CN104059132A - 整合素阻断剂多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了整合素阻断剂多肽及其制备方法和用途，属于生物制药领域。该多肽Ⅰ-多肽Ⅹ，其氨基酸数目只有9—17个，采用固相合成法合成，虽然减少了氨基酸数目，但依然具有体内免疫保护作用，对关节炎具有治疗作用；具有抑制新生血管的作用；具有抑制内皮细胞迁移的活性，进而达到预防或治疗血管及炎症相关疾病的效果，包括与新生血管相关的眼部疾病。对多种肿瘤保持了较高的抗肿瘤活性，大大降低了成本；具有较好的治疗类风湿性关节炎的作用，增强了适应性，增加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。

Description

整合素阻断剂多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术药物领域，具体涉及整合素阻断剂多肽及其制备方法和制备治疗用于关节炎的预防和治疗、肿瘤治疗、眼科疾病治药物中的应用。

背景技术

关节炎、细菌引起的炎症、肿瘤、眼科疾病(如AMD)均被称为血管相关性疾病。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。RA的病理过程中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因某种异常变化，而形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起类风湿关节炎患者滑膜组织发生异常变化，正常人的关节滑膜内层仅1-2层细胞组成，而RA患者的滑膜内层通常有4-10层细胞(有时甚至超过20层)。这些细胞不仅在数量上异常增多，而且在功能上处于异常活跃的状态，它们可以分泌大量的细胞因子、信号分子和蛋白酶，加速关节破坏的进程。另外，RA滑膜中还有大量炎性细胞的浸润，如T细胞、B细胞和单核细胞。

此外，肿瘤、眼病、炎症都是与血管相关的疾病。肿瘤的生长和转移依赖新生血管；眼科疾病如年龄相关性黄斑变性(AMD)主要表现是脉络膜新生血管的生成；炎症与血管新生是两个相互联系,共同发展的病理过程。

新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创伤愈合中是必不可少的过程。血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括：肿瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃疡性结肠类以及其它炎性障碍。

整合素是一类广泛分布于细胞表面的受体，能介导细胞与细胞外基质及细胞与细胞之间的相互黏附，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用参与血管生成。目前至少有8种的整合素(α1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α6β4、α5β1、αvβ3、αvβ5)参与血管生成，其中αvβ3发挥着重要作用。αvβ3能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp，RGD)。αvβ3可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合参与肿瘤的血管生成、侵袭、转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。因此，含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗剂作用，RGD序列可以作为一种载体，靶向运输到新生血管内皮，从而对新生血管性疾病达到更高效率的治疗。因此，血管抑制多肽通过 抑制血管生成不仅可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。

WO2013097709A1的专利说明书公开了一种整合素阻断剂多肽，其氨基酸序列为：X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Y,X的序列为缺失或含有Arg-Gly-Asp序列的多肽，Y的序列为缺失或含有Arg-Gly-Asp序列的多肽。该整合素阻断剂多肽具有抑制血管内皮细胞的增殖和迁移及对肿瘤细胞的抑制作用。

HM-3是由是在先公开的的整合素阻断剂，含有18个氨基酸。经前期研究研究发现HM-3具有显著的抑制血管生成的作用和抗肿瘤的活性，具有极大的开发成抗肿瘤药物的潜能。

对于长的氨基酸序列而言，其空间结构复杂，二级结构、三级结构及四级结构难以确定。生产成本高。另外，多肽运用到体内后，其半衰期较短，比如HM-3在大鼠体内的半衰期只有27min，但其体内活性依然存在。这种情况的原因是因为一般蛋白质多肽降解产物任然具有活性，有些多肽是以降解的产物发挥作用。为此本实验室合成了不同长度的多肽序列，分别分析其抗血管生成及抗炎活性，发现这些多肽存在很好的活性。

发明内容

1、发明要解决的技术问题

针对现有的HM-3半衰期短、容易在体内降解的问题，本发明提供了整合素阻断剂多肽及其制备方法，少于17个氨基酸的序列构成的整合素阻断剂多肽，HM-3降解片段仍然具有活性，可以用于制备用于治疗和预防关节炎以及和治疗、肿瘤治疗、眼科疾病治药物。

2、技术方案

整合素阻断剂多肽，其结构为下列中的一种：

多肽Ⅰ Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅱ Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅲ Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅳ Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅴ Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅵ Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅶ Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅷ Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅸ Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅹ Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。

