CN113354714B - 一种广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用,其包括活性肽段,所述活性肽段的氨基酸序列为MMTYSTELIFYIEMDP,还包括加载在活性肽段N端的跨膜结构或脂肪酸,所述脂肪酸为正癸酸、月桂酸或棕榈酸,具有该结构的多肽化合物为非甾体类抑制剂,以PI3K亚型成员p55PIK为靶点,能有效抑制炎症的发生,饱和脂肪酸连接至N端,能有效帮助活性区透过细胞膜,到达靶点部位,发挥功效,桥接聚乙二醇既能增强极性容易透膜又能增加水溶性,成药性强,C端结构可以增加制剂稳定性,具有良好的成药性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药中的多肽抑制剂领域,具体涉及一种广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用。
背景技术
身体组织对各种内外原因引起的损伤进行防御和修复,引起炎症,其基本病理变化有变质、渗出和增生,其临床表现为红、肿、热、痛、功能障碍,其全身反应为发热、白细胞增多等。
炎症在生活中无处不在,影响到每个人,是人类健康的最大敌人。所以,炎症治疗是没有满足的巨大医疗需求,由于靶点的限制,甾体激素毒副作用无法消除,自发现以来没有更新换代药物出现,甾体激素抗炎药物急需替代。
目前报导的自身免疫性疾病和炎症疾病激酶抑制剂,主要针对靶点JAKs和TYK2,其中JAKs为非受体型酪氨酸蛋白激酶,相对分子量130000,靶点TYK2为非受体酪氨酸蛋白激酶2,由于安全性和治疗窗窄方面的问题,JAKs抑制剂的发展仍面临诸多挑战。
抑郁症是一种严重的精神障碍疾病,其发病机制复杂。近年来随着对抑郁症发病机制的深入研究,发现了一些基于非单胺递质的新型抗抑郁药物分子靶标,N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid,NMDA)受体拮抗剂氯胺酮可以迅速起效缓解抑郁症状,效果可以持续7天,能降低自杀风险,临床抗抑郁效果较好,但氯胺酮是一种毒品,成瘾性限制了它的发展。NMDA受体作为氯胺酮药效的靶点,引起广泛关注,可以大胆的预测,对其的调节可能迅速有效的缓解抑郁症状。
磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白家族(PI3Ks)蛋白同免疫反应密切相关,其调节亚单位和催化亚单位的表达缺失或应用相应的PI3Ks抑制剂能够对免疫反应产生显著影响,其中,IA类PI3Ks调节亚单位能够通过其i-SH2结构域同相应的催化亚单位形成二聚体结构,进而调控催化亚单位的激酶活性。
目前,关于IA类PI3Ks亚单位对免疫反应尤其是炎症反应的调控作用存在较多争议,旨在明确IA类PI3Ks调节亚单位p55PIK对炎症反应的调控作用,初步探讨蛋白p55PIK对炎症反应的调控作用的机制。
p55PIK能够通过激活NFκB信号通路促进免疫细胞炎症因子转录和翻译,高表达p55PIK能够促进LPS诱导的炎症因子转录,翻译以及NFκB信号通路和PI3K/AKT通路激活;低表达p55PIK能够抑制LPS诱导的炎症因子转录翻译,以及减少NFκB信号通路和PI3K/AKT通路的激活。
蛋白p55PIK能够通过促进NFκB RelA转录活性,正向调控炎症反应,蛋白p55PIK与NFκB信号通路蛋白NFκB p65可能在免疫过程例如pV、PMA作用中相互结合。
穿膜融合多肽IP55能有效进入细胞,抑制肿瘤细胞细胞周期进程,抑制DNA合成,在单核巨噬细胞系采用穿膜融合多肽IP55预处理能够显著抑制LPS诱导的促炎因子TNF-α、IL-6以及IL-1β产生,在原代单核巨噬细胞采用穿膜融合多肽IP55预处理能够部分抑制LPS诱导的单核巨噬细胞THP1促炎因子TNF-α产生;在LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型采用穿膜融合多肽IP55预处理能够部分抑制LPS诱导的肝脏细胞NFκB p65的核转位以及减少急性肝损伤造成的小鼠死亡。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用,其为非甾体类抑制剂,以NMDA和PI3K亚型成员p55PIK为双靶点,有效抑制炎症的发生。
为了达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种广谱抗炎多肽化合物,其包括活性肽段,所述活性肽段从N端到C端的氨基酸序列如下:
蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酰胺,缩写为MMTYSTELIFYIEMDP;
或蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酰胺,缩写为MMTYSTELIFYIEMDPG。
进一步,所述广谱抗炎多肽化合物还包括加载在活性肽段N末端的跨膜结构或脂肪酸。
优选地,所述跨膜结构为YGRKKRRQRRR,所述脂肪酸为正癸酸、月桂酸或棕榈酸。
又,所述广谱抗炎多肽化合物的跨膜结构或脂肪酸与活性肽段N端氨基酸之间串联设置桥接段。
又,所述桥接段为PEG2、GGGG或PEG2-PEG2。
优选地,所述广谱抗炎多肽化合物具有如下结构:
YGRKKRRQRRRMMTYSTELIFYIEMDP-NH2;
CH3(CH2)8CO-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2;
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2;
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2;
CH3(CH2)8CO-PEG2-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2。
进一步,结构为CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2的广谱抗炎多肽化合物分子量为2339.78g/mol,等电点为3.9。
本发明提供所述以NMDA和p55PIK为靶点的广谱抗炎多肽化合物在制备治疗炎症疾病药物中的应用。
进一步,所述炎症为心肌炎、类风关、帕金森、忧郁症、老年痴呆、红斑狼疮、脓毒症、眼底病、慢阻肺、新冠肺炎、哮喘、溃疡性肠炎、眼炎、干眼病、鼻炎、中耳炎、皮炎、溃疡糜烂、烧烫伤或糖尿病足。
本发明的广谱抗炎多肽化合物主要针对自身免疫性疾病和炎症疾病,对炎症引起的慢性病和机体免疫缺陷有良好的改善和治疗作用。
本发明中,脂肪酸-桥接段-活性肽段的结构中,采用脂肪酸作为透膜载体,桥接段增加化合物分子量和极性,延长半衰期,脂肪酸和桥接段透膜载体比较牢固;组合活性区可增加水溶性和稳定性、增强活性疗效,该结构中,十六肽活性肽段中的第14位为苏氨酸,十七肽的活性肽段C端为甘氨酸,增强抗炎肽的机体抗炎活性,激活机体免疫性疾病的疗效,实验证明对忧郁症和干眼症具有显著疗效,碳原子数在8-16的饱和脂肪酸能够有效转运活性区,桥接PEG2既能增强极性容易透膜又能增加水溶性,成药性强。
本发明中多肽化合物YGRKKRRQRRRMMTYSTELIFYIEMDP-NH2的结构为跨膜区+活性区,多肽化合物CH3(CH2)8CO-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2采用脂肪酸+活性区结构,具备抗炎功效,脂肪酸能够有效转运活性区;多肽化合物CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2采用脂肪酸+PEG2+活性区结构,具备抗炎功效,脂肪酸能够有效转运活性区,桥接PEG2既能增强极性容易透膜又能增加水溶性,成药性强。
多肽化合物CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2采用脂肪酸+PEG2+活性区结构,脂肪酸能够有效转运活性区,桥接PEG2和甘氨酸既能增强极性容易透膜又能增加水溶性,桥接PEG2还能增加分子量延长化合物的半衰期,具备良好的抗炎功效,溶液性制剂成药性强、稳定性好;多肽化合物CH3(CH2)8CO-PEG2-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2设计采用脂肪酸+PEG2+PEG2+活性区结构,脂肪酸能够有效转运活性区,桥接串联两个PEG2虽能增强极性和水溶性,具备良好的抗炎功效。
本发明提供所述广谱抗炎多肽化合物的制备方法,包括如下步骤:
1)树脂溶胀
替代度为0.45-0.6mmol/g的氨基树脂为起始树脂,与溶剂DMF进行溶胀,温度30~40℃,N2吹拂搅拌20-30min至树脂充分泡涨,除去多余的DMF,得到溶胀后的树脂;
2)偶联反应
采用Fmoc固相合成法,将由Fmoc基团保护的氨基酸与溶胀后的树脂在缩合剂、防消旋剂存在下进行偶联反应,脱除前一氨基酸上的Fmoc保护基后再进行后一个氨基酸的偶联反应,将氨基酸逐次偶联至树脂上;其中,由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为:Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH;
或Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH;
所述偶联反应中,缩合试剂为HBTU、HOBt和DIEA,偶联反应时间为1.5-2小时,偶联温度范围,激活温度范围13-17℃;
在树脂上完成16或17个氨基酸的偶联反应之后,再偶联由Fmoc保护的跨膜结构、桥接段和/或脂肪酸,反应产物经DMF、甲醇收缩后干燥,得到侧链带保护基团的全保护肽树脂;
3)裂解反应
将全保护树脂与裂解液在33-37℃下机械搅拌反应2.5-3.5小时后,滤除液体,在乙醚中进行沉降,洗涤、干燥,得到粗肽;其中,所述裂解液由TFA、三异丙基硅烷、纯水组成;
4)纯化、冻干
将步骤3)获得的粗肽溶解后通过高效液相色谱进行两次纯化,游离、冻干后获得所述的广谱抗炎多肽化合物,其中,第一次纯化的流动相为三氟乙酸体系,第二次纯化的流动相为醋酸体系。
优选地,步骤1)中,所述氨基树脂为Rink Amide MBHA Resin,所述树脂与溶胀溶剂的质量体积比为1:5-8。
又,步骤3)中,干燥时,干燥温度为20-30℃,维持压力在-0.09Mpa以下,干燥6h以上至恒重,即2小时内重量变化百分比小于1.0%。
本发明中,在粗肽的第一次纯化中,收集纯度大于95%以上,单杂小于3%的样品合并,去除与目的肽色谱性质差异较大杂质,以及残留在粗肽溶液样品中的溶剂,第二次纯化中,收集纯度大于98.5%以上,单杂小于0.5%的样品合并,28-32℃浓缩,去除多数与主峰色谱保留特性接近的杂质。
本发明的多肽化合物碳端为胺化结构,在固相合成时其起始树脂需选择氨基树脂,确定反应树脂后,进行树脂替代度的选择,替代度太高会增加反应杂质,反应不能充分进行,影响产物纯度,替代度太低会影响成本,替代度在0.45-0.6mmol/g时,粗肽纯度为78%,超出此范围,粗肽纯度在65%以下。
本发明中,保护氨基酸的反应当量太高会增加反应的杂质,以及增加生产成本,当量太低会影响反应的速率和反应不充分,将反应当量设为3.0eq时,合成收率较高。
本发明的多肽合成过程中,需要切掉保护基团和树脂,选用的裂解液为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷Tis和水体系,切割温度为33~37℃,裂解时间2.5小时,该裂解体系完整、配比适宜、极性良好、气味较小,稳定性好、脱除效果达60%,味道较小,收率高、纯度好。
裂解结束后,用乙醚或甲基叔丁基醚进行沉降,能够让多肽从裂解液里面析出来,尽可能洗去裂解过程中的一些裂解试剂和产生的杂质;甲基叔丁基醚沉降比例主要取决于裂解液的量,更好的让多肽从裂解液里面析出来,尽可能洗去裂解过程中的一些裂解试剂和产生的杂质。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明的抗炎多肽属于双靶点原研创新药,是针对NMDA和PI3K亚型成员p55PIK的双靶点抑制剂,针对NMDA受体,特点是药物起效快、药效持续时间长;同时,该多肽化合物是首个针对PI3K调节亚基的PPI抑制剂,通过阻断p55PIK介导的信号通路抑制细胞增殖,降低NF-kB转录活性。
本发明的多肽化合物是新化合物实体,包括正癸酸-聚乙二醇-多肽活性区,多肽活性区以以NMDA和PI3K亚型成员p55PIK为靶点,有效抑制炎症的发生;饱和脂肪酸正癸酸、月桂酸或棕榈酸作为跨膜区侧链,连接至N端,能有效帮助活性区透过细胞膜,到达靶点部位,发挥功效,桥接聚乙二醇既能增强极性容易透膜又能增加水溶性,成药性强,C端桥接甘氨酸可以进一步增加制剂稳定性。
本发明采用多肽固相合成法制备多肽化合物,Fmoc基对酸很稳定,但能用哌啶很方便地脱去,这样在脱Fmoc时,对侧链保护基没有影响,肽链也不会被切割下来,完全达到交叉保护的目的,为优化工艺提供收率、减少杂质产生及增加成药性,优选反应条件和工艺参数设计科学合理。
附图说明
图1为本发明实施例4中的小鼠强迫游泳实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
材料、仪器型号来源:
间接检眼镜、iCare眼压计、KOWA手持裂隙灯(SL-17视频版)、光太Vitra 532nm激光仪、Heidelberg激光眼科诊断仪、台式裂隙灯显微镜系统等;分析仪器:Waters 2695检测器2996;分析色谱柱:Agilent C185um 300A。
