JP7385742B2 - ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス生産システム - Google Patents
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Description
5’逆末端反復配列(inverted terminal repeat,ITR)-Ψパッケージング信号配列-E1-他の遺伝子-3’逆末端反復配列。
5’逆末端反復配列(inverted terminal repeat,ITR)、Ψパッケージング信号配列、E1及び3’逆末端反復配列を含まなく;
E1直後部分からE3直前部分、及びE3直後部分から3’逆末端反復配列直前部分までは含み;及び
選択的に、E3を含んでも、含まなくてもよい。
最終ゲノムプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染(transfect)させる段階;及び
ヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階。
導入遺伝子を含むクローニングシャトルプラスミドに含まれた導入遺伝子発現カセット(expression cassette)はゲノムプラスミドに移動して最終ゲノムプラスミドとなる。最終ゲノムプラスミドを制限酵素で線形化する。その後、線形化された最終ゲノムプラスミド及びヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる。前記形質感染段階によってGLAdが生産される。
導入遺伝子を含むクローニングシャトルプラスミドに含まれた導入遺伝子発現カセット(expression cassette)は、ゲノムプラスミドに移動して最終ゲノムプラスミドとなる。最終ゲノムプラスミドを制限酵素で線形化する。その後、線形化された最終ゲノムプラスミド、ヘルパープラスミド及びpAd5pTP発現プラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる。前記形質感染段階によってGLAdが生産される。
ウイルスパッケージング細胞株にヘルパープラスミドを形質感染させる。適当な時間が経過した後、導入遺伝子発現カセットを含むGLAdを、前記形質感染された細胞株にさらに感染させる。適当な時間が経過すると、GLAdが生産される。このとき、生産されるGLAdは、増幅する様相を示してよい。
ウイルスパッケージング細胞株にヘルパープラスミド及びpAd5pTP発現プラスミドを形質感染させる。適当な時間が経過した後、導入遺伝子発現カセットを含むGLAdを、前記形質感染された細胞株にさらに感染させる。適当な時間が経過すると、GLAdが生産される。このとき、生産されるGLAdは、増幅する様相を示してよい。
pGT2プラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いてKanr~ColE1領域に該当する第1DNA断片を製造する段階;
第1DNA断片を制限酵素で切断する段階;
5’相同ストレッチ部位(homologous stretch)、5’逆末端反復配列(inverted terminal repeat,ITR)、Ψ5パッケージング信号配列、CMVプロモーター、多重クローニング部位(multi-cloning site,MCS)、SV40ポリ(A)信号配列、及び3’相同ストレッチ部位を含む第2DNA断片を製造する段階;
第2DNA断片を制限酵素で切断する段階;及び
制限酵素で切断された第1DNA断片と制限酵素で切断された第2DNA断片とを結合してpBestを製造する段階。
pGT2プラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いてΨ5-Left-Arm-1のKanr~ColE1領域部分を製造する段階;
Ψ5-Left-Arm-1のKanr~ColE1領域部分を制限酵素で切断する段階;
Ψ5ゲノムのBstZ17I~BamHI領域に該当する第3DNA断片を製造する段階;
制限酵素で切断されたΨ5-Left-Arm-1のKanr~ColE1領域部分に、制限酵素で切断された第3DNA断片を結合して、Ψ5-Left-Arm-1を製造する段階;
Ψ5-Left-Arm-1を制限酵素で切断する段階;
Ψ5を鋳型とし、プライマーセットを用いて第4DNA断片を製造する段階;
第4DNA断片を制限酵素で切断する段階;及び
制限酵素で切断されたΨ5-Left-Arm-1に、制限酵素で切断された第4DNA断片を結合して、Ψ5-Left-Arm-2を製造する段階。
pGT2プラスミド、Ψ5-Left-Arm-1又はΨ5-Left-Arm-2を鋳型とし、プライマーセットを用いてΨ5-Right-Arm-1のKanr~ColE1領域部分を製造する段階;
Ψ5-Right-Arm-1のKanr~ColE1領域部分を制限酵素で切断する段階;
Ψ5ゲノムのBamHI~3’ITR領域に該当する第5DNA断片を製造する段階;
制限酵素で切断されたΨ5-Right-Arm-1のKanr~ColE1領域部分に、制限酵素で切断された第5DNA断片を結合して、Ψ5-Right-Arm-1を製造する段階;
Ψ5-Right-Arm-1を制限酵素で切断する段階;
Ψ5を鋳型とし、プライマーセットを用いて第6DNA断片を製造する段階;
第6DNA断片を制限酵素で切断する段階;及び
制限酵素で切断された第Ψ5-Right-Arm-1に、制限酵素で切断された第6DNA断片を結合して、Ψ5-Right-Arm-2を製造する段階。
Ψ5-Right-Arm-2を制限酵素で切断する段階;
Ψ5-Left-Arm-2を制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階;及び
制限酵素で切断されたΨ5-Right-Arm-2に、制限酵素で切断されたΨ5-Left-Arm-2から分離した大きい断片を結合して、pAdBestを製造する段階。
pAdBestを制限酵素で切断して小さい断片を分離する段階;
pAdBestを制限酵素で切断して分離した小さい断片を、ClaI制限酵素サイト及びEcoRI制限酵素サイトを含むアダプターに結合して、pAdBest_EcoR_Claを製造する段階;
pAdBest_EcoR_Claを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階;
pAdBestを鋳型とし、プライマーセットを用いて第7DNA断片を製造する段階;
第7DNA断片を制限酵素で切断する段階;
