CN103079586B - G‑csf二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种G‑CSF二聚体。并公开了所述G‑CSF二聚体在制备治疗嗜中性粒细胞减少症的药物中的用途。具体地，本发明通过使用重组人G‑CSF二聚体分子，在动物体内可以加快骨髓嗜中性粒细胞的分化和增殖，因此能够使肿瘤病人化疗后，降低重度嗜中性粒细胞减少的程度，并缩短重度嗜中性粒细胞减少的时间。本发明的G‑CSF二聚体的血清半衰期延长，且生物活性增加，从而能够有效地治疗嗜中性粒细胞减少症。

Description

G-CSF二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的应用
技术领域
本发明涉及生物和医药技术领域。更具体地，本发明涉及重组人G-CSF二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的用途。
背景技术
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一个含有204个氨基酸组成并含有30个氨基酸信号肽的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白被分泌到细胞外不含信号肽由174个氨基酸构成,分子量为18–20kDa。人体主要由单核细胞，成纤维细胞和内皮细胞分泌。
G-CSF在生物体内主要发挥三大生物学功能：1.作用于嗜中性粒前体细胞和骨髓干细胞。驱动嗜中性粒细胞的分化、增殖和成熟。2.激活成熟的嗜中性细胞参与免疫反应。3.协同其他血液生长因子，如Stem Cell Factor，Flt-3配体，GM-CSF发挥造血功能。
G-CSF的受体已证实主要存在于骨髓造血干细胞Sca+Lin-Th1low，前体细胞CD34+，以及定向分化的嗜中性粒前体细胞(committed granulocyte precursor)和成熟的嗜中性粒细胞。人促嗜中性粒细胞刺激生长因子受体(G-CSF Receptor，G-CSFR)是一个单链的，对G-CSF有高亲合力的特异性受体，含有812个氨基酸。
Tamada等人获得G-CSF:G-CSFR复合物的晶体结构，并进行了2.8埃衍射分析(PNAS，2008，Vol.103:3135-3140)，结果显示，G-CSF:G-CSFR复合物是以2：2比例存在，即2个配体和2个受体结合的状态存在。每一个G-CSF分子结合一个受体分子，当两个都结合了G-CSF配体的受体，相互靠近相互作用而形成2:2二聚体时，G-CSF受体的羧基端才能激活下游的信号分子JAK2(Janus tyrosine kinase)。JAK2再通过激活STAT3启动转录基因，而刺激细胞增殖。
嗜中性粒细胞减少是指成人外周血液嗜中性粒细胞计数低于1.8x109/L，儿童的嗜中性粒细胞减少是指嗜中性粒细胞计数低于1.5x109/L。嗜中性粒细胞减少症往往是感染的前兆，嗜中性粒细胞数越低，被感染的机会越高。
嗜中性粒细胞数减少症的分类如下表所示。
嗜中性粒细减少症发生感染的频率和严重程度还受到其他因素的影响，比如：粘膜和皮肤的完整性，免疫球蛋白，淋巴细胞，单核细胞，补体系统的功能和水平等。
临床上常见的嗜中性粒细胞减少，根据嗜中性粒细胞减少的原因可以分为以下几类：造血系统生成障碍，由药物、放射、化学试剂、感染等继发因素引起；体内分布和循环改变，使用和周转加快(increased utilization and turnover)。肿瘤病人由于化疗引起的嗜中性粒细胞减少程度一般和化疗使用的剂量呈依赖关系，重复使用化疗，可以造成嗜中性粒细胞减少的累积效应。嗜中性粒细胞减少症的主要临床后果是综合性感染(infectedcomplication)。大多数病人感染主要是由好氧(aerobic)细菌感染造成，其中包括革兰氏阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pheumoniae)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，革兰氏阳性菌(Staphylococci(葡萄球菌),α-hemolyticStreptococci(溶血性链球菌),Straphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)和真菌。
肿瘤的细胞毒性化学治疗(cytotoxic-chemotherapy)方法仍然是目前治疗癌症的主要治疗手段之一。化疗治疗肿瘤的最大弱点是这种治疗方法将快速增殖分化的正常细胞无区分地和肿瘤细胞一起杀死。由其产生毒性的主要表现在造血系统，即嗜中性粒细胞减少(Neutropenia)，在临床上称之为化疗引起的嗜中性粒细胞减少症(chemotherapy-induced Neutropenia)。
嗜中性粒细胞减少可以导致下一个治疗周期的延迟，从而直接影响化疗的治疗效果。严重的嗜中性粒细胞减少，即嗜中性粒细胞绝对计数ANC(Absolute NeutrophilCount)低于0.5x109/L，可导致病人感染、器官衰竭甚至影响生命。重组人促嗜中性粒细胞刺激生长因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)已经广泛应用于化疗和放疗引起的白细胞数减少症，而作为肿瘤病人化疗的标准支持疗法。