实施例1一种广谱抗炎多肽化合物Dec-MTG-17的制备方法
多肽序列:Dec-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDPG-NH2;
三字符号:
Dec-AEEA-Met-Met-Thr-Tyr-Ser-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-Tyr-Ile-Glu-Met-Asp-Pro-Gly-NH2;
中文序列:正癸酸-AEEA-蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酰胺;
分子量:2339.78g/mol;
分子式:C108H167N19O32S3;
等电点:3.9;
PH=7时的净电荷:-2.0;
平均亲水性:0.4;
亲水残基比例:24%;
结构式如下:
具体制备方法包括如下步骤:
1.树脂溶胀
称取取代度为0.5mmol/g的Rink Amide MBHA Resin 2.0g加入到100ml反应柱中,加入15mlDMF在温度30~40℃下溶涨,N2吹拂搅拌20-30min至树脂充分泡涨,溶胀结束后,抽去DMF,得到溶胀后的树脂。
2.偶联反应
采用Fmoc固相合成法,将由Fmoc基团保护的氨基酸与溶胀后的树脂在缩合剂、防消旋剂存在下进行偶联反应,将氨基酸逐次偶联至树脂上;
将偶联后的反应树脂加入15ml DBLK(25%PIP/DMF)试剂进行脱保护处理,脱除时间为20min,即脱除Fmoc基团,以便于与下一个氨基酸偶联生成肽键;脱保护反应结束后,分别用DMF×1、甲醇×2、DMF×4,共洗涤7次,每次用量15ml,每次2-3分钟,抽干产品,取少量树脂茚三酮检测显阳性。
将已溶解好的3倍量反应液(将Fmoc-Gly-OH、HOBt、HBTU置于50ml烧杯中,加入10ml DMF溶剂,冰浴、搅拌至全溶)加入树脂中,再补加5ml DMF溶剂,N2吹拂搅拌同时缓慢加入1.0ml DIPEA,温度控制在35±2℃并搅拌反应30min,抽干反应液,DMF洗涤3次,每次用量15ml,每次2-3分钟,取少量树脂茚三酮检测,显阴性,则反应完全,进入下一个循环。
在偶联反应中,脱除前一氨基酸上的Fmoc保护基后作为反应树脂再进行后一个氨基酸的偶联反应,其中,以氨基酸树脂的摩尔比为1eq,带Fomc保护基的氨基酸为3eq,缩合试剂为HBTU和DIEA,防消旋剂为HOBt,洗涤溶剂为DMF和甲醇,偶联反应时间为1.5-2小时,偶联温度范围,激活温度范围33-37℃;脱保护时,以25%PIP/DMF为脱保护剂,在所有的偶联反应中,投料比例保持一致,参见表1;
表1
原料/溶剂 | 投料量 | 允许范围 | 摩尔比 | 备注 |
反应树脂 | 1mmol | 0.1mmol | — | 原料 |
25%PIP/DMF(V/V) | 15ml | ±2ml | 3.0倍×1(V/V) | 脱保护剂 |
DMF | 75ml | ±10ml | 2.5倍×1(V/V) | 洗涤溶剂 |
MeOH | 30ml | ±5ml | 2.5倍×1(V/V) | 洗涤溶剂 |
Fmoc-Gly-OH | 0.9g | ±10mg | 3.0eq | 原料 |
HOBt | 4.06g | ±5mg | 3.0eq | 防消旋剂 |
HBTU | 1.149g | ±10mg | 3.0eq | 缩合剂 |
DIPEA | 1ml | ±0.1mL | 6.0eq | 缩合试剂 |
DMF | 15ml | ±5mL | 2.5倍×1(V/V) | 反应溶剂 |
由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为:Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH。
在树脂上完成17个氨基酸的偶联反应之后,再偶联桥接段Fmoc-AEEA-OH、正癸酸Decanoic acid,反应产物分别用DMF×4、甲醇×2、每次用量15ml,每次2-3分钟,然后再用甲醇收缩两次,每次用量15ml,每次3-5分钟,抽干,减压干燥24h至恒重,得到全保护肽树脂,参见表2。
表2
原料/溶剂 | 投料量 | 允许范围 | 摩尔比 | 备注 |
偶联反应产物 | 1mol | 0.1mmol | — | 原料 |
DMF | 75ml | ±10ml | 2.5倍×1(V/V) | 洗涤试剂 |
MeOH | 30ml | ±5ml | 2.5倍×1(V/V) | 试剂 |
