CN1259416C - 人DNA聚合酶β突变基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的人基因核苷酸序列，尤其涉及人类修复基因DNA聚合酶β的cDNA序列，是DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式，它所编码的蛋白完全丧失DNA聚合酶β的DNA修复活性，它是一种分离出的DNA分子，以M-POLB表示，是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式，与GenBank中M13140比较，它包括：177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；97 3位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。本发明提供的基因特征对于食管癌的早期诊断和基因治疗具有重要作用。

Description

人DNA聚合酶β突变基因

                      技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新的人基因核苷酸序列，具体涉及一种人类修复基因DNA聚合酶β的cDNA序列，是DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式，称为M-POLB，它所编码的蛋白完全丧失DNA聚合酶β的DNA修复活性，该蛋白称为M-POLB.AMI。即本发明涉及了该基因的cDNA编码序列、该核苷酸序列编码的多肽以及利用重组技术生产所述的新的M-POLB.AMI的方法。

                      背景技术

1971年Weissbach等从牛胸腺中分离出了一类不同于DNA聚合酶α的新的DNA聚合酶，并命名为DNA聚合酶β(Polymeraseβ，POLB)，其全称为依赖DNA的DNA聚合酶β。迄今为止它是真核生物中已知的五种DNA聚合酶之一。有人称其为生物进化过程中的“看家酶”^[1]。POLB是一种分子量为39kDa的小分子多肽，广泛存在于哺乳类动物细胞内，其功能主要是参与DNA的损伤修复(Dresler S1 et al， J Bio Chem，1983：258：9990-9994)。POLB分子结构和催化活性：POLB是广泛存于哺乳动物细胞核内，是一条由单条肽链小分子蛋白质，其分子量为39Kda，在溶液中以单链形式存在。人和啮齿类动物POLB的一级结构为一条由335个氨基酸组成的多肽，其2级结构中有10％的螺旋和50％β片层(TanabeK et al， J Bio Chem，1981，256：3089-3102)。由四个亚基构成。POLB具有催化DNA聚合的作用，但它与其它DNA聚合酶不同，不具有3’→或5’→核酸外切酶活性，亦无焦磷酸置换，焦磷酸水解，dNTP和RNA水解功能。用蛋白裂解法证明该酶有两个不同的功能区(Beard Wa et al.Mutat Res 2000，30；460：231-44)：一个N-未端，约含有75个氨基酸；一个C-末端，约含有250个氨基酸，。在催化DNA聚合反应时，前者与模板结合，后者与dNTP结合。进一步研究表明，C-末端区分为三个亚区：一个“指部”亚区(88至151氨基酸)；一个“掌部”亚区(151至262氨基酸)和一个“拇指”亚区(263至355氨基酸)。N-末端具有切除脱氧磷酸残基的活性并与DNA模板及引物具有高度的亲和性；它的催化中心位于Lys72。而C-末端区具有核苷酸转移活性即聚合酶活性其中最重要的催化位点，位于掌亚区的190位和192位氨基酸的Asp以及拇指区256位氨基酸的Asp和283的Arg，它们均与核苷酸转移活性关系密切(M.R.Sawaya，et al， Science 1994，264：1930-1935)。更深入的研究表明：拇指亚区的运动对POLB的活性非常重要，在缺乏DNA和dNTP的情况下，位于盐桥中的Asp192与Arg258结合；而DNA和dNTP存在的情况下，拇指亚区与掌亚区接近，拇指亚区残基Glu295和Tys296以氢键结合到Arg258上，接着，Arg192从Arg258上解脱而连接上一个Mg²⁺，作为连接金属离子的核苷酸来激活核苷酸转移步骤。在催化反应过程中，需要Mg²⁺或Mn²⁺作为激活剂。与引物适当的结合形状、原料dNTP及POLB活性位点氨基酸残基均是该酶保真性的影响因素。其反应过程遵循BiBi机制：即它先和模板引物结合，再与dNTP反应，在双链DNA缺口中插入一个核苷酸时，再次与引物的3’-OH结合，开始第二轮反应。反应的最适PH在8.5-9.0范围内，高盐浓度(＞100mmol/L)对酶有激活作用，甘油和蔗糖对其也有激活作用。pH在4.5-10.5范围内该酶较稳定，若在酶溶液中加入蛋白质可以增加它的稳定性。它对许多试剂有抗性，如5M脲、磷酸乙酯、20％-50％乙醇和丙酮均可影响其活动。但是该酶的稳定性较差，在过热(＞42℃)时此酶更容易失去活性。某些抑制剂(如d₂TTP和d₂CTP)能特异性地抑制POLB的活性。综观现有研究结果，POLB参于DNA的聚合反应特点是：催化双链DNA上短小缺口中的DNA合成，当这些缺口在10个核苷酸下时它能将它们完成填补，对DNA双链上更大的缺口的修补，常常需要与其它修复酶共同参于。POLB还可能参与DNA的重组合成以及由单链DNA向双链DNA转化的过程。

