CN113185595B - 一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质及其制备方法 - Google Patents
一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质，并公开了其具体的结构。本发明还公开了该蛋白质的应用及制备方法。本发明公开的蛋白质能同时抑制新生血管生长及抑制炎症反应，可通过双重作用机制，对老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变及翼状胬肉等眼科相关疾病具备一定的预防和缓解效果。此外，该蛋白质的提取纯化工艺相对简单，并且重复性强，成本低，利于工业化生产。而且和现有的抗新生血管生长药物康柏西普相比，动物实验结果显示，该蛋白质抑制角膜新生血管生长的效果比康柏西普强。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是一种具有抑制新生血管生长及抑制炎 症反应活性的蛋白质及其制备方法。
背景技术
临床上很多眼科疾病都与眼部组织发炎及病理性血管新生相关，包括但 不限于湿性老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎及结膜结缔组织 增生(翼状胬肉)等。眼组织受到外部刺激或损伤后，会产生炎症反应，增 加生长因子的释放修复受损组织。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是人体其中一种重要的生长因子，主要促进血管内皮 细胞增生及形成新生血管。新血管生成是胚胎发育和伤口愈合过程中血管生 长的主要机制。正常血管生成过程不仅包括内皮细胞迁移和增殖，还有血管成熟，血管重塑以及细胞外基质的降解等步骤。在正常条件下，由于血管生 成因子如VEGF和色素上皮衍生因子(PEDF)的表达水平和功能的平衡，内皮 细胞静止而且没有增殖。病理性的新血管生成明显不同于正常的血管，过量 分泌的VEGF会诱导内皮细胞过度生长，快速形成不受控制的病理性新生血管。 这些新生血管结构脆弱，容易出现出血和渗漏。此外，VEGF还会导致微血管 壁内皮细胞形成间隙，增加血管的渗透性。如脉络膜出现病理性的新生血管 增生，有机会侵犯视网膜，渗出的血液可能导致视网膜黄斑病变，病情严重 的患者甚至会失去视力。如新生血管出现在结膜，则可能诱导病理性结膜组 织增生。眼部炎症可能由外部刺激、感染或意外损伤引起，不同部位的炎症 会引起不同的病变，包括角膜炎和葡萄膜炎等。有研究发现，长期的炎症刺 激会增加VEGF的表达，加快病理性的血管新生。现今临床治疗新生血管相关 的眼科疾病主要以针对清除VEGF的单克隆抗体为主。因此，同时具有抗炎生 物活性的抑制新生血管药物能提供更好的疗效。
因鉴于此，特提出此发明。
发明内容
现有针对新生血管的药物治疗以封闭血管渗漏及抑制新生血管生长为 主，临床治疗药物主要有针对VEGF的单克隆抗体，虽然单克隆抗体药物具有 一定疗效，但也具有干扰免疫系统，诱导系统性炎症反应的风险。而且，单 克隆抗体药物的分子量大，结构复杂，不容易存储，更重要的是对生产技术 及生产环境的要求很高，造成单克隆抗体药物的价格相对较高。
对此，本发明提供了一种蛋白质，编号为ZK002，具有抑制新生血管生成 及抗炎生物活性，同时制备工艺简单，成本较低，利于工业化生产。
首先，本发明提供了一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的 蛋白质，其编号为ZK002，所述蛋白质采用非还原性SDS-PAGE(非还原性聚 丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为25000-35000道尔顿，所述蛋白质的分 子由α链和β链组成，α链的蛋白序列如SEQ ID No.1所示，β链的蛋白序 列如SEQ ID No.2所示；所述蛋白质具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应 活性。
该蛋白质采用还原性SDS-PAGE(还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定的 α链分子量为12000-22000道尔顿，β链的分子量为9000-19000道尔顿。晶 体结构观察发现蛋白分子内存在6对链内二硫键(α链和β链各有3对)和1 对链间二硫键。
进一步的，本发明还公开了该蛋白质在抑制新生血管生成和抑制炎症反 应方面的应用，以及在药物组合物中的应用。进一步的，药物组合物中还包 括药学可接受的载体或药学可接受的赋形剂和/或稳定剂。
更进一步的，本发明公开了一种上述蛋白质ZK002的制备方法，依次按 以下步骤进行：
(1)将尖吻蝮蛇蛇毒用Tris-HCl缓冲液溶解，离心收集上清液；
