CN101186929A - 一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法。首先化学合成人APE1基因siRNA的双链表达模板，经酶切后插入到腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下，构建穿梭质粒pDC316－EGFP－U6－APE1siRNA，后者与腺病毒骨架质粒pBHG－fiber5/35共转染293细胞，通过Cre/loxP系统作用发生定点重组获得含有人APE1基因siRNA表达序列的Ad5/F35－APE1siRNA重组腺病毒。该重组腺病毒能够有效抑制APE1基因的表达，可有效增强对肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性。

Description

一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域。具体而言，本发明涉及一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法，是将外源DNA片段插入Ad5/F35腺病毒载体构建重组腺病毒，该重组腺病毒能够有效抑制肿瘤细胞APE1基因的表达，可有效增强对肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性。

背景技术

DNA损伤修复系统作为机体抵抗各种损伤的分子基础，对于维护基因组的稳定与完整起着至关重要的作用，然而对于通过损伤DNA杀死癌细胞的放、化疗，这一过程无疑削弱了治疗效果。因此以DNA损伤修复基因为靶点的基因治疗可望有效增强肿瘤细胞自身对放疗和细胞毒化疗药物的敏感性。

APE1是迄今发现的生物大分子中最具结构和功能特点的一个典范，它由DNA修复和氧化还原两个相对独立的功能区构成。APE1是DNA碱基切除修复(base excision repair，BER)途径的关键限速酶^[1]，是细胞放射性损伤和基因毒性药物烷化剂致伤的重要修复因子，在肿瘤放化疗抵抗中发挥重要作用。

APE1还具有氧化还原功能，故又称为氧化还原因子(redox factor，ref-1)，通过氧化还原机制调节多种转录因子的DNA结合活性及下游靶基因表达，而参与氧化应激、细胞周期调控及凋亡等多种关键的细胞反应。受控的转录因子包括与细胞增殖、分化、转化和凋亡相关的重要因子如NF-κB，AP-1，Egr-1，p53，PEBP2，Myb，HIF-1α及Pax5、8等^[2]，而这些转录因子与肿瘤放化疗抵抗密切相关。因此APE1通过核酸内切酶和氧化还原双功能直接影响和决定放疗和化疗敏感性的诸多环节，以APE1为靶点的基因治疗可望有效增强肿瘤细胞的放化疗敏感性。如何有效抑制APE1基因的表达将是决定临床应用的关键。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene silencing)。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解，从而抑制了该基因的表达。目前RNAi已成为基因组研究领域中的重要工具，正逐渐应用于肿瘤基因治疗领域。基因导入系统(gene delivery system)成为基因治疗和RNAi技术应用的关键。病毒载体因其对细胞天然的感染性而成为重要的基因导入手段。可用于导入s iRNA的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体等。

腺病毒载体具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高、无DNA整合等特点，是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一^[3]。目前应用于基因治疗腺病毒载体极大多数采用C种的2及5血清型腺病毒，其对细胞的感染主要是由纤毛上的小节与细胞表面受体-柯萨奇B组病毒和腺病毒受体(Coxsackie Bvirus-adenovirus receptor，CAR)结合，腺病毒对组织的感染主要取决于组织CAR的表达水平。在人体中，CAR广泛表达于各种上皮组织，而在肿瘤组织中存在CAR不同程度的下调或缺失，系统应用的腺病毒往往被截留在正常上皮细胞，尤其是肝细胞，因此肿瘤细胞感染的病毒量大大减少。因此，本发明人一直在寻找能够进一步提高肿瘤细胞感染效率的腺病毒载体。

Ad5/F35腺病毒载体是一种″改外壳″的腺病毒嵌合载体(Chimericadenovirus)，即用Ad35的纤毛小节替代第一代腺病毒5型腺病毒的纤毛小节。Ad35属腺病毒B种，对人的多数细胞具有良好的感染效率，因为其受体CD46几乎存在于所有的人细胞表面，而且许多肿瘤细胞高表达CD46。因此Ad5/F35腺病毒载体成为肿瘤细胞适合的基因导入载体。

发明内容

基于APE1基因在肿瘤放疗和化疗抵抗中发挥重要的作用，有效抑制APE1基因的表达，开展以APE1基因为靶点的基因治疗可望有效增强肿瘤细胞的放疗和化疗敏感性，提高临床肿瘤放疗和化疗的治疗效果。正是基于上述构思，发明人提出以Ad5/F35腺病毒载体作为肿瘤细胞适合的基因导入载体，将APE1基因的siRNA的编码序列插入腺病毒载体中构建一种重组腺病毒，使其能够在肿瘤细胞中表达，利用RNAi可以有效抑制APE1基因表达，达到增强对肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性的目的。

