CN103880959A - 一种抗p21ras蛋白的单链抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单链抗体及其在抑制高表达p21ras蛋白的人肿瘤细胞中的应用。该单链抗体的基因片段是由p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴细胞的轻、重链可变区基因片段通过柔性寡核苷酸链(Linker)连接而构建。对上述单链抗体进行可溶性表达，经ELISA及免疫组化等实验证实该单链抗体对三种p21ras蛋白具有广谱识别、特异性强，亲和性高的特性。用该单链抗体构建出的细胞内抗体能够抑制高表达p21ras蛋白的人肿瘤细胞的增殖及侵袭能力，并且能够在小鼠体内抑制高表达p21ras蛋白的人肿瘤细胞移植瘤的生长。证明该单链抗体可用于构建细胞内抗体等小分子抗体，为相关肿瘤的治疗研究提供一个新的途径。

Description

一种抗p21ras蛋白的单链抗体及其应用

技术领域

本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体及该抗体在p21ras基因相关的肿瘤诊断及治疗方面的应用。

背景技术

ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三个主要成员，即H-ras、K-ras、N-ras，分别定位于第12、11和1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即p21ras蛋白，三种p21ras蛋白的氨基酸序列约有85％的同源性。

p21ras蛋白作为及其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。p21ras蛋白合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。p21ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合，p21ras蛋白中GTP结合与在GTP酶激活蛋白作用下水解为GDP之间的循环形成了一种分子开关机制，即通过鸟嘌呤核苷酸不同形式的结合形成不同的激酶构象，也即ras蛋白的活性和非活性形式。p21ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的p21ras-GTP形式，从而激活p21ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱。

当ras基因发生突变或p21ras蛋白过表达或GTP酶激活蛋白缺失或生长因子受体活化及ras下游效应子的突变或扩增，均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras基因过表达，部分学者认为p21ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要作用。

用于肿瘤生物治疗的完整抗体由于分子量较大，其血管通透性弱，扩散入肿瘤内能力差，半衰期长，毒性高而限制了其靶向传递及肿瘤拮抗应用效果。利用基因工程技术构建的单链抗体(single chain fragment vriable,ScFv)是用柔性寡核苷酸片段连接完整抗体的可变区构建的线性片段，分子量只有完整抗体的1／6；渗透力强；在非靶向组织中滞留时间短、易从体内清除；且免疫原性低，用于人体几乎不会产生抗鼠抗体反应；容易在原核表达系统中表达获得，易于基因操作和基因工程大量生产，实用性强。将ScFv基因用病毒载体等导入非淋巴细胞内，通过偶联定位信号序列，定向表达于亚细胞器(如细胞核、细胞浆或内质网)而构建的抗体称为细胞内抗体。通过p21ras-Anti-ScFv单链抗体基因制备出的细胞内抗体，能够在肿瘤细胞内表达抗p21ras蛋白产物，阻断肿瘤细胞中p21ras蛋白信号转导途径，限制肿瘤的生长和扩散，可用于靶向治疗过表达p21ras蛋白的肿瘤，有望达到治疗p21ras蛋白过表达引起的各类肿瘤的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗p21ras蛋白的单链抗体p21ras-Anti-ScFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该抗p21ras蛋白单链抗体p21ras-Anti-ScFv是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；重链可变区如SEQ ID NO：2中第1至118位所述氨基酸残基序列；轻链可变区如SEQ ID NO：2中第150位至259位所示氨基酸残基序列。

本发明中所述编码抗p21ras蛋白的单链抗体的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，由重链可变区的编码序列、连接肽的编码序列和轻链可变区的编码序列组成，重链可变区的编码序列如SEQ ID NO：1中第1至354位所示核苷酸序列；所述轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO：1中第448至777位所示核苷酸序列。