(2)将步骤(1)得到上清液通过已充分平衡的阴离子交换层析柱进行吸附， 吸附完成后用A液洗脱未被吸附的杂蛋白，A液洗脱完成后用B液进行梯度洗 脱，用分部收集器收集B液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检 测追踪各组分峰值；本步骤中所述A液为pH7.0-9.0的0.01-0.1mol/L Tris-HCl溶液，B液为pH6.0-9.0的0.01-0.05mol/LTris-HCl和 0.05-0.6mol/L NaCl的混合溶液；
(3)将步骤(2)中收集的目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的 膜包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用已充分平衡好的阳离子交换层析柱进 行吸附，吸附完成后用C液洗脱未被吸附的杂蛋白，C液洗脱完成后用D液进 行梯度洗脱，用分部收集器收集D液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm 处检测追踪各组分峰值；本步骤中C液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/L Tris-HCl溶液，D液为pH7.0-9.0的0.01-0.06mol/L Tris-HCl和0.05-0.6mol/L NaCl的混合溶液；
(4)将步骤(3)中收集目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的膜 包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用亲和层析柱吸附，吸附完成后用平衡缓 冲液平衡，再用Gly缓冲液洗脱，收集Gly洗脱峰对应的洗脱产物，用NaOH 将该洗脱产物的pH调节至6.0-9.0本步骤中平衡缓冲液为pH6.0-9.0的 0.01-0.1mol/L Tris-HCl和0.05-0.5mol/L NaCl的混合溶液，Gly缓冲液为 0.1-0.5mol/L Gly，PH 2.0-4.0；
(5)将步骤(4)中收集的经pH调整的Gly洗脱峰的洗脱产物用截留分子量 3000-10000Da的滤膜进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用凝胶层析柱吸附，吸 附完成后用E液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱产物即为纯化后的蛋白质产品； 本步骤中E液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/LM Tris-HCl和0.05-0.5mol/L NaCl的混合溶液。
优选的，步骤(1)中所用的Tris-HCl缓冲液的pH为7.0-9.0，浓度为 0.01-0.1mol/L。
优选的，步骤(1)中溶解温度为4℃，溶解时间为6-12h。
优选的，步骤(1)中离心工艺为4000r/min离心两次，每次10min。
优选的，步骤(2)中上清液吸附工艺的流速为50mL/min。
优选的，步骤(2)A液洗脱流速为48mL/min，洗脱时间为600min；B液 洗脱流速为43mL/min。
优选的，步骤(3)中吸附工艺的流速为5mL/min。
优选的，步骤(3)中C液洗脱流速为5.5mL/min，洗脱时间为300min； D液洗脱流速为5.5mL/min。
优选的，步骤(4)中平衡缓冲液洗脱的流速为0.5mL/min。
优选的，步骤(5)中吸附工艺的流速为2.0mL/min。
优选的，步骤(5)中E液洗脱流速为0.3mL/min。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本发明公开的天然蛋白ZK002的能同时抑制新生血管生长及抑制炎症反 应，可通过双重作用机制，对老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变及翼状胬 肉等眼科相关疾病具备一定的预防和缓解效果。此外，ZK002的提取纯化工艺 相对简单，并且重复性强，成本低，利于工业化生产。
且和现有的抗新生血管药物康柏西普相比，动物实验结果显示，ZK002抑 制角膜新生血管生长的效果比康柏西普强。
附图说明
图1为本发明实施例一步骤(2)B液洗脱过程吸光度图；
图2为本发明实施例一步骤(3)D液洗脱过程吸光度图；
图3为本发明实施例一步骤(4)Gly缓冲液洗脱过程吸光度图；
图4为本发明实施例一步骤(5)E液洗脱过程吸光度图；
图5为本发明实施例二中ZK002对NO生成量影响结果图；
图6为本发明实施例二中ZK002对iNOS表达影响结果图；
图7为本发明实施例二中ZK002对促炎因子及肿瘤坏死因子a的mRNA表 达影响结果图；
图8为本发明实施例三中ZK002对LPS诱导的促炎因子IL-6及IL-8的 mRNA表达影响结果图；
图9为本发明实施例四中ZK002对LPS诱导的促炎因子IL-1β、IL-6及 TNF a的mRNA表达影响结果图；
图10为本发明实施例四中ZK002对LPS诱导的NF-κB从细胞质转入细胞 核结果对比图；
