CN101619324B - 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用。具体而言，本发明提供的载体系统包括一个骨架质粒、一个穿梭质粒和一个包装细胞系，其中所述骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需编码区的腺病毒Ad41基因组，所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的多克隆位点以及用于与骨架质粒发生同源重组的腺病毒Ad41基因组片段，所述包装细胞系在细胞基因组中整合了所述腺病毒Ad41包装所需基因并能稳定表达该包装基因。本发明产生的重组Ad41病毒在肠道基因治疗和口服重组疫苗研究中有广阔的应用前景。

Description

复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用

技术领域

本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用。 

背景技术

肠道作为基因治疗的靶器官有如下优点：(a)给药途径简便，可以直接口服给药或内窥镜给药；(b)肠道上皮的表面积大，便于载体的充分吸附和感染；(c)肠道上皮的隐窝细胞是干细胞，对其的感染能延长目的基因的表达时间(Croyle MA，Stone M，Amidon GL，Roessler BJ.In vitro and in vivo assessment of adenovirus 41 as avector for gene delivery to the intestine.Gene Ther，1998，5(5)：645-654.[pubmed：9797869])。粘膜是阻止多数病原微生物入侵机体的第一道屏障，口服给药的疫苗能激发粘膜免疫和系统免疫，是今后疫苗研究的重要方向。然而，目前缺乏安全有效的能够肠道给药的载体系统，将靶基因或抗原基因传递到肠道细胞非常困难，使得胃肠道的基因治疗和口服重组疫苗研究相对滞后(Lecollinet S，Gavard F，Havenga MJ，Spiller OB，Lemckert A，Goudsmit J，Eloit M，Richardson J.Improvedgene delivery to intestinal mucosa by adenoviral vectors bearingsubgroup B and d fibers.J Virol，2006，80(6)：2747-2759.[pubmed：16501084])。 

腺病毒载体(Adenovector，Ad)由于感染细胞效率高、遗传稳定、容易制备高滴度病毒、不整合入细胞基因组、既能感染分裂期也能感染非分裂期细胞等优点被广泛用于基因治疗和重组疫苗研究。现在得到广泛应用的腺病毒载体多是基于人5型腺病毒基因组，但胃酸或肠消化液能够较大幅度的降低Ad5的感染力，所以其不是理想的肠道给药的基因治疗载体(Favier AL，Burmeister WP，Chroboczek J.Uniquephysicochemical properties of human enteric Ad41 responsible for its survival and replication in the gastrointestinal tract.Virology，2004，322(1)：93-104.[pubmed：15063120])。 

人F组腺病毒包括2个成员：Ad40和Ad41，能引起婴幼儿急性胃肠炎，是天然的肠道病原，被称为肠腺病毒(enteric adenovirus)。研究表明Ad41对胃酸和肠消化液有很强的耐受性，对分化的肠上皮细胞感染能力强，是理想的用于肠道给药的基因治疗载体(TiemessenCT，Kidd AH.The subgroup F adenoviruses.J Gen Virol，1995，76(Pt3)：481-497.[pubmed：7897343])。 

发明内容

本发明的目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统。 

本发明提供的载体系统包括1个骨架质粒、1个穿梭质粒和1个包装细胞系。所述骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需编码区的腺病毒Ad41基因组，所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的多克隆位点以及用于与骨架质粒发生同源重组的腺病毒Ad41基因组片段，所述包装细胞系在细胞基因组中整合了所述腺病毒Ad41包装所需基因并能稳定表达该包装基因。 

利用本载体系统能够制备由CMV启动子控制目的基因表达的重组Ad41腺病毒。将目的基因编码区克隆到穿梭质粒pSh41-CMV的多克隆位点处，携带目的基因的穿梭质粒经限制性内切酶PacI酶切线性化，与骨架质粒pAdbone41共转化大肠杆菌BJ5183菌株(美国Stratagene公司)，在BJ5183细胞内经过同源重组得到携带目的基因的腺病毒质粒。该质粒经限制性内切酶PmeI酶切，释放重组腺病毒基因组，利用DNA转染方法将重组腺病毒基因组转染包装细胞293-E1B，在包装细胞内拯救得到携带目的基因的重组Ad41腺病毒。起始得到的少量重组病毒可以进一步用包装细胞扩增，制备大量的重组病毒。 

