CN101851293A - 一种长效胰高血糖素样肽-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长效的人血清白蛋白(HSA)和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)融合蛋白(简称GLH融合蛋白)的制备及其治疗用途，包括编码融合蛋白的基因序列，含有该基因的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。本发明的GLH融合蛋白包括序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白的第一区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No：2序列相同的第二区。本发明GLH融合蛋白的第一区与第二区之间可以设有连接肽，也可以不设，连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n为3。经初步的药理实验证明，本发明所述的GLH融合蛋白既有胰高血糖素样肽-2的特性，其半衰期又得到显著延长，可用于制备预防和/或治疗化疗中导致肠胃损伤、短肠综合症SBS、Corhn’s肠炎等多种胃肠道损伤疾病药物的用途。

Description

一种长效胰高血糖素样肽-2及其应用

技术领域

本发明涉及一种由人血清白蛋白和胰高血糖素样肽-2组成的融合蛋白及其制备与应用。

技术背景

胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是由33个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约为3.9KD。与胰高血糖素之间存在约50％的氨基酸序列同源性。GLP-2存在3种形式，即有活性的GLP-2^1～33、无活性的GLP-2^3～33和未处理的主要胰高血糖素原片段(MPGF)。其在循环血液和组织中以完整的有活性的GLP-2^1～33形式为主，但GLP-2^1～33可被二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase IV，DPP IV)从氨基端第2位的丙氨酸(Ala₂)残基处切除掉2个氨基酸残基而产生31个氨基酸残基组成的无活性的GLP-2^3～33。GLP-2目前已成为一种倍受推崇的肠道保护激素，被广泛应用于各种原因引起的肠道损伤修复及代偿的研究中。它在肿瘤放化疗、严重创(烧)伤、全肠外营养、炎症性肠病等因素引起的肠粘膜损伤、失血性休克、广泛肠切除、小肠移植等方面均具有潜在的临床应用价值。目前，美国NPS制药公司开发的可以抵抗DPP IV降解作用的GLP-2的突变体h[Gly2]GLP-2(商品名为teduglutide)已进入用于短肠综合征(SBS)和Corhn’s肠炎治疗的临床研究。然而在血液循环中，GLP-2^1～33和GLP-2^3～33的生物半衰期都较短，在人体分别约为7min和27min，使得在治疗过程中频繁给药才能获得良好的疗效，并且其治疗周期往往较长，因此研制出作用时间长的重组胰高血糖素样肽-2具有重要意义。

人血清白蛋白(Human serum albmin，HSA)是含585个氨基酸的非糖基化单链结构分子(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，198279：71-75)，是人体血清中的主要成分，广泛分布于血管内外，主要由人体肝脏产生，其对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用，肾清除率非常低，体内半衰期长，为14～20d。而且它没有酶或免疫活性，是体内因子和药物转运的天然载体，因此可望作为提高小分子蛋白在血液中的半衰期的载体。相关研究成果表明，很多蛋白药物与人血清白蛋白融合表达后，与先前的蛋白药物相比，药效相似，但体内半衰期大大延长。胰高血糖素样肽-2在预防和治疗化疗中导致肠胃损伤、短肠综合症SBS、Corhn’s肠炎等疾病过程中，医疗周期往往很长，长周期的频繁用药会增加病人的痛苦和毒副作用。且本发明融合蛋白在酵母菌中表达与现有胰高血糖素样肽-2相比，具有生产成本低、效率高、易于纯化等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种集胰高血糖素样肽-2和血清白蛋白的特性为一体的胰高血糖素样肽-2-人血清白蛋白融合蛋白及编码基因。与现有胰高血糖素样肽-2相比，本发明的融合蛋白具有以下优点：1)能够在酵母菌中实现胞外表达，产量高，无需复性，易纯化。2)重组融合蛋白在体内的半衰期延长，且作用效果明显，能减少现有胰高血糖素样肽-2潜在的毒副作用，发挥最大的治疗作用。3)重组表达生产成本较低、效率高，利于工业大量生产。