图11为本发明实施例五中ZK002对角叉菜胶诱导的大鼠脚掌肿胀的缓解 效果结果对比图；
图12为本发明实施例五中ZK002对胶原诱导的小鼠关节炎症的缓解效果 结果对比图；
图13为本发明实施例六中ZK002对FBS诱导的HUVEC细胞形成小管的抑 制效果结果对比图；
图14为本发明实施例七中视网膜经染色后新生血管生成结果对比图；
图15为本发明实施例七中视网膜厚度结果对比图；
图16为本发明实施例七中ZK002对炎性反应相关的细胞因子和趋化因子 抑制效果结果图；
图17为本发明实施例八中视网膜经染色后新生血管生成结果对比图；
图18为本发明实施例八中视网膜厚度结果对比图；
图19为本发明实施例八中ZK002对炎性反应相关的细胞因子和趋化因子 抑制效果结果图；
图20为本发明实施例九中视网膜经染色后新生血管生成结果对比图；
图21为本发明实施例九中视网膜厚度结果对比图；
图22为本发明实施例九中ZK002对炎性反应相关的细胞因子和趋化因子 抑制效果结果图；
图23本发明实施例十中烧灼大鼠角膜新生血管生成情况对比图；
图24本发明实施例十中烧灼大鼠角膜新生血管生成情况结果图。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本 发明的技术方案进行进一步阐述
实施例一蛋白质ZK002的制备
本实施例提供了一种具体的蛋白质ZK002的制备方法。
该方法依次按以下步骤进行：
(1)称取尖吻蝮蛇蛇毒40g，用320mL的0.02M pH 8.0的Tris-HCl缓 冲液在4℃的冷藏环境下将蛇毒溶解，溶解时间为6-12h，溶解完成后以 4000r/min连续离心两次，每次离心时间均为10min，离心完成后收集上清液。
(2)将步骤(1)中获得的上清液以流速50mL/min上样于已充分平衡的 阴离子交换层析DEAE柱中进行吸附，本步骤中使用的DEAE柱的型号为 BXK200×500，柱体积为8L，吸附过程中上样体积不超过200mL。吸附完成后 以A液(0.02M Tris-HCl pH 8.0)洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时 间600min，洗脱流速48ml/min；然后再以B液(0.02M Tris-HCl+0.3M NaCl pH 6.0)进行梯度洗脱，洗脱流速43mL/min。在B液洗脱的过程中，用纯化系统AKTA Pilot自带的紫外检测器在280nm处检测，并以系统所带分部收集器收 集。B液洗脱过程中的吸光度图如图1所示，收集目的峰洗脱产物，用于后续 步骤。
(3)将步骤(2)中收集的洗脱产物用截留分子量为5000Da的滤膜进行 超滤，浓缩至体积为100-200mL，将浓缩后的产物以流速5mL/min上样于已充 分平衡好的阳离子交换层析柱中进行吸附，本步骤中使用的层析柱型号为 XK50×60，柱体积为1L。吸附完成后，先以C液(0.02M Tris-HCl，pH 6.0) 洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时间300min，洗脱流速5.5mL/min； 然后再以D液(0.02M Tris-HCl+0.5M NaCl，pH 8.0)进行梯度洗脱，洗脱 流速5.5mL/min。在D液洗脱过程中，用纯化系统AKTA prime plus自带紫外 检测器在280nm处检测，并以系统所带分部收集器收集。D液洗脱过程中的吸 光度图如图2所示，收集目的峰洗脱产物，用于后续步骤。
(4)将步骤(2)中收集的2峰的洗脱产物用截留分子量为5000Da的滤 膜进行超滤，浓缩至体积30mL以下，将浓缩后的产物上样于负向亲和层析柱 中进行吸附，本步骤中使用的负向亲和层析柱的型号为XK16×40，柱体积为 60ml。吸附完成后，先以平衡缓冲液洗脱(0.02M Tris-HCl+0.15M NaCl，pH 7.6)不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱流速0.5ml/min，再以Gly缓冲液 洗脱，Gly洗脱过程中的吸光度图如图3所示，，收集目的峰洗脱产物，收 集后立即用1M的NaOH将pH调至7.0。
(5)将步骤(4)收集的活性峰洗脱产物用截留分子量为5000Da的滤膜 进行超滤，浓缩至层析柱柱体积的5％以下，将将浓缩后的产物以流速 2.0mL/min上样于凝胶层析柱进行吸附，，本步骤中适中的凝胶层析柱型号为 XK26×100cm，柱体积为0.5L。吸附完成后，用E液(0.02M Tris-HCl+0.15M NaCl，pH 7.6)洗脱，洗脱流速为0.3mL/min。洗脱过程中的吸光度图如图4 所示，收集目的峰洗脱产物，即为纯化后的目标蛋白。
实施例二利用人源视网膜色素上皮层细胞模型评价ZK002的抑制炎症反 应的作用