在制备的重组腺病毒中，Ad41基因组E1区由含目的基因的表达框(含启动子、目的基因CDS和多聚腺苷酸加尾信号)替代，故该重组病毒只能在稳定表达Ad41 E1B55K基因的包装细胞系293-E1B中复制包装，对于其他非包装细胞系，其是复制缺陷的。该重组病毒颗粒中，除基因组含有部分外源序列(目的基因表达框)外，基因组其 他部分以及病毒所有结构蛋白均源于野生型Ad41(GenBank登录号：DQ315364)。该野生型Ad41是从Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本中得到的。 

由于Ad41是天然的肠道病原，预计本发明产生的重组Ad41病毒在肠道基因治疗和口服重组疫苗研究中有广阔的应用前景。 

附图说明

图1是骨架质粒pAdbone41构建示意图。图中L arm：左臂同系物(left arm homolog)；R arm：右臂同系物(right arm homolog)；ORI：复制起点(origin of replication)；Amp：氨苄青霉素抗性的开放读码框(ampicillin resistance ORF)。骨架质粒中，从R arm开始(含R arm)至L arm结束(含L arm)的部分为Ad41基因组序列，其包括基因组E1B55K编码区(CDS)右侧全部序列(含E1B55K CDS内侧3’端46个核苷酸)。 

图2是穿梭质粒pSh41-CMV构建示意图。图中Kan：卡那霉素抗性的开放读码框(kanamycin resistance ORF)；ITR：反向重复序列(the inverted terminal repeat)；ES：包装信号(encapsidation signal)；CMV：巨细胞病毒启动子(CMV promoter)；MCS：多克隆位点(multiple cloning site)；pA：多聚腺苷酸加尾信号(polyA signal)；Larm，R arm：左臂或右臂同系物(left or right arm homolog)；ORI：复制起点(origin of replication)。 

图3是结晶紫染色法显示Ad41在293细胞和293-E1B包装细胞中形成的细胞病变效应(CPE)。将293和293-E1B细胞接种于96孔板，18～24小时后，按100μl/孔的接种量接种梯度稀释的Ad41病毒，继续培养6天后，用2％戊二醛固定，0.1％结晶紫染色。由图可见400倍稀释的Ad41在293-E1B包装细胞中引起CPE的情况与50倍稀释Ad41在293细胞中引起的CPE强度相当，说明293-E1B细胞对Ad41的敏感性较293细胞高。 

图4显示的是重组Ad41-GFP在293-E1B包装细胞中的扩增以及用氯化铯密度梯度离心法对其纯化。a.用收获的第9代Ad41-GFP(P9)感染293-E1B包装细胞4天后出现细胞病变效应(CPE)；b.箭头标示了氯化铯密度梯度离心后形成的病毒条带；c，纯化的Ad41-GFP 的负染电镜照片。 

图5显示的是重组Ad41-GFP感染Hep2细胞2天(MOI＝1000，以颗粒数计算)的情况。a.显微镜下观察；b.流式细胞仪定量测定。 

具体实施方式

在本发明的一个实施方案中，本发明的骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需编码区E1(SEQ ID NO：1)的腺病毒Ad41基因组。 

在具体实施方案中，所述骨架质粒为pAdbone41，依次含有pBR322质粒的复制起点(Ori)、氨苄青霉素的抗性基因(Amp)和Ad41基因组E1B55K编码区(CDS)(SEQ ID NO：1)下游全部序列(含E1B55K CDS内侧3’端46个核苷酸)，参见图1。 

