CN111548425A - 一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属基因工程生物技术领域,具体公开了一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的设计、制备方法及其药学应用。该肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体是由带有环状结构并含有NGR序列的短肽、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成融合蛋白质,通过基因工程方法通过克隆构建该变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化而生产。通过该肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体制备方法生产的变体具有很好的肿瘤组织靶向性,并且显著增强的抗肿瘤效果,能够降低获得治疗效果所需要的蛋白质给药剂量,提高其生物利用度,降低治疗成本和克服肿瘤坏死因子相关凋亡配体潜在的毒副作用。同时本发明中肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的生产方法提供一种生产可溶性、高聚体形式含量的表达方法和简便的分离纯化工艺。
Description
本申请是基于原申请的分案申请,原申请的申请号为201110187700.2,申请日为2011年7月6日,发明名称为一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用。
技术领域
本发明属基因工程生物技术领域,涉及一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的制备及其药学应用。
背景技术
肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一个成员。与肿瘤坏死因子超家族其它成员类似,可溶性形式的肿瘤坏死因子相关配体以三聚体形式与靶细胞表面三聚体化的受体分子结合而发挥生物学功能。肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的作用是通过与肿瘤细胞上的死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)的相互作用传递死亡信号而实现的。虽然肿瘤坏死因子超家族的其它成员由于具有全身性的毒副作用而使应用受到限制,但是肿瘤坏死因子相关凋亡配体是一个相对安全、具有肿瘤选择性的抗肿瘤物质。肿瘤坏死因子相关凋亡配体在体外能诱导多种肿瘤细胞和癌化细胞的凋亡,并且在小鼠的移植异种肿瘤,包括结肠癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神经胶质瘤、前列腺癌等多种模型中具有较好的抗肿瘤活性。尤其重要的是,在小鼠和非人类灵长类动物中全身给药时,TRAIL表现出较小或没有毒性。基于以上原因,重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体已经在进行肿瘤治疗的临床研究。
但是近来一些报道显示:除了诱导肿瘤细胞的凋亡外,肿瘤坏死因子相关凋亡配体还涉及到天然免疫和获得性免疫,和自身免疫性疾病相关。例如,近来的研究报道表明它在胸腺的发育过程中调节负向选择或凋亡胸腺细胞,并且在诱发自体免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外,肿瘤坏死因子相关凋亡配体的受体在整个身体广泛性表达,肿瘤坏死因子相关凋亡配体还参与肝细胞死亡和肝炎。因此在临床上重复、全身性使用大剂量外源性肿瘤坏死因子相关凋亡配体蛋白可能会导致不可预料的免疫结果。这些报道使科学家非常担心肿瘤坏死因子相关凋亡配体在临床中重复和持久使用时产生潜在的副作用。如何在肿瘤治疗时,避免肿瘤坏死因子相关凋亡配体对其它组织的毒副作用,这是肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)在潜在的临床应用中面临的难题。
发明内容
为克服野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗方面所面临的缺陷,本发明目的在于:发明一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,将其靶向输送到肿瘤组织中,以此提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的疗效,降低其毒副作用,从而能在治疗肿瘤疾病中得到应用。
氨基酞酶N(Aminopeptidase N,APN)/CD13蛋白是一种经研究证明只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上的蛋白质(Pasqualini R,Koivunen E,Kain R等,Cancer Res.2000,60:722-727),处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达CD13,近年来发现氨基酞酶N/CD13也与肿瘤的转移和预后相关联(Haraguchi N,Ishii H,Mimori K等,J ClinInvest.2010,120:3326-3339;Fontijn D,DuyndamMC,van Berkel MP等,Br JCancer.2006,94:1627-1636;Fujii H,NakajimaM,Saiki I等,Clin ExpMetastasis.1995,13:337-344)。
为达到实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体肿瘤组织靶向输送,提高其抗肿瘤疗效、降低其毒副作用的目的,本发明是通过以下技术方案来实现的:
一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,是具有序列表中序列1氨基酸残基序列的蛋白质,它是通过基因工程方法构建由CD13的配体、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质,即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化。所述CD13的配体可以是一种含有NGR序列的多肽,优选为一种带有环状结构的、含有NGR序列的多肽,例如短肽CNGRC。
上述的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所构成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体之间可以添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽,其中,短肽为1-25个氨基酸残基,主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。
上述的CD13的配体放置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体N端时,在CD13的配体之前增加一个不含支链的氨基酸,主要是丙氨酸或甘氨酸,以防表达时出现的N端氨基酸降解,影响CD13配体的功能。