选择人源视网膜色素上皮层细胞(APRE19)作为体外模型，通过在APRE19 细胞的培养环境中加入浓度为1μg/mL的脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS) 诱导APRE19细胞产生炎症反应，具体表现为诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)表 达和一氧化氮(NO)生成增加，及一些代笔性的促炎因子包括iNOS,白細胞介 素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-12、IL-18及肿瘤坏死因子α(TNFα)的mRNA 表达显著上升。而通过加入不同浓度的蛋白质ZK002(1.25-30μM)与LPS 共同培养后，其结果如图5-7和表1-2所示。
| ZK002(μM) | NO生成(％) | iNOS表达(％) |
| 1.25 | 86.80 | 93.10 |
| 2.5 | 65.60 | 51.80 |
| 5 | 53.40 | 28.20 |
| 10 | 33.10 | 21.50 |
| 20 | 18.90 | 10.60 |
| 30 | 10.88 | 1.70 |
| LPS(1μg/mL) | 100 | 100 |
表1蛋白质ZK002对抑制LPS诱导的APRE19细胞iNOS的表达和NO的生成效果表
表2蛋白质ZK002对抑制LPS诱导的APRE19细胞促炎因子mRNA表达效果表
由图5-7和表1-2所示的结果可以看出，蛋白质ZK002可以浓度依赖性 的抑制LPS诱导的APRE19细胞对iNOS的表达和NO的生成、以及抑制各促炎 因子的mRNA的表达。即蛋白质ZK002有一定的抑制炎症反应的作用。
实施例三利用人脐静脉内皮细胞模型评价ZK002的抑制炎症反应的作用
选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为体外模型，通过在HUVEC细胞的培养 环境中加入浓度为1μg/mL的LPS诱导HUVEC细胞产生炎症反应，具体表现 为LPC可诱导促炎因子IL-6及IL-8的mRNA表达显著上升。
将蛋白质ZK002(5μM)与HUVEC细胞预培养24小时后，再加入LPS(1 μg/mL)共同培养，结果如图8所示。
由图8的结果可以看出，蛋白质ZK002对LPS诱导的促炎因子IL-6及IL-8 的mRNA表达有一定的抑制作用。即蛋白质ZK002有一定的抑制炎症反应的作 用。
实施例四利用小鼠巨噬细胞模型评价ZK002的抑制炎症反应的作用
选择小鼠巨噬细胞(RAW264.7)作为体外模型，通过在RAW264.7细胞的培 养环境中加入浓度为1μg/mL的LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症反应，具体 表现为LPC可诱导促炎因子IL-1β、IL-6及TNF a的mRNA表达显著上升。
将蛋白质ZK002(5μM)与RAW264.7细胞预培养24小时后，再加入LPS (1μg/mL)共同培养，结果如图9所示。
由图9的结果可以看出，蛋白质ZK002对LPS诱导的促炎因子IL-1β、 IL-6及TNF a的mRNA表达有一定的抑制作用。
另一方面，LPS还可以诱导增加NF-κB从细胞质转入细胞核，再经蛋白质 ZK002处理后，LPS对NF-κB从细胞质转入细胞核的诱导增加作用被抑制，结 果如图10所示。
由上，蛋白质ZK002可以抑制细胞的炎性反应，具有一定的抗炎作用。
实施例五利用整体动物模型评价ZK002的抑制炎症反应的作用
选择SPF大鼠及SPF小鼠作为整体动物模型。向大鼠后脚掌皮下注射100 μL浓度为1％的角叉菜胶模拟急性炎症，注射后大鼠脚掌大小会在注射后4 小时涨大50％。在致炎前1小时对大鼠腹腔注射给药蛋白质ZK002(2.5mg/kg), 并在致炎前后的不同时间点测量大鼠后足体积，结果如图11所示。
由图11的结果可以看出，ZK002(2.5mg/kg)可以减轻角叉菜胶诱导的脚 掌肿胀，且效果与吲哚美辛(Indomethac,10mg/kg)相似。
利用胶原注射诱导小鼠产生关节炎，以模拟长期炎症。对小鼠进行腹腔 注射给药蛋白质ZK002(1mg/kg,3mg/kg)，结果如图12所示。
由图12的结果可以看出，ZK002可以显著的缓解胶原注射的诱导的关节 炎，且ZK002(3mg/kg)的药效与塞来昔布(Celebrex,30mg/kg)相似。
上述结果显示，蛋白质ZK002对急性和长期炎症均有一定的减轻效果。
实施例六利用人脐静脉内皮细胞模型评价ZK002的抑制新生血管生成作 用
选择HUVEC作为体外模型，HUVEC细胞可接种于Matrigel基质胶上。通 过加入2％胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)，培养8-12小时后可形成 管状结构。
将蛋白质ZK002(3μM)和2％FBS与HUVEC细胞共同培养8小时后，结果如 图13所示。
由图13可以看出，通过加入ZK002，可以显著的抑制FBS诱导的HUVEC 细胞形成管状结构的总长度、节点数目、覆盖面积以及成环数。即蛋白质ZK002 对新生血管生成有一定的抑制作用。
实施例七利用整体动物模型评价ZK002的抑制新生血管生成作用及抗 炎和对糖尿病视网膜病变的作用