pAdBest_EcoR_Claを制限酵素で切断して分離した大きい断片に、制限酵素で切断された第7DNA断片を結合して、pAdBest_EcoR_Cla_dITRを製造する段階;
pAdBest_EcoR_Cla_dITRを制限酵素で切断する段階;
pAdBestを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階;及び
制限酵素で切断されたpAdBest_EcoR_Cla_dITRに、pAdBestを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して、pAdBest_dITRを製造する段階。
pAdBestプラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いて第8DNA断片を製造する段階;
第8DNA断片を制限酵素で切断する段階;
制限酵素で切断された第8DNA断片にアダプターを結合してpAdBestGL1を製造する段階;
pAdBestGL1に存在する制限酵素サイトを除去してpAdBestGL1_dClaを製造する段階;
pAdBestGL1及びpAdBestGL1_dClaのそれぞれを制限酵素で切断する段階;
制限酵素で切断されたpAdBestGL1及びpAdBestGL1_dClaのそれぞれにアダプターを結合してpAdBestGL2_wtCla及びpAdBestGL2を製造する段階;
pAdBestGL2を制限酵素で切断する段階;
制限酵素で切断されたpAdBestGL2と制限酵素で切断されたラムダファージDNAを混合してpAdBestGL3を製造する段階;
pAdBestGL3を制限酵素で切断する段階;
制限酵素で切断されたpAdBestGL3にアダプターを結合してpAdBestGL4_3Hを製造する段階;
制限酵素で切断されたpAdBestGL3にアダプターを結合してpAdBestGL4_5Hを製造する段階;
pAdBestGL4_3Hに存在する制限酵素サイトを除去してpAdBestGL4_3H_2dClaを製造する段階;
pAdBestGL4_5Hに存在する制限酵素サイトを除去してpAdBestGL4_5H_dClaを製造する段階;
pAdBestGL4_3H_2dClaを制限酵素で切断する段階;
pAdBestGL4_5H_dClaを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階;
制限酵素で切断されたpAdBestGL4_3H_2dClaに、pAdBestGL4_5H_dClaを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して、pAdBestGL5を製造する段階;
pAdBestGL2_wtClaを制限酵素で切断する段階;
pAdBestGL5を制限酵素で切断する段階;
制限酵素で切断されたpAdBestGL2_wtClaと制限酵素で切断されたpAdBestGL5を混合してpAdBestGLを製造する段階;
pAdBestGLを制限酵素で切断する段階;
スキャフォールド/マトリックス付着要素(scaffold/matrix attachment,SMAR element)を製造する段階;
スキャフォールド/マトリックス付着要素を制限酵素で切断する段階;及び
制限酵素で切断されたpAdBestGLに、制限酵素で切断されたスキャフォールド/マトリックス付着要素を結合して、pGLAdを製造する段階。
5’逆末端反復配列(inverted terminal repeat,ITR)、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、イントロン、導入遺伝子(transgene)、ポリ(A)信号配列、スタッファーDNA(stuffer DNA;sDNA)及び3’逆末端反復配列。
試薬、キット、実験用マウス及び通常のクローニング技術
あらゆる種類の制限酵素、クレノウ断片(Klenow fragment)及びHindIII制限酵素で切断されたラムダファージDNAは、ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs,マサチューセッツ、米国)から購入した。エニィヒュージョン(AnyFusion)及びPfu重合酵素は、ジェネンメド(Genenmed,ソウル、韓国)のものを使用した。Ad5の一種であるΨ5は、以前に報告されたことがあり、それを使用した。化学物質試薬は、シグマ(Sigma,ミズーリ、米国)から入手した。DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium )とウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum,FBS)はそれぞれ、ウェルジン(Welgene,キョンサンプクド、韓国)とセルセラ(CellSera、ニューサウスウエスト、オーストラリア)から購入した。化学的反応能細胞(chemically competent)であるXL-1 Blue及びDH10bは、RBC(タイペイ、台湾)から導入した。ヒトジストロフィン(dystrophin)遺伝子、コドン最適化された(codon-optimized)ヒトハンチンチン(huntingtin)遺伝子及びmshRsは、ジェンスクリプト(GenScript、ニュージャージー、米国)で合成された。重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction,PCR)プライマー(primer)及び合成オリゴ(synthetic oligo)は、コスモジンテック(Cosmogenetech、ソウル、韓国)から入手した。ヌクレオチド配列分析もコスモジンテックで行われた。T-ブラントPCRクローニングキット(T-Blunt PCR cloning kit)とLaboPass Tissue Genomic DNA分離キットは、それぞれ、ソルジェント(SolGent、デジョン、韓国)とコスモジンテックから購入した。カラムクロマトグラフィーのためのQセファロースXL(Q Sepharose XL)及びキレート化セファロースFF樹脂(Chelating Sepharose FF resin)は、GEヘルスケア(GE Healthcare,イリノイ、米国)から購買した。ビバスピンターボ超微細濾過スピンカラム(Vivaspin Turbo ultrafiltration spin column、分画分子量(cut off):100kDa)は、サートリアス(Sartorius、ゲッティンゲン、ドイツ)から購入した。