所述合成的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所组成肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在制备肿瘤治疗药物中具有良好的应用。以上述肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体制备的肿瘤治疗药物与现有化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法在肿瘤治疗中能够得到联合运用。
进一步地,一种在大肠杆菌中可溶性表达和简便分离纯化大量的、高纯度肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的聚体的方法。尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达多为无生物活性的包涵体产物,而本发明中的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂,因此在大肠杆菌中表达时,其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本发明采用了低温下培养和诱导表达肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法,使得表达产物有效避免了包涵体的形成;本发明同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子的生物功能,利用离子交换层析和金属亲和层析相结合使得肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋白质产物,而且纯化产物具有高比例的聚体形式,因此具有非常好的生物活性。其中低温指35℃-10℃。
CD13只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上,处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达。最近的研究证实,CD13蛋白受碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)调节,选择性高表达于1F6恶性黑色素瘤等肿瘤细胞表面,并且与肿瘤的恶性侵润和转移密切相关。我们用流式细胞仪分析了CD13在不同细胞中的表达水平,结果表明:人微血管内皮细胞高水平表达CD13,人宫颈癌细胞Hela肿瘤细胞CD13表达水平也较高,结肠癌细胞HCT-15表达中等量的CD13分子,结肠癌细胞COLO-205表达极微量或不表达CD13分子。上述由CD13配体、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以大大提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的分布、实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的靶向输送、大大提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的抗肿瘤效果、同时显著降低肿瘤坏死因子相关凋亡配体的用量。
同时编码公开肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA,它可以通过肿瘤坏死因子相关凋亡配体的dDNA增加编码的CD13配体和连接肽的DNA序列制备。上述组成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA可用于基因治疗。
本发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以通过采用聚乙二醇、脂肪酸化、重组加上抗体Fc片段或白蛋白等方法修饰,从而延长肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的半衰期,达到更好的药代动力学效果。
同已有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体相比,本发明具有的有益效果:
(1)更好的肿瘤组织靶向性:现有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肿瘤组织的相对选择性作用主要是利用肿瘤组织表达的死亡受体4和死亡受体5来显示实现的,而本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体除了利用肿瘤组织表达的死亡受体4和死亡受体5之外,还利用肿瘤组织丰富表达CD13的特点,从而更为有效地实现了肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织的靶向输送。
(2)更为高效的抗肿瘤效果:由于实现了肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的靶向投递,本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体无论是与相同剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体相比、还是与靶向于肿瘤细胞表面的整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL(中国发明专利申请号:200710133862.1)相比,无论在单独使用、还是与现有的化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法联合使用时都表现出具有更好的抗肿瘤效果。
(3)更低的使用剂量:由于肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体比相同剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有更好的抗肿瘤效果,因此在使用时,能够在保证相同抗肿瘤疗效的情况下,大大降低肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质的用量。肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质给药剂量的降低将能够克服肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗中潜在的副作用,同时可以降低肿瘤患者的治疗费用,达到高效、低毒副作用、低成本肿瘤治疗的效果。
(4)便于表达和生产:与通过肿瘤细胞特异性抗体及其抗体片段靶向的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白质不同,本专利发明将肿瘤坏死因子相关凋亡配体与CD13的短肽配体相融合,分子量增加不大,从而更有利于肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的基因克隆、表达和生产,产量更高。
