CN102786596A - 一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv及其应用，属于医学生物学领域，尤其涉及一种携带单链抗体编码基因KGH-R1-ScFv的重组人腺病毒载体Ad-hrGFP-ScFv。本发明的单链抗体能够特异性、广谱性识别并拮抗不同来源、不同组织、不同细胞株中的p21Ras蛋白；能够在体外抑制高表达p21Ras蛋白的人肿瘤细胞的增殖能力和侵袭能力，降低分裂期细胞的比例，能够在小鼠体内抑制高表达p21Ras蛋白的人肿瘤细胞移植瘤的生长。

Description

一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv及其应用

技术领域

本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv及其应用。 

背景技术

肿瘤，尤其是恶性肿瘤，严重危害着人类的生命健康。开展恶性肿瘤的防治研究，对于预防肿瘤的发生、降低肿瘤发生率、减少死亡率、指导临床治疗等，都具有十分重要的现实意义。 

Ras基因是一种重要的原癌基因，参与多种肿瘤的发生与发展。其表达产物Ras蛋白作为重要的分子开关，参与细胞的增生、生长、分化、凋亡。研究表明，ras基因突变和（或）Ras蛋白过表达与肿瘤的发生与发展关系非常密切，在多种肿瘤的病变过程中起着非常重要的作用。因此，人们对Ras基因、Ras蛋白及其参与的信号转导通路进行了较为深入的研究。 

Ras基因是最早发现的原癌基因之一，最早发现于Harvery鼠肉瘤病毒和Kirsten鼠肉瘤病毒。Ras基因在进化中相对保守，广泛存在于各种真核生物中。哺乳动物的Ras基因家族有三个成员，即H-ras，K-ras，N-ras，在人染色体中，它们分别定位于11p14.1，12p12.1/12q24.2，1p13.2染色体上。Ras基因具有相似的结构，均由四个外显子组成，分布于全长约30kb的DNA上，编码由188-189个氨基酸组成的分子量为21KD的蛋白质，故称为p21Ras蛋白。 

p21Ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，定位于细胞膜内侧。p21Ras蛋白有较弱的GTP酶活性，与GTP和GDP有很强的亲和性。正常情况下，p21Ras与GDP结合并没有活性。当细胞外的生长分化因子把信号传导到胞膜内侧的p21Ras蛋白时，可增强p21Ras蛋白与GTP的结合活性，使p21Ras蛋白成为激活状态，信号系统开放。因为GTP酶活性的存在，p21Ras蛋白可使GTP水解成GDP，p21Ras蛋白成为失活状态，信号系统关闭。p21Ras蛋白和GDP结合后，可以激活鸟苷酸释放蛋白(GNRP)，GNRP使p21Ras蛋白释放GDP而结合GTP。因此，通过GTP和GDP的相互转换可以有节制地调节p21Ras蛋白对信号系统的开启和关闭，完成对细胞因子信号传导过程的调节。 

Ras原癌基因被激活后成为有致癌活性的癌基因。Ras基因激活的方式有3种：基因点突变、基因大量表达、基因插入和转位。Ras基因被激活后，其表达产物Ras蛋白的构型也发生改变，与GDP的结合能力减弱，与GTP结合后不需外界生长信号的刺激即可活化；同时Ras蛋白内在的GTP酶活性降低，导致Ras蛋白与GTP/GDP结合、调节的异常，活化状态的Ras蛋白持续地激活下游信号通路，导致细胞不可控制地增殖、恶变，同时细胞凋亡减少。 

随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，肿瘤形成的生物学过程得到进一步阐明，肿瘤治疗的新的生物治疗模式被逐渐应用于临床并显示了良好的疗效。肿瘤生物治疗又分为肿瘤免疫治疗和肿瘤基因治疗。基因治疗是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷、异常引起的疾病，达到治疗目的。随着细胞信号转导和抗体工程技术的发展，还诞生了细胞内抗体技术。细胞内抗体是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室（如胞核、胞浆或某些细胞器），与特定的靶分子作用（干扰或阻断靶分子的加工、分泌或功能）从而发挥其生物学功能的一类新的工程抗体。 

用于肿瘤生物治疗的完整抗体由于分子量较大，其血管通透性弱、扩散入肿瘤内能力差、半衰期长、免疫原性强，而限制了其靶向传递及肿瘤拮抗应用效果。细胞内抗体细胞内表达的特点提供了一种有效的拮抗p21Ras蛋白这类定位于细胞膜内侧的蛋白的方法。制备出一种细胞内抗体，能够在肿瘤细胞内表达抗p21Ras蛋白产物，阻断肿瘤细胞中p21Ras蛋白信号转导途径，限制肿瘤的生长和扩散，有望达到治疗Ras蛋白引起的各类肿瘤的目的。 

