CN102321158B - 阻止细胞dna合成抑制细胞增殖的多肽及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽及用途，其氨基酸序列为：甲硫氨酸—脯氨酸—酪氨酸—丝氨酸—苏氨酸—谷氨酸—亮氨酸—异亮氨酸—苯丙氨酸—酪氨酸—异亮氨酸—谷氨酸—甲硫氨酸—天门冬氨酸—脯氨酸，在制备治疗肿瘤及其他细胞生长异常有关疾病的药物的应用。该多肽具有结合增殖细胞核抗原PCNA，并阻断PCNA结合DNA聚合酶和促进DNA合成的能力，达到抑制细胞增殖的生物效应。应用该多肽及衍生物，或通过转染相应的cDNA在细胞内表达该多肽，能达到有效抑制细胞增殖及肿瘤生长的作用，在制备肿瘤及有关疾病的治疗药物、肿瘤药物及诊断试剂的中具有独特的使用价值。

Description

阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽及用途
技术领域
本发明属于医学生物工程领域，涉及一种阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽及用途。
背景技术
肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病。临床中主要应用化疗、放疗及手术治疗，这些方法形成了比较成熟的治疗体系，取得了较好的效果。然而，由于目前常用的治疗肿瘤药物选择性低，难以避免毒副作用强、正常细胞和肿瘤之间治疗窗口小的缺点，要进一步提高疗效乃至达到治愈目的发展潜力有限，因此亟待研发新的有效治疗方法。
近来肿瘤细胞生物学的快速发展，为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中，随着细胞的信号转导途径(Signaling transductionpathways)的阐明，发现了越来越多的可用作治疗肿瘤的药靶。有一些已经成功地应用于临床，取得了非常好的效果。比如在许多白血病细胞中表达BCR-ABL蛋白质，该蛋白质具有较强的蛋白激酶活性，在白血病的发生和发展中起重要的作用，通过研究BCR-ABL蛋白质的结构，人们设计和生产了多种能特异性抑制该蛋白质生物学活性的化合物，并成功开发出包括格列卫在内的药物应用于治疗白血病患者，格列卫是目前治疗多种白血病和其他肿瘤的首选药物。
细胞生长的信号是由细胞内外促进生长的因子经过一系列蛋白参与传递到细胞核，引起细胞周期的许多调节蛋白结构和功能变化而导致细胞分裂。在这些调节细胞生长周期的蛋白中，增殖细胞核抗原(PCNA)担当着一个极其重要的角色，在细胞DNA复制过程中，DNA复制叉是DNA合成的关键蛋白质复合体，PCNA是DNA复制叉复合体的组成成分，PCNA可以结合DNA和多种蛋白质，特别是PCNA结合DNA复制必需的DNA聚合酶，并使DNA聚合酶能催化新生DNA链的合成，参与DNA复制过程。PCNA存在于所有分裂细胞中，由于PCNA在细胞周期中的重要作用，阻断PCNA在细胞周期中的生物功能是一个很有前途的开发治疗肿瘤和其他细胞增殖异常疾病新药的途径。至今为止，由于PCNA参与细胞周期调节的机制还不清楚，目前没有有效的方法或化合物能直接阻断PCNA的生物功能，达到抑制细胞生长作用。
发明内容
本发明的目的提供一种阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽及用途。本发明所述的多肽具备阻断PCNA促进细胞DNA合成和复制的生物学功能，从而抑制细胞分裂，该多肽也能有效地抑制多种肿瘤动物体内生长模型中的肿瘤生长。
阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽，其特征在于其氨基酸序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸。
所述阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽在制备治疗肿瘤及其他细胞生长异常有关疾病的药物的应用。
所述阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽相应的核苷酸编码序列。
所述阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽相应的核苷酸编码序列在制备治疗人类肿瘤及其他细胞生长异常有关疾病的药物中的应用。
PTD-P15融合多肽，其特征在于其氨基酸序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸。
PTD-P15融合多肽在制备治疗人类肿瘤及其他细胞生长异常有关疾病的药物中的应用。
在研究中，我们发现了一个多肽片段和PCNA的相互作用。该片段的序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸；(见《氨基酸和核苷酸序列表》)，在以后该多肽称为P15，同时，我们还发现P15和PCNA结合后，阻止了PCNA和DNA聚合酶的结合，而结合到PCNA蛋白质的DNA聚合酶是细胞周期中的一个重要过程-DNA复制必需的。根据这一结果，我们设想，如果在细胞中表达P15，这一多肽能抑制PCNA和DNA聚合酶的结合，从而抑制DNA聚合酶介导的DNA复制过程，达到阻止细胞分裂过程的目的。