在细胞内POLB常与一种对双链DNA具有双向外切(5’→3’和3’→5’)作用的DNaseV以等克分子复合物一起分离出来。推测这两种蛋白一起构成了DNA修复复杂体系超分子结构中的一部分。Moshangh和Linn于1983年证实，Hela细胞POLB和DnaseV能从DNA上单个核苷酸缺口处开始进行长片段的DNA合成，Hela细胞能够加强POLB聚合DNA的速度和程度，它可能与DnaseV联合参与DNA链上长、短缺口的修复合成。Zmudzka等用重组大鼠POLB研究了酶浓度同催化作用的关系，表明该酶活性同反应混合物中酶蛋白浓度是有关的。当酶和模板缺口比例超过1∶1时，能够进行广泛的链重组合成；当酶浓度较低时，此酶难以利用带小缺口的DNA模板。POLB在催化DNA合成时，可能还需要酶蛋白分子的相互协同作用。最近有报道它也可与XRCC1形成复合体^[51]。Zhou J等报道p53能协助POLB进行碱基切除修复(ZhouJ，et al .EMBO J 2001 Feb 15；20(4)：914-23)

参与DNA损伤的修复：一系列研究结果提示，POLB参于DNA损伤修复过程。Hubscher等报道，成年大鼠神经细胞核中几乎无DNA聚合酶α活性，γ酶也只占0.8％，而POLB高达99.2％。这种细胞经UV照射后，大量的DNA修复合成是由POLB参与的。国内外的一些研究者采用γ和β酶专一性抑制剂NEM/d2TTP，在选择性抑制α酶和γ的条件下，观察γ射线照射后细胞核内受损DNA的修复合成，提示POLB参与了受损DNA的修复合成。一些学者对POLB参与了化学药物所致的DNA损伤修复过程也作了报道。另外Raaphorst在实验中发现，用d₂CTP抑制POLB以后，可以增加C3H10T-1/2细胞的潜在性致死损伤(PTD)和潜在性转化损伤(PTD)，细胞的存活率和肿瘤转化能力均降低，提示POLB还可能参与细胞PLD和PTD的修复过程，并且这种修复过程是通过旁路修复实现的。Ohnishi的研究结果提示，POLB对DNA损伤的修复作用，有一部分可能是通过切除修复完成的。T.Lindahl，和R.D.Wood指出，碱基修复包括五个程序化反应：①通过特异性的葡萄糖基酶移去突变的碱基而产生一个AP位点(apurinic-apyrimidinic site)；②通过AP核酸内切酶切开5’端的AP位点；③切除5’端的脱氧核糖磷酸残基而造成一个单链核苷酸缺口；④DNA聚合酶通过DNA合成来填补缺口；⑤DNA连接酶封闭缺口。在此过程中，DNA聚合酶既有切除脱氧核糖磷酸酶活性也有聚合酶活性，从而在碱基修复中发挥重要效能(Podlutsky AJ，et al， Biochemistry 2001 Jan23；40(3)：809-13)。

其它生物学功能：POLB除了有修复DNA损伤作用外，人们还发现它有其它功能。一些迹象表明，POLB对细胞生长，增殖和分化可能有调控作用；另外，POLB与肿瘤组织可能存在某些生物学联系。肿瘤组织中POLB变化可能与肿瘤细胞对化疗或放疗的抗性有关，也可能与肿瘤修复发有关(Miura M，et al， Radiat Res 2000，Jun；153(6)：773-80)。

                      发明内容

本发明的目的是提供一种新的人基因序列M-POLB，并根据M-POLB基因特征用于食管癌的早期诊断和基因治疗的人DNA聚合酶β突变体基因，该基因是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式。

本发明的目的还在于提供了一种利用重组技术生产对应该基因的新的蛋白M-POLB.AMI。

本发明的目的是这样实现的：

一种分离出的DNA分子(以M-POLB表示)，是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式，与GenBank中M13140比较它包括：177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。具体基因序列如下：