在具体实施方案中，骨架质粒pAdbone41在Ad41基因组右侧末端添加有一个限制性内切酶PmeI酶切位点(GTTTAAAC)。 

在本发明的一个实施方案中，本发明的穿梭质粒为pSh41-CMV，依次含有pBR322质粒的复制起点(Ori)、卡那霉素的抗性基因(Kan)、Ad41基因组左侧反向重复序列(ITR)、Ad41的包装信号(ES)(ITR-ES在野生型Ad41(GenBank登录号：DQ315364)基因组上的片段位置：1nt～361nt)、巨细胞病毒启动子(CMV)、多克隆位点(MCS)、猴病毒40(SV40)的多聚腺苷酸加尾信号(pA)、用于与骨架质粒pAdbone41发生同源重组的右臂和左臂(R arm、L arm)(L arm在野生型Ad41(GenBank登录号：DQ315364)基因组上的片段位置：33373nt～34189nt，R arm在野生型Ad41(GenBank登录号：DQ315364)基因组上的片段位置：3101nt～3964nt)，参见图2。 

在具体实施方案中，穿梭质粒pSh41-CMV在能够与骨架质粒pAdbone41发生同源重组的右臂和左臂(R arm、L arm)序列之间含有一个限制性内切酶PacI的识别位点(TTAATTAA)，并且在Ad41基因组左侧反向重复序列(ITR)左侧末端添加有一个限制性内切酶PmeI的识别位点(GTTTAAAC)。 

在本发明的一个实施方案中，本发明的包装细胞系通过用携带有E1B55K的重组真核质粒转染后获得，该包装细胞系是在293细胞基因组中整合了Ad41 E1B55K基因并且能够稳定表达该整合基因。所述包装细胞系中控制Ad41 E1B55K表达的启动子为巨细胞病毒启动子 (CMV)，其mRNA加尾信号为牛生长激素基因的polyA加尾信号(BGH polyA)。 

在本发明的具体实施方案中，所述包装细胞系于2008年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为人胚肾293细胞，保藏号为CGMCC No.2534。 

以下通过实施例来对本发明进行详细说明。应当理解，本申请的内容不限于以下具体实施例。 

实施例1、骨架质粒pAdbone41的构建 

1)含有重组用左臂、右臂(L arm、R arm)序列、复制子和氨苄青霉素抗性基因序列的质粒pAM-RLarm构建 

在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下(50微升体系：模板10纳克，引物各30皮摩尔，4种脱氧核苷三磷酸各10纳摩尔，高保真耐热DNA聚合酶1单位；反应条件：94摄氏度预变性2分钟，94摄氏度变性30秒，以较引物的解链温度低4摄氏度的温度退火30秒，68摄氏度延伸，延伸时间根据产物的长度按扩增800碱基对需1分钟计算，扩增30循环，68摄氏度末端补平5分钟；以下的PCR扩增条件与此同)，以野生型Ad41基因组(GenBank登录号：DQ315364)为模板(来源于Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本)，用引物Larm F：gcgggttaattaa(PacI)caaaaagctt(HindIII)gttgagagcgccc(SEQID NO：2)和引物Larm R：ccccgtatac(BstZ17I)gtttaaac(PmeI)catcatcaataatatacc(SEQ ID NO：3)扩增得到848bp左臂片段Larm；用引物Rarm F：cccgaattc(EcoRI)gatgttgtcgtgtcttcgcaccgact(SEQ ID NO：4)和引物Rarm R：ctttttgttaattaa(PacI)cccgcatgc(SphI)atccttcccaac(SEQ IDNO：5)扩增得到888bp右臂片段Rarm。由于Rarm的3’端与Larm的5’端有20bp的核苷酸序列相同，将回收的Rarm和Larm片段混合后作为模板，以Rarm F和Larm R为引物PCR扩增得到Rarm与Larm串联的片段RLarm(1716bp)。 