发明内容

本发明提供了一种抗p21Ras蛋白的单链抗体编码基因序列，以及该序列的应用。 

本发明的一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv，其特征在于该抗体编码基因序列如SEQ ID NO1所示。 

SEQ ID NO1： 

>KGH-R1-ScFv (DNA)

GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAATCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAAAAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATCCCCATTACTCCGGTAGTAGCCGCCTGTTTGTTAACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGAGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGCAAATCAAACGGGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG

>KGH-R1-ScFv (Amino acid)

AAQPAMAQVKLQESGEGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAIISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNTKKNLYLQMSSLRSEDTAMYYCARDPHYSGSSRLFVNWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWQIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA-

所述的单链抗体基因被插入pMD19-T(D102A，从Takara公司获得)载体并转化大肠杆菌DH5α ，获得的大肠杆菌DH5α  KGH-R1-ScFv（Escherichia coli DH5α  KGH-R1-ScFv），于2011年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为中国武汉武汉大学），保藏号CCTCC NO：M2011322。 

所述的单链抗体基因插入人腺病毒Ad5并转染HEK293细胞后获得重组人腺病毒载体Ad-hrGFP-ScFv，于2012年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为中国武汉武汉大学），保藏号CCTCC NO：V201219。 

为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案： 

1、单链抗体编码基因轻、重链可变区的扩增：

以抗p21Ras蛋白的杂交瘤细胞株KGH-R1（于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏号CCTCC NO：C201197）的cDNA为模板，使用小鼠特异的抗体基因扩增引物分别扩增抗体编码基因的轻、重链可变区，并通过重叠延伸PCR使用柔性寡核苷酸将扩增的轻、重链可变区片段连接成完整的单链抗体编码基因。

2、重组噬菌体质粒文库的构建： 

通过PCR的方法对扩增得到的单链抗体编码基因引入酶切位点，再通过酶切酶连的方式将单链抗体编码基因连接入带有同样酶切位点的噬菌体载体pCANTAB-5E (从Pharmacia公司获得)，从而构建得到重组噬菌体质粒文库。

3、噬菌体单链抗体展示文库的构建： 

将重组噬菌体质粒文库转化大肠杆菌TG1 (从Lucigen公司获得)，得到单链抗体初始文库。加入辅助噬菌体M13KO7 (27-1524, 从GE healthcare公司获得)，收集培养液上清，得到噬菌体单链抗体展示文库。

4、阳性噬菌体的分离： 

通过间接ELISA的方法，以p21Ras蛋白为抗原包被细胞培养板，以噬菌体单链抗体展示文库为抗体对包被细胞培养板的抗原进行结合。加入大肠杆菌TG1对与抗原结合的噬菌体进行释放，加入辅助噬菌体M13KO7，培养后分离上清，得到富集筛选的阳性噬菌体。重复富集筛选过程2遍，得到阳性噬菌体。阳性噬菌体重新转化大肠杆菌TG1后，对所提取质粒进行测序，得到插入片段序列，即单链抗体KGH-R1-ScFv编码基因序列。

5、单链抗体的可溶性表达： 

转化大肠杆菌TG1的阳性克隆经IPTG（从Sigma公司获得）诱导后，加入溶菌酶对菌体进行裂解，所得上清即为可溶性表达的单链抗体。

6、单链抗体抗原结合特性的检测： 

收集19株不同的肿瘤细胞株，分别是人胃癌细胞株BGC-853、MKN28，人肝癌细胞株QGY-7703、SMMC-7721、HepG2，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病细胞株THP-1、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宫颈癌细胞株HeLa，人喉鳞癌细胞株Hep-2，人卵巢癌细胞株SKOV3，人结直肠癌细胞株HCT116，人膀胱癌细胞株T-24（19株细胞株均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），按常规免疫组化程序进行制片，以可溶性表达的单链抗体为一抗，HRP/Anti-E-tag (ab3415-250, 从GE healthcare公司获得)为二抗，鉴定单链抗体的抗原结合特性。

