第2の核酸分子を反応させるステップ
であって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され、部位特異
的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムのコピー、好ましくは単一コピーを
含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全なゲノムであり、補完された完全
なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステップ、
e)場合により、組換え生成物を選択するステップ、
f)場合により、第1および第2の制限酵素を用いて組換え生成物を切断するステップ
を含む、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法によって解決される。
、第3および第2の核酸分子を、原核生物宿主細胞、好ましくは大腸菌において反応させ
、より好ましくは、宿主細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM23743でD
SMZに寄託された生物またはこのような生物と類似の生物である。
施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス、より好まし
くはヒトアデノウイルス5型である。
4の実施形態では、宿主細胞は、F因子複製起点を欠き、第3および第2の核酸分子の両
方によって提供される選択マーカーに対して感受性である大腸菌の群から選択される。
様の第5の実施形態では、宿主細胞は、piタンパク質の発現が欠損している大腸菌株で
ある。
8の態様の第6の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌K12由来の細胞、好ましくは、D
H10Bを含む群から選択される。
第3の核酸分子および第2の核酸分子を、真核生物宿主細胞において反応させ、組換え生
成物を選択するステップは存在せず、ここで、好ましくは、真核生物宿主細胞は、許容宿
主細胞である。
、許容宿主細胞は、293細胞、911細胞、PER.C6細胞およびCAP細胞を含む
群から選択される細胞である。
8の態様の第9の実施形態では、組換え事象の数は、1つの組換え事象に限定される。
の一実施形態でもある、第8の態様の第10の実施形態では、組換え生成物の選択は、第
3の核酸分子の陽性選択マーカーおよび第2の核酸分子の第2の選択マーカーを提供する
組換え生成物を有し、陰性選択マーカーに対して感受性ではない宿主細胞(単数または複
数)を選択することによって実施される。
実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第11の実施形態では、第3の核酸分子の
陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与しており、第3の核酸分子の陰性
選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を付与しており、第2の核酸分子の
第2の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与しており、ここで、組
換え生成物の選択は、原核生物宿主細胞を、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびク
ロラムフェニコールにさらすことによって得られる。
実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第12の実施形態では、第3の核酸分子の
陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与しており、第3の核酸分子の陰性
選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を付与しており、第2の核酸分子の
第2の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するが、カナマイシン
および/またはストレプトマイシンに対しては付与せず、ここで、組換え生成物の選択は
、原核生物宿主細胞を、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびクロラムフェニコール
にさらすことによって得られる。
実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第13の実施形態では、第3の核酸分子の
陽性選択マーカーは、第1の選択薬剤に対する耐性を付与しており、第3の核酸分子の陰
性選択マーカーは、第2の選択薬剤に対する感受性を付与しており、第2の核酸分子の第
2の選択マーカーは、第3の選択薬剤に対する耐性を付与しており、ここで、第1の選択
薬剤、第2の選択薬剤および第3の選択薬剤は、互いに異なり、組換え生成物の選択は、
原核生物宿主細胞を、第1、第2および第3の選択薬剤にさらすことによって得られる。
1、第12および第13の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第14の実施形
態では、第3および第2の核酸分子は、リコンビナーゼの存在下で反応させる。
1、第12、第13および第14の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第15
の実施形態では、リコンビナーゼは、第3の核酸分子によって提供される部位特異的組換
え部位および第2の核酸分子によって提供される部位特異的組換え部位と相互作用してい
る。
1、第12、第13、第14および第15の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様
の第16の実施形態では、リコンビナーゼは、Flpリコンビナーゼである。
1、第12、第13、第14、第15および第16の実施形態の一実施形態でもある、第
8の態様の第17の実施形態では、リコンビナーゼは、第1の核酸分子または第2の核酸
分子のいずれかによってコードされる。
1、第12、第13、第14、第15および第16の実施形態の一実施形態でもある、第
8の態様の第18の実施形態では、リコンビナーゼは、原核生物宿主細胞または真核生物
宿主細胞によって提供される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17および第18の実施形態の一実施
形態でもある、第8の態様の第19の実施形態では、組換え後、リコンビナーゼは不活化
される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施形態
の一実施形態でもある、第8の態様の第20の実施形態では、リコンビナーゼ、好ましく
は、Flpリコンビナーゼは、条件付きプロモーターまたは誘導性プロモーターによって
制御される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18および第19の実施形態
の一実施形態でもある、第8の態様の第21の実施形態では、リコンビナーゼの発現は、
温度感受性複製起点によって制御される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20および
第21の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第22の実施形態では、制限酵素
は、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaIを含む群か
ら選択される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1および第22の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第23の実施形態では、
第3および第2の核酸分子は、宿主細胞中に別個に導入される。
では、第2の核酸分子は、第3の核酸分子に先立って宿主細胞中に導入される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23および第24の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様の第25
の実施形態では、組換え生成物の切断によって、許容細胞において複製能力のある、補完
された完全なウイルスゲノムが提供される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24および第25の実施形態の一実施形態でもある、第8の態様
の第26の実施形態では、方法は、さらなるステップとして、補完された完全なウイルス
ゲノムを補完性宿主細胞中にトランスフェクトすることを含む。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25および第26の実施形態の一実施形態でもある、第
8の態様の第27の実施形態では、方法は、遺伝子導入、ワクチンまたは治療用途のため
のベクターの構築において使用される。
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第2
1、第22、第23、第24、第25、第26および第27の実施形態の一実施形態でも
ある、第8の態様の第28の実施形態では、本方法は、ウイルスゲノムのライブラリーの
構築において使用される。
、好ましくは、第2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、
第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19お
よび第20の実施形態において定義される第2の核酸分子の以下のエレメント、すなわち
、
(a)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(b)部位特異的組換え部位と、
(c)ウイルスのゲノムの第2の部分と、
(d)第2の制限部位と呼ばれる制限部位と、
好ましくは、第5の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、
第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、
第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、
第30、第31、第32、第33、第34、第35、第36、第37、第38、第39、
第40、第41、第42、第43、第44および第45の実施形態において定義される第
3の核酸分子の以下のエレメント、すなわち、
(a)場合によりウイルスのゲノムの第1の部分と、
(b)ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
(c)原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
(d)部位特異的組換え部位と、
(e)陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
(f)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(g)第1の制限部位
を含む第5の核酸分子によって解決され、
ここで、第5の核酸分子は、好ましくは、環状分子であり、好ましくは、第5の核酸分
子は、第8の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、
第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、
第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27および第28の実施形態のい
ずれかによる方法によって得られる。
いて、ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法によって解決され、前記ラ
イブラリーは、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーは、複数のウイ
ルスゲノムによって表され、各ウイルスゲノムは、単一の個々のヌクレオチド配列を含有
し、第8の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第
11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第
21、第22、第23、第24、第25、第26、第27および第28の実施形態のいず
れかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレオチド配列は、第3の核酸分子の
転写単位の部分である。
いて、ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法によって解決され、前記ラ
イブラリーは、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーは、複数のウイ
ルスゲノムによって表され、第4の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、
第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第1
8および第19の実施形態のいずれかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレ
オチド配列は、第3の核酸分子の転写単位の部分である。
ある、第10および第11の態様の第2の実施形態では、個々のヌクレオチド配列は、完
全なウイルスゲノム中に単一コピーとして存在する。
施形態でもある、第10および第11の態様の第3の実施形態では、個々のヌクレオチド
配列は、発現させる核酸である。
いて、第7の態様による、好ましくは、第7の態様の第1および任意のその他の実施形態
の複数の第4の核酸分子によって解決され、ここで、複数の核酸分子は、いくつかのこの
ような個々の核酸分子からなり、個々の核酸分子は、転写単位の部分である発現させる核
酸において互いに異なる。
いて、第9の態様、好ましくは、第9の態様の第1および任意のその他の実施形態による
複数の第5の核酸分子によって解決され、ここで、複数の核酸分子は、いくつかのこのよ
うな個々の核酸分子からなり、ここで、個々の核酸分子は、第3の核酸分子のエレメント
(b)において、好ましくは、エレメント(b)のヌクレオチド配列において、またはエ
レメント(b)の転写単位の部分である発現させる核酸において互いに異なる。
ある第12および第13の態様の第2の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであ
る。
いて、複数の個々のアデノウイルスによって解決され、ここで、個々のアデノウイルスは
、第12の態様の第1および第2の実施形態のいずれかならびに第13の態様の第1およ
び第2の実施形態のいずれかに定義される個々の核酸を含有する。
いて、場合により添付文書、ならびに適した容器(単数または複数)中に、少なくとも、
第1の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11
、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21
、第22、第23、第24および第25実施形態のいずれかに定義される第1の核酸分子
、第2の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第1
1、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19および第20の
実施形態のいずれかに定義される第2の核酸分子、場合により、第4の態様の第12の実
施形態に定義される部位特異的リコンビナーゼを提供する許容細胞株、第3の態様の第1
、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13
、第14、第15、第16の実施形態のいずれかに定義される第1の核酸分子および第2
の核酸分子の組合せ、第5の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、
第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第
19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第
29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第36、第37、第38、第
39、第40、第41、第42、第43、第44および第45の実施形態のいずれかに定
義される第3の核酸分子、第6の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第
8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18
、第19、第20、第21および第22の実施形態のいずれかに定義される第3の核酸分
子および第2の核酸分子の組合せ、第7の態様の第1の実施形態に定義される第4の核酸
分子、第9の態様の第1の実施形態に定義される第5の核酸分子、第12の態様の第1お
よび第2の実施形態に定義される複数の第4の核酸分子、第13の態様の第1および第2
の実施形態に定義される複数の第5の核酸分子または第14の態様の第1の実施形態に定
義される複数の個々のアデノウイルスを含むキットによって解決される。
は、核酸分子(単数または複数)は、すぐに使用できる形態で含まれる。
実施形態では、キットは、第4の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第
8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18
および第19の実施形態ならびに第8の態様の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第
7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、
第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27お
よび第28の実施形態のいずれかに定義される、ウイルスをコードする核酸分子を作製す
るための方法において使用するためのものである。
の第4の実施形態では、キットは、第11の態様の第1、第2および第3の実施形態のい
ずれかに定義されるヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法において使用
するためのものである。
実施形態1
第3の核酸分子とも呼ばれる核酸分子であって、第3の核酸分子が、
(1)以下のエレメント:
(a)場合によりウイルスのゲノムの第1の部分と、
(b)ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位と、
(c)原核生物において調節活性を有する調節核酸配列と、
(d)部位特異的組換え部位と、
(e)陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
(f)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マ
ーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(g)場合により第1の制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号6によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)受託番号DSM23754でブダペスト条約に基づいてDSMZに寄託された生
物中に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核酸分子であって、好ましくは、生
物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含み、
第3の核酸分子が、直鎖または環状分子のいずれかである、核酸分子。
(1)原核生物において調節活性を有する調節核酸配列の核酸分子において、部位特異
的組換え部位および陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、5’から3’方向
に配置される、実施形態1に記載の第3の核酸分子。
正確に1つの部位特異的組換え部位を含有する、実施形態1から2のいずれか1つに記
載の第3の核酸分子。
直鎖分子であり、エレメント(a)から(f)が、好ましくは、第3の核酸分子の環状
分子の、第1の制限部位で認識および切断する第1の制限酵素での切断の際に、以下のと
おりの以下の順序:
1.場合によりウイルスのゲノムの第1の部分、
2.核酸配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列、または転写単位、
3.原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、
4.部位特異的組換え部位、
5.陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、ならびに
6.(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位
で5’→3’方向に配置される、実施形態1から3のいずれか1つに記載の第3の核酸分
子。
ウイルスのゲノムの第1の部分をさらに含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載
の第3の核酸分子。
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分が、あるウイルスもしくは該ウイル
スのあるゲノムもしくは該ゲノムの末端配列または末端配列の1つもしくはいくつかの部
分を含む、実施形態5に記載の第3の核酸分子。
あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分が、アデノウ
イルス、好ましくはヒトアデノウイルスのゲノムの第1の部分であり、より好ましくは、
アデノウイルスが、ヒトアデノウイルス5型、最も好ましくはE1転写単位のTATAボ
ックスの上流のアデノウイルス5型の全左側末端またはその1つもしくはいくつかの部分
である、実施形態5から6のいずれか1つに記載の第3の核酸分子。
条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列が、複製起点を含み、好ましくは、複製起
点が、ファージgR6Kの最小の起点である、実施形態1から7のいずれか1つ、好まし
くは、実施形態7に記載の第3の核酸分子。
原核生物において調節活性を有する調節配列が、原核生物において、好ましくは原核生
物宿主細胞において、ヌクレオチド配列の発現を指示する配列である、実施形態1から8
のいずれか1つ、好ましくは実施形態7から8のいずれか1つに記載の第3の核酸分子。