        10         20         30         40         50         60

CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC AAGCTGGGAG

        70         80         90        100        110        120

AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG GGTGCAGGCC GCCATGAGCA

       130        140        150        160        170        180

AACGGAAGGC GCCGCAGGAG ACTCTCAACG GGGGAATCAC CGACATGCTC ACAGAAAAGC

       190        200        210        220        230        240

AGCATCTGTT ATAGCAAAAT ACCCACACAA AATAAAGAGT GGAGCTGAAG CTAAGAAATT

       250        260        270        280        290        300

GCCTGGAGTA GGAACAAAAA TTGCTGAAAA GATTGATGAG TTTTTAGCAA CTGGAAAATT

       310        320        330        340        350        360

ACGTAAACTG GAAAAGATTC GGCAGGATGA TACGAGTTCA TCCATCAATT TCCTGACTCG

       370        380        390        400        410        420

AGTTAGTGGC ATTGGTCCAT CTGCTGCAAG GAAGTTTGTA GATTAAGGAA TTAAAACACT

       430        440        450        460        470        480

AGAAGATCTC AGAAAAAATG AAGATAAATT GAACCATCAT CAGCGAATTG GGCTGAAATA

       490        500        510        520        530        540

TTTTGGGGAC TTTGAAAAAA GAATTCCTCG TGAAGAGATG TTACAAATGC AAGATATTGT

       550        560        570        580        590        600

ACTAAATGAA GTTAAAAAAG TGGATTCTGA ATACATTGCT ACAGTCTGTG GCAGTTTCAG

       610        620        630        640        650        660

AAGAGGTGCA GAGTCCAGTG GTGACATGGA TGTTCTCCTG ACCCATCCCA GCTTCACTTC

       670        680        690        700        710        720

AGAATCAACC AAACAGCCAA AACTGTTACA TCAGGTTGTG GAGCAGTTAC AAAAGGTTCA

       730        740        750        760        770        780

TTTTATCACA GATACCCTGT CAAAGGGTGA GACAAAGTTC ATGGGTGTTT GCCAGCTTCC

       790        800        810        820        830        840

CAGTAAAAAT GATGAAAAAG AATATCCACA CAGAAGAATT GATATCAGGT TGATACCCAA

       850        860        870        880        890        900

AGATCAGTAT TACTGTGGTG TTCTCTATTT CACTGGGAGT GATATTTTCA ATAAGAATAT

       910        920        930        940        950        960

GAGGGCTCAT GCCCTAGAAA AGGGTTTCAC AATCAATGAG TACACCATCC GTCCCTTGGG

       970        980        990       1000       1010       1020

AGTCACTGGA GTTGCAGGAG AACCCCTGCC AGTGGATAGT GAAAAAGACA TCTTTGATTA

      1030       1040       1050       1060       1070       1080

CATCCAGTGG AAATACCGGG AACCCAAGGA CCGGAGCGAA TGAGGCCTGT ATCCTCCCTG

      1090       1100       1110       1120       1130       1140

GCGCAGACAC AACCCAATGG GTCTTAATTT ATTTCTTAAC CTTTGCTATG TAAGGGTCTT

      1150       1160       1170       1180       1190       1200

TGGTGTTTTT AAATGATTGT TTCTTCTTCA TGCTTTTGCT TGCAATGTAG TCAATAAAAC

      1210       1220       1230       1240       1250       1260

C......... .......... .......... .......... .......... ..........

DNA分子即M-POLB，其编码的多肽序列如下(以M-POLB.AMI表示)，该序列具有M-POLB中从核苷酸114位～192位的核苷酸编码：Met Ser Lys Arg Lys Ala Pro Gln Glu Thr Leu Asn Gly Gly Ile Thr Asp MetLeu Thr Glu Lys Gln His Leu Leu。

本发明的积极效果如下：

本发明的M-POLB基因特征与食管癌发生的相关性极为密切，检测本发明特征基因位点，可用来对食管癌，早发现、早治疗，可以大大提高术后存活率。利用本发明提供的M-POLB基因，结合基因特征，可以人工合成针对M-POLB基因的反义RNA，用于阻断突变型DNA聚合酶β的表达，以实现基因治疗的目的。在中国食管癌高发区林州市食管癌病人手术标本中检测到本发明的M-POLB基因特征占80％以上。

1.食管癌病人与正常人DNA聚合酶β(简称POLB)基因比较

分组	标本数	POLB变异数	POLB正常数	统计分析结果
					高发区食管癌病人组	40	35	5	P＜0.05差异有显著性
高发区正常人组	100	0	100
				非高发区食管癌病人组	30	25	5	P＜0.05差异有显著性
非高发区正常人组	100	0	100
				早期食管癌病人组	17	14	3		P＜0.05差异有显著性
对照组	60	0	60

