CN1952160A - 智能腺病毒载体与khp53基因的重组体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种智能腺病毒载体与khp53抑癌基因的重组体及其应用，本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人肿瘤抑制基因的重组病毒载体，特别是涉及一种由Kozak序列引导的人p53肿瘤抑制基因重组智能腺病毒载体，还涉及含有该基因重组载体的药物组合物。通过联合使用MCMV启动子、内含子以及Kozak规则序列等增强真核基因表达的元件，解决了p53基因表达量相对不足的问题；并采用AdMAX HiIQ重组腺病毒载体系统，解决了外源基因高表达重组腺病毒的有效包装问题，最终在真核细胞中经位点特异的同源重组，包装出E1、E3缺失的5型重组腺病毒rAdMH－khp53。应用本发明的重组腺病毒，可制备成临床使用的基因药物，用于多种恶性肿瘤的预防和治疗。

Description

智能腺病毒载体与khp53基因的重组体及其应用

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人肿瘤抑制基因的重组病毒载体，特别是涉及一种由Kozak序列引导的人p53肿瘤抑制基因重组智能腺病毒载体，还涉及含有该基因重组载体的药物组合物。

背景技术：

1、肿瘤基因治疗

基因治疗是将有治疗作用的基因或DNA(RNA)片段通过一定方式导入人体靶细胞，针对导致疾病的各种分子病理变化，相应地在分子水平上调控基因的表达，从而发挥治疗作用，达到从根本上治疗疾病目的的分子医学治疗方法。

十几年来，肿瘤基因治疗发展迅速。美国从1995年前后陆续成立了10大基因治疗公司，1999年约有30家基因治疗的专业公司，到2000年达到近100家，2004年全球240多家基因治疗公司中，有75家在进行肿瘤基因治疗的研究和开发；截止到2004年7月底，全世界五大洲23个国家批准的基因治疗临床试验方案达到了987个，其中针对肿瘤的基因治疗方案最多，共有656个，占总数的66.5％。给药途径有肿瘤组织内、静脉内、肝动脉内、皮下、肌肉、膀胱内、腹腔内等；世界上第一个上市的基因治疗药物正是用于肿瘤的治疗。

尽管基因治疗的研究和应用起源于对遗传病的治疗，但近年来肿瘤基因治疗的发展却远远超过了遗传病，原因主要是肿瘤的发病率和患者人数远多于遗传病，据世界卫生组织报告，2000年全球新发恶性肿瘤病人1010万人，死亡620万人，现患恶性肿瘤病例2240万。过去的10年间，全球恶性肿瘤发病率增长了22％，它已经成为常见且严重威胁人们生命和生活质量的主要疾病之一，对人类健康威胁巨大，对患者身心造成的伤害严重；二是治疗基因的选择种类多，范围广，并不像遗传病那样局限于有缺陷的或突变的基因，只要能达到治疗肿瘤的目的而对正常人体细胞损伤小的基因均可采用，如肿瘤抑制基因、免疫增强基因、自杀基因、新生血管抑制基因等等；三是肿瘤的基因治疗不要求外源基因一定要持续表达，阶段性表达甚至一过性表达也可以达到杀伤肿瘤细胞的目的；四是多数肿瘤基因治疗方案是将治疗基因直接导入肿瘤细胞，对治疗基因表达调控的要求远不如遗传病治疗时严格。

2、人p53基因研究进展

1979年Lane和Crawford等在SV40大T抗原基因转染的细胞中发现了p53基因，并认为其为癌基因。以后Hinds、Finlay等通过研究发现转染了myc或ras癌基因的细胞中，若存在野生型p53基因，则出现生长抑制。因此提出p53基因属于抑癌基因。

