CN103819542A - 一种聚乙二醇修饰及蛋白质融合表达的整合素阻断剂ap-25及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制肿瘤血管生成、具有整合素亲和性和结合能力的一种整合素阻断剂，此阻断剂是一种多肽，此多肽经过了聚乙二醇修饰，修饰后延长了多肽的半衰期，降低了免疫原性；此阻断剂与牛血清白蛋白、热休克蛋白、伴侣素、谷胱甘肽转移酶(GST)、信号肽、免疫球蛋白融合表达，有利于二硫键的正确形成，延长了半衰期，同时还给增加了融合蛋白特有的一些功能，该修饰和融合表达后的整合素阻断剂多肽可用于实体肿瘤的治疗。本发明设计的整合素阻断剂多肽科学、合理、可行有效，能作为制备治疗人类实体肿瘤的治疗药物，其极大拓展了该整合素阻断剂的治疗谱，具有显著的社会价值和市场价值。

Description

一种聚乙二醇修饰及蛋白质融合表达的整合素阻断剂AP-25及其应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制肿瘤血管生成、具有整合素亲和性和结合能力的一类整合素阻断剂，此阻断剂是一种聚乙二醇修饰或融合多肽，该整合素阻断剂聚乙二醇修饰或融合多肽可用于制备治疗血管性疾病，包括类风湿、眼病及肿瘤药物中的应用。

背景技术

新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创伤愈合中是必不可少的过程，同时新生血管的生成也与很多疾病有着密切联系，如类风湿关节炎、眼科疾病如年龄相关性黄斑变性(AMD)、肿瘤等。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关节内滑膜血管增生，形成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯软骨并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响关节的稳定，容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系统性疾病。

年龄相关性黄斑变性(AMD)主要表现国视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细外排出形成玻璃膜疣，进而引起玻璃膜本断裂，脉络膜毛细血管通过破裂的玻璃膜时进入视网膜神经上皮下，形成脉络膜新生血管，由于新生血管壁的结构异常，导致血管的渗漏和出血，从而引发一系列的继发性病变。

研究表明，实体瘤的生长依赖于新生血管生成，新生血管不仅可以提供肿瘤所需要的营养和氧气，排泄代谢产物，而且是远处转移的途径。因此，阻断新生血管形成可能成为阻止肿瘤生长和转移的手段，从而激发了对促血管生成分子和抗血管生成分子的广泛研究。

相比传统肿瘤治药物疗，肿瘤血管生成抑制剂最大优点在于：①选择性作用于血管内皮细胞，全身毒副作用小；②靶细胞为血管内皮细胞，药物易从血液中到达与之接触发生作用；③血管内皮细胞无或少突变，不易产生耐药性，可长期用药；④可与放化疗方法联合应用并减轻后者的毒副反应。

目前，国际上开发出的整合素阻断剂已进入II期临床。而我国尚未有相似或同类产品进入市场，非常有必要开发我国自主知识产权的此类药物。ZL2005100403785高效抑制血管生成多肽及其制备方法和应用，介绍几种整合素抑制剂，其一为整合素阻断剂多肽序列为：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)(命名为AP-25)，该序列包含了整合素配体序列(Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly)和新生血管抑制序列(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)，其中整合素配体序列中含有RGD-4C序列(Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly)，整合素阻断剂多肽序列可以有效地结合于肿瘤特异性表达的整合素亚型，并且该序列中含有新生血管抑制序列，能够抑制肿瘤新生血管形成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。该多肽经反复体内外活性评价证实具有较好的抑瘤效果，能够显著抑制内皮细胞迁移、抑制肿瘤新生血管生成，从而抑制肿瘤的生长。然而上述多肽的半衰期短，拟用临床人的给药是每天静脉滴注，这给患者带来了一定的痛苦。

但是AP-25有两对二硫键，二硫键在合成过程中容易错配，形成沉淀，产率低，不容易产业化；另外AP25的体内半衰期短，临床上使用需要静脉滴注，来保证长时间内体内血药浓度。对于AP25的上述不足，需要通过修饰或融合蛋白来改进，以便将其开发成创新药物。

文献报道中，对分子结构进行修饰或改造是解决半衰期较短、需连续给药问题的常用方法，其中以化学修饰应用最为广泛，常用的化学修饰剂有聚乙二醇(polye thylene glycol，PEG)、葡聚糖、聚氨基酸、聚酸酐等。PEG具有无毒、无免疫原性、水溶性好的特点，被美国食品与药物管理局(FDA)认可作为药品的辅助原料和修饰剂。蛋白质类药物经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过率减少，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白水解酶水解，同时减少了中和抗体的产生，这些均有助于蛋白质类药物生物半衰期的延长。目前已有多种PEG修饰的蛋白质类药物上市销售。但PEG修饰同时也可能影响蛋白质的生物学活性，其影响大小与修饰剂、修饰条件及蛋白质本身的性质有关。对于具体的蛋白质，其最佳修饰需通过制备PEG修饰的蛋白质及生物活性研究来决定。合成小分子多肽的PEG修饰研究起步较晚，但已引起不少研究者的关注。

另外，也可以应用基因工程技术方法对分子结构进行修饰或改造。含有二硫键的多肽在生产过程中容易形成包涵体，产率低，易降解等，通过构建融合载体表达融合蛋白不仅提高了产率，延长了半衰期还增加了一些融合蛋白特有的功能。通过融合表达得到的蛋白主要有以下几个优点：一、增强了目的蛋白的稳定性，尤其对小分子量的多肽稳定性提高极为显著；二、目的蛋白易于分离，利用融合蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度高的融合蛋白；三、目的蛋白表达率高，目的蛋白与融合蛋白共用一套完善的表达元件，显著提高了目的蛋白的表达率；四、目的蛋白溶解性好，由于融合蛋白的存在，目的蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多数具有水溶性。融合表达也存在一些缺点如过程繁琐不易于产业化等。

AP-25与分子伴侣(伴侣素、热休克蛋白)融合表达有利于二硫键正确配对，促进空间构象的形成，与HSP融合表达能搞高稳定性，免受细胞内蛋白酶的破坏，降低了AP-25在体内与其他蛋白质结合的机率；与GST融合表达能增强细胞的抗损伤、抗癌变能力；与免疫球蛋白融合表达能增强机体的免疫力提高药效；与信肽融合表达有利于AP-25在体内的跨膜转移，有利于药物高效的、正确的作用于靶点。

PEG修饰一般会影响多肽的活性，原因是容易把活性位点遮盖，需要经过大量的筛选，才能获得活性不变，而半衰期延长的多肽。另外蛋白质融合表达后，等于重新获得一种新结构分子，新分子的活性、安全性、理化性质(包括分子量、空间结构等)都发生了变化，需要重新进行评价，才能获得有益效果的分子。

发明内容

发明目的

本发明针对mPEG-SC-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(修饰位点为N端丙氨酸，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、BSA-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(N端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-BSA(C端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(N端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP(C端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Cpn-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(N端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Cpn(C端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、GST-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(N端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-GST(C端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、SP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(N端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-SP(C端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ig-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(N端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ig(C端融合，序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)做了进一步研究，发现在相同给药剂量下能显著提高对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用。