本发明所提供的长效融合蛋白名称为h[Gly2]GLP-2-HSA融合蛋白，以下简称GLH融合蛋白。

本发明的GLH融合蛋白，包括与序列表中SEQ ID No：2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第二区和与序列表中SEQ ID No：1人血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区。在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的蛋白，但这些改变不能明显改变蛋白质的一个或多个有用的配体结合和生物活性的能力。特别是，将人血清白蛋白和人血清白蛋白片段中天然发生的多态性变体包括在内，融合蛋白中白蛋白可来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如：牛、羊、猪、鸡或鲑鱼。此外，胰高血糖素样肽-2可以由生物体中提取，也可以通过生物技术工程的方法获得。

可以通过对本发明的GLH融合蛋白中个别氨基酸残基进行取代、缺失或插入，得到与正常胰高血糖素样肽-2或血清白蛋白具有至少85％的序列同源性的变体。相对于正常的血清白蛋白，血清白蛋白变体应至少包含或是有血清白蛋白的一个完整的结构域组成。相对于正常的胰高血糖素样肽-2，胰高血糖素样肽-2的突变体具有与胰高血糖素样肽-2相同的活性，包含本领域内所周知的胰高血糖素样肽-2所有突变体。

当用本领域公认的软件与其他任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有85％以上的序列同源性，均认为与本发明长效融合蛋白所述的序列相同源。

为了使融合蛋白两部分间有较大的间隔，使胰高血糖素样肽-2的部分最大的与其受体结合，在所述的第一区与第二区之间设有连接肽。众所周知连接肽不改变融合蛋白的生物活性，所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n为0-10的整数，更优选的是3，通式描述为胰高血糖素样肽-2-连接肽-血清白蛋白。

本发明的另一个目的是提供编码本发明GLH融合蛋白的氨基酸序列和基因序列。包括与序列表中SEQ ID No：2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第二区和与序列表中SEQ IDNo：1血清白蛋白氨基酸序列相同第一区的融合蛋白氨基酸序列和基因序列。

本发明的又一个目的是提供携带编码本发明GLH融合蛋白基因序列的重组表达载体。重组表达载体包括pPIC9质粒，pPIC3质粒，pPIC9K质粒等。

本发明的再一目的是提供一种表达上述GLH融合蛋白的方法。所提供的表达上述GLH融合蛋白方法，是将含有上述GLH融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到长效融合蛋白。

所述的宿主可为酵母菌，大肠杆菌等，优选为酵母菌，酵母菌更优选巴氏毕赤酵母(Pichipastoris)，其中，所述的巴氏毕赤酵母优选巴氏毕赤酵母GS115。

本发明的GLH融合蛋白，编码胰高血糖素样肽-2和血清白蛋白的DNA序列可以用PCR，RT-PCR方法、人工合成的方法、构建筛选cDNA文库等本领域所周知的方法获得。其中上述方法所采用的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织(细胞)和文库等。可以用PCR等方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，进行编码白蛋白和编码胰高血糖素样肽-2的融合，通过酶切产生粘性末端用DNA连接酶连接后从而获得编码融合蛋白的基因。

本发明的GLH融合蛋白的表达载体和其对应的宿主可以是，酵母表达载体如pPIC9质粒，pPIC3质粒，pPIC9K质粒，pPICZ质粒等，动物细胞表达载体Psvk3质粒，pMSG质粒等。其中优选的质粒为带有His4选择性标记的酵母整合型质粒，如pPIC9质粒，pPIC9K质粒等，通过编码本发明的新型的长效融合蛋白的基因克隆到这些酵母表达载体中。