陰性選択マーカーまたは陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列の発現が、選択
薬剤および/または選択条件に対する感受性を媒介または付与する、実施形態1から9の
いずれか1つ、好ましくは実施形態8から9のいずれか1つに記載の第3の核酸分子。
陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、galK、tetAR、pheS、
thyA、lacy、ccdBおよびrpsL遺伝子を含む群から選択される遺伝子であ
る、実施形態10に記載の第3の核酸分子。
実施形態1から11のいずれかに定義される第3の核酸分子および第2の核酸分子とも
呼ばれる核酸分子の組合せであって、
第2の核酸分子が、
(1)以下のエレメント:
(a)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(b)部位特異的組換え部位と、
(c)ウイルスのゲノムの第2の部分と、
(d)場合により、第2の制限部位と呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号2および/もしくは配列番号13および/もしくは配列番号14による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)受託番号DSM24298および/もしくはDSM24299でブダペスト条約
に基づいてDSMZに寄託された生物に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核
酸分子であって、好ましくは、生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸
分子
を含み、
第2の核酸分子および第3の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子のいずれか
であり、好ましくは、第2の核酸分子が環状分子であり、第3の核酸分子が環状分子であ
る、組合せ。
第1の核酸分子とも呼ばれる核酸分子および第2の核酸分子とも呼ばれる核酸分子の組
合せであって、
第1の核酸分子が、
(1)以下のエレメント:
(a)部位特異的組換え部位と、
(b)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択
マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(c)ウイルスのゲノムの第1の部分と、
(d)転写単位と
(e)場合により第1の制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号1および/もしくは配列番号15によるヌクレオチド配列を含む核酸分
子、または
(3)ブダペスト条約に従って受託番号DSM23753でDSMZに寄託された生物
中に含有される核酸分子と類似または同一である核酸分子であって、好ましくは、生物中
に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸分子
を含み、
第2の核酸分子が、
(1)以下のエレメント:
(a)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選
択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(b)部位特異的組換え部位と、
(c)ウイルスのゲノムの第2の部分と、
(d)場合により、第2の制限部位とも呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号2および/もしくは配列番号13および/もしくは配列番号14による
ヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)受託番号DSM24298および/もしくはDSM24299でブダペスト条約
に基づいてDSMZに寄託された生物に含有される核酸分子と同一もしくは類似である核
酸分子であって、好ましくは、生物中に含有される核酸分子が、異種核酸分子である核酸
分子
を含み、
第1の核酸分子および第2の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子のいずれか
であり、好ましくは、第1の核酸分子が環状分子であり、第2の核酸分子が環状分子であ
る、組合せ。
第1の核酸分子が、正確に1つの部位特異的組換え部位を含有する、実施形態13に記
載の組合せ。
第1の核酸分子のウイルスのゲノムが、ヒトアデノウイルスゲノム、好ましくは、ヒト
アデノウイルス5型ゲノムとは異なるヒトアデノウイルスゲノムであり、より好ましくは
、第1の核酸分子のウイルスのゲノムが、ヒトアデノウイルス19a型ゲノムである、実
施形態13および14のいずれか1つに記載の組合せ。
第1の核酸分子の条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列が、複製起点を含む、実
施形態13から15のいずれか1つに記載の組合せ。
第1の核酸分子の第1の選択マーカーを提供する配列が、酵素をコードするこのような
核酸配列を有する宿主細胞に耐性を付与する酵素をコードする核酸配列である、実施形態
13から16のいずれか1つに記載の組合せ。
第1の核酸分子のウイルスのゲノムの第1の部分が、ウイルス末端反復、好ましくはア
デノウイルス末端反復である、実施形態13から17のいずれか1つに記載の組合せ。
第1の核酸分子のウイルスのゲノムの第1の部分が、アデノウイルスプロモーターpI
Xを含有し、より好ましくは、アデノウイルスプロモーターpIXが、ヒトアデノウイル
ス19a由来のpIXプロモーターである、実施形態13から18のいずれか1つに記載
の組合せ。
第2の核酸分子が、正確に1つの部位特異的組換え部位を含有する、実施形態12から
19のいずれか1つに記載の組合せ。
第2の核酸分子のウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルスゲノムであり、実施形態12
に記載の組合せの場合には、第2の核酸分子のウイルスゲノムが、好ましくはヒトアデノ
ウイルス5型ゲノムまたはヒトアデノウイルス19a型ゲノムであり、実施形態13に記
載の組合せの場合には、第2の核酸分子のウイルスゲノムが、好ましくは、ヒトアデノウ
イルス5型ゲノムとは異なるヒトアデノウイルスゲノムであり、より好ましくは、第2の
核酸分子のウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルス19a型ゲノムである、実施形態12
から20のいずれか1つに記載の組合せ。
第2の核酸分子の単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列が、原核生物宿主細胞
における単一コピー維持のための複製起点を含む、実施形態12から21のいずれか1つ
に記載の組合せ。
第2の核酸分子マーカーの第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、酵素を
コードするこのような核酸配列を有する宿主細胞に耐性を付与する酵素をコードする核酸
配列である、実施形態12から22のいずれか1つに記載の組合せ。
第2の核酸分子のウイルスのゲノムの第2の部分が、ウイルスの逆方向末端反復、好ま
しくはアデノウイルス逆方向末端反復、より好ましくはアデノウイルス右側逆方向末端反
復を含む、実施形態12から23のいずれか1つに記載の組合せ。
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法であって、
a)実施形態1から11のいずれか1つに定義される第3の核酸分子を用意するステッ
プ、
b)実施形態12に定義される第2の核酸分子を用意するステップ、または
c)実施形態12から24のいずれか1つに記載の第3の核酸分子および第2の核酸分
子の組合せ、
d)部位特異的組換えが起こるように第3および第2の核酸分子を反応させるステップ
であって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され、部位特異
的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムのコピー、好ましくは単一コピーを
含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全なゲノムであり、補完された完全
なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステップ、
e)場合により、組換え生成物を選択するステップ、ならびに
f)場合により、第1および第2の制限酵素を用いて組換え生成物を切断するステップ
を含む、方法。
ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法であって、
a)実施形態13から24のいずれか1つに記載の第1の核酸分子および第2の核酸分
子の組合せ、
b)部位特異的組換えが起こるように第1および第2の核酸分子を反応させるステップ
であって、部位特異的組換えが、部位特異的リコンビナーゼによって媒介され、部位特異
的組換えが、あるウイルスまたは該ウイルスのゲノムのコピー、好ましくは単一コピーを
含む組換え生成物を形成し、ゲノムが、補完された完全なゲノムであり、補完された完全
なゲノムが、部位特異的組換えによって補完されるステップ、
c)場合により、組換え生成物を選択するステップ、ならびに
d)場合により、第1および第2の制限酵素を用いて組換え生成物を切断するステップ
を含む、方法。
第3および第2の核酸分子を、ブダペスト条約に従って受託番号DSM23743でD
SMZに寄託された生物と類似または同一である原核生物宿主細胞、好ましくは大腸菌に
おいて反応させる、実施形態25に記載の方法。
第1および第2の核酸分子を、ブダペスト条約に従って受託番号DSM23743でD
SMZに寄託された生物と類似または同一である原核生物宿主細胞、好ましくは大腸菌に
おいて反応させる、実施形態26に記載の方法。
ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーが
、複数の個々の核酸配列を含み、前記ライブラリーが、複数のウイルスゲノムによって表
され、各ウイルスゲノムが、単一の個々のヌクレオチド配列を含有し、実施形態25およ
び27のいずれかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレオチド配列が、第3
の核酸分子の転写単位の部分である、方法。
ヌクレオチド配列のライブラリーを作製するための方法であって、前記ライブラリーが
、複数の個々のヌクレオチド配列を含み、前記ライブラリーが、複数のウイルスゲノムに
よって表され、各ウイルスゲノムが、単一の個々のヌクレオチド配列を含有し、実施形態
26および28のいずれかに定義される方法のステップを含み、個々のヌクレオチド配列
が、第1の核酸分子の転写単位の部分である、方法。
場合により添付文書、ならびに適した容器(単数または複数)中に少なくとも実施形態
1から11のいずれか1つに定義される第3の核酸分子および/または実施形態12から
24のいずれか1つに記載の第3の核酸分子および第2の核酸分子の組合せを含むキット
。
場合により添付文書、ならびに適した容器(単数または複数)中に少なくとも実施形態
13から19のいずれか1つに定義される第1の核酸分子および/または実施形態13か
ら24のいずれか1つに記載の第1の核酸分子および第2の核酸分子の組合せを含むキッ
ト。
核酸分子(単数または複数)がすぐに使用できる形態で含有され、かつ/またはキット
が使用説明書を含有する、実施形態31および32のいずれか1つに記載のキット。
たは「提供すること(providing)」とは、種々の方法に関連して、好ましくは
、このような方法に従う任意のステップを実施するために提供される核酸分子が入手可能
であることおよびこのような核酸分子を、このようなステップの前または直前に合成する
必要がないことも意味するということは理解される。むしろこのような核酸分子は、この
ような核酸分子の任意の貯蔵物から持ち込まれ得る。
象の数に関わりなく感染性ウイルスベクターゲノムの構築が可能となり、第2の核酸系に
ついて記載されるように、部位特異的組換えを使用する場合には、組換え事象の数を1に
制限し、第1のこのような系は、本発明の第1の核酸分子および本発明の第2の核酸分子
の組合せからなり、第2のこのような系は、本発明の第3の核酸分子および本発明の第2
の核酸分子の組合せからなる。当業者には、本発明に一致して、組換え事象の特定のパー
センテージは、複数の組換えをもたらすということは認識されよう。好ましくは、このよ
うなパーセンテージは、5%未満、好ましくは、3%未満、より好ましくは、2.5%未
満である。複数の組換え事象の出現は、混入であり、組換え体をスクリーニングし、特徴
付けることを必要とする。このようなスクリーニングは、ウイルスをコードする核酸分子
を作製するための本発明の方法に関連して実施され、組換え型産物の選択と呼ばれる。
て得られた組換え生成物は、組込み事象の数に関わらず、ウイルスゲノムの正確に1つの
コピーを含有する。本発明は、複数の組換えを排除し、複数のウイルスベクターゲノムを
含有するライブラリーのスクリーニングを避けるための溶液を提供した。このようなウイ
ルスゲノムまたは複数のウイルスゲノムは、ウイルス、好ましくはアデノウイルスの補完
された完全なゲノムである。このようなウイルスのゲノムは、ユニークな制限酵素を用い
る制限消化によって放出され、それによって、ウイルスゲノムと接続しているすべての細
菌配列を除去する。したがって、これらの方法によって作製されたウイルスゲノムは、本
質的に、不要な細菌配列は全く含まない。
が、組込み事象の数に関わらず、補完された完全なウイルスゲノムの正確に1つのコピー
を含有することを暗示する。したがって、本発明において、部位特異的リコンビナーゼの
存在下で該アデノウイルスまたはあるアデノウイルスに対して許容的な真核細胞宿主細胞
において、第1または第3の核酸の直線化された形態を、第2の核酸の直鎖形態と反応さ
せる方法が開示される。この方法は、組換え生成物を選択するステップを必要としない。
数のアデノウイルスゲノムの構築のために、例えば、Gateway(商標)システムの
対象のような、部位特異的組換えを使用する。より詳しくは、本発明の第1または第3の
核酸分子のいずれか上、および第2の核酸分子上に存在する1つのFrt部位間の組換え
によって、in vitroで、2つの同一でない組換え部位間の組換えと関連している
不利点が回避され、高効率および忠実度での複数のウイルスゲノムの作製が可能となる。
コスミドまたはプラスミドベクターにおけるゲノムDNA不安定性の問題を解決する。こ
のような方法と関連して、この効果は、単一コピーのF因子レプリコンを使用して複製す
る細菌人工染色体(BAC)の使用によって媒介される(Kim UJら、Nuclei
c Acids Res.、20:1083〜1085頁、1992年;Shizuya
HおよびKouros−Mehr H.、Keio J.Med.50:26〜30頁
、2001年)。さらに、本発明の方法は、複数の組換え事象のパーセンテージに関して
上記の考慮の対象となる大腸菌において生じる組換え反応について、組換え事象の数を1
に制限することによって、純粋なライブラリーの構築のための部位特異的組換えの制限を
克服する。ライブラリーは、単一コピーBACにおいて安定に維持され得、したがって、
現在のウイルス発現ライブラリーの制限を克服する。アデノウイルスの場合には、ライブ
ラリーは、生命体ウイルスとして維持され、したがって、cDNAの発現が増殖利点また
は不利点を付与し、したがって、ライブラリー集団中で過剰または過少提示されるcDN
A発現ライブラリーの場合には当然である、増殖利点を有するウイルス突然変異体の選択
による偏りの対象となる。さらに、本発明の方法による選択またはスクリーニングの使用
によって、多重挿入を有する組換え生成物は、完全に排除される。本明細書において好ま
しく使用されるように、選択は、第3の核酸分子および第2の核酸分子を使用するウイル
スをコードする核酸分子を作製するための方法の場合には、反応生成物が、両核酸分子に
よって提供された陽性および陰性選択マーカーの組合せの使用によって選択され得、第3
の核酸分子によって提供された陽性選択マーカーが、選択薬剤に対する耐性を付与し、第
3の核酸によって提供された陰性選択マーカーが、選択薬剤に対する感受性を付与し、第
2の核酸によって提供された第2の選択マーカーが、第2の選択薬剤に対する耐性を提供
することを意味する。
vitroおよびin vivoで組換えベクターゲノムの構築のためにFrt/Fl
p系に適用される解決法に関する。
有する大腸菌宿主における、各々、リコンビナーゼFlpの1つの認識部位を有する、2
種の核酸間の部位特異的組換えを含む系が、上記の制限を克服することができ、第2の核
酸における、また得られた組換え生成物におけるアデノウイルスゲノムの遺伝的安定性を
保ちながら、2種の核酸間の組換えの数を1に制限しながら、高効率、正確度でのアデノ
ウイルスゲノムおよび複数のアデノウイルスゲノムの構築を可能にすることを見い出した
。結果として、本発明の問題はまた、大腸菌における部位特異的組換えに基づいてウイル
スベクターを構築するための、高効率の信頼性のある簡単な方法を提供する、Flpリコ
ンビナーゼによって媒介される部位特異的組換えのための2つの核酸系によって解決され
る。
わち、第1の核酸分子および第2の核酸分子を含む系ならびに第2の核酸分子および第3
の核酸分子を含む系と一緒に使用することが、本発明のさらなる目的である。これは、ヌ
クレオチド配列を含有する複数の組換えられた核酸を構築するための高効率の信頼性のあ
る簡単な方法を提供する。好ましくは、このようなヌクレオチド配列は、ウイルス、好ま
しくはアデノウイルスのゲノムヌクレオチド配列またはその部分(単数または複数)であ
る。良好な形質転換効率を保つために、300kbを越えるゲノムを安定に維持するため
の本発明のこの態様を使用することは可能であるが、第1および第3の核酸の大きさは、
100kb未満であるべきであり、核酸のライブラリーが構築されるべきである場合には
、好ましくは、40kb未満、さらにより好ましくは、10kb未満であるべきである。
る、核酸分子、ベクターおよび方法に関する。核酸ライブラリーの作製のための方法が開
示され、本発明の方法の好ましい実施形態では、方法は、ウイルスゲノムおよび複数のそ
のウイルスゲノムを作製するためのものである。核酸分子は、個々に、または組合せとし
て、また本発明に開示される方法は、より信頼性があり、部位特異的組換え系の使用を拡
大し、中でも、補完された完全な、それぞれのウイルスゲノムの構築および偏りのない安
定なウイルスゲノムのライブラリーの作製を可能にする。
核酸分子を組み換えるために、部位特異的組換えを使用する、核酸分子の作製、ウイルス
ゲノムまたはその複数のウイルスゲノムの作製のための方法に関する。ウイルスゲノムま
たは複数のウイルスゲノムの作製のための方法が開示され、本発明の方法の好ましい実施
形態では、方法は、アデノウイルスベクターを作製するためのものである。本発明に開示
される方法は、アデノウイルス作製のための確立された方法よりも相当に迅速であり、部
位特異的組換え系の使用を拡大し、補完性細胞株において複製能力のある、ウイルスゲノ
ムまたは複数のウイルスゲノムの作製を可能にする。
ルスの補完された完全なゲノムを形成する2種のDNAをつなぎ合わせるための、Flp
リコンビナーゼによって媒介される部位特異的組換えのための高効率を有する大腸菌にお
ける第1の核酸系を提供する。本発明の核酸分子、より詳しくは、第1の核酸分子、第2
の核酸分子および第3の核酸分子の1つの適用は、E1、場合により、E3遺伝子につい
て欠失しており、E1遺伝子の代わりに外来DNAを含有するアデノウイルスゲノム(第
1世代アデノウイルスベクター)の構築である。
アデノウイルス、好ましくはヒト19a型アデノウイルスの補完された完全なゲノムを形
成する2種のDNAをつなぎ合わせるための、Flpリコンビナーゼによって媒介される
部位特異的組換えのための高効率を有する大腸菌における第1の核酸系が提供される。本
発明の核酸分子、より詳しくは、第1の核酸分子および第2の核酸分子の1つの適用は、
E1、場合により、E3遺伝子について欠失しており、E1遺伝子の代わりに外来DNA
を含有するヒト非5型アデノウイルスゲノム(第1世代血清型アデノウイルスベクター)
の構築である。
)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、部
位特異的組換え部位、優先的には野生型Frt部位(配列番号8)、ウイルスのゲノムの
第2の部分、優先的にはアデノウイルスのゲノムの第2の部分、ならびにより優先的には
ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイルス19a型の第2の部分、ならびに場合
により第2の制限部位を含むベクターpBACSir2(配列番号2)またはpBACS
ir Ad19a(配列番号14)と同一または類似である、1つの野生型Frt部位を
含有する、好ましくは、BACである第2の核酸分子が開示される。さらに、ウイルスの
ゲノムの第1の部分、優先的にはアデノウイルスのゲノムの第1の部分、さらにより優先
的にはアデノウイルス5型またはヒトアデノウイルス19a型の第2の部分、転写単位、
部位特異的組換え部位、優先的には最小のFrt部位(配列番号7)、(i)条件付き複
製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択マーカーを提供するヌクレ
オチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位を含む第1の核酸分子に対応する、pDon
orSir1(配列番号1)またはプラスミドpDonorSir19a(配列番号15
)と同一または類似であるプラスミドが提供される。
、優先的にはアデノウイルスのゲノムの第1の部分、さらにより優先的にはアデノウイル
ス5型ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列の第2の部分または転写単
位、原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、優先的には細菌プロモーター、部
位特異的Frt部位、優先的には最小のFrt(配列番号7)、陰性選択マーカーを提供
するヌクレオチド配列、(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(i
i)陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、場
合により第1の制限部位を含有する、本発明の第3の核酸分子に対応するpDonorS
ir2(配列番号6)と類似または同一であるプラスミドである。
イルスゲノム、優先的には、アデノウイルスゲノムまたはその複数のアデノウイルスゲノ
ム、より優先的には、アデノウイルス5型ゲノムまたは複数のアデノウイルス5型ゲノム
の構築である。開示された方法の1つのさらなる適用は、ウイルス発現ライブラリーの作
製である。本発明の核酸系およびウイルスゲノムをコードする核酸分子を作製するための