(5)可溶性的表达和简易的分离纯化:尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物,而本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂,因此在大肠杆菌中表达时,其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本发明采用了低温下培养和诱导表达肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法,使得表达产物有效避免了包涵体的形成;本发明同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子的生物功能,将金属亲和层析和离子交换层析方法相结合使得肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋白质产物。本发明专利通过可溶性表达和简易分离纯化方法的优化最终导致纯化产物具有高比例的聚体形式,从而保证了获得的产物具有非常好的生物活性。生产高比例聚体形式的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,这是本发明与同类研究的显著区别。本发明提供了一种有效表达和高效获得高的聚体含量的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法和纯化工艺。
(6)在CD13配体的N端增加一个不含支链的氨基酸,有效防止了表达时出现的N端氨基酸出现降解,从而影响CD13配体功能的情况。
附图说明
图1.纯化的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡配体及变体分析
1A.SDS-PAGE分析结果:1、靶向于CD13的肿瘤靶向性人肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(NGR-L-TRAIL);2、人肿瘤坏死因子相关凋亡配体;3、靶向于整合素αVβ3、αVβ5的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(RGD-L-TRAIL);
1B.非还原、非变性PAGE分析结果:1、靶向于CD13的肿瘤靶向性人肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(NGR-L-TRAIL);2、人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL);3、靶向于整合素αVβ3、αVβ5的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(RGD-L-TRAIL)。
图2.流式细胞仪分析绿色荧光素标记的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)与人微血管内皮细胞的结合。
NGR-L-TRAIL及其TRAIL、RGD-L-TRAIL、小牛血清白蛋白(BSA)对照蛋白用FITC荧光素标记。人微血管内皮细胞(HDMVEC)用1微克的标记蛋白标记1小时。
图3.COLO-205细胞表面CD13和整合素αVβ3、αVβ5的表达分析。
3A:CD13的表达分析;3B:整合素αVβ3的表达分析;3C:整合素αVβ5的表达分析。
图4.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)诱导各种肿瘤细胞凋亡的量效关系分析。
4A、Hela细胞;4B、COLO-205细胞;4C、HCT-15细胞。
图5.分光光度法检测人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)对CD13阳性Hela细胞Caspase-8和Caspase-3酶活的影响。
5A:Caspase-8;5B:Caspase-3。
细胞分别用10~270纳克/毫升浓度梯度的肿瘤靶向性变体NGR-L-TRAIL和RGD-L-TRAIL蛋白分别处理Hela细胞8小时,诱导后细胞冰上裂解,加入荧光底物反应1小时,然后用酶标仪检测分析(激发波长400nm,发射波长505nm)。
图6.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)在COLO-205肿瘤模型上单独治疗以及与CPT-11联合治疗的抗肿瘤效果。
6A:人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL),以及RGD-L-TRAIL单独治疗;
6B:人肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体与CPT-11联合治疗。数据统计分析结果用平均数表示;方差为标准误;星号*表示p<0.05;两个星号**表示p<0.01。
图7.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)在HT-15结肠癌肿瘤模型上单独治疗以及与CPT-11联合治疗的抗肿瘤效果。
7A:人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)单独治疗;
7B:人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)与CPT-11联合治疗。数据统计分析结果用平均数表示;方差为标准误;星号*表示p<0.05;两个星号**表示p<0.01。
图8.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)在TRAIL不敏感的HT-29结肠癌肿瘤模型上单独治疗以及与CPT-11联合治疗的抗肿瘤效果。
图9.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其变体(NGR-L-TRAIL)、以及RGD-L-TRAIL在COLO-205肿瘤动物模型中在肿瘤组织的靶向富集效果比较分析。
含有COLO-205肿瘤的裸鼠分别尾静脉注射100微升/5微居125I-标记的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体蛋白。在注射5、30、60、120和240分钟后,分别剥离肿瘤组织并称重,用液闪计数仪测定肿瘤组织同位素的放射量,肿瘤组织的放射量单位为每克组织测定放射量与注射放射量的百分比(%ID/g),所有结果为三次独立实验的平均值。
图10.125I同位素标记检测的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其变体(NGR-L-TRAIL)在动物器官组织中的分布。
具体实施方式
实施例1
肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的制备
利用计算机辅助结构模拟和分子设计,在SGI计算机工作站上,利用MSI公司的分子设计软件(InsightII、Discover等模块),在肿瘤坏死因子相关凋亡配体晶体结构的基础上,对肿瘤坏死因子相关凋亡配体的N-末端添加CD13配体短肽,进行分子模建和分子设计,确定连接肽的氨基酸长度。
在上述分子设计的基础上,我们首先选择了连接肽为5个甘氨酸的设计方案,因为计算机模拟显示:此方案连接肽较短,对肿瘤坏死因子相关凋亡配体蛋白质的结构、以CD13配体与CD13的结合都可能产生较大的影响。其它设计方案的连接肽大多都使得CD13配体与肿瘤坏死因子相关凋亡配体的分子表面有一段距离,因此这种干扰和影响要小很多。