取8周大的雄性C57BL/6小鼠作为整体动物模型，对小鼠单次腹腔注射 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(150mg/kg)对小鼠胰岛β细胞功能造成 损伤，并使小鼠血糖升高。当小鼠血糖高于18mmol/L，即为I型糖尿病。随 机把小鼠分成两组(每组10只)，分别接受玻璃体注射生理盐水或ZK002(5 μg)，每周两次给药，持续两周。14天后摘除眼球，固定视网膜并使用FITC 偶联抗体进行免疫荧光染色或苏木素-伊红染色，使用荧光显微镜观察新生血 管生成及视网膜厚度变化情况，结果如图14和15所示。
进一步的，收集采集的视网膜样品，匀浆后使用ELISA测量与炎性反应 相关的细胞因子和趋化因子的变化，结果如图16所示。
由图14和15可以看出，蛋白质ZK002可以显著的抑制视网膜新生血管 的生成，同时降低视网膜变薄的程度。
由图16可以看出，蛋白质ZK002可以抑制糖尿病小鼠的视网膜促炎因子 的表达。
由上可见，蛋白质ZK002有一定的抑制新生血管生成作用及抑制炎症反 应的作用，同时对于糖尿病引起的视网膜病变也有一定的潜在预防和缓解作 用。
实施例八利用整体动物模型评价ZK002的抑制新生血管生成作用及抗 炎和对糖尿病视网膜病变的作用
取16周大的Leprdb/db转基因2型糖尿病成年小鼠作为整体动物模型。随 机把小鼠分成两组(每组10只)，分别接受玻璃体注射生理盐水或 ZK002(5μg)，每周两次给药，持续两周。14天后摘除眼球，固定视网膜并使 用FITC偶联抗体进行免疫荧光染色或苏木素-伊红染色，使用荧光显微镜观 察血管生成及视网膜厚度变化情况，结果如图17和18所示。
进一步的，收集采集的视网膜样品，匀浆后使用ELISA测量与炎性反应 相关的细胞因子和趋化因子的变化，结果如图19所示。
由图17和18可以看出，蛋白质ZK002可以显著的抑制视网膜新生血管 的生成，同时降低视网膜变薄的程度。
由图19可以看出，蛋白质ZK002可以抑制糖尿病小鼠的视网膜促炎因子 的表达。
由上可见，蛋白质ZK002有一定的抑制新生血管生成作用及抑制炎症反 应的作用，同时对于糖尿病引起的视网膜病变也具有潜在的预防和缓解作用。
实施例九利用整体动物模型评价ZK002的抑制新生血管生成作用及抗 炎和对糖尿病视网膜病变的作用
取16周大的Ins2Akita转基因1型糖尿病成年小鼠作为整体动物模型。 随机把小鼠分成两组(每组10只)，分别接受玻璃体注射生理盐水或 ZK002(5μg)，每周两次给药，持续两周。14天后摘除眼球，固定视网膜并使 用FITC偶联抗体进行免疫荧光染色或苏木素-伊红染色，使用荧光显微镜观 察新生血管生成及视网膜厚度变化情况，结果如图20和21所示。
进一步的，收集采集的视网膜样品，匀浆后使用ELISA测量与炎性反应 相关的细胞因子和趋化因子的变化，结果如图22所示。
由图20和21可以看出，蛋白质ZK002可以显著的抑制视网膜新生血管 的生成，同时降低视网膜变薄的程度。
由图22可以看出，蛋白质ZK002可以抑制糖尿病小鼠的视网膜促炎因子 的表达。
由上可见，蛋白质ZK002有一定的抑制新生血管生成作用及抑制炎症反 应的作用，同时对于糖尿病引起的视网膜病变也具有潜在的保护治疗作用。
实施例十利用整体动物模型评价ZK002抑制角膜新生血管生成的作用
取8-12周大的SD大鼠作为整体动物模型，随机把大鼠分成三组(每组10 只)，先使用浸润1mol/L氢氧化钠的滤纸片，烧灼大鼠右眼角膜。取对侧眼 作为空白对照。建模当天开始给药，各组大鼠分别接受康柏西普(1.5mg/ml) 或ZK002(1.5mg/ml)滴眼液，每天三次给药，持续两周。分别在第7、第10 及14天后观察血管生成情况，结果如图23和24所示。
由图23和24可以看出，ZK002能显著性地抑制角膜新生血管的生成，且 抑制效果相比作为阳性对照组的康柏西普而言效果更加显著。
本发明提供了蛋白质ZK002及具体可行的制备方法。蛋白质ZK002具备 一定的抑制新生血管生成作用及抑制炎症反应的作用，同时对于糖尿病引起 的视网膜病变也有潜在的预防和缓解作用，同时可通过双重作用机制，提高 对老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变及翼状胬肉等眼科相关疾病的疗效。 相比现有的同类药物而言(如针对VEGF的单克隆抗体)，蛋白质ZK002的效 果更好，且提取纯化工艺相对简单，重复性强，成本低，更利于工业化的生 产。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不 局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根 据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明 的保护范围内。
序列表
<110> 兆科（广州）眼科药物有限公司
<120> 一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质及其制备方法
<150> 2020114528672