ベンゾナーゼ(Benzonase)は、メルク(Merck、ダルムシュタット、ドイツ)から入手した。ジストロフィン-ノックアウトMDX(Dystrophin-knockout MDX,C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)及び野生型(wild-type)マウス(C57BL/10J)は、ジャクソン研究所(Jackson Laboratory,メーン、米国)から購入した。ジストロフィン抗体(ab15277)及びハンチンチン抗体(sc-47757)はそれぞれ、Abcam(ケンブリッジ、英国)及びSanta Cruz Biotechnology(カリフォルニア、米国)から導入した。β-アクチン抗体(Abc-2002)は、アブクロン(AbClon,ソウル、韓国)から入手した。スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質溶液(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate solution)は、Fisher Scientific(ニューハンプシャー、米国)から購入した。HEK293T及びHEK293細胞は、ATCC(バージニア、米国)から入手した。DNA配列のクローニング及び操作には、一般に用いられる汎用DNA操作技術が適用された。
Kanr~ColE1領域に該当するDNA断片は、pGT2プラスミド(配列番号63)を鋳型とし、下記表のプライマーセットを用いてPCRで確保した:
下記のプライマーセットを用いて、実施例1と同じ方法でPCR生成物を収得した:
pAdBestをClaI/EcoRI制限酵素で切断した後、小さい断片を分離し、ClaI制限酵素サイト及びEcoRI制限酵素サイトを含む下記のアダプターに接合してpAdBest_EcoR_Claを製造した。
下記のプライマーセットを用いて、pAdBestを鋳型としてPCRを行った:
iHoAは、エニィヒュージョン(AnyFusion)を用いて行った。全過程にはやや修正を加えたものの、メーカーの指示事項に従って実施した:55℃で10分間培養、室温で20分間さらに培養した。その後、培養混合物を化学的反応能細胞であるXL-1Blue又はDH10b細胞に形質転換させ、抗生剤を含むアガープレートに塗抹した。
pGLAd_LacZ又はpGLAd3_LacZプラスミド(10ug)をPacI制限酵素で線形化し、PacI活性を熱不活性化(heat-inactivation)させた。このPacI制限酵素で線形化されたpGLAd_LacZ又はpGLAd3_LacZゲノムプラスミドを、pAdBest_dITRヘルパープラスミド30ugと共に、100mm培養皿に培養されたHEK293T細胞にカルシウムホスフェート沈殿法(calcium phosphate precipitation method)を用いて共同形質感染させた。培養6時間後に、培養培地(10% FBS)を新しい培養培地(5% FBS)に交替した。48時間後に、形質感染細胞及び培地を回収し(この段階で、培地は‘ウイルス性培地’として保存された。)、細胞を1mlの新しい培養培地(5% FBS)に再懸濁し、凍結及び解凍過程を3回繰り返し行って粉砕した(透明な溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。)。ウイルス性細胞溶解物を収得してHEK293細胞を感染させた(組換えGLAd.LacZ及びGLA3.LAZウイルスは、GLAdウイルスだけではHEK293細胞において増幅されず、HEK293細胞内で溶解性細胞死滅が誘導できない。)。処理48時間後に、LacZ発現のために細胞を染色した。
HEK293細胞から培養培地を除去し、細胞を室温で2分間新鮮な固定液[2%ホルムアルデヒド/メタノール(formaldehyde/methanol)及び0.1%グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)を含むPBS]で固定した。細胞をPBSで2回丁寧に洗浄した後、染色溶液[1mg/ml X-gal、2mM塩化マグネシウム(magnesium chloride,MgCl2)、5mMフェリシアン化カリウム(potassium ferri-cyanide)及び5mMフェロシアン化カリウム(potassium ferro-cyanide)を含むPBS]でLacZ染色が十分になるまで37℃で培養した。
C57BL/6Jマウスの尻尾からのゲノムDNA精製は、LaboPass組織ゲノムDNA分離キットを用いて行った。全手続きにはやや修正を加えたものの、メーカーの指示事項に従って行った。簡単にいうと、マウスの尻尾組織(2×2mm切片)を、タンパク質分解酵素K(proteinase K)を含有する溶解緩衝液で完全に溶解されるまで培養した。このように処理された試料を100%エタノールと混合し、ミニスピンカラムに通過させた。カラムフィルターに吸着しているゲノムDNAを、2種類の洗浄緩衝液を用いて完全に洗浄し、蒸留水を用いて溶出させた。
マウスの尻尾から精製したゲノムDNAを、PCRにおいて鋳型として用いた。プライマーセット及び配列は、表20に記載されている。F1、F2、F3、F4又はF5断片を確保するためのPCR増幅(95℃で30秒、60~65℃で30秒、72℃で4分)は、それぞれのプライマーセット及びPfu重合酵素(polymerase)を用いて45サイクル行われた。それぞれのPCR生成物は、T-ブラントPCRクローニングキットのT-Bluntベクターにクローニングされた。結果物であるT-F1、T-F2、T-F3、T-F4及びT-F5(図12のb)が正しく作製されたかどうかは、シーケンシングを用いて検証した。