7、重组腺病毒质粒的构建： 

通过PCR的方法对鉴定的单链抗体编码基因引入酶切位点，再通过酶切酶连的方式将鉴定的单链抗体编码基因连接入带有同样酶切位点的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1 (从Stratagene公司获得)。重组穿梭质粒经Pme I (从Takara公司获得)酶切线性化、去磷酸化处理后，电转化BJ5183-AD-1 (从Stratagene公司获得)细胞。线性的重组穿梭质粒与BJ5183-AD-1细胞内已经存在的骨架质粒pAdEasy-1（ D102A，从Takara公司获得）发生同源重组，产生重组腺病毒质粒。

8、重组腺病毒的制备： 

对重组腺病毒质粒进行Pac I酶切，回收酶切产生的约30 Kb大小的酶切片段。将回收的酶切片段混合转染试剂Lipofectamine^TM 2000，转染HEK293细胞（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。转染成功后HEK293细胞中将包装出成熟腺病毒，从而获得重组人腺病毒载体Ad-hrGFP-ScFv。

9、细胞内抗体的定位： 

重组腺病毒感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）细胞后，在细胞内产生单链抗体。通过融合在单链抗体末端的FLAG标签检测其在细胞内的定位。 

10、体外抑瘤试验： 

用重组腺病毒感染高表达p21Ras蛋白的人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞BEL-7402、人结肠癌细胞SW480、人卵巢癌细胞OVCAR3，以及低表达p21Ras蛋白的人卵巢癌细胞SKOV3（以上均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）：（1）加入MTT对细胞进行培养，通过测定OD490光吸收值，绘制细胞活力曲线，分析细胞内抗体对肿瘤细胞活力的影响；（2）将肿瘤细胞制备成单细胞悬液，以一定的细胞密度接种后，在含20%新生牛血清的RPMI 1640培养液中培养2-3周。吉姆萨染液染色后，倒置显微镜下计数细胞克隆数，分析细胞内抗体对肿瘤细胞增殖能力的影响；（3）将感染的肿瘤细胞以一定的细胞密度接种于基质胶Matrigel包被的Transwell微孔膜上表面，培养48 h后，用棉签擦去微孔膜上表面细胞，使用95%乙醇固定微孔膜下表面细胞。苏木素染色后，倒置显微镜下计数微孔膜下表面细胞数目，分析细胞内抗体对肿瘤细胞侵袭能力的影响；（4）加入预冷的75%乙醇，4℃固定细胞过夜。加入PI染液对细胞进行染色，使用流式细胞仪收集细胞PI荧光信号，分析细胞内抗体对肿瘤细胞周期分布的影响。

11、体内抑瘤试验： 

将肿瘤细胞BEL-7402、SW480、SKOV3（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）注射接种SPF级4周龄雌性Balb/c裸鼠，裸鼠成瘤后进行瘤内多点腺病毒注射。每3天注射1次，共注射7次。注射后对裸鼠进行观察，每隔一天称量裸鼠体重，并测量裸鼠瘤体长、短径，计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。分析细胞内抗体对肿瘤生长的抑制作用。

附图说明

图1 为PCR扩增抗体编码基因的轻、重链可变区； 

M：Marker，条带大小依次为600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp；1-2：重链可变区；3-4：轻链可变区。

图2为 轻、重链可变区连接而成的单链抗体基因电泳，M：DL2000。 

图3 为ELISA筛选表达抗p21Ras蛋白单链抗体的重组噬菌体克隆； 

H-ras、K-ras、N-ras蛋白分别作为抗原包被酶标板，每孔包被0.5 μg。1：200稀释的噬菌体上清(100 μl)作为一抗，1：2000稀释的HRP/Anti-M13 Monoclonal Ccojugate (100 μl)作为二抗，100 μl TMB显色。阳性对照使用1：2000稀释的抗p21Ras蛋白单克隆抗体上清(100 μl)为一抗，羊抗鼠IgG (1:2000稀释，100 μl)为二抗；空白对照使用PBS溶液；阴性对照使用辅助噬菌体M13KO7上清。酶标仪内读取每孔OD450值。

图4为细胞内抗体对肿瘤细胞活力的影响图。 

图5为细胞内抗体对肿瘤细胞增殖能力的影响图。 

图6为细胞内抗体对肿瘤细胞侵袭能力的影响图。 

图7为细胞内抗体对肿瘤细胞周期分布的影响图。 

具体实施方式

实施例1：一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv及其应用，其获得的技术方案如下： 

1、抗p21Ras杂交瘤细胞株总RNA提取及cDNA合成

1.1 总RNA提取

收集培养至对数生长期的杂交瘤细胞（于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：C201197），使用Trizol (从Mrcgene公司获得)，按照试剂使用说明，提取杂交瘤细胞总RNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。NanoDrop 2000 (从Thermo公司获得)分光光度计测定总RNA浓度。