用EcoRI和BstZ17I双酶切pAdeasy-1质粒(美国stratagene公司)，回收较小片段2049bp(GenBank登录号：AY370909；片段位置： 1622nt～3670nt)，其含有复制起点和氨苄抗性基因；EcoRI和BstZ17I双酶切RLarm后，将二者连接(连接反应条件为：10微升体系，10×连接缓冲液1微升，2个片段各2微升，1微升T4 DNA连接酶(美国NEB公司)，10摄氏度反应12小时；后续的连接反应条件与此同)。转化大肠杆菌DH10B得质粒pAM-RLarm(图1)。 

2)重组获得骨架质粒pAdbone41 

将pAM-RLarm用HindIII和SphI双酶切线性化，与Ad41基因组DNA共同电转化大肠杆菌BJ5183菌株(美国Stratagene公司)，筛选氨苄抗性菌落以获得发生重组的质粒pAdbone41(图1)，用重组的质粒pAdbone41转化大肠杆菌DH10B，扩增并纯化得到较大量pAdbone41质粒，保存并将pAdbone41测序。具体操作过程参照stratagene公司AdEasy腺病毒载体系统使用手册进行(AdEasyAdenoviral Vector System第21页：Cotransforming the BJ5183 Cells toProduce Recombinant Ad Plasmid；Catalog#240009)。 

实施例2、穿梭质粒pSh41-CMV的构建(图2) 

1)含卡那霉素的抗性基因(Kan)的克隆质粒pKan的构建 

以pShuttle-CMV(Stratagene公司)为模板，用引物5F070522：gcccggatcc(BamHI)cgagcggtatcagctcactcaaag(SEQ ID NO：6)和引物5R070522：gccccgcgcgc(BssHII)aaactggaacaacactcaaccctat(SEQID NO：7)扩增得到2483bp片段(参照pShuttle-CMV序列，version017005；片段位置：4660nt～7122nt)，该片段含有复制起点和卡那霉素的抗性基因。使用位于该片段两端的内切酶BamHI和BssHII双酶切后回收；将引物5F：cgcgcaaggg gaagagctcg ggaaggggaattcggagaagggtatacc(SEQ ID NO：8)和引物5R：gatcggtatacccttctccgaattccccttcccgagctcttccccttg(SEQ ID NO：9)混合后退火得到两端为粘端的长约为50bp的双链DNA，该段DNA含有SacI，EcoRI，BstZ17I酶切位点；上述酶切回收的片段(含复制起点和卡那霉素抗性基因)与引物退火形成的约50bp片段连接后，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞得pKan质粒。具体转化步骤如下：取连接产物5微升，加到100微升感受态细菌中，混匀；冰水浴30分钟，42摄氏度保温90秒，添加800微升LB液体培养基，以37摄氏度下150转/分钟的转速振摇 60分钟；将菌液涂布到含卡那霉素的LB琼脂平板上，37摄氏度下培养12～18小时，挑取单菌落，培养细菌提取质粒。 

2)含Ad41包装信号(ES)、CMV启动子、多克隆位点(MCS)和SV40polyA加尾信号(pA)的质粒pKan-ES-CMV的构建 

以野生型Ad41基因组为模板(来源于Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本)，用引物6F：ccccgcgcgc(BssHII)gtttaaac(PmeI)catcatcaataa tataccttaaag(SEQ ID NO：10)和引物6R：ccccgagctc(SacI)gtggcagtgccacgtagggaaac(SEQ ID NO：11)扩增得到388bp片段ITR-ES，其中含有Ad41左端反向重复序列(ITR)和包装信号(ES)；用BssHII和SacI双酶切该片段及pKan，连接后得pKan-ES质粒。 