マウスの尻尾から精製したゲノムDNAをPCRの鋳型とし、プライマーセットN-F/N-R及びC-F/C-R(表20)を用いて重複PCR(95℃で30秒、62℃で30秒、72℃で60秒)を50サイクル行った。BspEI、XhoI及びNsiIと同じ制限酵素サイトを含むNC断片PCR生成物とSacI/AvrII制限酵素で切断されたpGLAd(図12のb)との間にiHoAを行い、pGLAd_NCを製造した。その後、pGLAd_NCをNsiI/XhoI制限酵素で切断し、アニーリングされた合成Nsi-Xho断片(表20)を結合させ、後でF12345断片を受容する最終受容体となるpGLAd_NC_PUを製造した。これと並行して、T-F1_dPacは、PacI制限酵素で切断し、クレノウでブランティング(blunting)して自己結合することによって製造したが、このようにして、T-F1に唯一に存在するPacI制限酵素サイトを除去した。T-F2_SMARは、SfiI/SalI制限酵素で切断されたT-F2とSM-F/SMAR-Rプライマー(表20)、pGLAdを鋳型としてPCRで製造されたSMAR要素を結合させることによって製造した。その後、T-F12は、NotI/RsrII制限酵素で切断されたT-F1_dPac断片を、NotI/RsrII制限酵素で切断されたT-F2_SMARに移すことによって製造した。T-F34の製造は、PvuI制限酵素で切断し、クレノウでブランティング(blunting)して熱不活性化した後、PciI制限酵素で追加切断したT-F4断片を、SpeI制限酵素で切断し、クレノウでブランティングして熱不活性化後にPciI制限酵素でさらに切断したT-F3断片に移すことによって完成した。T-F345は、T-F5のMluI~XbaI領域に該当する断片を、SpeI/MluI制限酵素で切断されたT-F34と結合させることによって製造した(SpeI制限酵素部位は、XbaI制限酵素部位に結合させてよい。)。T-F12345は、T-F12のSalI~RsrII領域に該当する断片を、SalI/RsrII制限酵素で切断されたT-F345に移すことによって製造した。究極として、pGLAd3(配列番号74)の製造は、PstI制限酵素で切断されたpGLAd_NC_PUとXhoI制限酵素で切断されたT-F12345との間にiHoAを実施することによって完成した。製造手続きの全段階において、各生成物が正しく作製されたかどうかは、シーケンシングを用いて検証した。
このプラスミドのpCAG部分は、下記のプライマーセットを用いてPCRで製造された後、AseI制限酵素及びBsaI制限酵素で切断することによって準備した。
100mm培養皿に培養されたHEK293細胞[80~90%の合流性(confluency)]にAd.LacZウイルス[陽性対照群として1世代アデノウイルス(adenovirus,Ad);1×103感染性ウイルス粒子]、GLAd3.LacZウイルス[1.12×107~1.80×107BFU(blue-forming units)]又はヘルパープラスミド単独で形質感染後に、準備したHEK293T細胞溶解物(表18)を処理した。24時間後に、培養培地を除去し、アガロース(0.3%)を含む12mlの滅菌された培養培地で丁寧に覆った後、10~15日間CO2培養器で培養した。希釈されたMTT溶液10mlを分取してアガロース層に添加し、5時間培養した。その後、照明箱上でウイルス性プラークを計数した。
アデノウイルス第5型(Adenovirus type5,Ad5)のpTP遺伝子は、Ad Ψ5DNAを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてPCRを行って確保した:
配列番号36の配列目録のボールド体部分は、EcoRI制限酵素サイトである。
組換えGLAdの大量生産には、既存GLAdの生産に適用されて標準生産方法で提示されたことのある連続増幅方法を利用した。具体的に、10ugのpGLAd3_LacZ(PacI制限酵素で線形化した後に熱不活性化)、30ugのpAdBest_dITR及び2.5ugのpAd5pTPの混合物を、100mm培養皿に培養されたHEK293T細胞[50~70%合流性(confluency)]にカルシウムホスフェート沈殿法を用いて形質感染した。培養6時間後に、培養培地(10% FBS)を新しい培養培地(5% FBS)に交替した。48時間後に、形質感染された細胞を回収し、1mlの新しい培地(5% FBS)に再懸濁した後、凍結及び解凍サイクルを3回繰り返し行って粉砕し、GLAd3.LacZウイルス(P0段階GLAd)を収得した(rescue)。増幅の最初段階(P1)では、pAdBest_dITR 45ug及びpAd5pTP 3.75ugの混合物を、100mm培養皿に培養されたHEK293T細胞(50~70%合流性)にカルシウムホスフェート沈殿法を用いて形質感染した。培養6時間後に、培養培地(10% FBS)を、P0段階のGLAdを含む新しい培養培地(5% FBS)に交替した。48時間後に、形質感染された細胞及び培地を回収し(この段階で、培養培地を‘ウイルス性培地’として保存する。)、形質感染された細胞を1mlの新しい培養培地(5% FBS)に再懸濁した後、凍結及び解凍サイクルを3回繰り返し行って粉砕した(透明な溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。)。ウイルス性細胞溶解物を収得してウイルス性培地(総10ml)と混合し、次の段階の増幅(P2)のためにHEK293T細胞(10×150mm培養皿に培養)を感染させるのに使用した(図3参照)。GLAdの生産規模は、追加の増幅(P3、P4、P5など)によって増やすことができる。それぞれの増幅段階の流れ図、収得されたウイルスの力価(titer)、必要な細胞培養皿の数、必要なヘルパープラスミド及びpAd5pTPプラスミドの量は、図3に詳細に示した。
GLAdと違い、アデノウイルス及びRCAは、HEK293細胞において自ら複製可能である。したがって、Ad.LacZ(陽性対照群)又はGLAd3.LacZ(P3,3×109BFU;P4又はP5,1×108BFU)がHEK293細胞を感染した後、GLAd3.LacZに存在可能な潜在的汚染物であるアデノウイルス及びRCAが1段階増幅(P4又はP5である場合)又は3段階増幅、陽性対照群である場合には殆ど2段階増幅によって複製されるように許容した。GLAd3.LacZのMOI(感染の多数性(multiplicity of infection))数値が高すぎてLacZが過発現すると、感染された細胞を死滅させることがあり、GLAd3.LacZ(P3,3×109BFU)の初期感染には2個の150mm細胞培養皿が使用された。ベンゾナーゼ(Benzonase)は、P3、P4又はP5 GLAd3.LacZの製造に使用し続くヘルパープラスミドを分解するために使用した(ヘルパープラスミドはPCRベースの分析に必要な標的遺伝子を含んでいる。ただし、ウイルスカプシド皮内にパッケージングされるウイルスDNAはベンゾナーゼに分解されない。)。ベンゾナーゼ処理がアデノウイルス及びRCAの感染性自体に影響を及ぼすかどうかを確認するために、ベンゾナーゼは陽性対照群(Ad.LacZ)に対しても処理した。各増幅段階では、HEK293細胞をそれに相応するウイルスで感染させた後、72時間後に収得した。これらの細胞を1ml(100mm培養皿の場合)又は2.5ml(150mm培養皿の場合)の体積で再懸濁し、凍結及び解凍サイクルを3回繰り返し行って粉砕した(粉砕された溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。)。各ウイルス性細胞溶解物を追加増幅に使用し、最終的に細胞溶解物及び培地を共に収得した。このような増幅過程において、細胞変性効果(cytopathic effect,CPE)は顕微鏡を用いて確認した(全手続きは、図4のa及びcを参照)。