1.2 cDNA合成 

使用RevertAid^TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (从Fermentas公司获得)，按照试剂盒使用说明，对1.1中所提取总RNA进行反转录。

 2、杂交瘤细胞抗体编码基因轻、重链可变区扩增 

2.1 抗体编码基因轻链可变区扩增

使用小鼠来源特异的Light Primer Mix (27-1583-01, 从GE healthcare公司获得)，以1.2中合成的cDNA为模板，PCR扩增抗体编码基因轻链可变区，操作参照试剂使用说明。所得产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测电泳条带大小。

2.2 抗体编码基因重链可变区扩增 

同2.1，使用Heavy Primers 1, 2 (27-1586-01, 从GE healthcare公司获得)，PCR扩增抗体编码基因重链可变区。

2.3 轻、重链可变区连接构建ScFv基因片段 

使用DNA纯化回收试剂盒(DP214-02, 从Tiangen公司获得)，按照试剂盒使用说明，对2.1和2.2中PCR产物进行纯化回收。利用重叠延伸PCR原理，使用Linker-Primer Mix (27-1588-01, 从GE healthcare公司获得)，按照试剂使用说明，将回收纯化的轻、重链可变区基因片段连接成ScFv基因，结构为V_H-Linker-V_L。

 3、重组噬菌体单链抗体展示文库构建 

3.1 ScFv基因酶切位点引入

使用RS Primer Mix (27-1589-01, 从GE healthcare公司获得)，按照试剂使用说明，对2.3中所得ScFv基因进行PCR扩增，引入酶切位点。5’端酶切位点为Sfi I，3’端酶切位点为Not I。

3.2 ScFv基因连接噬菌体表达载体pCANTAB-5E 

Sfi I和Not I (从Fermentas公司获得)顺序酶切3.1中所得ScFv基因和噬菌体表达载体pCANTAB-5E (从Pharmacia公司获得)。酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切效果，并切胶纯化回收(DP214-02, 从Tiangen公司获得)酶切后的ScFv基因片段和表达载体pCANTAB-5E。按照基因片段比载体3：1的比例，使用T4 DNA Ligase (从Fermentas公司获得)连接酶切后的载体和ScFv基因片段。

3.3 单链抗体初始文库构建 

将3.2中所得重组载体转化大肠杆菌TG1 (从Lucigen公司获得)，转化条件参照E.coli Competent Cells DH5α (D9057A, 从Takara公司获得)使用说明书，培养控制温度为30℃，转化产物涂布SOB平板(SOB-AG，含100 μg/ml Ampicillin和2% Glucose)。30℃培养过夜后，收集平板上菌落于2×YT培养液(2×YT-AG，含100 μg/ml Ampicillin和2% Glucose)。加入甘油至终浓度为25%，分装保存于-80℃。所得即为单链抗体初始文库。

3.4重组噬菌体单链抗体展示文库构建 

取3.3中所得初始文库，于2×YT-AG培养液中培养至对数生长期。参照试剂使用说明，加入适量辅助噬菌体M13KO7 (27-1524, 从GE healthcare公司获得)，30℃共培养1 h。离心后重悬沉淀于2×YT培养液(2×YT-AK，含100 μg/ml Ampicillin和50 μg/ml Kanamycin)，30℃培养过夜。离心后收集上清，加入1/5体积的PEG8000 (从Meker公司获得)。离心后用适量PBS重悬沉淀，加入甘油至终浓度为25%，分装保存于-80℃。所得即为噬菌体单链抗体展示文库。

 4、阳性噬菌体的富集筛选 

以下部分详细步骤参考Recombinant Phage Antibody System (RPAS，从GE Healthcare公司获得)说明书。

4.1 阳性噬菌体富集 

将3.4中所得PBS重悬的噬菌体单链抗体库加入到10 μg/ml p21Ras蛋白包被的细胞瓶中，37℃培养2 h。使用PBS溶液(PBS-T，含0.05% Tween-20)洗瓶3次，再继续用PBS溶液洗瓶3次。所得即为富集的阳性噬菌体。