该多肽均是HM-3截短后的片段。与现有技术相比，含有的氨基酸数目大大减少、结构更加简单，并具有与受体好的亲和性和结合能力。

研究发现，本发明中的多肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是整合素的一个重要配体，含有RGD序列的多肽Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp能够特异性的识别整合素。

本发明的整合素阻断剂多肽，用固相合成方法制成，是其以wang resin(Wang树脂)为起始原料，然后用保护氨基酸保护氨基酸Fmoc-精氨酸-OH依次接一肽至八、九、十至十七肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多肽粗品。将粗品进行纯化，首先溶解，然后用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品.

其固相合成方法制得的多肽纯度均大于95％。多肽纯度98.02％—98.76％。

本发明的的整合素阻断剂多肽，能发挥体内免疫保护作用，对关节炎具有治疗作用。

本发明多肽在制备治疗关节炎药物中的应用，所述的关节炎包括类风湿关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、感染性关节炎和创伤性关节炎。

本发明的整合素阻断剂多肽具有有抑制新生血管的作用。

本发明的整合素阻断剂多对角膜新生血管具有的抑制作用。

本发明的整合素阻断剂多肽对角膜抑制新生血管的作用是以BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管为模型。

本发明的整合素阻断剂多肽对虹膜新生血管具有抑制作用。

本发明的整合素阻断剂多肽对虹膜新生血管的抑制作用，采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉为动物模型。

本发明的整合素阻断剂多肽对脉络膜新生血管的抑制作用以大鼠为动物模型。

本发明的整合素阻断剂多肽，多肽Ⅰ－多肽Ⅹ的序列即为RGD序列通过linker连接上不同长度的内皮抑素活性的短片段形成的多肽，内皮抑素能通过抑制内皮细胞生长进而抑制新生血管的生长。由此构建出了十种与整合素有亲和性和结合能力的整合素阻断剂多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到RA中血管翳形成过程中新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗血管及炎症相关疾病的效果。

本发明整合素阻断剂多肽在治疗眼科疾病药物中的应用，其特征在于所述的眼科疾病包括虹膜新生血管性眼病(包括新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变或视网膜中央静脉栓塞 引起的虹膜新生血管性眼病)、脉络膜新生血管性眼病(包括年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜病变脉络膜新生血管性眼病)、视网膜新生血管性眼病(包括糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新生血管性眼病)或角膜新生血管性眼病(为角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以及碱及其他化学物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的角膜新生血管性眼病)。

本发明的整合素阻断剂多肽，对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用。

本发明的整合素阻断剂多肽在治疗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胶质瘤、黑色素瘤和宫颈癌。

本发明的整合素阻断剂多肽，具有抑制内皮细胞迁移的活性的作用。

本发明的整合素阻断剂多肽，具有抑制人脐静脉内皮细胞的作用，所述人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用含5％胎牛血清和1×ECGS的内皮细胞培养液。

3、有益效果

本发明提供了整合素阻断剂多肽及其制备方法和用途，抗体小型化，能提高亲和力和特异性，增加抗体的渗透性和靶标的接触概率，副作用小。并且与现有技术相比大大降低合成成本。

本发明虽然减少了氨基酸数目，但依然具有较好的治疗类风湿性关节炎的作用，增强了适应性，增加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。

由于正常内皮细胞突变率很低,内皮抑素作为内源性的抗肿瘤药物,不会产生抗药性,并且具有抑瘤效果强,毒性小等特点。

本发明的整合素阻断剂多肽，能通过抑制内皮细胞生长进而抑制新生血管的生长。由于正常内皮细胞突变率很低,内皮抑素作为内源性的抗肿瘤药物,不会产生抗药性,并且具有抑瘤效果强,毒性小等特点,从而成为当前研究的热点之一。由此构建出了十种与整合素有亲和性和结合能力的整合素阻断剂多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到RA中血管翳形成过程中新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗血管及炎症相关疾病的效果。