本发明GLH融合蛋白的表达宿主可以是酵母，细菌，动物细胞或植物细胞以及包含本发明融合蛋白基因序列的转基因动植物等。融合蛋白或多肽的表达可以是胞内，也可以分泌表达到宿主胞外的培养基中。优选的表达方式是分泌至培养液中，形成可溶性蛋白。其中，含血清白蛋白的融合蛋白可以有信号肽主导并通过分泌表达途径而得到加工。分泌所用的信号肽，优选的是天然人血清白蛋白的信号肽或酿酒酵母配对因子α或这两种信号肽的类似物。更优选天然人血清白蛋白的信号肽。融合蛋白也可以不用信号肽，而以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或游离质粒形式存在。

宿主细胞可以利用周知的方法经遗传工程(转导、转化或转染)将携带本发明融合蛋白基因序列的质粒载体以入侵方式、病毒感染、噬菌体等形式转入宿主中表达。其中转化融合蛋白核苷酸序列至宿主细胞中可用周知的方法，如电穿孔，制备感受态的原生质体，化学转化等。成功转化并含有本发明融合蛋白基因序列构建体的细胞，可通过常用的方法进行鉴定，如提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者收集细胞破碎液或胞外培养液中的蛋白，用抗白蛋白抗体进行ELISA检测鉴定。

本发明的GLH融合蛋白的生产，可以通过培养含有本发明基因序列构建体的宿主菌体，如重组酵母，细菌，动、植物细胞，转基因动植物等获得。宿主细胞(或细胞)的培养可以是所周知的方法，如摇瓶或生物反应器等。

本发明的GLH融合蛋白的纯化处理，其中包括盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

本发明将人血清白蛋白和胰高血糖素样肽-2融合所形成的融合蛋白既保留了与胰高血糖素样肽-2受体结合的活性，同时与胰高血糖素样肽-2相比，其体内半衰期得到了显著延长，降低了给药频率和剂量，是一种长效候选药物。

本发明中的GLH融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等，如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。

本发明中的GLH融合蛋白及其衍生物可单独使用，也可以加入一种或多种药学上可以接受的载体一起组成药物制剂的形式使用。所述的载体包括药学领域常规的典型载体为水、盐水、糖类、醇类、氨基酸等。

本发明的GLH融合蛋白可以制成注射剂。该剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。药物制剂可以存在于单一剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。

本发明中的GLH融合蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为肠道保护激素可用于各种原因引起的肠道损伤修复及代偿疾病，如肿瘤放化疗、严重创(烧)伤、全肠外营养、炎症性肠病等因素引起的肠粘膜损伤、失血性休克、广泛肠切除、小肠移植等病人的治疗。

本发明中的GLH融合蛋白及其衍生物可以通过静脉注射，皮下注射等方法给药。优选的方法是静脉注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。

实验证明本发明的GLH融合蛋白稳定性高，半衰期较长，在医学上也有较高的安全性、较好的疗效。且该融合蛋白的表达量高，易纯化，生产周期短，成本低等优点，利于工业大量生产，具有重要应用前景和实际意义。

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。

附图说明

SEQ ID NO：1为人血清白蛋白的基因和氨基酸序列

SEQ ID NO：2为胰高血糖素样肽-2的基因和氨基酸序列

图1是目的基因h[Gly2]GLP-2-HSA通过PCR获得

图2是重组表达载体pPIC9-GLH质粒的构建

图3重组表达载体pPIC9K-GLH双酶切验证

图4是重组表达载体pPIC9K-GLH质粒的构建

图5是GLH融合蛋白分离纯化SDS-PAGE图

其中：m，marker；1，发酵液样品；2，浓缩样品；3，Blue-Sepharose亲和层析后的样品；4，Phenyl Sepharose 6F.F疏水层析后的样品；5，DEAE sepharose阴离子交换层析后的样品

图6是GLH融合蛋白对小鼠体重改变影响

图7是GLH融合蛋白对小鼠小肠干湿比重影响

图8是GLH融合蛋白对小鼠小肠重量影响

图9是GLH融合蛋白对小鼠小肠长度影响

图10是小鼠肠壁炎症及绒毛长度影响的病变评分

图11是小鼠空肠组织切片图

其中：A，saline组；B，5-FU模型组；C，GLH对照组；D，GLH1+5-FU实验组；E，GLH2+5-FU实验组；F，GLH3+5-FU实验组

图12是GLH融合蛋白大鼠单剂量静脉给药后的药时曲线

具体的实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：目的基因h[Gly2]GLP-2-HSA的获得