本发明的目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法，该方法得到的复制缺陷型重组腺病毒以DNA修复基因APE1为治疗靶点，利用RNAi技术有效抑制APE1基因表达，增强肿瘤细胞放化疗敏感性。

本发明的技术方案如下：

一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤：

1)、以基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人APE1基因eDNA编码序列中867-885共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人APE1基因siRNA的表达序列，该序列如序列表中序列1，在上述序列的两端分别引入酶切位点粘端，化学合成带有酶切位点粘端的单链DNA片段及其互补单链DNA片段，将上述互补单链退火得到退火产物即人APE1基因siRNA的双链表达模板；

2)、步骤1)所得人APE1基因siRNA的双链表达模板与腺病毒穿梭质粒经酶切后相连接，得到含有人APE1基因siRNA表达序列的腺病毒穿梭质粒；

3)、将步骤2)得到的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞，经定点重组得到带有人APE1基因siRNA表达序列的重组腺病毒。

步骤1)所述的人APE1基因siRNA的表达序列含有人APE1基因siRNA的特异性靶序列的正义链序列、反义链序列、连接正义链和反义链的9个碱基的Loop环序列及末端终止子序列。

步骤1)所述的基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列中的867-885碱基序列，其序列为CTGGTACGACTGGAGTACC。

步骤2)所述腺病毒穿梭质粒为pDC316-EGFP-U6，步骤3)所述骨架质粒为pBHG-fiber5/35，步骤3)所得到的带有人APE1基因siRNA表达序列的重组腺病毒为E1缺失的复制缺陷型重组腺病毒，该重组腺病毒命名为Ad5/F35-EGFP-U6-APE1siRNA重组腺病毒。

步骤2)所述人APE1基因siRNA的双链表达模板连接于pDC316-EGFP-U6腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下。

步骤3)所述定点重组为pBHG-fiber5/35骨架质粒与带有loxP位点的腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-U6配合，利用Cre/loxP系统的作用在293细胞内发生的定点重组。

按照本发明的重组腺病毒的构建方法得到的Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒可以制成液体制剂如注射液，用于恶性肿瘤放疗和/化疗中的增敏药物。

下面的实施例中详细描述了：(1)重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA的构建过程；(2)观察到了重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA可有效进入肿瘤细胞；(3)观察到了重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA对APE1基因的表达抑制；(4)观察到了重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA显著增强了对肿瘤放疗的敏感性；(5)观察到了重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA显著增强了对肿瘤化疗的敏感性。

由于APE1基因在恶性肿瘤放疗和化疗的抵抗中发挥重要作用，若本发明的构建重组腺病毒的方法得以应用，不但为恶性肿瘤的治疗提供一种新的治疗策略，而且具有广泛的临床应用价值。

附图说明

图1腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-U6的结构示意图。

图2 pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA穿梭质粒双酶切鉴定图。其中泳道1为20bp DNA marker；泳道2、3为2个阳性克隆。

图3 pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA穿梭质粒测序图。

图4重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA包装(构建)流程图。

图5重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA的PCR鉴定图。其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒原液；泳道3为Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒稀释10倍；泳道4为Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒稀释100倍；泳道5为阳性对照(pDC316-EGFP-U6-APE1-siRNA)稀释50倍；泳道6为阳性对照(pDC316-EGFP-U6-APE1-siRNA)稀释100倍；泳道7为阴性对照。

图6不同MOI的重组腺病毒体外感染大肠癌细胞株LOVO24h后感染效率。注：*，P＜0.01，与Ad5-EGFP比较。

图7重组腺病毒感染大肠癌细胞株LOVO裸鼠移植瘤3d后荧光显微镜下观察EGFP表达(×100)。

图8 Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒和对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞48h后Westernblotting检测APE1蛋白表达。

图9免疫组化结果显示Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒抑制LOVO细胞裸鼠移植瘤组织APE1蛋白表达(SP×100)。