HEK293細胞を用いた連続増幅(図4のa及びc)の結果物として収得したサンプルを、まず、95℃で10分間熱処理した後[この段階を省略すると、HEK293細胞の内因性(endogenous)DNA分解酵素(DNase)が、分析のためにさらにサンプルに含めた(spiked)Ad5 DNAを分解する。]、PCR方法を用いて、GLAdゲノム又はHEK293細胞には存在しないが、アデノウイルス及びRCAには存在するfiber遺伝子のN末端DNAを分析した。PCRの陽性対照群としてはAd5 DNA(10pg、Ad Ψ5DNA)を用いた。Ad.LacZサンプルは、希釈前、又は500個のウイルス粒子だけが含まれるように100倍希釈した後、PCRを行った。GLAd3.LacZサンプルは、スパイクされた(spiked)Ad5 DNA(10pg)の存在又は不在下でPCRで増幅した。PCRは、Pfu重合酵素及び下記のプライマーセットを用いて40サイクル(95℃で30秒、60℃で30秒)行い、結果は、アガロースゲル電気泳動(agarose gel electrophoresis)を用いて分析した(図4のb及びd):
pGLAd3には2個のBssHII制限酵素サイトがある(図14)。pGLAd4(配列番号77)は、pGLAd3をBssHII制限酵素で切断した後、自己結合して製造されるが、こうすると、長さが26,597bp(pGLAd3)から16,392bp(pGLAd4)ほど減少する。完了後に、生成物が正しく作製されたかどうかは、BssHII制限酵素サイトシーケンシングを用いて検証した。
十分によく作動すると確認されたmshR発現用鋳型は、以前の他の論文に既に記述されたことがある。この鋳型の保存的配列及び構造的特徴に基づき、相応するDNAを合成し(表21)、BamHI制限酵素サイト及びEcoRI制限酵素サイトを用いてpGT2プラスミド(配列番号63)にクローニングした。
100mm培養皿に培養されたHEK293T細胞を、それぞれ、15ugのpGT2、pGT2-mshR1、pGT2-mshR2又はpGT2-mshR3で形質感染した。48時間後に、未処理対照群及び形質感染細胞を収得し、内因性ハンチンチン発現に対するウェスタンブロッティング(Western blotting)分析を行った。
RIPA溶解緩衝液を用いて製造した全細胞溶解物(whole-cell lysate)を、SDSゲルから分子量によって分離した後、ニトロセルロース膜に移した。この膜を、室温で1時間、Blotto A溶液(TBST、5%牛乳)で遮断培養し、4℃で1次抗体(1:500~1:1,000)を含むBlotto B溶液(TBST、1%牛乳)に入れて一晩培養した。TBST[TBS、0.05% Tween-20;TBS(Tris-buffered saline):10mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム(NaCl)]で5分間1回洗浄した後、ニトロセルロース膜を、HRP接合2次抗体を含むBlotto B溶液(1:5,000~1:100,000)に入れて室温で2時間培養した。TBSTで5分ずつ2回洗浄した後、膜にスーパーシグナルウェストピコ化学発光基質溶液(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate solution)を短時間処理し、生成されたイメージをバイオイメージングシステム(Bio Imaging System)で分析した。
pCMV、mshR及びBGHpA部分を含むHTTmshR1及びHTTmshR3(図5のd)は、適切なプライマーセット(表22)とpGT2-mshR1又はpGT-mshR3を鋳型とし、PCRで準備した(図5のc及びd)。pGLAd4_HTTmshR1/3の製造は、Acc65I制限酵素で切断されたpGLAd4にHTTmshR1を、そしてPciI制限酵素で切断されたpGLAd4にHTTmshR3を、iHoAでそれぞれ挿入することによって完成した(図5のf)。その後、生成物が正しく作製されたかどうかは、Acc65I及びPciI制限酵素サイトの隣接領域シーケンシングで検証した。
Q22を含む全長(full-length)コドン最適化された合成ハンチンチン(huntingtin)遺伝子(9.4kb)をそれぞれ、異なる配列方向にpBest4シャトルプラスミドにクローニングした。既に確立した標準手続きに従い、PmeI制限酵素で切断されたpBest4_coHTT又はpBest4_coHTT(R)を、ClaI制限酵素で切断されたpGLAd4_HTTmshR1/3と共に混合し、iHoAを行った。このiHoA過程によってpGLAd4_coHTT.HTTmshR1/3(配列番号78)又はpGLAd4_coHTT(R).HTTmshR1/3が製造された。正しく製造されたかどうかは、シーケンシングで検証した。
組換えGLAd.LacZ及びGLAd3.LacZウイルスの生産に用いられた手続きを同一に適用して生産した。
組換えGLAd4.Dysウイルスは、図3に示すように生産されたが、特に、P3から精製された。精製は、2種類のカラムベースのクロマトグラフィー方法を利用し、以前に報告された方法をやや変形して実施した。簡略にいうと、ウイルス性細胞溶解物及び収得した培養培地を混合し(P3)、ベンゾナーゼの処理後に濾過して、精製第1段階としてQセファロースカラムクロマトグラフィー(Q Sepharose column chromatography)を行った。洗浄後に、吸着されたウイルスを溶出し、緩衝液で希釈して亜鉛-キレートクロマトグラフィーカラム(Zn-chelated chromatography column)にローディングした。カラムを十分に洗浄した後、吸着されたウイルスを溶出した。製剤緩衝液(formulation buffer)への緩衝液変更及びウイルスの濃縮は、ビバスピンターボ超微細濾過スピンカラム(Vivaspin Turbo ultrafiltration spin column)を用いて同時に行った。製剤緩衝液については、既に記述した通りである。