本发明所述整合素阻断剂多肽在佐剂诱导大鼠关节炎动物模型能发挥体内免疫保护作用，对AA大鼠关节炎具有治疗作用。所述对AA大鼠关节炎具有治疗作用多肽Ⅰ—多肽Ⅶ的治疗效果较多肽V-多肽Ⅶ优。大鼠阳性对照组左后足足爪肿胀度与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)；整合素阻断剂多肽Ⅰ-Ⅲ的高剂量组左后足足爪肿胀度与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)，整合素阻断剂多肽Ⅰ-Ⅲ的中剂量组和Ⅳ-Ⅶ的高剂量组左后足 足爪肿胀度与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，实验结果具有统计学意义。

本发明的整合素阻断剂多对角膜抑制新生血管的作用，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ种整合素阻断剂均能够极显著抑制角膜新生血管的生长，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ整合素阻断剂能够显著的抑制角膜新生血管的生长。多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为48.24％、58.89％、50.01％，HM-3组的抑制率为50.15％，可见与HM-3组相比较，多肽Ⅱ和多肽Ⅲ要比多肽HM-3的抑制率好。多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ实验组CD31阳性新生血管与对照组相比减少。多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为46.89％、48.01％、42.83％。多肽Ⅶ实验组CD31阳性新生血管与对照组相比有减少，但效果不如前几个多肽明显，对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率为30.42％。多肽Ⅷ、多肽Ⅸ和多肽Ⅹ对小鼠角膜新生血管抑制作用不明显。实验结果表明多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ种整合素阻断剂均能够极显著抑制角膜新生血管的生长，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ两种整合素阻断剂均能够显著的抑制角膜新生血管的生长能够作为治疗角膜新生血管性眼病的药物。

本发明的整合素阻断剂多肽对虹膜新生血管的抑制作用，其多肽Ⅰ—多肽Ⅹ能够抑制新生血管形成并使已形成的血管退化，其中多肽Ⅰ—多肽Ⅲ与阴性组相比新生血管的消退很明显，治疗效果优于多肽Ⅳ—多肽Ⅹ。

本发明的整合素阻断剂多肽对脉络膜新生血管具有抑制作用。其对角膜新生血管的抑制作用，多肽Ⅰ—多肽Ⅶ能够有效的治疗脉络膜新生血管，多肽Ⅷ—多肽Ⅹ在给药后效果不是很明显。

本明的整合素阻断剂多肽在治疗肿瘤药物中的应用，所述多肽Ⅰ—多肽Ⅲ能有效的抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胶质瘤和宫颈癌的增殖，其中对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的抑制率均在50％以上。

本发明的整合素阻断剂多肽，其多肽Ⅳ—Ⅵ能抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤的增殖，其中对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌的抑制率均在40％以上，达到抑制这些肿瘤增殖的效果。

本发明的整合素阻断剂多肽，其多肽Ⅶ—多肽Ⅹ对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤的增殖抑制作用相比较前几个多肽在同等的剂量下作用较弱，但对肿瘤细胞有增殖有抑制作用。

本发明的整合素阻断剂多肽，其特征在于：所述抑制内皮细胞迁移的活性采用transwell法测定，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ能抑制5％的胎牛血清及ECGS诱导的HUVEC的迁移作用， 抑制率均大于68.10％，对细胞迁移的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(P<0.01)；在多肽Ⅳ、多肽Ⅴ、多肽Ⅵ的作用下，迁移的内皮细胞数与阴性对照相比减少，抑制率均大于50.57％，对细胞迁移的抑制率与阴性对照相比有显著性的差异(P<0.05)。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明

实施例1

整合素阻断剂多肽合成肽Ⅰ－Ⅹ的制备及检验

采用多肽固相合成方法，其以wang resin(Wang树脂)为起始原料，然后用保护氨基酸Fmoc-精氨酸-OH依次接一肽至八、九、十至十七肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多肽粗品。将粗品进行纯化，首先溶解，然后用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。具体步骤如下：

一、合成：

称取Wang resin13g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱中，加入CH2Cl2130ml使树脂充分膨胀。

脱帽：加入六氢吡啶/DMF的脱帽液25mL,密封后放入振荡器中反应5分钟，温度控制在室温，5分钟后将脱帽液抽干，中间用DMF洗涤一次,然后再加入一次20％的脱帽液25mL反应15分钟；

洗涤：将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂6次，抽干，取20颗树脂在小试管内，加入验色剂，在115℃加热3分钟。