在本实验室已构建的带有HSA基因的质粒pPIC9K-HT的基础上，利用SOE-PCR(splicingby overlap extension，简称SOE)的方法扩增获得完整的融合基因h[Gly2]GLP-2-HSA(以下简称GLH)。所获得的基因片段GLH包含h[Gly2]GLP-2的DNA序列和编码连接肽([GlyGlyGlyGlySer]₃)及HSA的基因序列。

将实验室保存的含有质粒pPIC9K-HT的大肠杆菌DH5α接种入含有青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，用碱裂解法提取质粒(方法参见分子克隆实验指南，第2版)。

以pPIC9K-HT质粒作为模板，进行SOE-PCR，其中每一轮的PCR扩增产物经过电泳后用DNA凝胶回收试剂盒回收，作为下一轮PCR反应的模板，以获得完整的目的基因片段GLH，如图1。

上游引物P5-1：

5’-CGGAGGTTCTGGCGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGGAGTGATGCACACAAGAGTGAGG-3’

上游引物P5-2：

5’-TCATAAACTGGTTGATCCAGACCAAAATCACTGACGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGG-3’

上游引物P5-3：

5’-GAGATGAACACCATTCTTGATAATCTTGCCGCCAGGGACTTCATAAACTGGTTGATCC-3’

上游引物P5-4：

5’-CCGCTCGAGAAAAGACACGGTGATGGTTCCTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3’

下游引物P3-1：

5’-CAGCGTCTAGAGTGGTTTCATATGTC-3’

下游引物P3-2：

5’-GGCGAATTCTTACTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’

引物委托上海英俊生物公司合成。PCR反应体系(50μl)：5μl 10×Pfu buffer，4×dNTPmix(200μmol/L)，引物上(0.5μmol/L)，引物下(0.5μmol/L)，0.1μg模板(HT重组质粒)，0.5μl Pfu DNA聚合酶(5U/μl)，灭菌水补足至50μl(dNTP、反应缓冲液、Pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)，所有PCR反应程序均为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火1分钟，68℃延伸4分钟，25个循环，68℃延伸10分钟。四轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果与理论设计一致。

实施例2：质粒pPIC9-GLH的构建

将本实验室保存的含有质粒pPIC9的大肠杆菌DH5α接种入含有青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，用碱裂解法提取质粒pPIC9。

根据实施例1获得的基因片段GLH和本实施例中获得的质粒pPIC9分别进行双酶切后，得到重组pPIC9-GLH质粒的片段。酶切方法：基因片段GLH和质粒pPIC9均用XhoI和EcoRI双酶切(Xba I、EcoR I均为MBI Fermentas公司产品)，基因片段GLH的Xba I和EcoR I双酶切反应体系：10μl 10×Tango buffer，35μl基因片段GLH，2.5μl Xba I(10U/μl)，2.5μlEcoR I(10U/μl)。质粒pPIC9的Xba I和EcoR I双酶切反应体系：10μl 10×Tango buffer，35μlpPIC9，2.5μl Xba I(10U/μl)，2.5μl EcoR I(10U/μl)。上述酶切体系于37℃反应过夜后，电泳切下相应的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。

本实施例中获得的回收目的片段进行连接构建质粒pPIC9-GLH。酶连方法：将回收片段用T4DNA连接酶来连接(T4DNA连接酶为MBI Fermentas公司产品)，酶连的反应体系为：6μl基因片段GLH的酶切回收片段，2.5μl pPIC9质粒的酶切回收片段，1μl T410×Buffer，0.5μlT4DNA连接酶。上述酶连反应体系于16℃反应过夜。