方法は、同等の非アデノウイルス5型ゲノムの操作および構築との類似性によって同様に
適用可能である。さらなる実施形態では、このような核酸分子および方法は、それぞれ、
ミラー設定において適用され得、ヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムの右側末端
(例えば、E3)にレスキューされるか、E4遺伝子を欠失するため、またはこのような
ヌクレオチド配列を保持するアデノウイルスゲノムもしくは複数のアデノウイルスゲノム
を作製するために適用される。「ミラー設定」における2種の核酸系の使用の1つの適用
は、突然変異ウイルスタンパク質を用いるアデノウイルスゲノムまたは複数のアデノウイ
ルスゲノムの構築である。
酸分子および第2の核酸分子を含む組合せの使用をそれぞれ開示する。第1と第2または
第3と第2の核酸分子を、Flpリコンビナーゼによって媒介される部位特異的組換えに
よって大腸菌において高効率で反応させる。本発明では、第2の核酸分子は、BACであ
り、1つの、好ましくは、野生型Frt部位を含有し、第2の核酸分子は、ベクターpB
ACSir1、pBACSir2またはBacSir19aと同一または類似である。さ
らに、pDonorSir2と同一または類似の第3の核酸が開示される。この系の1つ
の適用は、各々、補完された完全なウイルスゲノムの1つのコピーを含有する、第4、第
5の核酸または複数の第4または第5の核酸分子の構築である。
本発明に提供される方法による第4の核酸分子に対応する反応生成物は、核酸分子pD
onorSir1またはpDonorSir19aおよびそれぞれpBACSir1また
はpBACSir19aと同一または類似のヌクレオチド酸分子間の組合せと、それに続
く大腸菌宿主細胞における部位特異的組換えに起因する。2種の核酸分子pDonorS
ir1およびpBACSir1間の部位特異的組換えに起因する反応生成物を、XhoI
を使用する制限分析によって特徴付けた(図2A)。1回組換えられた反応生成物pRA
B1x(配列番号4)および2回組換えられた反応生成物pRAB2x(配列番号5)の
制限分析が、図2Aに示されている。得られた反応生成物pRAB1xおよびpRAB2
xは、PacIを用いる制限消化によって反応生成物から放出された、補完された完全な
ヒトアデノウイルス5型ゲノムの正確に1つのコピーを含有していた。PacI消化され
たDNAを、293細胞にトランスフェクトし、組換えアデノウイルスが得られた。29
3細胞の増殖性感染後に単離されたアデノウイルス由来のDNAを、XhoIを用いる制
限消化によって分析した(図2A)。Flp媒介性組換え反応および得られた1回および
2回組換えられた反応生成物の模式図が、図1に示されている。
部位特異的組換えに起因する、本発明に提供された方法による第5の核酸分子に各々対応
する複数の反応生成物を、XhoIを使用する制限分析によって特徴付けた(図2B)。
1回組換えられた反応生成物pRAB_RPSL_1x(配列番号11)および2回組換
えられた反応生成物pRAB_RPSL_2x(配列番号12)のXhoIを用いる制限
分析が、図2Bに示されている。得られた反応生成物の大部分(83/88)は、pDo
norSir2およびpBACSir2間の単回組換えに起因していた(図2B)。(2
/88)組換え生成物の制限消化パターンは、2重に組み換えられた生成物pRAB_R
PSL_2xに対応していた。反応スキームおよび反応生成物の模式図が、図3に示され
ている。単回組換えられた生成物pRAB_RPSL_1xでは、原核生物において調節
活性を有する調節核酸配列、本明細書では、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーターおよび
陰性選択マーカー、本明細書では、RPSL遺伝子は、互いに機能的に分離しているが、
驚くべきことに、二重に組換えられた生成物pRAB_RPSL_2xについては、陰性
選択マーカーは、2種の陽性選択マーカーと組み合わせて、高度に機能的であり、二重に
組換えられた反応生成物の最小のバックグラウンドにつながった。この実施例において得
られた結果に基づいて(図3)、二重組換え生成物pRAB_RPSL_2xの高効率対
抗選択のための、陽性および陰性選択マーカーの可能性ある組合せを説明するマトリック
スが図6に示されている。
って媒介される部位特異的組換えを、部位特異的リコンビナーゼを提供する真核細胞宿主
細胞において行った。核酸分子pDonorSir1−EGFP(配列番号9)およびp
BACSir2を、それぞれ、第1および第2の制限部位を認識する酵素を用いて消化し
、直線化された核酸分子を、Flpリコンビナーゼを安定に発現する293細胞にトラン
スフェクトした。得られた組換え生成物は、293細胞において複製能力のあるEGFP
遺伝子を発現する補完された完全なヒトアデノウイルス5型ゲノムの1つのコピーを含有
していた(図4)。
ス血清型に移すことができ、GFPを発現する組換えアデノウイルス型Ad19aベクタ
ーを作製した。アデノウイルス19a型ゲノムを、左側ITRを含むAd19aゲノムの
左側末端、パッケージング部位およびポリアデニル化部位を含めたE1遺伝子領域につい
て欠失しているBAC(pBACSir19a)に、欠失しているエレメントのコピーを
保持するドナープラスミドのFlp媒介性挿入を可能にするためにこの部位に導入された
FRT部位を用いてクローニングした。さらに、微量のキャプシッドタンパク質をコード
するpIX遺伝子の発現に必要であるpIXプロモーターが、核酸pBACSir19a
中に保存された。さらに、pBACSir19aはまた、欠失されたE3領域も有してい
た。pBACSir19aベクターの配列は、配列番号14に提供されている。pIXプ
ロモーター、より詳しくは、アデノウイルスpIXプロモーターは、当技術分野で公知で
あり、その配列は、公的に入手可能なデータバンクから検索され得る。それに関連して、
当業者ならば、本明細書において好ましく使用されるpIXプロモーターは、アデノウイ
ルスにおいてpIXコード配列と作動可能に連結しているプロモーターであり、このよう
なアデノウイルスは、好ましくは、アデノウイルス5型またはアデノウイルス19a型で
あるということは認識されよう。一実施形態では、pIXプロモーターは、最小のプロモ
ーターであり、ここで前記の最小のプロモーターは、アデノウイルスpIX遺伝子の上流
のプロモーター領域に起因する70ヌクレオチドのDNAエレメントである。さらなる実
施形態では、最小のpIXプロモーターは、Ad5にTATAボックスおよびSp1ボッ
クスを含み、アデノウイルスゲノムのヌクレオチド3511〜3580に対応する。アデ
ノウイルスの多数のその他の(血清)型は、pIX遺伝子およびその上流プロモーターを
同様に含有し、これらのpIXプロモーターに起因する最小のプロモーターも、本発明に
同様に包含される。
ッケージングシグナルならびにEGFP転写単位を保持し、ドナーベクターpDonor
Sir1に匹敵するが、すべてのウイルスシスエレメントは、ヒトアデノウイルス19a
型由来の配列(配列番号15)によって置き換えられている。本発明において提供された
方法に従って得られた反応生成物は、核酸分子pDonorSir19aおよびそれぞれ
pBACSir19aと同一または類似のヌクレオチド酸分子間の大腸菌宿主細胞におけ
る組合せとそれに続く部位特異的組換えに起因する、複製能力のある組換えアデノウイル
ス19a型ゲノム全体を含有していた。得られた反応生成物を、KpnIを使用する制限
分析によって特徴付けた(図7)。得られた核酸の2種の独立したクローン(レーン1お
よびレーン4)を精製し、PacIを用いて消化し、293細胞をトランスフェクトし、
生存可能な組換えAd19aベクターが得られた。
物は、pDonorSir2_Ad19aの大腸菌宿主細胞における組合せおよび部位特
異的組換えに起因する。プラスミドpDonorSir2_Ad19aは、本発明の第3
の核酸分子の実施形態であり、すべてのAd5由来の配列に関してpDonorSir2
とは異なり、それらは、対応するAd19a配列によって置き換えられている。pDon
orSir2_ad19aおよびpBACSir19a間の組換えの結果、本発明に従っ
て、単一の組換え生成物が得られる。この単一の組換えられた生成物では、原核生物にお
いて調節活性を有する調節核酸配列、本明細書では、大腸菌ガラクトキナーゼプロモータ
ーおよび陰性選択マーカー、本明細書では、RPSL遺伝子は、互いに機能的に分離して
いるが、驚くべきことに、二重に組換えられた生成物については、陰性選択マーカーは、
2種の陽性選択マーカーと組み合わせて、高度に機能的であり、二重に組換えられた反応
生成物の最小のバックグラウンドにつながる。この実施例において得られた結果に基づい
て、二重組換え生成物の高効率対抗選択のための、陽性および陰性選択マーカーの可能性
ある相乗的組合せを説明するマトリックスが図6に示されている。
本発明は、ウイルスのゲノムの第2の部分を含む第2の核酸分子と組み合わせたウイル
スのゲノムの第1の部分を有する第1の核酸を開示し、第1および第2の核酸分子を、部
位特異的リコンビナーゼを提供する大腸菌宿主細胞において組み合わせ、部位特異的組換
えによって反応させる。得られた核酸分子は、あるウイルスまたは該ウイルスの補完され
た完全なゲノムの正確に1つのコピーを含有し、ウイルスゲノムは、許容細胞において複
製能力がある。本発明の概略図が、図1に示されている。本発明のさらなる実施形態では
、第3の核酸分子が記載される。第3の核酸を、部位特異的リコンビナーゼを提供する大
腸菌宿主細胞において、第2の核酸分子と組み合わせ、部位特異的組換えによって反応さ
せる。第3の核酸分子中の遺伝エレメントの機構は、発明性があり、本発明において提供
される方法に従って、97.5%超の場合において組換え事象の数を1に制限する。この
効率は、複数の第5の核酸分子または第5の核酸分子のライブラリーの構築にとって十分
であり、単一の組換えられた生成物についてこのような複数の核酸またはライブラリーを
スクリーニングする必要性という問題を解決する。本方法の図表示は、図3に示されてい
る。
ノムの第1の部分、さらにより優先的には、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウ
イルス19a型の第1の部分を含む。さらに、第1の核酸分子は、転写単位、部位特異的
組換え部位、優先的には最小のFrt部位(配列番号7)、(i)条件付き複製のための
細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択マーカーを提供する核酸配列を含む細
菌ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、第1の核酸は、ウイルスのあるゲノ
ムまたは該ゲノムの第1の部分を含有する細菌プラスミドであり、あるウイルスまたは該
ウイルスのゲノムの第1の部分は、末端反復、好ましくは、逆方向末端反復である。より
好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、末端反復は、アデノウイル
スの逆方向末端反復である。最も好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイル
ス5型であり、ヒトアデノウイルス5型のゲノムの第1の部分は、左側逆方向末端反復で
ある。
を含む。好ましい実施形態では、パッケージングシグナルは、末端配列の部分であり、よ
り好ましい実施形態では、パッケージングシグナルは、AV5ゲノムのnt194からn
t385に伸びるヒトアデノウイルス5型に由来するパッケージングシグナル(Ψ5)で
ある。アデノウイルスベクターのパッケージングは、一部が他のものよりもより重要であ
る階層的順序で使用される一連の7個の「A」の反復に頼っている。したがって、この領
域に由来する配列の部分を組み合わせることによって合成または最小パッケージング配列
を規定することがあり得る。アデノウイルスゲノムの左側部分へのシス作用性パッケージ
ングエレメントの位置が、アデノウイルスの多数のその他の型について実験的に確認され
ている。さらに、パッケージングプロセスのトランス作用因子の同定によって、サブタイ
プ特異的な方法で作用するいくつかのアデノウイルスタンパク質が同定され、これは、キ
ャプシド形成シグナルΨおよびトランス作用因子が、同一サブタイプに由来するか、適合
性である場合には、ウイルスDNAのパッケージングのみを可能にする。
位のTATAボックスの上流のAV5ゲノムの左側末端の全部または部分を含む、ウイル
スのゲノムの第1の部分。
ITR)を含有し、好ましい実施形態では、逆方向反復は、ヒトアデノウイルス5型(A
V5)の左側末端に由来し、左側逆方向末端反復を含む。左側逆方向末端反復配列(左側
ITR)の長さは、AV5配列のヌクレオチド1からヌクレオチド103に伸長する。I
TRの大きさは、アデノウイルスの血清学的に別個の型の間で変わり、in vivoで
ヒトアデノウイルス4型ウイルス複製を支持する18bp(nt1からnt18)程度の
短い最小末端ITR配列が、規定され得る。ITRの末端18bpは、DNA複製の基礎
レベルを支持するが、それぞれ、サブグループCアデノウイルス、AV2およびAV5で
は最大効率のために補助的領域が必要とされる。その他のウイルス型(例えば、アデノ随
伴ウイルスAVV)はまた、ウイルス複製のためのITRの存在に頼っている。ヒトAA
V2型については、ITRの長さは、145ヌクレオチドであり、ウイルス複製のために
必要な必須の末端配列である。原則はまた、複製およびキャプシド形成に必要なITR以
外の末端配列を含有する、その他の型のウイルス(例えば、SV40、バキュロウイルス
、γヘルペスウイルス)にも当てはまる。例として、サイトメガロウイルスゲノムのα配
列は、単純ヘルペスウイルス欠損ゲノムの切断/パッケージングシグナルとして機能する
。
スのゲノムの第1の部分中、および第1の核酸中に存在する転写単位中には存在しない。
本発明の好ましい実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制
限部位の群から選択される。より好ましい実施形態では、制限部位は、AbsI、Bst
BI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaIを含む、ヒトアデノウイルス5型
(AV5)中に存在しない部位の群から選択される。
ための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択マーカーを提供するヌクレオチ
ド配列を含む細菌ヌクレオチド配列、第1の制限部位、ウイルスのゲノムの第1の部分な
らびに転写単位を含み、好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、よ
り好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイル
ス19a型である。
の直鎖化後に得られる5’から3’方向に、以下のエレメントを含む第1の核酸分子を提
供する。ウイルスのゲノムの第1の部分、転写単位、部位特異的組換え部位、(i)条件
付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の選択マーカーを提供する
ヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、場合により第1の制限部位。発明的
内容によって、これが、第1の核酸分子の遺伝エレメントの好ましい方向である。
特異的組換え部位、転写単位、ウイルスのゲノムの第1の部分、場合により第1の制限部
位、ならびに(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第1の
選択マーカーを提供する配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位を含む「ミラーコンホメー
ション」で含有する。発明的内容によって、これが、第1の核酸分子の遺伝エレメントの
さらなる方向である。
は、末端反復を含む。好ましい実施形態では、ウイルスのゲノムの第1の部分は、逆方向
末端反復を含む。より好ましい実施形態では、ウイルスゲノムの右側末端反復を含み、さ
らにより好ましくは、アデノウイルスの右側末端反復は、ヒトアデノウイルス5型ウイル
スゲノムのゲノムの最後の103ヌクレオチドである。
結シグナルを含有する転写単位に関する。
現させる核酸配列および終結シグナルを含む転写単位を含有し、プロモーターは、PGK
などの真核生物RNA Pol IIおよびCMVによって認識される真核生物もしくは
ウイルスプロモーターの群から、またはU6、H1、tRNAおよびアデノウイルスVA
プロモーターなどのRNA Pol IIIによって認識される真核生物もしくはウイル
スのプロモーターの群から選択されるべきである。
を含有する転写単位に関し、発現させる核酸は、タンパク質、ペプチドをコードする核酸
、マイクロRNAおよび低分子干渉RNA(siRNA)およびshRNAを含めた非コ
ーディングRNAをコードする核酸の群から選択される。
グナルを含有し、それでは、終結シグナルは、ポリAシグナル、ストレッチTヌクレオチ
ドなどのRNA PolIIIによって転写される遺伝子の終結シグナルなどの真核生物
またはウイルスの遺伝子に由来する。
換え部位を含む。第1の核酸分子において使用されるFrt部位は、S.セレビシエ(c
erevisiae)のμプラスミドに由来する野生型Frt部位に基づいている。本発
明の一実施形態では、使用されるFrt部位は、野生型の48種のFrt部位に由来する
形態に制限されない(配列番号8)。それは、当技術分野で公知の突然変異Frt部位を
含めたその他のFrt部位の群から選択され得る(Schlake T.およびBode
J.Biochemistry 33:12746〜12751頁、1994年54;
WO/1999/025854)。本発明の好ましい実施形態では、第1の核酸分子にお
いて使用されるFrt部位は、wt FRT部位のR2、UおよびR3エレメントを含有
する、34ntの長さの最小の組換え部位である(配列番号7)(Cherepanov
PPおよびWackernagel W.Gene158:9〜14頁、1995年)
。
製のための細菌配列、および(ii)第1の選択マーカーを提供する配列を含み、複製の
ための細菌配列は、複製起点(ori)を含有する。
複製のための細菌配列、および(ii)第1の選択マーカーを提供する配列を含み、複製
のための細菌配列は、細菌細胞が必要なすべての機能を提供する特別な条件下での、特別
な大腸菌株における、または正常な大腸菌株における条件付き複製のための複製起点を含
有する。好ましい実施形態では、第1の核酸分子中の細菌配列は、piタンパク質発現の
存在下でのみ維持され得る条件付きレプリコンとしてファージgR6Kの最小のoriを
含有する(Shafferman Aら、J.Mol.Biol.161:57〜76頁
、1982年)。
提供し、選択マーカーは、選択薬剤に対するこのような核酸を有する細胞に耐性を付与す
る核酸である。本発明の好ましい実施形態では、第1の選択マーカーは、遺伝子をコード
し、より好ましい実施形態では、第1の選択マーカーは、好ましくは、当技術分野で公知
のものの中でも、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、テ
トラサイクリンおよびカナマイシンを含めた抗生物質に対する耐性を媒介する。本発明の
最も好ましい実施形態では、第1の選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を媒介す
る。
)−Ia、aph(3’)−II、aph(3’)−II、bleおよびcmlA、aa
dA、aadB、sacBおよびtetA遺伝子を含めた抗生物質に対する耐性を媒介す
る遺伝子の群から選択され得る。好ましい実施形態では、カナマイシンに対する耐性を媒
介するタンパク質をコードする遺伝子が、第1の選択マーカーである。
オチド配列、および(ii)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌
ヌクレオチド配列単位、部位特異的組換え部位、ウイルスのゲノムの第2の部分、ならび
に場合により第2の制限部位と呼ばれる制限部位を含む第2の核酸分子である。
り、ウイルスのゲノムの第1の部分と組み合わせるウイルスのゲノムの第2の部分は、補
完性細胞株において複製できる、補完された完全なウイルスゲノムを形成する。
より好ましい実施形態では、第2の核酸は、ヒトアデノウイルス5型(AV5)ゲノムの
第2の部分を含有する。より好ましい実施形態では、ウイルスゲノムの第2の部分は、A
V5の左側ITR、E1領域およびE3領域について欠失しており、場合により、キャプ
シド形成シグナルΨ5について欠失しているAV5ゲノムであり、第1の核酸が、このウ
イルスゲノムを、左側ITRについて、場合により、キャプシド形成シグナルについて補
完する。さらに、許容細胞株が、シスまたはトランスで欠失された配列について補完し得
る限りは、E2またはE4領域に由来するさらなる配列が、同様に欠失され得るので、A
V5ゲノムの第2の部分の欠失は、E1およびE3に限定されない。
し、より好ましい実施形態では、第2の核酸は、ヒトアデノウイルス19a型(AV19
a)ゲノムの第2の部分を含有する。より好ましい実施形態では、ウイルスゲノムの第2
の部分は、AV19aの左側ITR、E1領域およびE3領域について欠失しており、場
合により、キャプシド形成シグナルΨ5について欠失しているAV19aゲノムであり、
第1の核酸が、このウイルスゲノムを、左側ITRについて、場合により、キャプシド形
成シグナルについて補完する。さらに、許容細胞株が、シスまたはトランスで欠失された
配列について補完し得る限りは、E2および/またはE4領域に由来するさらなる配列が
、同様に欠失され得るので、AV19aゲノムの第2の部分の欠失は、E1およびE3に
限定されない。さらに、微量のキャプシッドタンパク質をコードするpIX遺伝子の発現
に必要であるpIXプロモーターは、核酸pBACSir19aにおいて保存された。
的組換え部位は、Flpリコンビナーゼの組換え部位を含む群から選択される。本発明の
好ましい実施形態では、使用されるFrt部位は、S.セレビシエ(cerevisia
e)のμプラスミドに由来する野生型Frt48部位であるが、それに制限されない。当
技術分野で公知の突然変異Frt部位を含めたその他のFrt部位が使用され得る。
くは、ウイルスの末端反復、より好ましくは、逆方向末端反復を含む。好ましくは、逆方
向末端反復は、アデノウイルスゲノム由来の右側逆方向末端反復であり、最も好ましい実
施形態では、アデノウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイル
ス19a型に由来し、逆方向末端反復は、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイ
ルス19a型の右側逆方向末端反復である。
ウイルスのゲノムの第2の部分中に存在しない。制限部位は、本特許に開示される方法に
従って含有される核酸の直鎖化のために使用される。さらに、第2の制限部位は、第1の
核酸分子によって提供されるウイルスのゲノムの第1の部分中に、また第1の制限部位か
ら組換え部位の範囲の、ウイルスゲノムの第1の部分を包含する第1の核酸の配列部分中
