JP6475698B2

JP6475698B2 - 組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質とヒト血清アルブミンの融合タンパク質及びその製造方法と応用

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Publication number: JP6475698B2
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Inventors: 張喜田; 孫非; 梁重陽
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Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は組換え融合タンパク質の構築、発現、精製と応用に関し、具体的には化学療法による白血球減少症と腫瘍などを治療するのに用いられる組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質とヒト血清アルブミンの融合タンパク質の製造及びその応用に関する。
［背景技術］
マンネンタケ免疫調節タンパク質（ＬＺ−８）はツガノマンネンタケの菌糸に由来するものであり、その構造の特徴は以下のとおりである：Ｎ端の二量体の形成に必要とする重要なタンパク質ドメイン及びＣ端のＦＮＩＩＩタンパク質ドメインを含み、ｒＬＺ−８のＮ−端のタンパク質ドメインはα−ｈｅｌｉｘ及びβ−ｓｔｒａｎｄで構成され、ＬＺ−８単量体にあるＮ端のα−ｈｅｌｉｘとβ−ｓｔｒａｎｄ及びもう一つの単量体にある同じタンパク質ドメインはスペースの切り替えによって重要な二量体結合タンパク質ドメインを形成し、亜鈴状をする。既存の文献にＬＺ−８が免疫調節（特許申請番号２０１１１０２２２０１２．５）及び腫瘍細胞を殺傷する生物活性を有することは報道される。

現在、タンパク質薬物の半減期が比較的に短いということを引き起こす原因は主に以下のとおりである：（１）タンパク質の加水分解は大多数のタンパク質の代謝手段の一つであり、生体組織に存在するタンパク質分解酵素はタンパク質薬物の活性を下げる；（２）腎臓は小分子タンパク質の分解代謝プロセスに最も重要な器官で、相対分子量が６９０００Ｄａより小さい大多数のタンパク質分子は全部糸球体の濾過作用を通じて体外に排出されることができる；（３）肝臓もタンパク質薬物の代謝プロセス中に重要な役割を果たし、薬物は拡散とキャリア転送などの形式によって肝細胞の中に転送され、次にミクロソーム酵素Ｐ４５０、サイトゾルにあるタンパク質酵素又はリゾソームに分解される；更に大きい分子のペプチドとタンパク質は受容体介在のエンドサイトーシス作用によって肝細胞に取られた後分解される。マンネンタケ免疫調節タンパク質二量体の分子量は２６ｋＤａに足らないため、体内のクリアランスが高く、薬物動力学のパラメータが新薬を開発する要件に満足できないことを引き起こす可能性があり、このせいで、遺伝子レベル融合などの技術手段によってＬＺ−８の体内にある作用時間を延長し、それの臨床治療における応用のためにしっかりした基礎を作る。タンパク質薬物の半減期を延長するために、近年各国の学者は主にタンパク質薬物のアルブミン融合、化学修飾、マイクロカプセル化、突然変異体の構築、グリコシル化などの方面で研究する。研究の進行と発展につれ、薬効が持続するタンパク質薬物の新品種が絶えず登場する。

遺伝子融合技術は異なる遺伝子を接続することによって複合機能を有する融合タンパク質を発現し、遺伝子融合技術によってポリペプチドとタンパク質薬物の分子量を増やす又は薬物と受容体の親和性を変えるなどの原理で薬物の半減期を延長することができる。融合タンパク質を構築する原則は以下のとおりである：タンパク質のコーディング遺伝子の終止コドンを除去し、その後に終止コドンを携帯するもう一つのタンパク質のコーディング遺伝子を接続し、それで二種類のタンパク質にあるコーディング遺伝子の融合を実現し、それにより二種類のタンパク質を同時に発現する。融合タンパク質遺伝子の安定性が高く、発現を調節制御することができ且つ製造しやすく、産物が均一で、タンパク質、ポリペプチド薬物の活性に対する影響が小さいなどは現在薬効が持続するポリペプチド、タンパク質薬物を研究する優れた方法である。

現在広く研究される融合遺伝子はヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧＩ、ＩｇＧ４）遺伝子など。ヒト血清アルブミン（ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡと略称する）はヒト血漿にあるタンパク質であって、その非グリコシル化の単鎖ポリペプチドは５８５個のアミノ酸を含み、分子量は６６ｋＤａである。血漿においてその濃度は４２ｇ／Ｌであり、血漿にあるタンパク質総量の約６０％を占める。体液においてヒト血清アルブミンは脂肪酸、胆汁色素、アミノ酸、ステロイドホルモン、金属イオンと多くの治療分子などを輸送することができる；同時に血液の正常の浸透圧を維持する。臨床においてヒト血清アルブミンはショックと火傷の治療に用いられることができ、手術、事故又は大出血による血液の損失を補充することに用いられ、また血漿相溶化剤とすることもできる。

ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）は人体の血液中に最も豊富なタンパク質であり、その半減期は２１日に達する。従来の報告はＩｇＧのＦｃ断片を他のタンパク質と融合することが、他のタンパク質の体内における生物活性と半減期を顕著に増やすことができ、その中に大多数の実験者はＩｇＧＩ、ＩｇＧ４という二種類のサブタイプのＦｃ断片を選択して融合対象とし、この方法はすでに広く臨床のかなり重要な細胞因子と可溶性受容体、例えばｓＴＮＦ−αＲ、ＬＦＡ３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−２、ＩＦＮ−αなどに用いられ、且つ成功したことを表示する。

上記背景技術に基づき、本発明は遺伝子組換え技術を使用してマンネンタケ免疫調節タンパク質をそれぞれヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦｃ段と融合させ、真核生物発現システムを構築し、発現、精製を経て目的タンパク質を得、且つ目的タンパク質に相関する生物活性及び薬学の研究を行い、その結果はマンネンタケ免疫調節タンパク質（ＬＺ−８）とＨＳＡ融合タンパク質が薬学と生物活性及び病理学の応用の面に顕著な差異があることを表示する。
［発明の内容］
本発明の目的は組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質とヒト血清アルブミンの融合タンパク質及びその製造方法を提供し、それが化学療法薬による白血球減少症などの病状に対する治療及び抗がん剤における応用を研究することである。

