CN111956781B - 一种多肽在治疗眼部炎症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种多肽在治疗眼部炎症药物中的应用，该多肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRMMPYSTELIFYIEMDP。采用该多肽制备的滴眼液，其中包括按重量百分数计的多肽0.05‑1%，所述的眼部炎症为结膜炎、角膜炎、和/或葡萄膜炎。该多肽滴眼液中，多肽治疗炎症的药理作用为抑制炎症参与细胞增殖，抑制NF‑κB活化，抑制多种炎症介质的产生和分泌，抑制新生微血管生长，抑制炎症细胞的聚集和侵润等。该多肽滴眼液药理明确，疗效好、副作用低，原料药生物学活性稳定，滴眼液生产工艺简单，成本低，有利于大规模临床应用降低患者负担。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽在治疗眼部炎症药物中的应用。
背景技术
眼部炎症主要有结膜炎、角膜炎、葡萄膜炎，以结膜炎为例，结膜炎是结膜组织在外界和机体自身因素的作用而发生的炎性反应的统称，包括细菌、病毒、衣原体、真菌或外界其它过敏原等引起的结膜炎症。目前，治疗眼炎的药物主要有抗组胺药物、激素类药物、肥大细胞稳定剂、减充血剂、炎性介质拮抗剂等。
激素类药物，现代科学已经证明激素类滴眼液具有抗炎、抗过敏和免疫抑制、改善新陈代谢等作用，在临床上用于一些眼科炎症，刚开始有缓解眼睛干涩、发红等功能，但长期使用可能引起眼压增高，甚至引起神经损害和视力下降，导致激素性青光眼等副作用。而青光眼所造成的视功能损伤是不可逆的，有长期使用激素类滴眼液导致失明的现象。
肥大细胞稳定剂，在有过敏原的情况下，阻止机体组织释放组织胺。可以引起嗜睡。色甘酸钠亦称咽泰、咳乐钠。本品为过敏反应物质阻释剂。作用机理是稳定肥大细胞的细胞膜，阻止其释放组胺、5－羟色胺、慢反应物质等介质，长期用药有可能引起白内障和青光眼等副作用还要避免支气管痉挛的发生。
减充血剂，减充血滴眼液是指药液含有收缩血管药物的滴眼液，滴用后可以使球结膜充血减轻或消失，缓解眼红症状。如果短期滴用这类滴眼液，问题不大，但是如果长期反复地滴用，这类滴眼液后，由于球结膜血管反弹式扩张，会加重结膜充血，看起来眼睛会更红。
靶向生物制剂虽然具有疗效好，特别是毒副作用小的优势，然而生物制品生物活性不稳，加之成本高昂的问题影响了这类药品在眼部炎症治疗的应用。
眼部炎症疾病严重危害到人民群众的生理和身心健康，而目前又无疗效好、毒副作用小的治疗药物，因此，急需开发新型治疗炎症疾病新药。
发明内容
本发明提供了一种多肽在治疗眼部炎症药物中的应用，该多肽滴眼液药理明确，疗效好、副作用低，原料药生物学活性稳定，滴眼液生产工艺简单，成本低，有利于大规模临床应用降低患者负担。
本发明采取的技术方案是，一种多肽滴眼液，包括按重量百分数计的多肽0.05-1％，该多肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRMMPYSTELIFYIEMDP。下称的伊匹乌肽为该多肽。
本发明还涉及多肽在制备用于治疗眼部炎症药物中的应用，该多肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRMMPYSTELIFYIEMDP。
进一步地，所述的眼部炎症为结膜炎、角膜炎、和/或葡萄膜炎。