缩合：称取保护氨基酸Fmoc-精氨酸-OH和HOBt2.790g，溶于15ml DMF和3.215mLDIC,然后倒入反应釜中反应1.5左右小时，温度控制在34℃左右。

洗涤：将反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取10-20颗树脂在小试管内，加入验色剂，在115℃加热3-5分钟。

切肽：把抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入切割液(按体积比比计三氟乙酸：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT＝82.5：5：5：5：2.5)，密封反应2小时，用砂芯漏斗将树脂与多肽分离。

后处理：先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用无水乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽粗品8.6g。

二、纯化：

溶解：精密称取多肽粗品，加入适当的纯化水配成溶液，搅拌至无颗粒状澄清溶液。

过滤：将多肽的溶液用沙芯过滤器0.45um的混合滤膜过滤.

1、制备方法：

通过一次纯化、二次纯化和三次纯化得到多肽精制合格品，流动相为A相纯水，B相1‰TFA水溶液，C相乙腈，D相3‰醋酸溶液。

将粗品溶解过滤，用输液泵上样，一次纯化洗脱梯度如下(表1)：

表1 一次纯化洗脱梯度

收取在紫外波长220nm吸收大于220mV的溶液，通过检测合并大于95％的液体样品待二次纯化，梯度见表2。

表2 二次纯化洗脱梯度

收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，通过检测纯度大于98％的作为合格。

浓缩、过滤、冻干：将合格溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用0.22um滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得纯品。

2、精制品的制备

二次纯化所得的样品，收取其中在紫外波长220nm吸收大于220mV的溶液，通过检测合并大于98.5％的液体样品待三次纯化，梯度见表3。

表3 三次纯化洗脱梯度

收取在紫外波长220nm吸收大于220mV的溶液，通过检测合并大于99.5％的液体样品，即为精制合格品。

将多肽精制合格品溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到多肽的精制合格品。

三、纯度检测

收集冻干后的纯化产物，通过反相液相检测多肽纯度分析纯度，分析条件为：

流动相：ACN(+0.1％TFA)、H2O(+0.1％TFA)；ACN线性梯度：15％-60％；流速：1mL/min；运行时间：30min；上样量：20μl；检测波长：220nm；分析柱:4.6×250mm，Kromasil C18-5；待检品溶液制备：多肽供试品适量，精密称定，加水溶解配制成约1mg/mL的供试品溶液。

表4 RP-HPLC检测整合素阻断剂多肽Ⅰ－Ⅹ的纯度

合成的整合素阻断剂多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果见表4，多肽纯度均大于95％，符合设计要求。

实施例2

整合素阻断剂多肽对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究整合素阻断剂多肽对佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物，清洁级wistar大鼠238只，雄性，体重为150g—180g，随机分成34组，分别是空白对照组，模型对照组，多肽Ⅰ－Ⅹ低中高3个剂量组(3，6，9mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)，再加一个HM-3治疗剂量组做比较。除空白组外，第0天各实验组建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌(H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐剂0.08ml造成大鼠佐剂性关节炎模型。第19天出现继发性炎症开始皮下注射给药：多肽Ⅰ－Ⅹ3个剂量组(3，6，9mg/kg)：每日一次，连续10天；：多肽HM-3组(6mg/kg)：每日一次，连续10天；阳性药对照组(甲 氨蝶呤1mg/kg)：每五天一次，连续3次；空白对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10天。分别于造模后第1，4，7，10，13，16，19，22，25,28，31天称重，造模后第19，22，25,28，31天进行关节评分以及左右后足足爪肿胀度的测量来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

1)体重

分别于造模后1，4，7，10，13，16，19，22，25,28，31天称重，并记录数据。

2)关节评分

四肢:按0—4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。大鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后第19，22，25,28，31天进行关节评分，并记录结果。

3)测量足爪肿胀度

分别于造模前和造模后1，4，7，10，13，16，19，22，25,28，31用排水法测量大鼠左后足足爪肿胀度并记录结果；造模前和造模后第19，22，25,28，31天测量大鼠右后足足爪肿胀度并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示,用SPSS11.0软件进行各给药组与对照组之间进行t检验,表中*表示p<0.05，**表示p<0.01。