には存在しない。本発明のより好ましい実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲ
ノム中に存在しない制限部位の群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、制
限部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼによって認識される部位およびジンクフィンガ
ーヌクレアーゼの合成結合部位のその他の型を含めた、当業者に公知のその他の制限部位
の中でもAbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaIを含む
、ヒトアデノウイルス5型(AV5)中に存在しない部位の群から選択される。
(ii)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単
位を含有する第2の核酸を提供する。好ましい実施形態では、複製のための細菌ヌクレオ
チド配列(ori)は、大腸菌における低コピー、好ましくは、単一コピー維持に必要な
すべてのエレメントを含有する。より好ましい実施形態では、第2の核酸中のoriは、
f−エピソーム因子(F因子)に基づいており、大腸菌における複製および維持に必要な
すべてのエレメントを含有する。
、切断する制限酵素を用いる第2の核酸分子の直鎖化の際に、5’→3’方向で以下のエ
レメント:(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の
選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、部位特異的
組換え部位、ウイルスのゲノムの第2の部分、ならびに場合により第2の制限部位を含む
第2の核酸分子である。
、酵素をコードする耐性媒介遺伝子をコードする第2の選択マーカーを提供する配列を含
有する。第2の核酸において使用される選択マーカーは、第1の核酸分子中に存在する選
択マーカーとは異なる。好ましい実施形態では、第2の選択マーカーは、当技術分野で公
知のものの中でも、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールお
よびカナマイシンを含めた抗生物質に対する耐性を付与する。最も好ましい実施形態では
、第2の選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を媒介する。
も、bla、ant(3’’)−Ia、aph(3’)−II、aph(3’)−II、
ble、aadA、aadBおよびcmlA遺伝子を含めた抗生物質に対する耐性を媒介
する遺伝子の群から選択され得る。より好ましい実施形態では、第2の選択マーカーは、
クロラムフェニコールに対する耐性を媒介するタンパク質をコードする遺伝子である。
子は、5’→3’方向で以下のエレメント:場合により第2の制限部位、ウイルスのゲノ
ムの第2の部分、組換え部位ならびに(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配
列、および(ii)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオ
チド配列単位を提供し、ウイルスのゲノムの第2の部分は、ウイルスゲノムの左側末端反
復、好ましい実施形態では、左側逆方向末端反復(ITR)を提供する。より好ましい実
施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、さらにより好ましい実施形態では、ア
デノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイルス19a型である。
いて、パッケージングシグナルを提供するウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の
部分を提供し、好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、より好まし
い実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイルス
19a型である。
製し、使用されるoriは、F因子またはP1レプリコンに基づいている。好ましい実施
形態では、第2の核酸は、細菌人工染色体(BAC)であるが、BACに限定されない。
しかし、この系は、十分な機能性を保持するために、大腸菌における第2の核酸の低コピ
ー、好ましくは、単一コピー維持を必要とする。より好ましい実施形態では、pBACS
ir1、pBACSir2またはpBAC Sir19aと同一または類似のBACベク
ターは、左側ITRおよびキャプシド形成シグナルについて欠失している、第1世代のE
1およびE3が欠失したAdベクターゲノムをコードし、単一コピー維持に必要である複
製起点のエレメントとしてparS the parA、parBおよびparC遺伝子
を含有する。
の閉じた形態との組合せであり、好ましい実施形態では、使用される第1の核酸は、プラ
スミドであり、第2の核酸は、BACベクターである。
は、別個の分子として存在する。用語「別個の分子」とは、各分子が、物理的に別個の構
成成分に解離できることを意味する。本発明の好ましい実施形態では、第1の核酸分子は
、プラスミドであり、第2の核酸分子は、BACである。
核酸によって提供されるウイルスのゲノムの第1の部分および第2の核酸によって提供さ
れるウイルスのゲノムの第2の部分は、一緒になると、完全なウイルスゲノムを形成する
。用語「完全なウイルスゲノム」は、真核細胞株へのトランスフェクションの際に、生存
可能な、複製能力のあるウイルスを生じさせる、ウイルスのゲノム配列をコードする核酸
を説明する。このような細胞株は、許容細胞株と呼ばれる。本発明の好ましい実施形態で
は、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムであり、本発明のより好ましい実施形態で
は、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス5型ゲノムまたはヒトアデノウイルス19a
型ゲノムである。
核酸分子によって提供される第1の制限部位および第2の核酸分子によって提供される第
2の制限部位は、ウイルスのゲノムの第1の部分および第2の部分ならびに転写単位中に
存在しない制限部位を含む群から選択される。好ましい実施形態では、制限部位は、ヒト
アデノウイルス5型ゲノムにおいて切断されない群:AbsI、BstBI、PacI、
PsrI、SgrDIおよびSwaIから選択される。さらなる好ましい実施形態では、
第1および第2の制限部位は、同一であり、さらにより好ましい実施形態では、第1およ
び第2の制限部位は、PacIである。
り好ましい実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノ
ウイルス19a型である。さらにより好ましい実施形態では、完全なウイルスゲノムは、
第1世代−E1およびE3が欠失しているヒトアデノウイルス5型またはヒトアデノウイ
ルス19a型であるが、E2領域に由来するさらなる配列がさらに欠失され得るか、また
は複数の領域が変更され得、またはガットレスアデノウイルスベクターにおいては、左側
および右側ITRならびにパッケージングシグナルを除く完全なウイルスゲノムでさえ欠
失しているので、この型のアデノウイルスゲノムに限定されない。
核酸分子によって提供される第1の選択マーカーおよび第2の核酸分子によって提供され
る第2の選択マーカーは、好ましくは、抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードす
る遺伝子である。遺伝子は、当技術分野で公知のものの中でも、カナマイシン、ネオマイ
シン、ピューロマイシン、アンピシリン、ゼオシン、ゲンタマイシンおよびクロラムフェ
ニコールに対する耐性を付与する群から選択され得る。好ましい実施形態では、第1の選
択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子であり、選択マーカーは、ク
ロラムフェニコールに対する耐性を付与するが、カナマイシンに対しては付与しない遺伝
子である。特に、選択薬剤が抗生物質である場合には、いくつかの遺伝子が、2種以上の
選択薬剤に対する耐性を媒介し(Tenorio Cら J.Clin.Microbi
ol.39:824〜825頁、2001年)、第1および第2の核酸の選択マーカーの
可能性ある組合せを限定することは、当技術分野では公知である。
核酸分子によって提供される複製のための細菌配列によって、細菌細胞が必要なすべての
機能を提供する特定の条件下での、特定の大腸菌株における、または正常な大腸菌株にお
ける条件付き複製が可能となる。さらに、第1および第2の核酸の複製のための配列の組
合せによって、宿主細胞における第2の核酸の複製のみが可能となる。細菌複製のための
配列の組合せが、宿主細胞またはその核酸自体によって提供される因子の存在に制限され
ることは、当技術分野で公知である(Scott JR.Regulation of
plasmid replication.Microbiol.Rev.48:1〜2
3頁、1984年)。好ましい実施形態では、第1の核酸分子中の細菌配列は、piタン
パク質発現の存在下でのみ維持され得る条件付きレプリコンとしてファージgR6Kの最
小のoriを含有し、第2の核酸の複製のための配列は、F因子に基づいており、大腸菌
細胞における単一コピー維持を可能にする。
第1の核酸分子およびウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分を提供する第2
の核酸分子の組合せであり、パッケージングシグナルは、ウイルスのゲノムの第1または
第2の部分のいずれかによって提供され得る。好ましい実施形態では、ウイルスは、アデ
ノウイルスであり、より好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルスであり
、さらにより好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウイルス5型(AV5)ま
たはヒトアデノウイルス19a型であり、パッケージングシグナルは、AV5またはヒト
アデノウイルス19a型(Ψ19a)に由来し、第1の核酸分子によって提供される。
末端反復配列は、第1の核酸分子によって提供されるあるウイルスまたは該ウイルスのゲ
ノムの第1の部分の部分であり、第2の末端反復配列は、第2の核酸分子によって提供さ
れるウイルスのゲノムの第2の部分の部分である。
端反復配列を提供し得る。好ましい実施形態では、末端反復配列は、アデノウイルスに由
来する逆方向末端反復配列であり、さらにより好ましい実施形態では、逆方向末端反復は
、AV5またはヒトアデノウイルス19a型に由来する。
スをコードする核酸分子を作製するための方法を開示し、両核酸は、その部位特異的組換
え部位によって反応させ、組換え生成物を形成し、組換え生成物が選択され、完全なウイ
ルスゲノムの1つのみのコピーを含有し、組換え生成物は、第1および第2の制限酵素で
切断される。
合わせ、その部位特異的組換え部位によって反応させる、ウイルスをコードする核酸分子
を作製するための方法を開示する。宿主細胞は、好ましくは、細菌細胞であり、エレクト
ロポレーションされるか、または標準法に従って化学的に能力があるようにされるのいず
れかによって核酸を受容し得る。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、第2の核酸分
子を有し、エレクトロポレーションによって第1の核酸分子を受容する。最も好ましい実
施形態では、細菌は、大腸菌である。
択薬剤に対して感受性である大腸菌細胞の群から選択される。好ましい実施形態では、大
腸菌株は、K12由来であり、piタンパク質を提供または発現しない。piタンパク質
は、第1の核酸分子の複製を維持するが、第2の核酸分子の複製は維持しない。より好ま
しい実施形態では、大腸菌株は、カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対して感受
性であり、当技術分野で公知のものの中でもDH5α、DH10Bを含む群から選択され
る。
、第1の選択マーカーを有する第1の核酸分子および第2の選択マーカーを有する第2の
核酸分子を組み合わせ、部位特異的リコンビナーゼの存在下でその組換え部位によって反
応させ、原核生物宿主細胞において組換え生成物を形成する。方法は、両選択マーカーに
対する耐性を付与することによって、反応生成物が宿主細胞において選択されるようなも
のである。第1の核酸中の条件付き複製起点の使用によって、方法が、もっぱら反応生成
物を選択することが確実になる。好ましい実施形態では、第1の選択マーカーは、カナマ
イシンであり、第2の選択マーカーは、クロラムフェニコールである。
分子によって提供される第1の部位特異的組換え部位および第2の核酸分子によって提供
される第2の部位特異的組換え部位間の組換えを触媒する部位特異的リコンビナーゼの存
在下で、第1の核酸分子および第2の核酸分子を組み合わせ、反応させる、ウイルスをコ
ードする核酸分子を作製するための方法を開示する。好ましい実施形態では、部位特異的
リコンビナーゼは、Flpであり、それは、第1の核酸上に存在するFrt部位特異的組
換え部位および第2の核酸上に存在するFrt部位特異的組換え部位間の組換えを媒介す
る。Flpは、Frt部位間の部位特異的組換えを触媒し、認識された部位特異的組換え
部位は、ヒトおよび細菌ゲノム中に総計的に存在しないよう十分に大きい。本発明によれ
ば、第1の核酸では、最小の野生型Frt34部位が使用され、第2の核酸中に存在する
野生型Frt48部位と反応させる。しかし、同等の高い選択性および効率で機能する限
り、当技術分野で公知のその他の部位特異的リコンビナーゼが使用されてもよい。
、第1の核酸分子および第2の核酸分子を、部位特異的リコンビナーゼの存在下で組み合
わせ、反応させ、リコンビナーゼが不活化される。大腸菌における部位特異的リコンビナ
ーゼの長期の存在は、ゲノムの安定性を干渉するということは、一般に承認されている。
Creの場合には、潜在性loxP部位が、哺乳類ゲノムにおいて認識されており、遺伝
的不安定性を引き起こし、BACおよびPACベクターを受け取るためのCre含有大腸
菌の使用を制限する(Semprini Sら Cryptic loxP sites
in mammalian genomes:genome−wide distri
bution and relevance for the efficiency
of BAC/PAC recombineering techniques.Nuc
leic Acids Res.35:1402〜1410頁、1997年)。核酸分子
が、大腸菌において組換えられ、さらに増殖されることを必要とする場合には、好ましく
は、部位特異的組換えの一過性の発現が望ましく、さらにより好ましくは、部位特異的リ
コンビナーゼの発現は、組換えが起こった後および細菌の増殖の間に十分に排除される。
発現は、λファージに由来する温度感受性レプレッサーによって制御される。Flp発現
は、培養温度を43℃に移すことによって誘導される。この手順によって、プラスミドの
排除(キュアリング)が同時に可能となる。部位特異的リコンビナーゼの条件付き発現お
よび/または誘導性発現のためのその他の系が、例えば、それに限定されるものではない
が、発現を誘導するためのアラビノース誘導性AraC−PBADプロモーターの使用の
代わりに使用され得る(Lee EC.らGenomics73:56〜65頁、200
1年)。
胞における部位特異的リコンビナーゼの条件付き発現が使用され、Flp部位特異的リコ
ンビナーゼの発現単位を有するプラスミドの複製が、温度感受性複製起点によって制御さ
れる。好ましい実施形態では、第2の核酸分子およびFlp発現単位を提供する細菌プラ
スミド(pCP20)を有する大腸菌宿主細胞が、アンピシリンの存在下、30℃で維持
され、増殖され得る。Flp発現は、培養温度を43℃に移すことによって誘導される。
この手順によって、pCP20の排除(キュアリング)が同時に可能となる(Chere
panov PPおよびWackernagel W、Gene158:9〜14頁、1
995年)。
コードする核酸が、第1および第2の制限酵素での制限消化によって放出され得る。本発
明の好ましい実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制限部
位の群から選択され、さらにより好ましい実施形態では、制限部位は、AbsI、Bst
BI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaIを含む、ヒトアデノウイルス5型
(AV5)中に存在しない部位の群から選択される。
組合せを含む、ウイルスをコードする核酸分子を作製するための方法を開示し、両核酸を
、許容細胞においてその部位特異的組換え部位によって反応させて、組換え生成物を形成
し、組換え生成物が選択されず、完全なウイルスゲノムの1つのコピーのみを含有し、部
位特異的リコンビナーゼが、許容細胞によって提供され、部位特異的リコンビナーゼが、
構成的な、条件付きな方法で、または誘導的な方法で発現される。部位特異的リコンビナ
ーゼの条件付き発現または誘導性発現は、当技術分野で公知のその他の系の中でも、テト
ラサイクリン調節発現系を用いて達成され得る。本発明の好ましい実施形態では、許容細
胞は、部位特異的リコンビナーゼを安定に発現し、許容細胞は、293、911、Per
.C6およびCAP細胞を含む群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、許
容細胞は、293であり、部位特異的リコンビナーゼFlpは、構成的に発現される。
第2の核酸分子を組み合わせ、反応させるウイルスをコードする核酸分子を作製するため
の方法を提供し、本発明に従って、得られた核酸分子は、完全ウイルスゲノムの1つのコ
ピーを含有し、これは、第1および第2の制限酵素での制限消化によって放出され得、許
容細胞株にトランスフェクトされると、生存可能な複製能力のあるウイルスを生成し、許
容細胞は、293、911、Per.C6およびCAP細胞を含む群から選択される。さ
らにより好ましい実施形態では、許容細胞は、293である。
、ウイルスは、遺伝子導入ベクターとして、ワクチンとして使用され得るか、または治療
用途のために使用され得る。
、方法は、核酸を発現する多数のウイルスまたはウイルスのライブラリーを作製するため
に使用され得る。
あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分、ヌクレオチド
配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列または転写単位、原核生物において調節活性を
有する調節核酸配列、部位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド
配列、(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マー
カーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位、ならびに場合により
第1の制限部位を含む。
切断の際に、5’から3’方向で以下のエレメント:場合によりあるウイルスまたは該ウ
イルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分、ヌクレオチド配列、好ましくはゲノム
ヌクレオチド配列または転写単位、原核生物において調節活性を有する調節核酸配列、部
位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、(i)条件付き複
製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マーカーを提供するヌクレオ
チド配列を含む細菌ヌクレオチド配列を含む。
スのるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、末端配列の部分を含有する。本発明の好ま
しい実施形態では、末端配列は、末端反復を含む。さらに、あるウイルスまたは該ウイル
スのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、許容細胞株において複製可能である完全
なウイルスゲノムであるために存在しなくてはならない。本発明のより好ましい実施形態
では、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、アデ
ノウイルスゲノムに由来し、さらにより好ましい実施形態では、ヒトアデノウイルスゲノ
ムの第1の部分は、ヒトアデノウイルス5型(AV5)ゲノムに由来し、E1転写単位(
nt1からnt342)(配列番号10)のTATAボックスの上流のAV5ゲノムの左
側末端のすべてまたは部分を含む。本発明のさらなる実施形態では、第3の核酸分子は、
パッケージングシグナルを、ウイルスゲノム部分として含む、あるウイルスまたは該ウイ
ルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分を提供する。より好ましい実施形態では、
パッケージングシグナルは、アデノウイルスゲノムに由来し、さらにより好ましい実施形
態では、アデノウイルスゲノムの第1の部分は、ヒトアデノウイルス5型(AV5)の左
側末端に由来するパッケージングシグナルΨ5を含有する。
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、あるウイルスまたは該ウイルスの
あるゲノムまたは該ゲノムの末端配列を含む。より好ましい実施形態では、末端配列は、
逆方向末端反復(ITR)であり、さらにより好ましくは、逆方向反復は、アデノウイル
スゲノムに由来し、最もより好ましい実施形態では、アデノウイルスゲノムの第1の部分
は、ヒトアデノウイルス5型(AV5)の左側末端に由来する逆方向末端反復を含有する
。
あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分中および第3の
核酸中に存在する転写単位中に存在しない。本発明の好ましい実施形態では、制限部位は
、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制限部位の群から選択され、より好ましい実施
形態では、制限部位は、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよび
SwaIを含む、ヒトアデノウイルス5型(AV5)中に存在しない部位の群から選択さ
れる。
に5’→3’方向で、ミラーコンホメーションで、原核生物において活性を有する調節核
酸配列、部位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列、(i)
条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マーカーを提供す
るヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列、第1の制限部位、あるウイルスまたは
該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分ならびに転写単位を提供し、あるウ
イルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、末端反復を含む。
好ましい実施形態では、ミラーコンホメーションで第3の核酸によって提供されるあるウ
イルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分は、逆方向末端反復を
含む。より好ましい実施形態では、逆方向末端反復は、ウイルスゲノムの右側末端反復、
さらにより好ましくはアデノウイルスの右側末端反復であり、最も好ましい実施形態では
、アデノウイルスの右側末端反復は、AV5の最後の18〜103のヌクレオチドを包含
するヒトアデノウイルス5型に由来する右側ITRである。
ロモーター、発現させる核酸配列および終結シグナルを含有する。プロモーターは、PG
Kなどの真核生物RNA Pol IIおよびCMVによって認識される真核細胞もしく
はウイルスプロモーターの群から、またはU6、H1、tRNAおよびアデノウイルスV
AプロモーターなどのRNA Pol IIIによって認識される真核生物もしくはウイ
ルスのプロモーターの群から選択される。発現させる核酸は、タンパク質、ペプチドをコ
ードする核酸、マイクロRNAおよび低分子干渉RNA(siRNA)およびshRNA
を含めた非コーディングRNAをコードする核酸の群から選択される。終結シグナルは、
ポリAシグナル、ストレッチTヌクレオチドなどのPolIIIによって転写される遺伝
子の終結シグナルなどの真核生物またはウイルスの遺伝子に由来する。
れる部位特異的組換え部位を含む。第3の核酸分子において使用されるFrt部位は、S
.セレビシエのμプラスミドに由来する野生型Frt部位に基づいている。本発明のさら
なる実施形態では、使用されるFrt部位は、野生型48Frt部位に由来する形態に制
限されない。それは、当技術分野で公知の突然変異Frt部位を含めたその他のFrt部
位の群から選択され得る。本発明の好ましい実施形態では、第3の核酸分子において使用
されるFrt部位は、wt FRT48部位(配列番号8)のR2、UおよびR3エレメ
ントを含有する、34ntの長さの最小の組換え部位(Frt34部位、配列番号7)で
ある。
製のための細菌配列、および(ii)陽性選択マーカーを提供する配列を含み、条件付き
複製のための細菌配列は、細菌細胞が必要なすべての機能を提供する特定の条件下での、
特定の大腸菌株における、または正常な大腸菌における複製のための複製起点(ori)
を含有する。グラム陰性菌におけるプラスミドベクターの複製は、宿主酵素およびプラス
ミドによって提供される決定因子によって制御される。プラスミドの複製は、細菌宿主に
おいて、複製に必要なすべての因子が、シスまたはトランスで存在する場合にのみ起こる
(Kues UおよびStahl U.Microbial reviews 53:4
91〜516頁)。好ましい実施形態では、第3の核酸分子中の細菌配列は、piタンパ
ク質発現の存在下でのみ維持され得る条件付きレプリコンとしてファージgR6Kの最小
のoriを含有する。
供し、選択マーカーは、酵素をコードする核酸であり、酵素は、選択薬剤に対する耐性を
媒介し、陽性選択マーカーは、当技術分野で公知のその他の遺伝子の中でも、bla、a
nt(3’’)−Ia、aph(3’)−II、aph(3’)−II、bleおよびc
mlAを含めた、抗生物質に対する耐性を媒介する遺伝子の群から選択され得る。好まし
い実施形態では、カナマイシンに対する耐性を媒介するタンパク質をコードする遺伝子が
、陽性選択マーカーとして使用される。
ーは、選択薬剤に対する感受性を媒介する酵素をコードする核酸であり、原核生物宿主細
胞における陰性選択マーカーの発現は、原核生物において調節活性を有するヌクレオチド
配列によって制御される。好ましい実施形態では、調節ヌクレオチド配列は、プロモータ
ーであり、プロモーターは、優先的に、原核生物のプロモーターの群から選択される。さ
らにより好ましい実施形態では、プロモーターは、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーター
である。
ーの群から選択され得、プロモーターの活性は、当技術分野で公知のその他の方法および
系の中でも、オペロンの抑制解除、イオンおよび分子による遺伝子の誘導、温度によるプ
ロモーター活性の調節を含めた種々の手段によって調節され得る。
は、酵素をコードする遺伝子のクラスから選択され、酵素は、当技術分野で公知のものの
中でも、ストレプトマイシン、親油性化合物(フサリン酸およびキナリン酸(quina
ric acid)、スクロース、p−クロロフェニルアラニン、トリメトプリム、t−
o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドに対する感受性を含めた、選択薬剤ま
たは条件に対する感受性を付与する。本発明の好ましい実施形態では、陰性選択マーカー
によってコードされる酵素は、ストレプトマイシンに対する感受性を媒介する。したがっ
て、陰性選択マーカーをコードする核酸は、当技術分野で公知のその他の遺伝子の中でも
、galK、tetAR、pheS、thyA、lacy、ccdBおよびrpsLを含
む遺伝子の群から選択され得る。好ましい実施形態では、ストレプトマイシンに対する感
受性を支配的に媒介するタンパク質をコードするrpsL遺伝子が、陰性選択マーカーと
して使用される(Reyrat JMら、Gene15:99〜102頁、1981年)
。
環状の閉じた分子として存在する。好ましい実施形態では、使用される第3の核酸分子は
、プラスミドであり、第2の核酸は、BACベクターである。
が、別個の分子として存在する。用語「別個の分子」とは、各分子が、物理的に別個の構
成成分に解離できることを意味する。本発明の好ましい実施形態では、第3の核酸分子は
、プラスミドであり、第2の核酸分子は、BACである。
1の部分を提供し、第2の核酸分子は、ウイルスのゲノムの第2の部分を提供する。第3
の、第2の核酸分子との組合せ後に得られた核酸は、1コピーの完全なウイルスゲノムを
含有する。本発明の好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムで
あり、本発明のより好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス5型
ゲノムである。
酸によって提供される核酸は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノ
ムの第1の部分であり、遺伝子導入単位を含有し、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノム
の第2の部分を提供する第2の核酸分子と組み合わせる。得られた核酸分子は、正確に1
つの遺伝子導入単位を含有する、1コピーの完全なウイルスゲノムを含有する。本発明の
好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムであり、本発明のより
好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス5型ゲノムである。
限消化によって放出され得る。本発明の好ましい実施形態では、第1および第2の制限部
位は、両核酸分子に関して同一であり、本発明のより好ましい実施形態では、PacI酵
素によって認識される制限部位が使用される。
ノムまたは該ゲノムの第1の部分を提供する第3の核酸分子を、第2の制限部位を有する
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分を提供する第2の核酸分子と組み合わ
せ、制限部位は、あるウイルスまたは該ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部
分および第2の部分ならびに転写単位中には存在しない制限部位を含む群から選択される
。好ましい実施形態では、制限部位は、ヒトアデノウイルス5型ゲノム中で切断されない
群:AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIおよびSwaIから選択さ
れる。本発明のさらにより好ましい実施形態では、第1および第2の制限部位は、Pac
Iである。
第3の核酸分子の、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分を提供する第2の
核酸分子との組合せであり、両核酸は、そのFrt部位によって組換えられ、1コピーの
完全な補完されたウイルスゲノムを含有する分子を形成し得る。得られた完全な補完され
たウイルスゲノムは、第1および第2の制限酵素での制限消化によって放出され得、した
がって、許容細胞株にトランスフェクトされると生存可能であり、複製能力がある。本発
明の好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、より好ましい実施形態
では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型(AV5)である。さらにより好まし
い実施形態では、得られた完全なウイルスゲノムは、第1世代−E1およびE3が欠失し
ているAV5であり、E2およびE4領域に由来するさらなる配列がさらに欠失され得る
か、または複数の領域が変更され得、またはガットレスアデノウイルスベクターにおいて
は、左側および右側ITRならびにパッケージングシグナルを除く完全なウイルスゲノム
でさえ欠失しているので、アデノウイルスゲノムの組成は、E1およびE3が欠失したゲ
ノムに限定されない。「許容細胞株」とも呼ばれるウイルスの再構成および増殖のために
使用される細胞株は、欠失しているか、または変更されている領域のすべてをシスまたは
トランスで補完できる。第1世代AV5ウイルスゲノムの場合には、当技術分野で公知の
ものの中でも、293、911、Per.C6、N52.E6などのE1について補完性
である細胞株が使用され得る。必要に応じて、トランスでウイルスゲノムのさらなる成分
を提供するその他の細胞株も、同様に使用され得る。さらに、前記の欠失された成分の一
過性発現または条件付き発現もまた、ウイルス再構成および複製を可能にするために使用
され得る。
ーを提供する。第2の核酸分子は、第2の選択マーカーを提供する。第3の、第2の核酸
分子との組合せの際に、得られた核酸分子は、第3の核酸に由来する陽性および陰性選択
マーカーならびに第2の核酸分子に由来する第2の選択マーカーを含む。本発明の好まし
い実施形態では、第3の核酸の陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与し
、陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を付与し、第2の核酸分子に
よって提供される選択マーカーは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。
第2の選択マーカーは、第3の核酸分子によって提供される陽性選択薬剤および陰性選択
薬剤とは異なる選択薬剤に対する耐性を付与する酵素をコードする遺伝子を媒介する耐性
である。本発明の好ましい実施形態では、陽性選択マーカーは、カナマイシンに対する耐
性を付与する遺伝子であり、陰性選択マーカーは、ストレプトマイシンに対する感受性を
付与する遺伝子であり、第2の核酸によって提供される第2の耐性マーカーは、クロラム
フェニコールに対する耐性を付与するが、カナマイシンまたはストレプトマイシンに対す
る耐性は付与しない。いくつかの遺伝子が、特に、選択薬剤が抗生物質である場合には、
2種以上の選択薬剤に対する耐性を媒介し(Tenorio CらJ.Clin.Mic
robiol.39:824〜825頁、2001年)、第3および第2の核酸における
選択マーカーの可能性ある組合せを制限することは、当技術分野では公知である。
酸分子は、陽性選択マーカーおよび陰性選択マーカーを提供し、陰性選択マーカーの活性
は、原核生物において調節活性を有する、第3の核酸によって提供される核酸配列によっ
て制御される。好ましい実施形態では、陰性選択マーカーの活性を制御する核酸配列は、
プロモーター、より好ましい実施形態では、原核生物のプロモーターである。さらにより
好ましい実施形態では、プロモーターは、大腸菌ガラクトキナーゼプロモーターである。
分子の、単一コピー複製のためのさらなるヌクレオチド細菌配列を含む第2の核酸分子と
の組合せである。それにより、第3の核酸分子の複製のための細菌配列で、特定の条件下
での、特定の大腸菌株における、または正常な大腸菌株における条件付き複製が可能とな
り、細菌細胞は、必要なすべての機能を提供する。好ましい実施形態では、第3の核酸分
子中の細菌ヌクレオチド配列単位は、piタンパク質発現の存在下でのみ維持され得る条
件付きレプリコンとしてファージgR6Kの最小のoriを含有し、第2の核酸の複製の
ための配列は、F因子に基づいており、大腸菌細胞における単一コピー維持を可能にする
(Scott JR.Regulation of plsmid replicati
on.Microbiol.Rev.48:1〜23頁、1984年)。
第3の核酸分子およびウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分を提供する第2
の核酸分子の組合せであり、パッケージングシグナルは、ウイルスのあるゲノムまたは該
ゲノムの第1または第2の部分のいずれかによって提供され得る。好ましい実施形態では
、ウイルスはアデノウイルスであり、より好ましい実施形態では、ウイルスはAV5であ
り、パッケージングシグナルは、AV5のパッケージングシグナルであり、第3の核酸分
子によって提供される。
第3の核酸分子およびウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分を提供する第2
の核酸分子の組合せであり、少なくとも1つの末端反復配列が、第3のものによって提供
され、1つの末端反復配列が、第2の核酸によって提供される。本発明のさらなる実施形
態では、1つの核酸は、すべての末端配列を提供し得るが、この場合には、得られた核酸
は、核酸分子の1つの細菌ヌクレオチド配列単位を含有する完全なウイルスゲノムを含有
する。本発明の好ましい実施形態では、末端反復配列は、ウイルスのあるゲノムまたは該
ゲノムの逆方向末端配列(ITR)である。さらにより好ましい実施形態では、ITRは
、アデノウイルスに由来し、第3の核酸分子は、左側ITRを提供し、第2の核酸分子は
、右側ITRを提供する。最も好ましい実施形態では、ITRは、ヒトアデノウイルス5
型に由来するITRである。
、そのFrt組換え部位によって、宿主細胞において組み合わせ、反応させ得る。得られ
た核酸分子は、補完された完全なウイルスゲノムの正確に1つのコピーを含有し、これは
、第1および第2の制限酵素での制限消化によって放出され得、制限部位は、第3の核酸
によって提供される転写単位、ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第1の部分および
ウイルスのあるゲノムまたは該ゲノムの第2の部分中に存在しない。本発明のより好まし
い実施形態では、制限部位は、アデノウイルスのゲノム中に存在しない制限部位の群から
選択され、さらにより好ましい実施形態では、制限部位は、AbsI、BstBI、Pa
cI、PsrI、SgrDIおよびSwaIを含む、ヒトアデノウイルス5型(AV5)
中に存在しない部位の群から選択される。
ルスは、アデノウイルスであり、より好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトアデノウ
イルス5型である。
物は、好ましくは、以下のエレメント:(i)単一コピー複製のための細菌配列、および
(ii)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単
位、部位特異的組換え部位、ウイルスのゲノムの第2の部分、場合により第2の制限部位
、さらなる部位特異的組換え部位、(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、
および(ii)第1の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド
配列単位、ウイルスのゲノムの第1の部分、好ましくは転写単位ならびに第1の制限部位
を含む、第4の、好ましくは、環状の核酸分子である。
され、第1の核酸分子および第2の核酸分子は、提供され、組み合わせ、部位特異的組換
えが起こり、部位特異的組換え生成物が形成するように反応させる。好ましくは、部位特
異的組換えは、宿主細胞において起こり、より好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。組
換え生成物は、場合により、選択され得、コピー、好ましくは、あるウイルスまたは該ウ
イルスのあるゲノムまたは該ゲノムの単一コピーを含有し、あるウイルスまたは該ウイル
スのゲノムは、補完された、完全なウイルスゲノムであり、第1および第2の制限酵素の
任意選択の切断の際に、得られた核酸は、許容細胞株およびこの許容細胞株において作製
され、増殖されたあるウイルスまたは該ウイルスにトランスフェクトされ得る。最も好ま
しい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、さらにより好ましい実施形態で
は、ウイルスは、ヒトアデノウイルス5型である。
され、第1の核酸分子および第2の核酸を組み合わせ、宿主細胞において、部位特異的組
換えが起こり、部位特異的組換え生成物が形成するよう反応させる。宿主細胞は、反応生
成物の選択を可能にし、宿主細胞ゲノムは、第2の核酸の単一コピー複製を可能にするF
因子の部分またはF因子について欠損しており、宿主細胞は、第1の核酸の条件付き複製
を可能にする因子の発現について欠損している。これは、宿主細胞における任意の反応し
ていない第1の核酸分子に対する選択を可能にする。好ましい実施形態では、宿主細胞は
、原核生物の宿主細胞であり、より好ましくは大腸菌である。さらにより好ましい実施形
態では、宿主細胞は、当技術分野で公知のものの中でも、DH10Bを含めた、K12由
来大腸菌宿主細胞を含む群から選択される。
が提供され、それにより第1の核酸分子および第2の核酸分子が提供される。第1および
第2の核酸分子は、部位特異的組換えが起こり、部位特異的組換え生成物が形成するよう
に、宿主細胞において組み合わせ、反応させ、反応生成物は選択されることを必要とせず
、あるウイルスまたは該ウイルスの1つの完全な補完されたゲノムを含有する。提供され
る方法によれば、宿主細胞は、真核生物宿主細胞であり、第1および第2の核酸分子は、
好ましくは、第1および第2の制限酵素での切断の際に、好ましくは、直鎖核酸分子であ
り、真核細胞宿主細胞は、好ましくは、許容宿主細胞であり、さらにより好ましくは、宿
主細胞は、当技術分野で公知のものの中でも、293、911、Per.C6、CAP細
胞を含む、ヒトアデノウイルス5型の複製を可能にする群から選択される。アデノウイル
スが、ヒトアデノウイルス5型以外である場合には、許容宿主細胞は、このウイルスの複
製を可能にするよう規定される。許容宿主細胞において、1つの完全なアデノウイルスゲ
ノムを含有する直鎖核酸分子は複製可能であることは、当技術分野で公知である。ウイル
ス複製の効率は、アデノウイルスゲノムの末端が、アデノウイルスのITRで正確に終了
している場合に最適であり、末端タンパク質が、アデノウイルスゲノムの左側末端と結合
している場合には、さらにより効率的であるが、ITRを伸長する配列を有する、完全な
アデノウイルスゲノムを含有する核酸分子も複製されるので、これは、許容細胞における
アデノウイルス複製にとって必要条件ではない。
第3の核酸分子および第2の核酸分子は、部位特異的組換えが起こり、部位特異的組換え
生成物が形成するように組み合わせ、反応させ、組換え事象の数が1に限定されている反
応生成物が生成する。好ましくは、部位特異的組換えは、宿主細胞において起こり、より
好ましくは、宿主細胞は、大腸菌であり、組換え生成物の選択は、第3の核酸分子の陽性
選択マーカー、第3の核酸分子の陰性選択マーカーおよび第2の核酸分子の第2の選択マ
ーカーを提供する組換え生成物を有する宿主細胞(単数または複数)を選択することによ
って実施され、宿主細胞は、陰性選択マーカーに対して感受性ではない。この方法によれ
ば、陰性選択薬剤に対して感受性ではない宿主細胞が使用され、好ましくは、陰性選択薬
剤は、ストレプトマイシンである。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ストレプトマイ
シンに対する耐性を付与するrpsL遺伝子の突然変異体形態を発現する大腸菌である。
したがって、宿主細胞は、rpsL遺伝子の突然変異体形態を発現する大腸菌細胞の群か
ら選択され得、好ましくは、宿主細胞は、当技術分野で公知のものの中でも、DH10B
を含む群から選択される。好ましい実施形態では、反応生成物を有する宿主細胞を選択す
るために使用される選択薬剤は、陽性選択マーカーについてはカナマイシンであり、第2
の選択薬剤についてはクロラムフェニコールであり、陰性選択薬剤としてストレプトマイ
シンである。陰性選択マーカーは、rpsLの野生型形態をコードし、突然変異体rps
Lを発現する宿主細胞によって付与されるストレプトマイシンに対する耐性は、同一宿主
細胞株において、rpsLの野生型および突然変異体対立遺伝子が発現される場合には劣
性であり、ストレプトマイシンに対する感受性をもたらす(Reyrat JMら In
fect.Immun.1998、66:4011〜4017頁;Lederberg
J.Streptomycin resistance: a genetically
recessive mutantion.J.Bacteriol.1951、61
:549〜550頁)。
換え部位を提供する第2の核酸分子と組み合わせ、両核酸分子は、宿主細胞において、部
位特異的組換えによって反応させ、部位特異的リコンビナーゼは、原核生物宿主細胞によ
って提供される。それにより、部位特異的リコンビナーゼは、好ましくは、宿主細胞によ
って、宿主細胞ゲノムの部分としてか、または染色体外エレメントのいずれかとして提供
される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、部位特異的リコンビナーゼを、染色体外プ
ラスミドとして提供し、より好ましい実施形態では、部位特異的リコンビナーゼはFlp
であり、プラスミドはpCP20である。本発明の方法によれば、部位特異的リコンビナ
ーゼの発現は、反応の間制御され、発現の制御は、発現を誘導するためのアラビノース誘
導性AraC−PBADプロモーターなどの誘導性発現系の使用を含めた種々の方法によ
って達成され得る(Lee EC.ら Genomics 73:56−65、2001
)が、これに限定されない。好ましい実施形態では、部位特異的リコンビナーゼの発現お
よびこのプラスミドの複製は、温度によって制御され、さらにより好ましい実施形態では
、Flpを発現することは、λファージに由来する温度感受性レプレッサーによって制御
され、プラスミドの複製は、温度感受性複製起点によって制御され、温度感受性FLP発
現プラスミドpCP20が使用される(Cherepanov PPおよびWacker
nagel W.Gene158:9〜14頁、1995年;Bubeck Aら、J.