人p53基因定位于第17号染色体17p13.1区，在基因组DNA上占据20303bp的长度，含11个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸残基的蛋白质即P53蛋白。P53蛋白，从功能上可划分为五个部分：N-末端的转录活化区(1-42 aa)能与一系列的蛋白结构(如MDM2 TBP TAFs)结合而调节p53的转录功能；信号区(64-92 aa)富含脯氨酸，有5个脯-X-X-脯重复顺序，此区不是转录活化所必须的，但对诱导细胞凋亡是必需的；DNA结合区(102-292 aa)识别顺序专一的DNA序列；四聚体化区(324-355 aa)此区能抑制癌细胞的生长；C-末端的非专一DNA结合区(370-393 aa)能与非特异性的DNA序列结合。p53的基本功能为核转录因子，其抗肿瘤的生物学活性主要表现在阻滞肿瘤细胞周期，可作用于G1/S期和G2/M期；诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤血管生成；增强肿瘤细胞的免疫原性；抑制肿瘤细胞的侵润和转移；增加肿瘤细胞对放化疗以及热疗的敏感性等。

p53基因突变是许多肿瘤发生的重要原因之一.基因突变主要包括点突变、等位基因的缺失、基因重排、与肿瘤病毒癌蛋白结合而失活等.据报道在大约200多种不同的肿瘤中有50％的肿瘤带有p53基因突变.已发现p53基因中有4个位于外显子5-8的突变热点，虽然不同组织器官发生的肿瘤中p53基因突变谱显示有差异，但约有90％的突变是集中在这部分区域。他们分别编码132-143 174-179 236-248和272-281号氨基酸。

在多种人类肿瘤中，如食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠及直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤中，p53基因的突变率都在50％左右。在黑色素瘤(原发)中p53基因突变率高达97％。肺癌中各型肺癌均存在p53基因突变，约52％的非小细胞性肺癌，90％的小细胞性肺癌存在p53基因突变。还有部分白血病、脑肿瘤、多发性骨髓瘤、星形细胞瘤也存在p53基因的改变。研究发现，难治的肿瘤p53基因突变率较高而相对容易治疗的肿瘤较少发生p53基因突变。而且p53基因的突变与病情的发展、肿瘤的转移以及对放疗化疗的敏感性和预后都关系密切。

3、腺病毒载体研究进展

腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体，无包膜，直径为70～90nm，有252个壳粒，其中20面体顶角壳粒为12个五邻体(penton)，每个五邻体有2条纤维。除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体(Hexon)。腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，长约36kb，其5’端与一种末端蛋白(TP)共价结合，5’端上还具有倒转末端重复序列(ITRs)。病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合。另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系。作为基因治疗载体的腺病毒基因组，通常是将其E1区和/或E3区删除，而将外源基因表达盒插入E1区的位置，这样构建的重组腺病毒是复制缺陷型的，即不能在一般的细胞中复制，而只能在特定的细胞中(如293细胞)复制生产。

腺病毒载体的特点是：载体容量较大(＞7.5kb)，转染效率极高(体外转染人肿瘤细胞可达100％)，生产效率高(病毒可在生产细胞上几百倍地扩增)，非整合性感染细胞，无遗传毒性，感染能力强(分裂，非分裂细胞均可被感染)，外源基因表达量高。这些特点使腺病毒特别适合于肿瘤的基因治疗及其制品的工业化生产。

重组腺病毒载体毒种制备方法的演进：早期采用双质粒共转染法：即将带有目的基因的穿梭载体小质粒和带有腺病毒基因组的大质粒共同转染包装细胞——293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组，形成重组腺病毒载体基因组，并在293细胞内包装成病毒颗粒，此方法效率较低；Ad-Easy法：即将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒转化携带了腺病毒大部分基因组质粒的细菌，在细菌Cre重组酶的作用下，重组获得重组腺病毒载体基因组的质粒，抗性筛选后，扩增，提取质粒，酶切纯化后转染293细胞，在其中包装成重组病毒颗粒，此法效率较高；AdMax法：即将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，在重组酶的作用下，重组产生重组腺病毒，这是目前包装效率最高的方法。

腺病毒载体携带的外源基因的表达往往会有一定的细胞毒性，甚至有时没有细胞毒性的基因的中度水平的表达也会明显阻碍腺病毒载体的复制和扩增，其导致的结果是病毒重组出毒困难，或难以扩增到高滴度。出现这种情况时，采用病毒单克隆筛选的方法也无法得到高表达目的蛋白的病毒。比如，表达糖蛋白的腺病毒往往难以出毒，类似的情况还有表达某些DNA结合蛋白或酶的腺病毒载体。所以很难预先估计某一株腺病毒载体的滴度和产量。

