CN103290029A - Survivin启动子介导的表达植物毒素Gelonin基因的重组载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及Survivin启动子介导的表达植物毒素Gelonin基因重组载体及其用途。本发明的主要目的是寻找一种更安全有效的植物毒素治疗肝癌的方法。本发明的技术方案是由Survivin启动子可操作的连接植物毒素Gelonin基因构成的基因表达框架。本发明还提供了在Survivin启动子介导下表达植物毒素Gelonin基因的重组载体。本发明为Survivin启动子介导的植物毒素靶向基因治疗提供了一种新的方法，为临床试验提供一种较安全有效的治疗肿瘤新策略，具有较强的应用价值和广阔的应用前景。

Description

Survivin启动子介导的表达植物毒素Gelonin基因的重组载体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及Survivin启动子介导的表达植物毒素Gelonin基因的重组载体及其用途。

背景技术

肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤[1]。根据最新统计，全世界每年约有六十万新发肝癌患者[2]，并呈逐年增长趋势。肝癌位居死亡相关癌症排名的第三位[1]。通常被确诊为肝癌晚期的患者平均生存期小于3个月，五年生存率仅有10%左右[3-5]。因此，寻找有效地治疗策略和方法是科研工作者们面临的艰巨而又迫切的问题。直到现在，研究者们仍未发现有非常理想的手段治疗肝癌。

之前研究表明，毒素能够应用于癌症的治疗研究[6-10]。Gelonin植物毒素是一种来源于东亚热带森林中大戟科植物Gelonium multiflorum种子中的蛋白质，其属于核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating proteins,RIPs），可催化真核生物核糖体中60S亚单位28S核糖体核糖核酸（rRNA）的4324位腺嘌呤碱基不可逆失活，从而阻断蛋白质的合成。植物毒素gelonin具有高稳定性和低毒性，并且不易引起毛细血管渗漏综合症等副作用的产生，已被应用于肿瘤的治疗研究中[11,12]。含gelonin的重组蛋白已被应用于肿瘤的治疗研究[13-15]。将毒素与其他生长因子或单链抗体融合，组成的免疫毒素能够很好的靶向实体瘤、肿瘤血管或恶性血液癌，并展现出对靶细胞很高的选择性和很好的特异性，是较好的临床药物候选者[13]。抗EGFR单链抗体融合gelonin免疫毒素能够抑制EGFR表达阳性的肿瘤细胞增殖，能够较好的抑制非小细胞肺癌的生长，具有良好的抗肿瘤活性[12]。毒素药物在治疗中易引起机体免疫原性和非肿瘤组织毒性，并容易诱发血管渗漏综合征产生。并且有较差的实体肿瘤渗透性。这些问题在很大程度上限制了免疫毒素在临床治疗中的应用[16-18]。

理想的基因治疗需要有精确的靶向性和较好的安全性[19]。近年来，研究的基因靶向策略主要针对于基因转移水平，基因转录水平，和表达水平的靶向[20]。其中，介导治疗基因在特定组织特异性表达，已经成为一种新的癌症治疗策略，并被广泛应用。该策略往往选用细胞特异性的启动子插入到靶基因的上游，调节治疗基因在特定组织或细胞中表达，达到治疗的目的。其中，治疗基因通常选用的是致死基因[21]，细胞因子[22]，毒素[23]等。可是到目前为止，在毒素基因治疗中，国内外有关植物毒素的报道却比较少。在基因治疗中，如果能够将植物毒素gelonin基因有针对性的表达的话，治疗肝癌的效果将是可观的[24,25]。为了使植物毒素gelonin能够在癌症细胞中特异性表达，一种较好的方法无外乎选择一个较好的癌症特异性启动子以限制治疗基因的无选择性表达[26,27]。在基因治疗中，选择的启动子需要有较好的特异性。目前，一些启动子已被较好的应用于癌症基因治疗，并取得了较好的治疗效果[28,29]。

Survivin蛋白是凋亡抑制家族新成员。Survivin蛋白过表达于多种肿瘤细胞中，但在正常成年人组织中几乎不表达[30-32]。据统计，发现约有70%的肝癌患者癌症组织中survivin蛋白呈较高表达。并且，癌旁组织survivin蛋白表达量很低，与癌组织中蛋白表达量差异很大[33-34]。Survivin基因上游2560-2920bp是survivin基因启动子，能够介导启动survivin基因的表达。survivin启动子优越于其他的启动子，是因为它在大多数正常组织中展现出非常低的活性[35]。survivin启动子介导的靶向治疗已经广泛应用于乳腺癌[36]、肺癌[37,38]、胃癌[39]和胶质瘤[40]。这些研究表明，survivin启动子能够用于肿瘤靶向的治疗研究[36]。

发明内容

本发明的主要目的是寻找一种更安全有效的植物毒素治疗肝癌的方法。

本发明的技术方案是基因表达框架，由Survivin启动子可操作的连接植物毒素Gelonin基因构成。

进一步的，所述的基因表达框架的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了Survivin启动子介导下表达植物毒素Gelonin基因的重组载体。

进一步的，所述的重组载体的Survivin启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，所述的重组载体的植物毒素Gelonin蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述的表达植物毒素Gelonin基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述的重组载体为真核表达载体。