证明上述模型的关键之处在于把P15多肽导入细胞中，再观察P15多肽对细胞分裂的影响。为达到这一目的，我们采用分子生物学的手段，制造一个DNA构建体，这一构建体编码由P15和绿色荧光蛋白GFP组成的融合蛋白，再把这种构建体转入培养的人细胞中，然后观察表达P15-GFP融合蛋白的细胞中细胞周期的变化。另外，我们还通过人工合成的方式，生产一个由具有穿透细胞膜的多肽片段和P15多肽构成的融合多肽PTD-P15；PTD的序列为精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸。在培养的细胞中加入PTD-P15，再观察进入细胞的P15多肽对细胞周期的影响。为了观察P15多肽对动物模型中肿瘤生长的影响，我们通过小鼠尾静脉注射PTD-P15融合多肽，观察PTD-P15能否抑制动物模型中肿瘤的生长。
实验结果表明，在几种不同的具有生长分裂能力的培养细胞系中表达P15多肽或加入PTD-P15，P15抑制了PCNA结合DNA聚合酶的能力，导致这些细胞的DNA合成及其他几个证明细胞生长的观察指标都显著降低，证明了P15多肽具有抑制细胞增殖的能力；同时，注射PTD-P15多肽能够抑制细胞增殖和抑制动物模型中肿瘤的生长。
与现有抑制细胞增殖的方法相比，采用本发明达到了以下效果：
①P15阻断PCNA结合DNA聚合酶的能力，从而抑制了DNA聚合酶促进DNA复制的作用，导致细胞周期的停止，为治疗肿瘤和其他细胞生长异常疾病新药的设计和筛选，提供了一种新的方法和途径。同时，PTD-P15融合多肽能有效地抑制肿瘤生长，证明P15多肽在穿透细胞膜后仍具有抑制细胞生长的生物学效应，也说明具有穿膜功能的多肽或分子也可能用于帮助具有生物学活性P15穿透细胞膜。
②P15多肽毒副作用低，抗原性弱，实验结果也发现P15多肽对细胞凋亡没有明显的影响，所以对正常细胞没有明显的杀伤作用。由PTD-P15融合多肽加入培养细胞和应用于动物体内，也没有观察到明显的毒性。
③在细胞中表达P15多肽和PTD-P15融合多肽能有效抑制多种人类和鼠类肿瘤细胞在体内和体外培养系统中的生长，证明P15在肿瘤等细胞生长异常疾病的治疗方面具有高效、广谱等优点。
④PTD-P15多肽分子量小能化学合成，便于大规模直接应用于临床，同时也可用其他的方法(比如用质粒及病毒载体)把P15多肽投人到细胞内，以达到治疗肿瘤和其他细胞增殖异常疾病的目的。
附图说明
图1：PTD-N15阻断PCNA结合DNA聚合酶。人直肠癌细胞HT29培养于培养皿中，分别加入对照多肽或不同量的PTD-P15多肽，细胞培养过夜后，收集细胞，用免疫共沉淀法检查细胞中PCNA蛋白质结合的DNA聚合酶的量，结果显示加入PTD-P15能减少PCNA结合的DNA聚合酶量，因为结合于PCNA的DNA聚合酶的量和细胞DNA复制密切相关，所以，PTD-P15能抑制细胞DNA复制速度。阻断了PCNA结合DNA聚合酶的能力，抑制了DNA聚合酶促进DNA复制的作用，阻断了细胞的分裂。
图2a、图2b、图2c、图2d：分别为PTD-P15抑制细胞周期。人直肠癌细胞HT29培养于培养皿中，分别加入对照多肽或不同量的PTD-P15多肽，细胞培养24小时后，收集细胞，测定细胞在不同的细胞周期的百分比。结果显示PTD-P15能增加G0/G1期细胞数量，同时减少S期和G2/M期细胞数量，表明PTD-P15抑制了细胞周期。
具体实施方式
下面借助具体实验及其数据结果对本发明进行论证说明，但应该说明的是，这些实施例子并不对本发明加以限制。P15多肽在下列实验中证明其抑制细胞增殖和肿瘤生长的有效性，包括但不限于下列实验。
例1：在pEGFP质粒中引入编码P15多肽cDNA，DNA构建体表达P15-GFP融合蛋白的检测。
pEGFP-N 1质粒载体购于美国Clontech公司(目录号为：6085-1)，质粒包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA，用EcoRI-BamHI(购于美国Promega公司，目录号为：R6011，R6021)酶切质粒，酶切后的质粒在琼脂糖胶中分离、纯化，用于以后的连接反应。从胶中回收DNA片段的试剂盒来自德国Qiagen公司(产品目录号为：28704)。
编码P15多肽的cDNA来源于人工合成的双链DNA，其序列为：
单链1：
5’TTTTGAATTCATGCCCTATTCGACAGAACTGATATTTTATATTGAAATGGATCCTGGATCC；
单链2：
5’TTTTGGATCCAGGATCCATTTCAATATAAAATATCTGTTCTGTCGAATAGGGCATGAATTC。
两个单链混合后，结合成双链DNA，产物经过纯化后(纯化用的试剂盒来自德国Qiagen公司，产品目录号为：28704)，用EcoRI-BamHI酶切；再用琼脂糖胶纯化，然后和酶切纯化后的载体pEGFP-N1进行连接反应(连接试剂盒来自美国Promega公司，目录号为：M1801)。转化细菌后(感受态细菌来自美国Promega公司，目录号为：L2001)，选出阳性克隆，其cDNA序列的正确性通过核酸序列测定得到证实后，大规模纯化制备质粒(大规模纯化试剂盒来自美国Promega公司，目录号为：A7270)，用于以后的实验。这种质粒在真核细胞分别表达一个P15和GFP的融合蛋白，表达的P15连接在GFP的N未端，该融合蛋白称为P15-GFP。