技术方案

一种聚乙二醇修饰的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为mPEG-SC-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)(命名为AP-25)，其特征在于所述的mPEG-SC的分子量范围为500-40000。

作为一种优化方式所述的一种聚乙二醇修饰的整合素阻断剂AP-25，其特征在于所述的mPEG-SC(单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯)的分子量为20000，修饰位点为N端丙氨酸，PEG与丙氨酸上的游离氨基发生缩合反应。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为BSA-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为BSA，N端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-BSA(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为BSA，C端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白HSP的分子量范围为68-90kD，N端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白HSP的分子量范围为68-90kD，C端融合表达。

作为一种优化方式所述的融合表达的整合素阻断剂AP-25，其特征在于所述的融合蛋白HSP的分子量为70kD。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Cpn-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为Cpn，N端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Cpn(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为Cpn，C端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为GST-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为GST，N端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-GST(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为GST，C端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为SP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为信号肽(SP)，N端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-SP(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为信号肽(SP)，C端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ig-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为Ig，N端融合表达。

一种融合表达的整合素阻断剂AP-25，其中整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ig(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的融合蛋白为Ig，C端融合表达。

一种聚乙二醇修饰的或融合表达的整合素阻断剂AP-25在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。

AP-25基因序列为：GCC TGC GAC TGC CGA GGC GAC TGC TTC TGT GGC GGC GGCGGC ATT GTC AGG AGG GCC GAC CGA GCC GCC GTC CCC。

有益效果

1、为了延长多肽Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的半衰期，我们采用不同分子量的聚乙二醇(PEG)对此多肽进行了修饰和进行融合表达AP-25，发现mPEG-SC_20k-AP-25、BSA-AP-25、AP-25-BSA、HSP-AP-25、AP-25-HSP、Cpn-AP-25、AP-25-Cpn、GST-AP-25、AP-25-GST、SP-AP-25、AP-25-SP、Ig-AP-25、AP-25-Ig具有延长了AP-25半衰期，但又不影响其体内外活性的特点。一个多肽的修饰产物属于一个新型分子，往往与修饰前的分子在活性上产生不同的效果。本发明针对上述整合素阻断剂mPEG-SC_20k-AP-25、BSA-AP-25、AP-25-BSA、HSP-AP-25、AP-25-HSP、Cpn-AP-25、AP-25-Cpn、GST-AP-25、AP-25-GST、SP-AP-25、AP-25-SP、Ig-AP-25、AP-25-Ig对多种肿瘤有治疗作用进行了大量的体内外活性研究，发现给药频率降低的情况下，mPEG-SC-AP-25、BSA-AP-25、HSP-AP-25、Cpn-AP-25、GST-AP-25、SP-AP-25、Ig-AP-25对多种血管性疾病，包括类风湿、眼病、肿瘤保持了很好的抑制作用，拓展了其社会价值和经济价值。

2、研究发现，在该整合素阻断剂多肽的N端特别优化进行了聚乙二醇修饰，最终优化的序列为：mPEG-SC-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，其含有PEG和25个氨基酸的多肽，分子中RGD-4C序列具有整合素亲和性和结合能力，研究表明其起作用靶点为整合素αvβ3和αvβ5结合，但主要的结合靶点仍为整合素αvβ3，并且该序列中含有新生血管抑制序列，从而抑制肿瘤新生血管形成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。经前期试验表明PEG修饰如果再C端的话，会影响其活性，造成活性降低，遮盖了其活性位点，说明PEG修饰位点是本发明的关键因素。

聚乙二醇(PEG)是一类具有独特理化性质的大分子聚合物，它具有良好的生物相容性，无毒、无抗原性。蛋白质或多肽药物经PEG修饰后，其主要的生物学功能保持不变，并且经PEG修饰能赋予蛋白质和多肽类药物多种优良性能：(1)增加稳定性，延长血浆半衰期；(2)降低免疫原性和抗原性；(3)降低毒副作用；(4)减小被水解酶降解的可能性、降低被肾脏清除的速率；(5)改善药物体内分布和动力学行为等。

聚乙二醇(mPEG-SC)修饰后多肽的靶点不变，延长多肽分子的体内半衰期、清除率低、降低了免疫原性和抗原性，并且抗肿瘤活性保持不变，但是降低了给药频率，修饰后由原来每天给药一次，变为每2-3天给药一次。

发明人经过大量实验获知该整合素阻断剂体内实验具有明显的抗肿瘤效果，并且副作用少，用量少成本低。说明本发明设计的聚乙二醇修饰的整合素阻断剂多肽科学、合理、可行有效，能作为制备治疗人类实体肿瘤的治疗药物，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。

表1、AP-25和mPEG-SC-AP-25的比较

表2、AP-25和融合表达AP-25的比较

表3、AP-25和PEG修饰、融合表达AP-25的活性比较

表4、AP-25和PEG修饰、融合表达AP-25的活性比较

表5、AP-25和PEG修饰、融合表达AP-25对眼病治疗效果比较

附图说明

附图1PEG修饰的AP-25与AP-25免疫原性比较；

附图2抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖作用；

附图3抑制人胰腺癌SW-1990细胞的增殖作用；

附图4抑制人肺癌H460细胞的增殖作用；

附图5抑制人食管癌Ec109细胞的增殖作用；

附图6抑制人鼻咽癌CNE细胞的增殖作用；

附图7抑制人甲状腺癌SW-579细胞的增殖作用；

附图8抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖作用；

附图9抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖作用；

附图10抑制人肾癌A498细胞的增殖作用；

附图11抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖作用；

附图12抑制人卵巢癌SK-OV-3细胞的增殖作用；

附图13抑制人子宫内膜癌HHUA细胞的增殖作用；

附图14抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖作用；

附图15抑制人前列腺癌DU-145细胞的增殖作用；

附图16抑制人膀胱癌HT1376细胞的增殖作用；

附图17抑制人纤维肉瘤HT-1080细胞的增殖作用；

附图18对佐剂型原发性关节炎模型大鼠足爪肿胀度的影响；

附图19对佐剂型原发性关节炎模型大鼠足爪肿胀度的影响；

附图20对大鼠棉球肉芽肿亚急性炎症模型体内免疫保护作用；

附图21对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用

附图22为实施例7电泳结果图，其中泳道1：蛋白Marker；2：阴性对照；3-10：多肽样品

附图23为实施例8电泳结果图，其中泳道1：蛋白Marker；2：阴性对照；3-8：多肽样品

附图24为实施例9电泳结果图，其中泳道1：蛋白Marker；2：阴性对照；3-6多肽样品

附图25为实施例10电泳结果图，其中泳道1：蛋白Marker；2：阴性对照；3-4多肽样品

附图26为实施例11电泳结果图，其中泳道1：蛋白Marker；2：阴性对照；3-6多肽样品

附图27为实施例12电泳结果图，其中泳道1：蛋白Marker；2：阴性对照；3-6多肽样品

具体实施方式

材料：

1、表达载体pET-23a(+)-AP-25        金斯瑞生物科技

2、胶回收试剂盒                    生工生物工程(上海)有限公司

3、成熟载体                        上海德聚生物技术有限公司

实施例1 整合素阻断剂AP-25

Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的固相合成方法，其以Fmoc-Pro-2Cl resin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至二十五肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得AP-25粗品。将粗品进行纯化，首先溶解，然后用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。具体步骤如下：