本发明的另一目的是将抗p21ras蛋白的单链抗体应用在制备与p21ras基因相关的肿瘤药物中，为相关肿瘤的治疗研究提供了一个新的选择。

本发明还提供了一种重组噬菌体质粒，该重组噬菌粒由单链抗体基因与噬菌粒表达载体pCANTAB-5F连接而成。

本发明还提供了融合及可溶性表达目的单链抗体的宿主大肠杆菌TG1及BL21(DE3)，该宿主菌分别转化含有目的片段的重组噬菌体质粒。

本发明还提供了一种重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-ScFv，该载体嵌合了所述单链抗体的编码基因，能够在与骨架质粒pAdEasy-1重组并包装为完整的腺病毒KGHV100后，在细胞内编码出具有活性的抗p21ras蛋白单链抗体。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

本发明抗p21ras蛋白的单链抗体能广谱拮抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白；该单链抗体作为制备双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体研究的基础材料，用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。

本发明抗p21ras蛋白单链抗体的制备方法及其应用，具体步骤如下：

(1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过p21ras蛋白免疫后的Balb／c小鼠脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链(Linker)和所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段；

(2)在单链抗体的基因片段两端分别引入不同的酶切位点并与同步双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒。将鉴定连接正确的重组噬菌粒转化大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13K07进行挽救，通过噬菌体展示技术将目的单链抗体基因片段与表达载体中的gIII基因融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出阳性重组噬菌粒；

(3)将筛选获得的阳性重组噬菌粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，从而获得与E-tag标签融合表达的抗p21ras蛋白的可溶性单链抗体，以该单链抗体为一抗，以抗E-tag抗体为二抗，采用间接ELISA和免疫细胞化学法检测目的单链抗体的特异性及亲和力，证实该单链抗体可特异性识别并结合三种p21ras蛋白；

(4)将单链抗体的编码基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1(购自Stratagene公司)，将重组穿梭质粒转化入已存在腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(购自Takara公司)的BJ5183-AD-1细胞(购自Stratagene公司)内，通过同源重组产生重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体酶切线性化后转染HEK293细胞，从而得到包装成熟的重组腺病毒KGHV100；

(5)将重组腺病毒KGHV100转染至MDA-MB-231细胞，通过FLAG融合标签检测其在细胞内的定位。再将重组腺病毒转染至高表达p21ras蛋白的肿瘤细胞内，通过检测细胞侵袭及增殖能力、流式细胞术等分析细胞内抗体在体外对肿瘤细胞的抑制作用；

(6)将肿瘤细胞接种Balb／c裸鼠，待裸鼠成瘤后，对瘤体进行多点腺病毒注射。观察肿瘤生长情况，分析细胞内抗体在体内对肿瘤生长的抑制作用。

本发明的有益成果：本发明创造性地直接从经过p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴细胞内扩增获得抗体的轻、重链基因，通过噬菌体展示技术和间接ELISA简单、高效的获得了具有高亲和力与特异性的抗p21ras蛋白的ScFv片段。将该单链抗体基因克隆到腺病毒载体后，将包装成熟的KGHV100病毒感染表达p21ras蛋白的肿瘤细胞，确定了单链抗体在细胞内的表达情况，同时分别在体外和体内研究了细胞内抗体对肿瘤细胞的生长抑制作用。结果表明其在体外可以显著影响肿瘤细胞的生长能力、侵袭能力和增殖能力等，在体内可以显著抑制肿瘤的形成、生长及转移，并且没有明显的毒副作用，为今后肿瘤的诊断及治疗提供了一种新途径。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明直接从经过p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴细胞内扩增获得抗体的轻、重链基因。与传统单链抗体的制备方法相比，减少了杂交瘤细胞株的制备过程。

(2)本发明所筛选出的单链抗体，具有抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白的广谱抗性，并且抗体比目前已知的抗p21ras蛋白抗体的特异性和亲和力高。

(3)本发明还提供了p21ras-Anti-ScFv单链抗体的原核表达系统，表达出了具有高特异性和亲和力的抗p21ras蛋白单链抗体。使简单、大量的制备抗p21ras蛋白抗体成为可能，能够有效降低生产抗体的成本，让p21ras-Anti-ScFv单链抗体的应用更具有前景。

(4)本发明还提供了在p21ras-Anti-ScFv单链抗体基础之上的细胞内抗体，为p21ras-Anti-ScFv单链抗体在细胞内的应用奠定了基础，也为高表达p21ras蛋白肿瘤的治疗研究提供了一个新的途径。