目前市场上已有的治疗用的重组人促嗜中性粒细胞刺激生长因子(rhG-CSF)主要有两类，第一类包括由大肠杆菌表达的重组蛋白，含有175个氨基酸，分子量为19kD，其氨基端为甲硫氨酸(Filgrastim)。也包括哺乳动物细胞CHO产生的重组蛋白，含有174个氨基酸，并具有糖基化修饰。这一类的重组rhG-CSF都属于短效型，需要每天或每周多次注射。第二类是在Filgrastim的蛋白分子的N-端上进行了聚乙二醇化修饰(20kD-PEG)，修饰后的Pegfilgrastim分子量增加了约一倍，分子量变大后的Pegfilgrastim减少了肾脏排出速度，使半衰期从Filgrastim的3.5小时增加到15～80小时，方便了病人的临床使用。这两类的重组人促嗜中性粒细胞刺激生长因子都是G-CSF单体分子。
目前临床应用的短效Filgrastim和长效的Pegfilgrastim仍然不能满足病人的需要。2008年Sierra等人比较了Filgrastim和Pegfilgrastim在急性白血病人化疗中对嗜中性粒细胞减少的效果(BMC Cancer2008,8:195)，该研究设计为随机双盲临床试验，急性粒细胞白血病患者接受化疗一期诱导中(Induction I)，1-3天给化疗剂Idarubicin12mg/M2，1-7天给化疗剂Cytarabine100mg/M2，每天两次。病人在6-8天随机分组。一组给Filgrastim5μg/kg/day(n=41)，另一组给Pegfilgrastim6.0mg/week(n=42)。结果显示，所有病人在化疗后，在使用重组人G-CSF治疗的第3-4天起，仍发生重度嗜中性粒细胞减少而约持续3周时间，并且使用两种重组人G-CSF治疗组的疗效无明显差异。这提示，单纯延长半衰期似乎不足以获得令人满意的治疗效果。
然而，本领域迫切需要开发更有效的治疗嗜中性粒细胞减少症的药物，以便有效降低嗜中性粒细胞减少的程度和/或缩短重度嗜中性粒细胞减少的时间。
发明内容
本发明的目的就是一种更有效的治疗嗜中性粒细胞减少症的药物及其用途。
在本发明的第一方面，提供了一种人集落刺激因子G-CSF的二聚体的用途，它用于制备治疗嗜中性粒细胞减少症的药物。
在另一优选例中，所述的嗜中性粒细胞减少症包括：放疗、化疗所导致的嗜中性粒细胞减少症。
在另一优选例中，所述的嗜中性粒细胞减少症是重度嗜中性粒细胞减少症。
在另一优选例中，所述的人集落刺激因子G-CSF的二聚体是式I所示的人粒细胞集落刺激因子G-CSF的二聚体：
M1-L-M2 式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在另一优选例中，所述的接头元件L选自下组：
(i)3-50个(或5-50)氨基酸的短肽(或连接肽)；
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z- 式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键。
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是相同的。
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是不同的。
在另一优选例中，所述的生物活性包括：
(a).作用于嗜中性粒前体细胞和骨髓干细胞，驱动嗜中性粒细胞的分化、增殖和成熟；
(b)激活成熟的嗜中性细胞参与免疫反应。
在另一优选例中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
在另一优选例中，所述的人IgG的Fc片段至少缺失铰链区第1-4位的氨基酸，并且保留至少二个半胱氨酸。
在另一优选例中，所述的载体蛋白是二个IgG的Fc片段之间通过二硫键连接而形成。在另一优选例中，所述二硫键的数量为2-3个。
在另一优选例中，所述的“-”是肽键。
在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体的血清半衰期是所述第一单体和/或第二单体的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。
在另一优选例中，所述二聚体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2-6所示的单体所构成的二聚体。
在本发明的第二方面，提供了一种人集落刺激因子G-CSF的二聚体，所述的二聚体的结构如式I所示，
M1-L-M2 式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在另一优选例中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
在另一优选例中，所述集落刺激因子G-CSF的二聚体采用以下步骤制备：
(a)采用包含编码G-CSF-Fc复合物的DNA序列的表达载体转化哺乳动物细胞。
(b)培养所述哺乳动物细胞，表达含G-CSF-Fc复合物、G-CSF二聚体及其多聚体的表达产物；和