一、合成：

称取Fmoc-Pro-2Cl resin1g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱中，加入CH₂Cl₂10mi使树脂充分膨胀。

脱帽：加入六氢吡啶/DMF的脱帽液10ml，密封后放入振荡器中反应5分钟，温度控制在室温，5分钟后将脱帽液抽干，中间用DMF洗涤一次，然后再加入一次20％的脱帽液10ml反应15分钟；

洗涤：将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂6次，抽干，取20颗树脂在小试管内，加入验色剂，在115℃加热3分钟。

缩合：称取保护氨基酸和HOBt0.144g，溶于15ml DMF和0.376ml DIEA，然后倒入反应釜中反应1.5左右小时，温度控制在34℃左右。

洗涤：将反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取10-20颗树脂在小试管内，加入验色剂，在115℃加热3-5分钟。

切肽：把抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入300mL90％的切割液(按体积比比计三氟乙酸∶苯酚∶苯甲硫醚∶EDT∶水＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)，密封反应2小时，用砂芯漏斗将树脂与多肽分离。

后处理：先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用无水乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽粗品0.672mg。

二、纯化：

溶解：精密称取AP-25粗品，加入适当的纯化水配置成10g/L的溶液，超声搅拌至无颗粒状澄清溶液。

过滤：将AP-25的溶液用沙芯过滤器0.45um的混合滤膜过滤.

制备：

一次纯化

平衡：制备柱用5％乙腈+95％三氟乙酸水溶液，流速80ml/min冲洗10min。

上样：用输液泵上样，流速80ml/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。

洗脱：

洗脱梯度：

收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测纯度大于95％的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。

二次纯化

平衡：制备柱用5％乙腈+95％醋酸水溶液，流速80ml/min冲洗10min

上样：将一次收到的峰顶旋转蒸发掉有机溶剂后用输液泵上样，流速80ml/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。

洗脱：

洗脱梯度：

收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，通过检测纯度大于99％的作为合格。浓缩、过滤、冻干：将合格溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用0.22um滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得纯品。

实施例2

PEG的合成

PEG委托上海吉尔生化有限公司合成，其中PEG有5000D、10000D、20000D、40000D四种分子量。

实施例3 聚乙二醇修饰多肽的步骤

mPEG-SC_20K与AP-25的反应

分别称取2g mPEG-SC_20K和168.33mg AP-25(摩尔比为1.5∶1)置于40ml-100ml配好的pH5-8.5的PBS缓冲溶液中，在4℃条件下过夜，使其进行反应，PEG修饰位点为N端丙氨酸，PEG与丙氨酸上游离的氨基发生缩合反应。PEG-SC500-20000都可按实施例2进行连接反应合成修饰多肽。

实施例4 分离纯化步骤

一、分离

对反应后的样品应用半制备型高效液相(HPLC，BIO-RAD)进行纯化，纯化条件为：

流动相：ACN(+0.1％TFA)、H₂O(+0.1％TFA)；ACN线性梯度：30％-100％；

流速：2ml/min；运行时间：12min；

上样量：1.0ml；检测波长：220nm。

半制备色谱柱：YMC，250mm×10mm(5μm填料)。

在目的峰出峰过程中，用离心管收集产物。

二、纯化

将经过HPLC收集的产物首先于-70℃低温冰箱预冻过夜，之后于提前遇冷的冷冻干燥机冻干，直到目测全为白色粉末为止(30h左右)。收获冻干产物，称量并记录产物重量后于-20℃冰箱保存，并进行鉴定。

1.产物的纯度分析

将冻干后的产物，通过分析型高效液相色谱分析纯度，分析条件为：

流动相：ACN(+0.1％TFA)、H₂O(+0.1％TFA)；ACN线性梯度：10％-100％；

流速：1ml/min；运行时间：15min；

上样量：20μl；检测波长：220nm。

分析型色谱柱：北京创新通恒，250mm×4.6mm(5μm填料)。

2.修饰产物SDS-PAGE分析

基本操作参考《分子克隆(第二版)》。浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为10％，浓缩电压80伏，分离电压120伏。电泳结束后样品条带先进行BaI₂.染色，对含有PEG的部分进行染色；marker用考马斯亮兰R250对蛋白部分染色。染色完毕放入脱色液中至本底透明后扫描分析。

实施例5

mPEG-SC-AP-25和融合表达的AP-25在大鼠体内药代动力学研究

SD大鼠，随机分为14组，雌雄各半。每组尾静脉分别给予AP-25：14mg/kg；mPEG-SC5k-AP-2542mg/kg(折合AP-2514mg/kg)，mPEG-SC10k-AP-25：70mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；mPEG-SC20k-AP-25：126mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；mPEG-SC40k-AP-25：238mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；BSA-AP-25：378mg/kg(折合AP-2514mg/kg)，HSP68-AP-25：392mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；HSP70-AP-25：406mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；HSP75-AP-25：434mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；HSP90-AP-25：518mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；Cpn-AP-25：350mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；GST-AP-25：154mg/kg(折合AP-2514mg/kg)SP-AP-25：28mg/kg(折合AP-2514mg/kg)；Ig-AP-25：840mg/kg(折合AP-2514mg/kg)，各组大鼠分别于给药后0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、108h、132h由眼眶静脉丛采血，每点采全血0.5ml，肝素抗凝，12000rpm/2min离心分离血浆，吸取上清血浆各200μl与80℃预热的PBS(0.05MpH7.4)缓冲液600μl混匀，80℃水浴30min，12000rpm离心2min，取上清液，-20℃低温保存备用。待室温溶解后，用ELISA方法测定整合素阻断剂多肽血药浓度。

表6mPEG-SC_20k-AP-25和AP-25在SD大鼠体内的药代动力学参数比较(t_1/2β为半衰期，CL为血浆清除率，AUC为曲线下面积，MRT为平均滞留时间)

药物	t1/2β(h)	CL(L/h/kg)	AUC0-∞(mg/L/h)	MRT0-∞(min)
					AP-25	0.83±0.52	1.20±0.13	781.96±106.04	63.35±9.7
mPEG-SC5k-AP-25	12.19±0.67	0.0107±0.0012	5012.21±431.29	1004.32±65.72
					mPEG-SC10k-AP-25	16.49±0.39	0.0095±0.0004	5473.55±541.28	1037.43±70.81

mPEG-SC20k-AP-25	24.36±0.52	0.0063±0.0009	5362.48±661.73	1024.15±72.65
					mPEG-SC40k-AP-25	32.92±0.74	0.0055±0.0008	5673.82±509.78	1240.67±33.78
BSA-AP-25	36.12±0.71	0.0072±0.0011	5743.12±423.18	1513.27±69.83
					HSP68-AP-25	37.24±0.83	0.0041±0.0006	5843.48±603.23	1497.15±71.11
HSP70-AP-25	40.66±0.63	0.0059±0.0010	5917.32±610.25	1327.43±74.39
					HSP75-AP-25	47.89±0.82	0.0032±0.0003	6062.71±608.95	1605.46±80.36
HSP90-AP-25	55.18±0.77	0.0011±0.0002	5842.16±493.58	1833.28±81.91
					Cpn-AP-25	36.01±0.37	0.0066±0.0014	5567.23±572.39	1736.15±90.34
GST-AP-25	25.06±0.76	0.0064±0.0007	5831.71±382.69	1578.64±71.22
					SP-AP-25	10.17±0.83	0.0098±0.0008	6012.11±426.19	1001.33±55.79
Ig-AP-25	72.14±0.37	0.0022±0.0004	6105.73±552.86	1803.63±60.29