以pShuttle-CMV为模板，用引物7F：ccccgagctc(SacI)taatagtaatcaattacggggtcat(SEQ ID NO：12)和引物7R：ccccgaattc(EcoRI)taagatacattgatgagtttggaca(SEQ ID NO：13)扩增得到913bp片段CMVpA(参照pShuttle-CMV序列，version 017005；片段位置：346nt～1238nt)，该片段含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和SV40polyA加尾信号；用SacI和EcoRI双酶切PCR产物和pKan后连接，得pKan-CMVpA质粒。 

用SacI和EcoRI双酶切pKan-CMVpA，回收约903bp片段(CMVpA)，连接到pKan-ES质粒的SacI和EcoRI位点间，得pKan-ES-CMV质粒。 

3)克隆得到穿梭质粒pSh41-CMV 

用EcoRI和BstZ17I双酶切pAM-RLarm并回收1705bp片段(RLarm)，连接到pKan-ES-CMV的EcoRI和BstZ17I切点间，即得pSh41-CMV，其多克隆位点含有限制性内切酶位点BglII、KpnI、SalI、NotI、XhoI和EcoRV。 

实施例3、包装细胞系293-E1B的构建 

1)Ad41 E1B55K基因的克隆 

以Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本DNA为模板，利用PCR扩增E1B55K基因，反应条件与前同。所用引物为8F：gcccaagctt (HindIII)atggagcgcccaaacccatctg(SEQ ID NO：14)和8R：gccctctaga (XbaI)tacccttaatcctcatcgctggattc(SEQ ID NO：15)，扩增包含E1B55K完整CDS的片段。将扩增片段连接到T载体(pMD-18T，TAKARA公司)，测序证实序列无误后(测序在北京奥科生物技术公司进行)，用HindIII和XbaI双酶切，连接到pcDNA3质粒(Invitrogen)的酶切位点HindIII和XbaI之间，得到真核表达质粒pcDNA3-E1B55K。 

2)基因转染及细胞系的筛选 

用脂质体(lipofectamine 2000，Invitrogen)包裹质粒pcDNA3-E1B55K并转染293细胞(具体操作按照Invitrogen公司lipofectamine2000产品说明书进行)，用800μg/ml G418(Roche)筛选2～3周后挑取单克隆(293-E1B’)，扩增后，用RT-PCR的方法检测E1B55K的表达，保留E1B55K表达阳性的克隆，使用完全CPE法检测其扩增Ad41腺病毒的能力(详细筛选鉴定过程参照文献进行：韩炳娟，郭丽，屈建国，王敏，王健伟，鲁茁壮，洪涛.转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力.病毒学报.2007，23(4)：258-264)。 

以2×10⁴细胞/孔的接种密度将293和293-E1B’的单克隆细胞接种于96孔板，用含10％FBS的DMEM培养基培养18～24小时；将含有Ad41阳性的婴幼儿病毒性腹泻的粪便标本上清，用PBS稀释，过滤除菌后，用含2％FBS的DMEM培养基进行2倍的梯度稀释，将稀释好的各梯度以100μl/孔的接种量分别接种293和293-E1B’单克隆细胞；继续培养6～9天后，直接加入2％戊二醛固定液(PBS配制)100μl/孔，固定0.5～2小时，吸弃固定液，用蒸馏水冲洗3次后，加入0.1％结晶紫水溶液50μl/孔，染色30min，再用蒸馏水冲洗3次后晾干，裸眼观察CPE的强弱，得到一株能引起较强CPE的单克隆293-E1B’细胞。达到相同的CPE的强度时，其病毒接种量约为对照293细胞的1/8(图3)。该单克隆的编号为12号，将其重新命名为293-E1B，于2008年6月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2534。 