<151> 2020-12-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 134
<212> PRT
<213> Deinagkistrodon
<400> 1
Met Ala Asp Cys Pro Pro Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Leu Tyr Cys Tyr
1 5 10 15
Gln Gly Phe Asn Gly Pro Gln Thr Trp Asp Asp Ala Glu Arg Phe Cys
20 25 30
Thr Glu Gln Ala Lys Gly Gly His Leu Val Ser Ile Ser Asp Ser Gly
35 40 45
Glu Ala Asp Phe Val Gly Gln Leu Ile Thr Gln Asn Ile Ser Arg Pro
50 55 60
Glu Tyr Tyr Val Trp Thr Gly Leu Arg Asp Arg Arg Ser Glu Gln Gln
65 70 75 80
Cys Asn Pro Glu Trp Asn Asp Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Thr Asn Trp
85 90 95
Asp Ser Gly Glu Ser Glu Met Cys Gln Ala Phe Ser Arg Trp Thr Asn
100 105 110
Phe Arg Glu Trp Met Asn Thr Asn Cys Gln Gln Lys Asn Pro Phe Val
115 120 125
Cys Lys Phe Pro Pro Ala
130
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> Deinagkistrodon
<400> 2
Asp Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Gly His Cys Tyr Gln Val
1 5 10 15
Phe Ser Asp Leu Lys Asn Trp Asp Asp Ala Glu Ser Phe Cys Ser Gly
20 25 30
Gln His Glu Gly Ser Arg Leu Ala Ser Ile His Ser Arg Glu Glu Glu
35 40 45
Ala Phe Val Gly Lys Met Ala Ser Arg Thr Leu Lys Tyr Thr Ser Met
50 55 60
Trp Leu Gly Leu Asn Asn Pro Trp Lys Glu Cys Lys Trp Glu Trp Ser
65 70 75 80
Asp Asp Thr Arg Leu Asp Tyr Lys Val Trp Thr Arg Arg Pro Tyr Cys
85 90 95
Thr Val Met Val Val Lys Thr Asp Arg Ile Phe Trp Phe Asn Arg Gly
100 105 110
Cys Glu Lys Ser Val Ser Phe Val Cys Lys Phe Lys Ala
115 120 125
Claims (16)
1.一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质采用非还原性SDS-PAGE(非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为25000-35000道尔顿，所述蛋白质的分子由α链和β链组成，α链的蛋白序列如SEQ ID No.1所示，β链的蛋白序列如SEQ ID No.2所示；所述蛋白质具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，采用还原性SDS-PAGE(还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定的α链分子量为12000-22000道尔顿，β链的分子量为9000-19000道尔顿。
3.权利要求1-2中任一所述的蛋白质在制备抑制新生血管生成和抑制炎症反应的药物中的应用。
4.权利要求1-2中任一所述的蛋白质在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物为抑制新生血管生成和抑制炎症反应的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学可接受的载体或药学可接受的赋形剂和/或稳定剂。
6.一种权利要求1-2中任一所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：
(1)将尖吻蝮蛇蛇毒用Tris-HCl缓冲液溶解，离心收集上清液；