眼部炎症中的炎症介质包括趋化因子和细胞因子与炎症细胞的相互作用构成炎症反应的主要成分。炎症是指机体对感染、外来物质或其它原因(如抗原抗体复合物)所致损伤的一种反应,炎症反应有利于损伤的减轻和修复，然而过度和延长的炎症过程会加大对机体的损伤。炎症过程中，在外来或内在因素的刺激下，发炎部位的免疫和炎症细胞的细胞周期(Cell cycle)受到激活，进行大量增殖，同时受多种炎症介质的影响，血管通透性增加，免疫和炎症细胞移行聚集到发炎部位，新产生的和从其他部位移行来的免疫和炎症细胞正反馈产生和分泌更多的细胞因子，整个炎症过程得到迅速增加和放大，所以虽然机理较为复杂，但是炎症参与细胞增殖和多种炎症介质的大量产生和分泌，是炎症疾病发生发展的关键病理过程。
以结膜炎为例，分类根据病情及病程，可分为急性、亚急性和慢性三类；根据病因又可分为细菌性、病毒性、衣原体性、真菌性和变态反应性等；根据结膜的病变特点，可分为急性滤泡性结膜炎、慢性滤泡性结膜炎、膜性及假膜性结膜炎等。结膜炎的病因可根据其不同性质分为感染性和非感染性两大类。①感染性由于病原微生物感染所致的结膜炎症。②非感染性以局部或全身的变态反应引起的过敏性炎症最常见，外界的理化因素，如光、各种化学物质也可成为致病因素。
本发明提供多肽滴眼液的主药成分伊匹乌肽的靶标是p55PIK蛋白质，三磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的一个亚型成员。p55PIK蛋白质在炎症过程调控中起重要作用，有促进细胞增殖和和活化NF-κB信号通路的功能。
p55PIK通过激活细胞周期促进了细胞增殖，其中p55PIK主要通过激活两个重要的细胞周期调节蛋白质，RB和PCNA，参与了细胞周期中的两个期的激活，G0/G1期和S期(DNA合成)。
而伊匹乌肽特异抑制p55PIK介导的信号转导通路，使细胞周期停止在G0/G1期和S期,从而抑制了细胞增殖。而且研究还发现p55PIK不直接参与细胞死亡或凋亡过程这是伊匹乌肽对机体的毒副作用小的分子机理。
NF-κB是转录因子,NF-κB通路一直被认为是典型的炎症信号转导通路。NF-κB可诱导细胞因子、趋化因子、黏附因子、基质金属蛋白酶、环加氧酶2和诱导性一氧化氮合酶的表达，大部分已知的炎症因子比如TNF-α，白介素2，白介素6，白介素8，HIF等的表达都受到NF-κB通路的调控。
伊匹乌肽是p55PIK蛋白的特异性抑制剂，抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化是其抑制炎症疾病的重要药理之一。
伊匹乌肽治疗炎症疾病的药理作用在于其具有：(1)抑制炎症参与细胞的增殖；(2)抑制NF-κB活化和抑制多种重要的炎症介质(比如TNF-α，白介素2，白介素1，白介素6等)的产生和分泌的作用。
伊匹乌肽滴鼻剂治疗眼炎的药理作用机理在于在葡萄球参与细胞的增殖、抑制NF-κB活化及多种炎症介质的产生和分泌，除此之外，伊匹乌肽还能够抑制炎症细胞的迁移，减少炎症部位的炎症细胞的侵润和聚集，抑制炎症部位的血管通透性和液体渗出，抑制病变部位新生血管的生成，减少病变部位的炎症反应等。
伊匹乌肽英文名：Epivotide，分子式：C155H250N48O40S3，分子量：3522道尔顿(Da)，该多肽药物结构独特新颖，靶标明确，药理清晰，治疗炎症效果好，作用范围广，毒副作用小。
伊匹乌肽的靶标是p55PIK蛋白质，p55PIK属于由多种亚型成员组成的蛋白质家族-磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)。p55PIK参与细胞周期的调控，同时它还参与了NF-κB活化信号转导通路，而伊匹乌肽是p55PIK特异生物学功能阻断剂。