结果：造模后大鼠与正常大鼠相比较，在大鼠左后足跎处注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂后，左后足会迅速产生原发性关节炎，出现明显的肿胀，并伴有溃烂；右后足大约19d后开始出现继发性关节炎。整合素阻断剂多肽在佐剂诱导大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用结果见表5，由表可知，整合素阻断剂多肽Ⅰ—Ⅶ在佐剂诱导大鼠关节炎动物模型能发挥体内免疫保护作用，整合素阻断剂多肽Ⅷ-Ⅹ的作用效果较Ⅰ—Ⅶ多肽的作用弱，结果如下：

大鼠阳性对照组左后足足爪肿胀度与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)；整合素阻断剂多肽Ⅰ-Ⅲ的高剂量组左后足足爪肿胀度与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)，整合素阻断剂多肽Ⅰ-Ⅲ的中剂量组和Ⅳ-Ⅶ的高剂量组左后足足爪肿胀度与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，实验结果具有统计学意义。

表5 整合素阻断剂多肽对佐剂型类大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

*表示p<0.05，**表示p<0.01.

结论：整合素阻断剂多肽Ⅰ—Ⅹ对AA大鼠关节炎具有治疗作用，比较而言多肽Ⅰ—Ⅲ组的治疗效果较Ⅳ—Ⅶ组优，Ⅷ—Ⅹ组的治疗效果比较弱，多肽Ⅰ和多肽Ⅱ的中、高剂量组均较HM-3治疗组的效果好，多肽Ⅲ的高剂量组较HM-3治疗组的效果好，多肽Ⅰ的低剂量组与HM-3治疗组的效果相当。可见，截断后的多肽有仍有开发的价值。

实施例3

整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用

1)BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型的制备：

健康BALB/c小鼠55只，雄性，体重20-25g，裂隙灯显微镜下检查双眼眼前段及附属器，排除眼部病变。碱烧伤模型制备前1d予0.3％氧氟沙星眼药水点眼，每日2次。小鼠经腹腔注射1.8％Avertin麻醉后，用镊子夹住直径为2mm的单层滤纸片，浸于1mol/L氢氧化钠溶液中，使其达饱和状态，去除多余液体，将滤纸片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，弃掉滤纸，立即用15mL的PBS充分冲洗烧伤区及结膜囊1min。棉签拭去过多水分，于手术显微镜下以角膜刮铲平行于角膜缘的方式旋转刮除角膜上皮，注意勿伤及上皮下基质层及角膜 缘，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。

(2)实验动物分组及标本获取

60只小鼠按随机分组，标记为多肽Ⅰ实验组、多肽Ⅱ实验组至多肽Ⅹ实验组共十个实验组、HM-3实验组和对照组，每组5只，自碱烧伤后分别给予50μg多肽Ⅰ—Ⅹ、HM-3和生理盐水玻璃体腔注射，每日1次，持续1周，碱烧伤后1d、7d、14d于裂隙灯显微镜下观察各组角膜的炎症反应及新生血管情况。碱烧伤后第14d于带眼前段照相的裂隙灯显微镜下拍照记录各组角膜新生血管形成情况，随即以颈椎脱臼法处死所有小鼠并摘除眼球，生理盐水冲洗血迹，4％多聚甲醛固定1.5h，含30％蔗糖的PBS中脱水过夜，OCT冰冻切片包埋剂包埋，-80℃冰箱中保存，8μm冰冻切片，免疫组织化学法检测CD31的表达。

(3)角膜组织微血管密度定量测定

微血管密度(Microvessel density，MVD)是评价血管形成的指标。我们采用抗CD31抗体免疫组织化学法标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，由此来衡量新生血管生成的程度。统计微血管的标准：显微镜下观察角膜组织中与邻近组织分界清楚，并被染成棕黄色或褐色的内皮细胞或细胞团均计入新生血管。在10×20镜下计数整张切片新生血管数目，角膜组织片照相后以图像处理软件Image J计算出整个角膜组织片面积，求出该例整张切片的新生血管密度，并计算整合素阻断剂多肽对血管新生的抑制率。