AdMax^TMHi-IQ腺病毒载体系统可以实现上述情况下的腺病毒载体的制备。它是在AdMax的基础上，利用乳糖操纵子(lac operator)控制目的基因的转录，在表达乳糖抑制子(lacrepressor)的293细胞上包装腺病毒载体，目的基因的表达受到抑制，而在其它细胞上，目的基因的表达不受任何抑制。

“Hi-IQ”系统可以用来高产制备携带具有或潜在的细胞毒性的目的基因的腺病毒载体，与AdMax系统不同的是，前者包括一株表达lac repressor的293细胞(293-IQ细胞)，和含有MCMV启动子、内含子、lac操纵子的Shuttle质粒、含腺病毒基因组的辅助大质粒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。

发明内容

重组人p53腺病毒应用于临床治疗恶性肿瘤已有十年的历史，虽然取得了一些令人鼓舞的疗效，但总的来说，疗效尚不十分确切，究其原因，主要是由于在p53肿瘤抑制基因的真核表达装置中，普遍采用RSV、SV40或CMV等较弱的启动子，致使P53蛋白在肿瘤细胞中的表达量相对不足所致。研究表明，当一个人的正常细胞由于体内外各种因素致使其基因发生变化，最后导致肿瘤细胞的产生时，已经积累了10000多个基因水平的改变(如抑癌基因的缺失、点突变、甲基化，原癌基因的重排、扩增、突变等等)，而肿瘤抑制基因p53的的作用机制是通过对细胞周期的阻滞、促进肿瘤细胞的凋亡、诱导细胞分化、衰老以及抑制肿瘤血管生成等来抑制肿瘤的生长，因此它的一个最显著的作用特点就是，多靶点，而不是单一位点作用，如P53蛋白作为转录因子，直接与特异的DNA序列作用，可以调控下游多种基因的表达，基因芯片研究发现，P53转录激活从而表达上调的有107种基因，转录抑制导致表达下调的有54种基因；同时，P53蛋白本身，也能与多个胞内蛋白相互作用，如癌基因mdm2的基因表达产物就可与P53蛋白特异地结合而抑制P53的功能。因此，相对于肿瘤细胞中的众多基因改变，作为基因替代疗法的重组人p53腺病毒基因药物制剂，在感染肿瘤细胞并表达后，其P53蛋白的表达量就显得捉襟见肘，难以确切有效地控制肿瘤生长。

然而，当我们构建了高表达的人p53重组腺病毒穿梭载体后，却发现它无法在293细胞中包装出重组腺病毒，也就无法将人p53基因转导至肿瘤细胞中，达不到基因治疗的目的。其原因是高表达人p53基因的真核表达装置在包装细胞中也同样地高效表达，消耗了包装细胞中大量用于蛋白质合成的资源(因重组腺病毒的包装过程也是一个大量蛋白质合成的过程，二者形成了一种直接的竞争关系)，而且大量的P53蛋白致使293细胞周期阻滞，甚至凋亡，因此除了基因的高效表达外，还需要重组腺病毒的高效包装。

本发明的目的是提供一种重组腺病毒，在其插入的真核表达装置中，综合使用多个增强基因表达的调控元件，如MCMV(Murine Cytomegalovirus，鼠巨细胞病毒)启动子，Intron(内含子)，Kozak规则序列等，在基因表达的不同水平，不同阶段，使得人p53肿瘤抑制基因通过重组腺病毒载体进入肿瘤细胞后，可直接在肿瘤细胞中大量表达，抑制肿瘤细胞的生长，并最终导致其凋亡。同时在其真核表达装置的MCMV下游插入大肠杆菌乳糖操纵子(LacOperator)，并在293包装细胞中转入能与大肠杆菌乳糖操纵子DNA序列特异结合的乳糖阻遏子基因，并稳定表达，这样在重组腺病毒的包装过程中，293细胞表达的乳糖阻遏子蛋白就卡在MCMV启动子与人p53肿瘤抑制基因之间，使p53基因的转录无法正常进行，外源基因在293细胞中的表达受到明显抑制，不会再影响到重组腺病毒的包装过程。通过以上两种方法，即可使人p53肿瘤抑制基因在肿瘤细胞中高效表达，也可在经转基因改造过的293细胞(即293IQ细胞)中高效包装。