其中，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了含有所述重组载体的宿主细胞。

本发明还提供了所述的重组载体在制备治疗肝癌药物中的用途。

本发明还提供了肝癌药物，其主要活性成分为前述的重组载体。

本发明的有益效果：

本发明的基因表达框架能够明显的抑制肝癌细胞的增值和肝癌肿瘤的生长。本发明的重组载体对肝癌有更好的选择性和特异性，并且对肝脏组织有更低的毒性，更加的安全。本发明为制备肝癌药物提供了新的选择。本发明还为Survivin启动子介导的植物毒素靶向基因治疗提供了一种新的方法，为临床试验提供一种较安全有效的治疗癌症新策略，具有较强的应用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1survivin蛋白在不同肝细胞株中的表达。免疫印迹(western-blot)检测survivin蛋白在人的不同肝癌细胞株中（HepG2，BEL-7402,SMMC-7721）和正常细胞株LO2的表达。

图2pCMV-Gel和pSur-Gel表达质粒设计。(A)pCMV-MCS是一种含有巨细胞病毒启动子的克隆载体。Gelonin基因通过PCR扩增，之后插入到pCMV-MCS的HindIII/EcoRI位点，构建成为pCMV-Gel。（B）为了构建pSur-MCS，1430bp的survivin启动子基因被扩增，之后经NotI和EcoRI双酶切，克隆到pCMV-MCS载体中，构建成为pSur-MCS载体。Gelonin基因插入到pSur-MCS的HindIII/EcoRI位点，构建成为pSur-Gel。pCMV：巨细胞病毒启动子，pSur：survivin启动子，ampicillin：氨苄青霉素，hGH pA：人类生长激素polyA终止子。

图3构建重组质粒酶切验证图。（A）pCMV-GFP、pSur-GFP重组质粒酶切验证：泳道1，pCMV-MCS；泳道2，pCMV-GFP；泳道3，pCMV-GFP HindIII/EcoRI双酶切验证；泳道4，pSur-MCS；泳道5，pSur-GFP；泳道6，pSur-GFP HindIII/EcoRI双酶切。（B）pCMV–Gel、pSur-Gel重组质粒酶切验证：泳道1，pCMV-MCS；泳道2，pCMV-Gel；泳道3，pCMV-Gel HindIII/EcoRI双酶切；泳道4，pSur-MCS；泳道5，pSur-Gel；泳道6，pSur-Gel HindIII/EcoRI双酶切验证。

图4Survivin启动子在肝细胞株中的特异性激活。pCMV-GFP和pSur-GFP分别转染到HepG2细胞和LO2细胞中，转染72h后的细胞在荧光显微镜下观察，分别在白光:和荧光照射条件下拍照分析。(A)不同光照射时拍照图片，(B)转染效率分析（n=5,*P<0.05）。显示数据从两个独立的不相关实验所得。

图5survivin启动子介导gelonin在HepG2肝细株中特异性表达。（A）反转录酶-聚合酶链锁反应（RT-PCR）分析转染pCMV-Gel和pSur-Gel重组质粒的LO2和HepG2中gelonin信使核糖核酸（mRNA）水平。β-肌动蛋白（β-actin）作为内参。（B）免疫印迹分析gelonin在转染的LO2和HepG2中的表达量。β-肌动蛋白（β-actin）作为内参。

图6pSur-Gel特异性抑制肝癌细胞生长。在克隆形成实验中，Survivin启动子能够介导gelonin基因特异性抑制肝癌细胞的增值。转染空载、pCMV-Gel和pSur-Gel的LO2和HepG2细胞，经结晶紫染色，计克隆数。（A）代表的是克隆形成实验所拍摄的照片，(B)代表的是克隆数经分析后所做的均值的标准差直方图（n=3,*P<0.05）。显示数据从两个独立的不相关实验所得。

图7pSur-Gel能够抑制鼠模型中的肿瘤生长。(A)BALB/C裸鼠皮下接种1×107HepG2细胞，接种当天计为0天，待肿瘤体积达到30-50立方毫米，小鼠每隔两天接受一次静脉给药，药物分别为脂质体混合物，含5微克空载、pCMV-Gel或pSur-Gel。其中正常对照组小鼠给的是同等剂量的生理盐水。肿瘤体积每三天测量一次，持续测量4周。最后一次给药后24小时处死小鼠，去肿瘤组织拍片。测肿瘤体积。（B）每组中随机选取的肿瘤拍片。（C）取出的肿瘤体积经分析后所做的均值的标准差直方图（n=6,*P<0.05）。

图8pSur-Gel的肝脏低毒性。（A）8周大的BALB/C小鼠经过一次性接受经脉注射生理远水或脂质体混合的50微克空载，pCMV-Gel、pSur-Gel混合物。指定时间处死小鼠收集血清，分别作进一步的谷丙转氨酶（ALT）分析。做的均值标准差直方图（n=6,*P<0.05）。（B）评估经pSur-Gel给药的小鼠的肝脏组织病理变化，肝组织做苏木素和伊红(HE)染色。放大倍数为×200。