融合タンパク質の序列は以下のとおりである：本発明のマンネンタケ免疫調節タンパク質（ＬＺ−８）とＨＳＡ融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡは、その特徴がマンネンタケ免疫調節タンパク質とＨＳＡを含むことである；そのアミノ酸序列は以下のとおりである：SDTALIFRLAWDVKKLSFDHPNWGRG NPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNL GVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNND FIIAQWNGGGGSSMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHV KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVR PEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSA KQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSI SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVE VSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAAS QAALGL (SEQ ID NO.1)であって、そのうちのマンネンタケ免疫調節タンパク質ポリペプチドのＣ端とヒト血清アルブミンポリペプチドとの間にある連結ペプチドのアミノ酸序列はＧＧＧＧＳＳである；
本発明が提供するマンネンタケ免疫調節タンパク質（ＬＺ−８）とヒトＩｇＧＩＦｃ断片のｒＬＺ−８−Ｆｃｌ融合タンパク質は、その特徴がマンネンタケ免疫調節タンパク質とＩｇＧ１Ｆｃ断片を含むことである；そのアミノ酸序列は以下のとおりである：RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSG RNLGVKPSYAVESDG SQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGS SEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.2)であって、そのうちのマンネンタケ免疫調節タンパク質ポリペプチドのＣ端とヒト血清アルブミンポリペプチドとの間にある連結ペプチドのアミノ酸序列はＧＧＧＧＳＳである；
本発明が提供するマンネンタケ免疫調節タンパク質（ＬＺ−８）とヒトＩｇＧ４Ｆｃ断片のｒＬＺ−８−Ｆｃ４融合タンパク質は、その特徴がマンネンタケ免疫調節タンパク質とＩｇＧ４Ｆｃ断片を含むことである；そのアミノ酸序列は以下のとおりである：RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSG RNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGS SYTQRFKDKAKLTAVTSANTAYMELSSLTNE DSAVYYCSIIYFDYADFIMDYWGQGTTVTVSTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQXSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLXGKEY KCKVSXKGLPSSIEKTISXAXGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSXWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO.3）であって、そのうちのマンネンタケ免疫調節タンパク質ポリペプチドのＣ端とヒト血清アルブミンポリペプチドとの間にある連結ペプチドのアミノ酸序列はＧＧＧＧＳＳである；
工学菌株の構築と目的タンパク質の発現及び精製：それぞれＬＺ−８融合タンパク質のヌクレオチド序列のキャリアを構築する；電気的転換技術を用いてピキア酵母を融合タンパク質の細胞外での発現とする宿主細胞を得る；ピキア酵母の発酵条件を最適化し融合タンパク質の発現量を向上させる；重力カラム親和クロマトグラフィー、分子篩、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、疎水クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を用いて目的産物を精製し、得る異なる融合タンパク質の純度は９９％以上に達し、後続の薬学実験に原薬を提供する。

薬学実験方面：異なる融合タンパク質をｒＬＺ−８と対照して活性検査実験を行い、ＥＬＩＳＡ法にて検出して結論を得、その結果は融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡの生物活性が融合する前のｒＬＺ−８の生物活性より高く、顕著な差異があり、統計学の意味を有するということを説明する；ｒＬＺ−８−ＦｃｌとｒＬＺ−８−Ｆｃ４の生物活性は融合する前ｒＬＺ−８の活性目標に達しなく、顕著な差異がある；異なる融合タンパク質をｒＬＺ−８と対照して体内での半減期実験を行い、ＥＬＩＳＡ法にて検出して異なる融合タンパク質の体内での半減期は全部著しく向上し、ｒＬＺ−８の約３倍であることを得る；同時に異なる融合タンパク質をｒＬＺ−８と対照して白血球減少症を治療する実験を行い、動物全血球分析装置で白血球の数を検出し、その結果は異なる融合タンパク質とｒＬＺ−８が白血球減少症を治療する効果に顕著な差異があるということを表示する；ここにおいて、同じ用量で、融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡが白血球の成長を促進する周期は更に短く、同じ治療周期で、融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡが白血球の成長を促進する数は更に多い；これはＨＳＡがｒＬＺ−８の融合対象により適切で、ＬＺ−８の白血球減少症の治療における応用を顕著に強化することができる；融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡがメラノーム細胞の成長を抑制する実験によって、同じ用量（ＬＺ−８の量で計る）で、融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡがマラノーム細胞の成長を効果的に抑制し、融合する前のｒＬＺ−８の治療効果と比較すると顕著な差異がある；同時に融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡが肝癌細胞の成長を抑制する実施例から見ると、同じ治療周期内で、融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡの治癒率は顕著に向上し、これは発明者が予期しないことである；本発明はまた融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡが血小板減少症を治療する実施例を提供し、それから見ると、モデル組と比較し、投薬初期でｒＬＺ−８−ＨＳＡ薬物組はすでにネズミの血小板の増殖を顕著に刺激し、差異は極めて著しく、投薬中期に正常のレベルに戻り、抗血小板血清の注射による血小板減少症を有する実験動物モデルに対する治療もよい効果を得る。