3.裂解反应
在500ml的裂解烧瓶中加入约10g全保护肽树脂,加入已冰浴降温处理的裂解液(TFA、三异丙基硅烷、纯水的100ml混合液)让其在温度为35±2℃下机械搅拌反应3小时,滤出液体,缓慢的加入装有600ml无水乙醚的烧杯中,待其自然沉降,30分钟后去除上清液,将带有无水乙醚的粗肽进行过滤处理,倒出上清液,用无水乙醚洗粗肽,再次过滤,以此循环上述两步操作3~4次。
所得湿品进行真空干燥,控制干燥箱温度在25±5℃,维持压力在-0.09Mpa或以下,干燥12h(6h以上)至恒重(即2小时内重量变化百分比小于1.0%)。称重,得到Dec-MG-17粗肽2.27g(理论值),放入合适容器中,贴上标签,在2~8℃下密封保存,取粗品进行质谱检测和纯度检测,具体投料配比参加表3。
表3Dec-MTG-17粗肽的制备投料配比表
原料/溶剂 | 投料量 | 允许范围 | 体积比 | 备注 |
全保护肽树脂 | 10g(理论) | 0.1mmol | — | 中间体 |
TFA | 95ml | ±5ml | 95 | 裂解试剂 |
三异丙基硅烷(Tis) | 2.5ml | ±0.5ml | 2.5 | 裂解试剂 |
纯水 | 2.5ml | ±0.5ml | 2.5 | 裂解试剂 |
无水乙醚 | 2L | ±100ml | 沉降,洗涤试剂 |
4.纯化、冻干
将步骤3)获得的Dec-MG-17粗肽溶解后通过高效液相色谱进行两次纯化,游离、冻干后获得所述的广谱抗炎多肽化合物,其中,第一次纯化的流动相为三氟乙酸体系,第二次纯化的流动相为醋酸体系。
1)Dec-MTG-17粗品分析方法及仪器
分析方法:分析型高效液相色谱仪梯度洗脱分离
分析仪器:Waters 2695检测器2996
分析色谱柱:Agilent C185um 300A
2)分析条件:
流动相:A相:0.1%TFA+水;B相:0.1%ACN
检测波长:215nm;柱温:50℃;流速:1.0mL/min
Dec-MTG-17粗品溶解过滤:将2,27g Dec-MTG-17粗品用含5%的ACN水溶液进行溶解,溶解浓度约10mg/ml,溶解体积230ml搅拌30min至澄清,溶液呈淡黄色,无颗粒;用0.45um有机滤膜过滤,过滤结束后定量。
过滤目的:选择合适材质的0.45μm滤膜对Dec-MTG-17粗品进行过滤,除去不溶性物质。
3)一纯工艺开发
一纯目的:浓缩样品并去除与目的肽色谱性质差异较大杂质,以及残留在粗肽溶液样品中的溶剂。
色谱柱:5cm×250mm 1根,填料Daisogel-SP-120-50-ODS-AP;
操作:将粗品过滤液通过制备型HPLC的制备泵上样,每次抽取不超过3g的Dec-MTG-17多肽液体上样。
制备方法:制备型液相色谱仪梯度洗脱分离。
制备仪器:汉邦或是创新通恒制备型高效液相色谱仪
流动相:A相:0.1%TFA+H2O;B相:0.1%TFA+80%ACN+20%H2O;
检测波长:λ=220nm;
柱温:室温;
梯度洗脱条件:梯度洗脱条件:A相:B相从50:50到40:60洗脱15min,从40:60到65:35洗脱50min,流量60ml/min。
收集纯度大于95%以上、单杂小于3%的样品合并,检测纯度,定含肽量。
4)二纯工艺开发
二纯目的:去除多数与主峰色谱保留特性接近的杂质。
色谱柱:选用1根5cm×250mm色谱柱,任意选一种填料YMC-SP-120-10-ODS-A、YMC-SP-120-10-ODS-AQ和Daisogel-SP-120-10-ODS-AP。
操作:将粗品过滤液通过制备型HPLC的制备泵上样,每次抽取不超过5g的Dec-MTG-17多肽液体上样。
制备方法:制备型液相色谱仪梯度洗脱分离。
制备仪器:汉邦或创新通恒制备型高效液相色谱仪
流动相:A相:0.1%HAc+H2O;B相:0.1%HAc+80%ACN+20%H2O;
检测波长:λ=220nm;
柱温:室温;
梯度洗脱条件:A相:B相从45:55到40:60洗脱15min,从40:60到75:25洗脱50min,流量60ml/min。
收集纯度大于98.5%以上、单杂小于0.5%的样品合并,检测纯度,定含肽量。
利用0.055—0.065%醋酸为洗脱流动相,以50mM乙酸铵醋酸为离子转换流动相,调pH3.5,进行洗脱,将样品中的成盐离子置换为醋酸根离子,转换完成后进行冻干,获得Dec-MTG-17多肽化合物。
实施例2Dec-MTP-16多肽化合物的制备方法
多肽序列:Dec-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2
三字符号:
Dec-AEEA-Met-Met-Thr-Tyr-Ser-Thr-Glu-Leu-Ile-Phe-Tyr-Ile-Glu-Met-Asp-Pro-NH2
中文序列:正癸酸-AEEA-蛋氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-络氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-络氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-脯氨酰胺
分子量:2282.73g/mol;
分子式:C106H164N18O31S3;
等电点:3.9;
PH=7时的净电荷:-2.0;
平均亲水性:0.4;
亲水残基比例:25%;
Dec-MTP-16多肽化合物的结构式如下:
偶联反应中,由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为:Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH。
在树脂上完成16个氨基酸的偶联反应之后,再偶联桥接段Fmoc-AEEA-OH、正癸酸Decanoic acid。
其余操作参照实施例1的方法。
本实施例中,选择了不同条件进行偶联反应,具体反应条件及结果见表4-14。
1.不同树脂类型及替代度
表4不同类型树脂的实验结果
起始树脂 | 替代度 | 粗品收率% |
RinkAmideMBHAResin | 0.45mmol/g | 60% |
AmResin | 0.45mmol/g | 60% |
表5不同类型树脂的实验结果
起始树脂 | 替代度 | 粗肽纯度% |
RinkAmideMBHAResin | 0.3-0.45mmol/g(低) | 60% |
RinkAmideMBHAResin | 0.45-0.6mmol/g(中) | 78% |
RinkAmideMBHAResin | 0.6-0.85mmol/g(高) | 65% |
实验结果显示,选择替代度为0.45-0.6mmol/g的树脂时,收率较高。
2、保护氨基酸的不同反应当量
设置不同的反应当量进行偶联反应,具体参见表6。
表6不同保护氨基酸反应当量的实验结果
保护氨基酸反应当量 | 粗肽纯度% | 合成收率 |
2eq | 66% | 50% |
3eq | 80% | 60% |
4eq | 70% | 55% |
由表6可见,当量太高会增加反应的杂质,增加生产成本,当量太低会影响反应的速率和反应不充分。
3、不同缩合试剂对合成的影响
表7不同缩合试剂的实验结果
不同缩合试剂 | 粗肽纯度% | 合成收率 |
HOBt/DIC | 70% | 56% |
HBTU/HOBT/DIEA | 76% | 60% |
由表7可见,采用HBTU、HOBT和DIEA缩合试剂粗肽纯度和收率比较理想。
4、偶联时间的选择
进行偶联反应时间主要取决于合成规模,合成反应速率和随着时间推移产生的一些副反应三点考虑。
表8不同保护氨基酸反应当量的实验结果
偶联反应时间 | 粗肽纯度% | 合成收率 |
1h | 65% | 50% |
2h | 80% | 60% |
3h | 68% | 55% |
可见,根据Dec-MTP-16粗肽纯度和合成收率来看,该化合物偶联反应时间的最佳时间为2h。
5、偶联温度的选择
不同偶联反应温度的实验结果参见表9。
表9不同偶联反应温度的实验结果
偶联反应温度 | 粗肽纯度% | 合成收率% |
25±2℃ | 75% | 56% |
35±2℃ | 80% | 60% |
由表9可见,根据Dec-MTP-16粗肽纯度和合成收率来看,反应温度35±2℃较为合适。
6、激活温度的选择
在上述反应条件确定的情况下,进行激活温度的选择实验,激活温度分别为0±2℃、15±2℃、30±2℃,参见表10。
表10不同激活温度的实验结果
激活温度 | 粗肽纯度% | 合成收率 |
0±2℃ | 60% | 50% |
15±2℃ | 78% | 60% |
30±2℃ | 68% | 55% |
根据Dec-MTP-16粗肽纯度和合成收率来判断最适的激活温度15±2℃。
7、裂解液配比选择
从多肽序列分析,需要切掉的保护基团有tbu和树脂,分别选用以下裂解液配比进行实验,实验结果参见表11:
1.TFA:TIS:苯甲醚=95:3:2;
2.TFA:苯甲硫醚:苯甲醚=95:1:4;
3.TFA:TIS:水=95:2.5:2.5;
4.TFA:苯甲硫醚:苯甲醚=95:3:2;