由表6可知，AP-25经修饰和融合表达后，半衰期有显著延长，血浆清除率明显降低。以上实验数据均证明经PEG修饰和融合表达能够显著改善蛋白多肽药物在大鼠体内的药代动力学特征。

实施例6

mPEG-SC-AP-25和AP-25免疫原性检测

BALB/c白鼠，随机分为5组，雌雄各半，尾静脉分别注射mPEG-SC-AP-25和AP-25。连续给药8周，于1-12周眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，_-20℃低温保存备用。待室温溶解后，取0.1ml上清液间接ELISA检测血清中抗体滴度。

组别设置：

第一组有效给药剂量的AP-2510mg/kg，给药：1天1次，6只动物雌雄各半；

第二组有效给药剂量的mPEG-SC5k-AP-2530mg/kg，给药：2天1次，6只动物雌雄各半。

第三组有效给药剂量的mPEG-SC10k-AP-2550mg/kg，给药：2天1次，6只动物雌雄各半。

第四组有效给药剂量的mPEG-SC20k-AP-2590mg/kg，给药：2天1次，6只动物雌雄各半。

第五组有效给药剂量的mPEG-SC40k-AP-25170mg/kg，给药：2天1次，6只动物雌雄各半。

由图2显示，AP-25组给药第3周便有抗体产生，而mPEG-SC-AP-25组给药第5周才检测到较低滴度的抗体。且各时间点整合素阻断剂多肽组抗体滴度明显低于AP-25组，停药后抗体滴度逐渐下降，到第12周整合素阻断剂多肽组抗体已检测不到。说明PEG修饰可显著降低AP-25体内免疫原性。

实施例7

BSA-AP-25的融合表达试验

一.PCR扩增获得AP-25编码基因

在工程菌pET-23a(+)-AP-25的基础上，根据目的基因AP-25的序列设计含有酶切点Nco I(CCATGG)的上游引物P1和含有酶切位点Bpu1102I(GCTGAGC)的下游引物P2。

P1：5’-CATGCCATG GCTCGTGGTGACGGTGGTGGTGGT-3’

P2：5’-CGCT CAGCGGTCATCAGGCGCGGAAGGTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应流程如下：

Step1

94℃5.0min(变性)

Step2

Step3

74℃7.0min(延伸)

PCR扩增得到目的片段后1.7％琼脂糖凝胶电泳检测验证，采用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段。

二.表达载体的构建

1、双酶切消化回收PCR产物和成熟载体(含有融合蛋白BSA基因序列的载体)酶切片段参照双酶切消化体系如下，反应条件为37℃，时间约为4h；

1.0％和2.0％琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切成熟载体和AP-25基因序列均使用胶回收试剂盒回收消化完全的目的基因片段；

Table7Reaction system of Double Enzyme Digestion

2、连接基因和载体片段

分别定量基因片段和载体片段浓度，按照终浓度5∶1进行连接反应；反应温度为4℃，时间约为16h。

Table8Reaction system of Ligation

3、转化筛选阳性克隆

将连接液各10μl转化至新鲜E.Coli DH5α感受态细胞；随即挑选单克隆PCR和双酶切消化验证，进行基因测序；测序阳性者保存质粒和菌种。

三、工程菌发酵表达

将发酵种子1％接种于10ml液体试管氨苄抗性LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜，10ml过夜培养完全转接至350ml抗性培养基中，振荡培养至对数中期(OD₆₀₀≥0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h后8000rpm离心10min收集菌体，制备菌体蛋白样品。

蛋白样品电泳图谱，见附图22。

四、融合蛋白BSA-AP-25镍亲和柱纯化

(1)以10倍柱床体积Balance Buffer通过恒流泵加入层析柱平衡基质，直至基线完全稳定；

(2)超声后得到的上清可溶性蛋白经0.45μm滤膜过滤后缓慢低温上样，收集流出样品待检测；

(3)上样完毕后，以10倍柱体积的Balance Buffer，流速0.5ml/min平衡直至基线完全稳定；

(4)以5倍柱体积的Wash BufferI，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品；

(5)换用5～10倍柱体积的Wash BufferII，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品待检测，直至基线稳定；

(6)以5倍柱体积Elute Buffer，流速2.0ml/min洗脱特异性结合目的蛋白，收集出峰处样品待检测；

(7)透析除盐后酶切融合蛋白，将酶切后的样品再过一次亲和层析柱，再次除盐浓缩，即可获得目的蛋白。

实施例8

HSP-AP-25的融合表达试验

一.PCR扩增获得AP-25编码基因

在工程菌pET-23a(+)-AP-25的基础上，根据目的基因AP-25的序列设计含有酶切点Nco I(CCATGG)的上游引物P1和含有酶切位点Bpu1102I(GCTGAGC)的下游引物P2。

P1：5’-CATGCCATG GCTCGTGGTGACGGTGGTGGTGGT-3’

P2：5’-CGCT CAGCGGTCATCAGGCGCGGAAGGTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应流程如下：

Step1

94℃5.0min(变性)

Step2

Step3

74℃7.0min(延伸)

PCR扩增得到目的片段后1.7％琼脂糖凝胶电泳检测验证，采用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段。

二.表达载体的构建

1、双酶切消化回收PCR产物和成熟载体(含有融合蛋白HSP基因序列的载体)酶切片段参照双酶切消化体系如下，反应条件为37℃，时间约为4h；

1.0％和2.0％琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切成熟载体和AP-25基因序列均使用胶回收试剂盒回收消化完全的目的基因片段；

Table9Reaction system of Double Enzyme Digestion

2、连接基因和载体片段

分别定量基因片段和载体片段浓度，按照终浓度5∶1进行连接反应；反应温度为4℃，时间约为16h。

Table10Reaction system of Ligation

3、转化筛选阳性克隆

将连接液各10μl转化至新鲜E.Coli DH5α感受态细胞；随即挑选单克隆PCR和双酶切消化验证，进行基因测序；测序阳性者保存质粒和菌种。

三、工程菌发酵表达

将发酵种子1％接种于10ml液体试管氨苄抗性LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜，10ml过夜培养完全转接至350ml抗性培养基中，振荡培养至对数中期(OD₆₀₀≥0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h后8000rpm离心10min收集菌体，制备菌体蛋白样品。