附图说明

图1为本发明p21ras蛋白免疫Balb／c小鼠的脾B淋巴细胞总RNA电泳图，M：DL2000，泳道1、2为平行样品；

图2为本发明小鼠脾B淋巴细胞cDNA扩增的轻、重链可变区片段电泳图，M：DNAMaker I，泳道1-3为扩增出的重链可变区条带，泳道4-5为扩增出的轻链可变区条带；

图3为本发明构建的单链抗体基因片段，M：DL2000，泳道1：单链抗体条带；

图4为本发明含单链抗体基因重组噬菌体表达载体的Sfi I、Not I双酶切鉴定电泳图，M：DL2000，泳道1-4：双酶切后的重组噬菌粒条带，均为平行样品；

图5为本发明SDS-PAGE检测可溶性表达单链抗体的电泳图，M：14.4-94KDa蛋白质分子量标准，泳道1-2：可溶性单链抗体，均为平行样品；

图6为本发明重组穿梭质粒的Bgl II、Xho I双酶切鉴定电泳图，M：DL2000，1：未酶切的pShuttle-IRES-hrGFP质粒，2：双酶切含单链抗体的重组穿梭质粒条带；

图7为本发明含有单链抗体重组腺病毒载体的Pac I酶切鉴定电泳图，M：λHind III，1：未酶切的重组腺病毒载体，2：经过Pac I酶切的重组腺病毒载体条带；

图8为本发明单链抗体在细胞内表达的激光共聚焦定位图，绿色荧光为Flag标签蛋白的分布，红色荧光为单链抗体的分布；

图9为本发明细胞内抗体对不同肿瘤细胞的克隆形成率的影响；

图10为本发明细胞内抗体对不同肿瘤细胞的侵袭能力的影响；

图11为本发明细胞内抗体对BEL-7402肿瘤细胞在小鼠体内成瘤实验的影响；

图12为本发明细胞内抗体对SW480肿瘤细胞在小鼠体内成瘤实验的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：单链抗体基因片段的制备

1、p21ras蛋白免疫Balb／c小鼠：取5只鼠龄在6-8周的Balb／c小鼠(购自重庆第三军医大学实验动物中心)，每只注射100μg的本实验室经过原核表达纯化后的p21ras-K蛋白(p21ras-K蛋白的制备方法参照论文《重组p21ras蛋白的表达、鉴定与纯化及其多克隆抗体的制备》)，初次注射加等量的完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第二次注射，剂量同第一次，加等量不完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第三次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。两周后进行第四次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。3天后取其脾脏，用10ml灭菌的D-Hank's液冲洗研碎的脾脏。用滴管吸取培养皿内细胞的悬液，移入50ml离心管中，1000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为所需要的小鼠脾B淋巴细胞。

2、小鼠脾B淋巴细胞总RNA的提取和逆转录合成cDNA：将已分离得到的小鼠脾B淋巴细胞，使用传统的Trizol法提取总RNA。提取的具体步骤参照分子克隆指南(第三版)。最后将提取出的RNA尽快放在-80℃冰箱中。提取出的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。可见提取的总RNA的28S、18S、5S亚基大小正确，条带清晰无明显杂带，可用于下游的反转录实验。电泳图见附图1。

反转录使用购自Fermentas公司的反转录试剂盒，具体步骤参见说明书操作。反转录出的cDNA可保存于-20℃冰箱。

3、重叠延伸PCR合成单链抗体基因片段：扩增小鼠轻、重链可变区引物和重叠延伸PCR构建单链抗体的Linker引物等均使用购自GE healthcare公司的重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System，RPAS)。首先在PCR管内加入下列试剂进行轻链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA4μl；10×PCR Buffer5μl；dNTP(10mM)5μl；轻链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。另一只PCR管内加入下列试剂进行重链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA4μl；10×PCR Buffer5μl；dNTP(10mM)5μl；重链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。将上述体系配制好后放入PCR仪经95℃，5分钟；(94℃30秒，55℃45秒，72℃1分钟，30个循环)；72℃10分钟，结束反应。将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。可见扩增的重链可变区大小约为350bp，轻链可变区大小约330bp，与预期一致，电泳图见附图2。