将本实施例中得到的重组质粒pPIC9-GLH，采用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α(方法参见分子克隆实验指南，第2版)，转化产物涂布于含有青霉素的LB平板，37℃培养过夜后挑取板上的单菌落接种入含有青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后抽提质粒。将重组质粒送上海博亚生物技术公司测序验证结果与理论设计结果相一致。

重组表达载体pPIC9-GLH质粒的构建过程，如图2。

实施例3：重组pPIC9K-GLH质粒构建及转化

根据实施例2获得的质粒pPIC9-GLH和质粒pPIC9K分别进行双酶切后，再酶连得到重组pPIC9K-GLH质粒。

将实施例2获得的含有质粒pPIC9-GLH和本实验室保存的pPIC9K的大肠杆菌DH5α分别接入含有青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后分别抽提质粒。质粒pPIC9-GLH和pPIC9K分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，得到重组pPIC9K-GLH质粒的片段。酶切方法：pPIC9-GLH和pPIC9K用BamH I和EcoR I进行双酶切(BamH I、EcoR I均为MBIFermentas公司产品)，pPIC9-GLH的BamH I和EcoR I双酶切反应体系：10μl 10×Tango buffer，35μl pPIC9-GLH，3.3μl BamH I(10U/μl)，1.7μl EcoR I(10U/μl)。质粒pPIC9K的BamH I和EcoR I双酶切反应体系：10μl 10×Tango buffer，35μl pPIC9K，3.3μl BamH I(10U/μl)，1.7μlEcoR I(10U/μl)。上述酶切体系于37℃反应过夜后，切下相应的片段后用DNA凝胶回收试剂盒回收。

本实施例中获得的回收片段进行连接构建质粒pPIC9K-GLH。酶连方法：将回收片段用T4DNA连接酶来连接(T4DNA连接酶为MBI Fermentas公司产品)，酶连的反应体系为：5μlpPIC9-GLH质粒酶切回收片段，3.5μl pPIC9K质粒酶切回收片段，1μl T410×Buffer，0.5μlT4DNA连接酶。上述酶连反应体系于16℃反应过夜。

将本实施例中得到的重组质粒pPIC9K-GLH，采用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，转化产物涂布于含有青霉素的LB平板，37℃培养过夜后挑取板上的单菌落接种入含有青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后抽提质粒，经酶切验证与理论设计结果相一致，如图3。

重组表达载体pPIC9K-GLH质粒的构建过程，如图4。

实施例4：毕赤酵母工程菌的构建及工程菌菌株的筛选

将实施例3中构建的阳性克隆大肠杆菌pPIC9K-GLH培养扩增，抽提重组质粒。将获得的纯化质粒用Sal I酶切使其线性化。酶切反应体系：42.5μl pPIC9K-GLH，5μl 10×BufferO，3.3μl Sal I(Sal I酶为MBI Fermentas公司产品)。将酶切反应体系置于37℃反应过夜后，直接用DNA回收试剂盒回收酶切产物，用于毕赤酵母GS115的转化(Invitrogen Corp.USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)。转化后的重组GS115，分别涂布MD培养基平板(2％琼脂，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，30℃倒置培养2～5天。挑取his⁺克隆。用灭过菌的牙签将每个克隆同时点种于MM、MD(2％琼脂，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，2％甲醇)平板的对应位置上，30℃倒置培养3～5天，只有在MM平板上和MD平板上同时生长的菌落大小相差不多的菌株才是Mut+表型。将获得的his+Mut+转化子分别点种于G418浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml的G418平板，30℃培养3～5天，挑选能够耐受较高浓度G418生长的转化子。挑取经筛选的单菌落，接种入含50mlYPD(1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)培养基的250ml摇瓶中，30℃，220r/min培养20h至OD₆₀₀达10～20。按照1％的接菌量将上述菌液转接至BMGY培养基(1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，10％磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1％甲醇)重悬菌体，置于30℃，220r/min摇床上继续生长，每24小时向BMGY培养基中添加甲醇至终浓度0.5％，按时间点分别取菌液样品，取样量为0.5ml，置于EP管中，离心取上清，SDS-PAGE凝胶电泳分析，筛选出表达量高的菌株，以其作为表达融合蛋白的目标菌株。