蛋白样品电泳图谱见图24：

四、融合蛋白HSP-AP-25镍亲和柱纯化

(1)以10倍柱床体积Balance Buffer通过恒流泵加入层析柱平衡基质，直至基线完全稳定；

(2)超声后得到的上清可溶性蛋白经0.45μm滤膜过滤后缓慢低温上样，收集流出样品待检测；

(3)上样完毕后，以10倍柱体积的Balance Buffer，流速0.5ml/min平衡直至基线完全稳定；

(4)以5倍柱体积的Wash Buffer I，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品；

(5)换用5～10倍柱体积的Wash BufferII，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品待检测，直至基线稳定；

(6)以5倍柱体积Elute Buffer，流速2.0ml/min洗脱特异性结合目的蛋白，收集出峰处样品待检测；

(7)透析除盐后酶切融合蛋白，将酶切后的样品再过一次亲和层析柱，再次除盐浓缩，即可获得目的蛋白。

实施例9

Cpn-AP-25的融合表达试验

一.PCR扩增获得AP-25编码基因

在工程菌pET-23a(+)-AP-25的基础上，根据目的基因AP-25的序列设计含有酶切点Nco I(CCATGG)的上游引物P1和含有酶切位点Bpu1102I(GCTGAGC)的下游引物P2。

P1：5’-CATGCCATG GCTCGTGGTGACGGTGGTGGTGGT-3’

P2：5’-CGCT CAGCGGTCATCAGGCGCGGAAGGTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应流程如下：

Step1

94℃5.0min(变性)

Step2

Step3

74℃7.0min(延伸)

PCR扩增得到目的片段后1.7％琼脂糖凝胶电泳检测验证，采用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段。

二.表达载体的构建

1、双酶切消化回收PCR产物和成熟载体(含有融合蛋白Cpn基因序列的载体)酶切片段参照双酶切消化体系如下，反应条件为37℃，时间约为4h；

1.0％和2.0％琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切成熟载体和AP-25基因序列均使用胶回收试剂盒回收消化完全的目的基因片段；

Table11Reaction system of Double Enzyme Digestion

2、连接基因和载体片段

分别定量基因片段和载体片段浓度，按照终浓度5∶1进行连接反应；反应温度为4℃，时间约为16h。

Table12Reaction system of Ligation

3、转化筛选阳性克隆

将连接液各10μl转化至新鲜E.Coli DH5α感受态细胞；随即挑选单克隆PCR和双酶切消化验证，进行基因测序；测序阳性者保存质粒和菌种。

三、工程菌发酵表达

将发酵种子1％接种于10ml液体试管氨苄抗性LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜，10ml过夜培养完全转接至350ml抗性培养基中，振荡培养至对数中期(OD₆₀₀≥0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h后8000rpm离心10min收集菌体，制备菌体蛋白样品。

蛋白样品电泳图谱见附图24：

四、融合蛋白Cpn-AP-25镍亲和柱纯化

(1)以10倍柱床体积Balance Buffer通过恒流泵加入层析柱平衡基质，直至基线完全稳定；

(2)超声后得到的上清可溶性蛋白经0.45μm滤膜过滤后缓慢低温上样，收集流出样品待检测；

(3)上样完毕后，以10倍柱体积的Balance Buffer，流速0.5ml/min平衡直至基线完全稳定；

(4)以5倍柱体积的Wash Buffer I，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品；

(5)换用5～10倍柱体积的Wash Buffer II，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品待检测，直至基线稳定；

(6)以5倍柱体积Elute Buffer，流速2.0ml/min洗脱特异性结合目的蛋白，收集出峰处样品待检测；

(7)透析除盐后酶切融合蛋白，将酶切后的样品再过一次亲和层析柱，再次除盐浓缩，即可获得目的蛋白。

实施例10

GST-AP-25的融合表达试验

一.PCR扩增获得AP-25编码基因

在工程菌pET-23a(+)-AP-25的基础上，根据目的基因AP-25的序列设计含有酶切点Nco I(CCATGG)的上游引物P1和含有酶切位点Bpu1102I(GCTGAGC)的下游引物P2。

P1：5’-CATGCCATG GCTCGTGGTGACGGTGGTGGTGGT-3’

P2：5’-CGCT CAGCGGTCATCAGGCGCGGAAGGTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应流程如下：

Step1

94℃5.0min(变性)

Step2

Step3

74℃7.0min(延伸)

PCR扩增得到目的片段后1.7％琼脂糖凝胶电泳检测验证，采用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段。

二.表达载体的构建

1、双酶切消化回收PCR产物和成熟载体(含有融合蛋白GST基因序列的载体)酶切片段参照双酶切消化体系如下，反应条件为37℃，时间约为4h；

1.0％和2.0％琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切成熟载体和AP-25基因序列均使用胶回收试剂盒回收消化完全的目的基因片段；

Table13Reaction system of Double Enzyme Digestion

2、连接基因和载体片段

分别定量基因片段和载体片段浓度，按照终浓度5∶1进行连接反应；反应温度为4℃，时间约为16h。

Table14Reaction system of Ligation

3、转化筛选阳性克隆

将连接液各10μl转化至新鲜E.Coli DH5α感受态细胞；随即挑选单克隆PCR和双酶切消化验证，进行基因测序；测序阳性者保存质粒和菌种。

三、工程菌发酵表达

将发酵种子1％接种于10ml液体试管氨苄抗性LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜，10ml过夜培养完全转接至350ml抗性培养基中，振荡培养至对数中期(OD₆₀₀≥0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h后8000rpm离心10min收集菌体，制备菌体蛋白样品。

蛋白样品电泳图谱见图25；

四、融合蛋白GST-AP-25镍亲和柱纯化

(1)以10倍柱床体积Balance Buffer通过恒流泵加入层析柱平衡基质，直至基线完全稳定；

(2)超声后得到的上清可溶性蛋白经0.45μm滤膜过滤后缓慢低温上样，收集流出样品待检测；

(3)上样完毕后，以10倍柱体积的Balance Buffer，流速0.5ml/min平衡直至基线完全稳定；

(4)以5倍柱体积的Wash Buffer I，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品；

(5)换用5～10倍柱体积的Wash BufferII，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品待检测，直至基线稳定；

(6)以5倍柱体积Elute Buffer，流速2.0ml/min洗脱特异性结合目的蛋白，收集出峰处样品待检测；

(7)透析除盐后酶切融合蛋白，将酶切后的样品再过一次亲和层析柱，再次除盐浓缩，即可获得目的蛋白。

实施例11

SP-AP-25的融合表达试验

一.PCR扩增获得AP-25编码基因

在工程菌pET-23a(+)-AP-25的基础上，根据目的基因AP-25的序列设计含有酶切点Nco I(CCATGG)的上游引物P1和含有酶切位点Bpu1102I(GCTGAGC)的下游引物P2。

P1：5’-CATGCCATG GCTCGTGGTGACGGTGGTGGTGGT-3’

P2：5’-CGCT CAGCGGTCATCAGGCGCGGAAGGTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应流程如下：

Step1

94℃5.0min(变性)

Step2

Step3

74℃7.0min(延伸)

