CN1205335C - 肿瘤凋亡诱导配体基因、基因表达蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，是肿瘤凋亡诱导配体基因、基因表达蛋白及其制备方法。本发明克隆了中国人的Trail全长cDNA，与已报道的欧美人群序列进行比较，发现5’端第598位碱基由C变成G，使其编码的N端第200位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，从而证实此cDNA序列为中国人群所特有。本发明利用这一Trail全长cDNA，建立了Trail高效的原核表达系统。用克隆的Trail全长cDNA，分别克隆可溶性胞外段Trail₁₀₉和Trail₁₁₄的cDNA，并分别建立Trail₁₀₉cDNA和Trail₁₁₄cDNA原核表达系统。本发明建立的原核表达系统大大提高了肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄的表达量，可为杀伤肿瘤细胞提供新的制剂。

Description

肿瘤凋亡诱导配体基因、基因表达蛋白及其制备方法

技术领域：本发明涉及医药生物技术领域，是肿瘤凋亡诱导配体基因、基因表达蛋白及其制备方法。

背景技术：肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一。采用基因重组技术获得特异性杀伤肿瘤的重组蛋白进行肿瘤生物治疗是当今肿瘤治疗研究中的一个热点领域。1996年Pitti，RM等发现了肿瘤凋亡诱导配体(Tumor related apoptosis inducingligand)基因，这个基因所编码的完整蛋白即肿瘤凋亡诱导配体蛋白(简称Trail)，是一种由281个氨基酸组成的II型膜蛋白，它还可以通过剪切形成两种可溶性胞外段部分，一种由N端第109位到第281位氨基酸组成的蛋白(简称Trail₁₀₉)；另外一种由N端第114位到第281位氨基酸组成的蛋白(简称Trail₁₁₄)。Trail、Trailx和Trail₁₁₄都可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡，尤其对于血液、淋巴系统恶性肿瘤及肺癌等都有特异性的杀伤作用，而对于正常人体细胞无杀伤作用。但目前的研究仍存在如下问题：(一)Trail的表达局限于真核表达系统，其表达量低，无法形成规模产品；(二)两种可溶性胞外段Trail₁₀₉和Trail₁₁₄没有相应的表达系统，使其生产和功能的发挥受到限制；(三)虽然有人报道了中国人群的Trail基因的部分cDNA序列，但至今未见有关中国人群的Trail基因的全长cDNA序列的报道。

发明内容：本发明克隆了中国人的Trail全长cDNA，与已报道的欧美人群序列进行比较，发现5’端第598位碱基由C变成G，使其编码的N端第200位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，从而证实此cDNA序列为中国人群所特有。本发明利用这一Trail全长cDNA，建立了Trail高效的原核表达系统。用克隆的Trail全长cDNA，分别克隆可溶性胞外段Trail₁₀₉和Trail₁₁₄的cDNA，并分别建立Trail₁₀₉和Trail₁₁₄原核表达系统。在此基础上制备Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄蛋白，经过对杀伤肿瘤细胞的活性分析，证明它们都具有较强的杀伤肿瘤细胞的作用。

肿瘤凋亡诱导配体基因的克隆、基因表达系统及其肿瘤凋亡诱导配体蛋白的制备，具体包括如下步骤：

一、分别制备肿瘤凋亡诱导配体基因cDNA

1.由外周血淋巴细胞总RNA通过RT-PCR反转录并扩增得到Trail全长cDNA，见核苷酸序列表1。

2.设计并合成引物，通过PCR扩增从Trail全长cDNA得到Trail₁₀₉ cDNA，见核苷酸序列表2。

3.设计并合成引物，通过PCR扩增从Trail全长cDNA得到Trail₁₁₄ cDNA，见核苷酸序列表3。

二、分别构建上述cDNA的原核表达载体

1.构建Trail全长cDNA原核表达载体。

2.构建Trail₁₀₉ cDNA原核表达载体。

3.构建Trail₁₁₄ cDNA原核表达载体。

三、分别用上述cDNA的原核表达载体转化大肠杆菌，构建各工程菌株

四、分别制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄

1.诱导各工程菌株表达肿瘤凋亡诱导配体蛋白；

2.纯化各肿瘤凋亡诱导配体蛋白；

3.各肿瘤凋亡诱导配体蛋白的活性分析。

扩增Trail全长cDNA的基本材料是健康中国人外周血淋巴细胞中抽取的总RNA，原核表达载体为pET-11a(Novagen公司)，所使用的转化宿主细菌株为大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)。