(c)分离纯化所述G-CSF二聚体。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明第二方面中所述的人集落刺激因子G-CSF的二聚体以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中基本上不含有人集落刺激因子G-CSF单体。较佳地，人集落刺激因子G-CSF的二聚体与人集落刺激因子G-CSF单体的重量比≥20:1；更佳地≥30:1，最佳地≥50:1。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一种G-CSF二聚体的示意图。其中，“-”表示连接肽，G-CSF椭圆形表示G-CSF单体。
该G-CSF二聚体的一种序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1-174位为G-CSF，第175-190位为连接肽，第191-364位为另一G-CSF。
图2A和2B显示了本发明G-CSF二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，G-CSF椭圆形表示G-CSF单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且G-CSF位于载体蛋白的N-末端。图2B中显示二个Fc通过二硫键配对。
一种用于构成该G-CSF二聚体的、带有Fc片段的G-CSF单体的序列如SEQ ID NO:2所示，其中第1-174位为G-CSF，第175-190位为连接肽，第191-418位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该G-CSF二聚体的、带有Fc片段的G-CSF单体的序列如SEQ ID NO:3所示，其中第1-174位为G-CSF，第175-180位为连接肽，第181-408位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
图3A和3B显示了本发明G-CSF二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，G-CSF椭圆形表示G-CSF单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且G-CSF位于载体蛋白的C-末端。图3B中显示二个Fc通过二硫键配对。
一种用于构成该G-CSF二聚体的、带有Fc片段的G-CSF单体的序列如SEQ ID NO:4所示，其中第1-228位为人IgG2的Fc片段，第229-244位为连接肽，第245-418位为G-CSF。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该G-CSF二聚体的、带有Fc片段的G-CSF单体的序列如SEQ ID NO:5所示，其中第1-228位为人IgG2的Fc片段，第229-234位为连接肽，第235-418位为G-CSF。二个带有Fc片段的G-CSF单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
图4显示了单次注射同摩尔数G-CSF的重组人G-CSF单体(G-CSF,PEG化G-CSF)和G-CSF二聚体(G-CSF-D)对正常小鼠外周血嗜中性粒细胞计数的作用(均值±标准差)。结果表明，本发明的G-CSF二聚体在体内能够更强地促进粒系造血细胞的分化成熟，提高外周血嗜中性粒细胞的数量(ANC)。
图5显示了G-CSF单体和G-CSF二聚体对5-FU诱导的小鼠嗜中性粒细胞减少模型中嗜中性粒细胞计数的影响。结果表明，本发明的G-CSF二聚体(G-CSF-D)治疗效果明显优于PEG化的G-CSF单体。
图6显示了G-CSF单体和G-CSF二聚体对环磷酰胺诱导的嗜中性粒细胞减少的食蟹猴模型上的作用。结果表明，本发明的G-CSF二聚体(G-CSF-D)治疗效果明显优于PEG化的G-CSF单体。
图7A显示了在非还原条件下，以抗人G-CSF单克隆抗体(R&D systems,Cat.MAB214)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，细胞培养上清、纯化中间产物和纯化的G-CSF二聚体的免疫印迹分析（Western blot）结果。各泳道如下：1.分子量标准；2.细胞培养上清；3.纯化中间产物；4.纯化的G-CSF二聚体。
图7B显示了在还原条件下，以抗人G-CSF单克隆抗体(R&D systems,Cat.MAB214)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，细胞培养上清、纯化中间产物和纯化的G-CSF二聚体的免疫印迹分析（Western blot）结果。各泳道如下：1.分子量标准；2.细胞培养上清；3.纯化中间产物；4.纯化的G-CSF二聚体（G-CSF-Fc单体分子量约为48KD）。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现：与G-CSF单体相比，使用重组人G-CSF二聚体，可以产生更强的受体激活信号而加快骨髓嗜中性粒细胞的分化和增殖。同时G-CSF二聚体的药代(pharmacokinetics)和药效(pharmacodynamics)性质优于重组人G-CSF单体，因此在肿瘤病人化疗后，可有效降低重度嗜中性粒细胞减少的程度，并缩短重度嗜中性粒细胞减少的时间。在此基础上完成了本发明。
G-CSF二聚体
本发明的G-CSF二聚体的结构如式I所示。代表性的结构如图1-3中所示。其中，载体蛋白包括(但并不限于)是指人IgG(1,2,3,4)的Fc片段、或人白蛋白(albumin)。