本发明的技术方案为以上游引物5’-ATA GGATCC ACCATGG AGG AGC CGC AGT C 3’，下游引物5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’，通过PCR扩增人p53肿瘤抑制基因编码区，将PCR产物克隆至T载体，双向测序，再利用限制性内切酶BamH I亚克隆到pDCn15(io)腺病毒穿梭质粒，PCR筛选正向插入克隆，与腺病毒基因组骨架质粒DNA共转染293IQ细胞，在真核细胞中经位点特异的同源重组，包装出重组腺病毒rAdMH-khp53，阳性重组腺病毒毒种经克隆化，感染293IQ细胞扩增，纯化，制备基因治疗药物。

此重组腺病毒具有下列特点：

l、独特的真核基因表达装置结构：首先是采用了目前世界上启动真核基因表达效率最高的鼠巨细胞病毒启动子MCMV，在转录水平提高外源基因的表达，并在启动子与外源基因之间插入一内含子，进一步提高基因转录后mRNA的稳定性；其次是在人p53肿瘤抑制基因编码区前巧妙地设计了一个Kozak序列，从而在蛋白翻译水平再次提高基因的表达量；最后是在MCMV下游插入大肠杆菌乳糖操纵子，与293IQ细胞配合应用，使得上述真核基因高表达装置能有效地重组到腺病毒载体中，并高效包装。

2、腺病毒载体具有转染率高、可操作性好，能携带较大的基因，可制备高效价的病毒颗粒，宿主范围广，安全性好，致病性低的优点。

3、人p53肿瘤抑制基因抗癌作用的多靶点特性，除了阻滞肿瘤细胞周期，抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡外，尚可诱导细胞分化、衰老，抑制肿瘤血管生成，增强肿瘤细胞的免疫原性，抑制肿瘤细胞的侵润和转移，增加肿瘤细胞对放化疗以及热疗的敏感性等。

4、由腺病毒载体将人p53肿瘤抑制基因导入人肿瘤靶组织细胞中直接表达，从而解决了由于P53蛋白不稳定、无法用基因工程的方法体外制备成重组基因工程蛋白产品的问题，并在蛋白质分子修饰程序上，如蛋白质磷酸化、折叠以及多聚化等方面都与内源性P53蛋白没有任何差别，具有完全的生物活性，直接在肿瘤局部充分发挥其抗癌作用。

本发明的贡献在于，所构建的具有独特结构和特性的重组腺病毒rAdMH-khp53，不仅实现了人p53肿瘤抑制基因在人肿瘤靶组织细胞中直接高效表达，而且能在特定的293IQ细胞中高效包装，因此其抗癌作用明显优于低表达系统，使许多对低表达P53基因治疗不敏感的肿瘤细胞也同样能得到有效抑制，治疗效果更加确切、有效。本发明的人p53肿瘤抑制基因与腺病毒连接可直接在真核细胞中表达，也就是说可以直接导入实体瘤部位让其表达，使受治疗者自身变成一个生产P53肿瘤抑制蛋白的“工厂”。这种方法能够克服蛋白不稳定、半衰期短、活性低、成本高等缺点，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。

其中实验所用的293IQ细胞是在293细胞基础上转入大肠杆菌乳糖阻遏子基因后得到。详细资料请参阅Matthews D A，Cummings D，Evelegh C，et al.Development and use ofa 293 cell line expressing lac repressor for the rescue of recombinant adenovirusesexpressing high levels of rabies virus glycoprotein.Journal of General Virology(1999)，80，345-353。