本发明用RT-PCR方法反转录扩增Trail全长cDNA，以之为模板，用相应引物从5’端第325位到第843位碱基通过PCR扩增得到Trail₁₀₉ cDNA，从5’端第340位到第843位碱基通过PCR扩增得到Trail₁₁₄ cDNA。扩增过程中所用的各引物均有酶切位点，用各相应酶，分别酶切各cDNA片段和与之相应的表达载体，酶切片段通过连接、转化和鉴定，就可得到表达Trail的原核表达载体pET-Trail、表达Trail₁₀₉的原核表达载体pET-Trail₁₀₉、表达Trail₁₁₄的原核表达载体pET-Trail₁₁₄。分别将各构建好的原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过IPTG诱导表达筛选，SDS-page电泳鉴定，分别得到表达Trail的原核表达菌株pET-BL21-Trail、表达Trail₁₀₉的原核表达菌株pET-BL21-Trail₁₀₉、表达Trail₁₁₄的原核表达菌株pET-BL21-Trail₁₁₄。而后利用离子交换法纯化各原核表达蛋白，分别得肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄。

本发明具有如下优点和积极效果：

本发明得到的Trail cDNA是中国人群中所特有的，为该基因在特定人群和非特定人群中的研究提供了良好的材料。所得到的Trail₁₀₉ cDNA和Trail₁₁₄ cDNA与Trail全长cDNA相配合，覆盖了表达肿瘤凋亡诱导配体蛋白的功能区域。本发明所使用的原核表达载体能高效表达重组蛋白，为选择相应的工程菌奠定了基础。尤其是pET-BL₂₁-Trail菌株、pET-BL₂₁-Trail₁₀₉菌株和pET-BL₂₁-Trail₁₁₄菌株都能够高效的表达重组蛋白，成为良好的工程菌。所表达的各产物有良好的活性，从而可为人肿瘤的治疗提供有效的制剂。

附图说明：

图1.Trail cDNA、Trail₁₀₉ cDNA和Trail₁₁₄ cDNA的长度及所处相对位置示意图；

图2.制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄的流程图；

图3.Trail全长cDNA的原核表达载体pET-Trail的构建图；

图4.Trail₁₀₉ cDNA原核表达载体pET-Trail₁₀₉的构建图；

图5.Trail₁₁₄ cDNA原核表达载体pET-Trail₁₁₄的构建图。

具体实施方式：

现结合附图和实施例，对本发明作进一步详细叙述。

实施例1：制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail

一、制备Trail全长cDNA(见图2)

1.总RNA反转录制备外周血cDNA

按常规用人外周血总RNA，以MMLV反转录酶和寡聚核苷酸，42℃1小时将人外周血总RNA反转录得cDNA(详见《分子克隆》第396页)。

2.设计并合成引物

设计两套引物：引物1、引物2和引物3、引物4，其中在引物3和引物4中分别加入NdeI和BamHI酶切位点GATATG和GGATCC。

引物1：5’GGC TGC CTG GCT GAC TTA CAG CA3’

引物2：5’CAT CCT GAA AAC TGA ATA GTC ACT 3’

引物3：5’ATT TCT CAT ATG GTG AGA GAA AGA CC3’

引物4：5’CTC GAG GGA TCC TTA GCC AAC TAA AAA GGC C3’

3.PCR扩增Trail全长cDNA

采用槽式PCR方法，以引物1和引物2对外周血cDNA进行第一次扩增。

外周血cDNA(50ng/ul)                   1ul

20mM dNTP                             1ul

引物1(50uM)                           0.5ul

引物2(50uM)                         0.5ul

10X缓冲液                           5ul

pfu DNA聚合酶(5U/ul)                1ul

去离子水                            41ul

先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃30秒，55℃30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，扩增物经1％琼脂糖凝胶电泳后，回收800～900bp间的条带，得到第一次扩增的PCR产物，。