G-CSF位于可用载体蛋白的C-末端，也可用位于载体蛋白的N-末端。
如本文所用，术语“连接肽”(linker)指位于G-CSF单体和G-CSF单体之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸。通常，连接肽不影响或不显著影响G-CSF单体和G-CSF单体形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：
较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-16个氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro;
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨基酸；
(c)来自于G-CSF单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如来自于IgG或白蛋白的氨基酸序列；
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。
优选的连接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1中第175-190位)和ASTKGP(SEQ ID NO:3中第175-180位)。
此外，在融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响G-CSF单体活性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg))，或可促进融合蛋白的活性。
制备方法
编码本发明G-CSF二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得G-CSF第一单体和/或G-CSF第二单体的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对G-CSF二聚体编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明中，可以采用酵母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对G-CSF二聚体基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细 胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
药物组合物和施用方法
由于本发明G-CSF二聚体可产生更强的受体激活序号并具有优异的血清半衰期，因此本发明G-CSF二聚体以及含有本发明G-CSF二聚体为主要活性成分的药物组合物可用于治疗嗜中性粒细胞减少症。其中，所述的嗜中性粒细胞减少症包括：放疗、化疗所导致的嗜中性粒细胞减少症。
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明G-CSF二聚体及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg本发明G-CSF二聚体/剂，较佳地0.05-300mg本发明G-CSF二聚体/剂，更佳地，含有0.5-200mg本发明G-CSF二聚体/剂。
本发明的化合物及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明G-CSF二聚体或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
施用本发明G-CSF二聚体时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中， 剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明G-CSF二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明G-CSF二聚体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。(通常，本发明的G-CSF二聚体不与G-CSF单体联用)。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明G-CSF二聚体适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
1.可产生更强的受体激活信号；
2.更强的体内生物半衰期。
3.在动物模型中已证实具有显著的、明显优于现有产品的治疗嗜中性粒细胞减少症的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
用常规方法制备和纯化，获得结构如图1-图3所示的G-CSF二聚体(序列为SEQIDNO:1,或单体序列如SEQ ID NO:2-5所示)。
实施例2
G-CSF二聚体体内半衰期
大鼠皮下单次注射G-CSF二聚体(由序列如SEQ ID NO:2所示的二个G-CSF单体构成的二聚体)100ug/kg，药代动力学参数如下表所示(n=6).单体G-CSF在大鼠的半衰期约2小时。
实施例3.