从本表统计分析结果可以清晰看出，正常人中DNA聚合酶β(简称POLB)基因正常，而在食管癌病人中，无论是早期、无论是高发区、还是非高发区的癌病人的DNA聚合酶β(简称POLB)基因绝大多数发生了本发明涉及的变异。因此，利用检测本发明的M-POLB，作为早期检测和诊断食管癌的方法，是可行的、也是可靠的。

2.反义RNA基因治疗荷瘤动物实验结果

设计包含M-POLB基因特征点177-234位缺失的反义RNA，纯化后，用脂质体包裹，注入荷瘤裸鼠体内。反义RNA基因治疗组比对照组荷瘤裸鼠的平均存活时间长出22天，比干扰素治疗组荷瘤裸鼠的平均存活时间长出14天。本实验结果说明，使用本发明设计的针对M-POLB的反义RNA治疗方法，对食管癌细胞有显著的治疗效果，比通常使用的抗肿瘤药物干扰素更有效。

                        附图说明

图1、2、3为本发明的M-POLB基因的获得途径图。

图4为本发明的M-POLB基因核苷酸序列读码框架分析图。

图5为本发明的M-POLB基因原核表达载体构件及蛋白表达纯化图。

图6为本发明的M-POLB基因真核表达载体构件及蛋白表达纯化图。

                      具体实施方式

实施例1：M-POLB基因的克隆

如图1、2、3、4所示，本发明的M-POLB基因的获得途径和M-POLB基因核苷酸序列读码框架分析如下：

1.组织分离

中国食管癌高发区河南省林州市浸润癌的食管癌组织手术标本，于手术现场取材后立即储存于-196℃液氮中。

2.mRNA的分离

用QIAGEN公司总RNA提取试剂盒选取(按提取试剂盒进行)

3.逆转录合成cDNA片段

5×RT缓冲液(含50mmol/LMgCl₂)6μl，10mmol/L 4×dNTP 2μl，RNasin 40U，AMV 2U，下游引物(P2 5’TCATTCGCTCCGGTCCTTGG 3’)1μl，提取总RNA 5μl，DEPC水补足30μl，用2滴液体石蜡封顶，42℃水浴逆转录45min。

4.PCR扩增和克隆

扩增反应体积为30μl，10×缓冲液3μl，5mmol/L 4×dNTP 2μl，上游和下游引物(P1 5’ATGAGCAAACGGAGGGCGCCG 3’，P2 5’TCATTCGCTCCGGTCCTTGG 3’由上海生工公司合成，PAGE纯化)各1μl，PE公司Golden Taq酶2U，逆转录产物2μl，去离子H₂O补足30μl体积。20μl液体石蜡封顶，用PE 480型PCR仪扩增，扩增反应参数为95℃ 10min预变性；94℃ 50sec，66℃ 50sec，72℃ 60sec三温循环30次；72℃ 7min末延伸。将聚合酶β全基因PCR产物进行琼脂糖电泳，从琼脂糖中回收该区段PCR扩增产物，采用Promega公司的PCR产物纯化和克隆试剂盒，纯化后与T载体连接，转化入宿主菌JM103。经α互补蓝白筛选得到阳性克隆。

5.序列分析

利用荧光标记法ABI377测序仪测序，得到M-POLB基因序列。

M-POLB基因同源性比较：

本发明的人M-POLB的全长cDNA编码序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ数据库及Non-redundantGenBanktranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索，结果发现与人和小鼠DNA聚合酶β基因具有最高的同源性。

图中M13140为GenBank人DNA聚合酶β基因序列，加方框处为，本发明基因特征位点，包括177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。

                    10         20         30         40         50

M13140    1 CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC     50

M-POLB    1 CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC     50

                    60         70         80         90        100

M13140   51 AAGCTGGGAG AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG    100

M-POLB   51 AAGCTGGGAG AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG    100