我们同时也尝试表达了连接肽为丙氨酸或甘氨酸、丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的短肽的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,以及含有以上三个重复的甘氨酸-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)3的25个氨基酸残基的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,都获得了相似的结果,从而证明了计算机分子设计的正确性。相形之下,添加了五个半胱氨酸的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体表达水平最高(100mg/L),其它变体的表达水平略低,但都在50-100mg/L左右的水平。
在肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的计算机辅助分子设计中,我们利用对肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体进行了结构模拟和分子设计,在肿瘤坏死因子相关凋亡配体晶体结构的基础上,对肿瘤坏死因子相关凋亡配体与CD13配体之间的连接肽氨基酸序列和长度进行分子模建和分子设计,确定连接肽的氨基酸长度。结果发现:在计算机分子设计时计算的添加1-25个氨基酸短肽长度内,只要短肽由不含支链的、柔性较大的氨基酸残基、例如:甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等组成,都不会对肿瘤坏死因子相关凋亡配体的结构产生任何影响,也不会影响CD13配体的功能;而且在分子动力学所计算的不含支链、柔性较大的25个氨基酸短肽长度范围内,短肽长度越长,对肿瘤坏死因子相关凋亡配体的结构产生的扰动越小;相对来说,长度过短时可能对肿瘤坏死因子相关凋亡配体蛋白质的结构产生一定的影响,也可能影响CD13配体与CD13的结合。
野生型人肿瘤坏死因子相关凋亡配体基因由从人胎盘中获得的信使RNA反转录获得。融合有CNGRC短肽的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体基因的PCR引物的核苷酸序列为:
引物1:
5’-GGAATTCCATATGTGCAATGGTCGTTGCGGTGGTGGTGGTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’;
引物2:5’-ATGGATCCTTAGCCA ACTAAAAAGGCCC-3’。
通过PCR反应获得编码CNGRC短肽和5个甘氨酸组成的连接肽的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(NGR-L-TRAIL)基因。肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(NGR-L-TRAIL)基因克隆在Novagen公司的pET-23a表达载体中。获得的重组表达质粒在埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。为了获得肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL的可溶性表达,表达条件如下:将过夜生长的重组表达菌100倍稀释于LB培养基中,37℃培养2.5小时,然后再在24℃下培养1-2小时,在24℃下加入IPTG至0.5mM,然后细菌在24℃下诱导表达过夜。细菌经离心后,悬浮于裂解液(50mM磷酸钠,0.5M氯化钠,1mM二硫苏糖醇,pH 7.6)中超声波破碎。
重组肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL蛋白质经过上清通过SP-sepharose阳离子树脂纯化,收集300mM NaCl洗脱峰。洗脱蛋白经Ni-NTA琼脂糖凝胶介质(Qiagen公司)亲和层析进一步纯化,用250兵mM咪唑洗脱,然后用SephdexG-25脱盐。实验中所有用到的水均为除去内毒素的超纯水,蛋白质定量用南京建成生物工程研究所提供的BCA蛋白测试试剂盒测定。肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体蛋白质的纯度和分子量用SDS-PAGE电泳银染方法检测,分子量经质谱分析鉴定(Applied Biosystems4700Proteomics Analyzer)。
靶向于整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL的构建、表达与纯化按照中国发明专利申请200710133862.1进行。
在以往的报道中,野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达时,常常会以无生物活性的包涵体产物形式存在;本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体增加了4个半胱氨酸(即增加两对二硫键),该变体在大肠杆菌中表达时应当比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更加容易形成无生物活性的包涵体产物、纯化将更为困难。本发明通过优化表达条件和分离纯化过程、成功地实现了肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体以可溶性形式表达,而且经过阳离子树脂层析和镍金属亲和层析,纯化获得了具有生物活性的、高纯度的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质,产率为100毫克/升。变性还原条件下的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析(图1A)和质谱测序分析都证明表达产物的正确性。而且在本专利的表达条件和纯化工艺下,肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体具有很高的聚体比例(图1B),这一点在肿瘤坏死因子相关凋亡配体表达和纯化的同类工作中是难得一见的。
肿瘤坏死因子超家族蛋白都有形成单体、二聚体和三聚体的特性,并且它们的生物学活性依赖于二聚体和三聚体形式,肿瘤坏死因子相关凋亡配体也不例外。为了检测融合CNGRC结构域后是否对肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体形成聚体的能力产生影响,非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示:重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体蛋白具有形成聚体的能力。结果显示肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体蛋白、以及RGD-TRAIL都有分子量约为20,000、40,000和60,000道尔顿左右的三个条带,这三个分子量的条带对应于单体、二聚体和三聚体(图1B)。这证明:本专利表达、纯化的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体蛋白确实具有正确的空间结构、比以往报道的大肠杆菌表达的TRAIL具有更好的生物活性。
实施例2
肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体与内皮细胞结合实验
肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体NGR-L-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL变体分别用荧光素(Sigma公司)进行标记,标记好的蛋白经过Sephadex-G25分子筛除去游离的荧光素。人包皮微血管内皮细胞经胰蛋白酶消化后,用含2%的胎牛血清的冰冷磷酸缓冲液洗两遍,然后重新悬浮,加入1微克的标记蛋白,在4℃冰育1小时。实验采用荧光素标记的小牛血清白蛋白作对照。染色好的细胞洗三遍后用流式细胞仪(Becton Dickinson公司)分析结合能力。
我们还进一步评价了荧光素标记的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体NGR-L-TRAIL、以及靶向于整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL(中国发明专利号:ZL200710133862.1)直接与人包皮微血管内皮细胞结合的能力。流式细胞仪检测结果显示:肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL与人包皮微血管内皮细胞的结合能力远远高于肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其靶向于αVβ3和αVβ5受体的变体RGD-L-TRAIL。这些结果表明:CD13的配体短肽显著提高肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体与血管内皮细胞特异性结合的能力,该肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL与血管内皮细胞特异性结合的能力甚至明显高于整合素αVβ3和αVβ5配体短肽所提高的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体RGD-L-TRAIL与血管内皮细胞特异性结合的能力(图2)。人微血管内皮细胞表面的表达有CD13和整合素αVβ3和αVβ5是不同的研究者所分别发现的,本专利首次在同一个实验系统中比较了人微血管内皮细胞表面的CD13与整合素αVβ3和αVβ5的丰度,发现CD13的表达丰度明显高于整合素αVβ3和αVβ5的丰度,从而发现CD13是一个比整合素αVβ3和αVβ5更好的人微血管内皮细胞的定向靶分子。整合素αVβ3和αVβ5在国际上是最受公认的新生血管的标志物,含有RGD序列的配基目前已经广泛被用来作为诊断肿瘤前期生长和肿瘤早期转移的探针,本发明则在国际上首次证明CD13是一个比整合素αVβ3和αVβ5更好的肿瘤靶分子,用CD13作为肿瘤靶向能够产生比整合素αVβ3和αVβ5好得多的效果,这是出乎同行科学家意料之外的结果,也是出乎发明意料的结果,这是本发明最重要的创新之一。
实施例3
CD13和整合素αVβ3、αVβ5的表达分析
细胞表面的CD13或整合素表达丰度用间接标记法用流式细胞仪分析检测。消化后的细胞用含2%胎牛血清的冰冷磷酸缓冲液洗两遍,细胞重新悬浮后在冰上包被抗人CD 13单克隆抗体(eBioscience公司)或抗人αVβ3整合素抗体MAB23C6(eBioscience,公司)或抗人αVβ5整合素抗体MAB 1961(Chemicon International公司)1小时,阴性对照采用纯化的同型鼠免疫球蛋白G(eBioscience公司)。一抗包被的细胞洗两遍后,加入绿色荧光素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白G1(γ)(Caltag Laboratories公司)二抗避光标记30分钟。然后洗三次,再用含4%福尔马林的磷酸缓冲液洗固定,最后在流式细胞仪上检测分析CD13或整合素αVβ3、αVβ5表达的丰度,所有的染色实验重复三次。
CNGRC是能够形成两对二硫键的、具有环状结构的、含有NGR序列的CD13的配体,它具有较好的CD13的亲和性和选择性。由于本发明是针对CD13进行设计靶向的,我们首先分析内皮细胞和肿瘤细胞表面的CD13表达情况。流式细胞仪分析结果显示:人包皮微血管内皮细胞表面表达高水平的CD13,人包皮微血管内皮细胞表面CD13表达水平甚至高于整合素αVβ3和αVβ5的表达水平;此外值得注意的是:多种肿瘤细胞也有不同程度的CD13的表达,其中HDMVEC和Hela具有高水平的CD13表达、结肠癌HCT-15表达中等丰度的CD13、结肠癌COLO-205的CD13表达量极微弱或不表达。
肿瘤新生血管及肿瘤细胞表面表达CD13、以及整合素αVβ3、αVβ5,但是至于CD13与整合素αVβ3、αVβ5相比较,到底哪一个是更好的肿瘤靶向性靶点?从未有人对此做过详细的研究和对比。本发明专利仔细地比较了肿瘤新生血管及肿瘤细胞表面CD13、以及整合素αVβ3、αVβ5的表达水平,并且在细胞和动物模型水平评价了分别靶向于CD13的TRAIL变体NGR-L-TRAIL和靶向于整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL的抗肿瘤活性,获得了令人惊讶的、与预期结果相反的结果。本发明专利比较了COLO-205表面的CD13和整合素αVβ3、αVβ5的表达情况,发现:COLO-205表面几乎不表达CD13分子,但是表达低水平的整合素αVβ3和高水平的整合素αVβ5(图3)。与此相印证,靶向于CD13的TRAIL变体NGR-L-TRAIL诱导COLO-205细胞凋亡的活性略有增加(图5B),而靶向于整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL诱导COLO-205细胞凋亡的活性提高了10倍(对于COLO-205细胞,TRAIL的半致死剂量为3.5纳克/毫升;RGD-L-TRAIL的半致死剂量为0.37纳克/毫升)。因此无论从COLO-205细胞表面的靶标的表达水平、还是从NGR-L-TRAIL和RGD-L-TRAIL对于COLO-205细胞半致死剂量的增加水平,RGD-L-TRAIL都远优于NGR-L-TRAIL。照此推理,在COLO-205肿瘤模型体内,RGD-L-TRAIL的抗肿瘤效果应该明显好于NGR-L-TRAIL。但是在体内COLO-205肿瘤模型实验中,NGR-L-TRAIL的抗肿瘤效果明显优于相同剂量(100微克)的RGD-L-TRAIL,甚至于1/5剂量(20微克)的NGR-L-TRAIL的抗肿瘤效果基本等同于5倍剂量(100微克)的RGD-L-TRAIL的抗肿瘤效果。上述结果清楚地告诉我们:抗肿瘤药物的体内抗肿瘤生物活性是无法根据其体外的实验活性和人们的常规逻辑和理解进行推测和演绎的,是必须经过踏踏实实的科学实验一步一步进行验证,每一个层次的实验都缺一不可。在本专利中,体外的多个实验都显示RGD-L-TRAIL的抗肿瘤活性会显著优于NGR-L-TRAIL,但是体内肿瘤动物模型的抗肿瘤实验却给出了截然不同的结果。
实施例4
膜联蛋白(Annexin V)和碘化吡啶(PI)双染色法检测细胞凋亡
将经过肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体NGR-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL变体处理过的细胞经过胰蛋白酶消化后,从培养板上吸出,用磷酸缓冲液洗两遍,300g离心力下离心5分钟,弃上清,然后用100微升结合缓冲液重新悬浮,加入终浓度为2微克/毫升的Annexin V-FITC(BD Pharmgen公司)室温孵育,10分钟后补充400微升的结合缓冲液,将细胞转移到流式分析管内,每管加入1微克的碘化吡啶(Sigma公司)。细胞在30分钟内用流式细胞仪分析。每个细胞系至少重复三次实验。