本発明の有益効果は以下のとおりである：本発明が提供する融合タンパク質は、その体内での半減期がｒＬＺ−８と比べると顕著に延長される；遺伝子融合技術で融合タンパク質を構築するため、タンパク質が融合された後目的タンパク質の生物活性を影響することが発生するが、本発明が構築する融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡの生物活性は実験で証明されるようにその生物活性は融合する前のｒＬＺ−８より顕著に優れる；且つ本発明が構築するｒＬＺ−８−ＨＳＡ融合タンパク質ピキア酵母工学菌株の発酵技術がシンプルで、産出量が高く、発現産物が単一で、精製しやすく、工業化生産に有利な条件を提供する；ピキア酵母発現システムを用いるのは発現産物が発酵液に分解しやすいなどという問題があるため、本発明は発酵技術条件を制御することにより、ピキア酵母の発酵発現プロセス中に目的産物に対する分解を大幅に削減し、収率を向上させる；本発明は体内での実験を用いて体内での半減期が融合する前のｒＬＺ−８より顕著に延長されると同時に白血球減少症を治療する研究における薬の最低用量と作用発現時間が全部融合する前のｒＬＺ−８より優れることを証明する；メラノームと肝癌を採用して抗がん研究の代表とし、それぞれ体内と体外での実験を展開し、メラノームと肝癌実施例に二種類の実験手段の治療効果が全部融合する前のｒＬＺ−８より顕著に優れ、これは発明者が予期しないことである；血小板減少症を治療する実施例から以下のことが分かり、モデル組と比較し、投薬初期にｒＬＺ−８−ＨＳＡ薬物組はすでにネズミの血小板の増殖を顕著に刺激し、差異は極めて顕著であり、投薬中期に正常なレベルに戻り、今まで発現したｒＬＺ−８融合タンパク質が達することができる最適効果である。
［図面による説明］
図１は６６ｈと７２ｈに誘導発現して各融合タンパク質の発現状況
説明テキスト：コース１サンプルはタンパク質Ｍａｒｋｅｒである；コース２サンプルはＨＳＡ規格品である；コース３サンプルはｒＬＺ−８である；コース４サンプルは７２ｈに誘導されるｒＬＺ−８−ＨＳＡ上清液である；コース５サンプルは６６ｈに誘導されるｒＬＺ−８−ＨＳＡ上清液である；コース６サンプルは７２ｈに誘導されるｒＬＺ−８−Ｆｃｌ上清液である；コース７サンプルは６６ｈに誘導されるｒＬＺ−８−Ｆｃｌ上清液である；コース８サンプルは７２ｈに誘導されるｒＬＺ−８−Ｆｃ４上清液である；コース９サンプルは６６ｈに誘導されるｒＬＺ−８−Ｆｃ４上清液である。

図２は異なる融合タンパク質ＷｅｓｔｅｒｎＢｏｌｔの鑑定クロマトグラム
説明テキスト：コース１サンプルはタンパク質Ｍａｒｋｅｒである；コース２サンプルはｒＬＺ−８である；コース３サンプルはｒＬＺ−８−ＨＳＡである；コース４サンプルはｒＬＺ−８−Ｆｃｌである；コース５サンプルはｒＬＺ＿８＿Ｆｃ４である。

図３はｒＬＺ−８−ＨＳＡ融合タンパク質の分子篩精製クロマトグラム
図４は異なる融合タンパク質とｒＬＺ−８タンパク質の体内での半減期の対比
［具体的な実施手段］
実施例１ｒＬＺ−８融合タンパク質工学菌株の構築と発現
構築部分：酵母のコドンバイアスによってそれぞれ目的断片ｒＬＺ８−ＨＳＡ、ｒＬＺ８−Ｆｃｌ、ｒＬＺ８−Ｆｃ４序列を合成し、ｐｕｃ５７プラスミドに保存する。設計は酵素切断サイトＳｔｕｌとＫｐｎｌのプライマーを含む。プライマーの合成は以下のとおりである：
(1) LZ-8-HSA :5' CATAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3'
5' CGGGGTACCGAATTCCTATTACA 3'
(2) LZ-8-Fcl :5' GTTAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3'
5' TAGGGTACCTCATTTACCAGGGG 3’
(3) LZ-8-Fc4 :5' CCGAGGCCTTCTGATACTGCTT 3'
5' GATGGTACCTCACGGAGCATGAG 3’
ＰＣＲによって目的断片を得、ＰＣＲ条件は以下のとおりである：初めには９５℃、３０ｓで、次に９５℃３０ｓ、５８℃３０ｓ、７２℃２ｍｉｎで、合わせて３０個のサイクルで、最後に７２℃１０ｍｉｎ１６℃で、待機する。

１％のアガロオリゴ糖が電気泳動で鑑定する目的断片はそれぞれ２１８４ｂｐ（ＬＺ−８−ＨＳＡ）１０６４ｂｐ（ＬＺ−８−Ｆｃｌ）、７７４ｂｐ（ＬＺ−８−Ｆｃ４）にある。ｐＰＩＣＺαＡキャリアと目的断片をＧＥＮＥＡＲＴＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔキットの説明書に従って操作し、キャリアと目的断片のモル比は１：３であって、５Ｘ緩衝液、１０Ｘ酵素混合液と３０分に反応する。１０ｕｌの連結産物を取って大腸菌コンピテントＤＨ５ａｌｐｈａの中に転化させ、３７℃で１時間培養した後、ブレオマイシン耐性のＬＢパネルを塗る。単一コロニーを選び３７℃で振動培養し一夜を越す。１２０００ｇの菌液を遠心分離して上清液を廃棄し、プラスミドミニキットで組換えプラスミドを抽出し、序列を測定する。制限酵素切断と電気泳動で転換体が正確であるかどうかを鑑定し、最後に５‘Ａ０Ｘと３’Ａ０Ｘプライマーで序列の正確性を証明する。

組換えプラスミドを取ってＳａｃｌ酵素で、３７℃、１時間ほど線形化する。Ｘ３３ピキア酵母をＹＰＤ培地に接種して３０℃、３００ｒｐｍで振動培養し一夜を越す。５００ｍＬまで培養を拡大し、ＯＤ_６００が１．３ほどに達し、酵母コンピテントを調製し、３０ｍｉｎに氷浴をした後氷浴滅菌水を再懸濁するまで、４℃、１５００ｇで遠心分離し、２回を繰り返す。氷浴１Ｍソルビトールに変えて再懸濁し、４℃、１５００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、各管に８０ｕｌの酵母コンピテントを詰み分け、１０ｕｇの線形化プラスミドを加える。５分間氷浴をする。電動カップに転移し、１．５ｋＶ、５０μＦ、２５ｍＡ条件で電気変換させる。３０℃で２時間を振動培養し、ブレオマイシンＺｅｏｃｉｎ耐性のＹＰＤＳパネルを塗り、３０℃で３日を培養する。