图9pSur-Gel引发肝癌细胞凋亡。（A）2微克空载,pCMV-Gel或pSur-Gel转染HepG2和LO2细胞，24小时后，转染细胞经钙磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和溴化乙丙锭（PI）双染，流式细胞术分析凋亡细胞百分比。流式图中右下角象限代表的是钙磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素阳性细胞，早期凋亡细胞。右上角象限代表的是钙磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素和溴化乙丙锭双阳性细胞，晚期凋亡细胞。（B）免疫印迹分析转染48小时后的HepG2和LO2细胞中多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的切割量。

图10pSur-Gel不引发细胞自噬。免疫印迹分析转染48h后的HepG2and LO2细胞中LC3-II的构成变化。

图11pSur-Gel导致肝癌细胞乳酸盐脱氢酶（LDH）释放量增加。HepG2和LO2细胞经质粒转染48小时后，乳酸盐脱氢酶释放实验检测重组质粒的细胞毒性。实验所得数据做均值标准差直方图（n=3,**P<0.01）。

具体实施方式

主要试剂、材料及试剂盒的来源：

1)含有巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子和多克隆位点（MCS）的PAAV-MCS表达载体购于Cell Biolabs公司，在本文中以pCMV-MCS表示。

2)E.coli DH5а购买于TIAGEN公司并由本实验室保存。

3)人正常肝细胞株LO2,肝癌细胞株HepG2,SMMC-7721,BEL-7402购于中国科学院上海细胞生物学研究所，国科学院细胞文库菌物保藏中心，由本实验室保存。

4)各种限制性核酸内切酶、蛋白分子量标准物均购于Fermentas公司。

5)PCR所用Taq酶及T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。

6)RPMI-1640、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶：购自美国GIBCO公司。

7)Endofree plasmid Giga Kit购自QIAGEN公司。

8)一步法反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

9)BCA蛋白质定量试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific Inc。

10)抗survivin抗体购于美国Santa Cruz biotechnology,β-肌动蛋白抗体购于中国北京中杉金桥公司。

11)新英格兰大白兔抗Gelonin血清来自四川大学生物治疗国家重点实验室动物实验中心。

12)RIPA裂解液(强)、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAB显色试剂盒购自中杉金桥公司

13)LC3I/II和多聚ADP核糖聚合酶（PARP）抗体购于美国Cell Signaling公司。

14)钙磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素/溴化乙丙锭凋亡检测试剂盒购于KeyGenBioTECH。

15)乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒购于Promega公司。

16)原位末端标记（tunnel）细胞凋亡检测试剂盒购自Upstate公司。

17)4～5周大雌性BALB/C无胸腺裸鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

18)其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

细菌培养基的配置：

普通肉汤培养基（LB）液体培养基：蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，蒸馏水溶解、定容至1000毫升，高温高压灭菌20分钟。

选择性LB液体培养基：临用前在灭菌后的普通肉汤培养基液体培养基中加入100mg/mL的氨苄青霉素贮存液，使其终浓度为100微克每毫升。

选择性LB固体培养基：在普通肉汤培养基液体培养基中加入琼脂（终浓度为1.5%），灭菌后冷却至50摄氏度左右时加入氨苄青霉素（终浓度100微克每毫升）。混匀后倒入已经消毒备用的玻璃培养皿，室温固化后置4摄氏度保存备用。

细胞培养基的配置：

Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和RPMI-1640培养基原粉、胎牛血清（FBS）及胰酶（Trypsin）均购自GIBCO公司。按其说明配制液体培养基：先配制成10×的储存液，称取适量培养基粉末，加入超纯水，完全溶解后，每1L加入碳酸氢钠37克，充分溶解，经0.22微米滤膜过滤除菌，置于4摄氏度冰箱保存。配制成1×培养基经无菌实验，确定无菌后方可使用。临用前已灭菌的超纯水稀释成1×的工作液，并加入适宜浓度的胎牛血清(FBS)。

细胞冻存液：完全培养基（DMEM/10%FBS）加入10%的二甲亚砜（DMSO）混匀，4摄氏度保存备用。

0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸细胞消化液：每0.25克胰蛋白酶和0.02克乙二胺四乙酸四钠盐溶解于100mL无钙镁离子的磷酸盐缓冲液中，无菌过滤后4摄氏度保存。

DNA电泳缓冲液（TAE）：

50×的储存液：242克三异丙基乙磺酰，57.1毫升冰醋酸，100毫升0.5摩尔每升的乙二胺四乙酸四钠盐（酸碱值为8.0），加双蒸水定容至1升。

1×的工作液：取50×的储存液20毫升加双蒸水定容至1升。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳及免疫印迹（western-blot）系统：

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离胶按下表1配制，度量单位为毫升：

表1分离胶配制体系

浓度	7.5%	10%	12.5%	15%
					蒸馏水	6	4.88	3.3	2.28
30%丙烯酰胺溶液	4	5.4	6.7	8
					1.5摩尔每升三异丙基乙磺酰(酸碱值为8.8)	4	4	4	4
1%十二烷基硫酸钠	1.6	1.6	1.6	1.6
					10%过硫酸铵	0.1	0.1	0.1	0.1
四甲基乙二胺	0.1	0.1	0.1	0.1

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶（4.5%，5毫升）：蒸馏水4.33毫升，30%丙烯酰胺溶液1.35毫升，0.5摩尔每升三异丙基乙磺酰（酸碱值为6.8）2.25毫升，1%十二烷基硫酸钠0.9毫升，10%过硫酸铵70微升，四甲基乙二胺70微升。