                     110        120        130        140        150

M13140    101 GGTGCAGGCC GCCATGAGCA AACGGAAGGC GCCGCAGGAG ACTCTCAACG    150

M-POLB    101 GGTGCAGGCC GCCATGAGCA AACGGAAGGC GCCGCAGGAG ACTCTCAACG    150

                     160        170        180        190        200

M13140    151 GGGGAATCAC CGACATGCTC ACAGAACTCG CAAACTTTGA GAAGAACGTG    200

M-POLB    151 GGGGAATCAC CGACATGCTC ACAGAA

200

                     210        220        230        240        250

M13140    201 AGCCAAGCTA TCCACAAGTA CAATGCTTAC AGAAAAGCAG CATCTGTTAT    250

M-POLB    201

AAGCAG CATCTGTTAT  250

                     260        270        280        290        300

M13140    251 AGCAAAATAC CCACACAAAA TAAAGAGTGG AGCTGAAGCT AAGAAATTGC    300

M-POLB    251 AGCAAAATAC CCACACAAAA TAAAGAGTGG AGCTGAAGCT AAGAAATTGC    300

                     310        320        330        340        350

M13140    301 CTGGAGTAGG AACAAAAATT GCTGAAAAGA TTGATGAGTT TTTAGCAACT    350

M-POLB    301 CTGGAGTAGG AACAAAAATT GCTGAAAAGA TTGATGAGTT TTTAGCAACT    350

                     360        370        380        390        400

M13140    351 GGAAAATTAC GTAAACTGGA AAAGATTCGG CAGGATGATA CGAGTTCATC    400

M-POLB    351 GGAAAATTAC GTAAACTGGA AAAGATTCGG CAGGATGATA CGAGTTCATC    400

                     410        420        430        440        450

M13140    401 CATCAATTTC CTGACTCGAG TTAGTGGCAT TGGTCCATCT GCTGCAAGGA    450

M-POLB    401 CATCAATTTC CTGACTCGAG TTAGTGGCAT TGGTCCATCT GCTGCAAGGA    450

                     460        470        480        490        500

M13140    451 AGTTTGTAGA TGAAGGAATT AAAACACTAG AAGATCTCAG AAAAAATGAA    500

M-POLB    451 AGTTTGTAGA T

AAGGAATT AAAACACTAG AAGATCTCAG AAAAAATGAA  500

                     510        520        530        540        550

M13140    501 GATAAATTGA ACCATCATCA GCGAATTGGG CTGAAATATT TTGGGGACTT    550

M-POLB    501 GATAAATTGA ACCATCATCA GCGAATTGGG CTGAAATATT TTGGGGACTT    550

                     560        570        580        590        600

M13140    551 TGAAAAAAGA ATTCCTCGTG AAGAGATGTT ACAAATGCAA GATATTGTTC    600

M-POLB    551 TGAAAAAAGA ATTCCTCGTG AAGAGATGTT ACAAATGCAA GATATTGT

C   600

                     610        620        630        640        650

M13140    601 TAAATGAAGT TAAAAAAGTG GATTCTGAAT ACATTGCTAC AGTCTGTGGC    650

M-POLB    601 TAAATGAAGT TAAAAAAGTG GATTCTGAAT ACATTGCTAC AGTCTGTGGC    650

                     660        670        680        690        700

M13140    651 AGTTTCAGAA GAGGTGCAGA GTCCAGTGGT GACATGGATG TTCTCCTGAC    700

M-POLB    651 AGTTTCAGAA GAGGTGCAGA GTCCAGTGGT GACATGGATG TTCTCCTGAC    700

                     710        720        730        740        750

M13140    701 CCATCCCAGC TTCACTTCAG AATCAACCAA ACAGCCAAAA CTGTTACATC    750

M-POLB    701 CCATCCCAGC TTCACTTCAG AATCAACCAA ACAGCCAAAA CTGTTACATC    750

                     760        770        780        790        800

M13140    751 AGGTTGTGGA GCAGTTACAA AAGGTTCATT TTATCACAGA TACCCGTTCA    800

M-POLB    751 AGGTTGTGGA GCAGTTACAA AAGGTTCATT TTATCACAGA TACCC TCA   800

                     810        820        830        840        850

M13140    801 AAGGGTGAGA CAAAGTTCAT GGGTGTTTGC CAGCTTCCCA GTAAAAATGA    850

M-POLB    801 AAGGGTGAGA CAAAGTTCAT GGGTGTTTGC CAGCTTCCCA GTAAAAATGA    850

                     860        870        880          890       900

M13140    851 TGAAAAAGAA TATCCACACA GAAGAATTGA TATCAGGTT- ATACCCAAAA    900

M-POLB    851 TGAAAAAGAA TATCCACACA GAAGAATTGA TATCAGGTT

ATACCC

AAA  900

                       910        920        930        940       950

M13140    901 GATCAGTATT ACTGTGGTGT TCTCTATTTC ACTGGGAGTG ATATTTTCAA    950