实施例5：毕赤酵母工程菌的发酵

从实施例4中获得的目标菌株的YPD斜面培养基上挑一环菌至YPD液体培养基(1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃，220r/min培养20h至OD₆₀₀达10～20；将上述菌液按1％接菌量转接至50ml三角烧瓶的BMGY培养基中(1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10^-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，10％磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1％甲醇)，30℃，220r/min培养12小时，补加甲醇至终浓度0.5％，每24小时向培养基补加一次甲醇，诱导表达4～7天，8000r/min离心收集上清。

实施例6：GLH融合蛋白的分离纯化

将实施例5中获得的高表达量的菌株发酵后，收集发酵液样品，经4℃离心(8000g，10min)得上清，上清经超滤浓缩。浓缩样过Blue-Sepharose(Amershan产品)亲和色谱进行分离，上样缓冲液pH为4.0-6.0缓冲液，上样平衡后用2.0M的NaCl进行洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱峰；超滤浓缩后用Phenyl Sepharose 6F.F(Amershan产品)疏水填料进行层析分离，上样缓冲液pH为6.0-8.0，平衡后用0-1.5M的缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液；超滤浓缩后用DEAE sepharose(Amershan产品)阴离子交换色谱进行分离，上样缓冲液为pH为6.0-8.0，上样平衡后用0-1.0M的NaCl进行梯度洗脱，收集目的蛋白的洗脱峰，即可获得纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈电泳纯为均一条带。如图5，其中：m，marker；1，发酵液样品；2，浓缩样品；3，Blue-Sepharose亲和层析后的样品；4，Phenyl Sepharose 6F.F疏水层析后的样品；5，DEAE sepharose阴离子交换层析后的样品。

实施例7：GLH融合蛋白对于5-FU导致小鼠肠道损伤(体重减轻、小肠萎缩)的预防作用

癌症的化疗常导致小肠上皮细胞的损伤，而导致胃肠道粘膜炎。小鼠尾静脉注射GLH融合蛋白连续给药三天，第四天同时腹腔注射5-FU，实验周期为7天。在最后一次给药后24小时禁食处死小鼠。剪开小鼠腹腔，在冰浴中，截取小鼠的小肠、大肠，用生理盐水冲洗后，测量其长度并进行称重。测湿重和干重：将肠段直接称重，之后置于试管中冻干过夜除水再称重。组织学分析采用的方法：近端空肠(与幽门相距8厘米)，加入10％的福尔马林溶液中，浸泡48小时，植入石蜡，切成4-6μm的横切片(每只小鼠至少制备10个切片)，用苏木紫和伊红(HE)染色，使用普通光镜下观察、照像检测，观察肠的病理改变。实验结果显示，实验组与对照组相比，小鼠体重变化程度小，小肠萎缩减轻，小肠绒毛破坏程度轻，GLH融合蛋白对于化疗中造成的肠道损伤有良好的预防和治疗作用。

本实施例中小鼠分为6组：空白对照saline组给生理盐水，5-FU模型组只给与实验组等量的5-FU，GLH组只给予405mmol/kg的GLH融合蛋白，实验GLH(1，2，3)+5-FU组给予三个不同剂量(405mmol/kg，135mmol/kg，46mmol/kg)的GLH融合蛋白，同时给予5-FU50mg/kg。融合蛋白GLH对小鼠体重改变影响，如图6；对小鼠小肠干湿比重影响，如图7；对小鼠小肠重量影响，如图8；对小鼠小肠长度影响，如图9；小鼠肠壁炎症及绒毛长度影响的病变评分，如图10；小鼠空肠组织切片，如图11，其中：A，saline组；B，5-FU模型组；C，GLH对照组；D，GLH1+5-FU实验组；E，GLH2+5-FU实验组；F，GLH3+5-FU实验组