選別部分：無菌条件でブレオマイシンＺｅｏｃｉｎ耐性のＹＰＤＳパネルにて各種類の融合タンパク質工学菌の２０つのモノクローナルをそれぞれ選別し、菌株を選び１０ｍＬのＹＰＤ液体培地に置いて３０℃、３００ｒｐｍで１２時間をフラス振動培養し、１５００ｇ、５ｍｉｎを遠心分離して上清液を廃棄し、ＢＭＧＹ培地に変えて３０℃、３００ｒｐｍで１８時間をフラス振動培養し、１５００ｇ、５ｍｉｎを遠心分離して上清液を廃棄し、ＢＭＭＹ（１％のメタノール）培地に変え、各２４時間１％のメタノールを補充し、７２時間を誘導発現する。１５００ｇ、５ｍｉｎを遠心分離し、−２０℃で上清液を保存し、ＳＤＳ電気泳動及びＷｅｓｔｅｒｎＢｏｌｔ鑑定によって定量と定性に目的タンパク質の発現を説明し、これで高発現の工学菌株を選別する。

実施例２融合タンパク質の精製技術
融合タンパク質がＬＺ−８構造を共有するため、該構造の特徴と性質にて、それぞれ重力カラム親和クロマトグラフィー、分子篩、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、疎水クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を検索して精製し、具体的な方法は以下のとおりである：
ｒＬＺ−８−Ｆｃｌ、ｒＬＺ−８−Ｆｃ４の精製方法：
精密濾過：発酵液を１０００回／分で遠心分離し上清液を得、また口径サイズが１００Ｋｄである中空繊維カラムで精製し（精密濾過）、小分子の塩類と糖類を除き、８Ｌの色素、核酸、タンパク質を含む黄色い上澄み液を得る。

ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＧｒａｖｉＴｒａｐ重力カラム親和クロマトグラフィー：緩衝液Ａ相を調製する：０．２２Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．７、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、緩衝液Ｂ相を調製する：０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．０、０．２２μｍで吸引濾過し、超音波脱ガスをする；Ａ相リン酸塩緩衝液を用いてクロマトグラフィックカラムを平衡させ、体積は１０ｍｌである。それぞれ１０ｍｌの前処理したｒＬＺ−８−Ｆｃｌ、ｒＬＺ−８−Ｆｃ４発酵液をローディングし、二回を繰り返して結合させる。（サンプル処理：９０ｍｌの発酵液＋１０ｍｌ１０Ｘのリン酸塩緩衝液、０．２２μｍで濾過殺菌保存する）、Ａ相リン酸塩緩衝液を用いてクロマトグラフィックカラムを押し流し、溶出し結合しない。Ｂ相クエン酸塩緩衝液でサンプルを溶出し、体積は１０ｍｌである。２ｍｉｎを放置し、１ｍｌのクロマトグラフィックカラム内の体積を廃棄し、１．５ｍｌの遠心管でサンプルを受け、保留して検出する。５回を使用した後、再生が必要で、５ｍｌ６Ｍの塩酸グアニジンを加え、２ｍｉｎを放置し、またＡ相でクロマトグラフィックカラムを押し流す。

分子篩クロマトグラフィー：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５填料でカラムを充填し（ＧＥ会社、ＸＫ１６／７０型、即ち内径が１６ｍｍで、高度が７０ｃｍである）、填料の高度は６０ｃｍである。１００μＬの１％のアセトンで試料導入検査をし、カラム効率が１００００ほどと測定する。タンパク質は２ｍｇ／ｍｌの流速で５ｍｌの濃度に従ってローディングし、次にｐＨ７．５、ＮａＨ_２ＰＯ_４−ＮａｈＰＯ_４（５０ｍＭ）緩衝液で溶出し（図３のように）、収集ピークにサンプリングし、電気泳動とＨＰＬＣ検出を行う。

実験の結論：精製された後、タンパク質ＨＰＬＣの検出純度は９９％以上に達し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動が一条の帯である。

ｒＬＺ−８−ＨＳＡの精製方法：
ステップ（１）：固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）でｒＬＺ−８−ＨＳＡを精製して填料ＩＭＡＣＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ１リットルがＧＥ会社から購入され、ＸＫ５０/０カラムを充填し、充填高度は１５ｃｍであり、精製水で保存液を置換し、カラム体積の１倍の０．１Ｍ硫酸銅溶液でクロマトグラフィー分離し、体積の４倍の精製水で吸着されない銅イオンを押し流す。緩衝液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、０．６ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３で、カラムを平衡させる。ヒト血清アルブミンを含む発酵上清液をリン酸塩、塩化ナトリウムに加え、それが２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、０．６ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３に達させる。その後ＡＫＴＡ^ＴＭＰｕｒｉｆｙクロマトグラフィーシステムを使用してローディングし、流速は５０ｍｌ／ｍｉｎである。ローディングした後、吸収値が基点に達するまで、緩衝液Ａで洗浄する。緩衝液Ｂ：２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、０．６ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．３Ｍのイミダゾール、ｐＨ７．５で目的タンパク質を溶出し、緩衝液Ｂの溶出ピークを収集する。