Virol.78:8026〜8035頁、2004年)。
細胞における部位特異的組換え反応に起因する選択された反応生成物は、完全なウイルス
ゲノムを含み、選択された核酸分子は、第1の制限部位を有し、第2の制限部位は、好ま
しくは、アデノウイルスゲノム中には存在せず、より好ましくは、ヒトアデノウイルス5
型のゲノム中に存在しない、AbsI、BstBI、PacI、PsrI、SgrDIお
よびSwaIを含む制限部位の群から選択される。この方法によれば、第3および第2の
核酸分子は、原核生物宿主細胞中に別個に導入され得、好ましい実施形態では、宿主細胞
は、第2の核酸を有し、最先端の技術を使用する第3の核酸分子を用いる形質転換にとっ
て能力のあるものにされる。提供される方法によれば、選択された組換え生成物は、完全
な補完されたウイルスゲノムを含み、これは、制限消化の際に、好ましくは、1種または
複数の制限酵素結合およびそれぞれ、第1および第2の制限部位での核酸の切断を用いる
制限消化の際に、反応生成物から放出され得る。この方法は、さらなるトランスフェクシ
ョンステップを含み、放出されたウイルスゲノムが、標準法を使用して、好ましくは、当
技術分野で公知のその他の方法の中でも、トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン
(PEI)またはリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、許容真核生物宿
主細胞中に導入される。完全な補完されたウイルスゲノムの、真核生物許容宿主細胞への
トランスフェクションによって、複製能力のあるアデノウイルスベクターが得られ、ベク
ターは、遺伝子導入、ワクチンまたは任意の治療用途のために使用される。
法が提供され、複数の第3の核酸分子および第2の核酸分子が提供され、複数の第3の核
酸分子および複数の第2の核酸分子を、部位特異的組換えが起こり、複数の核酸分子が形
成されるように組み合わせ、反応させ、全体として複数がライブラリーを形成し、ライブ
ラリーが、第2の核酸分子の以下のエレメント:(i)単一コピー複製のための細菌ヌク
レオチド配列、および(ii)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列単位を含
む細菌ヌクレオチド配列単位、部位特異的組換え部位、ウイルスのゲノムの第2の部分な
らびに第2の制限部位と呼ばれる制限部位、ならびに場合によりウイルスのゲノムの第1
の部分、ヌクレオチド配列、好ましくはゲノムヌクレオチド配列または転写単位、原核生
物において調節活性を有する調節核酸配列、部位特異的組換え部位、陰性選択マーカーを
提供するヌクレオチド配列、(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および
(ii)陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位
ならびに第1の制限部位を含む第3の核酸分子に由来するエレメントを含む複数の第5の
核酸分子からなる。
5の核酸分子または第5の核酸分子のライブラリーを作製するための方法を開示し、複数
の第3の核酸分子および第2の核酸分子を組み合わせ、原核生物宿主細胞において提供さ
れる方法に従って反応させ、宿主細胞は、好ましくは、細菌細胞であり、エレクトロポレ
ーションされるか、または標準法に従って化学的に能力があるようにされるのいずれかに
よって核酸を受容し得る。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、第2の核酸分子を有
し、エレクトロポレーションによって第3の核酸分子を受容する。より好ましい実施形態
では、細菌は、大腸菌である。
リーニングされる必要がない。方法は、組換え生成物を有する宿主細胞が、第2の選択マ
ーカーおよび陽性選択マーカーに対する耐性を付与し、陰性選択薬剤に対して感受性では
なく、陰性選択マーカーの発現を伴わないようなものである。さらに、提供される方法に
よれば、第3の核酸分子の条件付き複製によって、宿主細胞が、反応生成物のみを複製し
、不要な混入核酸分子をいずれも避けることが確実になる。好ましい実施形態では、陽性
選択マーカーは、カナマイシンに対する耐性を付与し、陰性選択マーカーは、ストレプト
マイシンに対する感受性を付与し、第2の核酸によって提供される第2の選択マーカーは
、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。
オチド配列のライブラリーを作製するための方法が提供され、ライブラリーは、各々、単
一の個々のヌクレオチド配列を含有する複数のウイルスゲノムによって表され、ヌクレオ
チド配列は、転写単位の部分である。本発明の好ましい実施形態では、核酸配列は、発現
させる核酸であり、ヌクレオチド配列は、完全なウイルスゲノム中に、単一コピーとして
存在する。より好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノウイルスであり、方法は、複
数の個々のアデノウイルスを構築するための手段を提供する。さらにより好ましい実施形
態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型である。得られたアデノウイルスウ
イルスライブラリーは、遺伝子機能の同定のために、スクリーニング適用において、発現
ライブラリーまたはゲノムライブラリーを構築するために、また遺伝子導入のために使用
され得る。
デノウイルスゲノム、それにより各々の完全な補完されたアデノウイルスゲノムが、第1
および第2の制限酵素での制限消化によって放出され、許容宿主細胞へのトランスフェク
ションの際に生存可能な複製能力のあるアデノウイルスを生成し得る。アデノウイルスの
再構成および増殖のために使用される許容細胞株は、すべての欠失された領域をシスまた
はトランスで補完できる。第1世代のAV5ウイルスゲノムの場合には、E1機能を補完
する許容細胞株が使用され得、細胞株は、当技術分野で公知のものの中でも、293、9
11、Per.C6、CAPを含む群から選択され得る。ウイルスゲノムのさらなる成分
をトランスで提供するその他の細胞株も同様に、必要に応じて使用され得る。さらに、ウ
イルス再構成および複製を可能にするために、前記の欠失された成分の一過性発現も使用
され得る。
中に少なくとも第1の核酸分子、第2の核酸分子、場合により、部位特異的リコンビナー
ゼを提供する許容細胞株、第1の核酸分子および第2の核酸の組合せ、第3の核酸分子、
第3の核酸分子および第2の核酸分子の組合せ、第4の核酸分子、第5の核酸、複数の第
4の核酸分子、複数の第5の核酸分子または複数の個々のアデノウイルスを含むキットが
提供される。
第2の核酸、好ましくは、第2の核酸の直鎖形態および部位特異的リコンビナーゼを提供
する許容細胞株を含む。好ましい実施形態では、第2の核酸の部分は、少なくとも部位特
異的組換え部位およびウイルスのゲノムの第2の部分を含む。本発明において提供される
方法によれば、各々、完全な補完されたウイルスゲノムにおいて、ヌクレオチド配列また
はヌクレオチド配列のライブラリーを含む、核酸または前記核酸のライブラリーが構築さ
れ得、核酸分子は、アデノウイルスまたは複数の個々のアデノウイルスを作製するために
、使用される準備ができており、前記許容細胞株中に直接導入され得、好ましい実施形態
では、細胞株は293であり、リコンビナーゼは、野生型Flpリコンビナーゼであり、
アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス5型である。
発明の第2の核酸分子間の、または本発明の第2の核酸分子および本発明の第3の核酸分
子間の組換えの場合におけるように、ウイルスのゲノムの部分または異なる部分を用いる
組換えの対象となるか、または組換えの対象となるべきである場合には、ウイルスは、同
一種のものである、好ましくは、同一血清型のものであるということは好ましい。より詳
しくは、本発明の第1の核酸分子が、アデノウイルス19a型のゲノムの部分を含有し、
本発明の第2の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである
場合には、本発明の前記の第2の核酸分子はまた、アデノウイルス19a型の部分を含有
する。本発明の第1の核酸分子は、アデノウイルス5型のゲノムの部分を含有し、本発明
の第2の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである場合に
は、本発明の前記第2の核酸分子はまた、アデノウイルス5型の部分も含有する。同様に
、本発明の第3の核酸分子が、アデノウイルス19a型のゲノムの部分を含有し、本発明
の第2の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである場合に
は、本発明の前記第2の核酸分子はまた、アデノウイルス19a型の部分も含有する。ま
た、本発明の第3の核酸分子が、アデノウイルス5型のゲノムの部分を含有し、本発明の
第2の核酸分子を用いる組換えの対象となるか、組換えの対象となるべきである場合には
、本発明の前記第2の核酸分子はまた、アデノウイルス5型の部分も含有する。
例示であって、本発明の範囲の限定と考えられてはならない。
種の核酸を組み合わせ、その組換え部位によって反応させ、実施例1および2の開示され
る方法に従って第4の核酸分子に対応する組換え生成物を形成する。作製された第4の核
酸は、選択され得、正確に1コピーの完全な補完されたウイルスゲノムを含有する。反応
生成物は、許容細胞において複製され得る完全なウイルスゲノムを放出するために、場合
により、第1および第2の制限酵素で切断され得る。実施例1によれば、pDonorS
ir1と同一または類似の第1の核酸ベクター(配列番号1)は、野生型Frt部位に由
来する最小のFrt34組換え部位(配列番号7)、(i)条件付き複製のための細菌ヌ
クレオチド配列(OriR6K)、および宿主細胞にカナマイシンに対する耐性を付与す
る第1の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列(KnR)を含む細菌ヌクレオチド配
列、第1の制限部位(RS1)、アデノウイルスゲノムの左側ITR(ITRleft)
を含有するウイルスのゲノムの第1の部分およびパッケージングシグナルESならびに転
写単位(TU)を含有する。第2の核酸は、野生型Frt48組換え(配列番号8)部位
、アデノウイルスゲノムの右側ITR(ITRrigth)を含むアデノウイルスのゲノ
ムの第2の部分(Ad)、第2の制限部位(RS2)、ならびに(i)単一コピー複製の
ための細菌ヌクレオチド配列(F’ori)、および(ii)宿主細胞にクロラムフェニ
コールに対する耐性を付与する第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列(CmR
)を含む細菌ヌクレオチド配列を含む、pBACSir1(配列番号13)またはpBA
CSir2(配列番号2)と同一または類似であるBACベクターである。両核酸分子は
、Flpリコンビナーゼの存在下で、細菌宿主細胞において、その組換え部位によって反
応させる。得られた第4の核酸分子は、単回組換え生成物または多重組換え生成物のいず
れかからなる、組換えアデノウイルスBAC(pRAB)である。図1Aには、単回組換
え生成物(pRAB1x)(配列番号4)の模式的組成が示されている。図1Bには、二
重(pRAB2x)組換え生成物(配列番号5)の模式的組成が示されている。第1およ
び第2の制限酵素での第4の核酸のDNAの消化の際に、左側および右側ITR、パッケ
ージングシグナルおよび転写単位を含有する完全なアデノウイルスゲノムが、pRABか
ら放出される(図1C)。実施例1において開示された方法に従って得られ、実施例2に
おいて開示された方法に従って第1および第2の制限酵素で消化された第4の核酸のDN
Aが、許容293細胞にトランスフェクトされる場合には、生存可能な第1世代アデノウ
イルスベクターは、事例の97%において得られる。
第1世代アデノウイルスウイルスの組成を示す図である。2つの型の反応生成物のDNA
は、pBACSir1へのpDonorSir1の単回および二重挿入に起因するpRA
B1xおよびpRAB2xであり、pDonorSir1は、ブダペスト条約に従って受
託番号DSM23753でDSMZに寄託された生物と同一であり、pBAcSir1は
、ブダペスト条約に従って受託番号DSM 24298でDSMZに寄託された生物と同
一である。それぞれの反応生成物を、標準プロトコールに従って、DH10B細菌の増殖
培養物から単離し、XhoIを用いる制限消化によって特徴付けた(図2A、レーン3〜
4)。レーン1には、ヌクレオチド長マーカーをロードし、1から10kbの間の規定の
長さを有する参照断片を提供した。レーン2には、組換えアデノウイルスBACベクター
pRABref(配列番号3)の制限パターンが、参照として示されている。pRABr
efのコンピュータで作製したXhoI制限パターンは、以下のとおりである:14.5
kb、10.274kb、7.403kb、2.466kb、1.445kbおよび0.
595kb。単回組換え生成物RAB1x(レーン3)の分析によって、それぞれ、6.
266kbおよび4.187kbの長さの特徴的なさらなるバンドの対が得られる。単回
組換え反応生成物RAB1x(配列番号4)のXhoIを用いる消化のコンピュータで作
製したパターンは、以下のとおりである:14.5kb、10.274kb、6.266
kb、4.187kb、2.466kb、1.445kbおよび0.595kb。二重組
換え生成物の場合には、3.05kbの第3のさらなるバンドが、(レーン4)において
現れる。二重組変え反応生成物RAB2x(配列番号5)のXhoIを用いる消化のコン
ピュータで作製したパターンは、以下のとおりである:14.5kb、10.274kb
、6.266kb、4.187kb、3.05kb、2.466kb、1.445kbお
よび0.595kb。さらなる実験では、RAB1xおよびRAB2x DNAを単離し
、PacI制限酵素を用いて切断し(それぞれ、図1中、RS1およびRS2に対応する
)、許容293細胞にトランスフェクトした。図2Aは、PacI制限されたRAB1x
(レーン6)およびRAB2x(レーン7)でトランスフェクトされた293細胞から単
離されたウイルスDNAの制限パターンを示す。それぞれ、再構成組換えアデノウイルス
、RAB1xおよびRAB2xの両方から得られたウイルスDNAの、XhoIを用いる
消化のコンピュータで作製されたパターンは、以下のとおりである:14.5kb、8.