我们使用COLO-205、HCT-15和HT-29肿瘤细胞分别评价了肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的活性(图4)。肿瘤细胞经过一系列浓度梯度的TRAIL变体或TRAIL诱导处理后,用Annexin V-FITC和PI双染色的方法、用流式细胞仪检测分析。结果显示:不同的肿瘤细胞对TRIAL的敏感程度有差异。COLO-205细胞最为敏感,HCT-15细胞其次,Hela细胞相对不敏感。但是在Hela肿瘤细胞中,NGR-L-TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的活性显著提高,NGR-L-TRAIL对Hela细胞半致死剂量(EC50)约18.5纳克/毫升,TRAIL对Hela细胞半致死剂量(EC50)约145纳克/毫升,NGR短肽的加入使得Hela细胞对TRAIL的敏感性提高了8倍;而对于COLO-205和HCT-15肿瘤细胞,NGR-L-TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡的活性比TRAIL稍高一些。NGR-L-TRAIL和TRAIL对这些肿瘤细胞诱导凋亡程度的差异与肿瘤细胞表面的CD13分子的表达及丰度是正相关的。在CD13高表达的Hela肿瘤细胞,NGR-L-TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡活性的显著提高源于NGR-L-TRAIL中的NGR结构域能够将TRAIL变体蛋白导向到靶细胞的表面、在细胞表面富集、从而增加了靶细胞表面肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的局部浓度,使变体分子中的肿瘤坏死因子相关凋亡配体部分更加便利、频繁和有效地接近TRAIL受体,近而增强了其激活细胞凋亡通路的信号,从而增强了NGR-L-TRAIL的活性。并且,这种细胞凋亡活性增强的程度取决于肿瘤细胞表面CD13表达的丰度,丰度高的活性增强程度高,反之也亦然。例如,在CD13高表达的Hela肿瘤细胞中,由于CD13表达量高,NGR-L-TRAIL的活性提高了8倍(图4)。而对于CD13表达较低的COLO-205结肠癌细胞,NGR-L-TRAIL的活性提高极少。以上结果清晰地表明:肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL活性的提高是由于CNGRC的靶向性而获得的。
实施例5
Caspase-8和Caspase-3酶活测定
Caspase-8和Caspase-3酶活测定用荧光检测试剂盒测定(Oncogene公司),实验方法依据厂家提供的方法。荧光值由酶标仪检测,荧光参数为:激发波长400nm,发射波长505nm。
与肿瘤细胞不同,正常的人包皮微血管内皮细胞、293T肾细胞与原代的肝细胞用300纳克/毫升的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体处理24小时,也不能观察到明显的细胞毒性。这说明肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体能够区分正常细胞和肿瘤细胞,可以诱导肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞是相对安全。
我们用荧光法检测了肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体处理后Hela细胞中的Caspase-8和Caspase-3的活性,与相同剂量的TRAIL相比,NGR-L-TRAIL显示出更高的Caspase-8和Caspase-3的活性(图5A、5B)。这说明由于NGR-L-TRAIL中的NGR结构域能够将TRAIL变体蛋白导向到靶细胞的表面、在细胞表面富集、从而增加了靶细胞表面肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的局部浓度,使变体分子中的肿瘤坏死因子相关凋亡配体部分更加便利、频繁和有效地接近TRAIL受体,近而增强了其激活细胞凋亡通路的信号。在FADD-/-和Caspase-8-/-突变的Jurkat细胞中,肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体都不能检测到诱导细胞凋亡。这说明肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体一样,都是通过受体-FADD-Caspase-8途径发挥诱导细胞凋亡作用的。
实施例6
肿瘤动物模型的抗肿瘤疗效实验
5-6周龄的雌性裸鼠购于上海实验动物中心。裸鼠先尾静脉注射100微克封闭自然杀伤性细胞的特异抗体一纯化的Asialo GM-1抗体(日本Wako Chemicals公司)。24小时后,在裸鼠背部右上侧皮下接种10万个COLO-205、HT-15或HT-29结肠癌细胞。当肿瘤达到70立方毫米时,随机分组,开始治疗。重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体NGR-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL变体蛋白经腹腔给药,每天一次,连续10到14天。水溶性的喜树碱CPT-11(11-羟基-喜树碱;商品名:开普托;Pharmacia/Upjohn公司产品)每周静脉给药一次,共给两次。重组蛋白和喜树碱均用磷酸缓冲液稀释。肿瘤的大小用游标卡尺进行测量,计算公式为:长乘以宽的平方除2。
我们在无胸腺的裸鼠中用COLO-205和HT-15两种结肠癌模型来测试和比较肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体NGR-L-TRAIL的抗肿瘤活性。因为COLO-205和HCT-15结肠癌都对TRAIL敏感(其中COLO-205最为敏感),我们在这两个模型上评价单独NGR-L-TRAIL对比TRAIL的治疗效果。实验结果如图4、6所示,NGR-L-TRAIL极其显著地抑制肿瘤的生长,抑制肿瘤生长的效果明显强于野生型TRAIL和RGD-L-TRAIL。
在COLO-205模型中,100微克/天剂量的NGR-L-TRAIL抑制肿瘤的生长的程度远大于100微克/天的野生型TRAIL(p<0.01);100微克/天剂量的NGR-L-TRAIL抑制肿瘤生长的程度也大于100微克/天的RGD-L-TRAIL(p<0.05);即使NGR-L-TRAIL剂量降低到野生型的1/5后(20微克/天),抑制肿瘤生长效果优于野生型TRAIL(100微克/天)(p<0.05);20微克/天剂量的NGR-L-TRAIL抑制肿瘤生长效果已经将近于100微克/天剂量的RGD-L-TRAIL抑制肿瘤生长的效果(图6)。
HCT-15模型中,相同剂量处理下(400微克/天),NGR-L-TRAIL比野生型TRAIL抑瘤效果好(p<0.05),也优于RGD-L-TRAIL(p<0.05);当NGR-L-TRAIL(80微克/天)的给药剂量降低到野生型TRAIL的1/5时,其抑瘤效果与野生型TRAIL(400微克/天)相当(两者之间没有显著性)(图7)。80微克/天给药剂量的NGR-L-TRAIL的抑瘤效果已经接近于400微克/天的RGD-L-TRAIL的抑瘤效果。在治疗过程中,NGR-L-TRAIL抑制肿瘤的生长具有剂量依赖性。