实施例4、携带GFP报告基因的重组腺病毒Ad41-GFP的制备 

本实施例以“携带GFP报告基因的重组腺病毒Ad41-GFP的制备”的为例，具体表述制备携带目的基因的重组Ad41病毒的制备过程。 

利用本载体系统能够制备由CMV启动子控制目的基因表达的重组Ad41腺病毒。将目的基因编码区克隆到穿梭质粒pSh41-CMV的多克隆位点处。携带目的基因的穿梭质粒经限制性内切酶PacI酶切线性化后，与骨架质粒pAdbone41共转化大肠杆菌BJ5183菌株，在BJ5183细胞内经过同源重组得到携带目的基因的腺病毒质粒。该质粒经限制性内切酶PmeI酶切，释放重组腺病毒基因组，利用DNA转染方法将重组腺病毒基因组转染包装细胞293-E1B，在包装细胞内拯救得到携带目的基因的重组Ad41腺病毒。起始得到的少量重组病毒可以进一步用包装细胞扩增，制备大量的重组病毒。 

1)GFP基因的克隆及腺病毒质粒pAd41-GFP的制备 

以pLEGFP-C1(BD CLONTECH公司)为模板，以9F：ggccagatct(BglII)gctaccggtcgccaccatggtgag(SEQ ID NO：16)和9R：gccgtcgac(SalI)ttagagtccggacttgtacagctcgt(SEQ ID NO：17)为引物，扩增得到764bp片段(参照Clontech公司提供的序列，文件编号PT3232-5；片段在原pLEGFP-C1质粒上的位置：3058nt～3799nt)，用BglII、SalI双酶切后，连接到穿梭质粒pSh41-CMV的BglII、SalI酶切位点之间，得到pSh41-GFP。将pSh41-GFP用PacI线性化后，与骨架质粒pAdbone41共转化大肠杆菌BJ5183菌株(美国Stratagene公司)，经卡那霉素筛选得到重组腺病毒质粒pAd41-GFP。具体操作过程参照stratagene公司AdEasy腺病毒载体系统使用手册进行(AdEasyAdenoviral Vector System第21页：Cotransforming the BJ5183 Cells toProduce Recombinant Ad Plasmid；Catalog#240009)。 

2)重组腺病毒Ad41-GFP的拯救 

将pAd41-GFP使用PmeI线性化后，转染包装细胞系293-E1B，培养3-5天，去除部分培养基，收获细胞，冻融裂解3次，离心后用上清(P0代)再次感染293-E1B细胞，随着盲传代数的增加，GFP+细胞逐渐增多，P7代病毒上清使得培养的293-E1B产生完全CPE，说明病毒得到扩增(图4a)。具体操作过程参照stratagene公司AdEasy腺病毒载体系统使用手册进行(AdEasy Adenoviral Vector System第27页：Preparation of Primary Adenovirus Stock with Recombinant AdPlasmid；Catalog#240009)。 

3)重组腺病毒Ad41-GFP的制备和纯化 

继续用293-E1B细胞扩大培养病毒，传至P11代，能获得约20个培养皿(150cm²)由293-E1B细胞产生的病毒上清，氯化铯密度梯度离心，可见病毒富集成单一线性条带，收获病毒，透析后保存于5％甘油Hanks液中(图4b和c)。氯化铯密度梯度离心的具体过程参加手册(Ng P，Graham FL.Construction of first-generation adenoviralvectors.gene therapy protocols，2nd Edition，Edited by Morgan JR.Humana Press Inc.)。 

4)Ad41-GFP滴度测定及对Hep2细胞的感染 

用293细胞以2×10⁴细胞/孔的接种密度接种96孔板，培养18～24小时，对纯化的重组腺病毒Ad41-GFP进行10倍的梯度稀释，吸弃96孔板中细胞的原培养基，加入病毒稀释液100μl/孔，培养2天后，荧光显微镜下计数每孔GFP+细胞数，以同一稀释度下各孔平均GFP+细胞数除以0.1ml/孔，再乘以该列孔所加病毒液的稀释倍数，即得病毒原液的滴度。以这种有限稀释法测定批号为071116的纯化Ad41-GFP的感染滴度为2.4×10⁹IU/ml(infection units per milliliter)。 