附图说明：

图1是重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒的研究技术路线框图；

图2是带有Kozak规则序列的人p53基因编码片段的琼脂糖凝胶电泳分析；

图3是pDCnl5(io)-khp53重组质粒的酶切、电泳鉴定；

图4是重组腺病毒rAdMH-khp53毒种的产生；

图5是重组腺病毒rAdMH-khp53 PCR、电泳鉴定结果；

图6是重组腺病毒rAdMH-khp53基因组结构示意图；

图7是RT-PCR、电泳分析Saos-2细胞感染rAdMH-khp53后p53 mRNA的表达；

图8是rAdMH-khp53感染鼻咽癌细胞后24小时，Western blot的分析结果；

图9是重组腺病毒rAdMH-khp53体外抑癌活性；

图10是重组腺病毒rAdMH-khp53体内抑癌活性。

具体实施方式：

下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。

实施例1：重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒的构建

1)带有Kozak规则序列的人p53肿瘤抑制基因编码序列(简称为khp53)的获得：根据已发表的人野生型p53 cDNA全序列，设计合成两条引物，上游引物5’-ATA GGATCC A CCATGGAGG AGC CGC AGT C 3’，下游引物5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’，(上下游引物中均插入BamHI酶切位点GGATCC和酶切保护碱基ATA，并在上游引物BamHI酶切位点GGATCC后加入一个A碱基，最后是人p53 cDNA中起始密码子ATG前两个碱基CC以后的序列，即CCATGG AGG AGC CGC AGT C，这样由BamHI酶切位点GGATCC中的CC碱基，添加的A碱基以及人p53 cDNA中自有的CCATGG，就构成了Kozak规则序列CCACCATGG)，以人p53 cDNA为模板，采用TaKaRa LA Taq^TM DNA聚合酶，通过PCR扩增人p53肿瘤抑制基因编码区，其中，反应条件为：第一步，94℃变性2分钟，第二步，94℃变性30秒，第三步，45℃退火40秒，第四步，72℃延伸60秒，第五步，回到第二步，共30个循环，第六步，72℃延伸5分钟，第七步，4℃保存。由此得到大量的1206bp人p53基因编码片段，并带有Kozak规则序列，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2。

2)khp53肿瘤抑制基因编码序列的克隆和测序：将带有Kozak规则序列的人p53基因PCR产物直接与T载体连接，转化JM109宿主菌，铺于含X-gal，IPTG，Amp的琼脂平皿中，长出许多蓝色和白色菌落，挑蓝色，白色克隆各六个，均扩增2ml，热裂解菌液制备PCR模板，以上游引物5’-AGCACTGTCC AACAACACCA 3’，下游引物5’-ATA GGATCC ATG TCA GTCTGA GTC AG 3’，PCR扩增人p53肿瘤抑制基因编码区内277bp的特异片段来鉴定克隆中是否插入了人p53肿瘤抑制基因，结果蓝色克隆无277bp片段PCR产物，为空载体，白色克隆均有277bp片段PCR产物；然后小提PCR鉴定阳性克隆质粒，BamHI酶切、电泳，在线性化T载体条带前产生约为1200bp的条带，证实T载体中插入了两端带有BamHI酶切位点的人p53肿瘤抑制基因编码区片段，将该质粒命名为pUCm-khp53，双向测序，与预期结果一致。

3)腺病毒穿梭载体pDCn15(io)-khp53的构建：扩增、提取质粒pUCm-khp53和腺病毒穿梭载体pDCn15(io)，均用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离所需基因片段和线性化载体，切胶回收、纯化目的片段，紫外定量，按插入片段与载体的摩尔比为3∶1的比例，混合，T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌，按2)的方法初筛出阳性克隆，再以上游引物5’-ACA TCC ACT TTG CCT TTC TC 3’，下游引物5’-GG GAC AGC ATC AAA TCA TCC3’，PCR鉴定基因插入方向，然后小提PCR鉴定阳性克隆质粒，BamHI酶切、电泳，在线性化穿梭载体条带前产生约为1200bp的条带，如图3所示，证实载体中插入了两端带有BamHI酶切位点的人p53肿瘤抑制基因编码区片段，最后-20℃保存基因正向插入的阳性克隆，该克隆命名为pDCn15(io)-khp53。