图10不同剂量X线照射后LOVO细胞存活曲线。

图11 TUNEL法检测X线照射后LOVO细胞凋亡。

图12肿瘤生长曲线显示Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒放疗组肿瘤生长显著抑制。

图13 X线照射后各组移植瘤组织细胞凋亡率。

图14不同剂量5-FU处理后LOVO细胞存活曲线。

图15 5-FU处理后各组LOVO细胞凋亡率。

具体实施方式

材料与方法

DMEM培养基、胎牛血清和RPMI1640(Hyclone公司)，Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；Hind III、BamH I、T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)；pDC316-EGFP-U6、pBHG-fiber5/35质粒(本元正阳公司)；小鼠β-actin单克隆抗体(Sigma公司)，小鼠APE1单克隆抗体(NovusBiologicals公司)。HRP标记的羊抗小鼠二抗(Pierce公司)。大肠癌细胞LOVO购自美国ATCC，293细胞购自本元正阳公司。对照重组腺病毒载体Ad5/F35-EGFP和Ad5-EGFP由本元正阳公司馈赠。

实施例1 APE1 siRNA腺病毒穿梭质粒构建和鉴定

根据我们[4]设计的有效的人APE1 siRNA序列，以Ambion siRNA靶序列分析设计系统，扫描基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人APE1基因cDNA编码序列中867-885共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人APE1基因siRNA的表达序列，该序列如序列表中序列1，在序列1两端分别引入BamH I、HindIII酶切位点粘端，化学合成如下两条互补单链：

Top strand：

5′-GATCCGCTGGTACGACTGGAGTACCTTCAAGAGAGGTACTCCAGTCGTACCAGACTTTT

TTGGAAA-3′；

Bottom strand：

5′-AGCTTTTCCAAAAAAGTCTGGTACGACTGGAGTACCTCTCTTGAAGGTACTCCAGTCGT

ACCAG CG-3′

上述互补单链95℃退火5min，自然冷却至室温，得到退火产物即人APE1基因siRNA的双链表达模板。BamH I、HindIII双酶切腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-U6(图1)与退火产物，酶切产物连接，即构建腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA，转化大肠杆菌DH5α，氨苄平板筛选，挑选阳性克隆，提取质粒DNA，酶切和测序鉴定正确(图2，图3)。

实施例2 Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒包装、扩增和纯化2.1 Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒包装

包装原理及流程图：采用本元正阳公司的腺病毒Ad5/F35MaxTM包装系统构建重组腺病毒。将带有人APE1基因siRNA表达序列的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA与腺病毒骨架质粒pBHG-fiber5/35共转染293细胞，pBHG-fiber5/35骨架质粒可以与带有loxP位点的穿梭质粒配合，利用Cre/loxP系统的作用在293细胞内发生定点重组，产生带有人APE1基因siRNA表达序列的Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒。这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。本系统包装流程见图4。

转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞，培养基为DMEM+10％胎牛血清，置37℃含5％CO2的培养箱中培养过夜。用Lipofectamine2000脂质体将腺病毒骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA。转染后分别于不同时间在荧光显微镜下观察EGFP表达状况，了解腺病毒包装过程。10d左右293细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将出毒的细胞培养瓶先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融3次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。

2.2毒种鉴定、扩增和纯化

毒种鉴定：根据穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA序列设计一对引物来鉴定带有siRNA的病毒产品。上游引物与EGFP基因内部偏3’端的序列特异结合，下游引物与U6启动子内部的序列特异结合。扩增的片段长约为500bp，包括EGFP基因的一部分、siRNA编码序列以及U6启动子的一部分。

上游引物(RNAi-ID-f)：5’-TGTAGAGGTTTTACTTGCTT-3’下游引物(RNAi-ID-r)：5’-CATATACGATACAAGGCTG-3’Ad5/F35-EGFP-U6-APE1腺病毒模板处理：取50ul腺病毒加入2ulProtein K(10mg/mL)，56℃1小时，煮沸10分钟，冰水浴，ddH2O稀释。PCR条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，72℃ 5min，共30Cycles。

Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒稀释100倍能扩出目的基因条带，大小在500bp左右，PCR鉴定正确(图5)。

腺病毒扩增和纯化：第一代毒种经PCR鉴定正确后再反复感染293细胞进行扩增。收集细胞，-70℃及37℃反复冻融3次裂解细胞，充分振荡并离心后收集含病毒的上清。用DNase酶消化后，用0.45um的滤膜过滤，然后进行柱纯化。用SOURSE 15Q进行离子交换纯化，然后再用分子筛进一步纯化，将纯化后的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用0.22UM一次性滤器过滤出菌，用从而得到无菌的纯化病毒，分装保存于-70℃冰箱中。