以上结果表明:将CNGRC肽与TRAIL融合后显著性提高了TRAIL的体内抗肿瘤活性,不仅如此,NGR-L-TRAIL的抗肿瘤效果明显强于RGD-L-TRAIL。
本发明还探讨了肿瘤靶向性TRAIL变体与化疗药物CPT-11联合使用的抗肿瘤效果。使用无胸腺裸鼠的COLO-205、HCT-15和HT-29结肠癌模型来评价NGR-L-TRAIL与化疗药物CPT-11联合后在体内的抗肿瘤效果。其中COLO-205、HCT-15是TRAIL敏感型的,并且COLO-205最为敏感,而HT-29是TRAIL不敏感型。NGR-L-TRAIL或TRAIL每天腹腔注射蛋白一次,共注射两周,CPT-11每两天尾静脉注射一次,共注射七次。在联合给药组中,对TRAIL敏感的COLO-205肿瘤模型中,我们选择一个相对低的CPT-11剂量(6.25毫克/每公斤/每次)联合不同剂量的NGR-L-TRAIL(30或80微克/每天/每只)或TRAIL(270微克/每天/每只或90微克/每天/每只);对TRAIL抵抗性的HT-29结肠癌模型中选择相对较高剂量的CPT(25毫克/每公斤/每次)联合NGR-L-TRAIL或TRAIL(400微克/每天/每只)。
COLO-205模型中,30微克/天NGR-L-TRAIL联合6.25毫克/公斤/每次CPT-11组抑制肿瘤生长的程度远大于单独的6.25毫克/公斤/每次CPT-11组(p<0.01),大于单独的30微克/天NGR-L-TRAIL组(p<0.05),与270微克/天TRAIL联合6.25毫克/公斤/每次CPT-11组效果相当,优于90微克/天TRAIL联合6.25毫克/公斤/每次CPT-11组(p<0.05)(图6)。
HCT-15肿瘤模型中,80微克/天NGR-L-TRAIL联合6.25毫克/公斤/每次CPT-11组抑制肿瘤生长的程度大于单独的6.25毫克/公斤/每次CPT-11或80微克/天NGR-L-TRAIL,并且好于400微克/天TRAIL组和400微克/天TRAIL联合6.25毫克/公斤/每次CPT-11组(图7)。值得一提的是,在400微克/每天/每只剂量NGR-L-TRAIL+CPT-11联合治疗组中,第28天后10只给药小鼠中,有8只小鼠肿瘤消失;400微克/每天/每只TRAIL+CPT-11联合治疗组中10只动物中,有7只小鼠肿瘤消失(图7B)。
在TRAIL耐受的HT-29结肠癌模型中,单独使用NGR-L-TRAIL时,即使在每天腹腔注射高达400微克/每只裸鼠的剂量下仅观察到较弱的抗肿瘤效果。但是当NGR-TRAIL+CPT-11联合治疗时,能够显著抑制肿瘤生长,并且比TRAIL+CPT-11联合治疗效果更好。400微克/天NGR-L-TRAIL联合25毫克/公斤/天CPT-11组抑制肿瘤生长的程度最好,极优于400微克/天NGR-L-TRAIL组(p<0.01),大于25毫克/公斤/天CPT-11(p<0.05)组,同时也强于400微克/天TRAIL联合25毫克/公斤/天CPT-11组(p<0.05)。
总之,在以上三种肿瘤模型中,联合化疗药物CPT-11后,NGR-L-TRAIL的抗肿瘤活性都比单独使用NGR-L-TRAIL或CPT-11治疗效果强;并且NGR-L-TRAIL与CPT-11的联合使用效果比TRAIL与CPT-11联用的效果好。对TRAIL敏感的COLO-205和HCT-15肿瘤,达到TRAIL相当的抑制肿瘤效果,NGR-L-TRAIL的使用剂量分别只需要TRAIL的1/9~1/3和1/5;对TRIAL不敏感的HT-29肿瘤,相同剂量的NGR-L-TRAIL联合CPT-11组抗肿瘤效果优于TRAIL与CPT-11的联合组。结果表明:肿瘤靶向性变体蛋白NGR-L-TRAIL在与化疗药物CPT-11联用下,抗肿瘤活性比单独使用显著增强,并且抑制肿瘤的效果优于野生型的TRIAL与化疗药物的联用。不仅如此,联合使用还扩大了TRAIL的应用范围,肿瘤靶向性变体蛋白可以更有效地抑制对于TRAIL不敏感的肿瘤(例如HT-29结肠癌)。
体内的动物模型进一步证明了肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体、以及靶向于整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL具有更好的疗效。这说明将肿瘤坏死因子相关凋亡配体与靶向于CD13的肿瘤靶向肽融合后,确实能够在动物肿瘤模型体内水平提高其抗肿瘤生物活性。同样,肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体不仅在单独使用时的药效提高,在与化疗药物CPT-11联合使用时,其也具有明显的协同效应,疗效更加显著。将肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体与CPT-11联用治疗,不仅可以降低各自的使用剂量,将潜在的全身性毒性最小化,而且可以扩大应用到原来对肿瘤坏死因子相关凋亡配体不敏感的肿瘤治疗(图8)。体内动物实验充分证明肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的治疗效果比肿瘤坏死因子相关凋亡配体、甚至于整合素αVβ3、αVβ5靶向的TRAIL变体RGD-L-TRAIL更为优越。
实施例7
重组蛋白质在肿瘤组织的药物分布测试
重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体及肿瘤靶向性变体NGR-TRAIL、以及RGD-L-TRAIL变体分别用放射性同位素125碘标记试剂盒(Pierce公司)进行标记。标记结果:125I-肿瘤坏死因子相关凋亡配体比活为7.86μCi/μg蛋白,125I-肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体比活为7.49μCi/μg蛋白。裸鼠接种COLO-205结肠癌后,当肿瘤大小达到400至500立方毫米后随机分组,分为野生型组和二种变体组,每组设五个时间点,分别为:5、30、60、120、240分钟,每个时间点三只动物。每只荷瘤裸鼠注射100微升含有5微居的标记蛋白质。在各时间点,手术剥离小鼠肿瘤并称重,在液闪记数仪上测定放射剂量。标记蛋白质在肿瘤组织的分布量为每克组织测定放射量与注射放射量的百分比(%ID/g)表示。