伊匹乌肽滴眼液治疗眼炎的药理作用机理在于在眼部发炎区抑制炎症参与细胞的增殖、抑制NF-κB活化及多种炎症介质的产生和分泌，除此之外，伊匹乌肽还能够抑制炎症细胞的迁移，减少炎症部位的炎症细胞的侵润和聚集，抑制炎症部位的血管通透性和液体渗出，抑制病变部位新生血管的生成，减少病变部位的炎症反应等。
优选地配方中，该滴眼液包括按重量百分数计的伊匹乌肽0.1％、渗透压调节剂0.9％、防腐剂0.1％和pH值调节剂，该多肽滴眼液的pH值控制在7.3～7.4；余量为水。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的多肽滴眼液中，伊匹乌肽治疗炎症的药理作用为抑制炎症参与细胞增殖，抑制NF-κB活化，抑制多种炎症介质的产生和分泌，抑制新生微血管生长，抑制炎症细胞的聚集和侵润等。抗炎药理明确,治疗效果好，毒副作用小，作用范围广。
其中的原料药伊匹乌肽采用固相全化学合成，通过高效液相色谱法分离纯化和转盐冻干获得，质量可控。伊匹乌肽是生物多肽，其人体内的代谢产物是不同长度的肽链或氨基酸，这些产物具有和伊匹乌肽类似的化学性质和代谢途径，不增加更多的毒副作用。
伊匹乌肽作为p55PIK的特异抑制剂，靶标点特异性非常高，除p55PIK外，目前没有发现伊匹乌肽有其他的作用靶标，没有脱靶效应(Off-targets-Effects)；没有结合DNA的能力，不引起基因突变，无遗传毒性和致畸变作用等。
药效学研究结果表明，本发明提供的多肽滴眼液对动物模型中多种炎症疾病具有显著的治疗作用；另外，在应用了伊匹乌肽的动物中没有观察到明显的影响，表明了伊匹乌肽对动物的炎症模型治疗效果好、毒副作用小。是一个具有良好开发前景的治疗眼部炎症有效、安全低毒、质量可控的创新药物。
附图说明
图1为原料药伊匹乌肽生产的工艺流程示意图。
图2为LPS眼底注射造模后小鼠眼底照片。
图3为LPS眼底注射造模成功后随机分组给药治疗后眼刺激积分结果。
图4为造模24h后，房水中蛋白质含量检测的结果。
图5为造模24小时后取两眼前房及视网膜进行H&E染色后的图。
图6为造模24小时两眼前房及视网膜提取total RNA，通过荧光定量PCR测定多个重要炎症因子的mRNA表达水平结果。
图7为病例1中患者使用本发明滴眼液前的照片和使用后的照片对比。
具体实施方式
下面结合附图及实施例，进一步阐明本发明。
伊匹乌肽是由27个氨基酸残基构成的单链多肽，不含有具有巯基(SH)基团的氨基酸，也不含有罕见氨基酸，同时，其生物活性稳定，所以，伊匹乌肽适合化学合成。伊匹乌肽原料药的制备工艺是采用化学合成、高效液相仪分离纯化和转盐冻干精制而成，该工艺过程分为两部分：多肽全长的固相化学合成(伊匹乌肽粗品)和精制。伊匹乌肽原料药生产的工艺流程如图1所示。
1、伊匹乌肽粗品合成
肽是氨基酸中的氨基(H2N)和另外一个氨基酸的羧基(COOH)缩水后形成肽键连接而成。其化学反应式为
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。将所要合成的肽链的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(高分子树脂)相连接，再以结合在固相载体上的氨基酸的氨基作为合成起点，脱去氨基保护基并同过量的活化羧基反应以延长肽链，不断重复这个步骤，即缩合成肽，直到得到目的肽链。最后，将肽链从树脂上裂解下来，进行分离纯化等步骤得到所要的多肽。
伊匹乌肽粗品采用固相合成方法获得。在多肽粗品合成过程中，主要有以下几步：