PCR扩增得到目的片段后1.7％琼脂糖凝胶电泳检测验证，采用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段。

二.表达载体的构建

1、双酶切消化回收PCR产物和成熟载体(含有融合蛋白SP基因序列的载体)酶切片段参照双酶切消化体系如下，反应条件为37℃，时间约为4h；

1.0％和2.0％琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切成熟载体和AP-25基因序列均使用胶回收试剂盒回收消化完全的目的基因片段；

Table15Reaction system of Double Enzyme Digestion

2、连接基因和载体片段

分别定量基因片段和载体片段浓度，按照终浓度5∶1进行连接反应；反应温度为4℃，时间约为16h。

Table16Reaction system of Ligation

3、转化筛选阳性克隆

将连接液各10μl转化至新鲜E.Coli DH5α感受态细胞；随即挑选单克隆PCR和双酶切消化验证，进行基因测序；测序阳性者保存质粒和菌种。

三、工程菌发酵表达

将发酵种子1％接种于10ml液体试管氨苄抗性LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜，10ml过夜培养完全转接至350ml抗性培养基中，振荡培养至对数中期(OD₆₀₀≥0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h后8000rpm离心10min收集菌体，制备菌体蛋白样品。

蛋白样品电泳图谱见图26。

四、融合蛋白SP-AP-25镍亲和柱纯化

(1)以10倍柱床体积Balance Buffer通过恒流泵加入层析柱平衡基质，直至基线完全稳定；

(2)超声后得到的上清可溶性蛋白经0.45μm滤膜过滤后缓慢低温上样，收集流出样品待检测；

(3)上样完毕后，以10倍柱体积的Balance Buffer，流速0.5ml/min平衡直至基线完全稳定；

(4)以5倍柱体积的Wash Buffer I，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品；

(5)换用5～10倍柱体积的Wash BufferII，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品待检测，直至基线稳定；

(6)以5倍柱体积Elute Buffer，流速2.0ml/min洗脱特异性结合目的蛋白，收集出峰处样品待检测；

(7)透析除盐后酶切融合蛋白，将酶切后的样品再过一次亲和层析柱，再次除盐浓缩，即可获得目的蛋白。

实施例12

Ig-AP-25的融合表达试验

一.PCR扩增获得AP-25编码基因

在工程菌pET-23a(+)-AP-25的基础上，根据目的基因AP-25的序列设计含有酶切点Nco I(CCATGG)的上游引物P1和含有酶切位点Bpu1102I(GCTGAGC)的下游引物P2。

P1：5’-CATGCCATG GCTCGTGGTGACGGTGGTGGTGGT-3’

P2：5’-CGCT CAGCGGTCATCAGGCGCGGAAGGTGCC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应流程如下：

Step1

94℃5.0min(变性)

Step2

Step3

74℃7.0min(延伸)

PCR扩增得到目的片段后1.7％琼脂糖凝胶电泳检测验证，采用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段。

二.表达载体的构建

1、双酶切消化回收PCR产物和成熟载体(含有融合蛋白Ig基因序列的载体)酶切片段参照双酶切消化体系如下，反应条件为37℃，时间约为4h；

1.0％和2.0％琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切成熟载体和AP-25基因序列均使用胶回收试剂盒回收消化完全的目的基因片段；

Table17Reaction system of Double Enzyme Digestion

2、连接基因和载体片段

分别定量基因片段和载体片段浓度，按照终浓度5∶1进行连接反应；反应温度为4℃，时间约为16h。

Table18Reaction system of Ligation

3、转化筛选阳性克隆

将连接液各10μl转化至新鲜E.Coli DH5α感受态细胞；随即挑选单克隆PCR和双酶切消化验证，进行基因测序；测序阳性者保存质粒和菌种。

三、工程菌发酵表达

将发酵种子1％接种于10ml液体试管氨苄抗性LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜，10ml过夜培养完全转接至350ml抗性培养基中，振荡培养至对数中期(OD₆₀₀≥0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导6h后8000rpm离心10min收集菌体，制备菌体蛋白样品。

蛋白样品电泳图谱见图27：

四、融合蛋白Ig-AP-25镍亲和柱纯化

(1)以10倍柱床体积Balance Buffer通过恒流泵加入层析柱平衡基质，直至基线完全稳定；

(2)超声后得到的上清可溶性蛋白经0.45μm滤膜过滤后缓慢低温上样，收集流出样品待检测；

(3)上样完毕后，以10倍柱体积的Balance Buffer，流速0.5ml/min平衡直至基线完全稳定；

(4)以5倍柱体积的Wash Buffer I，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品；

(5)换用5～10倍柱体积的Wash BufferII，流速1.0ml/min，洗涤非特异性结合的杂蛋白，收集出峰处样品待检测，直至基线稳定；

(6)以5倍柱体积Elute Buffer，流速2.0ml/min洗脱特异性结合目的蛋白，收集出峰处样品待检测；

(7)透析除盐后酶切融合蛋白，将酶切后的样品再过一次亲和层析柱，再次除盐浓缩，即可获得目的蛋白。

实施例13

对人胃癌MGC-803等细胞的增殖抑制试验

采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制人胃癌MGC803生长的活性。人胃癌MGC803细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至90％以上的汇合度时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3×10⁴个/ml，将细胞悬液接种到96孔板中，100μl/孔，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。整合素阻断剂多肽用培养液稀释到各个预定浓度。恩度用培养液稀释到终浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中(100μl/孔)。以加入整合素阻断剂多肽稀释液的作为给药组，以加入恩度、紫杉醇作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为阴性对照组。在37℃，5％CO₂培养箱孵育72h。向96孔板中加入5mg/ml的MTT，每孔20μl，继续培养4h。吸掉培养基，每孔加入100μl DMSO溶解，摇床10分钟轻轻混匀。用酶标仪在测定波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferationinhibition，PI)，公式如下：

PI(％)＝1-给药组/阴性组

试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表19.对人胃癌MGC-803细胞的增殖抑制试验

结果：见表19和图2，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖，与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人胃癌MGC-803细胞增殖的抑制作用。

实施例14

对人胰腺癌SW-1990细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表20.对人胰腺癌SW-1990细胞的增殖抑制试验

结果：见表20和图3，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人胰腺癌SW-1990细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人胰腺癌SW-1990细胞增殖的抑制作用。

实施例15

对人肺癌H460细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表21对人肺癌H460细胞的增殖抑制试验

结果：见表21和图4，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人肺癌H460细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人肺癌H460细胞增殖的抑制作用。

实施例16

对人食管癌Ec109细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表22对人食管癌Ec109细胞的增殖抑制试验

结果：见表22和图5，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人食管癌E_c109细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人食管癌E_c109细胞增殖的抑制作用。

实施例17

对人鼻咽癌CNE细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表23.对人鼻咽癌CNE细胞的增殖抑制试验

结果：见表23和图6，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人鼻咽癌CNE细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人鼻咽癌CNE细胞增殖的抑制作用。

实施例18

对人甲状腺癌SW-579细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表24.对人甲状腺癌SW-579细胞的增殖抑制试验

结果：见表24和图7，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人甲状腺癌SW-579细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人甲状腺癌SW-579细胞增殖的抑制作用。