M-POLB    901 GATCAGTATT ACTGTGGTGT TCTCTATTTC ACTGGGAGTG ATATTTTCAA    950

                       960        970        980        990      1000

M13140    951 TAAGAATATG AGAGCTCATG CCAAGGAAAA GGGTTTCACA ATCAATGAGT   1000

M-POLB    951 TAAGAATATG AG

GCTCATG CC

GAAAA GGGTTTCACA ATCAATGAGT   1000

                      1010       1020       1030       1040      1050

M13140   1001 ACACCATCCG TCCCTTGGGA GTCACTGGAG TTGCAGGAGA ACCCCTGCCA   1050

M-POLB   1001 ACACCATCCG TCCCTTGGGA GTCACTGGAG TTGCAGGAGA ACCCCTGCCA   1050

                      1060       1070       1080       1090      1100

M13140   1051 GTGGATAGTG AAAAAGACAT CTTTGATTAC ATCCAGTGGA AATACCGGGA   1100

M-POLB   1051 GTGGATAGTG AAAAAGACAT CTTTGATTAC ATCCAGTGGA AATACCGGGA   1100

                      1110       1120       1130       1140      1150

M13140   1101 ACCCAAGGAC CGGAGCGAAT GAGGCCTGTA TCCTCCCTGG CGCAGACACA   1150

M-POLB   1101 ACCCAAGGAC CGGAGCGAAT GAGGCCTGTA TCCTCCCTGG CGCAGACACA   1150

                      1160       1170       1180       1190      1200

M13140   1151 ACCCAATGGG TCTTAATTTA TTTCTTAACC TTTGCTATGT.AAGGGTCTTT   1200

M-POLB   1151 ACCCAATGGG TCTTAATTTA TTTCTTAACC TTTGCTATGT AAGGGTCTTT   1200

                      1210       1220       1230       1240      1250

M13140   1201 GGTGTTTTTA AATGATTGTT TCTTCTTCAT GCTTTTGCTT GCAATGTAGT   1250

M-POLB   1201 GGTGTTTTTA AATGATTGTT TCTTCTTCAT GCTTTTGCTT GCAATGTAGT   1250

                      1260       1270       1280       1290      1300

M13140   1251 CAATAAAACC .......... .......... .......... ..........   1300

M-POLB   1251 CAATAAAACC .......... .......... .......... ..........   1300

蛋白质同源性比较结果

                    10         20         30         40         50

M13140    1 MSKRKAPQET LNGGITDMLT ELANFEKNVS QAIHKYNAYR KAASVIAKYP     50

M-POLB    1 MSKRKAPQET LNGGITDMLT EKQHLL---- ---------- ----------     50

                    60         70         80         90        100

M131405   1 HKIKSGAEAK KLPGVGTKIA EKIDEFLATG KLRKLEKIRQ DDTSSSINFL    100

M-POLB   51 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------    100

                   110        120        130        140        150

M13140  101 TRVSGIGPSA ARKFVDEGIK TLEDLRKNED KLNHHQRIGL KYFGDFEKRI    150

M-POLB  101 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------    150

                   160        170        180        190        200

M13140  151 PREEMLQMQD IVLNEVKKVD SEYIATVCGS FRRGAESSGD MDVLLTHPSF    200

M-POLB  151 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------    200

                   210        220        230        240        250

M13140  201 TSESTKQPKL LHQVVEQLQK VHFITDTRSK GETKFMGVCQ LPSKNDEKEY    250

M-POLB  201 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------    250

                   260        270        280        290        300

M13140  251 PHRRIDIRLY PKDQYYCGVL YFTGSDIFNK NMRAHAKEKG FTINEYTIRP    300

M-POLB  251 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------    300

                   310        320        330        340        350

M13140  301 LGVTGVAGEP LPVDSEKDIF DYIQWKYREP KDRSE..... ..........    350

M-POLB  301 ---------- ---------- ---------- -----..... ..........    350

实施例2：针对M-POLB基因特征点的基因检测方法

设计检测M-POLB基因特征点177-234位缺失的探针。设计探针应用于检测本发明的M-POLB基因。设计探针可以包含部分和全部以下核苷酸序列或互补序列：

5’CTCGCAAACTTTGAGAAGAACGTGAGCCAAGCTATCCACAAGTACAATGCTTACAGAA  3’

具体核酸分子杂交方法见分子克隆。以杂交反应阳性，可早期诊断为食管癌。

PCR扩增检测M-POLB基因特征点177-234位缺失的引物，如：上游引物

5′GTCCTGGTACCTCCTTCAA 3′下游引物5′ACTCGTATCATCCTGCCGAA 3′，扩增片段为365bp为正常，扩增片段为308bp为异常，可早期诊断为食管癌。具体PCR方法见分子克隆。以PCR反应阳性，可早期诊断为食管癌。