将大小正确的条带进行切胶纯化，胶回收的步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书操作；将纯化后的条带再次取2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟，确定胶回收后DNA的质量和大致浓度。

用Linker引物连接扩增的轻重链可变区并在连接产物两端引入Sfi I和Not I酶切位点：通过重叠延伸PCR法用Linker混合物将纯化后的相同摩尔量的轻重链可变区片段进行连接，连接产物在RS Primers(酶切位点引物)作用下在重链的5’末端加上Sfi I限制性位点和轻链的3’末端加上Not I酶切位点，可用于后续与有相同酶切位点的表达载体pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)进行连接。具体步骤参照GE healthcare公司的RPAS系统说明书。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见单链抗体条带大小约780bp，与预期一致，条带集中，清晰无杂带，电泳图见附图3。目的条带进行切胶纯化及纯化后的浓度测定。对所构建好的单链抗体命名为p21ras-Anti-ScFv。

4、单链抗体基因片段的克隆：将构建出的单链抗体片段p21ras-Anti-ScFv连入pMD-18T载体(购自TAKARA公司)，构建出pMD-ScFv重组质粒。在200μl PCR管中配制如下连接体系：pMD-18T载体1μl；目的片段DNA0.1pmol-0.3pmol；Solution I补足10μl。金属浴16℃反应4小时。将连接产物加入到100μl DH5α感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后立即冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于含有X-Gal的LB／Amp平板上37℃倒置培养10小时。

5、菌液PCR鉴定阳性重组子：挑取LB／Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH₂O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR的模板。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer2.5μl；dNTP Mix(2.5mM each)2μl；M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH₂O14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的930bp处出现条带，确定为阳性重组克隆。

实施例2：单链抗体库的建立及筛选鉴定

1、重组噬菌粒的构建

1.1重组pMD-ScFv载体及表达载体的双酶切：将经PCR鉴定正确的阳性pMD-ScFv克隆提取质粒，提取步骤按天根质粒小提试剂盒说明书操作。将重组的pMD-ScFv质粒及表达载体质粒pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)分别先进行Sfi I酶切，在200μl PCR反应管内分别加入表达载体质粒／pMD-ScFv载体各30μl；Sfi I酶(10U／μl)4μl；10×Buffer M5μl，ddH₂O11μl，上述体系配置好后50℃反应4小时。将酶切产物经过胶回收纯化后，在新的200μlPCR反应管中加入纯化产物30μl，Not I酶(10U／μl)2μl，10×Buffer H5μl，BSA2μl，Trion X-1002μl，ddH₂O9μl，上述体系配置好后37℃反应4小时。酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，重组的pMD-ScFv质粒双酶切后在780bp处出现目的条带，表达载体质粒双酶切后在3.5kb处出现目的条带。目的条带分别进行切胶纯化，步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。

1.2重组表达载体的连接：将经过Sfi I和Not I同步双酶切后的表达载体pCANTAB-5E与ScFv目的片段按摩尔比1∶5进行连接，从而构建出含有单链抗体基因的重组表达载体pCANTAB-ScFv。连接总体积为10μl，16℃反应4小时。将连接产物全部加入100μl的TG1感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后再冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于LB／Amp平板上37℃倒置培养10小时。

1.3重组表达载体的鉴定：挑取LB／Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH₂O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR反应的模板。PCR鉴定插入片段使用表达载体pCANTAB-5E的通用引物，S1F：CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC，S6R：GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer2.5μl；dNTPs(2.5mM each)2μl；S1F(10μM)0.5μl，S6R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH₂O14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的950bp处出现条带。将重组表达载体pCANTAB-ScFv进行Sfi I和Not I分步双酶切，可见在3.5kb和780bp处有酶切条带，确认为阳性重组克隆，电泳图见附图4。

2噬菌体抗体库的富集和筛选

2.1噬菌体抗体库的富集：按细菌数量与辅助噬菌体数量1∶20的比例加入辅助噬菌体M13K07(购自GE healthcare公司)于鉴定为阳性含有pCANTAB-ScFv的重组子菌液内，放恒温摇床内37℃，150rpm，培养2小时。当看到液体变浑浊时，放入离心机内，室温下1500g离心25分钟，弃上清。用2×YTAK液重悬沉淀，37℃，200rpm，过夜振荡培养。所得的液体即为经过富集后的噬菌体培养液。