三异丙基乙磺酰-甘氨酸电泳缓冲液：三异丙基乙磺酰3克，甘氨酸14.4克，十二烷基硫酸钠1g，蒸馏水定容于1升。

2×十二烷基硫酸钠凝胶上样缓冲液：100毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（酸碱值为6.8），200毫摩尔二硫苏糖醇，4%三异丙基乙磺酰，0.2%溴酚蓝，20%甘油。

转移缓冲液：3克三异丙基乙磺酰，14.4克甘氨酸，200毫升甲醇，蒸馏水定容于1升。

洗膜缓冲液（TBST）缓冲液：1.21克三异丙基乙磺酰，l8.8g克氯化钠，0.1%吐温-20，酸碱值为7.5，蒸馏水定容于1升。

封闭液：5%脱脂奶粉，用洗膜缓冲液缓冲液稀释。

实验仪器及设备的购买厂家：

PCR仪：MJ research Inc；恒温摇床：Forma公司，型号：4580；凝胶成像系统：Bio-Rad公司，型号：Gel Doc 1000；紫外分光光度仪：SmartSpec 3000，BIO-RAD；生物安全柜：Forma公司，型号：A/B3；CO₂孵箱：Forma公司，型号：3111；液氮罐：Forma公司，型号：8031；PCR扩增仪：MJ Research Inc.；倒置相差显微镜：Olympus公司，型号：CK40；倒置相差显微镜：Nikon公司，型号：TE2000U；冷冻高速离心机：Beckman公司，型号：J25；冷冻超速离心机：Beckman公司，型号：Optima L-100XP；超低温冰箱：SANYO公司，型号：MDF-382E；紫外分光光度仪：Bio-Rad公司，型号：SmartSpec3000；酶标仪：Bio-Rad公司；核酸水平电泳系统：Bio-Rad公司；蛋白垂直电泳系统：Bio-Rad公司，型号：Mini PROTEIN3；曝光控制台：PM-30，Olympus；纯水仪：Millipore公司，型号：EASYpure UF07412；高压灭菌锅：SANYO，型号：LaboAutoclave；NiKon图像分析仪：E600型，购自NiKon公司；病理切片机：RM2125，LEICA；病理组织漂烘处理仪：PHY-Ⅲ，常州中威电子仪器厂；图像采集系统：显微镜Nikon ECLIPSE E600，摄像仪SPOT；ECL凝胶成像仪(Thermo FisherScientific Inc,Hudson,NH,U.S.A.)。

实施例一Western blot检测survivin蛋白表达

1．总蛋白的提取

1)生长状态良好的人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402细胞（购于国科学院细胞文库菌物保藏中心）经胰酶消化后离心收集在离心管中，同时培养基中悬浮细胞一并收集；

2)加入RIPA裂解液（购自中杉金桥公司，每瓶细胞加约400微升的RIPA）反复吹打重悬细胞，按1毫升裂解液加10微升苯甲基磺酰氟（PMSF）（100毫末），摇匀置于冰上；

3)冰上裂解30分钟，并不时混匀；

4)裂解完后，4摄氏度，12000转/分钟离心5分钟；

5)将离心后的上清分装转移至0.5分钟的离心管中放于-20摄氏度保存；

2．蛋白浓度的测定

按照Thermo公司的BCA蛋白定量试剂盒进行，具体步骤如下：

1)将试剂A与试剂B以50：1的比例混合配制工作试剂；

2)用标准蛋白从2毫克每毫升到0毫克每毫升按浓度梯度稀释备用，共设9个梯度；

3)取标准蛋白和待测样品25微升分别加入96孔板中，设2个复孔；

4)每个孔内加入200微升工作试剂，振荡30秒保证充分混匀；

5)37摄氏度孵育30分钟；

6)取出放置至室温，在562纳米测定吸光值；

7)绘制标准曲线，计算样品浓度。

3．免疫印迹

1)蛋白定量后，根据所测浓度用磷酸缓冲溶液调整，使每组浓度一致，加入一定量的上样缓冲液，100℃水浴，5min，使蛋白变性；

2)根据待检测蛋白质的大小选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每泳道上样50微克，先80伏跑出浓缩胶，用120伏跑分离胶；

3)电泳后凝胶浸泡于转移缓冲液中，剪切与凝胶大小相同的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）和6层滤纸，滤纸在转移缓冲液中浸泡，PVDF膜在甲醇中稍浸泡，移入转移缓冲液；

4)自电极板阴极到阳极方向，顺序整齐叠放3层滤纸，凝胶，PVDF膜和3层滤纸。去除各层之间的气泡，80伏，40分钟。转膜，PVDF膜置入封闭液（5%脱脂奶粉），室温下振摇封闭2小时。加入survivin抗体4摄氏度孵育过夜；