(1)树脂活化：树脂偶联上氨基(H2N)集团，7以用于以后合成的肽链连接在树脂上。
(2)活化的树脂和多肽中C端第一个氨基酸(Pro)的偶联：活化树脂连接的H2N集团在合适的促进氨基和羧基缩合的催化剂催化下可以和氨基酸的COOH缩水形成肽键，从而连接到树脂。由于氨基酸中一般含有其他多个反应集团，为了避免不合适的连接，氨基酸中不需要连接的集团需要事先封闭(保护)，在本次反应中加入的是Fmoc保护的Pro(Fmoc-Pro)。
(3)肽链在树脂上的延长：当Pro连接树脂的缩合反应完全时，将没有连接上的Pro洗脱去除，然后加入第二个保护的氨基酸(Fmoc-Asp)到树脂中，进行新的偶联反应。氨基酸偶联反应是否完全对于最终获得的多肽的完整性十分关键，因此偶联反应是否完全要有合适的方法进行检测。由于茚三酮在加热条件下能和自由氨基反应形成紫或黄色化合物，所以多肽固相合成中一般选择茚三酮显色反应作为检验氨基羧基缩合反应是否完全的指标。当茚三酮显色反应证实偶联反应已经完全后，洗脱没有连接到树脂的自由氨基酸，再加入新的保护氨基酸进行新的偶联反应。然后根据伊匹乌肽的氨基酸序列，依次加入其他保护的氨基酸到树脂溶液中，重复进行，直至整个肽链合成的完成。
(4)肽链从树脂上的裂解(切割)，获得多肽粗品：当全长肽链的连接反应完成后，把合成的肽链从树脂上裂解下来，并去除树脂，通过乙醚沉淀，并洗涤多肽沉淀，获得多肽粗品用于下步多肽的精制。
在伊匹乌肽粗品合成工艺中，采用CTC树脂作为多肽合成载体，以Fmoc保护的氨基酸作为原料，选择DIC/HOBt作为主要的肽链形成缩合剂，合成完成后，选用TFA/苯酚/水/茴香硫醚/EDT作为切割脱保护体系。采用该工艺完成多批伊匹乌肽粗品的合成，冻干后粗品中伊匹乌肽的纯度为45％～55％。
2、伊匹乌肽粗品精制和原料药的生产：
通过上述固相合成方法获得的粗肽在纯化水中溶解后，经制备型高效液相色谱柱分离纯化，收集纯度超过90％的组分，经过醋酸盐转化和冷冻干燥后，冻干粉末即为伊匹乌肽原料药。
伊匹乌肽原料药生产工艺流程是分两步进行，粗品的合成和多肽分离纯化精制。这两个步骤都容易放大，另外，原料药生产关键的步骤-多肽分离纯化和精制采用制备型高效液相色谱法，原料药冻干粉是通过收集多批次的产品合并而成，所以未来大生产批量可以方便简单的通过增加分离纯化批次达到。
采用该多肽制备的多肽滴眼液，其中多肽按重量百分数计的0.05-1％。多肽滴眼液主要为水，还可以包含其他辅剂如渗透压调节剂、防腐剂和pH值调节剂，如可选将多肽滴眼液的pH值控制在7.3-7.4。
进一步地，所述的渗透压调节剂为氯化钠。
进一步地，其特征在于：所述防腐剂为羟苯甲酯钠。
进一步地，所述pH值调节剂为氢氧化钠。
实施例1：一种多肽滴眼液，包括按重量百分数计的伊匹乌肽0.1％、渗透压调节剂氯化钠0.9％、防腐剂羟苯甲酯钠0.1％和pH值调节剂氢氧化钠，该多肽滴眼液的pH值控制在7.3～7.4；余量为水。
实施例2：一种多肽滴眼液，包括按重量百分数计的伊匹乌肽0.05、渗透压调节剂0.7、防腐剂0.05和pH值调节剂，其余为水；该多肽滴眼液的pH值控制在7.3-7.4。
实施例3：一种多肽滴眼液，包括按重量百分数计的伊匹乌肽0.5％、渗透压调节剂1.2％、防腐剂0.3和pH值调节剂，其余为水；该多肽滴眼液的pH值控制在7.3-7.4。
实施例4：一种多肽滴眼液，其特征在于：包括按重量百分数计的伊匹乌肽0.25％、渗透压调节剂1.1％、防腐剂0.2和pH值调节剂，其余为水；该多肽滴眼液的pH值控制在7.3-7.4。