PCR扩增检测M-POLB基因特征点462nt G→T；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A的引物。具体PCR方法见分子克隆。以PCR反应阳性，可早期诊断为食管癌。

实施例3 反义RNA

设计包含M-POLB基因特征点177-234位缺失的反义RNA，体外表达或合成，纯化后，用脂质体包裹，注入病变部位。设计的反义RNA如下：

5′CUAUAACAGAUGCUGCUUUUCUGUGAGCAUGUCGGUGAUUCCCCCGUUGAGAGUCUCCUGCGGCGCCUUCCGUUUGCUCAU 3′

实施例4 人M-POLB在大肠杆菌中的表达

以得到M-POLB基因克隆为模板，以含有PstI和HindIII的引物，使用PE公司高保真Taq酶扩增出M-POLB读码框部分基因，用PstI和HindIII双酶切扩增片段和表达质粒pQE-9，然后用T4连接酶连接，转入表达受体菌M15/rep4，M15/rep4含有多拷贝的质粒pERP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan+)。在含有Amp和Kan的LB培养基上筛选转化子，抽提质粒，用PstI和HindIII鉴定插入片段，并测序验证M-POLB表达区cDNA片段已正确插入载体。

在加入Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养上述鉴定过的阳性转化子克隆，培养到光密度(OD₆₀₀)为0.6时加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1mmol/L。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高，继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000g，20min)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中，待澄清后，通过对6-His标记的亲和层析柱分离，然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白进行透析，得到纯的表达蛋白。经电泳分析和氨基酸序列测序，结果与预期一致。冻干保存。

实施例5 人M-POLB在真核细胞(CHO)中的表达

以得到M-POLB基因克隆为模板，以含有HindIII和BamHI的引物，使用PE公司高保真Taq酶扩增出M-POLB读码框部分基因，用HindIII和BamHI双酶切扩增片段和真核表达质粒pcDNA3，然后用T4连接酶连接，转入表达受体菌Ecoli DH5α。在含有Amp的LB培养基上筛选转化子，抽提质粒，用HindIII和BamHI鉴定插入片段，并测序验证M-POLB表达区cDNA片段已正确插入载体。然后在含有Amp(100μg/ml)的液体培养基中过夜培养含所构件的克隆。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)实施。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养。对混合克隆无限稀释，选择具有较高蛋白酶活性的细胞亚克隆。按照常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞，以含0.05％Triton的50mmol/L Tris-HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以.含0.1mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白活性峰。然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白进行透析。冻干保存。

实施例6 抗体制备

将实施5和6中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下，重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳方法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全福氏佐剂乳化，用100-500μg/ml乳化过的蛋白，0.2ml对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全福氏佐剂乳化的100-500μg/ml乳化过的蛋白，0.2ml对小鼠进行加强免疫，以后每各7天进行一次加强免疫，至少进行4次。获得的抗血清的特异性反应用它在体外沉淀M-POLB基因表达产物的能力加以评估。结果显示，抗体可特异性的与本发明蛋白发生沉淀。

附图为本发明的构成图(图1-图6)。采用一些常规方法，图示质粒和DNA片段。在实施本发明中所采取的大部分分子生物学的方法，包括RNA提取、逆转录、PCR、SSCP、DNA重组、DNA序列分析、同源性序列比较、克隆表达等，都是该领域中专业人员所熟知的标准方法。使用的各种酶是由商业来源得到的，并按照说明书建议的方法使用。各种试剂、缓冲液和培养条件都是该领域中的专业人员公知的。这些标准技术的一般参考资料为Sambrook et al，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

″.″表示上下核苷酸一样，″-″表示缺失，图中M13140为GenBank人DNA聚合酶β基因序列，加方框处为，本发明基因特征位点，包括177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G，896位缺失A。

Claims (5)

1、一种人DNA聚合酶β突变体基因，其特征在于：是一种分离出的DNA分子，以M-POLB表示，它是人DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式，与GenBank中人DNA聚合酶β基因M13140比较，它包括：177-234位缺失；462nt G→T；599位T→A；796位G→T；797位T→G；962位A→G；972位A→C；973位A→T；974位G→A；889位插入G；896位缺失A，具体基因序列如下：