转染试剂盒购于美国Invitrogen(目录号为11668)，转染实验也按照生产厂家提供的使用说明完成。COS7细胞培养在质量浓度为10％小牛血清DMEM营养液中。转染48小时后，COS7细胞用生理盐水(PBS)洗两次，加入细胞裂解液裂解细胞，用超声波破坏DNA后，加入适量的2-巯基乙醇和溴酚蓝，于沸水中处理5分钟，置于冰上保存，随后上样于质量浓度为12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的蛋白转移到尼龙膜上，此膜用抗GFP抗体(购于美国Invitrogen，目录号为R970)检测融合蛋白的产生，结果证实了P15-GFP在细胞中的表达。
例2：P15多肽的表达抑制细胞生长及细胞周期的实验。
用NIH/3T3(小鼠成纤维上皮细胞，购自美国ATCC，目录号为：CRL-1658)和MCF-7(人乳腺癌细胞系，购自美国ATCC，目录号为：HTB-22)检测P15多肽对细胞生长的影响。细胞在含质量浓度为10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，37℃、5％(体积)CO2/95％(体积)空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿。
用于实验质粒：pEGFP-P15(表达P15-GFP融合蛋白)；pEGFP-N1作为对照质粒。
用于转染的质粒和脂质体转染试剂(购自购于美国Invitrogen，目录号为：11668)混合后，室温放置15分钟，加入培养于无血清DMEM营养液的细胞中(细胞密度约为50％)在37℃中培养5小时，再加质量浓度为10％胎牛血清，继续培养48小时。在荧光显微镜中，表达融合绿色荧光蛋白或单独荧光蛋白的细胞很容易和不表达这些蛋白的细胞区分开来。另外，采用流式细胞仪，这些荧光蛋白阳性细胞也很容易分离纯化出来。细胞周期等检测细胞生长的标志指标被用来研究证实P15多肽对细胞生长的影响，在这些实验中，仅仅只表达荧光蛋白的细胞作为对照组用。
首先，我们用上述质粒转染3T3和MCF7细胞，两天后，采用流式细胞仪把转染了DNA的GFP阳性细胞挑选出来，分析这些细胞的细胞周期分布。
实验结果表明：表达P15对细胞凋亡没有明显影响，而P15能抑制细胞周期进入S期，诱导细胞进入G0/G1期，其作用见下表(表1)。
表1：P15抑制细胞周期，诱导细胞进入G0/G1期作用
Figure BDA0000085497220000051
DNA合成是细胞增殖的标志。下一个实验中，我们检测P15对细胞DNA合成的影响。3T3和MCF7细胞在转染pEGFP-N 1及表达P15-GFP质粒两天后，在细胞培养液加入能渗入到新合成的DNA链中的BrdU标记细胞15小时，再用免疫荧光技术检测转染了质粒的GFP阳性细胞，再确定这些细胞DNA中BrdU渗入的阳性率(这代表了细胞DNA合成率)。结果表明，P15也强烈抑制了细胞DNA的合成。(见表2)
表2：P15抑制细胞DNA合成
Figure BDA0000085497220000052
例3：人工合成由具有穿膜功能的多肽和P15多肽组成的融合多肽PTD-P15。
P15多肽并不能自由通透细胞膜，为了进一步观察P15对细胞周期和肿瘤生长的影响，我们人工合成能穿透细胞膜的P15融合多肽。该融合多肽被称为PTD-P15，PTD-P15的氨基酸序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸；其中P15片段的氨基酸序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸；具有穿透细胞膜功能的PTD多肽片段氨基酸序列为：精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸。
我们同时设计和合成了一个对照多肽，其氨基酸序列为：天门冬氨酸-精氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-亮氨酸-酪氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸-甘氨酸-苏氨酸-甲硫氨酸。
例4：PTD-N15阻断PCNA结合DNA聚合酶。
人直肠癌细胞HT29培养于培养皿中，分别加入对照多肽或不同量的PTD-P15融合多肽，细胞培养过夜后，收集细胞，用免疫共沉淀法检查细胞中PCNA结合的DNA聚合酶的量，结果显示PTD-P15能减少PCNA蛋白质结合的DNA聚合酶量，因为结合于PCNA的DNA聚合酶的量和细胞DNA复制密切相关，所以，PTD-P15能抑制细胞DNA复制速度。阻断了PCNA结合DNA聚合酶的能力，抑制了DNA聚合酶促进DNA复制的作用，阻断了细胞的分裂(图1)。
例5：PTD-P15融合多肽影响细胞生长及细胞周期的实验。