本发明提供多肽滴眼液对内毒素所致葡萄球膜炎的作用研究，通过建立内毒素所致的小鼠葡萄球膜炎模型来评估伊匹乌肽滴眼液的药效作用。
材料和方法
1.实验动物具体如下表1所示
表1
2.药物与试剂
2.1受试药物
名称：多肽滴眼液
配制方法：使用万分之一天平分别称取伊匹乌肽原料药0.027g于称量瓶内，在洁净工作台用移液枪吸取经0.22μm滤膜过滤处理的滴眼液辅料(渗透压调节剂、防腐剂和pH值调节剂，此处可以与某一实施例的配方对应)3ml置于瓶中，轻轻振摇至溶解澄清，保存于4℃冰箱备用。
2.2阳性对照药物
名称：妥布霉素地塞米松磷酸钠滴眼液
生产单位：美国爱尔康药厂比利时分厂
批号：18E06CA有效期至：2020年2月
2.3造模试剂
名称：伤寒杆菌内毒素(LPS,sigma公司)
生产单位：sigma公司
配制方法：用生理盐水溶解，终浓度为2mg/ml。
3动物分组
BALB/C雌鼠12只，随机分为阴性对照组、模型组(EIU)、0.9％TAT-N16组、阳性组(0.1％地塞米松滴眼液)每组3只。
4、模型制备及给药
除正常组外，模型组，阳性组和受试物组分别在BALB/C雌鼠玻璃体腔注射LPS，每只小鼠每眼注射总量为200ng。小鼠注射LPS后，阳性组立即双眼滴妥布霉素地塞米松滴眼液。受试物组双眼滴伊匹乌肽滴眼液，正常组和模型组双眼滴生理盐水。小鼠双眼滴眼每次10微升每侧，24h内滴眼6次，具体如下表2所示。
表2
5.观察指标
5.1裂隙灯观察
采用裂隙灯显微镜进行临床检查，临床表现由两名专业眼科医师按表3进行评估。
表3：葡萄球膜炎临床评分
5.2组织病理学观察
各组动物在造模24小时后取两眼前房及视网膜进行H&E染色。小鼠脱颈处死后，立即取出双眼，用4％多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，染色，透明封片，光镜下观察。
5.3房水蛋白的浓度
抽取小鼠房水，用BCA法测其总蛋白浓度。
5.4荧光定量PCR
用Trizol试剂(Invitrogen,Carsbad,CA)从小鼠眼部组织复合物中提取总RNA，采用SYBR Green Realtime PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，检测TNF-α,IL-1β，IL-2、IL-6,NF-κBp65等炎症因子的mRNA表达水平。下表4为检测这些炎症因子mRNA表达水平用的DNA引物序列。
表4：检测炎症因子mRNA表达水平引物序列
6.统计学处理
采用SPSS20.0统计软件分析，数据均用平均值±标准差表示，对试验数据进行组间t检验，*p<0.05表示有显著差异，**p<0.01表示有极显著差异，***p<0.001表示非常显著性差异。
实验结果
1.眼睛炎症症状的观察
LPS眼底注射造模后，动物开始出现流泪、眼角分泌物，结膜充血和水肿等症状，与正常组比较差异非常明显，小鼠眼底照片详见图二所示。按照眼刺激实验评分标准进行评分，评分明显高于正常组动物，表明在小鼠眼睛建立葡萄膜炎症模型成功。
动物造模成功后随机分组给药治疗，24h内不同时间点对各组动物进行眼刺激评分，眼刺激积分结果详见图3。与模型组相比，造模24小时后，妥布霉素地塞米松滴眼液组、伊匹乌肽滴眼液剂量组葡萄球膜炎症状都有明显的改善，眼刺激积分减少有显著差异(p<0.001)。
2.房水中总蛋白含量测定
造模24h后，抽取房水并测定房水中蛋白质含量，检测的结果如图4所示。和正常组相比，模型组动物房水中蛋白质含量明显增多，表明炎症模型的成功建立，同时，和模型组相比，伊匹乌肽用药组和阳性药物处理组动物房水中蛋白质含量减少非常明显，说明伊匹乌肽抑制眼炎的效果明显，具有和目前临床治疗炎症常用的药物的消炎效果类似。