4)重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒毒种的制备：pDCn15(io)-khp53，腺病毒基因组骨架DNA等质粒的大量扩增、提取、纯化和定量；293IQ细胞的复苏、扩增和铺板，Lipofectamine2000转染试剂介导pDCn15(io)-khp53与腺病毒基因组骨架DNA共转染293IQ细胞，同时设阴性对照，8天后共转染孔293IQ细胞出现细胞病变效应(CPE)，而阴性对照孔293IQ细胞生长正常，初步可以断定有重组腺病毒产生，至第10天，共转染孔293IQ细胞完全病变，如图4所示；收集病变细胞及上清，-20℃～37℃之间反复冻融三次，-20℃保存备用。

实施例2：重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒的鉴定、克隆化、大量扩增、纯化及制备临床级基因药物制剂

1)重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒的鉴定：以上游引物：5’-TCG TTT CTC AGC AGCTGT TG 3’，下游引物：5’-CAT CTG AAC TCA AAG CGT GG 3’，PCR扩增Ad5基因组特异片段(11-13.4mu，860bp)来鉴定所产病毒是否为5型腺病毒；以上游引物5’-AGCACTGTCC AACAACACCA 3’，下游引物5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’，PCR扩增人p53肿瘤抑制基因编码区内277bp的特异片段来鉴定该5型腺病毒中是否插入了人p53肿瘤抑制基因，结果如图5所示，共6个克隆，均为5型腺病毒，并都带有人p53肿瘤抑制基因。

2)重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒毒种的克隆化：293IQ细胞用MEM培养液制成浓度为1×10⁵cells/ml的悬液，以100μl/孔接种于96孔板；同时按10倍稀释制备病毒稀释液分别感染上述细胞，37℃，CO₂孵箱中培养10天，倒置显微镜下观察，判断并记录最高稀释度CPE情况，收集只产生一个空斑的单孔细胞及上清，-20℃～37℃之间反复冻融三次后，在293IQ细胞上进一步扩增，作为克隆化的的重组腺病毒种子，其结构如图6所示。将该重组腺病毒命名为“E1、E3缺失的5型重组腺病毒rAdMH-khp53”，简称为rAdMH-khp53，2005年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国，武汉，保藏编号为，CCTCC-V200508。

3)重组腺病毒的大量扩增及保存：于37℃，5％CO₂的条件下，用Φ15cm细胞培养皿培养293IQ细胞(培养基：MEM+10％FBS)，共100个皿，待细胞长至80-90％汇合状态时加入20μl种子病毒液，将细胞置回37℃，5％CO₂的条件下继续培养、观察，待所有细胞出现病变后，吹打悬浮细胞，收集细胞悬液于离心管中，于800-1000rpm离心5min收集细胞，每300cm²收集的细胞沉淀用2ml的腺病毒保存液(1×PBS²⁺+10％甘油)悬浮，-20℃～37℃之间反复冻融三次，4℃、2000rpm离心10min收集上清，经0.45/0.2μm膜过滤，-20℃保存备用。

4)离子交换层析法纯化及制备临床级重组腺病毒基因药物制剂：使用AKTA^TMexplorer 100全自动色谱系统，层析条件为：20ml Q Sepharose XL色谱柱，洗脱液为1M NaCl，50mMTris/HCl，pH8.0，5％甘油，线性梯度从0到100％，共400ml(20个柱体积)，根据色谱图收集重组腺病毒组份，最后用0.1M NaOH洗柱；纯化后的重组腺病毒再经脱盐，调整pH值，0.2μm滤膜过滤除菌，分装，最后保存于-80℃冰箱。

实施例3：重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒的滴度测定、腺病毒颗粒数的测定及在人恶性肿瘤细胞中的基因表达分析

1)TCID50方法测定重组腺病毒滴度：293IQ细胞用MEM培养液制成浓度为1×10⁵cells/ml的悬液，以100μl/孔接种于96孔板；同时按10倍稀释制备病毒稀释液分别感染上述细胞，每排前10个孔分别加入100μl同一浓度的病毒稀释液，第11、12孔加入等体积2％BCS的MEM做阴性对照。37℃，CO₂孵箱中培养10天，倒置显微镜下观察，判断并记录CPE情况，最后按公式计算出重组腺病毒的滴度，T＝10^1+d(S-0.5)IU/ml，其中d＝Log10(稀释倍数)＝1，S＝从第一次稀释起的阳性比率之和(每个孔的值，阳性为0.1，阴性则为0)，2次平行实验得到的滴度值相差应≤10^0.7＝5，简化后该公式成为T＝10^S+0.5IU/ml。结果，两个96孔板的S值分别为8.8和8.6，滴度分别为2.00×10¹⁰IU/ml和1.26×10¹⁰IU/ml，均值为1.63×10¹⁰IU/ml。