用人宫颈癌细胞系，购自美国ATCC，目录号为：HTB-22的Hela细胞检测PTD-P15融合多肽对细胞生长的影响。Hela细胞在含质量浓度为10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5％(体积)CO2/95％(体积)空气培养条件下培养于10厘米细胞培养皿，将细胞培养至对数生长期后，加入不同浓度的PTD-P15多肽(浓度分别为：8，30和50微克/毫升)，同时在另外的培养细胞中加入对照多肽(空白对照组)用以对照，培养24小时收取细胞，利用流式细胞仪分析细胞周期分布。实验结果表明：PTD-P15融合多肽抑制细胞增殖，增加G0/G1期细胞数，同时，多肽对细胞凋亡没有明显影响，见图2a、图2b、图2c、图2d。
例6：PTD-P15融合多肽抑制小鼠体内人类直肠癌肿瘤生长的实验。
在小鼠的皮下注射5×106个人类直肠癌HT29细胞后，将小鼠随机分成两组。注射肿瘤细胞一天之后，1毫克的PTD-P15融合多肽通过尾静脉向治疗组中的小鼠分别注射，隔天注射同样的量重复五次。1毫克的对照多肽注射次数和时间同治疗组。注射肿瘤十天后杀死并从小鼠体内取出肿瘤进行重量测量。结果显示，与对照组相比，注射PTD-P15治疗的小鼠体内的肿瘤重量减少了57％。
例7：PTD-P15融合多肽抑制小鼠体内人类白血病肿瘤生长的实验。
在小鼠的皮下注射5×106个人类粒细胞白血病K562细胞后，将小鼠随机分成五组。接种肿瘤细胞一天以后，各组小鼠分别通过尾静脉注射空白溶液1毫克、对照多肽1毫克、PTD-P15融合多肽1毫克、格列卫10微克和PTD-P151毫克加格列卫10微克溶液，同样的注射隔天重复，注射7次，两个星期后，动物处死后，取小鼠皮下长的肿瘤，进行称重。结果显示与对照组相比，注射PTD-P15能明显减少K562细胞产生的肿瘤的重量，减少达到34％。格列卫是目前临床上用作治疗白血病的药物，在本实验中，注射格列卫也减少了肿瘤的重量减少48％，如果把PTD-P15和格列卫结合起来应用，小鼠体内的肿瘤的重量比单独用这两个药物有更多的减少，和对照多肽组相比，减少69％，证明合用PTD-P15和格列卫比单独用两个药物具有更好的治疗肿瘤效果，见表3。
表3：PTD-P15抑制动物模型中K562细胞形成的肿瘤的生长。
Figure BDA0000085497220000071
序列表
<110>常州德健生物科技有限公司
<120>阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽及用途
<160>3
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Met Pro Tyr Ser Thr Glu Leu Ile Phe Tyr Ile Glu Met Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>2
<211>26
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Pro Tyr Ser
1               5                   10                  15
Thr Glu Leu Ile Phe Tyr Ile Glu Met Asp Pro
                20                      26
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(45)
<400>3
ATG CCC TAT TCG ACA GAA CTG ATA TTT TAT  30
Met Pro Tyr Ser Thr Glu Leu Ile Phe Tyr
1               5               10
ATT GAA ATG GAT CCT  45
Ile Glu Met Asp Pro
                15

Claims (1)

1. 阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽，其特征在于其氨基酸序列为：甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸；该多肽具有结合增殖细胞核抗原PCNA，并阻断PCNA结合DNA聚合酶和促进DNA合成的能力，达到抑制细胞增殖的生物效应。
2、根据权利要求1所述阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽在制备治疗肿瘤及其他细胞生长异常有关疾病的药物的应用。
3、根据权利要求1所述阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽相应的核苷酸编码序列。
4、根据权利要求3所述阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖的多肽相应的核苷酸编码序列在制备治疗人类肿瘤及其他细胞生长异常有关疾病的药物中的应用。
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