4.2 噬菌体释放 

于4.1富集阳性噬菌体的细胞瓶中加入适量处于对数生长期的大肠杆菌TG1，30℃培养1 h。离心后重悬沉淀于2×YT-AG培养液，铺2×YT-AG平板。30℃培养过夜后，收集平板上菌落于2×YT-AG培养液，培养至对数生长期。加入适量辅助噬菌体M13KO7，30℃共培养1 h。离心后重悬沉淀于2×YT-AK培养液，30℃培养过夜。离心后收集上清，加入1/5体积的PEG8000。离心后用适量PBS重悬沉淀，再次离心，上清过0.45 μm孔径滤膜后，加入甘油至终浓度为25%，保存于-80℃。此即为经过第一轮富集筛选的阳性噬菌体。

4.3 纯化富集 

重复上述富集筛选过程 4.1和4.2，2遍，所得噬菌体用于进一步分析。

4.4 单克隆分离 

于 4.3所得噬菌体中加入对数生长期的大肠杆菌TG1，30℃培养1 h。离心后重悬沉淀于2×YT-AG培养液，铺2×YT-AG平板。30℃培养过夜后，将平板上分离良好的单克隆挑入每孔含400 μl 2×YT-AG培养液的48孔板内。每孔取40 μl加入到一块新的48孔培养板内，加入辅助噬菌体M13KO7 (5×10¹⁰ pfu/ml) 400 μl。30℃培养2 h，至液体变浑浊。将平板离心，小心吸除上清。每孔加入400 μl 2×YT-AK培养液，30℃培养过夜。将平板离心，所得上清即为单克隆噬菌体液。

 5、阳性单克隆噬菌体鉴定 

5.1间接ELISA法鉴定阳性重组克隆

将 4.4中所得噬菌体上清加入到每孔0.5 μg p21Ras蛋白包被的96孔酶标板中。37℃反应1 h后，PBS-T溶液洗板3次。加入二抗HRP/Anti-M13 Monoclonal Ccojugate (27-9421-01, 从GE healthcare公司获得) 100 μl (1：2000稀释)，37℃反应0.5 h。PBS-T溶液洗板3次，再蒸馏水洗板2次。加入100 μl TMB，于暗处显色。明显着色孔即为阳性单克隆噬菌体。

5.2 菌液PCR法鉴定阳性重组克隆 

以5.1所鉴定阳性噬菌体上清为模板，以pCANTAB-5E载体外源插入片段上下游S1、S6引物为鉴定引物，对噬菌体载体外源插入片段进行PCR扩增，鉴定插入片段大小。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。其中，S1引物序列为：5'-CAACGTCAAAAAATTATTAT TCGC-3'，S6序列为：5'-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3'。

5.3 外源插入片段测序 

使用DNA纯化回收试剂盒，按照试剂盒使用说明，对5.2中PCR产物进行纯化回收。回收产物连接pMD19-T载体(D102A，从Takara公司获得)，筛选的阳性克隆送华大基因公司(BGI)测序，相关操作按照试剂使用说明。所得测序序列去除载体序列后即为目的单链抗体KGH-R1-ScFv的编码基因序列。用测序克隆转化大肠杆菌DH5α，获得的DH5α KGH-R1-ScFv，于2011年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2011322。

 6、单链抗体的可溶性表达及鉴定 

6.1 单链抗体的可溶性表达

经5.1鉴定阳性噬菌体后，于4.4中吸取对应的单克隆培养液进行扩大培养。30℃培养至OD600=0.8，离心。小心去除上清，加入新鲜配制的2×YT培养液(2×YT-AI，含100 μg/ml Ampicillin和1mM IPTG)，诱导可溶性的单链抗体表达，30℃培养过夜。离心后去上清，用PBS悬浮菌体沉淀，加入溶菌酶(从Sigma公司获得)使其终浓度为1U/μl。消化10 min后离心，所得上清即为可溶性表达的单链抗体。

6.2 单链抗体相对分子量鉴定 

对6.1所得到的可溶性表达的单链抗体进行SDS-PAGE，鉴定单链抗体的相对分子量。将6.1所得上清上样于1×SDS溶液，25mA电泳。室温下，置于摇床上，异丙醇固定15 min，考马斯亮蓝染色2 h，10%乙酸脱色过夜。显色完后对照蛋白分子量标准(Marker)分析单链抗体相对分子量大小。

6.3 单链抗体的抗原结合特性 

收集对数生长期的肿瘤细胞株，共19株，包括：人胃癌细胞株BGC-853、MKN28，人肝癌细胞株QGY-7703、SMMC-7721、HepG2，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病细胞株THP-1、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宫颈癌细胞株HeLa，人喉鳞癌细胞株Hep-2，人卵巢癌细胞株SKOV3，人结直肠癌细胞株HCT116，人膀胱癌细胞株T-24（分别购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库/昆明细胞库，或云南省天然药物重点实验室）。