纯化病毒的滴度测定：用10×的病毒裂解液裂解纯化病毒样品，测定的OD260和OD280值，按照公式：VP/ml＝OD260×1.1×10¹²，计算得到每ml制品中的病毒颗粒数(V.P./ML)。用TCID5 0法测定腺病毒的滴度。扩增纯化后滴度测定结果：Ad5/F35-EGFP-U6-APE1 siRNA物理滴度3.8×10¹¹VP/mL，感染性滴度1.6×10¹⁰ TCID50/mL；Ad5/F35-EGFP物理滴度5.8×10¹¹VP/mL，感染性滴度2.6×10¹⁰ TCID50/mL。

重组腺病毒TCID50测定操作规程：

1)培养293细胞，待细胞生长密度约为80-90％时，消化细胞并计数细胞数量。

2)用含有5％FBS的DMEM培养液制备细胞悬液，每板需要11ml浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液。

3)按每孔100μl(即1×10⁴个细胞)加入2个96孔板。

4)制备感染样品：无菌操作进行第一组稀释，10⁶开始连续8个稀释梯度；

再进行第二组稀释，小心操作，以免将两组样品稀释液混淆。

5)接种样品：将96孔板中的11、12两列各加入100μl5％FBS的DMEM，做阴性对照。依次加入96孔板中的A-H排，各加100μl标记为8各连续梯度稀释的样品溶液。盖上第一个板并在37℃CO₂培养箱中培养。同样步骤操作第二块板。盖上第二个板并在37℃ CO₂培养箱中培养。

实验中培养板的结构如下：

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	1×104	1×104	1×104	1×104	1×104	1×104	1×104	1×104	1×104	1×104	阴性对照	阴性对照
B	1×105	1×105	1×105	1×105	1×105	1×105	1×105	1×105	1×105	1×105	阴性对照	阴性对照
													C	1×106	1×106	1×106	1×106	1×106	1×106	1×106	1×106	1×106	1×106	阴性对照	阴性对照
D	1×107	1×107	1×107	1×107	1×107	1×107	1×107	1×107	1×107	1×107	阴性对照	阴性对照
													E	1×108	1×108	1×108	1×108	1×108	1×108	1×108	1×108	1×108	1×108	阴性对照	阴性对照
F	1×109	1×109	1×109	1×109	1×109	1×109	1×109	1×109	1×109	1×109	阴性对照	阴性对照
													G	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	1×1010	阴性对照	阴性对照
H	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	1×1011	阴性对照	阴性对照

6)将96孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养10天。从第3天到第10天观察细胞状况。

7)第10天分析、记录CPE结果：CPE应在10天之内出现。第10天在显微镜下观察每孔CPE情况，并与阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数(如有一个板被污染，实验必须重做)。

8)在第10天，满足以下条件即可进行结果计算：(a)至少有一个样品稀释液在12个孔内CPE都是明显的；(b)至少有一个样品稀释液最少有3个但不多于9个孔内有明显的CPE；(c)至少有一个样品稀释液在12个孔内都是明显无CPE。

病毒滴度计算公式：

对于100μl样品，滴度T＝10^1+d(s-0.5)。d＝log₁₀稀释度＝1(对于10倍的稀释度而言)；s＝阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)。两次重复实验得到的滴度值应相差≤10^0.7。

实施例3 Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒对大肠癌细胞的感染效率

3.1体外感染效率检测

LOVO细胞置于37℃含5％CO2的孵箱中培养，培养液RPMI1640含有10％FCS，1.0×10⁵U/L青霉素和链霉素。腺病毒感染前一天，将LOVO细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞。分别以0～20感染复数(multiplicity of infection，MOI)的腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA或对照腺病毒Ad5/F35-EGFP和Ad5-EGFP感染LOVO细胞90min，然后吸弃培养液，更换完全培养基，24h后于荧光倒置显微镜下观察LOVO细胞EGFP表达并摄像。0.25％胰酶消化细胞，500g室温离心5min，吸弃上清，0.01MPBS重悬细胞，500g室温离心5min，收集细胞，送重庆医科大学儿童医院儿研所，流式细胞术检测EGFP阳性细胞比例。

0～20MOI的腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA或对照腺病毒Ad5/F35-EGFP和Ad5-EGFP感染LOVO细胞24h后于荧光倒置显微镜下观察LOVO细胞EGFP表达，在蓝色荧光激发下，可见部分细胞发出强度不等的绿色荧光，随着MOI的增加，绿色荧光逐渐增强；同一MOI情况下Ad5/F35-APE1siRNA和Ad5/F35-EGFP腺病毒感染的LOVO细胞绿色荧光强度相当，但明显强于Ad5-EGFP腺病毒。经流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例发现，Ad5/F35-APE1siRNA和Ad5/F35-EGFP腺病毒对LOVO细胞的感染效率相当，但显著高于Ad5-EGFP腺病毒(图6)。