499kb、3.365kb、2.466kb、1.445kbおよび0.595kb。
PacIを用いる消化の際に、同一の完全な補完されたアデノウイルスゲノムが、pRA
Bsから遊離されるので、制限断片パターンは、両ウイルスについて同一である。RAB
1xまたはRAB2xの制限パターンを、RAB1xおよびRAB2xと本質的に同一で
あるが、転写単位を欠く空のアデノウイルスと比較した(図2、レーン5)。それぞれ、
RAB1xまたはRAB2xから単離されたアデノウイルスDNAのXhoIを用いる消
化の際のコンピュータによる制限断片パターンは、以下のとおりである:14.5kb、
8.499kb、3.365kb、2.466kb、1.445kbおよび0.595k
b。
BACSir2間の組換え生成物の制限断片分析を示す図であり、pDonorSir2
は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM 23754でDSMZに寄託された生物と
同一であり、pBACSir2は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM 24299
でDSMZに寄託された生物と同一である。組換え生成物の選択は、選択薬剤として、カ
ナマイシン(25μg/ml)クロラムフェニコール(25μg/ml)および硫酸スト
レプトマイシン(50μg/ml)を含有する寒天プレート上で行われた。これらの条件
下で、大腸菌は、組換えられた組換えアデノウイルスBAC(pRABs)を含有してお
り、88種の分析された反応生成物のうち83種において反応生成物としてpRAB_R
PSL_1x(配列番11)を含有していた。88の事例のうち2種のみにおいて、二重
組換え反応生成物pRAB_RPSL_2x(配列番号12)が得られた。シングルコロ
ニーを選択プレートから選び取り、クロラムフェニコール(25μg/ml)を含有する
液体培地中で継代培養し、pRABを含有するコロニーのその後の継代培養物からBAC
DNAを単離し、XhoIを用いる消化の際の制限断片分析によって、反応生成物の完
全性を分析した(図2B)。分析された6種の分析された組換え体のすべてが、pRAB
_RPSL_1xを含有していた。方法の信頼性を調べるために、実験を反復し、さらに
82種のコロニーを選択プレートから選び取り、上記のように特徴付けた。本発明者らは
、図2B中Dで印が付けられたpRAB_RPSL_2xに対応する多重挿入生成物を含
有する2種のクローンのみ、それぞれ、クローン番号47および53を見い出すことがで
きた。さらに7種のBAC DNA調製物が、親のベクターpBACSir2によって混
入されており(Vで印が付けられている、クローン番号9、17、22、39、41、6
2、67)、3種が、再編成に起因する組換え生成物であった(rで印が付けられている
、クローン番号25、46、68。さらなる実験では、第5の核酸に対応する合計44種
のBACを分析し、1種のみの組換え生成物が、pRAB_RPSL_2xに対応してお
り、44種のクローンのうち43種が、pRAB_RPSL_1xに対応していた。全部
で126/132種のBACが、単回組換え生成物pRAB_RPSL_1xに対応して
おり(分析された組換え生成物の95.5%)、多重組換えは、クローンの2.3%に相
当する3/132において観察された。
れらのライブラリーを構築するための実施例3に開示される方法を示す図表示である。第
3の核酸分子および第2の核酸分子間の組換えが、組み合わせ、そのFrt組換え部位に
よって反応させ、選択され得る組換え生成物を形成し、組換え事象の数は1に限定される
。実施例3によれば、原核生物プロモーター(PKプロモーター)、野生型Frt部位に
由来する最小のFrt34組換え部位、陰性選択マーカー(Rpsl)、(i)条件付き
複製のための細菌ヌクレオチド配列(OriR6K)、および宿主細胞にカナマイシンに
対する耐性を付与する陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオ
チド配列(KnR)、第1の制限部位(RS1)、アデノウイルスゲノムの左側ITR(
ITRleft)およびパッケージングシグナルESを含有するウイルスのゲノムの第1
の部分、転写単位または対象とする遺伝子(GOI)を含有する、pDonorSir2
と同一または類似である第3の核酸分子。pBACSir2(配列番号2)と同一または
類似である第2の核酸は、野生型Frt48組換え部位(配列番号8)、アデノウイルス
ゲノムの右側ITR(ITRrigth)、第2の制限部位(RS2)ならびに(i)単
一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列(F’ori)、および(ii)宿主細胞に
クロラムフェニコールに対する耐性を付与する第2の選択マーカーを提供するヌクレオチ
ド配列(CmR)を含む細菌ヌクレオチド配列単位を含むアデノウイルスのゲノムの第2
の部分を含む。両核酸分子は、Flpリコンビナーゼの存在下で、細菌宿主細胞において
、その組換え部位によって反応させる。開示される方法を使用して、得られた組換えBA
Cは、大部分は(95%超)、単回組換え生成物からなる。図3Aには、単回組換え生成
物pRAB_RPSL_1xの模式的組成が示されている。図3Bには、二重組換えが、
図式的に表されている。組換え生成物pRAB_RPSL_2xでは、原核生物プロモー
ター(PKプロモーター)は、陰性選択マーカー(Rpsl)のオープンリーディングフ
レームに近接している。この生成物は、実施例3に開示される方法に従って、組換え生成
物の2.5%未満で観察される。
lp細胞における、補完された感染性アデノウイルスウイルスの再構成を示す図であり、
293Flp細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM ACC3077でDSM
Zに寄託された生物と同一である。293Flp細胞を、pSirDonor1−EGF
P(配列番号9)に対応する第1の核酸分子およびpBACSir2に対応する第2の核
酸分子を用いてトランスフェクトし、トランスフェクションに先立って、両核酸をPac
Iで処理した。標準細胞培養条件下、37℃で3日培養した後、293細胞における増殖
性アデノウイルス製造に特徴的な細胞変性効果(CPE)を示す細胞の彗星型の蛍光集合
体が、顕微鏡下で検出された。
B_RPSL_2xを保持する大腸菌DH10B細胞の、ストレプトマイシンによる増殖
の選択的阻害を示す図である。それぞれ、空のベクターpBACSir2、単回組換えp
RAB_RPSL_1x_番号1または2種の二重組換えアデノウイルスBACベクター
、pRAB_RPSL_2x_番号47およびpRAB_RPSL_2x_番号53でト
ランスフェクトした大腸菌DH10B細胞から増殖曲線を作成した。細菌培養物の増殖は
、出発材料として希釈された飽和一晩培養物から出発して、異なる濃度のストレプトマイ
シンで行い、OD600を経時的にモニタリングした。対照BACベクターpBACSi
r2を含有する同型培養物のOD600の平均が、0.8に達した後、通常、播種の8時
間後、OD600値を測定し、光学濃度を算出し、100%に設定された対照培養物の平
均OD600に参照した。各増殖条件の5回の独立実験の結果をプロットし、プロットさ
れた5回の実験内の相対光学密度の標準偏差を、エラーバーとして含めた。対照BACベ
クターpBACSir2または単回組換えBACベクターpRAB_RPSL_1xを保
持する大腸菌クローンは、極めて高濃度(200μg/ml)のストレプトマイシンの存
在下でさえも良好に増殖した。対照的に、pDonorSir2の二重挿入を保持するク
ローン(pRAB_RPSL_2x番号47)およびpRAB_RPSL_2x_番号5
3)の増殖は、50μg/mlのストレプトマイシンによって阻害され、一部の阻害は、
25μg/mlのストレプトマイシンの存在下ですでに検出可能であった。
基づいて、陽性および陰性選択マーカーは、カナマイシンの存在下で相乗的に働く可能性
を有する。組換えアデノウイルスウイルスベクターの作製のための本明細書に記載された
本発明の方法による、多重組換え生成物の対抗選択のために相乗的に働くと期待される、
陽性および陰性選択マーカーの組合せは、表中に「+」の印が付けられており、相乗的に
働くと期待されていない組合せは、「0」で印が付けられている。
ウイルス19a型ベクターの組成を示す図である。標準プロトコールに従って、DH10
B細菌の増殖培養物から反応生成物を単離し、KpnIを用いる制限消化によって特徴付
けた。Mで印が付けられた最初のレーンには、ヌクレオチド長マーカーをロードし、1か
ら10kbの間の規定の長さを有する参照DNA断片を提供した。単回組換え生成物pR
AB19a1x(レーン1、2、3)および二重組換え生成物(レーン4)のKpnIを
用いる制限分析が示されている。単回組換え反応生成物pRAB19a1x(配列番号1
6)のコンピュータで作製したKpnIを用いる消化のパターンは、以下のとおりである
:11.361kb、6.254kb、5.447kb、4.443kb、3.271k
b、2.016kb、1.886kb、1.868kb、1.585kbおよび28bp
。二重組換え生成物の場合には、3.364kbのさらなるバンドが現れる(レーン4)
。二重組換え反応生成物pRAB19a2x(配列番号17)のKpnIを用いる消化の
コンピュータで作製したパターンは、以下のとおりである:11.361kb、6.25
4kb、5.447kb、4.443kb、3.364kb、3.271kb、2.01
6kb、1.886kb、1.868kb、1.585kbおよび28bp。
用する組換えアデノウイルスBACの構築]
組換えアデノウイルスゲノムの構築のために、第1の核酸pDonorSir1および
第2の核酸分子pBACSir1を組み合わせ、pBACSir1およびFLPリコンビ
ナーゼの条件付き発現のためのプラスミドpCP20を有するDH10B大腸菌細胞にお
いて反応させ、pDonorSir1は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM237
53でDSMZに寄託された生物と同一であり、pBACSir1は、ブダペスト条約に
従って受託番号DSM24298でDSMZに寄託された生物と同一であり、pBACS
ir1およびpCP20を有する大腸菌細胞は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM
23742でDSMZに寄託された生物と同一である。標準プロトコールを使用するエレ
クトロポレーションによって、プラスミドpDonorSir1をDH10B大腸菌細胞
に導入した。核酸分子pBACSir1は、pKSO BACベクターの誘導体であり(
Messerleら Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:14
759〜14763頁、1997年)、E1領域およびE3領域について欠失しているヒ
トアデノウイルス5型(AV5)ゲノムの右側部分を含有する。核酸分子pBACSir
1は、Flpの発現のための条件付き発現系を有する大腸菌DH10B(または同等の、
F因子を欠く大腸菌K12由来株)中で維持した。本明細書では、実施例1において、D
H10B細胞は、アデノウイルスBAC pBACSir1を有しており、Flpリコン
ビナーゼは、プラスミドpCP20によって提供され、その複製は、温度感受性複製起点
によって制御される(Bubeck A.ら、J.Virol.78:8026〜803
5頁、2004年)。pBACSir1およびpCP20を有するDH10B細胞を、ア
ンピシリン(50μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)の存在下
、30℃で維持した。次いで、これらのDH10B細胞を、pDonorSir1を用い
て電気形質転換し、あらゆる抗生物質の不在下、42℃で60分間培養した。発現された
Flpは、それぞれ、pDonorSir1およびpBACSir1上に存在するFRT
部位間の部位特異的組換えを誘導した。同時に、pCP20は、高温下で大腸菌において
複製できないので、Flp発現の排除も始まった。形質転換された培養物を、選択薬剤と
してカナマイシン(25μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を
含有する寒天プレート上にプレーティングした。これらの条件下で、少なくとも1つのp
DonorSir1プラスミドが、pBACSir1で組み換えられている、組み換えら
れた組換えアデノウイルスBAC(pRAB)を含有する大腸菌を選択した。pRABを
含有するDH10B細胞の増殖培養物からDNAを単離し、XhoIを用いる制限消化に
よって反応生成物の完全性を分析した(図2A(レーン2〜4)。分析したすべての組換
え生成物が、pRABを含有しており、単回(pRAB1x)または多重組換え生成物(
pRAB2x)のいずれかである。
て生じた組換えアデノウイルスの再構成]
実施例1に開示される方法による部位特異的組換えから得られた2つの主要な型のBA
Cベクターは、それぞれ、pRAB1xおよびpRAB2xである。DH10B細胞にお
けるFlp−組換えによって生じたpRABは、完全な補完されたアデノウイルスゲノム
の1つの、1つのみの連続配列を含有しており、これは、293細胞において複製能力が
あった。プラスミド調製のためのキットを使用して、pRABのDNAを、LB培地中の
飽和大腸菌一晩培養物(100ml)から精製した。本明細書では、Macherey
and Nagel、Germany製のNucleobond PC−100キットを
、製造業者の推奨に従って使用した。得られたpRBAの同一性は、pRAB DNAの
制限分析によって確認した(図2A、レーン2〜4)。ウイルス再構成のために、精製p
RAB DNAを、製造業者の推奨に従って、DNA1μgあたり10UのPacIを用
いて2時間処理した。続いて、PacI消化されたpRAB1xおよびpRAB2x D
NAを、標準プロトコールに従ってフェノール−クロロホルムを使用して精製し、その後
、293細胞へトランスフェクションした。手短には、10μgのpRAB DNAを、
水浴中、37℃で、100μlの容量中で、1.5時間消化した。続いて、反応試験管(
Eppendorffカップサイズ1.5ml、Eppendorf AG、Hambu
rg、Germany)に50μlのフェノール/クロロホルム(1:1混合物)を加え
、20秒間ボルテックス処理し、ここでは、Vortexer MS−3 basicを
使用した(IKAIKA(登録商標)Werke GmbH & Co.KG、Stau
fen、Germany)。試験管を、卓上遠心機において、最大速度(20000×g
)で、室温で5分間遠心分離し、80μlの水性上相を、新たな試験管に移し、10μl
の3M NaAc(pH4.5)および200μlのEtOHを加えた。すべての試薬お
よび化学物質は、Sigma−Aldrich、St Louis、USAから購入した
。沈殿したDNAが目に見えるようになるまで、試験管を指先で混合した。さらに、試験
管を室温で5分間インキュベートし、DNAを、卓上遠心機において、最大速度で、室温
で15分間ペレットにした。上清を定量的に除去し、ペレットを、20μlの滅菌脱イオ
ン水に直ちに溶解した。293細胞のトランスフェクションは、リポフェクションを使用
して行った。本明細書では、Superfectトランスフェクション試薬(Qiage
n、Hilden、Germany)を、製造業者の推奨に従って使用した。得られたア
デノウイルスは、293細胞において複製能力があり、標準プロトコールに従って増殖さ
れ得る(Green MおよびLoewenstein P、Human Adenov
iruses:Propagation,Purification,Quantifi
cation、and Storage in Current Protocols
in Microbiology79)。この実施例に開示される方法に従って得られた
組換えアデノウイルスベクターの同一性は、XhoIを用いるアデノウイルスベクターD
NAの制限消化およびアガロースゲル電気泳動を使用するDNA断片の分析によって確認
した(図2A)。ゲノムアデノウイルスベクターDNAを調製するために、293細胞(
2.5×107個細胞)を、293細胞へのPacI消化されたpRABのトランスフェ
クション後に得られた組換えアデノウイルスベクターを用い3のMOIで感染させた。細
胞変性効果(CPE)が完了した後、感染細胞をPBS中で1回洗浄し、プレートからか
きとり、PBSに再懸濁した。細胞(約4×106個細胞/ml)を、細胞懸濁液に等容
積のTSTバッファー(2% TritonX−100、400mM NaCl、20m
M Tris−HCl pH8.0)を加えることと、それに続いて、氷上で30分間イ
ンキュベートすることによって溶解した。4℃で、20,000gで10分間の遠心分離
によって細胞片を除去し、上清を、0.5% SDSの存在下、50μg/mlのプロテ
イナーゼK(Roche)を用いて、56℃で60分間処理した。フェノール/クロロホ
ルムおよびエタノール沈殿法によって核酸を抽出した後、抽出物をRNアーゼA(Sig
ma)で処理した。RNA不含ウイルスDNAを、再度フェノール/クロロホルム抽出し
、エタノールを用いて沈殿させた。pRAB1xおよびpRAB2xに由来する再構成さ
れたウイルスのXhoI制限パターンは、コンピュータで作製したパターンと対応してお
り、得られた組換えアデノウイルスウイルス中のアデノウイルスゲノムの完全性を確認し
た(図2Aレーン5〜7)。
多重挿入を避け、アデノウイルス発現ライブラリーの構築を改善するために、本発明者
らは、本発明の第3の核酸分子の一実施形態であるpDonorSir2を構築し、pD
onorSir2は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM23754でDSMZに寄
託された生物と同一である。pDonorSir2は、そのFRT遺伝子座でpDono
rSir1とは異なり、次に、このpDonorSir2は、FRT部位の上流に、強力
な大腸菌ガラクトキナーゼプロモーター(Warming, S.、N.Costant
ino、Court DL、N.A.JenkinsおよびN.G.Copeland.