5)取出PVDF膜，用洗膜缓冲溶液振摇洗涤3次，每次10分钟。加入辣根过氧化物酶标记二抗（1︰10000），37摄氏度振摇1h；

6)以洗膜缓冲溶液液漂洗3次，每次10分钟，最后以TBS缓冲液漂洗10分钟，加入等量的ECL反应液A和B混合后加至膜上，X光片压片、显影、定影。

结果如图1所示，在HepG2细胞中，免疫印迹检测发现在16.5千道尔顿（KDa）处有一条很浓的survivin蛋白条带，在BEL-7402细胞和SMMC-7721细胞中，免疫印迹检测到一条浓度较弱的survivin蛋白条带，而在LO2细胞中却未检测到survivin蛋白的表达。由此，我们推测survivin蛋白在肝癌细胞中过表达，尤其是在HepG2细胞株中，而在正常细胞LO2中不表达。

实施例二载体构建

由于在正常组织和癌组织中巨细胞病毒启动子都能介导基因表达，所以我们选用了巨细胞病毒启动子，核酸序列请见SEQ ID No.8，作为对照，于Cell Biolabs公司购买了PAAV-MCS表达载体，命名为pCMV-MCS。之后，通过基因合成survivin启动子序列，进行体外扩增，引入NotI和EcoRI酶切位点。扩增后的survivin启动子和pCMV-MCS载体进行双酶切，将survivin启动子连接到载体中，从而使巨细胞病毒启动子被survivin启动子替换，构建成为pSur-MCS载体。

绿色荧光蛋白是一种报告分子，它能够在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，可在荧光显微镜下观察到。由于具有这种自发荧光的特性，其在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。为了更好的研究survivin启动子在不同细胞中的活性，体外扩增绿色荧光蛋白核苷酸序列，EcoRI和HindIII双酶切后，将绿色荧光蛋白基因，其核酸序列请见SEQ ID No.6，蛋白序列请见SEQ ID No.7，插入到pCMV-MCS和pSur-MCS载体中，构建成为pCMV-GFP和pSur-GFP重组质粒。

为了更好地探讨survivin启动子介导植物毒素gelonin的靶向基因治疗研究，通过体外扩增gelonin核苷酸序列，EcoRI和HindIII双酶切后，将gelonin基因插入到pCMV-MCS和pSur-MCS载体中，构建pCMV-Gel和pSur-Gel重组质粒。具体载体构建步骤如下：

1、survivin启动子基因的扩增

合成survivin启动子基因序列（Genscript China Inc），设计PCR引物，同时在5’引物引入NotI位点和3’引物引入EcoRI位点。Survivin上游引物（SEQ ID No.9）：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAATCCCAGCACTTTGGGAGGCC-3’；Survivin下游引物（SEQ ID No.10）：5’-AATATATCCGGAATTCTGCCGCCGCCGCCACCTCTG-3’。

使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶扩增survivin基因片段，按照说明进行操作，PCR反应条件如下：

5微升       10×扩增缓冲液

4微升       脱氧核苷三磷酸(各2.5毫摩尔)

1微升       上游引物(1.0微摩尔)

1微升       下游引物(1.0微摩尔)

1微升       模板脱氧核糖核酸(约1ng)

0.2微升     Pyrobest DNA聚合酶(5U/微升)

加至50微升  双蒸水

聚合酶链式反应混合物在94摄氏度变性4分钟后，按下列条件进行反应：94摄氏度变性30秒；55摄氏度退火30秒；72℃延伸45秒。反应30个循环。然后72摄氏度再延伸10分钟。1%琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链式反应产物大小。

2、将聚合酶链式反应产物构建入真核表达载体—pCMV-MCS，构建pSur-MCS

使用道普生物胶回收试剂盒，按试剂盒的方法回收聚合酶链式反应片段；聚合酶链式反应产物和pCMV-MCS分别用NotI、EcoRI双酶切，37摄氏度孵育过夜；回收片段，T4DNA连接酶连接，16摄氏度孵育过夜；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板，挑取单克隆鉴定。酶切验证重组成功的阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司自动测序仪测序。

3、GFP基因的扩增

绿色荧光蛋白（GFP）基因由金斯瑞生物科技公司合成，设计PCR引物，同时在5’引物引入EcoRI位点和3’引物引入HindIII位点：GFP上游引物（SEQ ID No.11）：5’-CTCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT-3’，GFP下游引物（SEQ ID No.12）：5’-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’。

4、Gelonin基因的扩增

Gelonin基因由金斯瑞生物科技公司合成，设计PCR引物，同时在5’引物引入EcoRI位点和3’引物引入HindIII位点：Gelonin上游引物（SEQ ID No.13）：

5’-TACCGGAATTCATGGGCCTGGACACCGTGAGCTTTAGCACTAAAGGTGCCACTTATATT-3’，Gelonin下游引物（SEQ ID No.14）：

5’-CCGCCACCGCCCAAGCTTTTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATATTTAGGATCTTTATCGACG-3’。

5、构建pCMV-GFP，pSur-GFP，pCMV-Gel，pSur-Gel重组质粒

使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶扩增绿色荧光蛋白，Gelonin互补DNA片段，如上述说明所做，分别用EcoRI和HindIII双酶切聚合酶链式反应产物和真核表达载体pAAV-MCS，pAAV-MCS，选用T4连接酶连接聚合酶链式反应产物与载体，构建CMV-GFP，Sur-GFP，CMV-Gel，Sur-Gel，构建好的质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板，挑取单克隆鉴定。酶切验证重组成功的阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司自动测序仪测序。两种pCMV-Gel和pSur-Gel的重组质粒图如图2所示。以上构建好的重组质粒做经EcoRI和HindIII双酶切验证。酶切验证电泳图如图3所示，表明构建成功。