ステップ（２）：疎水クロマトグラフィー（ＨＩＣ）で精製し、ステップ（１）に収集したＢ緩衝液の溶出ピークに疎水クロマトグラフィー精製を行う。フェニル疎水クロマトグラフィー媒介ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ｈｉｇｈｓｕｂ）（ＧＥ会社）で直径が５ｃｍであるクロマトグラフィーカラムを充填し、カラムの高度は１５ｃｍである。媒介を使用する前カラム体積の３倍の緩衝液Ｃ：５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡させる必要がある。ステップ（１）に得る目的タンパク質を含むＢ緩衝液の溶出溶液に脱イオン水を加え、０．５ＭＮａＣｌの濃度に希釈し、リン酸でＰＨ値を６．５まで調節する。ＡＫＴＡ^ＴＭＰｕｒｉｆｙクロマトグラフィーシステムを使用してローディングし、流速は５０ｍｌ／ｍｉｎであり、ローディングした後、カラム体積の２倍の緩衝液Ｃ：５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で溶出し続ける。フロースルーピーク及び緩衝液Ｃを用いる溶出ピークを収集する。疎水クロマトグラフィーカラムと結合する部分を、カラム体積の２倍の脱イオン水で溶出し、流出物を廃棄する。疎水クロマトグラフィーカラムの収集溶液を、最終濃度が０．１Ｍである四ホウ酸ナトリウムと塩化カルシウム溶液を加え、ｐＨを９．０まで調節し、０．５−２４時間処理し、１００００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を取り、ＭＩＬＬＴＰＯＲＥ会社の１０Ｋ超フィルターで塩出しする。

ステップ（３）：陰イオン交換クロマトグラフィーでサンプルを精製し、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭＨｉｇｈＰｒｅｆｏｒｍａｎｃｅ填料を直径が２．６ｃｍで、高度が１５ｃｍであるクロマトグラフィーカラムに詰め、填料の体積は８０ミリリットルである。カラム体積の２倍の脱イオン水で洗浄し、カラム体積の５倍の緩衝液Ｅで（５０ｍＭＰＢ、ｐＨ７．０）平衡させる。ローディングした後２つのカラム体積の緩衝液Ｅで洗浄する。その後０−０．５ＭＮａＣｌでカラム体積の１０倍の勾配で溶出し、主ピークを収集する。

実験の結論：精製された後、タンパク質ＨＰＬＣの検出純度は９９％以上であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動が一条の帯である。

実施例３異なる融合タンパク質がマウス脾細胞の増殖を促進する比較
ＷＳＴ−１方法で融合タンパク質がマウス脾細胞の増殖作用に対する影響を検出し、その生物活性の強弱を反映し、本発明はＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用い、体重が２０−２２ｇであり、首を引きマウスを屠殺し、無菌条件で脾臓を取り、事前に５ｍｌの１０％の子牛血清を含むＤＭＥＭを加えた平皿に置く：ピンセットでそれぞれ脾臓を搗き砕き、且つガーゼで組織懸濁液を濾過することで組織塊を除去し、脾細胞の細胞懸濁液を調製する：１００ミリリットルの細胞懸濁液を取って９００ミリリットルの２％氷酢酸溶液を加えて顕微鏡で計数する。２％の子牛血清を含むＤＭＥＭで細胞濃度を５＊１０^６／ｍｌまで調節する：それぞれ同じモル濃度勾配の融合タンパク質とｒＬＺ−８を調製し、３つの勾配濃度を設け、各濃度に９つの穴を設け、１００マイクロリットル／穴。細胞濃度が５＊１０^６／ｍｌの細胞懸濁液１００マイクロリットル／穴を加える。攪拌して均一に混合した後３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて２４ｈを孵化する；孵化した後ＷＳＴ−１を加え、２０マイクロリットル／穴。３７℃、５％CO₂のインキュベータに入れて３時間を孵化し続けた後、ＯＤ_４５０を測定する（ＢＩＯ−ＲＡＤマイクロプレートリーダ）。実験の結果はグラフ１を見る。

グラフ１から見ると、タンパク質濃度の増加につれ、融合タンパク質が脾細胞の増殖に対する促進作用も増加し、同じタンパク質濃度において、異なる融合タンパク質とｒＬＺ−８の増殖作用との比較から見ると、ｒＬＺ−８−ＨＳＡの脾細胞の増殖を促進する作用はｒＬＺ−８組より高いことが分かり、顕著な差異があり統計学の意味を有する。融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＦｃｌとｒＬＺ−８−Ｆｃ４のマウスの脾細胞増殖に対する促進作用は顕著に弱くなる：実験の結果が、ＬＺ−８とＨＳＡを融合した後活性部位が融合に影響されなく、ＬＺ−８とＩｇＧ−ＦｃｌとＩｇＧ−Ｆｃ４と融合された後、タンパク質の活性が影響され、ＬＺ−８活性の発揮を妨げることを説明する。

実施例４．異なる融合タンパク質の半減期検出
体重が１８−２２ｇほどであるＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して実験マウスとし、各組に１０匹のマウスがあり、融合タンパク質を１００ｇ／ｋｇ（ＬＺ−８の量で計る）の用量で静脈注射して投薬し、時間帯を２、４、６、８、１０時間に設計して異なる時間帯で採血検出を行い、結果を得、薬物濃度と時間との曲線図（図４）を製作して実験の結果から見ると、薬物がマウスの体内に入る時間の延長について、血液にある薬物の濃度が異なる程度の下落が現れ、ここにおいて、融合されたタンパク質の半減期が融合する前ｒＬＺ−８の半減期より極めて顕著な増加があり（Ｐ＜０．０００１）、血液にある薬物の濃度を大幅に延長し、ｒＬＺ−８がマウスの体内での半減期を向上させることが分かる。

実施例５．融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡが白血球減少症を治療する研究
Ｗｉｓｔａｒマウスを用いて実験動物とし、合わせて１８匹で、体重が１００ｇほどである。製剤の調製方法は以下のとおりである：ｒＬＺ−８を無菌生理的食塩水で調製する。６０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ用量組に分けられる；ｒＬＺ−８−ＨＳＡ融合タンパク質を無菌生理的食塩水で調製する。６０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１５μｇＡｇ（ＬＺ−８の量で計る）用量組に分けられる；金磊賽強「組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射液（ｒｈＧ−ＣＳＦ）」は、製品ロット番号：２０１３０４０３；７５μｇ／本、無菌生理的食塩水で１３．５μｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ／匹に調製し、シクロホスファミド（ＣＰ）を注射し、製品ロット番号は１３０２０２２５である；２００ｍｇ／本。無菌生理的食塩水で調製する：２０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ／匹、即ち２０ｍｇ／ｋｇ。