收集上述细胞株于离心管内，离心后去除上清，用生理盐水洗涤细胞沉淀。再次离心，用95%乙醇重悬细胞。再次离心去除上清后，重新加入95%乙醇，固定细胞3 h。小心取出肿瘤细胞块，按常规石蜡切片程序进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化、及抗原高压修复。对制备好的肿瘤细胞切片进行免疫细胞化学检测，以6.1所得到的可溶性表达的单链抗体为一抗，HRP/Anti-E-tag (ab3415-250, 从GE healthcare公司获得)为二抗，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）对底物作用显色，鉴定单链抗体的抗原结合特性。 

结果显示，可溶性表达的单链抗体与除白血病细胞株以外的其他肿瘤细胞株呈不同程度的免疫阳性，说明制备的单链抗体具有广谱的肿瘤细胞株的免疫能力。 

 7、重组腺病毒的构建 

7.1 重组穿梭质粒的构建

以5.3所鉴定的连接有单链抗体编码基因的pMD19-T载体质粒为模板，用末端分别带有Bgl II和Xho I酶切位点的正反引物(5'-GAAGATCT TCATGGCCCAGGTGAA-3'和5'-CCCTCGAG GGCGGCGGGCAAACTAA-3')进行PCR扩增。扩增得到的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用DNA纯化回收试剂盒回收纯化750 bp大小长度的目的条带。使用Bgl II和Xho I限制性内切酶分别双酶切回收的PCR产物和穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1 (从Stratagene公司获得)，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，切胶纯化回收经双酶切的PCR产物和穿梭质粒。使用T4 DNA Ligase连接回收后的PCR产物和穿梭质粒，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物铺LB-卡那霉素平板，37℃培养过夜。挑取分散良好的转化菌落，用穿梭质粒的载体引物pShuttle-F (5'-CTCACGGGGATTTCCAAGTC-3')和pShuttle-R (5'-ATGCAGTCGTCGAGGAATTG-3')对菌落进行PCR鉴定。使用TIANprep Mini质粒提取试剂盒(DP103-02，从Tiangen公司获得)对经PCR鉴定阳性的菌落提取质粒，使用Bgl II和Xho I对提取的质粒做进一步的酶切鉴定。对酶切鉴定阳性的质粒进行测序，以保证插入片段的序列完整性。

7.2 重组腺病毒质粒的构建 

将7.1鉴定的重组穿梭质粒进行Pme I酶切，使其线性化。线性化的重组穿梭质粒回收纯化后，对其进行CIAP (从Fermentas公司获得)处理，使其去磷酸化。将去磷酸化处理的线性重组穿梭质粒电转化BJ5183-AD-1 (从Stratagene公司获得)感受态细胞，转化菌液涂布LB-卡那霉素平板，37℃培养过夜。线性的重组穿梭质粒与BJ5183-AD-1细胞内存在的骨架质粒pAdEasy-1发生同源重组，产生重组腺病毒质粒使用Pac I对重组腺病毒质粒进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切产生的片段大小。线性重组穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1同源重组后，能够产生约30 kb大小的Pac I酶切片段。

7.3 重组腺病毒制备 

参照试剂使用说明，混合7.2过程中制备的Pac I酶切产生的约30 kb大小的片段于Lipofectamine^TM 2000 (从Invitrogen公司获得)中，将转染试剂同HEK293细胞（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）共同孵育。转染后24 h，倒置荧光显微镜下对转染的细胞进行观察，如可见明显绿色荧光，则说明转染成功。在HEK293细胞中包装出成熟腺病毒。获得的重组人腺病毒载体Ad-hrGFP-ScFv，于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：V201219。

7.4 腺病毒纯化 

转染后10-14天，绝大部分HEK293细胞出现肿胀、变圆、脱落、聚集成团的细胞病变效应时，收集细胞。将细胞悬液进行离心，PBS溶液洗涤、悬浮细胞。将细胞于-80℃甲醇/37℃水浴中反复冻融，4次，每次冻、融各约5 min。离心后收集上清，分装保存于-80℃。所得即为腺病毒原液。腺病毒原液经氯化铯密度梯度离心进一步纯化。该法所得腺病毒满足进一步实验的要求。