Simple and highly efficient BAC recombin
eering using galK selection.Nucleic Acid
s Res 2005年、33:e36)、FRT部位の下流に、rpsLオープンリー
ディングフレームを含有し、これは、発現されると、ストレプトマイシン感受性を媒介し
た(Reyrat JM、Pelicic V、Gicquel B、Rappuoli
R.Counterselectable markers:untapped to
ols for bacterial genetics and pathogene
sis.Infect.Immun.1998年、66:4011〜4017頁)。pD
onorSir2の使用は、以下のとおりに例示されている:pBACSir2およびp
CP20を有するDH10B細胞を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールの存在下
、30℃で維持し、本発明の第2の核酸分子の一実施形態でもあるpBACSir2は、
ブダペスト条約に従って受託番号DSM24299でDSMZに寄託された生物と同一で
あり、pBACSir2およびpCP20を有する大腸菌細胞は、ブダペスト条約に従っ
て受託番号DSM23743でDSMZに寄託された生物と同一である。次いで、DH1
0B細胞を、pDonorSir2を用いて電気形質転換し、あらゆる抗生物質の不在下
、42℃で150分間培養した。発現されたFlpは、それぞれ、pDonorSir2
およびpBACSir2上に存在するFRT部位間の部位特異的組換えを誘導した。同時
に、pCP20は、高温下で大腸菌において複製できないので、Flp発現の排除も始ま
った。形質転換された培養物を、選択薬剤としてカナマイシン(25μg/ml)および
クロラムフェニコール(25μg/ml)および硫酸ストレプトマイシン(50μg/m
l)を含有する寒天プレート上にプレーティングした。これらの条件下で、pDonor
Sir2プラスミドが、pBACSir2で組み換えられている、組み換えられた組換え
アデノウイルスBAC(pRAB_RPSL)を含有する大腸菌を選択した。シングルコ
ロニーを選択プレートから選び取り、振盪インキュベーターにおいて、クロラムフェニコ
ール(25μg/ml)を含有する10ml液体LB培地中、37℃で一晩培養した。使
用したすべての化学物質および培地は、Sigma−Aldrich、St Louis
、USAから購入した。これらの培養物に由来するpRAB_RPSL DNAを、DN
A−プラスミド単離キットを使用して、製造業者の推奨に従って、続いて単離し、Xho
Iを用いる制限消化によって、反応生成物の完全性を分析した(図2B)。本明細書では
、Macherey and Nagel、Germany製のNucleobond
PC−100キットを、製造業者の推奨に従って、pRAB_RPSL−DNAの単離の
ために使用した。分析された6種のpRABすべてのXhoI制限パターンは、単回組換
え生成物(pRAB_RPSL_1x)に対応していた。適用された対抗選択の信頼性を
調べるために、本発明者らは、選択プレートからさらに82種のクローンを選び取り、上
記のように試験した。2種のクローンのみが、多重挿入生成物を含有しており(図2Bに
おいて「D」と印が付けられている)、さらなる7種のクローンは、pBACSir2が
混入されており(図2Bにおいて「V」と印が付けられている)、3種が、その他の同定
されていない再編成を含有していた(図2Bにおいて「r」と印が付けられている)。全
部で、コロニーの大多数(83/88)が、pRAB_RPSL_1xのみを含有してい
た(図2B)。さらなる実験では、合計44種のクローンを分析し、1種の組換え生成物
のみがpRAB_RPSL_2xに対応しており、44種のクローンのうち43種が、p
RAB_RPSL_1xに対応していた。全部で、126/132種のBACが、単回組
換え生成物pRAB_RPSL_1xに対応するが(分析された組換え生成物の95.4
5%)、多重組換えは、クローンの2.3%に相当する3/132において観察された。
リー効率の決定]
本発明者らの大腸菌組換え系の効率を調べ、組み換えられていないpBACSir2ベ
クターの実施例3のpRAB_RPSL DNA調製物の混入を避けるために、実施例3
に記載された実験を、以下の修飾を用いてさらに2回反復した。
i) 一次クローニング効率を調べるために、本発明者らは、50μlの10mlの形
質転換後培養を取り出し、段階10倍希釈物を、選択薬剤としてカナマイシン(25μg
/ml)、クロラムフェニコール(25μg/ml)および硫酸ストレプトマイシン(5
0μg/ml)を含有する3連の選択アガロースプレート上にプレーティングした(実験
2)。使用したすべての化学物質および培地は、Sigma−Aldrich、St L
ouis、USAから購入した。60分後、培養物の残りを、さらに90分インキュベー
トし、上記のように最終的に150分の合計形質転換後培養時間となった(実験3)。2
枚のプレートに、各実験から得た50μlのトランスフェクション後培養物の各希釈物(
1:101、1:102および1:103)の1mlの最終容量のうち200μlによっ
て播種した。
ii)pRABを含有するコロニーが選択プレート上に現れた後、本発明者らは、選択
薬剤としてカナマイシン(25μg/ml)、クロラムフェニコール(25μg/ml)
および硫酸ストレプトマイシン(50μg/ml)を含有する3連の選択プレートの第2
ラウンドでレプリカプレートを作製した。この手順によって、ベクターおよび多重挿入生
成物両方による混入が最小化され、レプリカプレートの作製が、大腸菌ライブラリーの維
持において定期的に適用される。
よび89であり、実験3では204および129であった。pDonorSir2の50
ngのDNAが使用され、形質転換後培養物の容量が50μlであり、各希釈物の1/5
がプレーティングされたことを考慮して、平均クローニング効率は、1μgの投入に対し
て1.85×106コロニーであった。
デノウイルスの作製]
Flpリコンビナーゼを発現するHEK293 Flp細胞を構築するために、2.5
×105個HEK293細胞を、10μgのPvuIで直線化されたプラスミドpFlp
−Puroを用いるリポフェクションを使用してトランスフェクトし、293Flp細胞
は、ブダペスト条約に従って受託番号DSM ACC3077でDSMZに寄託された生
物と同一である。本明細書において、Superfectトランスフェクション試薬(Q
iagen、Hilden、Germany)を、製造業者の推奨に従って使用した。ト
ランスフェクトされた細胞を、標準細胞培養条件(95%湿度、5% CO2)下、37
℃で48時間インキュベートした。使用した細胞培養培地は、10% FCS、2mM
グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトアビジン(P/S))を含有するDMEM
とした。選択のために、ピューロマイシンを、培地に1μg/μlの最終濃度に加え、細
胞を、選択条件下で12日間培養して、FLPリコンビナーゼを安定に発現する293個
の細胞を得た。使用したすべての化学物質および培地は、Sigma−Aldrich、
St Louis、USAから購入した。安定な細胞プールを拡大し、マスター細胞バン
クを確立した。組換えアデノウイルスの再構成のために、ウェルあたり2×105個の2
93FlpP細胞を、6ウェルプレート上にプレーティングし、プレーティングの5時間
後、細胞を、リポフェクションを使用して、PacIを用いて両方とも直線化された0.
8μgのpDonorSir2−EGFP(配列番号9)および2.5μgのpBACS
ir2を用いて同時トランスフェクトした。本明細書において、Superfectトラ
ンスフェクション試薬(Qiagen、Hilden、Germany)を、製造業者の
推奨に従って使用した。標準細胞培養条件下、37℃で3日培養した後、細胞をかきとる
ことによって回収し、その後の200×gで5分の遠心分離によって集めた。細胞ペレッ
トを、400μlの細胞培養培地(DMEM、10% FCS、2mMグルタミン、1%
P/S)に再懸濁し、3回の連続凍結/解凍サイクルに付した。細胞片を、4.400
×gで15分間の遠心分離によって可溶性物質から分離した。EGFP遺伝子を発現する
アデノウイルスベクターのレスキューの成功を実証するために、2×105個のHEK−
293細胞/ウェルを、6ウェルプレートにプレーティングし、200μlの凍結/解凍
溶解物を用いて12時間後に感染させ、続いて、標準細胞培養条件下、37℃で3日イン
キュベーションした。この時点で、増殖性アデノウイルス複製に特徴的な細胞変性効果(
CPE)を示す細胞の彗星型の蛍光集合体が、顕微鏡下で検出可能であった(図4参照の
こと)。したがって、本方法によって、293Flp細胞への第3の核酸分子の第2の核
酸分子との同時トランスフェクションによる第1世代組換え体複製可能アデノウイルスベ
クターの作製が可能となった。
する組換えアデノウイルス19a型BACの構築]
ヒト非5型組換えアデノウイルスゲノムの構築のために、本発明の第1の核酸分子の一
実施形態である第1のAd19a核酸pDonorSir19aおよび本発明の第2の核
酸分子の一実施形態である第2のAd19a核酸分子pBACSir19aを組み合わせ
、pBACSir19aおよびFLPリコンビナーゼの条件付き発現のためのプラスミド
pCP20を有するDH10B大腸菌細胞において反応させる。プラスミドpDonor
Sir19aを、標準プロトコールを使用するエレクトロポレーションによってDH10
B大腸菌細胞に導入した。核酸Ad19a分子pBACSir19aは、Flpの条件付
き発現系を有する大腸菌DH10B(または同等の、F因子を欠く大腸菌K12由来株)
において維持した。本明細書において、実施例6では、DH10B細胞は、アデノウイル
ス19a型BAC pBACSir19aを有しており、Flpリコンビナーゼは、プラ
スミドpCP20によって提供され、その複製は、温度感受性複製起点によって制御され
る。pBACSir19aおよびpCP20を有するDH10B細胞は、アンピシリン(
50μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)の存在下、30℃で維
持した。次いで、これらのDH10B細胞を、pDonorSir19aを用いて電気形
質転換し、あらゆる抗生物質の不在下、42℃で60分間培養した。発現されたFlpは
、それぞれ、pDonorSir19aおよびpBACSir19a上に存在するFRT
部位間の部位特異的組換えを誘導した。同時に、pCP20は、高温下で大腸菌において
複製できないので、Flp発現の排除も始まった。形質転換された培養物を、選択薬剤と
してカナマイシン(25μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を
含有する寒天プレート上にプレーティングした。これらの条件下で、少なくとも1つのp
DonorSir19aプラスミドが、pBACSir19aで組み換えられている、組
み換えられた組換えアデノウイルス19a型BAC(pRAB19a)を含有する大腸菌
を選択した。pRAB19aのものを含有するDH10B細胞の増殖培養物からDNAを
単離し、KpnIを用いる制限消化によって反応生成物の完全性を分析した(図7)。分
析したすべての組換え生成物が、pRAB19aのものを含有しており、単回(pRAB
19a1x配列番号16)または多重組換え生成物(pRAB19a2x、配列番号17
)のいずれかである。
換えRABの作製]
複数のヒト非5型組換えアデノウイルスゲノムまたはヒト非5型組換えアデノウイルス
ゲノムのライブラリーを構築するために、本発明の第3の核酸分子の一実施形態である第
3のAd19a核酸pDonorSir2_19aおよび本発明の第2の核酸分子の一実
施形態である第2のAd19a核酸分子pBACSir19aを組み合わせ、pBACS
ir19aおよびFLPリコンビナーゼの条件付き発現のためのプラスミドpCP20を
有するDH10B大腸菌細胞において反応させる。プラスミドpDonorSir2_A
d19aは、そのFRT遺伝子座でpDonorSir2と異なり、次いで、このpDo
norSir2_Ad19aは、FRT部位の上流に、強力な大腸菌ガラクトキナーゼプ
ロモーター(Warming SNら Nucleic Acids Res 2005
年、33:e36)およびFRT部位の下流に、rpsLオープンリーディングフレーム
を含有し、これは、発現されるとストレプトマイシン感受性を媒介した(Reyrat
JMら Infect.Immun.1998年、66:4011〜4017頁)。ドナ
ー核酸pDonorSir2_19aは、PacI部位、Ad19a ITRおよびパッ
ケージングシグナルを保持する。
ir19aおよびpCP20を有するDH10B細胞が、アンピシリンおよびクロラムフ
ェニコールの存在下、30℃で維持される。次いで、DH10B細胞を、pDonorS
ir2_Ad19aを用いて電気形質転換し、あらゆる抗生物質の不在下、42℃で15
0分間培養した。発現されたFlpは、それぞれ、pDonorSir2_Ad19aお
よびpBACSir19a上に存在するFRT部位間の部位特異的組換えを誘導する。同
時に、pCP20は、高温下で大腸菌において複製できないので、Flp発現の排除も始
まる。形質転換された培養物を、選択薬剤としてカナマイシン(25μg/ml)および
クロラムフェニコール(25μg/ml)および硫酸ストレプトマイシン(50μg/m
l)を含有する寒天プレート上にプレーティングする。これらの条件下で、pDonor
Sir2_Ad19aプラスミドが、pBACSir19aで組み換えられている、組み
換えられた組換えアデノウイルスBACを含有する大腸菌を選択する。シングルコロニー
を選択プレートから選び取り、振盪インキュベーターにおいて、クロラムフェニコール(
25μg/ml)を含有する液体LB培地10ml中、37℃で一晩培養した。使用され
るすべての化学物質および培地は、Sigma−Aldrich、St Louis、U
SAから購入する。これらの培養物に由来する組換え生成物からDNAを、DNA−プラ
スミド単離キットを使用して、製造業者の推奨に従って、続いて単離し、KpnIを用い
る制限消化によって、反応生成物の完全性を分析した。本明細書において、Macher
ey and Nagel、Germany製のNucleobond PC−100キ
ットを使用する。KpnI制限パターンは、単回組換え生成物に対応する。
本発明は、ブダペスト条約に基づいて寄託された生物学的材料を使用する、および/ま
たは関する。より詳しくは、本明細書において、DSMZとも呼ばれる「Deutsch
e Sammlung von Mikroorganismen und Zellk
ulturen GmbH (DSMZ)」で以下の寄託が行われている。DSM237
53;DSM24298;DSM24299;DSM23743;DSM23742;D
SM ACC3077m;DSM ACC3077;およびDSM23754。
、およびその任意の組合せの両方で、本発明をその種々の形態で理解するための材料であ
る。
Claims (10)
- 第3の核酸分子とも呼ばれる核酸分子と第2の核酸分子とも呼ばれる核酸分子との組合わせであって、
前記第3の核酸分子が、
(1)以下のエレメント:
(a)アデノウイルスの逆方向末端反復を1つのみ含む、アデノウイルスのゲノムの第1の部分と、
(b)ヌクレオチド配列または転写単位と、
(c)原核生物においてプロモーター活性を有する、細菌プロモーターである調節核酸配列と、
(d)1つのみの部位特異的組換え部位と、
(e)陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列と、
(f)(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(g)第1の制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号6によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)受託番号DSM23754でブダペスト条約に基づいてDSMZに寄託された生物中に含有される、(1)で定義された第3の核酸分子を含む異種核酸分子
を含み、かつ、
前記第2の核酸分子が、
(1)以下のエレメント:
(a)(i)単一コピー複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)第2の選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む細菌ヌクレオチド配列単位と、
(b)1つのみの部位特異的組換え部位と、
(c)アデノウイルスの逆方向末端反復を1つのみ含む、アデノウイルスのゲノムの第2の部分と、
(d)第2の制限部位と呼ばれる制限部位と
を含む核酸分子、または
(2)配列番号2および/もしくは配列番号13および/もしくは配列番号14によるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
(3)受託番号DSM24298および/もしくはDSM24299でブダペスト条約に基づいてDSMZに寄託された生物に含有される、(1)で定義された第2の核酸分子を含む異種核酸分子
を含み、
前記第2の核酸分子および前記第3の核酸分子が各々独立に直鎖分子または環状分子のいずれかであり、かつ、
前記第2の核酸分子および前記第3の核酸分子は補完的に完全なウイルスゲノムを形成する、
組み合わせ。 - 前記第3の核酸分子において、原核生物においてプロモーター活性を有する前記調節核酸配列、前記部位特異的組換え部位、および陰性選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列が、5’から3’方向に配置される、請求項1に記載の組合せ。
- 前記第3の核酸分子が、直鎖分子であり、エレメント(a)から(f)が、第1の制限部位を認識および切断する第1の制限酵素を用いて、第3の核酸分子の環状分子を切断する際に、以下の1から6:
1.ウイルスのゲノムの前記第1の部分、
2.前記ヌクレオチド配列または転写単位、
3.原核生物においてプロモーター活性を有する、細菌プロモーターである調節核酸配列、
4.対応するリコンビナーゼの存在下で組み換えられる、前記部位特異的組換え部位、
5.陰性選択マーカーを提供する前記ヌクレオチド配列、ならびに
6.(i)条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列、および(ii)陽性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列を含む前記細菌ヌクレオチド配列単位
の順序で5’→3’方向に配置される、請求項1または2に記載の組合せ。 - 前記アデノウルスが、ヒトアデノウイルスである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組合せ。
- 前記アデノウルスが、ヒトアデノウイルス5型である、請求項4に記載の組合せ。
- 前記アデノウルスのゲノムの第1の部分が、E1転写単位のTATAボックスの上流のアデノウイルス5型の左側末端全体またはその1つもしくはいくつかの部分である、請求項4に記載の組合せ。
- 前記条件付き複製のための細菌ヌクレオチド配列が、複製起点を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組合せ。
- 前記陰性選択マーカーまたは陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列の発現が、選択薬剤および/または選択条件に対する感受性を媒介または付与する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組合せ。
- 前記陰性選択マーカーを提供するヌクレオチド配列が、galK、tetAR、pheS、thyA、lacy、ccdBおよびrpsL遺伝子を含む群から選択される請求項8に記載の組合せ。
- 前記ヌクレオチド配列が、ゲノムヌクレオチド配列である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組合せ。
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