同摩尔数G-CSF的G-CSF单体和G-CSF二聚体对正常小鼠嗜中性粒细胞增生的作用(G-CSF二聚体在体内可产生更强的受体激活信号)
ICR小鼠，雌性，20-22克，随机分为4组，每组6-8只。动物给药体积为0.1ml/10g体重，各试验组给予同摩尔数的G-CSF分子剂量(1摩尔二聚体中的G-CSF按2摩尔计算)，即分别皮下一次注射等体积的溶剂(溶剂对照组)、G-CSF-Peg40μg/kg，rhG-CSF40μg/kg，G-CSF-D100μg/kg。
G-CSF-Peg单体为Neulasta(Pegylated Filgrastim，Amgen公司产品)。
G-CSF单体为注射用重组人G-CSF(长春金赛药业有限公司产品)。
G-CSF-D是由序列如SEQ ID NO:5所示的二个G-CSF单体构成的二聚体。
给药后各组在相应的时间点眼眶静脉丛取血40μL检测血细胞计数及分类。
结果如图4所示，与溶剂对照组相比，G-CSF单体(rhG-CSF,Peg化的G-CSF)，和G-CSF二聚体(G-CSF-D)对正常小鼠具有不同程度的促嗜中性粒细胞增生作用。因实验动物是正常动物，故给药后G-CSF单体或二聚体会与嗜中性粒细胞的受体结合后被代谢消除，随之嗜中性粒细胞数也相应的的降低，在本实验中，三种药物均在72hr时恢复至基础水平。
值得注意的是，在同摩尔数G-CSF分子剂量条件下，G-CSF-D组ANC升高倍数最大，尤其在给药48小时，G-CSF二聚体组的嗜中性粒细胞数是G-CSF-Peg组的3.1倍，是G-CSF单体组的6.1倍，G-CSF二聚体、G-CSF-Peg、G-CSF单体组的嗜中性粒细胞数均值分别为22.14X109/L、7.04X109/L、3.61X109/L，药效比较结果：G-CSF-D>G-CSF-Peg>G-CSF，可以说明二聚体的药效更好。换言之，注射了G-CSF二聚体的小鼠，嗜中性粒细胞增加的幅度，不仅远远大于注射了G-CSF单体的动物组，也远远大于注射了半衰期较长的PEG化G-CSF单体的动物组。该试验结果表明，在动物体内，同摩尔数的G-CSF剂量条件下，G-CSF二聚体生物活性明显优于G-CSF单体的生物活性。
实施例4
同摩尔数的G-CSF单体和G-CSF二聚体对5-FU诱导的小鼠嗜中性粒细胞减少模型中嗜中性粒细胞增生的作用(G-CSF二聚体在小鼠动物模型中的治疗作用)
ICR小鼠，雌雄各半，24-26克，随机分组，10只/组。所有动物静脉注射150mg/kg剂量的5-氟尿嘧啶(5-Fu)造模，24小时后，模型组动物注射溶剂对照、G-CSF-D(二聚体)组注射重组人G-CSF-D(G-CSF-D是由序列如SEQ ID NO:3所示的二个G-CSF单体构成的二聚体)1500μg/kg，G-CSF-Peg(聚乙二醇化的G-CSF单体)组注射Neulasta300μg/kg。试验组的G-CSF剂量为同摩尔数剂量(1摩尔二聚体中的G-CSF按2摩尔计算)，皮下注射给药。各组第1，3，5，7天各给药1次，注射体积为0.1ml/10g体重。分别于第0，2，4，6，8，天取外周血检测白细胞计数及分类。
结果如图5所示，模型组动物静脉注射5-Fu后，嗜中性粒细胞值迅速下降，第6天降至最低。注射注射同摩尔数的重组人G-CSF单体(Peg化G-CSF)和G-CSF二聚体(G-CSF-D)的动物，嗜中性粒细胞值的最低谷也出现在大约第6天。但是，G-CSF二聚体(G-CSF-D)治疗组动物嗜中性粒细胞值(均值为0.23X109/L)比G-CSF单体(PEG化G-CSF)治疗组的嗜中性粒细胞值(均值为0.05X109/L)高4.6倍。
该结果提示，在化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的嗜中性粒细胞减少症(Neutropenia)的小鼠模型中，G-CSF二聚体(G-CSF-D)治疗效果明显优于G-CSF单体(PEG化G-CSF)的治疗效果。
实施例5
G-CSF单体和G-CSF二聚体对环磷酰胺诱导的嗜中性粒细胞减少的食蟹猴模型上的作用(G-CSF二聚体在食蟹猴动物模型中的治疗作用)
正常食蟹猴24只，雌雄各半，静脉注射两次(第0天，第1天)60mg/kg剂量的环磷酰胺(lot：2008040921，江苏恒瑞医药股份有限公司产品)，导致白细胞和嗜中性粒细胞减少。随机分为3组，雌雄各半。第5天开始，试验组分别单次皮下 注射G-CSF二聚体(60μg/kg，相当于0.67μM/kg)(G-CSF-D是由序列如SEQ ID NO:2所示的二个G-CSF单体构成的二聚体)；或单次皮下注射G-CSF-Peg单体(60μg/kg,相当于3.2μM/kg)；或每天注射G-CSF单体(10μg/kg/day，相当于0.53μM/kg)连续注射5天，总剂量为50μg/kg，相当于2.65μM/kg。注射体积均为0.2mL/kg。在不同时间点采集血液样本，观察不同剂量的F627对模型食蟹猴外周血液嗜中性粒细胞计数的作用。