表6 整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用a

a:*p<0.05,**P<0.01vs.the negative control group；

整合素阻断剂多肽对小鼠角膜新生血管的作用结果见表6：CD31作为微血管标记物，主要表达于血管内皮细胞胞质中，染色阳性细胞为血管内皮细胞染成棕黄色或褐色，无背景染色。多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ实验组CD31阳性新生血管与对照组相比显著减少。多肽Ⅰ实验组切片MVD值为37.61±3.56，多肽Ⅱ实验组MVD值为29.87±3.43，多肽Ⅲ实验组MVD值为35.92±4.19与对照组72.66±6.31比较有极显著性差异，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为48.24％、58.89％、50.01％，HM-3组的抑制率为50.15％，可见与HM-3组相比较，多肽Ⅱ和多肽Ⅲ要比多肽HM-3的抑制率好。多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ实验组CD31阳性新生血管与对照组相比减少。多肽Ⅳ实验组切片MVD值为42.27±6.82，多肽Ⅴ实验组MVD值为38.78±2.87，多肽Ⅵ实验组MVD值为44.41±4.08与对照组72.66±6.31比较有显著性差异，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为46.89％、48.01％、42.83％。多肽Ⅶ实验组CD31阳性新生血管与对照组相比有减少，但效果不如前几个多肽明显，对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率为30.42％。多肽Ⅷ、多肽Ⅸ和多肽Ⅹ对小鼠角膜新生血管抑制作用不明显。实验结果表明多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ种整合素阻断剂均能够极显著抑制角膜新生血管的生长，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ两种整合素阻断剂均能够显著的抑制角膜新生血管的生长能够作为治疗角膜新生血管性眼病的药物。

实施例4

整合素阻断剂多肽对家兔虹膜新生血管的作用

采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉，经眼底荧光素血管造影(FFA)证实静脉阻塞成功。5-12天后眼虹膜荧光素血管造影(IFA)显示虹膜血管与正常对照组对比荧光素渗漏明显，证实虹膜新生血管化的动物模型(NVI)形成。

取造模成功的12只眼，随机分成4组，每组3只。分别标记为阴性对照组、多肽Ⅰ—Ⅹ治疗组和多肽HM-3治疗组，分别以生理盐水、150μg多肽Ⅰ—Ⅹ和多肽HM-3玻璃体腔注射给药，每日1次，持续2周。第3周用光学及电子显微镜观察。

结果：光学显微镜下可观察到虹膜前表面是主要由纤维组织组成的纤维血管膜残迹，仅有极少的开放血管腔。在虹膜基质内可看到血管残存物，为坏死细胞及细胞碎片。而光镜下的对照眼的虹膜表面为有分枝的和潜在管腔的纤维血管膜。

治疗组虹膜的超微结构为一系列的退行性改变。虹膜基质中部的大血管的内皮细胞有正 常的细胞核、细胞质和细胞连接。虹膜基质中及虹膜前表面有毛细血管残迹，周围有细胞碎片和巨噬细胞浸润。无潜在管腔的毛细血管及退变的壁细胞，表明新生血管消退。

通过虹膜新生血管化的动物模型实验，证明了多肽Ⅰ—Ⅹ和多肽HM-3能够抑制新生血管形成并使已形成的血管退化，在光学显微镜下观察发现，其中多肽Ⅰ—Ⅲ与阴性组相比新生血管的消退很明显，治疗效果优于HM-3组和多肽Ⅳ—Ⅹ组，多肽HM-3组的血管退化程度与多肽Ⅴ相似。

实施例5

整合素阻断剂多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用

用846复合麻醉剂0.5mL/kg腹腔注射充分麻醉6-8周雄性BN大鼠，激光光凝前5min用复方托品酰胺眼液滴眼一次，充分散大双眼瞳孔。固定动物，在-53.00D角膜接触镜辅助下，围绕视盘并在距视盘2PD位置等距离行氪离子激光光凝，共计8个光凝斑，激光波长为647.1nm，功率为350mW，光凝斑直径和时间分别为50μm及0.05s。光凝后立刻进行眼底照相。于光凝后3、7、14、21、28分别进行FFA、组织病理及透射电镜检查。

通过眼底照相及FFA检查证实，光凝后第21天光凝斑荧光素渗漏达到高峰。同时进行病理组织学检查，光凝后21天，光镜下显示CNV呈现显著的纤维血管增殖，其中可见大量新生血管，管腔内可见红细胞；镜下显示脉络膜黑色素细胞间有毛细血管呈凝聚性改变，内皮细胞凝聚。表明21天后大鼠脉络膜新生血管模型形成。