2.2间接ELISA法筛选单链抗体的特异性：将所得培养液室温下低速离心25分钟，吸取上清，上清内加入1／5体积的10％脱脂奶粉封闭液，室温下放置10分钟。用PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将p21ras-H、N、K蛋白分别稀释至5μg／ml，在每个酶标板孔内加入100μl稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，每孔加入0.15M PBS-Tweenz(磷酸盐-吐温)洗涤缓冲液300μl，置振荡摇床上振摇3分钟，弃孔内液体，重复洗涤3次。每孔加入1％BSA-PBS封闭液100μl，置37℃恒温培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100μl适当稀释的融合表达的单链重组噬菌体克隆上清为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1∶2000稀释的酶标二抗(HRP标记的抗M13gSp蛋白)100μl新鲜配制的TMB(四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M H₂SO₄50μl终止反应。使用酶标仪读取OD₄₅₀值，凡待测孔值／阴性对照孔值≥2即为阳性。

3、单链抗体的可溶性表达及鉴定

3.1单链抗体的可溶性表达：将经过ELISA筛选出的含有阳性重组噬菌体的菌液重新扩大培养至OD₆₀₀≈0.8。将培养好的菌液提取质粒，步骤按QIAGEN质粒小提试剂盒说明书进行。将3μl各个质粒分别转化至100μl BL21(DE3)感受态中。挑取阳性单克隆接于5ml的LB／Amp液体培养基中培养，取前一次的培养菌液按1／100比例加入到1L新的LB／Amp液体培养基中培养至OD₆₀₀≈0.8。收集培养后的菌体，用灭菌PBS缓冲液重悬菌体，加入100U／μl溶菌酶使溶菌酶终浓度达到1U／μl，室温放置15分钟，4℃，12000rpm，离心30分钟后收集上清。

3.2可溶性表达单链抗体的鉴定

3.2.1SDS-PAGE确定单链抗体的相对分子量：在上一步所得的上清中加入一定量的2×SDS上样缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4mg／ml，混合液在沸水浴中加热10分钟，冷却后即可上样进行电泳。电泳完毕，取出分离胶放在盛有去离子水的容器中，加热沸腾后取出。加入快速染色液浸没分离胶即可，在脱色摇床上摇10分钟，当蛋白条带已可见时弃染色液。再次加入约50ml的水，加热沸腾2分钟，停止加热继续在脱色摇床上摇30分钟后观察结果。结果可见在30KDa处出现目的条带，与预期一致，电泳图见附图5。

3.2.2免疫细胞化学法检测可溶性表达的单链抗体与肿瘤细胞株的结合特异性及敏感性：采用人肝癌细胞株HepG2，人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人胃癌细胞株MKN-28，人结肠直肠癌细胞株HCT116，人卵巢癌细胞株SKOV3，人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF-7共10种肿瘤细胞株；将呈对数生长期的10种肿瘤细胞株收集于离心管内，离心弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，离心弃上清，用95％乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95％乙醇中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入制备的可溶性单链抗体作为一抗，抗E-tag抗体作为二抗(购自Abcam公司)，通过SP法检测肿瘤细胞表达p21ras蛋白的情况。结果显示制备的可溶性单链抗体可与上述所有肿瘤细胞株呈不同程度的阳性反应，显示了良好的广泛的抗肿瘤细胞株谱系。

4、将鉴定结果正确的单链抗体进行测序：将可溶性表达结果正确含有单链抗体基因重组pMD-ScFv载体的菌液送测序公司测序，DNA测序结果表明单链抗体的基因序列排列方式为V_H-Linker-V_L，与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对后发现序列符合小鼠轻重链可变区基因结构，具体序列见SEQ ID NO：1。