实施例19

对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表25.对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制试验

结果：见表25和图8，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用。

实施例20

对人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表26对人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖抑制试验

结果：见表26和图9，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人胆囊癌GBC-SD细胞增殖的抑制作用。

实施例21

对人肾癌A498细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表27.对人肾癌A498细胞的增殖抑制试验

结果：见表27和图10，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人肾癌A498细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人肾癌A498细胞增殖的抑制作用。

实施例22

对人结肠癌HT-29细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表28.对人结肠癌HT-29细胞的增殖抑制试验

结果：见表28和图11，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用。

实施例23

对人卵巢癌SK-OV-3细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表29.对人卵巢癌SK-OV-3细胞的增殖抑制试验

结果：见表29和图12，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人卵巢癌SK-OV-3细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人卵巢癌SK-OV-3细胞增殖的抑制作用。

实施例24

对人子宫内膜癌HHUA细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表30.对人子宫内膜癌HHUA细胞的增殖抑制试验

结果：见表30和图13，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人子宫内膜癌HHUA细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人子宫内膜癌HHUA细胞增殖的抑制作用。

实施例25

对人宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表31.对人宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制试验

结果：见表31和图14，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用。

实施例26

对人前列腺癌DU-145细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表32.对人前列腺癌DU-145细胞的增殖抑制试验

结果：见表32和图15，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人前列腺癌DU-145细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人前列腺癌DU-145细胞增殖的抑制作用。

实施例27

对人膀胱癌HT1376细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表33.对人膀胱癌HT1376细胞的增殖抑制试验

结果：见表33和图16，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人膀胱癌HT1376细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人膀胱癌HT1376细胞增殖的抑制作用。

实施例28

对人纤维肉瘤HT-1080细胞的增殖抑制试验(本实施例实验方法参照实施例13)

表34.对人纤维肉瘤HT-1080细胞的增殖抑制试验

结果：见表34和图17，与阴性对照相比，整合素阻断剂多肽能显著抑制人纤维肉瘤HT-1080细胞的增殖；与AP-25组相比，经PEG修饰和融合表达后并未影响AP-25对人纤维肉瘤HT-1080细胞增殖的抑制作用。

实施例29

在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内的免疫保护作用

构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究整合素阻断剂多肽对小鼠胶原诱导性关节炎(collageninduced arthritis，CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DAB/1小鼠110只(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab.Animal Ltd)提供，动物生产许可证号码：SCXK(沪)2008-0016)，雄性，7-8周龄，体重为18-22g，随机分成11组，分别是空白对照组，模型对照组，修饰AP-25和融合表达AP-25剂量组(折合AP-25剂量6mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤2mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨II型胶原(cII)用0.1mol/1醋酸溶解成4mg/ml的溶液，于4℃冰箱过夜。实验当天用II型胶原与含4mg/mlMyeobaeterium tuberculosis strain H37Rv的完全弗氏佐剂(CFA)等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化剂50μl进行致敏，21d后用4mg/ml的II型胶原(cII)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30d起皮下注射给药：AP-25给每日一次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤2mg/kg)：每五天一次，连续3次；空白对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10天。分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分考察整合素阻断剂多肽对小鼠佐剂型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

1)体重

分别于造模后第21天至第70天每3天称重，并记录数据。

2)关节评分

四肢：按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。小鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后第21天至第70天每3天进行关节评分，并记录结果。

3)测量足爪肿胀度

分别于造模前和造模后第21天至第70天每3天用排水法测量小鼠左、右足足爪肿胀度，并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示，用SPSS11.0软件进行各给药组与对照组之间进行t检验，表中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。

结果：造模后小鼠与正常小鼠相比较，在小鼠尾部皮内注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂，21天后尾部皮内注射不完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂左后，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第45-60天为肿胀高峰，模型组自第35天开始体重几乎不增加，后期还略微有下降。AP-25在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用见表25。

表35、对胶原型类小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

结果：AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用。

实施例30

对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内的免疫保护作用

构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究整合素阻断剂多肽对佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis，AA)大鼠的治疗作用。采用清洁级wistar大鼠作为受试动物，(由扬州大学比较医学中心)提供，动物生产许可证号码：SCXK(苏)2012-0004)，雄性，体重为150g一180g，随机分成11组，分别是空白对照组，模型对照组，给药组和阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)。除空白组外，第0天各实验组建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌(H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐剂0.08ml造成大鼠佐剂性关节炎模型。第19天出现继发性炎症开始皮下注射给药：AP-25、修饰AP-25和融合表达AP-25(折合AP-25剂量6mg/kg)：每日一次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)：每五天一次，连续3次；空白对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10天。分别于造模后第1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31天称重，造模后第19，22，25，28，31天进行关节评分以及左右后足足爪肿胀度的测量来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

1)体重

分别于造模后1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31天称重，并记录数据。

2)关节评分

四肢：按0一4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。大鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后第19，22，25，28，31天进行关节评分，并记录结果。

3)测量足爪肿胀度

分别于造模前和造模后1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31用排水法测量大鼠左后足足爪肿胀度并记录结果；造模前和造模后第19，22，25，28，31天测量大鼠右后足足爪肿胀度并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示，用SPSS11.0软件进行各给药组与对照组之间进行t检验，表中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。

表36、对佐剂型类大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

结果：AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均对AA大鼠关节炎具有治疗作用。

实施例31

对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀急性炎症模型体内的免疫保护作用

采用足测定方法(毛细血管放大法)，在其右后肢踩关节处用圆珠笔(或脂溶性标记笔)作一标志，将动物右后足浸入足容积测定装置内。浸入深度以标记处为界，以该装置的刻度吸管处读取数值即为动物右后肢的正常体积。各组皮下给药，连续给药3d，空白对照组给予等体积的生理盐水。末次给药前测致炎前大鼠右后足容积，末次给药后1h，于大鼠右后足跖皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，分别于致炎后1h，3h，5h，7h测量足容积。按照下列公式计算足肿胀度：足肿胀度(ml)＝致炎后足容积-致炎前容积。比较给药组和对照组的差异(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)。

表37、对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀模型急性炎症体内免疫保护作用

结果：AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均能够抑制角叉菜胶诱导诱导的大鼠足趾肿胀急性关节炎模型。

实施例32

对大鼠棉球肉芽肿亚急性炎症模型体内免疫保护作用

大鼠用乙醚浅麻醉，在无菌操作下，于左、右两侧腋下各植入棉球1个，缝合皮肤。连续给药后7d，将动物处死，取出棉球，放入小皿内，60℃烘箱2h，称重，减去原棉球重，即为肉芽肿重量。实验设置对照组、阳性药物对照组、受试药物组。术后当天开始皮下给药，连续给药7d。比较用药组和空白对照组肉芽肿的差异。抑制率(％)＝1-给药组肉芽肿平均值/对照组肉芽肿平均值。