        10         20         30         40         50         60

CCGGAGCTGG GTTGCTCCTG CTCCCGTCTC CAAGTCCTGG TACCTCCTTC AAGCTGGGAG

        70         80         90        100        110        120

AGGGCTCTAG TCCCTGGTTC TGAACACTCT GGGGTTCTCG GGTGCAGGCC GCCATGAGCA

       130        140        150        160        170        180

AACGGAAGGC GCCGCAGGAG ACTCTCAACG GGGGAATCAC CGACATGCTC ACAGAAAAGC

       190        200        210        220        230        240

AGCATCTGTT ATAGCAAAAT ACCCACACAA AATAAAGAGT GGAGCTGAAG CTAAGAAATT

       250        260        270        280        290        300

GCCTGGAGTA GGAACAAAAA TTGCTGAAAA GATTGATGAG TTTTTAGCAA CTGGAAAATT

       310        320        330        340        350        360

ACGTAAACTG GAAAAGATTC GGCAGGATGA TACGAGTTCA TCCATCAATT TCCTGACTCG

       370        380        390        400        410        420

AGTTAGTGGC ATTGGTCCAT CTGCTGCAAG GAAGTTTGTA GATTAAGGAA TTAAAACACT

       430        440        450        460        470        480

AGAAGATCTC AGAAAAAATG AAGATAAATT GAACCATCAT CAGCGAATTG GGCTGAAATA

       490        500        510        520        530        540

TTTTGGGGAC TTTGAAAAAA GAATTCCTCG TGAAGAGATG TTACAAATGC AAGATATTGT

       550        560        570        580        590        600

ACTAAATGAA GTTAAAAAAG TGGATTCTGA ATACATTGCT ACAGTCTGTG GCAGTTTCAG

       610        620        630        640        650        660

AAGAGGTGCA GAGTCCAGTG GTGACATGGA TGTTCTCCTG ACCCATCCCA GCTTCACTTC

       670        680        690        700        710        720

AGAATCAACC AAACAGCCAA AACTGTTACA TCAGGTTGTG GAGCAGTTAC AAAAGGTTCA

       730        740        750        760        770        780

TTTTATCACA GATACCCTGT CAAAGGGTGA GACAAAGTTC ATGGGTGTTT GCCAGCTTCC

       790        800        810        820        830        840

CAGTAAAAAT GATGAAAAAG AATATCCACA CAGAAGAATT GATATCAGGT TGATACCCAA

       850        860        870        880        890        900

AGATCAGTAT TACTGTGGTG TTCTCTATTT CACTGGGAGT GATATTTTCA ATAAGAATAT

       910        920        930        940        950        960

GAGGGCTCAT GCCCTAGAAA AGGGTTTCAC AATCAATGAG TACACCATCC GTCCCTTGGG

       970        980        990       1000       1010       1020

AGTCACTGGA GTTGCAGGAG AACCCCTGCC AGTGGATAGT GAAAAAGACA TCTTTGATTA

      1030        1040      1050       1060       1070       1080

CATCCAGTGG AAATACCGGG AACCCAAGGA CCGGAGCGAA TGAGGCCTGT ATCCTCCCTG

      1090       1100       1110       1120       1130       1140

GCGCAGACAC AACCCAATGG GTCTTAATTT ATTTCTTAAC CTTTGCTATG TAAGGGTCTT

      1150       1160       1170       1180       1190       1200

TGGTGTTTTT AAATGATTGT TTCTTCTTCA TGCTTTTGCT TGCAATGTAG TCAATAAAAC

      1210       1220       1230       1240       1250       1260

C......... .......... .......... ........... ......... ..........。

2、一种用于检测权利要求中1所述聚合酶β突变体基因的人探针，其特征在于：通过权利要求1中M-POLB的特征突变点177-234位缺失点设置探针，探针核苷酸序列如下：

5‘-CTCGCAAACTTTGAGAAGAACGTGAGCCAAGCTATCCACAAGTACAATGCTTACAGAA-3’。

3、一种包含权利要求1所述人DNA聚合酶β突变体基因的载体，其特征在于：该载体为pQE9和pcDNA3，将权利要求1所述DNA聚合酶β突变体基因导入，可得到的重组克隆pQE9-M-POLB和pcDNA3-M-POLB。

4、一种由权利要求3所述载体转化的宿主细胞，其特征在于：其为将重组克隆pQE9-M-POLB转化入E.coliDH5α所得到的原核表达所述的多肽M-POLB.AMI的工程菌细胞；重组克隆pcDNA3-M-POLB转化入真核细胞株CHO所得到的真核表达所述的多肽M-POLB.AMI的工程细胞株。

5、一种权利要求2所述探针对应的反义RNA分子，其特征在于：其序列如下：

5‘-CUAUAACAGAUGCUGCUUUUCUGUAAGCAUGUCGGUGAUUCC

CCCGUUGAGAGUCUCCUGCGGCGCCUUCCGUUUGCUCAU-3’。

Images