实施例三Survivin启动子活性检测

1、Survivin启动子介导绿色荧光蛋蛋白表达活性检测

培养LO2和HepG2细胞，铺六孔板，大约2.5×10⁵个/板，37摄氏度培养过夜。待细胞融合度达到50～60%。通过脂质体与质粒混合，每孔细胞瞬转2微克构建好的pCMV-GFP、pSur-GFP重组质粒。其中，固态阳离子的脂质体由本实验室制备，固态脂质体的制备方法是用体积比为3：1的氯仿和乙醇将摩尔比为1：1的1，2-二油酰-3-三甲胺基丙烷(DOTAP)和胆固醇(CHOL)溶解，在圆底烧瓶中将脂质混合物干燥成薄层，在高的真空状态下将残留的氯仿和乙醇去除，接着将脂质用5％的葡萄糖水化，并且在水浴超声的状态下使脂质完全溶解，通过聚碳酸酯膜将脂质连续挤压产生小的单层小囊而制备成脂质体，4摄氏度储存备用。使用时，将其溶解于灭菌水中，与质粒混合。质粒与脂质体混合的质量之比为1：6，带有阳离子的脂质体能够包裹质粒，与带负电的细胞膜结合，使质粒能够较易转入细胞。转染4～6小时后，更换新鲜含抗生素含10%血清的Dulbecco改良的Eagle培养基。继续培养72小时。之后转染细胞在荧光显微镜下每个孔选取5个视野，观察GFP蛋白表达量。结果见图4，通过观察分析荧光蛋白表达，发现survivin启动子能够介导绿色荧光蛋白在HepG2细胞中高表达，在正常细胞中表达很低。

2、Survivin启动子介导Gelonin蛋白转录活性检测

2.1总RNA的提取（Trizol法提取）

取出上述转染细胞，弃上清，每孔加0.5毫升Trizol，反复用枪吹打裂解细胞；将细胞的Trizol裂解液转入无内毒素的1.5毫升EP管中，室温放置5分钟；在上述EP管中，按照TRIZOL与氯仿5︰1的量加入氯仿，盖上EP管盖子，手中用力震荡15秒，室温放置2～3分钟后，4摄氏度12000g转速离心15分钟；取上层水相于新EP管中，按照TRIZOL与异丙醇2︰1的量加入异丙醇，室温放置10分钟，4摄氏度12000g转速离心10分钟；弃上清，按每1毫升TRIZOL加1毫升75%乙醇的量进行洗涤，涡旋混合，4摄氏度7500g转速离心5分钟，弃上清；核糖核酸在室温下自然干燥；无RNA酶的蒸馏水溶解核糖核酸沉淀。

2.2反转录聚合酶链反应（RT-PCR）反应体系

1)设计合成Gelonin(753bp)扩增引物：上游引物（SEQ ID No.15）5’-TATATGGCCTGGACACCGTGAGCTTT-3’，下游引物（SEQ ID No.16）：5’-GCCGCTTTAGGATCTTTATCGACGAAC-3’,β-肌动蛋白(132bp)上游引物（SEQ ID No.17）5’-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3’，下游引物（SEQ ID No.18）5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3’。

2）反应液配制在冰上进行（50微升体系，见表1）：

表2反应体系

一步法逆转录PCR缓冲溶液	1微升
		酶混合物	25微升
PCR上游引物（20微摩尔每升）	1微升
		PCR下游引物（20微摩尔每升）	1微升
总RNA	2微升
		无RNA酶的双蒸水	20微升

3）反转录聚合酶链反应扩增条件：逆转录，50摄氏度，30分钟；预变性，94摄氏度，2分钟；变性，94摄氏度，30秒；退火，55摄氏度，30秒；延伸，72摄氏度，0.5分钟，25个循环；最终延伸72摄氏度，10分钟。-20摄氏度保存备用。

结果见图5A，巨细胞病毒启动子在LO2和HepG2细胞中均能够介导gelonin转录，而survivin启动子只能在HepG2细胞中能够介导gelonin转录，在LO2细胞中未见有gelonin转录。

3、Survivin启动子介导Gelonin蛋白转录活性检测

细胞转染72h后，弃上清；1×磷酸盐缓冲液清洗3次；吸去磷酸盐缓冲液，每孔（6孔板）加入80微升RIPA裂解液（其中含有1/100的蛋白酶抑制剂）；细胞刮子轻轻将贴壁细胞刮离板子，随即将裂解物转入无内毒素的1.5毫升EP管中，冰浴30分钟；4摄氏度条件下，12000转/分钟离心15分钟；上清移入无内毒素的1.5毫升EP管中；蛋白定量采用牛血清蛋白（BSA）标准品（2毫克/毫升）定量，倍比稀释法稀释牛血清蛋白，绘制标准曲线，计算蛋白质样品浓度；RIPA调整蛋白样品浓度，使各组浓度一致；蛋白样品中加入5×加样缓冲液（终浓度为1×），沸水煮7分钟，-20摄氏度保存备用。蛋白样品做免疫印迹分析，选择自制抗兔血清为一抗检测gelonin蛋白表达。