结果如图6所示，模型组动物静脉注射环磷酰胺后，嗜中性粒细胞值减少，第6-8天降至最低。注射约同等剂量的重组人G-CSF单体和Peg化G-CSF单体，嗜中性粒细胞谷值出现在大约第6-7天。单次注射G-CSF二聚体(G-CSF-D)的动物，在摩尔剂量小于PEG化G-CSF单体的4.8倍时，防止了嗜中性粒细胞减少症状的发生。在嗜中性粒细胞计数处于低谷值(给予环磷酰胺后第8天)时，单次注射G-CSF二聚体(G-CSF-D)的动物组的嗜中性粒细胞计数分别是G-CSF单体组的3.0倍，是PEG化G-CSF单体注射组的6.9倍，G-CSF-D组的嗜中性粒细胞数均值为1.17×109/L，G-CSF单体组为0.39×109/L，PEG化G-CSF单体组为0.17×109/L。
该结果显示，在化疗药物环磷酰胺诱导的嗜中性粒细胞减少症(Neutropenia)的食蟹猴模型中，G-CSF二聚体(G-CSF-D)治疗效果明显优于G-CSF单体和PEG化G-CSF的治疗效果，可有效防止化疗药物诱导的嗜中性粒细胞减少症状的发生，有效降低嗜中性粒细胞减少的程度和/或缩短重度嗜中性粒细胞减少。
实施例6
由G-CSF-Fc复合物形成的G-CSF二聚体
a．G-CSF二聚体表达细胞株的构建
采用全基因合成G-CSF-Fc复合物的cDNA序列(如SEQ ID NO:7所示)，将人G-CSF单体的基因与IgG2的Fc基因片段连接，5’引入HindIII位点，以及哺乳动物细胞表达所需要的元件如Kozak序列和信号肽序列，3’端引入EcoRI位点，克隆到市售的pUC19质粒，命名为pG-CSF-Fc，转化E.coli TG1。用Hind III和EcoRI酶切pUC19质粒，回收约1400bp的G-CSF-IgG2Fc片段，与经Hind III和EcoRI酶切后的pcDNA3(Invitrogen)表达质粒相连接，构建表达质粒pEX-G-CSF-Fc。表达质粒pEX-G-CSF-Fc经线性化，纯化，电穿孔转化CHO细胞，筛选，ELISA法检测表达量，筛选出蛋白产量较高的细胞株，冻存细胞，制备细胞库。
由SEQ ID NO.:7获得G-CSF-Fc单体No.1,其结构为“G-CSF-连接肽-IgG2Fc”，氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
用类似方法构建类似的表达质粒，从而表达不同结构的G-CSF-Fc单体No.2至4（表1）。通过类似的方法表达获得不同结构的G-CSF二聚体。
表1不同G-CSF-Fc单体
b．细胞规模培养
从细胞库取一支细胞(～1x107cells/ml)，复苏后于10cm培养皿，培养于10mL基础培养基，37°C,5%CO2培养24hr。
种子扩增：将10mL培养物传代至30-40mL培养基中，培养至细胞浓度达1.0-1.5x106cells/mL且存活率≥90%时，逐级扩大至300-400mL培养基中，置于摇瓶中37°C,5%CO2.培养，转速120rpm。
细胞罐中扩增(3L-10L)：细胞浓度达1.0–3.0x106cells/mL且存活率≥90%时，将300-400mL培养物接种至3-10L细胞罐中培养，培养基pH控制在6.8，溶解氧约50%，转速65-100rpm。
细胞罐生产(30-100L)：3L-10L细胞罐中的细胞浓度达1.0–3.0x106cells/ml且存活率≥90%时，将3-10L细胞罐中的培养物接种至30-100L细胞罐，培养基pH控制在6.8，溶解氧约50%，转速65-100rpm，培养12-48hr开始控制培养基中的葡萄糖浓度(<1g/L)，采用补料培养。
c．G-CSF二聚体的分离纯化
细胞罐中培养结束后，收集细胞上清(含有G-CSF-Fc复合物、G-CSF二聚体、G-CSF-Fc多聚体及代谢物)，细胞上清收集后经过滤、多级凝胶层析纯化，例如，rProtein ASepharose FF(GE Healthcare,cat#17-1279-04)捕获，用50mM柠檬酸/柠檬酸钠，0.2MNaCl,pH3.7-3.8的缓冲液洗脱，得到纯度>90%的G-CSF二聚体，接下来采用Capto Adhere层析，用50mM NaAc/HAC,0.2M NaCl,pH4.5-5.0的缓冲液洗脱，再用SP Sepharose FF(GEHeathcare Cat#17-0729-04)，10mM PB(pH6.0±0.1)缓冲液平衡，10mM PB,0.2M NaCl(pH7.2±0.1)洗脱液，洗脱液经低pH除病毒，过滤等，最终获得G-CSF二聚体。
分离纯化的G-CSF二聚体的纯度>95%(采用反向HPLC分析)，分子量为47±5 Kd(采用还原型SDS-PAGE分析)，O糖基化占整个分子量的2-10%，等电点为5.8-6.8，紫外吸收光谱为280nm。G-CSF二聚体在体外能激活M-NFS-60细胞的STAT3，刺激M-NFS-60细胞的增殖(ED50为0.1-10ng/mL)。