精製された組換えGLAd4.Dysウイルスを、ウイルス溶解緩衝液[virus lysis buffer,0.1% SDS、10mM Tris-Cl(pH7.4)、1mM EDTA]を用いて連続して希釈し、軽く振盪しながら56℃で10分間培養した。次に、OD260を測定し、下記式を用いてウイルス粒子濃度を計算した:
[式]
ウイルス粒子(VP/ml)=OD260×ウイルス希釈因子(virus dilution factor)×(1.1×1012)
この計算において、ブランク溶液(blank solution)は、ウイルス溶解緩衝液及びウイルス製剤緩衝液(formulation buffer)の混合からなっている。吸光係数(extinction coefficient)は、既に確立されたものを用いた:
[吸光係数]
OD260 1単位=1.1×1012VP/ml
全ての動物実験は、慶北大学校(大邱、大韓民国)の動物実験倫理委員会(Institutional Animal Care and Use Committee,IAUCC)が承認した手続き(KNU2018-0134)にしたがって行った。8週齢雄野生型対照群マウス(C57BL/10J)及びジストロフィンノックアウトMDXマウス(dystrophin-knockout MDX mice,C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)を、12時間の明暗周期(cycle)下で飼育し、キョンブク大学校の大学動物施設規定に従って水は自由に提供した。MDXマウスの腓腹筋(focal gastrocnemius muscle)にPBS(n=3)又は50ulの組換えGLAd4.Dysウイルス(4×1010粒子)(n=3)を、筋肉内注射した。4週後、筋肉組織試料を生検して分析した。
ジストロフィン(dystrophin)に対する免疫蛍光染色は、以前に報告された方法をやや変形して実施した。採取された筋肉組織を、4% PFAを含むPBSで4℃で一晩固定した。次に、組織を、5%砂糖(sucrose)を含むPBSで4℃で6時間培養し、20%砂糖を含むPBSで4℃で一晩培養した。このように処理された組織をOCT混合物に埋め立て、液体窒素で冷却されたイソペンタン(isopentane)に浸漬して凍結させた後、零下70℃で保管した。4マイクロン(micron)厚の断面に切った後、10分間PBSに静置させた後、室温でPBST(0.1% Triton X-100を含むPBS)で10分ずつ3回洗浄した。組織切片を、10%ウマ血清を含むPBSTで4℃で一晩遮断培養し、ジストロフィン抗体(遮断培養緩衝液に1:100に希釈)と共に4℃で一晩培養した後、室温でPBSTで10分ずつ3回洗浄した。最後に、組織切片を4℃で一晩TRITC接合された2次抗体(遮断培養緩衝液に1:100に希釈)と共に培養し、室温でPBSTで10分ずつ3回洗浄した。染色された組織切片を、DAPIを含む封入剤(mounting medium)で覆った後、共焦点顕微鏡(confocal microscope)下で分析した。
pAdBest_dITRヘルパープラスミド及びpGLAdゲノムプラスミドの製造、並びにGLAd生産においてそれらの使用
現在、ヘルパーアデノウイルスとして最も広く用いられているのは、Ψパッケージング信号配列の両側にloxPサイトを含んでいるものである(図1のa)。この構造的特性によって、相同組換え酵素であるCreを発現させるパッケージング細胞において、このヘルパーアデノウイルスは、アデノウイルスに対する汚染を下げながらも組換えGLAdを効率的に生産可能にする。ただし、このような精巧な生産システムにおいてすらヘルパーアデノウイルスの汚染を防ぐことは不可能である。しかも、このシステムにおいてRCAに関する綿密な分析がなされたことはないが、このシステムでは、ヘルパーアデノウイルスとパッケージング細胞との間に共通に存在するE1領域における相同組換えによってRCAが生成されることがある。このため、本発明者は、相同組換えに関与する領域を除去し、ヘルパーアデノウイルスをヘルパープラスミドに転換させると、GLAd製造においてアデノウイルス及びRCA汚染物が発生することを同時に防止できると仮定した。本発明者は、このような目標を達成するために、GLAdパッケージングに必要なウイルスタンパク質を供給しながらも、活性アデノウイルス粒子に転換されることは不可能なためRCAを生成させない、ヘルパープラスミドの製造を試みた。
興味深いことに、GLAdに使用されるスタッファーDNAの特性が導入遺伝子の発現に否定的な影響を及ぼすと報告されたことがある。論議の余地が完全に解消されたわけではないが、特に、ラムダファージに由来したスタッファーDNAがこのような特性を有することを示した。それにも拘わらず、本発明者がこの発明を始めた初期には、ラムダDNAをスタッファーとして使用するが、それは、プラスミド作製過程に対する設計が正しくなされたかを速かに確認し、ヘルパープラスミドベースのGLAd生産システムも、設計された通りに作動するかを優先的に確認する必要があったためである。上述したように、GLAd生産システムが設計通りに作動することがもう確実に確認されたので、本発明者は、ラムダスタッファーDNAが導入遺伝子の発現を減少させ得るとの恐れを解消する目的で、新しいスタッファーDNAを準備した。本発明者は、マウスE-カドヘリン(E-cadherin)イントロン2領域において複数個のゲノム断片をクローニングし(図12のa)、新しいGLAdゲノムプラスミドとしてpGLAd3を製造した(図2のa及び図12のb)。本発明者は、さらに他のクローニングシャトルプラスミドであるpBest4(図12のc)も製造したが、この新規のpBest4には強力なCAGプロモーター及びイントロンを追加することにより、性能をさらにアップグレードした。pBest及びpGLAdを用いる元来システムと同様に、LacZ遺伝子で試験されたpBest4及びpGLAd3ベースのこの新しいシステムも同様、細胞変性効果(cytopathic effect,CPE)(図2のb)を示しながら組換えGLAd3.LacZウイルス(表18、図2のb及びc)を効率的に生産したが、このような結果は、pCAG、イントロン、iHoA及びGLAdパッケージングのような要素、そしてGLAd作製に関連した全手続きが設計通りに正しく作動したことを示す。これとは極めて対照的に、pAdBest_dITRヘルパープラスミドで単独形質感染されたHEK293T細胞は、いかなるウイルス性粒子も生産できなかった(表18)。その上、本発明者の2種類-プラスミドベースの(two-plasmid-based)システムによって生産された組換えGLAdは、アデノウイルス又はRCAのような別のウイルスを一切含有していなかった(表18)。したがって、本発明者のヘルパープラスミドは、単にGLAdパッケージングのためのヘルパー機能のみを提供するだけで、活性ウイルス粒子に転換されることはない点か明らかである。さらに、このような結果は、本発明者のヘルパープラスミドはRCAを生成することがない点を意味するが(図13)、これは、構造的特性(図2のd)に起因する。