5.TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:水=95:1:3:1。
表11不同配比的裂解液对裂解效果的影响
由表11可见,结合Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率,TFA:Tis:水=95%:2.5%:2.5%的组合裂解效果较好,且味道较小,对环境影响小。
8、不同裂解反应温度
表12裂解反应温度对裂解效果的影响
裂解反应温度(℃) | 粗肽纯度(%) | 合成收率(%) |
20±2 | 65% | 50% |
25±2 | 70% | 52% |
30±2 | 75% | 55% |
35±2 | 78% | 60% |
40±2 | 70% | 54% |
由表12可见,以Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率,合适的反应温度为35±2℃。
9、裂解反应时间选择
裂解反应时间主要取决于裂解树脂的量和裂解效果等,分别选用不同的裂解时间进行实验,参见表13。
表13裂解反应温度对裂解效果的影响
由表13可见,以Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率来看,合适的切割温度为2-3h。
10、甲基叔丁基醚沉降比例的选择
甲基叔丁基醚沉降比例主要取决于裂解液的量,更好的让多肽从裂解液里面析出来,尽可能洗去裂解过程中的一些裂解试剂和产生的杂质,分别选用不同的沉降液比例进行实验
表14沉降比例对实验的影响
沉降液比例 | 粗肽纯度% | 合成收率% |
1:3 | 65% | 50% |
1:6 | 70% | 55% |
1:10 | 76% | 60% |
由表14可见,以Dec-MTP-16粗肽纯度及合成收率看,合适的甲基叔丁基醚沉降液体积比例为甲基叔丁基醚:裂解液=1:10。
实施例3干眼症动物模型的药效评价
1、给药技术及眼组织取材
眼局部给药:结膜囊滴眼;玻璃体腔注射;前房注射;球后注射;视网膜下注射
眼组织取材:角膜、房水、结膜、虹膜、晶状体、视网膜
2、眼科药效学动物模型
1)莨菪碱诱导的干眼症(C57小鼠或SD大鼠);前房注射粘弹剂诱导的急性青光眼(新西兰兔);
角膜内皮损伤模型(新西兰兔);激光光凝诱导的脉络膜新生血管(NHP)
2)高氧诱导的视网膜新生血管(C57乳鼠);STZ诱导的糖尿病视网膜病变(BN大鼠);视神经损伤模型(SD大鼠);苯扎溴铵诱导的干眼症(SD大鼠)
3)升高眼内压诱导的缺血再灌注(SD大鼠);碱烧伤诱导的角膜新生血管(新西兰兔);角膜缝线法诱导角膜新生血管(新西兰兔);MNU/碘酸钠诱导的视网膜变性(C57小鼠)
4)去卵巢诱导干眼症(NHP);组胺诱导过敏性结膜炎(豚鼠);激光小梁网诱导慢性高眼压模型(NHP);
5)亚硒酸钠注射诱导白内障;眼部疼痛、近视、弱视及眼部炎症模型
3、体内药效学评价指标
泪液分泌量:测量棉线变色长度(mm);
角膜损伤评分:根据角膜荧光素钠染色面积评分;
4、具体过程:
根据《干眼临床诊断专家共识》(2013年)和《干眼症动物模型制备规范》(草案,2018年)中关于干眼症的临床指标,依此考察药物的治疗效果。
本模型采用皮下注射东莨菪碱配合干燥环境建立干眼小鼠模型,其原理是东莨菪碱可以抑制泪腺上分布的M3胆碱能受体,从而抑制小鼠泪液分泌。同时,长期处于干燥环境可以刺激眼表感觉神经末梢,引起神经源性炎症,进而加重眼表损害。该模型用来评价泪液分泌量(Schirmer I)、泪膜破裂时间(BUT)和角膜银光素染色(FLS)等干眼症重要的临床指标。
动物:C57BL/6J小鼠,实验分组及周期参见表15,其中,生理盐水模型组是干眼症模型的动物+生理盐水,作为阴性对照,生理盐水对照组是正常组+生理盐水,受试模型组中采用实施例1中的多肽化合物。
表15
实验周期:30天
观测指标:红肿程度、畏光程度。
泪膜破裂时间检测(BUT):分别检测给药后第7、14天泪膜破裂程度。
泪液分泌量(Schirmer I实验):在给药前和给药后第3、7、11、14天分别测量泪液检测滤纸泪液的浸入长度。
角膜损伤评分:在给药前和给药后的第3、7、11、14天进行荧光素钠染色评分。
如果药物对上述临床检查指标改善明显,则进行以下病理检测:
做组织切片,观察药物对造模后小鼠的角膜和结膜组织的影响。
实验结束后,去结膜上皮组织和泪腺,分析MHC-II蛋白、TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA等相关炎症因子的变化。