实施例8：融合蛋白GLH在在大鼠体内药代动力学评价

大鼠静脉注射给予GLH融合蛋白分别于0.5，1，2，4，6，8，12，36，48，72小时的不同时间采样，用碘示踪法测定血中胰高血糖素样肽-2的浓度，其中药-时曲线如图12，实验结果显示重组GLH融合蛋白与胰高血糖素样肽相比其半衰期更长。

SEQ ID NO：1为人血清白蛋白的基因和蛋白质序列

1     GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA  45

1     Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly  15

46    GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT  90

16    Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr  30

91    CTT CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA  135

31    Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu  45

136   GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCT GAA  180

46    Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu  60

181   AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC  225

61    Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys  75

226   ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC  270

76    Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys  90

271   TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC  315

91    Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His  105

316   AAA GAT GAC AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT  360

106   Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val  120

361   GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG  405

121   Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu  135

406   AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT  450

136   Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr  150

451   GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA GCT GCT TTT    495

151   Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe    165

496   ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA    540

166   Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro    180

541   AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA    585

181   Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys    195

586   CAG AGA CTC AAG TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT    630

196   Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala    210

631   TTC AAA GCA TGG GCA GTA GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA    675

211   Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys    225

676   GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA    720

226   Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys    240

721   GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT    765

241   Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp    255

766   GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAA GAT TCG    810

256   Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser    270

811   ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA    855

271   Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu    285

856   AAA TCC CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT    900

286   Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala    300

901    GAC TTG CCT TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT    945

301    Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val    315

946    TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT    990

316    Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe    330

991    TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG    1035

331    Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu    345

1036   CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC    1080

346    Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys    360

1081   TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT    1125

361    Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp    375

1126   GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA    1170

376    Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln    390

1171   AAT TGT GAG CTT TTT GAG CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT    1215

391    Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn    405

1216   GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCA ACT    1260

406    Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr    420

1261   CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG GGC AGC    1305

421    Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser    435

1306   AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA    1350

436    Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu    450

1351   GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG    1395

451    Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu  465

1396   AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACC AAA TGC TGC ACA GAA TCC  1440

466    Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser  480

1441   TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA  1485

481    Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu  495

1486   ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT  1530

496    Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His  510

1531   GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA  1575

511    Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys  525

1576   CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA  1620

526    Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr  540

1621   AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA  1665

541    Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val  555

1666   GAG AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG  1710

556    Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu  570

1711   GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA  1755

571    Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

 

SEQ ID NO：2为胰高血糖素样肽-2的基因和氨基酸序列

l      CAC GGT GAT GGT TCC TTC TCT GAT GAG ATG AAC ACC ATT CTT GAT  45

1      His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp  15

46     AAT CTT GCC GCC AGG GAC TTC ATA AAC TGG TTG ATC CAG ACC AAA  90

16   Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys    30

91   ATC ACT GAC   99

31   Ile Thr Asp   33

Claims (7)

1.一种长效胰高血糖素样肽-2融合蛋白，它包括序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白的第一区，连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No：2序列相同的第二区。

2.根据权利要求1所述的长效胰高血糖素样肽-2融合蛋白，其特征是：所述的融合蛋白包括与序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No：2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第二区。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征是：所述血清白蛋白的第一区与连接在血清白蛋白的N-末端的序列表中SEQ ID No：2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n为3。

4.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征是：携带编码融合蛋白基因序列的重组表达载体是pPIC9或pPIC9K。

5.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征是：表达融合蛋白的宿主是细菌、酵母、动物细胞、植物细胞或含有本发明融合蛋白基因序列的转基因动、植物中的任一种。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征是：表达融合蛋白的宿主是毕赤酵母。

7.权利要求1、2或3所述的融合蛋白用于制备一种具有预防和/或治疗化疗中导致肠胃损伤、短肠综合症SBS、Corhn’s肠炎作用的药物的用途。

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