3.2体内感染效率检测

裸鼠移植瘤模型：LOVO细胞在37℃，5％CO2，含10％胎牛血清的RPMI-1640的培养基中培养，将处于对数生长期的细胞用0.25％胰蛋白酶消化，用无菌PBS液重悬制成2.5×10⁷/ml的单细胞悬液，每只4～5周龄BALB/c nu/nu裸小鼠右侧腋下皮下接种0.2ml(5×10⁶/ml)细胞悬液。

接种LOVO细胞5～6d后BALB/c nu/nu裸小鼠皮下可见明显肿块。皮下接种后第11天，当肿瘤体积达到约100mm³时，将裸鼠随机分为四组：正常对照组，Ad5-EGFP对照组，Ad5/F35-EGFP对照组，Ad5/F35-APE1siRNA组。每组5只裸鼠。分别瘤内局部注射50μl的PBS和5×10⁸IU的Ad5-EGFP、Ad5/F35-EGFP、Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒。注射3d后处死裸鼠，立即取肿瘤组织冰冻切片，厚20μm，甘油封片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况。结果显示PBS对照组无绿色荧光，Ad5-EGFP腺病毒组可见少量EGFP阳性细胞，Ad5/F35-EGFP和Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒组可见大量EGFP阳性细胞，EGFP呈弥漫性强阳性表达(图7)。

实施例4 Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒对大肠癌细胞APE1蛋白表达的抑制作用

4.1 Western blot分析重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA体外对大肠癌细胞APE1蛋白的抑制作用

LOVO细胞置于37℃含5％CO2的孵箱中培养，培养液RPMI1640含有10％胎牛血清，1.0×10⁵U/L青霉素和链霉素。腺病毒感染前一天，将LOVO细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞。以0～20MOI腺病毒Ad5/F35-EGFP-U6-APE1siRNA或对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞90min，然后吸弃培养液，更换完全培养基，48h后收集细胞，常规提取细胞总蛋白。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为10％，积层胶浓度为5％)。电泳后转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭后，加入APE1或β-actin一抗，4℃摇床孵育过夜，37℃孵育1h，加入HRP标记的羊抗小鼠二抗，室温下摇床孵育1h。以ECL试剂盒显色，X光片暗室中曝光，常规显影、定影。

1～20MOI腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA感染LOVO细胞48h后，细胞APE1蛋白表达均有不同程度的下降。随着MOI的增高，APE1蛋白表达逐渐下降；对照腺病毒Ad5/F35-EGFP对LOVO细胞APE1蛋白表达无明显影响(图8)。

4.2免疫组化分析重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA体内对大肠癌细胞APE1蛋白的抑制作用

裸鼠移植瘤瘤内局部注射50μl的PBS和5×10⁸IU的Ad5/F35-EGFP、Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒。3d后取肿瘤组织，中性福尔马林固定24h，常规包埋切片，免疫组织化学染色观察APE1表达。结果显示PBS和Ad5/F35-EGFP对照组APE1蛋白呈胞核和胞质强阳性表达，主要定位于胞核。Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒组APE1蛋白表达明显减弱(图9)。

实施例5评价Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒对大肠癌放疗敏感性的影响

5.1克隆形成分析检测大肠癌细胞体外放疗敏感性

5.1.1腺病毒感染：腺病毒感染前一天，将对数生长期的LOVO细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞。以10、20 MOI的腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA或20 MOI的对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞90min，然后吸弃培养液，更换完全培养基，继续培养48h。

5.1.2放疗：用0、2、4、6、8 Gy不同的剂量照射细胞；

5.1.3接种细胞：照射后立即用PBS清洗两遍，经0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液。根据照射剂量大小分别接种500、1000、2000、10000、100000个细胞于60mm培养皿中，每个剂量点设3个平行样品。

5.1.4培养皿细胞置于37℃，饱和湿度，含5％CO₂的孵箱中常规培养，培养液为含有10％FCS和100U/ml青霉素和链霉素的RPMI-1640，每2～3天换液一次，共培养10天。