结论:本发明的多肽化合物有明显改善疗效,经切片和炎症因子分析,有显著性差异。
经对实验动物C57小鼠、SD大鼠或新西兰兔进行药效模型试验,治疗干眼症、近视眼或角结膜眼等有改善疗效。
实施例4本发明的多肽化合物在抑郁模型中的药效评价
通过抑郁症常用的分析指标,即强迫游泳,初步评价多肽药物的抗抑郁效果。本发明先利用正常动物,考察给药一周后的抗抑郁药效。
动物及实验方案:
C57BL/6小鼠,正常动物急性给药,以强迫游泳(FST)为抗抑郁样行为考察指标,受试化合物口服给药,受试化合物为本发明实施例2中的多肽化合物Dec-MTP-16;艾司氯胺酮(Esketamine)作为阳性药物,腹腔给药,设空白对照;单次给药后24h测FST,受试药物以三种不同剂量经口灌胃给药,FST测试,统计小鼠的静止不动时间(Immobility time),检测指标:在单次给药后的1h测强迫游泳,考察是否有快速抗抑郁的效果,参见表16、表17和图1,其中,表17中的Dec-MTP-16为按照剂量10mg/kg腹腔注射给药的结果。
表16
表17强迫游泳实验中小鼠的不动时间(单位为秒)
由表17和图1可见,强迫游泳实验中,静止不动时间按平均值计算,空白对照为144.09秒,用多肽化合物Dec-MTP-16为117.07秒,平均静止不动时间缩短27.02秒,有显著性差异,证明本发明的多肽化合物有抗抑郁功效,仅次于阳性对照品盐酸艾司氯胺酮的疗效,相对于现有多肽化合物成药性好,在治疗忧郁症方面有替代艾司氯胺酮的前景。
Claims (8)
1.一种广谱抗炎多肽化合物,其包括活性肽段,所述活性肽段从N端到C端的氨基酸序列如下:
MMTYSTELIFYIEMDP。
2.根据权利要求1所述的广谱抗炎多肽化合物,其特征在于,所述广谱抗炎多肽化合物还包括加载在活性肽段N端的跨膜结构或脂肪酸。
3.根据权利要求2所述的广谱抗炎多肽化合物,其特征在于,所述跨膜结构为YGRKKRRQRRR,所述脂肪酸为正癸酸、月桂酸或棕榈酸。
4.根据权利要求2所述的广谱抗炎多肽化合物,其特征在于,所述广谱抗炎多肽化合物的跨膜结构或脂肪酸与活性肽段N端氨基酸之间串联设置桥接段。
5.根据权利要求4所述的广谱抗炎多肽化合物,其特征在于,所述桥接段为PEG2、GGGG或PEG2-PEG2。
6.根据权利要求1所述的广谱抗炎多肽化合物,其特征在于,所述广谱抗炎多肽化合物为具有如下氨基酸序列的化合物:
YGRKKRRQRRRMMTYSTELIFYIEMDP-NH2、
CH3(CH2)8CO-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2、
CH3(CH2)8CO-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2或
CH3(CH2)8CO-PEG2-PEG2-MMTYSTELIFYIEMDP-NH2。
7.如权利要求1-6任一项所述广谱抗炎多肽化合物在制备治疗忧郁症疾病药物中的应用。
8.如权利要求1-6任一项所述广谱抗炎多肽化合物的制备方法,包括以下步骤:
1)树脂溶胀
替代度为0.45-0.6mmol/g的氨基树脂为起始树脂,与溶剂DMF进行溶胀,温度30~40℃,N2吹拂搅拌20-30min至树脂充分泡涨,除去多余的DMF,得到溶胀后的树脂;
2)偶联反应
采用Fmoc固相合成法,将由Fmoc基团保护的氨基酸与溶胀后的树脂在缩合试剂、防消旋剂存在下进行偶联反应,脱除前一氨基酸上的Fmoc保护基后再进行后一个氨基酸的偶联反应,将氨基酸逐次偶联至树脂上;其中,由Fmoc基团保护的氨基酸按照所述活性肽段从C端至N端的偶联顺序依次为:
Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met-OH;
所述偶联反应中,缩合试剂为HBTU、HOBt和DIEA,偶联反应时间为1.5-2小时;
在树脂上完成氨基酸的偶联反应之后,再偶联由Fmoc保护的跨膜结构、桥接段和/或脂肪酸,反应产物经DMF、甲醇收缩后干燥,得到侧链带保护基团的全保护肽树脂;
3)裂解反应
将全保护肽树脂与裂解液在33-37℃下机械搅拌反应2.5-3.5小时后,滤除液体,在乙醚中进行沉降,洗涤、干燥,得到粗肽;
其中,所述裂解液由TFA、三异丙基硅烷、纯水组成;
4)纯化、冻干
将步骤3)获得的粗肽溶解后通过高效液相色谱进行两次纯化,游离、冻干后获得所述的广谱抗炎多肽化合物,其中,第一次纯化的流动相为三氟乙酸体系,第二次纯化的流动相为醋酸体系。
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