正常対照組、ｒＬＺ−８低用量組、ｒＬＺ−８中用量組、ｒＬＺ−８高用量組、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ融合タンパク質の低中高用量組、陽性対照組（金磊賽強）。正常対照組（同じ用量の生理的食塩水を与える）を除き、各組のマウスに全部シクロホスファミド尾静脈注射を与え、２０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ／匹、３日を持続する。三日目、マウスの尾から静脈採血し、細胞分析装置で白血球の数を検出する。モデル製作が成功した後上記組分けによって相応する用量のｒＬＺ−８、三種類の融合タンパク質、陽性薬（金磊賽強）治療を与え、正常対照組とＣＰ組に同じ用量の生理的食塩水を与え、治療する１日目、３日目と７日目にそれぞれマウスの尾から静脈採血し、白血球の数を検出する。治療前後白血球の数量変化を対比し、薬物の効果を分析する。

グラフ２から見ると、ＣＰ対照組と比較し、投薬する１日目にｒＬＺ−８−ＨＳＡ組にマウスの白血球が顕著に向上し、差異は極めて顕著であり、投薬する７日目基本的に正常に達する。金磊賽強と比較し、投薬する１日目に、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ組がマウスの白血球の数量増加に対する作用は顕著であり、投薬する７日目に、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ組のマウスの白血球の数量は基本的に正常に達し、重点はｒＬＺ−８−ＨＳＡ組とｒＬＺ−８タンパク質組と比較し、それから見ると、同じ薬物用量の条件において、ｒＬＺ−８−ＨＳＡが投薬する一日目に、顕著な白血球増殖を促進する作用を有し、数値にはｒＬＺ−８タンパク質の増殖数量の約２倍であり、同じ投薬時間において、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ低用量組の白血球増殖を促進する作用はｒＬＺ−８タンパク質の高用量組より顕著に高く、且つｒＬＺ−８タンパク質組がマウス白血球の増殖に対する促進作用より優れることが分かる。

実施例６、融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡのメラノーマに対する抑制作用
体外での実験：ＷＳＴ−１方法で融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡがメラノーマ細胞の成長を抑制する作用による影響を検出し、メラノーマ細胞懸濁液を調製する；１００マイクロリットルの細胞懸濁液を取って９００マイクロリットルの２％の氷酢酸溶液に加えて顕微鏡で計数する。２％の子牛血清を含むＤＭＥＭで細胞の濃度を２＊１０^５／ｍｌに調節する；それぞれ同じモル濃度勾配の融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡとｒＬＺ−８を調製し、３つの勾配濃度を設け、各濃度に９つの穴を設け、１００マイクロリットル／穴。細胞濃度が２＊１０^５／ｍｌの細胞懸濁液１００マイクロリットル／穴を加える。攪拌して均一に混合した後３７℃、５％のＣＯ_２インキュベータに入れて２４ｈを孵化する；孵化した後ＷＳＴ−１に加え、２０マイクロリットル／穴。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて３時間を孵化し続けた後、ＯＤ_４５０（ＢＩＯ−ＲＡＤマイクロプレートリーダ）を測定する。実験の結果はグラフ３を見る。

体内での実験：まず、マウス腫瘍モデルを確立し、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６−Ｆ１０は１０％の胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を選択し、３７℃、ＣＯ_２インキュベータで培養する。マウスの背側及び腹側に皮下で１ｍｌの注射器を用いてゆっくりと２００μｌ（細胞の含有量は１＊１０^７個）のＢ１６−Ｆ１０細胞懸濁液を注入し、マウス移植癌モデルを確立する。

組分けと治療手段：腫瘍細胞を接種した２４ｈ後、尾静脈注射ｒＬＺ−８組（１２３μｇ／ｋｇ、２４６μｇ／ｋｇ、４９２μｇ／ｋｇ）、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ組（ＬＺ−８の量で計る１２３μｇ／ｋｇ、２４６μｇ／ｋｇ、４９２μｇ／ｋｇ）、ダカルバジン組（２．５ｍｇ／ｋｇ）又は生理的食塩水組。ｒＬＺ−８、ｒＬＺ−８−ＨＳＡを毎日一回注射し、ダカルバジンを５日尾静脈注射し続け、３週間隔をあけて再度注射し、治療周期は２８日である。実験期間にマウスの生活状態を観察し、７日間隔をあけて一回体重を量り、２週間隔をあけてマウスに静脈採血を行い、各組の最終実験が終わる時腫瘍を剥離させ、腫瘍の重量を量り且つ記録する；腫瘍成長抑制率＝（生理的食塩水組の腫瘍重量平均値−投薬組の腫瘍重量平均値）／生理的食塩水組の腫瘍重量平均値という方式に基づき、治療薬がインサイチュ腫瘍の成長に対する抑制率を計算する。

実験の結果は以下を表明する：腫瘍の重量を量った後、各組の腫瘍重量の平均値を計算し、グラフ４から各組に２８日投薬し、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ高用量組の腫瘍重量が他の組より小さく、ｒＬＺ−８、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ組において薬物の濃度の絶えず増加につれ、皮下腫瘍の重量はどんどん小さくなることが分かる。ｒＬＺ−８−ＨＳＡ組と陰性対照組を比較して差異は極めて顕著で、ｒＬＺ−８組において低、中、高との間の差異も顕著で（ｎ＝１０、ｐ＜０．０５）、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ組において低、中、高間の差異も顕著である（ｎ＝１０、ｐ＜０．０５）。