实施例3：细胞内抗体的构建及对肿瘤细胞的抑制实验

1、重组腺病毒载体的构建

1.1重组穿梭质粒pShuttle-ScFv的构建：以连接有单链抗体编码基因的pMD-ScFv重组质粒为模板，用末端分别带有Bgl II和Xho I酶切位点的正向引物(5’-GAAGATCTCCGGACATGGACCAGGTGAA-3’)和反向引物(5’-CCCTCGAGACCTAGCGCGTCTGCGGCTGC-3’)扩增单链抗体基因片段。扩增得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用DNA纯化回收试剂盒回收纯化780bp大小长度的目的条带。使用Bgl II和Xho I分别同时双酶切PCR产物和穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1(购自Stratagene公司)，1％琼脂糖电泳检测酶切是否完全，使用天根DNA纯化试剂盒切胶回收完全双酶切的PCR产物和穿梭质粒。使用T4DNALigase连接回收后的PCR产物和酶切后的穿梭质粒，连接产物转化DH5α感受态，转化产物涂布于LB／Kan平板，37℃培养12小时，构建出重组穿梭质粒pShuttle-ScFv。挑取单菌落，用穿梭质粒载体的通用引物pShuttle-F(5'-CTCACGGGGATTTCCAAGTC-3’)和pShuttle-R(5'-ATGCAGTCGTCGAGGAATTG-3’)进行菌落PCR鉴定。将鉴定为阳性的重组克隆接于5ml的LB／Kan液体培养基中培养至OD₆₀₀≈0.8左右，使用天根质粒小提试剂盒提取质粒。使用Bgl II和Xho I对提取的质粒做进一步的酶切鉴定，酶切结果见附图6。对酶切鉴定阳性的质粒进行测序，选择没有突变的含有插入片段的重组穿梭质粒进行后续实验。

1.2重组腺病毒载体的构建：将鉴定结果正确的重组穿梭质粒pShuttle-ScFv进行Pme I酶切，将线性化的重组穿梭质粒回收纯化后，使用小牛碱性磷酸酶(购自TAKARA公司)去磷酸化。将去磷酸化的线性重组穿梭质粒电转化BJ5183-AD-1(购自Stratagene公司)感受态，转化菌液涂布LB／Kan平板，37℃培养12小时。线性的重组穿梭质粒pShuttle-ScFv与BJ5183-AD-1细胞内已存在的骨架质粒pAdEasy-1发生同源重组，产生重组腺病毒载体。使用天根质粒小提试剂盒提取重组腺病毒载体，用Pac I对重组腺病毒载体进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切后的片段大小。线性重组穿梭质粒pShuttle-ScFv与骨架质粒pAdEasy-1同源重组后，能够产生约30kb和4.5kb或3kb大小的Pac I酶切片段，酶切结果见附图7。

2、重组腺病毒KGHV100的制备

2.1重组腺病毒载体转染293细胞：用50μl高糖DMEM稀释0.8μg上一步过程中纯化的经Pac I酶切产生的约30kb大小的重组片段，再用50μl高糖DMEM稀释2μl的Lipofectamine^TM2000(购自Invitrogen公司)，室温孵育5分钟。将稀释的酶切片段和Lipofectamine^TM2000混合，混匀后室温孵育20分钟。取出铺好的24孔培养板，弃原培养液，换为400μl无血清的高糖DMEM，然后向每孔滴加100μl转染混合物，混匀后将培养板放回培养箱内。培养6小时后，吸除旧培养液，每孔更换500μl含5％FBS的高糖DMEM。转染后24小时，荧光显微镜下观察有无绿色荧光。

2.2病毒原液的制备及纯化：将经过观察有绿色荧光的转染细胞继续培养10-14天，当几乎所有细胞呈现肿胀、变圆、脱落，聚集成团，即细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时，收集细胞，制备病毒原液。取出细胞培养板，吹打培养液制备细胞悬液，吸入离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清，再用少量PBS重悬细胞沉淀。将细胞悬液于-80℃甲醇浴／37℃水浴反复冻融4次，每次冷冻或解冻约5分钟，每次解冻后剧烈涡旋振荡十秒。12000g离心10分钟，所得上清即为病毒原液。将收集的病毒液，用腺病毒纯化试剂盒(购自CELL BIOLABS公司)回收重组腺病毒。由于试剂盒纯化腺病毒滴度过低，无法满足下一步实验要求，所以通过双重氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩重组腺病毒。先用不连续密度梯度离心将细胞污染物和一些缺陷性病毒颗粒去除，然后用连续密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒完全分开。最后用透析法去除浓缩病毒液中的氯化铯，该法所得重组腺病毒KGHV100满足进一步实验的要求。