通过测定病毒基因组含量计算病毒颗粒数滴度。将纯化病毒与等量的2×裂解液(20mM EDTA、1％SDS、0.8mg/ml蛋白酶K)混合，50度下保温3小时，取5微升裂解液加样到不含溴化乙啶(EB)的0.7％琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后再用EB染色，紫外灯下照相记录电泳结果，根据病毒基因组条带与内参DNA条带的灰度，计算病毒基因组的含量，根据基因组的分子量换算为摩尔数，一个完整病毒粒子含有一个病毒基因组，得到病毒的颗粒数滴度。批号为071116的纯化Ad41-GFP的颗粒数滴度为2.4×10¹¹vp/ml(Viral particle permilliliter)。 

Ad41-GFP感染Hep2细胞的情况如图5所示。用1000MOI(以颗粒数计算)的Ad41-GFP感染Hep2细胞，2天后，在荧光显微镜下照相，用胰酶消化细胞并且用流式细胞仪测定GFP+细胞含量为72.3％。 

序列表 

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 

<120>复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用 

<130>CP1080242 

<160>17 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>1422 

<212>DNA 

<213>人类 

<220> 

<221>Ad41 E1B55K CDS 

<222>(1)..(1422) 

<400>1 

atggagcgcc caaacccatc tgtcggaggg gtatactctg gattacatga caatggccct     60 

gtggagaacc ctgctgcgga ggaagagggt cttaggttgc tcgccggcgc agcctccgca    120 

cggtctggat ccagtgcggg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg agaacctgag    180 