ダカルバジン組と比較し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１三回に実験を繰り返し、結果全体の傾向は一致で、このグラフは中の一組の結果である；
実施例７融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡがマウスのＳ１８０エールリッヒ腹水腫瘍に対する抑制作用
体外での実験：ＷＳＴ−１方法を用いて融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡがマウスのＳ１８０エールリッヒ腹水腫瘍細胞の成長を抑制する作用による影響を検出し、Ｓ１８０エールリッヒ腹水腫瘍細胞懸濁液を調製する；１００マイクロリットルの細胞懸濁液を取って９００マイクロリットルの２％の氷酢酸溶液に加えて顕微鏡で計数する。２％の子牛血清を含むＤＭＥＭで細胞の濃度を２＊１０^５／ｍｌに調節する；それぞれ同じモル濃度勾配の融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡとｒＬＺ−８を調製し、３つの勾配濃度を設け、各濃度に９つの穴を設け、１００マイクロリットル／穴。細胞濃度が２＊１０^５／ｍｌの細胞懸濁液１００マイクロリットル／穴を加える。攪拌して均一に混合した後３７℃、ＣＯ_２インキュベータに入れて２４ｈを孵化する；孵化した後ＷＳＴ−１に加え、２０マイクロリットル／穴。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れて３時間を孵化し続けた後、ＯＤ４５０（ＢＩＯ−ＲＡＤマイクロプレートリーダ）を測定する。実験の結果はグラフ５を見る。

体内での実験：実験の材料：マウスであり、体重が１８−２２ｇで、吉林大学の実験動物センターで提供される。マウスエールリッヒ腹水腫瘍細胞株Ｓ１８０は本室で提供される。シクロホスファミド（ＣＴＸ）で、江蘇恒瑞医薬株式会社、ロット番号：０６１０９２１；Ｓ１８０エールリッヒ腹水腫瘍及び固形腫瘍実験組は全部正常対照組、陰性対照組、陽性対照組、ｒＬＺ−８低用量組（0.25ｍｇ・ｋｇ^-1）、ｒＬＺ−８中用量組（0.5ｍｇ・ｋｇ^-1）、ｒＬＺ−８高用量組（1ｍｇ・ｋｇ^-1）に分けられる；ｒＬＺ−８−ＨＳＡ低用量組（0.25ｍｇ・ｋｇ^-1）、ｒＬＺ−９−ＨＳＡ中用量組（0.5ｍｇ・ｋｇ^-1）、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ高用量組（1ｍｇ・ｋｇ^-1）、ｒＬＺ−８−ＨＳＡの各用量組は全部ＬＺ−８の量で計る。各組に１０匹のマウスがある。

実験方法：Ｓ１８０皮下腫瘍抑制の実験方法：成長がよいＳ１Ｓ０細胞を取り、適量の無菌生理的食塩水で腫瘍細胞懸濁液に希釈し、細胞の計数は１０^７・Ｌ^-1であり、各マウスの右脇に皮下で０．２ｍｌ接種する（正常対照組を除く）。接種した２４ｈ後、治療する。正常対照組と陰性対照組に０．２ｍｌ・匹^-1・ｄ^-1の生理的食塩水を与え、腹腔の中に注射する；陽性対照組に２０ｍｇ・ｋｇ^-1、０．２ｍｌ・匹^-1・ｄ^-1のシクロホスファミドを与え、腹腔に注射する。ｒＬＺ−８治療組にそれぞれ対応する用量の尾静脈注射を与え、０．２ｍｌ・匹^-1・ｄ^-1。１０日を持続する。それぞれ投薬する前、投薬した１０ｄ後にマウスの眼窩静脈叢から採血し、吉大一院の臨床検査室に送って白血球の数を測定する。且つ投薬を止む翌日、頸椎を脱臼させてマウスを屠殺し、解剖して腫瘍塊を取り出し、腫瘍の重量を量る。下記の公式で腫瘍抑制率を計算する：
腫瘍抑制率（％）＝（対照組の平均腫瘍重量−実験組の平均腫瘍重量）／対照組の平均腫瘍重量＊１００％
実験の結果：Ｓ１８０皮下腫瘍抑制実験の結果：グラフ６から見ると、３つの用量のｒＬＺ−８は全部Ｓ１８０の成長を抑制することができ、腫瘍抑制率はそれぞれ１６．８％、２５．７％と４５．５％であることが分かる。ｒＬＺ−８治療組の腫瘍重量は陰性対照組と比較し、全部顕著な差異（Ｐ＜０．０１）がある。ｒＬＺ−８−ＨＳＡ治療組の腫瘍重量は陰性対照組と比較し、全部顕著な差異（ｐ＜０．０１）があると同時にｒＬＺ−８治療組と比較して全部顕著な差異（ｐ＜０．０１）がある。

実施例８は融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡでシクロホスファミドによるマウスの血小板減少症を治療する薬力学実験。

実験用薬物：組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）無菌注射を水で１９．２５μｇ・ｋｇ^-1、９．６２５μｇ・ｋｇ^-1用量組に調製し、０．２ｍｌ／匹である；組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡ無菌注射を水で１９．２５μｇ・ｋｇ^-1、９．６２５μｇ・ｋｇ^-1（ＬＺ−８の量で計る）用量組に調製する。

陽性対照薬物：トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）であって、瀋陽三生製薬株式会社で生産され、７７０μｇ・ｋｇ^-1／ｄ、０．２ｍｌ／匹である。

化学療法薬物：シクロホスファミド（Ｃｙ）であって、江蘇恒瑞製薬株式会社で生産され、製品ロット番号は１２１１２１２１である；２００ｍｇ／本。無菌注射を水で１００ｍｇ・ｋｇ^-1に調製し、０．２ｍｌ／匹である。