GLAd大量生産において、既に確立された最適化された標準生産方法は、一連の増幅過程を伴う(図3のa)。GLAdは、ヘルパーアデノウイルスの存在下でのみ増幅可能なため、この標準生産方法では、増幅段階が進行する度に新しくヘルパーアデノウイルスを添加しなければならない。シードGLAd(seed GLAd)は、4~6回反復して増幅され、大量培養された細胞(~1×109細胞)を用いて最終的に増幅される。全増幅過程を通じて~1×1012BFU[~1,000BFU/cell;BFUは、LacZ染色によって確認された青色形成単位(blue-forming units)を意味する。]程度は容易に生産可能である。このようにGLAdを比較的高い収率で得ることは、GLAdパッケージング及び増幅に必要なウイルスタンパク質を十分な量で供給する、自ら複製可能なヘルパーアデノウイルス(replicable helper adenovirus)を利用するためである。
GLAd生産においてアデノウイルス及びRCA汚染を防止することは、GLAdの臨床的適用を考慮する上で非常に重要な要素である。本発明者は、ヘルパープラスミド及びPacI制限酵素で線形化されたGLAdゲノムプラスミドを共同に形質感染させることによってGLAdを生産できるということ、及び3回にわたる独立したGLAd生産のうちいずれもアデノウイルス及び/又はRCAを含まないこと、を既に示したことがある(表18)。それにも拘わらず、本発明者は、規模面において十分に大きいことから、将来、臨床的に使用される可能性があるGLAdサンプル(P3、P4又はP5)において(図3)アデノウイルスとRCAをより詳細に再び分析してみた。
上に言及した全てのものが成功的に作動したので、次に、本発明者は、組換えGLAdが試験管内(in vitro)及び生体内(in vivo)で実際に遺伝子伝達をよく行うかどうか試験してみた。そのために、本発明者は、ハンチンチン(huntingtin,9.4kb)及びジストロフィン(dystrophin,11kb)を標的導入遺伝子として選定したが、その理由は、他のウイルスベクターはこのような長い遺伝子を伝達することが非常に難しく、また、遺伝子治療法がそれらの遺伝子と関連した疾患[ハンチントン病(Huntington disease,HD)及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne muscular dystrophy,DMD)]において治療選択肢として長い間追求されてきたためである。
遺伝子治療法に使用される理想的な生体内(in vivo)遺伝子伝達ベクターは、宿主ゲノムに無作為に挿入されないこと(挿入突然変異誘発に対する恐れを払拭する。)、ウイルスタンパク質発現がないこと[ガットレス(gutless)ウイルスゲノムを必要とすることにより宿主免疫反応を最小限に下げる。]、広範囲な細胞及び組織親和性(tropism)を有すること、導入遺伝子伝達において高い形質導入効率を示すこと、及び如何なる導入遺伝子も伝達可能な程度の大きい受容能力を有すること、などのような特性を有するように推奨される。現在、利用可能な多くの遺伝子伝達ベクターのうち、GLAdは、実際にこのような推奨特性を全て有する唯一のベクターであるといえる。にもかかわらず、こういう特性を全て揃えたGLAdがいままで動物における研究にのみ使用され、臨床には使用されたことがないため臨床データが存在しないという点は、非常に驚くべきことである。予想を覆すこのような結果は、既存GLAdの生産工程においてパッケージング及び以降の増幅過程ではヘルパーとして必須であるが、生産工程の最後には汚染物として残るアデノウイルスと関連した安全性問題のためだと見なされる。GLAdの臨床的使用のために克服すべき更なる障害物は、既存GLAdの生産過程中に、又はヘルパーアデノウイルスの大量生産過程中に生成されるRCA汚染である。
a LacZ染色で決定される(BFU合計数)
b アデノウイルス及び/又はRCA
c プラーク分析(plaque assay)によって決定される
d 100mm培養皿に培養されたHEK293T細胞に形質感染される
e プラーク分析のための陽性対照群
a 相対的活性
b ただし、その頻度は低い
Claims (31)
- ガットレスアデノウイルス(gutless adenovirus,GLAd)生産システムであって、
5’逆末端反復配列(5’ITR)、Ψパッケージング信号配列、E1、E3、及び3’逆末端反復配列(3’ITR)を含まず、その他のアデノウイルスゲノムを含むヘルパープラスミドと、
制限酵素で線形化され、5’ITR、Ψパッケージング信号配列、GLAdを用いて発現させようとする導入遺伝子(transgene)、スタッファーDNA(sDNA)、及び3’ITRを含むゲノムプラスミドと、
ウイルスパッケージング細胞株とを含む、ガットレスアデノウイルス生産システム。 - 前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子以外のものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子に転換されないものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ゲノムプラスミドは、5’相同ストレッチ部位(homologous stretch)及び3’相同ストレッチ部位(homologous stretch)を含むものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ゲノムプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものである、請求項4に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ゲノムプラスミドは、Ori複製原点をさらに含むものである、請求項4に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記スタッファーDNAは、スキャフォールド/マトリックス付着要素(scaffold/matrix attachment