 8、细胞内抗体的定位 

将7.4所制备的腺病毒按感染复数MOI=100感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），重组腺病毒感染细胞后，其质粒携带的基因在细胞内表达，能够通过绿色荧光信号检测到细胞内腺病毒的存在，通过融合在单链抗体末端的FLAG标签的检测知道插入的外源单链抗体编码基因的表达及其在细胞内的定位。通过细胞爬片的方法使对数生长期的MDA-MB-231细胞固定在载玻片上，腺病毒感染细胞36h后，对载玻片上的细胞进行免疫反应，加入一抗Anti-FLAG (R) M2 Antibody (2368, 从Cell Signaling Technology公司获得)，二抗Rhodamine-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (ZF-0316, Biomarket公司获得)，免疫反应结束后在激光共聚焦显微镜FV1000下分别观察hrGFP和Rhodamine所激发荧光以及两者的共聚焦荧光在细胞内的定位。

 9、细胞内抗体对癌细胞的抑制研究 

9.1 细胞活力的检测

将7.4所制备的腺病毒感染高表达p21Ras蛋白的人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞BEL-7402、人结肠癌细胞SW480、人卵巢癌细胞OVCAR3，以及低表达p21Ras蛋白的人卵巢癌细胞SKOV3。同时，设立空载体病毒组以及空白对照组。腺病毒感染细胞24 h、36 h、48 h、72 h、96 h后，加入MTT。培养4 h后，弃MTT，加入DMSO，低速振荡10 min。测定每个样品的OD490光吸收值，每个样品设3个重复。以感染时间为横轴，OD490光吸收值为纵轴，绘制细胞活力曲线，分析肿瘤细胞感染腺病毒后表达的细胞内抗体对其活力的影响，比较高表达与低表达p21Ras蛋白的肿瘤细胞株对该细胞内抗体的敏感性。

9.2 细胞增殖能力的检测 

实验细胞生长良好、汇合度达到80%时，对其进行腺病毒感染，同时设立空载体病毒组对照。实验细胞包括MDA-MB-231细胞、BEL-7402细胞、SW480细胞、OVCAR3细胞、SKOV3细胞（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。感染24h后使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，用含20%新生牛血清(从Gibco公司获得)的RPMI 1640 (从Hyclone公司获得)培养液悬浮细胞制成单细胞悬液，以250、500、750个细胞的密度分别接种于6孔板，每个样品设3个重复，培养2-3 周。吉姆萨染液染色后，倒置显微镜BX41下计数细胞克隆（单个克隆的细胞数大于50）数目，计算克隆形成率。分析比较肿瘤细胞感染腺病毒后表达的细胞内抗体对其增殖能力的影响。

克隆形成率(%)=克隆数/接种的细胞数×100%。 

9.3 细胞侵袭能力的检测 

按试剂使用说明，使用基质胶Matrigel (从BD Matrigel^TM公司获得)包被细胞小室Transwell微孔膜。同9.2，对MDA-MB-231细胞、BEL-7402细胞、SW480细胞、OVCAR3细胞、SKOV3细胞（均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）进行腺病毒感染。感染24 h后使用胰蛋白酶消化细胞，用含2%新生牛血清的RPMI 1640培养液悬浮细胞制成单细胞悬液，以3×10⁴个细胞的密度接种于基质胶Matrigel包被的Transwell微孔膜上表面。在嵌套Transwell微孔膜的24孔板孔中加入含20%新生牛血清的RPMI 1640培养液，培养48 h。用棉签轻轻擦去微孔膜上表面细胞后，使用95%乙醇固定微孔膜下表面细胞。苏木素染色后，倒置显微镜下计数微孔膜下表面细胞数目。分析比较肿瘤细胞感染腺病毒后表达的细胞内抗体对其侵袭能力的影响。

9.4 细胞周期的检测 

通过流式细胞术碘化丙锭(PI, 从Beckman公司获得)染色法检测细胞内DNA含量，将不同细胞的细胞周期时相区分为G0/G1期，S期，G2/M期，计算各时相的百分率。同9.2，对MDA-MB-231细胞、BEL-7402细胞、SW480细胞、OVCAR3细胞、SKOV3（均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）细胞进行腺病毒感染。感染48h后使用胰蛋白酶消化细胞，吹打成单细胞悬液。每个实验组取1×10⁶个细胞，使用预冷的PBS溶液洗涤细胞2次。加入预冷的75%乙醇，4℃固定细胞过夜。再次使用预冷的PBS溶液洗涤细胞2次。加入PI染液对细胞进行染色，30 min。使用流式细胞仪通过流式细胞术收集细胞PI荧光信号，其中激发光波长为488 nm，发射光波长为620 nm，每个样品收集多于10000个荧光信号。使用MultiCycle DNA软件分析细胞荧光强度、细胞周期分布，并计算细胞增殖指数。分析比较肿瘤细胞感染腺病毒后表达的细胞内抗体对其细胞周期分布的影响。