表38、对大鼠棉球肉芽肿亚急性炎症模型体内免疫保护作用

结果：AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均对大鼠棉球肉芽肿有抑制作用。

实施例33

对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用

采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制人视网膜血管内皮细胞增殖的活性。HRCEC细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×104个/ml，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μl，并于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。将各浓度药物加入96孔板中，每孔100μl。以加入AP-25作为给药组，Avastin作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对照组，在37℃，5％CO2培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入20μl5mg/ml的MTT，继续培养4小时。吸去培养基，每孔加入100μl DMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

$\mathrm{PI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\×100\%$

其中N_test为测试组的OD值，N_control为空白对照组的OD值。

表39、对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用

结果：AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均能抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖。

实施例34

对小鼠角膜新生血管的作用

(1)BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型的制备：

健康BALB/c小鼠20只，雄性，体重20-25g，裂隙灯显微镜下检查双眼眼前段及附属器，排除眼部病变。碱烧伤模型制备前1d予0.3％氧氟沙星眼药水点眼，每日2次。小鼠经腹腔注射1.8％Avertin麻醉后，用镊子夹住直径为2mm的单层滤纸片，浸于1mol/1氢氧化钠溶液中，使其达饱和状态，去除多余液体，将滤纸片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，弃掉滤纸，立即用15ml的PBS充分冲洗烧伤区及结膜囊1min。棉签拭去过多水分，于手术显微镜下以角膜刮铲平行于角膜缘的方式旋转刮除角膜上皮，注意勿伤及上皮下基质层及角膜缘，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。

(2)实验动物分组及标本获取

将小鼠按随机分组，每组5只，自碱烧伤后分别给予AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25和生理盐水玻璃体腔注射，每日1次，持续1周，碱烧伤后1d、7d、14d于裂隙灯显微镜下观察各组角膜的炎症反应及新生血管情况。碱烧伤后第14d于带眼前段照相的裂隙灯显微镜下拍照记录各组角膜新生血管形成情况，随即以颈椎脱臼法处死所有小鼠并摘除眼球，生理盐水冲洗血迹，4％多聚甲醛固定1.5h，含30％蔗糖的PBS中脱水过夜，OCT冰冻切片包埋剂包埋，-80℃冰箱中保存，8μm冰冻切片，免疫组织化学法检测CD31的表达。

(3)角膜组织微血管密度定量测定

微血管密度(Microvessel density，MVD)是评价血管形成的指标。我们采用抗CD31抗体免疫组织化学法标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，由此来衡量新生血管生成的程度。统计微血管的标准：显微镜下观察角膜组织中与邻近组织分界清楚，并被染成棕黄色或褐色的内皮细胞或细胞团均计入新生血管。在10×20镜下计数整张切片新生血管数目，角膜组织片照相后以图像处理软件Image J计算出整个角膜组织片面积，求出该例整张切片的新生血管密度，并计算整合素阻断剂多肽对血管新生的抑制率。

表40、对小鼠角膜新生血管的作用

结果：AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均能够极显著抑制角膜新生血管的生长，能够作为治疗角膜新生血管性眼病的药物。

实施例35

对家兔虹膜新生血管的作用

采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉，经眼底荧光素血管造影(FFA)证实静脉阻塞成功。5-12天后眼虹膜荧光素血管造影(IFA)显示虹膜血管与正常对照组对比荧光素渗漏明显，证实虹膜新生血管化的动物模型(NVI)形成。

取造模成功的27只眼，随机分成9组，每组3只。分别标记为阴性对照组、治疗组，分别以生理盐水、AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25玻璃体腔注射给药，每日1次，持续2周。第3周用光学及电子显微镜观察。

结果：光学显微镜下可观察到虹膜前表面是主要由纤维组织组成的纤维血管膜残迹，仅有极少的开放血管腔。在虹膜基质内可看到血管残存物，为坏死细胞及细胞碎片。而光镜下的对照眼的虹膜表面为有分枝的和潜在管腔的纤维血管膜。

治疗组虹膜的超微结构为一系列的退行性改变。虹膜基质中部的大血管的内皮细胞有正常的细胞核、细胞质和细胞连接。虹膜基质中及虹膜前表面有毛细血管残迹，周围有细胞碎片和巨噬细胞浸润。无潜在管腔的毛细血管及退变的壁细胞，表明新生血管消退。

通过虹膜新生血管化的动物模型实验，证明了AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25能够抑制新生血管形成并使已形成的血管退化。

实施例36

对大鼠脉络膜新生血管的作用

用846复合麻醉剂0.5ml/Kg腹腔注射充分麻醉6-8周雄性BN大鼠，激光光凝前5min用复方托品酰胺眼液滴眼一次，充分散大双眼瞳孔。固定动物，在-53.00D角膜接触镜辅助下，围绕视盘并在距视盘2PD位置等距离行氪离子激光光凝，共计8个光凝斑，激光波长为647.1nm，功率为350mW，光凝斑直径和时间分别为50μm及0.05s。光凝后立刻进行眼底照相。于光凝后3、7、14、21、28分别进行FFA、组织病理及透射电镜检查。

通过眼底照相及FFA检查证实，光凝后第21天光凝斑荧光素渗漏达到高峰。同时进行病理组织学检查，光凝后21天，光镜下显示CNV呈现显著的纤维血管增殖，其中可见大量新生血管，管腔内可见红细胞；镜下显示脉络膜黑色素细胞间有毛细血管呈凝聚性改变，内皮细胞凝聚。表明21天后大鼠脉络膜新生血管模型形成。

将造模成功的45只大鼠，随机分成9组，每组5只大鼠。分别标记为空白对照组、治疗组，分别以生理盐水、AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25玻璃体腔注射，每日1次，持续1周。给药后3天、7天、14天及28天均进行FFA检查。

表41、各实验组给药后不同时间CNV发生率

结果：治疗组荧光素渗漏比用药前逐渐减轻；说明AP-25、PEG修饰AP-25和融合表达AP-25均能够治疗大鼠脉络膜新生血管，有可能开发成为治疗脉络膜新生血管性眼病的药物。

Claims (5)

1.一种聚乙二醇修饰及蛋白质融合表达的整合素阻断剂AP-25，其特征在于所述的整合素阻 

断剂的序列为如下任一序列： 

mPEG-SC-AP-25：mPEG-SC-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

BSA-AP-25：BSA-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

BSA-AP-25：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-BSA； 

HSP-AP-25：HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

HSP-AP-25：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP； 

Cpn-AP-25：HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

Cpn-AP-25：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP； 

GST-AP-25：HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

GST-AP-25：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP； 

SP-AP-25：HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

SP-AP-25：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP； 

Ig-AP-25：HSP-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro； 

Ig-AP-25：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-HSP。 

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰及蛋白质融合表达的整合素阻断剂AP-25，其特征在于所述的mPEG-SC的分子量分别为5000、10000、20000、40000。 

3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰及蛋白质融合表达的整合素阻断剂AP-25，其特征在于所述的融合蛋白为BSA、HSP、Cpn、GST、SP、Ig。 

4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰及蛋白质融合表达的整合素阻断剂AP-25，分为在N、C端融合表达两种类型。 

5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的整合素阻断剂AP-25在制备治疗血管性疾病中的应用，包括类风湿、眼病及肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的胃部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、肺脏、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。 

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