3、细胞内抗体的定位：单链抗体片段末端带有Flag标签蛋白，可用兔源性的抗Flag抗体作为一抗，以罗丹明标记的山羊抗兔IgG作为二抗检测细胞内抗体在高表达p21ras蛋白肿瘤细胞内的表达、定位情况。将贴壁生长的MDA-MB-231细胞用0.25％胰蛋白酶消化后收集，以合适的细胞密度(10⁵／张)将细胞接种于载玻片上。待细胞贴壁良好时按MOI=100加入上一步已制备好的腺病毒KGHV100，病毒感染24h后取出玻片。4％多聚甲醛固定后0.25％、0.5％Tween-20透化细胞、封闭液封闭、加入一抗Anti-FLAG(R)M2Antibody(购自Cell Signaling Technology公司)4℃孵育过夜，再加入二抗Rhodamine-Conjugated GoatAnti-Rabbit IgG(购自Biomarket公司)室温下避光孵育2小时后封片。在奥林巴斯共聚焦显微镜下分别观察hrGFP和Rhodamine所激发的绿色荧光和红色荧光，以确定细胞内抗体的表达及定位情况。结果显示绿色荧光均匀分布于MDA-MB-231细胞胞质内，说明所构建的细胞内抗体进入细胞，并且绿色荧光蛋白正确表达；红色荧光主要分布于细胞膜内侧，说明细胞内抗体在细胞膜内表达。同时，p21ras蛋白定位于细胞膜内侧，说明细胞内抗体表达的位置与p21ras蛋白在细胞膜内的分布一致，激光共聚焦扫描图见附图8。

4、细胞内抗体的体外抑瘤实验

4.1细胞增殖能力的检测：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。一般情况下，每个克隆可含有50个以上的细胞，大小在0.3～1.0mm²之间。通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增值能力做定量分析。本次实验取生长良好、汇合度达到80％的细胞，对其进行腺病毒KGHV100的感染，同时设立空载体病毒组对照。实验细胞包括MDA-MB-231细胞、BEL-7402细胞、SW480细胞和OVCAR3细胞。腺病毒感染24h后使用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，用含20％胎牛血清(购自Gibco公司)的RPMI1640(购自Hyclone公司)培养液悬浮细胞制成单细胞悬液，以200、500、800个细胞的密度分别接种于6孔板，每个样品设3个重复，培养2-3周，当出现肉眼可见的克隆时终止培养。用PBS缓冲液漂洗细胞，甲醇固定，吉姆萨染液染色后，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。分析比较肿瘤细胞感染腺病毒KGHV100后表达的细胞内抗体对其增值能力的影响。实验结果显示上述高表达p21ras的肿瘤细胞，感染腺病毒KGHV100后形成的克隆数目明显减少，克隆形成率大大降低，只有感染空载体病毒对照组的一半。这表明所表达的细胞内抗体能有效降低高表达p21ras肿瘤细胞系的克隆形成能力，高度抑制细胞增殖活性，结果见附图9。

4.2细胞侵袭能力的检测：肿瘤细胞通过膜表面特定受体与基质或基底膜的层连蛋白(1aminin，LN)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和IV型胶原等相连，然后肿瘤细胞可释放蛋白水解酶激活基质中已存在的酶原，使基质成分降解，最后肿瘤细胞运动而填充到被水解的基质的空隙处，如此三个过程不断重复肿瘤细胞不断向深层侵袭。具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可穿过多孔滤膜而附着在膜的下室侧面，通过给细胞染色、镜下计数细胞、进行统计学比较以确定肿瘤细胞的侵袭能力。