5.1.5用PBS将细胞清洗两遍，经甲醇固定后用0.1％结晶紫(crystalviolet)染色，作克隆计数(每个克隆不能少于50个细胞)，计算细胞克隆形成率和存活分数(surviving fract ion，SF)，未照射细胞克隆形成率，即接种效率(plating efficincy，PE)根据以下公式计算：

PE＝未照射细胞形成的克隆数/接种细胞数

SF＝照射后细胞形成的克隆数/(接种细胞数×PE)

5.1.6根据不同的放疗剂量得到相应的一系列SF，最后用单击多靶数学模型(Single-hit multitarget model)拟合细胞的存活曲线，并求出平均致死剂量(D₀)值和准域剂量(quasithreshould dose，Dq)值。

单击多靶数学模型公式：SF＝1-(1-e^-KD)^N或SF＝1-(1-e^-D/D0)^N。

D₀是剂量存活曲线的直线部分斜率(k)的倒数，从存活曲线对数坐标0.1和0.037各作一条与横坐标相平行的线与曲线相交，从这两个交点分别作垂直线与剂量轴相交，相交点剂量之差即为D₀值，即在剂量效应曲线的直线部分把SF从0.1降至0.037所需的剂量。D_q是存活曲线的直线部分向上延伸与通过SF等于1的横轴相交点的剂量，即克服肩区所需的剂量，反映细胞积累亚致死性损伤的能力，与损伤修复有关。将存活曲线直线部分外推与纵坐标相交点的数值即为外推N值(extrapolation number)，代表细胞内靶的个数或所需击中靶的次数。

用GraphPad Prism 4.0软件拟合细胞存活曲线，求出D₀、N和k值，根据公式Dq＝D₀log_eN求出Dq值。

计算放射增敏比(sensitive enhancement ratio，SER)，SER(D₀)＝对照D₀/照射后D₀；SER(D_q)＝对照D_q/照射后D_q。

感染Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒和对照Ad5/F35-EGFP腺病毒的LOVO细胞受0～8Gy的X线照射，培养10d后均可见大小不等的典型细胞克隆，用经典的克隆形成分析法检测细胞增殖和放射敏感性，采用单靶多击数学模型[SF＝1-(1-e^-D/D0)^N]，经GraphPad Prism4.0软件拟合LOVO细胞的存活曲线，见图10(半对数坐标图)。不同组别的放射敏感性参数见表1。

表1 Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒对LOVO细胞放射敏感性参数比较

Group	D0(Gy)	Dq(Gy)	SF2	SER(D0 )	SER(Dq)
						Ad5/F35-EGFP(20MOI)Ad5/F35-APE1siRNA(10MOI)Ad5/F35-APE1siRNA(20MOI)	1.431.281.16	1.610.770.28	0.580.350.22	/1.121.23	/2.095.75

由存活曲线可以看出Ad5/F35-EGFP对照组LOVO细胞有一较明显的“肩宽”，而Ad5/F35-APE1siRNA组LOVO细胞的“肩宽”明显缩小变窄，且在各个剂量点的存活份数均明显低于Ad5/F35-EGFP对照组，表明Ad5/F35-APE1siRNA组LOVO细胞的放射敏感性较对照组高，且20MOI比10MOIAd5/F35-APE1siRNA组放射敏感性高。其增敏比见表1，不同增敏比求法反映了不同的增敏机制，D₀值比反映了射线在造成相同生物效应时所需剂量比值(平均致死剂量的高低比较)，反映的是不同细胞对射线的敏感程度。D_q值比反映了细胞对射线亚致死性损伤修复能力高低的比较。本研究用单靶多击模型分析结果表明，APE1 siRNA导入LOVO细胞后所增加的放射敏感性，主要是通过抑制亚致死损伤修复而实现的。

5.2 TUNEL法检测细胞凋亡

采用TUNEL法检测LOVO细胞原位凋亡。TUNEL原位凋亡试剂盒为美国Roche公司产品。对数期生长的LOVO细胞接种于六孔板内盖玻片上，每孔1×10⁵个细胞。20MOI的重组腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA或对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞48h后，予0、5Gy放疗剂量照射细胞，照射后继续培养24h，TUNEL法检测LOVO细胞原位凋亡。盖玻片4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗2次，0.5％Triton X-100室温10min，PBS冲洗2次，滴加TUNEL反应液20μl(TUNEL反应液现用现配，末端核苷酸转移酶TdT∶荧光素标记dUTP＝1∶9，阴性对照不加TdT酶。)，湿盒密封，37℃孵育1h。PBS冲洗2次，滴加辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体(POD)20μl，湿盒密封，37℃孵育30min。PBS冲洗2次，加50μl DAB底物液，室温孵育10min。苏木素复染15-30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片。