3.组织病理观察炎症细胞侵润
各组动物在造模24小时后取两眼前房及视网膜进行H&E染色以观察眼部炎症细胞的侵润。结果见图5。和对照组相比，模型组中眼睛炎症细胞明显增多，表明炎症模型的成功建立，同时，和模型组相比，伊匹乌肽用药组和阳性药物处理组动物眼睛里炎症细胞明显减少，说明伊匹乌肽抑制眼炎的效果明显，具有和目前临床治疗炎症常用的药物的消炎效果类似。
4.多种炎症因子的表达水平
各组动物在造模24小时后取两眼前房及视网膜提取total RNA，并通过荧光定量PCR测定多个重要炎症因子的mRNA表达水平，结果见图6。和对照组相比，模型组中IL-1β，IL-2,IL-6，NF-κBp65和TNF-a的mRNA表达水平明显增加，表明炎症模型的成功建立，同时，和模型组相比，伊匹乌肽用药组和阳性药物处理组动物眼睛里炎症因子IL-1β，IL-2,IL-6，NF-κBp65和TNF-a的mRNA表达水平明显减少，说明伊匹乌肽抑制眼炎的效果明显，具有和目前临床治疗炎症常用的药物的消炎效果类似。
结论
伊匹乌肽滴眼液能有效改善小鼠葡萄球膜炎的临床症状，明显减轻小鼠眼结膜充血和水肿。伊匹乌肽滴眼液通过减少多种重要的炎症因子的产生和分泌，从而有效的阻断炎症过程。达到治疗效果，伊匹乌肽滴眼液对内毒素所致小鼠葡萄球膜炎有明显的治疗作用，进一步证实了伊匹乌肽的抗炎功效，表明伊匹乌肽滴眼液是临床眼科炎症的有效药物。
目前已针对本发明提供的滴眼液征集志愿者进行试用，为了进一步证明多肽滴眼液的治疗效果，现提供部分病例以供参考。
病例1：王某，过敏性结膜炎，采用本发明提供滴眼液进行治疗，1mg/ml滴眼液每个眼球两滴，滴后稍有刺激感，三分钟左右消失，七分钟左右眼感舒适，眼干减轻，缓持二三小时。用后症状明显减轻，结膜充血也明显好转。其使用前和使用后的眼部照片如图7所示。
病例2：严某某，角膜炎，采用本发明提供滴眼液进行治疗，滴时稍有“辣感”，二三分钟消失，滴后症状缓解三小时左右。目前眼痒，见风流泪，发作明显减少，程度也明显减轻，结膜充血也减轻，属显效。
病例3：潘某某，男，31岁，眼痒一周，频繁揉眼，有过敏性鼻炎病史，结膜稍充血，滴三天左氧氟沙星眼药水无效。诊断为过敏性结膜炎，今给予多肽滴眼液进行治疗，滴时刺激反应明显，五分种反应消失，十分钟后眼痒稍减轻，维持二个多小时。用后症状轻些，结膜充血也好转。
病例4：何某某，女，65岁，新病人。眼痒，刺激感一月，结膜无感染充血体征，诊断为过敏性结膜炎，今给予多肽滴眼液进行治疗，自述滴时有轻微刺激反应，三分钟后消失，六分钟后眼痒减轻，维持三小时左右。
病例5：姚某，眼痒多年，见风流泪，曾用其它眼药水，药名不详，疗效欠佳。上月已换用多肽滴眼液，点滴时稍有刺激感，三分钟消失，睁开后眼感舒适，症状缓解，维持一二小时。近期眼痒，见风流泪次数明显减少，程度也减轻。结膜充血也好转。用药前症状一直持续存在，没有出现长时间缓解的状态。
Claims (1)
1.一种多肽滴眼液在制备用于治疗眼部炎症药物中的应用，其特征在于：该多肽滴眼液包括按重量百分数计的多肽0.05-1%，该多肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRMMPYSTELIFYIEMDP；所述的眼部炎症为结膜炎、角膜炎、和/或葡萄膜炎。
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