血小板シンナー：尿素：１．３ｇ、クエン酸ナトリウム：０．５ｇ、ホルムアルデヒド：０．１ｍｌ、１００ｍｌまで蒸留水を加えて混合し、濾過して必要に備える。

実験の方法：実験動物を５組に分け、各組に１０匹のマウスがあり、メスとオスは半々である。正常対照組（同じ体積の生理的食塩水を与える）を除き、各組のマウスは全部腹腔にシクロホスファミドを注射し、１００ｍｇ・ｋｇ^-1、０．２ｍｌ・匹^-1・ｄ^-1、3日を持続する。血小板の数が３００＊１０^９／Ｌ以下に下がる時、上記組分けによって対応する用量のｒＬＺ−８と融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡ（１９．２５ｕｇ・ｋｇ^-1、９．６２５μｇ・ｋｇ^-1０．２ｍｌ・匹^-1・ｄ^-1）及び陽性薬物（ＴＨＰＯ７７０μｇ・ｋｇ^-1、０．２ｍｌ・匹^-1・ｄ^-1）で皮下にて治療し、正常対照組とモデル組（ＣＰ）に同じ体積の生理的食塩水を与え、治療する３ｄ目と７ｄ目、１４ｄ目にそれぞれマウスの尾から静脈採血し、高倍率のレンズで血小板の数を計り、実験の結果はグラフ７を見る。

実験の結果：モデル組と比較し、各薬物用量組に各マウスが投薬される３日目血小板の数は顕著に向上し、投薬される７日目基本的に正常に達し、且つ顕著な差異がある（ｐ＜０．０５）；ｒＬＺ−８−ＨＳＡ各組の血小板の数量は顕著に増し、投薬される３日目基本的に正常に達し、モデル組と比較して顕著な差異がある（ｐ＜０．０５）。統計学意味を有する。

実施例９：ｒＬＺ−８−ＨＳＡ抗がん組成物製剤
1．上記薬理実験によって、ｒＬＺ−８−ＨＳＡの抗がん作用と生体の白血球レベルを維持する効果は顕著であり、且つ副作用がないことが証明され、このため、ｒＬＺ−８−ＨＳＡが薬物として使用することに適し且つ安全であると考えられる。

２．本発明のｒＬＺ−８−ＨＳＡが抗がん薬物とする応用は経口と非経口にて投薬することができる。用量は病状、年齢、体重などの素子で決められる。大人にとって、内服し、一人各剤１０−１０００ｍｇで、毎日数回する；非経口投薬は１０−１００ｍｇで、毎日数回する。

３．本発明の経口薬包み錠剤、丸薬カプセル（硬カプセルと軟カプセルを含む）は、これらの剤型がｒＬＺ−８と少なくとも一種類の不活性シンナー（乳糖、マンニット、葡萄糖、澱粉、ポリビニルピロリドンなど）を含む同時に不活性シンナーを除く潤滑剤、崩壊剤、安定剤など薬物学に受けられる添加物を加えることもできる。必要であれば、胃溶又は腸溶材料で錠剤又は丸薬に一層又は一層以上のフィルムを塗ることができる。非腸管服用注射剤はｒＬＺ−８−ＨＳＡ及び少なくとも一種類の不活性シンナー（注射用蒸留水、生理的食塩水など）を含み、またｒＬＺ−８−ＨＳＡを凍結乾燥粉に製造し、使用する前それを不活性シンナーに溶解させて注射に使用する。

（１）製剤例１
１０００ｍｇのｒＬＺ−８−ＨＳＡを取り、１００ｍｌの無菌生理的食塩水に溶解させ、均一に混合した後、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ濃度が１０ｍｇ／ｍｌ／本である注射液に分けて薬瓶に詰め、密封し、殺菌して製品を生成する。他の項目は中華人民共和国薬局方２０１０年版の注射液項目に合致するべき。

（２）製剤例２
１００ｇのｒＬＺ−８−ＨＳＡ、０．５ｋｇの薬用澱粉を取って公知のカプセル製造技術と設備によって、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ１０ｍｇ／錠のカプセルを製造する。他の項目は中華人民共和国薬局方２０１０年版のカプセル項目に合致するべき。

（３）製剤例３
１００ｇのｒＬＺ−８−ＨＳＡ、５６０ｇの微結晶性セルロース、３８０ｇの無水乳糖、２００ｇのステアリン酸マグネシウムを取り、公知の錠剤製造技術と設備によって、ｒＬＺ−８−ＨＳＡ１０ｍｇ／錠の錠剤を製造し、他の項目は中華人民共和国薬局方２０１０年版の錠剤製造項目に合致するべき。

（４）製剤例４
適量のｒＬＺ−８−ＨＳＡを取り、中華人民共和国薬局方２０１０年版の経口液体項目によって、公知の製造技術と設備によって経口液体を製造する。

図１は６６ｈと７２ｈに誘導発現して各融合タンパク質の発現状況図２は異なる融合タンパク質ＷｅｓｔｅｒｎＢｏｌｔの鑑定クロマトグラム図３はｒＬＺ−８−ＨＳＡ融合タンパク質の分子篩精製クロマトグラム図４は異なる融合タンパク質とｒＬＺ−８タンパク質の体内での半減期の対

Claims

配列番号１に一致するアミノ酸配列からなり、
組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質のＣ末端が、ペプチドＧＧＧＧＳＳを介して、ヒト血清アルブミンに融合されている、
組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質およびヒト血清アルブミンの融合タンパク質（ｒＬＺ−８−ＨＳＡ）。
請求項１に記載の融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡを使用することを含んでいる、化学療法薬による白血球減少症を治療する薬物を製造するための方法。
請求項１に記載の融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡを使用することを含んでいる、メラノーマおよび肝癌を治療する薬物を製造するための方法。
請求項１に記載の融合タンパク質ｒＬＺ−８−ＨＳＡを使用することを含んでいる、血小板減少症を治療する薬物を製造するための方法。
請求項１に記載の融合タンパク質、および薬学に認められる補助剤を含んでいる、薬物製剤。
経口液体、錠剤、丸薬およびカプセルを含む経口剤形、または
付け薬および注射剤を含む非経口剤形にて投与される、請求項５に記載の薬物製剤。