ggccggtctg gatcctcaaa cggaattgta actgaacctg accccgaaga gggtactagc    240 

agtgggcaaa ggggggagaa aaggaagtta gaaaatgacg gggcggattt tctaaaggag     300 

ttaaccttga gtttaatgtc tcgttgttat cctgagtctg tctggtgggc tgatttggaa     360 

gatgagttta aaaatggaaa catgaatctt ttatacaagt atggatttga acagctgaaa     420 

acacattgga tggagccttg ggaggactgg gaactagctt tgaatatgtt tgccaaagtg     480 

gctcttcgcc cagacactat ttataccatt aagaaaactg ttaatatacg taaatgtgcc     540 

tatgtaattg gaaatggagc cgtggttaga ttccaaacct ttgaccgggt ggtttttaac     600 

tgtgcaatgc agagtttagg tcctggggtg attggtatga gcggggtaac atttaataat     660 

gtcagatttg cagcagatgg atttaatggc aaggtgtttg cttctaccac tcaattaact     720 

ttgcatggtg tgttttttca aaattgcagc ggtgtttgcg tggattcctg gggtagggtg     780 

tctgccagag gttgtacgtt tgtgggatgt tggaaagggc tggtggggca aaacaagagc     840 

caaatgtctg taaaaaaatg tgtgtttgaa cgatgcattt tggctatggt ggtagaaggc     900 

caggcgcgaa ttcgacataa tgcgggttcc gaaaatgtgt gctttttact gctgaaggga     960 

actgccagtg ttaagcataa tatgatttgt ggcactggtc actctcagct gctaacttgc    1020 

gcagatggaa actgtcagac tctaaaagtg attcatgtgg tttcccatca gcgccgcccc    1080 

tggcctgttt ttgagcataa catgcttatg cgttgtacca tgcatttggg ggctcgtcgt    1140 

ggcatgtttt ctccatatca gagtaatttt tgccatacta aagttttaat ggaaactgat    1200 

gctttttcgc gggtgtggtg gagcggggtg tttgatttga ccatagagct gtataaagtg   1260 

gtgagatatg atgagttaaa ggctcgttgt cgcccctgtg agtgtggagc caatcacatc   1320 

aggttatatc cagcaactct gaacgtgacg gagcagctgc gcacggacca tcagatgttg   1380 

tcgtgtcttc gcaccgacta cgaatccagc gatgaggatt aa                      1422 

<210>2 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

gcgggttaat taacaaaaag cttgttgaga gcgccc                               36 

<210>3 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

ccccgtatac gtttaaacca tcatcaataa tatacc                               36 

<210>4 

<211>35 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

cccgaattcg atgttgtcgt gtcttcgcac cgact                                35 

<210>5 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

ctttttgtta attaacccgc atgcatcctt cccaac                               36 

<210>6 

<211>34 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

gcccggatcc cgagcggtat cagctcactc aaag                                 34 

<210>7 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>7 

gccccgcgcg caaactggaa caacactcaa ccctat                               36 

<210>8 

<211>48 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>8 

cgcgcaaggg gaagagctcg ggaaggggaa ttcggagaag ggtatacc                  48 

<210>9 

<211>48 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>9 

gatcggtata cccttctccg aattcccctt cccgagctct tccccttg                  48 

<210>10 

<211>42 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>10 

ccccgcgcgc gtttaaacca tcatcaataa tataccttaa ag                        42 

<210>11 

<211>33 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>11 

ccccgagctc gtggcagtgc cacgtaggga aac                                  33 

<210>12 

<211>35 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>12 

ccccgagctc taatagtaat caattacggg gtcat                                35 

<210>13 

<211>35 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>13 

ccccgaattc taagatacat tgatgagttt ggaca                                35 

<210>14 

<211>32 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>14 

gcccaagctt atggagcgcc caaacccatc tg                                   32 

<210>15 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>15 

gccctctaga tacccttaat cctcatcgct ggattc                               36 

<210>16 

<211>34 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>16 

ggccagatct gctaccggtc gccaccatgg tgag                                 34 

<210>17 

<211>35 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>17 

gccgtcgact tagagtccgg act tgtacag ctcgt                               35 

Claims (9)

1.一种复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，包括一个骨架质粒、一个穿梭质粒和一个包装细胞系，

其中所述骨架质粒含有缺失了腺病毒包装所需基因编码区的腺病毒Ad41基因组；

其中所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的多克隆位点以及用于与骨架质粒发生同源重组的腺病毒Ad41基因组片段；

其中所述包装细胞系在细胞基因组中整合了所述腺病毒Ad41包装所需基因并能稳定表达该包装基因。

2.权利要求1所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述腺病毒包装所需基因为由SEQ ID NO:1所示的Ad41E1B55K基因。

3.权利要求2所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述骨架质粒为pAdbone41，所述骨架质粒pAdbone41依次含有pBR322的复制起点、氨苄青霉素抗性基因、E1B55K CDS内侧3’端46个核苷酸以及Ad41基因组E1B55K编码区下游全部序列。

4.权利要求3所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述穿梭质粒为pSh41-CMV，所述穿梭质粒pSh41-CMV依次含有pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因、巨细胞病毒启动子、多克隆位点、猴病毒40的多聚腺苷酸加尾信号和用于与骨架质粒pAdbone41发生同源重组的左臂和右臂。

5.权利要求1-4任一项的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述包装细胞系为：在293细胞基因组中整合有Ad41E1B55K基因并且能够稳定表达该E1B55K基因，控制Ad41E1B55K表达的启动子为巨细胞病毒启动子，其mRNA加尾信号为牛生长激素基因的polyA加尾信号。

6.权利要求5所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述骨架质粒pAdbone41中，在Ad41基因组右侧末端添加有一个限制性内切酶PmeI酶切位点GTTTAAAC。

7.权利要求6所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述穿梭质粒pSh41-CMV中，在能够与骨架质粒pAdbone41发生同源重组的右臂和左臂序列之间含有一个限制性内切酶PacI的识别位点TTAATTAA，并且在Ad41基因组左侧反向重复序列左侧末端添加有一个限制性内切酶PmeI的识别位点GTTTAAAC。

8.权利要求7所述的复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统，其中所述包装细胞系的保藏号为CGMCC No.2534。

9.权利要求1-4任一项的载体系统用于制备重组腺病毒的用途。

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