G-CSF二聚体(由二个SEQ ID NO.:6所示单体构成)纯化结果如图7A和图7B所示，显示纯化后获得了G-CSF二聚体(图7A中泳道4)。
此外，试验显示，当载体蛋白的Fc片段N端部分含有四个半胱氨酸时，例如ERKCCVECPPC(SEQ ID NO.:2第191－201位)，对于形成正常配对的G-CSF二聚体有一定影响，这提示二个Fc片段之间宜通过2-3对二硫键连接。
实施例7
G-CSF二聚体在人体内的药代动力学
24个正常人随机分成4组，分别为30、60、120、240ug/kg剂量组，给予G-CSF二聚体(二聚体由二个SEQ ID NO:6所示单体构成)剂量分别为30、60、120、240ug/kg，单次给药，于给药后0.5,1,2,4,8,16,24,36,48,72,96小时,第6(120hrs),7,9,11,13,和15天，采血分离血清冻存于-70℃冰箱。采用ELISA法检测血药浓度(ELISA,Quantikine human G-CSFELISA kit,R&D System,Inc.Minneapolis,Min,Cat:PDCS50)。检测结果采用非房室模型分析药代动力学参数(软件WinNonlin v5.2,Pharsight Corporation,USA)，结果如表2所示(表中的括号内的数据为SD，括号外为均值)。
表2药代动力学参数
*Tmax用中位数和范围表示：括号内的数据为范围值，括号外为中位数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种人集落刺激因子G-CSF的二聚体的用途，其特征在于，用于制备治疗嗜中性粒细胞减少症的药物；所述的嗜中性粒细胞减少症包括：放疗、化疗所导致的嗜中性粒细胞减少症；
所述的人集落刺激因子G-CSF的二聚体是式I所示的人粒细胞集落刺激因子G-CSF的二聚体，
M1-L-M2 式I
式中，
M1是人集落刺激因子G-CSF的第一单体；
M2是人集落刺激因子G-CSF的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上；
所述的接头元件L选自下组：
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z- 式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键；
其中，所述的载体蛋白是两个人IgG的Fc片段之间通过二硫键连接而形成,且所述人IgG为人IgG2；
所述的“-”是肽键；
其特征在于，所述的嗜中性粒细胞减少症是重度嗜中性粒细胞减少症；和
所述二聚体由两个G-CSF-Fc复合物形成，每个G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列如SEQ IDNO:2-6任一所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二硫键的数量为2-3个。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第一单体和第二单体是相同的。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生物活性包括：
(a).作用于嗜中性粒前体细胞和骨髓干细胞，驱动嗜中性粒细胞的分化、增殖和成熟；
(b)激活成熟的嗜中性细胞参与免疫反应。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人IgG的Fc片段是如SEQ ID NO:2第191-418位所示的人IgG2的Fc片段。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人IgG的Fc片段至少缺失铰链区第1-4位的氨基酸，并且保留至少两个半胱氨酸。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人IgG的Fc片段是如SEQ ID NO:6第191-413位所示的人IgG2的Fc片段。
8.如权利要求1所述的用途，所述二聚体由两个G-CSF-Fc复合物形成，每个G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.如权利要求1所述的用途，所述二聚体由两个G-CSF-Fc复合物形成，每个G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
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