实验分为四组：Ad5/F35-EGFP组；Ad5/F35-APE1si RNA组；C：Ad5/F35-EGFP联合放疗组，即Ad5/F35-EGFP+IR组；Ad5/F35-APE1siRNA联合放疗组，即Ad5/F35-APE1siRNA+IR组。结果显示：Ad5/F35-EGFP对照组偶见凋亡细胞，Ad5/F 35-APE1si RNA组凋亡细胞增加(P＜0.01)。Ad5/F35-APE1siRNA+IR组较Ad5/F35-EGFP+IR组凋亡细胞数显著增加(P＜0.01)(图11)。

5.3体内裸鼠移植瘤实验

1.裸鼠移植瘤模型

同实施例3。接种LOVO细胞5～6d后BALB/c nu/nu裸小鼠皮下可见明显肿块。皮下接种后第11天，当肿瘤体积达到约100mm³时，开始以下实验。

2.病毒体内感染和放疗

将裸鼠随机分为四组：Ad5/F35-EGFP组；Ad5/F35-APE1siRNA组；C：Ad5/F35-EGFP联合放疗组，即Ad5/F35-EGFP+IR组；Ad5/F35-APE1siRNA联合放疗组，即Ad5/F35-APE1siRNA+IR组。每组5只裸鼠。

重组腺病毒体内感染：相应组别瘤内局部注射5×10⁸IU(50μl)的Ad5/F35-APE1siRNA病毒或对照Ad5/F35-EGFP病毒。注射3d后采用瑞典医科达(ELEKTA)precise直线加速器，源皮距100cm，照射剂量率3Gy/min，于裸鼠移植瘤局部给予6Gy 6MV X射线放疗一次。

3.肿瘤生长检测

放疗后每天用游标卡尺测量瘤体最长径(a)与最短径(b)，根据公式V(mm³)＝ab²/2计算肿瘤的体积，绘制生长曲线，计算抑瘤率。2W后处死裸鼠，测量肿瘤最终体积和瘤重。放疗后每3天测量裸鼠体重一次。

各组生成曲线见图12。体内实验结果显示Ad5/F35-APE1siRNA+IR组肿瘤生长较Ad5/F35-EGFP+IR组明显被抑制，表明Ad5/F35-APE1siRNA显著增强LOVO细胞放疗敏感性。2W后单纯Ad5/F35-APE1siRNA组肿瘤抑制率为15.06％，Ad5/F35-EGFP+IR组肿瘤抑制率为41.41％，Ad5/F35-APE1siRNA+IR组肿瘤抑制率为70.90％。

4.TUNEL染色检测细胞凋亡

TUNEL原位凋亡试剂盒为美国Roche公司产品。肿瘤标本取下后立即用新配制的4％多聚甲醛固定24h，梯度酒精系列脱水，石蜡包埋后切片，切片常规脱蜡水化。以后各步骤同方法“(四)细胞凋亡检测(TUNEL法)”。以细胞核呈棕黄色或褐色为凋亡阳性染色。在400倍高倍视野下随机选取5个视野，计算凋亡细胞在全部癌细胞中所占的比例。凋亡指数(apoptosis index，AI)＝(凋亡细胞数/癌细胞总数)×100％。

实验分为四组：Ad5/F35-EGFP组；Ad5/F35-APE1siRNA组；C：Ad5/F35-EGFP联合放疗组，即Ad5/F35-EGFP+IR组；Ad5/F35-APE1siRNA联合放疗组，即Ad5/F35-APE1siRNA+IR组。LOVO细胞移植瘤组织TUNEL法检测结果显示：Ad5/F35-EGFP对照组偶见凋亡细胞，Ad5/F35-APE1siRNA组凋亡细胞增加(P＜0.01)。Ad5/F35-APE1siRNA+IR组较Ad5/F35-EGFP+IR组凋亡细胞数显著增加(P＜0.01)(图13)。

实施例6评价Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒对大肠癌5-FU化疗敏感性的影响

6.1 MTT法检测细胞存活率

1.腺病毒感染：腺病毒感染前一天，将对数生长期的LOVO细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞。以20MOI的腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA或对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞90min，然后吸弃培养液，更换完全培养基，继续培养48h。