以引物3和引物4对第一次获得的PCR产物作第二次PCR扩增。

第一次扩增产物(0.5ug/ul)             1ul

20mM dNTP                            1ul

引物3(50uM)                          0.5ul

引物4(50uM)                          0.5ul

10X缓冲液                            5ul

pfu DNA聚合酶(5U/ul)                 1ul

去离子水                             41ul

先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃30秒，55℃30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，获得Trail全长cDNA，共843bp，进行DNA测序，结果见核苷酸序列表1，该序列中的黑体字GATATG和GGATCC是NdeI和BamHI酶切位点。

二、Trail全长cDNA原核表达载体pET-Trail的构建(见图3)

以NdeI和BamH同时酶切Trail cDNA和pET-11a原核表达载体，分别经1％琼脂糖凝胶电泳，回收相应酶切片段，两种酶切片段在16℃下用T4 DNA连接酶连接8小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化后的菌落，扩增并抽取质粒，酶切鉴定和DNA测序后，得到表达Trail的原核表达载体pET-Trail(构建过程详见《分子克隆》第1～48页)。

连接体系：NdeI和BamHI酶切后Trail cDNA(100ng/ul)               3ul

          NdeI和BamHI酶切后pET-11a(100ng/ul)                  1ul

          10X T4 DNA连接酶缓冲液                              1ul

          T4 DNA连接酶(5U/ul)                                 1ul

           去离子水                       4ul

三、表达Trail的工程菌株pET-BL₂₁-Trail的构建

按常规将得到的pET-Trail原核表达载体以CaCl₂法转化大肠杆菌BL₂₁(DE3)，挑取单克隆菌落扩增后，得到Trail的表达菌株pET-BL₂₁-Trail。(详见《分子克隆》第48～66页)。

四、制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail

挑取单个克隆的pET-BL₂₁-Trail菌落，接种到500ml的LB培养基中，37℃以200转/分钟摇动至细菌浓度达到O.D.为0.5～0.6，加入蛋白表达诱导物IPTG500mM，使其终浓度达到1mM/L，诱导5～6小时，以8000转/分钟离心10分钟，弃上清，可收获细菌约3克。以20ml 50mM Tris.Cl pH7.9缓冲液重悬细菌，加入1mg/ml溶菌酶和1ug/ml DNaseI消化30分钟，13000转/分钟离心10分钟，收获细菌裂解后产生的含目的蛋白的包含体约1克。以8M/L的尿素溶解包含体，13000转/分钟离心10分钟，将上清转移到新的管中，弃细菌碎片组成的沉淀。用1升50mM Tris.Cl pH10.0缓冲液对上清进行透析，约48小时，其间换液2～3次。将透析好的上清加样于DEAE-spharose Fast Ftow离子交换层析柱，在pH10.0的条件下细菌中大多数杂蛋白都结合在层析柱上，而滤下的80％都是表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail，反复过柱2次后，得到纯度达90％以上的Trail约0.6克。从3克细菌中可得到0.6克肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail，因此从细菌总蛋白中得率约为20％。Trail的氨基酸序列见表4。

实施例2：制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₀₉

一、Trail₁₀₉ cDNA的克隆(见图1)

1.设计并合成引物

以Trail全长cDNA为模板，设计覆盖Trail₁₀₉ cDNA的引物5和引物6，并在其中分别加入NdeI和BamHI酶切位点CAT ATG和CAT ATG。

引物5：5’GAA AAG CAT ATG AAT ATT TCT CCC CT3’

引物6：5’CTC GAG CAT ATG TTA GCC AAC TAA AAA GGC C3’

2.扩增Trail₁₀₉ cDNA

以引物5和引物6和Trail全长cDNA模板，通过PCR进行扩增。

                Trail全长cDNA(50ng/ul)                    1ul

20mM dNTP                          1ul

引物5(50uM)                        0.5ul

引物6(50uM)                        0.5ul

10X缓冲液                          5ul

pfu DNA聚合酶(5U/ul)               1ul

去离子水                           41ul

先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃30秒，55℃30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，得到Trail₁₀₉ cDNA，并进行DNA测序，结果见核苷酸序列表2，该序列中的黑体字GATATG和GGATCC是NdeI和BamHI酶切位点。

二、Trail₁₀₉原核表达载体pET-Trail₁₀₉的构建(见图4)

以NdeI和BamH同时酶切Trail₁₀₉ cDNA和pET-11a原核表达载体，分别经1％琼脂糖电泳，回收相应酶切片段，再用T4 DNA连接酶在16℃下对两种酶切片段连接8小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化后的菌落，扩增并抽取质粒，酶切鉴定和DNA测序后，得到表达Trail₁₀₉原核表达载体pET-Trail₁₀₉。