2)紫外吸收法测定腺病毒颗粒数：取重组腺病毒液250μl，加等体积0.2％SDS溶液裂解，振荡混匀，56℃水浴中放置10分钟；等温度降至室温时，瞬时离心。以病毒保存液与0.2％SDS溶液等体积混合液作空白对照，测定波长260nm和280nm处的吸光值，平行实验2次，按公式计算出病毒颗粒数：A260×稀释倍数×1.1×10¹²。测定结果表明，这批rAdMH-khp53的病毒颗粒数为4.6×10¹¹VP/ml

3)RT-PCR检测p53基因表达：复苏、培养人骨肉瘤Saos-2细胞(不表达p53基因)和人肺癌A549细胞(表达野生型p53基因)，分别铺6cm细胞培养皿(Saos-2细胞铺2个，A549细胞铺1个)，rAdMH-khp53重组腺病毒按10MOI感染一个皿的Saos-2细胞，10小时后，用Trizol reagent(invitrogen)按试剂盒提供的方法提取Saos-2、Saos-2+rAdMH-khp53、A549细胞的总RNA；用Fermentas Rebert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit按试剂盒提供方法合成Saos-2、Saos-2+rAdMH-khp53、A549细胞的cDNA第一链；以各细胞的cDNA第一链为模板PCR扩增p53特异片段，同时PCR扩增看家基因GAPDH的特异片段作为内对照，并设空白对照；琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物，紫外下照相，结果如图7所示。

4)SDS-PAGE，Western blot检测P53蛋白表达：提取类似3)处理细胞的总蛋白，定量；配制15％的聚丙烯酰胺凝胶，进行蛋白电泳；剪下NC膜和两片Whatman滤纸，并和两片海绵一同在转移缓冲液中浸泡5分钟；电转移装置安装好后，在50毫安电流下转膜过夜；转膜后，用PBS洗涤2分钟，在5％BSA的PBS中封闭30分钟；加入5毫升一抗(含5％BSA的PBS稀释至1∶500)在摇床上孵育1小时；用PBS洗涤5次，每次5分钟；加HRP-鼠抗人p53二抗，稀释到1∶1000(含5％BSA的PBS稀释)在摇床上孵育30分钟；用PBS洗涤5次，每次5分钟：将膜放入DAB显色液中，室温下轻轻摇动。观察显色反应，当条带达所需深度时(1～3分钟)立即用水洗膜，最后将膜转入PBS溶液中，取出照相，结果如图8所示。

实施例4：重组khp53肿瘤抑制基因智能腺病毒在体外和体内对人恶性肿瘤细胞的生长抑制

1)MTT测定细胞存活率实验：在96孔板上按5000个细胞/孔接种恶性肿瘤细胞(人肺癌A549细胞，人肝癌HepG2细胞，人乳腺癌MCF-7细胞，人鼻咽癌HNE-1细胞，人卵巢癌SK-OV-3，人宫颈癌Hela细胞等)，待完全贴壁后，用不同MOI(0，2.5，5，10，25，50，100，250)的rAdMH(无外源基因)、rAdMH-LacZ(带有β-半乳糖苷酶基因)和rAdMH-khp53分别感染细胞.4天后，弃去培养液，每孔加入150μL(0.5 mg/mL)的MTT溶液，37℃作用4 h后弃去；再加入150 μ L/孔LDMSO，放水平摇床上摇10min，在570nm波长下测定A值，结果rAdMH-khp53对各恶性肿瘤细胞有明显的杀伤作用，以人肺癌A549细胞为例，基因治疗组的存活细胞显著减少，如图9所示。