结果见图5B，与巨细胞病毒启动子相比较，survivin启动子能够介导gelonin在HepG2细胞中特异性表达。

实施例四克隆形成实验

培养细胞，3×10²个/孔LO2或HepG2细胞铺六孔板，37摄氏度培养过夜。待细胞融合度达到50～60%。每孔细胞瞬转2微克构建好的pCMV-Gel、pSur-Gel重组质粒，做三个复孔，转染4～6小时后，更换新鲜Dulbecco改良的Eagle培养基培养基，继续培养72小时。70%乙醇孵育30分钟，适量结晶紫染色2分钟，超纯水清洗三次，自然风干。观察计算每孔克隆数。

结果见图6。HepG2细胞对pCMV-Gel和pSur-Gel都很敏感，毒性效果在转染后7天非常明显。而survivin启动子在LO2细胞中展现出来较低的活性，但转染有pCMV-Gel的LO2细胞克隆数明显低于转染有pSur-Gel和空载的克隆数。在LO2细胞中，pCMV-Gel比pSue-Gel有更强的细胞毒性。虽然在HepG2细胞中pCMV-Gel和pSue-Gel两种重组质粒的毒性均比空载大，可pCMV-Gel和pSue-Gel两组相比并没有明显差别，这些数据均说明survivin启动子能够介导gelonin在肝癌细胞中表达从而抑制细胞的生长，但对LO2正常肝细胞没有作用。

实施例五体内肝癌模型基因治疗

购买的BALB/C无胸腺裸鼠这些老鼠被饲养在一个特定的无菌环境,鼠方便获得食物和水。待小鼠生长至5周大时，选取24只体重相似雌鼠，在背部皮下接种无血清无抗生素的DMEM培养基重悬的HepG2细胞，每只接种约1×10⁷个，构建肝癌皮下瘤小鼠模型。接种约两周，待肿瘤体积生长至30～50立方毫米，小鼠随机分为4组，每组6只。小鼠接受经脉注射重组质粒，pCMV-Gel、pSur-Gel或空载与脂质体混合，质粒和脂质体质量之比为1：6，注射剂量为5微克每只，每隔两天注射一次，共8次。设空白对照生理盐水组，注射相同剂量的生理盐水。肿瘤体积用游标卡尺每三天测量一次，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（立方毫米）=肿瘤长×肿瘤宽（毫米）²×1/2。经最后一次注射24小时后处死动物。

结果发现pSur-Gel和pCMV-Gel组均比空载组和生理盐水组有明显的抑制肿瘤生长效果，但pSur-Gel和pCMV-Gel两组之间的抗肿瘤效果并没有明显的差别（图7）。以上数据说明，在体内，pSur-Gel能够达到与pCMV-Gel几乎同样的抗肿瘤效果。

实施例六苏木素和伊红（HE）染色

1、溶液配制

1）0.5～1%的伊红酒精溶液配置：称取伊红0.5～1克，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

2）苏木素染液配方：(配制3000毫升，可按比列减少)苏木精6克、无水乙醇100毫升、硫酸铝钾150克、蒸馏水2000毫升、碘酸钠1.2克、冰醋酸120毫升、甘油900毫升。

3）配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

4）1%盐酸酒精分化液配置：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

2、组织处理：

小鼠经最后一次给药24小时后收集肝脏组织，10%中性福尔马林固定，大于24小时；固定后冲水1～2小时；75%酒精，1次，1小时；85%酒精，1次，1小时；95%酒精，3次，30分钟/次；100%酒精，3次，20分钟/次；二甲苯，2次，20分钟/次；石蜡浸泡，3次，30分钟，30分钟，20分钟；包埋组织。

3、苏木素和伊红（HE）染色

水化：二甲苯浸泡2次，分别是30分钟和20分钟；100%酒精浸泡3分钟；95%酒精浸泡3分钟；85%酒精浸泡3分钟；75%酒精浸泡3分钟；自来水浸泡。

染色：Mayer氏苏木素染色，镜下观察30秒-2分钟（1分钟），实时观察（若染色过深，75%盐酸酒精消色，3秒）；自来水冲洗，10分钟-15分钟；依红复染，镜下观察10秒；自来水洗10分钟。75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精脱水，自然风干；中性树胶封片；镜下观察病理组织变化。

结果发现pCMV-Gel组的肝脏组织有大面积的肝血窦扩张，肝细胞萎缩。但在其他pSur-Gel组、空载组或生理盐水组中，并没有发现任何肝损伤和异常（图8B）。

实施例七急性毒性实验

一个理想的基因治疗重组质粒不仅能够提供一个很好的治疗效果，并且也需要有较好的安全性和对治疗机体的低毒性。处于这种目的，分析了pSur-Gel和pCMV-Gel两种重组质粒对小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的影响。每只BALB/C小鼠静脉注射给药50微克，分4组：生理盐水、空载、pCMV-Gel和pSur-Gel。给药后48小时处死。眼球取血，37摄氏度孵育1小时，4摄氏度离心机3000转/分钟，离心30分钟。分离血清，自动分析仪检测其血清中谷丙转氨酶的含量变化。