(2)将步骤(1)得到上清液通过已充分平衡的阴离子交换层析柱进行吸附，吸附完成后用A液洗脱未被吸附的杂蛋白，A液洗脱完成后用B液进行梯度洗脱，用分部收集器收集B液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检测追踪各组分峰值；本步骤中所述A液为pH7.0-9.0的0.01-0.1mol/L Tris-HCl溶液，B液为pH6.0-9.0的0.01-0.05mol/L Tris-HCl和0.05-0.6mol/L NaCl的混合溶液；
(3)将步骤(2)中收集的目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的膜包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用已充分平衡好的阳离子交换层析柱进行吸附，吸附完成后用C液洗脱未被吸附的杂蛋白，C液洗脱完成后用D液进行梯度洗脱，用分部收集器收集D液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检测追踪各组分峰值；本步骤中C液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/L Tris-HCl溶液，D液为pH7.0-9.0的0.01-0.06mol/L Tris-HCl和0.05-0.6mol/L NaCl的混合溶液；
(4)将步骤(3)中收集目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的膜包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用亲和层析柱吸附，吸附完成后用平衡缓冲液平衡，再用Gly缓冲液洗脱，收集Gly洗脱峰对应的洗脱产物，用NaOH将该洗脱产物的pH调节至6.0-9.0本步骤中平衡缓冲液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/L Tris-HCl和0.05-0.5mol/L NaCl的混合溶液，Gly缓冲液为0.1-0.5mol/L Gly，PH2.0-4.0；
(5)将步骤(4)中收集的经pH调整的Gly洗脱峰的洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的滤膜进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用凝胶层析柱吸附，吸附完成后用E液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱产物即为纯化后的蛋白质产品；本步骤中E液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/L Tris-HCl和0.05-0.5mol/L NaCl的混合溶液。
7.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所用的Tris-HCl缓冲液的pH为7.0-9.0，浓度为0.01-0.1mol/L。
8.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(1)中溶解温度为4℃，溶解时间为6-12h。
9.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(1)中离心工艺为4000r/min离心两次，每次10min。
10.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(2)中上清液吸附工艺的流速为50mL/min。
11.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(2)A液洗脱流速为48mL/min，洗脱时间为600min；B液洗脱流速为43mL/min。
12.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(3)中吸附工艺的流速为5mL/min。
13.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(3)中C液洗脱流速为5.5mL/min，洗脱时间为300min；D液洗脱流速为5.5mL/min。
14.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(4)中平衡缓冲液洗脱的流速为0.5mL/min。
15.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(5)中吸附工艺的流速为2.0mL/min。
16.根据权利要求6所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤(5)中E液洗脱流速为0.3mL/min。
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