2)rAdMH-khp53基因药物治疗裸鼠移植瘤实验：选用9只裸鼠，分别于前背部、右后背部和左后背部不同部位皮下注射0.1ml含5×10⁶人肺癌A549细胞PBS悬液；肿瘤接种6天后，于不同部位肿瘤小结节(或肿瘤接种部位)内分别注射0.1ml的1×10⁸IU的rAdMH-khp53(右后背部)、rAdMH-LacZ(前背部)及空白对照液PBS(左后背部)。每隔2天注射1次，共注射6次，每次注射前测量肿瘤体积，观察24天。结果基因治疗组的瘤体显著缩小，如图10所示。实验完成后处死实验动物，切取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑等组织，固定，石蜡包埋，组织切片，免疫组化分析动物体内重组腺病毒导入靶组织与非靶组织的分布情况，结果小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等组织结构完好，无明显损伤，肿瘤组织中能看到重组腺病毒的存在，而非肿瘤组织中则没有腺病毒。

整个真核表达装置的序列表如下：

G₁AGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAAT

CAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTT

TTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACG

TACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCATTTAATTAAAACGCCAT

GTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAAC

GGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATG

GGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATAT

TGGCACTCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGT

CG₄₈₁GTACCGTCGGAATTGTGAGCGGATAACAATTGGTACC₅₁₈GTCGCAGTCTTCGGTCTG

ACAACGCAGAT₅₅₅CGAATTGGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCA₅₈₀AGGTAGGCTGAGCAC

CGTGGCCACCGTAGGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTG

CTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGC

AGGCTTGAGATCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTC

TCCACAGGTGTCCACTCCCAGG₇₉₅TCCAACCGAATTCAAGCTGCTAGCAAGGATG₈₂₆CACC

A₈₃₁TGG₈₃₄AGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTT

TCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCA

ATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGT

CCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCT

CCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCC

CAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCC

AAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAG

ACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCC

ATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCAT

GAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGA

AATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCC

TATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAAC

AGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGAC

TCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCATGTTTGTGCCTGTCCTGGG

AGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTG

CCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGTCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAG

AAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAG

ATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCA

GGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGC

CATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA₂₀₁₂CATGGATCCAGCT

TGTCGACT₂₀₃₃TCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG

CATCACAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAA

ACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCC₂₁₇₁

注解：

1-555 MCMV 启动子

481-518 Operator

586-795 Intron

826-834 Kozak 规则序列

831-2012 p53 基因编码序列

2033-2171 SV40 PolyA 加尾信号

Claims (8)

1、一种智能腺病毒载体与khp53基因的重组体，其特征在于，该重组体是利用DNA重组技术，将人野生型p53基因cDNA改造为Kozak序列引导的人p53基因编码序列，并将其正向插入真核基因表达装置，最后在真核细胞中经位点特异的同源重组，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中超高表达人p53基因的重组腺病毒。

2、如权利要求1所述的重组体，其特征在于，所述真核基因表达装置是由真核细胞启动子-操纵子-内含子-Kozak序列-人p53基因编码序列-PolyA加尾信号所构成。

3、如权利要求2所述的重组体，其特征在于，所述真核细胞启动子为鼠的巨细胞病毒立即早期启动子(MCMV)。

4、如权利要求2所述的重组体，其特征在于，所述操纵子为大肠杆菌的乳糖操纵子。

5、如权利要求2所述的重组体，其特征在于，所述Kozak序列为CCACCATGG。

6、如权利要求1所述的重组体，其特征在于，该重组体是在真核细胞中经位点特异的同源重组获得的，首先将已克隆并鉴定的带有Kozak序列的人p53编码序列正向插入腺病毒穿梭载体pDCn15(io)中，再与带有大部分腺病毒基因组的骨架质粒DNA共转染表达乳糖阻遏子的293细胞(293IQ细胞)，进而产生超高表达人p53基因的复制缺陷型腺病毒。将该重组腺病毒命名为“E1、E3缺失的5型重组腺病毒rAdMH-khp53”，简称为rAdMH-khp53，保藏编号为，CCTCC-V200508。

7、如权利要求1所述的重组体，其特征在于，该重组体能有效地抑制和杀灭肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌以及宫颈癌等癌细胞。

8、如权利要求1所述的重组体，其特征在于，该重组体可用于制备临床使用的抗肿瘤药物制剂。

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