element,SMAR)をさらに含むものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ゲノムプラスミドは、GLAdのカプシド内にパッケージングされるGLAdゲノム部分を含んでいるものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ゲノムプラスミドは、導入遺伝子発現に必要な要素をさらに含んでいる最終ゲノムプラスミドである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記システムは、クローニングシャトルプラスミドをさらに含むものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記クローニングシャトルプラスミドは、5’相同ストレッチ部位(homologous stretch)、5’逆末端反復配列(inverted terminal repeat,ITR)、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、多重クローニング部位(multi-cloning site,MCS)、ポリ(A)信号配列、及び3’相同ストレッチ部位を含むものである、請求項10に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記クローニングシャトルプラスミドは、イントロンをさらに含むものである、請求項11に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記クローニングシャトルプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものである、請求項11に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記クローニングシャトルプラスミドは、Ori複製原点をさらに含むものである、請求項11に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記クローニングシャトルプラスミドは、GLAdを用いて発現させようとする導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素を含むものである、請求項10に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記ウイルスパッケージング細胞株は、アデノウイルスのE1領域に属するタンパク質を発現させる細胞株である、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 前記システムは、配列番号76の塩基配列を含むプラスミドをさらに含むものである、請求項1に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
- 下記の段階を含むガットレスアデノウイルス(gutless adenovirus,GLAd)生産方法:
制限酵素で線形化され、5’ITR、Ψパッケージング信号配列、GLAdを用いて発現させようとする導入遺伝子(transgene)、スタッファーDNA(sDNA)、及び3’ITRを含む最終ゲノムプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階;及び
5’ITR、Ψパッケージング信号配列、E1、E3、及び3’ITRを含まず、その他のアデノウイルスゲノムを含むヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階。 - 前記形質感染は、カルシウムホスフェート沈殿法(calcium phosphate precipitation method)で行われる、請求項18に記載の生産方法。
- 前記生産方法は、配列番号76の塩基配列を含むプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階をさらに含む、請求項18に記載の生産方法。
- 前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子以外のものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子に転換されないものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記最終ゲノムプラスミドは、5’ITR、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、イントロン、GLAdを用いて発現させようとする導入遺伝子(transgene)、ポリ(A)信号配列、スタッファーDNA(stuffer DNA;sDNA)、及び3’ITRを含むものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記最終ゲノムプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記最終ゲノムプラスミドは、Ori複製原点をさらに含むものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記スタッファーDNAは、スキャフォールド/マトリックス付着要素(scaffold/matrix attachment element,SMAR)をさらに含むものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記最終ゲノムプラスミドは、GLAdのカプシド内にパッケージングされるGLAdゲノム部分を含んでいるものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記最終ゲノムプラスミドは、導入遺伝子発現に必要な要素をさらに含んでいるものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記ウイルスパッケージング細胞株は、アデノウイルスのE1領域に属するタンパク質を発現させる細胞株である、請求項18に記載の生産方法。
- 前記ガットレスアデノウイルス(GLAd)生産方法によって生産されたGLAdは、汚染物ウイルス種を含んでいないものである、請求項18に記載の生産方法。
- 前記汚染物ウイルス種は、アデノウイルス又は複製可能アデノウイルス(replication-competent axdenovirus,RCA)である、請求項30に記載の生産方法。
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