连接体系：NdeI和BamHI酶切后Trail₁₀₉ cDNA(100ng/ul)               3ul

          NdeI和BamHI酶切后pET-11a(100ng/ul)                      1ul

          10X T4 DNA连接酶缓冲液                                  1ul

          T4 DNA连接酶(5U/ul)                                     1ul

          去离子水                                                4ul

三、表达Trail₁₀₉的工程菌株pET-BL₂₁-Trail₁₀₉的构建

按常规以pET-Trail₁₀₉转化大肠杆菌BL₂₁(DE3)，挑取单菌落后扩增，得到表达Trail₁₀₉的菌株pET-BL₂₁-Trail₁₀₉。

四、制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₀₉

细菌的扩增、收获及包含体的收获、溶解方法同实施例1。由于Trail₁₀₉的等电点与Trail的不同，所以在进行透析和离子交换时使用pH11.0的缓冲液，其操作过程同实施例1。得到纯度达90％以上的Trai₁₀₉。从3克细菌中可得到0.8克Trail₁₀₉，因此从细菌总蛋白中得率约为27％。其相应氨基酸序列见表5。

实施例3：制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₁₄

一、Trail₁₁₄ cDNA的克隆(见图1)

1.设计并合成引物

以Trail全长cDNA为模板，设计覆盖Trail₁₁₄ cDNA的引物7和引物8，在其中分别加入NdeI和BamH酶切位点CAT ATG和GGA TCC。

引物7：5’ATT TCT CAT ATG GTG AGA GAA AGA CC3’

引物8：5’CTC GAG GGA TCC TTA GCC AAC TAA AAA GGC C3’

2.扩增Trail₁₁₄ cDNA

以引物7和引物8和Trail全长cDNA模板，通过PCR进行扩增。

                Trail全长cDNA(50ng/ul)                   1ul

                20mM dNTP                                1ul

                引物5(50uM)                              0.5ul

                引物6(50uM)                              0.5ul

                10X缓冲液                                5ul

                pfu DNA聚合酶(5U/ul)                     1ul

                去离子水                                 41ul

先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃30秒，55℃30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，得到Trail₁₁₄ cDNA，并进行DNA测序，结果见核苷酸序列表3，该序列中的黑体字GATATG和GGATCC是NdeI和BamHI酶切位点。

二、Trail₁₁₄原核表达载体pET-Trail₁₁₄的构建(见图5)

以NdeI和BamH同时酶切Trail₁₁₄ cDNA和pET-11a原核表达载体，分别经1％琼脂糖凝胶电泳，回收相应酶切片段，再用T4 DNA连接酶在16℃下对两种酶切片段连接8小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化后的菌落，扩增并抽取质粒，酶切鉴定和DNA测序后，得到表达Trail₁₁₄原核表达载体pET-Trail₁₁₄。

连接体系：NdeI和BamHI酶切后Trail₁₁₄ cDNA(100ng/ul)                3ul

          NdeI和BamHI酶切后pET-11a(100ng/ul)                       1ul

          10X T4 DNA连接酶缓冲液                                   1ul

          T4 DNA连接酶(5U/ul)                                      1ul

          去离子水                                                 4ul

三、表达Trail₁₁₄工程菌株pET-BL₂₁-Trail₁₁₄的构建

以pET-Trail₁₁₄转化大肠杆菌BL₂₁(DE3)，挑取单菌落后扩增，得到表达Trail₁₁₄的菌株pET-BL₂₁-Trail₁₁₄。

四、制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₁₄

细菌的扩增、收获及包含体的收获、溶解方法同实施例1。由于Trail₁₁₄的等电点与Trail和Trail₁₀₉的都不同，所以在进行透析和离子交换时使用pH12.0的缓冲液，其操作过程同实施例1。得到纯度达90％以上的Trail₁₁₄。从3克细菌中可得到0.9克肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₁₄，因此从细菌总蛋白中得率约为30％。其相应氨基酸序列见表6。

Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄杀伤肿瘤细胞的活性分析：

将Trail、Trail₁₀₉和Trail₁₁₄分别加入培养的肿瘤细胞株Hela(宫颈癌)、Jurkat(白血病)和正常人胚肾细胞293细胞中，24小时后通过流式细胞仪检测其诱导肿瘤细胞凋亡情况，发现各组的诱导凋亡率相似，其中对杀伤Hela细胞各组均约20％，对Jurkat细胞各组均约80％，而对正常对照组293细胞则无杀伤作用。

                   表1：Trail cDNA核苷酸序列

ATGGCTATGATGGAGGTCCAGGGGGGACCCAGCCTGGGACAGACCTGCGTGCTGATCGTGATCTTCACAGTG

CTCCTGCAGTCTCTCTGTGTGGCTGTAACTTACGTGTACTTTACCAACGAGCTGAAGCAGATGCAGGACAAG

TACTCCAAAAGTGGCATTGCTTGTTTCTTAAAAGAAGATGACAGTTATTGGGACCCCAATGACGAAGAGAGT

ATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGTTAGAAAGATGATTTTGAGAACCTCT

GAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG

AGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAA

AAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCAC

TTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTT

CAGGAGGAAATAAAAGAAAAC GCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTAT

CTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTAT

TCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCAC

TTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGC

                        表2：Trail₁₀₉ cDNA核苷酸序列

AATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGA

AGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCA

TCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGG

TTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAAC GCAAAGAACGACAAA

CAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAAT

AGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAA

AATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGG

GCCTTTTTAGTTGGC

                        表3：Trail₁₁₄ cDNA核苷酸序列

GTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCT

TCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCAT

TCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTAT

TCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAAC GCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATAT

ATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAA

GATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTT

GTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGC

                    表4：Trail氨基酸序列

MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEES

MNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNE

KALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKEN AKNDKQMVQYIYKYTSY

PDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

                    表5：Trail₁₀₉氨基酸序列

NISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKG

FYYIYSQTYFRFQEEIKEN AKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKE

NDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

                    表6：Trail₁₁₄氨基酸序列

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIY

SQTYFRFQEEIKEN AKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIF

VSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

Claims (8)

1、一种肿瘤凋亡诱导配体基因，由843个碱基组成，其特征在于5’端第598位碱基为鸟嘌呤G，核苷酸序列如下：

ATGGCTATGATGGAGGTCCAGGGGGGACCCAGCCTGGGACAGACCTGCGTGCTGATCGTGATCTTCACAGTGCTCCTGCAGTCTCTCTGTGTGGCTGTAACTTACGTGTACTTTACCAACGAGCTGAAGCAGATCCAGGACAAGTACTCCAAAAGTGGCATTGCTTGTTTCTTAAAAGAAGATGACAGTTATTGGGACCCCAATGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGTTAGAAAGATGATTTTGAGAACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAAC GCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGC。

2、一种肿瘤凋亡诱导配体基因，其特征在于由权利要求1所述的肿瘤凋亡诱导配体基因的5’端第325位到第843位碱基组成，核苷酸序列如下：

AATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAAC GCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGC。

3、一种肿瘤凋亡诱导配体基因，其特征在于由权利要求1所述的肿瘤凋亡诱导配体基因的5’端第340位到第843位碱基组成，核苷酸序列如下：GTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAAC GCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGC。

4、权利要求1所述的肿瘤凋亡诱导配体基因表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail，由281个氨基酸组成，其特征在于N端第200位氨基酸为丙氨酸A，氨基酸序列如下：

MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKEN AKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG。

5、权利要求2所述的肿瘤凋亡诱导配体基因表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₀₉，由173个氨基酸组成，其特征在于N端第92位氨基酸为丙氨酸A，氨基酸序列如下：

NISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKEN AKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG。

6、权利要求3所述的肿瘤凋亡诱导配体基因表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail₁₁₄，由168个氨基酸组成，其特征在于N端第87位氨基酸为丙氨酸A，氨基酸序列如下：

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKEN AKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG。

7、权利要求4或5或6所述的肿瘤凋亡诱导配体蛋白的制备方法，包括肿瘤凋亡诱导配体基因cDNA的制备、表达载体的构建、工程菌株的建立、及肿瘤凋亡诱导配体蛋白的表达、纯化，其特征在于所用的表达系统为原核表达系统pET11a。

8、权利要求4或5或6所述的肿瘤凋亡诱导配体蛋白用于制备杀伤宫颈癌或白血病肿瘤细胞制剂的用途。

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