如图8A所示，荷瘤小鼠经一次大剂量注射pSur-Gel，pCMV-Gel重组质粒，空载和同样剂量生理盐水，48小时后检测到pCMV-Gel组小鼠血清谷丙转氨酶水平明显升高（P≤0.05）。该结果说明pSur-Gel与pCMV-Gel重组质粒相比，对正常鼠肝脏有更低的急性毒性。其中，pCMV-Gel所造成的急性肝脏毒性或许是由于gelonin的非选择性表达所引起的。总之，pSur-Gel/脂质体介导的系统性基因治疗在肝癌小鼠模型中提供了一个非常有效且安全的治疗方法，并且为以后的临床试验研究提供很好的参考。

实施例八重组质粒作用机制研究

为了探讨pCMV-Gel和pSur-Gel重组质粒抑制细胞生长的作用机制，分别做了凋亡、自噬、坏死相关的实验研究。

1、流式分析术

LO2、HepG2细胞铺六孔板，经2微克空载、pCMV-Gel、pSur-Gel转染，48小时后，胰酶消化，双有培养基中和；用磷酸盐缓冲液洗涤细胞二次（2000转/分钟，离心5分钟）细胞计数收集1～5×10⁵细胞；加入500微升的结合缓冲液悬浮细胞；加入5微升钙磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素（AnnexinV-FITC）混匀后，加入5微升碘化丙啶（PI），混匀；室温、避光、反应5～15分钟；用流式细胞仪检测，激发波长=488纳米；发射波长=530纳米。进行流式细胞仪的观察和检测。

如图9A所示，实验结果表明，HepG2和LO2细胞经转染空载后，有很少的PI染色阳性细胞和Annexin-V染色阳性细胞。而pCMV-Gel能够引起较多的细胞凋亡，凋亡百分比分别是17.88%（HepG2）和12.68%（LO2）。相比之下，pSur-Gel能够引起较多的HepG2细胞凋亡，百分比达到11.09%，但在LO2细胞中，引起的凋亡细胞数较少，仅有5.70%。

2、免疫印迹检测重组质粒造成的多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）切割，及LC3变化

LO2、HepG2细胞铺六孔板，转染2微克空载、pCMV-Gel或pSur-Gel，48h后胰酶消化细胞，双有培养基中和胰酶，细胞计数。RIPA裂解液提取细胞蛋白，冰上孵育裂解细胞30分钟，13000转/分钟低温离心30分钟，提取细胞总蛋白。免疫印迹检测多聚ADP-核糖聚合酶切割，及LC3变化。如图9B中所示，在转染过pCMV-Gel或pSur-Gel两种重组质粒的HepG2细胞和转染过pCMV-Gel重组质粒的LO2细胞中，发现有明显的多聚ADP-核糖聚合酶切割。由此进一步证明，gelonin的毒性效果或许是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的。

3、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验

LO2和HepG2细胞铺六孔板，用2ug空载、pCMV-Gel、pSur-Gel分别转染细胞。48h后，收集培养基样品以评估由于细胞死亡引起的乳酸脱氢酶释放。4摄氏度离心5分钟，用培养基稀释，转移到一个新的96孔板中。用冻融法裂解转染的细胞，以评估最大乳酸脱氢酶活性。收集一定体积的培养基，象前一步那样操作。测量从细胞中自发释放的乳酸脱氢酶，并校正酚红以及血清中内源性乳酸脱氢酶活性的影响。配制底物混合物，每个样品孔中加入50微升。在室温孵育检测板30分钟，避光。加入终止液，在490纳米记录吸光值，从样品读数中减去背景值，用下面的公式计算细胞死亡的百分数，%细胞毒性=实验孔乳酸脱氢酶释放（OD490）/最大乳酸脱氢酶释放（OD490）。从自噬实验结果发现，在各组中LC3-II组成比例并没有发生改变（图10）。并且，为了检测重组质粒是否造成了细胞坏死，还检测了细胞的乳酸脱氢酶释放量。结果显示与转染空载组相比，HepG2细胞转染pCMV-Gel或pSur-Gel后，乳酸脱氢酶的释放百分比明显升高，并且LO2细胞经pCMV-Gel重组质粒传染后，乳酸脱氢酶释放量也检测到有明显增高，其他组均无明显变化（图11）。

综上所述，本发明提出了一种肝癌治疗的新方法。选用肿瘤特异性survivin启动子选择性介导植物毒素gelonin在肿瘤细胞中表达，从而达到特异性抑制肿瘤生长的作用。该研究提供了一种安全有效地基因治疗手段，为植物毒素基因治疗提供了研究基础。该研究或许为以后植物毒素基因治疗提供了一种具有发展前景的新途径，为将来临床试验提供了依据。

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Claims (11)

1.基因表达框架，由Survivin启动子可操作的连接植物毒素Gelonin基因构成。

2.权利要求1所述的基因表达框架，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

3.Survivin启动子介导下表达植物毒素Gelonin基因的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述的Survivin启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

5.如权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于：所述的的植物毒素Gelonin蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述的表达植物毒素Gelonin基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。

7.如权利要求3～6任一项所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体为真核表达载体。

8.如权利要求7所述的重组载体，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNo.5。

9.含有权利要求3～8任一项所述重组载体的宿主细胞。

10.权利要求3～8任一项所述的重组载体在制备治疗肝癌药物中的用途。

11.肝癌药物，其主要活性成分为权利要求3～9任一项所述的重组载体。

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