2.MTT法检测细胞存活率

腺病毒感染的LOVO细胞以4×10³/孔接种于96孔培养板培养，24h后吸除原培养液，更换新RPMI1640培养液，以0～100μM的5-FU处理细胞，另设只加培养液，不加细胞和药物的为空白组。每组3个复孔。将各组细胞继续培养72h后，进行MTT实验，每孔加MTT溶液(5g/L)20μL，继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，使结晶充分溶解，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度A值(A490)，按下列公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率(IR)＝[1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100％。并计算5-FU的半数抑制浓度IC50。

5-FU作用72h后LOVO细胞的存活曲线图(图14)可见，随着5-FU浓度的增加，LOVO细胞存活率逐渐下降，与Ad5/F35-EGFP组比较，Ad5/F35-APE1siRNA组下降更明显，5-FU每个剂量点均有非常显著统计学差异(P＜0.01)。Ad5/F35-EGFP和Ad5/F35-APE1siRNA组的IC50分别为7.04μM和1.69μM。

6.2细胞凋亡检测(TUNEL法)

采用TUNEL法检测LOVO细胞原位凋亡。对数期生长的LOVO细胞接种于六孔板内盖玻片上，每孔1×10⁵个细胞。20MOI的腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA或对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞48h后，予0、10μM的5-FU处理细胞，继续培养24h，TUNEL法检测LOVO细胞原位凋亡。具体步骤同第三部分。

实验分为四组：Ad5/F35-EGFP组；Ad5/F35-APE1siRNA组；C：Ad5/F35-EGFP联合5-FU组，即Ad5/F35-EGFP+5-FU组；Ad5/F35-APE1siRNA联合5-FU组，即Ad5/F35-APE1siRNA+5-FU组。TUNEL法检测结果显示：Ad5/F35-EGFP对照组偶见凋亡细胞，Ad5/F35-APE1siRNA组凋亡细胞增加(P＜0.01)。Ad5/F35-APE1siRNA+5-FU组较Ad5/F 35-EGFP+5-FU组凋亡细胞数显著增加(P＜0.01)(图15)。

参考文献

1.Shen JC，Loeb LA.Mutations in the alpha8 loop of human APE1 alterbinding and cleavage of DNA containing an abasic site.J BiolChem，2003，278(47)：46994-47001.

2.Tell G，Pines A，Paron I，et al.Redox effector factor-1regulates the activity of thyroid transcription factor 1 bycontrolling the redox state of the N transcriptional activationdoma in.J Biol Chem，2002，277(17)：14564-14574.

3.Volpers C，Kochanek S.Adenoviral vectors for gene transfer andtherapy.J Gene Med，2004，Suppl 1：S164-71.

4.Wang D，Luo M，Kelley MR.Human apurinic endonucl ease1(APE1)expression and prognostic significance in osteosarcoma：enhanced sensitivity of os teosarcoma to DNA damaging agentsusing silencing RNA APE1 expression inhibition.Mol Cancer Ther，2004，3(6)：679-686.

序列表

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列中APE1基因siRNA的靶序列遴选设计原则而设计

<400>1

ctggtacgac tggagtacct tcaagagagg tactccagtc gtaccagact ttttt    55

Claims (6)

1.一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤：

1)、以基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人APE1基因cDNA编码序列中867-885共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人APE1基因siRNA的表达序列，该序列如序列表中序列1，在上述序列的两端分别引入酶切位点粘端，化学合成带有酶切位点粘端的单链DNA片段及其互补单链DNA片段，将上述互补单链退火得到退火产物即人APE1基因siRNA的双链表达模板；

2)、步骤1)所得人APE1基因siRNA的双链表达模板与腺病毒穿梭质粒经酶切后相连接，得到含有人APE1基因siRNA表达序列的腺病毒穿梭质粒；

3)、将步骤2)得到的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞，经定点重组得到带有人APE1基因siRNA表达序列的重组腺病毒。

2.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤1)所述的人APE1基因siRNA的表达序列含有APE1基因siRNA的特异性靶序列的正义链序列、反义链序列、连接正义链和反义链的9个碱基的Loop环序列及末端终止子序列。

3.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤2)所述腺病毒穿梭质粒为pDC316-EGFP-U6。

4.如权利要求3所述的构建方法，其中步骤2)所述人APE1基因siRNA的双链表达模板连接于pDC316-EGFP-U6腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下。

5.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤3)所述骨架质粒为pBHG-fiber5/35。

6.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤3)所述定点重组为pBHG-fiber5/35骨架质粒与带有loxP位点的腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-U6配合，利用Cre/loxP系统的作用在293细胞内发生的定点重组。

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