将造模成功的60只大鼠，随机分成12组，每组5只大鼠。分别标记为空白对照组、多肽Ⅰ—Ⅹ治疗组和多肽HM-3治疗组，分别以生理盐水、多肽Ⅰ—Ⅹ(75μg)、HM-3(75μg)治疗组玻璃体腔注射，每日1次，持续1周。给药后3天、7天、14天及28天均进行FFA检查。

表7 各实验组给药后不同时间CNV发生率

结果：见表7，各实验组给药后不同时间CNV发生率(发生渗漏的光斑数/总光斑数)。FFA检测，给药后3天，多肽Ⅰ—Ⅹ治疗组和HM-3治疗组荧光素渗漏与用药前相比无明显变化；给药后7天，治疗组Ⅰ—Ⅲ和HM-3治疗组荧光素渗漏比用药前逐渐减轻；给药后14天，治疗组Ⅰ—Ⅶ和HM-3治疗组荧光素渗漏比用药前逐渐减轻；给药后28天，荧光素渗漏相比用药后14天更少。说明七种整合素阻断剂多肽能够有效的治疗大鼠脉络膜新生血管，有可能开发成为治疗脉络膜新生血管性眼病的药物。治疗组Ⅷ—Ⅹ在给药后效果不是很明显。

实施例6

整合素阻断剂多肽对多种肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制多种肿瘤细胞增殖的活性。以多西他赛为阳性药(Taxol)，生理盐水为阴性组。多种肿瘤细胞细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×104个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。将多肽Ⅰ—Ⅹ、HM-3、Taxol用培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL。以加入整合素阻断剂多肽作为给药组，Taxol作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对照组，在37℃，5％CO2培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入20μL5mg/ml的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

$\mathrm{PI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\&times;100\%$

其中Ntest为测试组的OD值，Ncontrol为空白对照组的OD值。

表8-1 整合素阻断剂对多种肿瘤细胞增殖抑制作用

表8-2 整合素阻断剂对多种肿瘤细胞增殖抑制作用(接上表)

整合素阻断剂多肽对多种肿瘤细胞增殖抑制作用见过如表8-1和8-2，多肽Ⅰ—Ⅲ能有效的抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胶质瘤和宫颈癌的增殖，其中对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和宫颈癌的抑制率均在70％以上；多肽Ⅳ—Ⅵ能抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤的增殖，其中对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌的抑制率均在60％以上，达到抑制这些肿瘤增殖的效果。多肽Ⅶ—Ⅹ对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤的增殖抑制作用相比较前几个多肽在同等的剂量下作用较弱，但实验数据显示其任对肿瘤细胞有增殖抑制作用。与HM-3组相比较，多肽Ⅰ组对肝癌、结肠癌、胶质瘤和宫颈癌的增殖抑制率要高于HM-3组；多肽Ⅱ组对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤和宫颈癌的增殖的增殖抑制率要高于HM-3组；多肽Ⅲ组对胃癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、结肠癌和宫颈癌 的增殖抑制率要高于HM-3组；多肽Ⅳ组对肺癌、肝癌、黑色素瘤的增殖抑制率和HM-3组相当。

实施例7

三维transwell法检测多肽HM-3抑制人脐静脉内皮细胞迁移的活性

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用含5％胎牛血清和1×ECGS的内皮细胞培养液，在37℃、5％CO2的培养箱中培养至90％以上的汇合度时，采用transwell法检测HM-3的抑制内皮细胞迁移的活性，内皮细胞HUVEC只用第2-8代，具体操作如下：

用10mg/mL MatrigelMatrigel胶用DMEM培养基以1:4稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。

将培养到对数生长期的HUVEC细胞用0.2％EDTA消化，收集，用PBS洗涤两次后用含有0.1％BSA的内皮细胞培养液重悬。在显微镜下计数，将细胞浓度调整到1×10⁵个/mL。

配制各组的试验用液，用含0.1％BSA的细胞培养液稀释到100μL。

分组如下：

空白对照组：为不含药物的细胞培养液。

恩度组：为用不含药物的细胞培养液将5mg/mL的恩度药液稀释到预定浓度。

多肽Ⅰ—Ⅹ组：为用不含药物的细胞培养液将多肽Ⅰ—Ⅹ稀释到10μg/mL。

将细胞接种到transwell小室中，每孔100μL，并且将各组试验用液加入小室中。24孔板中加入0.6mL含5％胎牛血清和1×ECGS的内皮细胞培养液刺激细胞迁移，于5％CO2，37℃孵育24h。

弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration inhibition，MI)：

$\mathrm{MI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\&times;100\%$

其中Ntest为测试组的细胞迁移数，Ncontrol为空白对照组的细胞迁移数。

数据统计：

试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t-test检验，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。实验结果见表9。

由实验结果可见在多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ和多肽HM-3的作用下，迁移的内皮细胞数与阴性对照相比显著减少，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ和多肽HM-3能抑制5％的胎牛血清及ECGS诱导的HUVEC的迁移作用，抑制率为71.95％、73.68％、70.27％、68.10％，对细胞迁移的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(P<0.01)；在多肽Ⅳ、多肽Ⅴ、多肽Ⅵ的作用下，迁移的内皮细胞数与阴性对照相比减少，抑制率为61.78％、65.19％、61.57％，对细胞迁移的抑制率与阴性对照相比有显著性的差异(P<0.05)；多肽Ⅷ、多肽Ⅳ、多肽Ⅹ在该剂量下对HUVEC的迁移作用比较弱，没有前面多肽的抑制效果好，与阴性组对照没有显著性差异。

表9 多肽Ⅰ—Ⅹ对HUVEC的迁移抑制

a:a:*p<0.05,**P<0.01vs.the control group；ES:endostar。

Claims (9)

1.整合素阻断剂多肽，其所述的多肽的氨基酸序列为下列中的一种：

多肽Ⅰ Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅱ Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅲ Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅳ Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅴ Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅵ Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅶ Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅷ Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅸ Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；

多肽Ⅹ Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。

2.权利要求1所述的整合素阻断剂多肽的制备方法，其特征在于：所述多肽采用固相合成方法合成，所述固相合成方法是其以wang resin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接一肽至八、九、十至十七肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多肽粗品，将粗品进行纯化，首先溶解，然后用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。

3.根据权利要求2所述的整合素阻断剂多肽，其特征在于：所述固相合成方法制得的多肽纯度均大于95％。

4.根据权利要求1所述的整合素阻断剂多肽在制备治疗关节炎、抑制新生血管眼部疾病、抑制肿瘤细胞增值或抑制内皮细胞迁移的活性药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的整合素阻断剂多肽的用途，其特征在于：所述整合素阻断剂多肽在佐剂诱导大鼠关节炎动物模型能发挥体内免疫保护作用，对AA大鼠关节炎具有治疗作用。

6.根据权利要求4所述的整合素阻断剂多肽的用途，其特征在于所述抑制新生血管的作用为对角膜新生血管的抑制作用；对虹膜新生血管的抑制作用；对脉络膜新生血管的抑制作用。

7.根据权利要求4所述的整合素阻断剂多肽的用途，其特征在于所述对角膜抑制新生血管的作用，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ整合素阻断剂均能够极显著抑制角膜新生血管的生长，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ整合素阻断剂能够显著的抑制角膜新生血管的生长；对虹膜新生血管的抑制作用，多肽Ⅰ—多肽Ⅹ能够抑制新生血管形成并使已形成的血管退化，其中多肽Ⅰ—多肽Ⅲ与阴性组相比新生血管的消退很明显，治疗效果优于多肽Ⅳ—多肽Ⅹ；多肽Ⅰ—多肽Ⅶ能够有效的治疗脉络膜新生血管。

8.根据权利要求4所述的整合素阻断剂多肽的用途，其特征在于多种肿瘤细胞增值的抑制为对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胶质瘤、黑色素瘤和宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、鼻咽癌增殖具有抑制作用。

9.根据权利要求4所述的整合素阻断剂多肽的用途，其特征在于：所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞，所述人脐静脉内皮细胞用含5％胎牛血清和1×ECGS的内皮细胞培养液；多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ能抑制5％的胎牛血清及ECGS诱导的HUVEC的迁移作用，抑制率均大于68.10％，对细胞迁移的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(P<0.01)；在多肽Ⅳ、多肽Ⅴ、多肽Ⅵ的作用下，迁移的内皮细胞数与阴性对照相比减少，抑制率均大于60.57％，对细胞迁移的抑制率与阴性对照相比有显著性的差异(P<0.05)。