为了进一步证实肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在动物模型上抗肿瘤活性的增强是由于其能够靶向富集到肿瘤组织,而且也为了进一步比较NGR-L-TRAIL与RGD-L-TRAIL在体内肿瘤动物模型上的靶向能力,我们检测了用碘125同位素标记的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL和RGD-TRAIL、以及野生型TRAIL在肿瘤组织的分布。相同放射剂量的碘125标记的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体分别注射到COLO-205荷瘤裸鼠中,注射5、30、60、120和240分钟后,手术剥离小鼠肿瘤组织并称重,分别在液闪计数仪上测定同位素的剂量。结果显示:肿瘤坏死因子相关凋亡配体TRAIL融合了CD13的短肽配体CNGRC、以及αVβ3和αVβ5整合素的短肽配体ACDCRGDCFC肽后,明显增强了TRAIL蛋白靶向富集到COLO-205肿瘤组织区域的能力,NGR-L-TRAIL能够存在和特异性地富集在肿瘤组织中。注射初期,125I-RGD-L-TRAIL在肿瘤组织的分布约是125I-TRAIL的2倍、125I-NGR-L-TRAIL在肿瘤组织的分布约是125I-TRAIL的2.5倍,NGR-L-TRAIL在COLO-205肿瘤组织中的富集程度明显比RGD-L-TRAIL高(图9)。由于NGR-L-TRAIL和RGD-L-TRAIL对肿瘤组织的亲和力增强、在肿瘤组织中分布增加,大大减弱了其在循环血液中的清除速度,因此延长了其在肿瘤组织中的分布。注射240分钟后,TRAIL在肿瘤组织中的分布基本已经难以检测到,但是仍然有相当多的RGD-L-TRAIL持续分布在肿瘤区域(图9)、而且此时肿瘤组织中NGR-L-TRAIL的含量为RGD-L-TRAIL的2倍。以上结果说明CNGRC肽与TRAIL融合后保持了CNGRC肽跟血管内皮细胞结合并抑制其增殖和诱导凋亡的生物学功能。因此,肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在动物体内肿瘤组织区域分布的增多和在动物模型上观察到其抗肿瘤活性的增强这两个事实都充分证明了本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体NGR-L-TRAIL能够赋予肿瘤坏死因子相关凋亡配体非常好的、强于变体RGD-L-TRAIL的肿瘤靶向性,并且能够降低用药剂量,最终提高抗肿瘤效果。本发明首次证明CD13的配体是一个比目前在肿瘤早期诊断中广泛应用的整合素Integrin的RGD配体靶向性更好的肿瘤探针。
实施例8
重组蛋白质在体内与肿瘤组织的结合
肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体NGR-L-TRAIL、RGD-L-TRAIL变体、小牛血清白蛋白用绿色荧光素进行标记。标记的蛋白用凝胶分子筛Sephadex-G25除去游离的荧光素。肿瘤长至400至500立方毫米大小的荷瘤鼠经尾静脉注射500微克荧光素标记的蛋白,注射30分钟后、手术剥离小鼠肿瘤,制备肿瘤细胞单细胞悬浮液,生理盐水洗数次,取6万个进行细胞流式细胞仪检测,分析重组蛋白质在肿瘤细胞表面的结合情况。
数据统计采用社会科学数据包软件进行统计分析。所有的实验至少重复三次,细胞凋亡和黏附实验结果用平均标准差表示,肿瘤大小用标准误表示。P值小于0.05视为显著性差异,小于0.01视为极其显著差异,分别用一个和两个星号标记。
NGR-L-TRAIL在其它器官组织中的分布与TRAIL类似,并没有在其它脏器中特异性聚集(图10A、10B)。NGR-L-TRAIL在体内的代谢主要通过肾脏排除体外(图10B)。
因此动物体内肿瘤组织区域分布的增多和动物模型上观察到抗肿瘤活性的增强充分表明了我们设计分子中的NGR-L-TRAIL比RGD-TRAIL更优越,能够赋予TRAIL蛋白更好的靶向性,最终提高抗肿瘤效果。
序列表
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<120> 一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用
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Gly
1
Claims (12)
1.一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,其特征在于,由一种带有环状结构并含有NGR序列的短肽、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体而组成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质;所述连接肽为1-25个氨基酸残基;所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸中的任意一种或多种,但是所述氨基酸不包括5个甘氨酸的情形。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,其特征在于,所述含有NGR序列的短肽放置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体N端时,在含有NGR序列的短肽之前增加一个不含支链的的丙氨酸或甘氨酸。
3.根据权利要求1或者2所述的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,其中所述的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体是用聚乙二醇、脂肪酸化、重组加上抗体Fc片段或白蛋白等方法修饰的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体。
4.根据权利要求1或2所述的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的制备方法,其特征是通过人工合成或者基因克隆构建肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的编码基因,利用常规基因工程方法实现该编码基因的基因工程表达和分离纯化。
5.根据权利要求1或2所述的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在大肠杆菌中可溶性表达的方法,其特征在于,权利要求1或3所述的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的大肠杆菌重组表达菌株在低温下进行培养和诱导表达,其中低温是指35℃-10℃。
6.一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的分离纯化方法,其特征在于,权利要求1或2所述的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体通过离子交换层析和金属亲和层析获得纯化。
7.一种编码选自肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA,所述cDNA带有编码CD13配体和连接肽的连续序列。
8.一种包含权利要求7的cDNA的基因治疗载体。
9.根据权利要求7或8所述的一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体cDNA及其基因治疗载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10.根据权利要求7或8所述的一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体cDNA及其基因治疗载体在制备肿瘤治疗药物中与现有的肿瘤治疗药物和技术在肿瘤治疗中的联合应用。
11.根据权利要求1或2所述的一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
12.根据权利要求1或2所述的一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在制备肿瘤治疗药物中与现有的肿瘤治疗药物和技术在肿瘤治疗中的联合应用。
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