(Proliferation Index, PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) ×100%。 

 10、细胞内抗体对肿瘤生长的抑制研究 

10.1 裸鼠肿瘤模型的建立

实验细胞BEL-7402、SW480、SKOV3生长良好、汇合度达到80%时，使用胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS溶液洗涤细胞后将细胞密度调整成10⁷个细胞/200 μl，作为单次注射用量。将制备好的细胞注射接种于SPF级4周龄雌性Balb/c裸鼠，每种肿瘤细胞接种10只，裸鼠成瘤后用于细胞内抗体对肿瘤生长的抑制研究。

10.2 细胞内抗体对肿瘤生长的抑制研究 

裸鼠注射接种成瘤后对其进行分组，每组5只。瘤体直径达到0.5 cm时，对其进行瘤内多点腺病毒注射，同时设立空载体病毒组对照。注射量为3×10⁸ pfu/只，每3天注射1次，共注射7次。注射后对裸鼠进行观察，每隔一天称量裸鼠体重，并测量裸鼠瘤体长、短径，计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。分析比较肿瘤注射腺病毒后表达的细胞内抗体对其生长的抑制。

瘤体体积=1/2×长径×短径² 。

    SEQUENCE LISTING

 

<110>  杨举伦

 

<120>  一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  822

<212>  DNA

<213>  KGH-R1-ScFv (DNA)

 

<400>  1

gcggcccagc cggccatggc ccaggtgaag ctgcaggagt ctggggaagg cttagtgaag        60

 

cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggat tcactttcag tgactattac            120

 

atgtattggg ttcgccagac tccggaaaag aggctggagt gggtcgcaat cattagtgat          180

 

ggtggtagtt acacctacta tccagacagt gtgaaggggc gattcaccat ctccagagac          240

 

aataccaaga aaaacctgta cctgcaaatg agcagtctga ggtctgagga cacagccatg         300

 

tattactgtg caagagatcc ccattactcc ggtagtagcc gcctgtttgt taactggggc            360

 

caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc         420

 

ggtggcggat cggacatcga gctcactcag tctccagctt ccttagctgt atctctgggg           480

 

cagagggcca ccatctcata cagggccagc aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat           540

 

atgcactgga accaacagaa accaggacag ccacccagac tcctcatcta tcttgtatcc           600

 

aacctagaat ctggggtccc tgccaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcacc           660

 

ctcaacatcc atcctgtgga ggaggaggat gctgcaacct attactgtca gcacattaga            720

 

gagcttacac gttcggaggg gggaccaagc tggcaaatca aacgggcggc cgcaggtgcg         780

 

ccggtgccgt atccggatcc gctggaaccg cgtgccgcat ag                                    822

 

 

<110>  杨举伦

     

<120>  一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  2

<211>  273

<212>  DNA

<213>  KGH-R1-ScFv (Amino acid)

 

<400>  1

aaqpamaqvk lqesgeglvk pggslklsca asgftfsdyy mywvrqtpek rlewvaiisd          60

 

ggsytyypds vkgrftisrd ntkknlylqm sslrsedtam yycardphys gssrlfvnwg           120

 

qgttvtvssg gggsggggsg gggsdieltq spaslavslg qratisyras ksvstsgysy             180

 

mhwnqqkpgq pprlliylvs nlesgvparf sgsgsgtdft lnihpveeed aatyycqhir            240

 

eltrseggps wqikraaaga pvpypdplep raa                                                   273

Claims (3)

1.一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv，其特征在于该抗体编码基因序列如SEQ ID NO1所示。

2.如权利要求1所述的一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv，其特征在于所述的单链抗体基因被插入pMD19-T(D102A，从Takara公司获得)载体并转化大肠杆菌DH5α ，获得的大肠杆菌DH5α  KGH-R1-ScFv，于2011年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2011322。

3.如权利要求1所述的一种抗p21Ras蛋白的单链抗体KGH-R1-ScFv，其特征在于所述的单链抗体基因转染HEK293细胞后获得重组人腺病毒载体Ad-hrGFP-ScFv，于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：V201219。

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