按试剂使用说明，用提前预冷的PBS缓冲液将50mg／L的Matrigel(购自BD MatrigelTM公司)稀释后包被细胞小室Transwell微孔膜，每孔加入60μl。用腺病毒KGHV100分别感染MDA-MB-231细胞、BEL-7402细胞、SW480细胞和OVCAR3细胞。感染24小时后使用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞沉淀，用含2％胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮细胞制成单细胞悬液，以3×10⁴个细胞的密度接种于基质胶Matrigel包被的Transwell微孔膜上表面。在嵌套Transwell微孔膜的24孔板中加入含20％胎牛血清的RPMI1640培养液，培养48小时。用棉签轻轻擦去微孔膜上层细胞后，使用95％乙醇固定微孔膜下层细胞15分钟。苏木素染色后，无水乙醇、蒸馏水漂洗，室温晾干后显微镜下计数微孔膜下层细胞数目。分析比较肿瘤细胞感染腺病毒KGHV100后表达的细胞内抗体对其侵袭能力的影响。结果显示上述高表达p21ras的肿瘤细胞感染腺病毒KGHV100后肿瘤侵袭能力下降至对照组的一半左右，与对照组相比具有显著的统计意义(P<0.05)，结果见附图10。

4.3细胞周期的检测：通过流式细胞术碘化丙啶PI(购自Beckman公司)染色法检测细胞内DNA含量，将不同细胞周期时相区分为G1／G0期，S期，G2／M期，通过专业软件计算各时相的百分率。用腺病毒KGHV100分别感染MDA-MB-231细胞、BEL-7402细胞、SW480细胞和OVCAR3细胞。感染48h后使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，并吹打成单细胞悬液。每个实验组取1×10⁶个细胞，经4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，用预冷的75％乙醇4℃固定细胞过夜，再次使用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次。加入PI染液0.5ml对细胞进行避光染色30min。使用流式细胞仪检测细胞PI荧光信号，其中激发光波长为488nm，发射光波长为620nm，每个样品收集多于10000个荧光信号。使用MultiCycle DNA软件分析细胞荧光强度、细胞周期分布，并计算细胞增殖指数。分析比较肿瘤细胞感染腺病毒KGHV100后表达的细胞内抗体对其细胞周期分布的影响。结果显示上述高表达p21ras蛋白的肿瘤细胞在感染腺病毒KGHV100后，G0／G1期细胞比例明显增高、S期和G2／M期比例降低。表明细胞的增殖指数明显降低，相对于对照组具有显著的统计学意义(P<0.05)。

5细胞内抗体的体内抑瘤实验

5.1裸鼠移植瘤模型的建立：实验细胞BEL-7402和SW480生长良好、汇合度达到80％时，使用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，PBS缓冲液洗涤细胞后将细胞密度调整成10⁷个细胞／200μl，作为单次注射用量。将制备好的细胞注射接种于SPF级4周龄雌性Balb／c裸鼠，每种肿瘤细胞接种10只，观察裸鼠成瘤后所制备的细胞内抗体对肿瘤生长的体内抑制实验。

5.2细胞内抗体对肿瘤生长的体内抑制实验：对成瘤后的裸鼠进行分组，每组5只。当瘤体平均直径达到0.5cm时，进行瘤内多点腺病毒KGHV100注射，同时设立空载体腺病毒组对照。腺病毒注射量为3×10⁸pfu／只，每3天注射1次，共注射7次。注射后对裸鼠进行观察，每隔一天称量裸鼠体重，并测量裸鼠瘤体长、短径，计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。分析比较注射重组腺病毒KGHV100后表达的细胞内抗体对肿瘤生长的抑制情况。结果显示在上述高表达p21ras蛋白肿瘤细胞的成瘤裸鼠中，实验组肿瘤生长速度明显减慢，说明瘤内注射的腺病毒KGHV100能够显著抑制肿瘤的生长，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)，结果见附图11、12。

瘤体体积=1／2长径×短径²。

Claims (4)

1.一种抗p21ras蛋白的单链抗体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述抗p21ras蛋白的单链抗体的多核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述抗p21ras蛋白的单链抗体在制备与p21ras基因相关的肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述抗p21ras蛋白的单链抗体在制备与p21ras基因相关的肿瘤药物中的应用，其特征在于：与p21ras基因相关的肿瘤细胞包括肝癌细胞、胃癌细胞、结肠直肠癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞。

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