CN1084565A - 具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因 - Google Patents

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Abstract

一种新型水溶性酶蛋白，它由三种异源亚单位组 成并具有腈水合酶活性，它由根瘤菌属(Rhizobium) 的细菌分离出来并加以纯化。确定了编码该蛋白的 基因的核苷酸顺序；利用具有该核苷酸顺序的表达载 体转化的转化体，该蛋白获得了表达；通过将由培养 转化体而获得培养肉汤，由该培养肉汤分离出的微生 物及类似物与腈起反应生产相应的酰胺。
通过使该培养肉汤，由所述培养肉汤分离出的微 生物及类似物，可以将腈有效地转化成相应的酰胺。

Description

本发明有关一种具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白基因，以及一种通过含该基因的转化体由腈生产酰胺的方法，更具体地说，本发明有关一种具有能由腈产生相应酰胺的活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因，以及用一种表达载体转化的转化体，该表达载体至少具有表达蛋白所必须的启动子顺序，编码该蛋白的DNA顺序和终止区顺序，一种通过转化体培养表达蛋白的方法，和一种通过用一种培养肉汤，一种分离的微生物，一种经过处理的衍生物，一种蛋白或其制动产物处理腈生产酰胺的方法。
对于由水合作用将腈类的腈基转化成酰胺基由此生产相应的酰胺的技术来说，人们已经知道了一种用酸或碱作反应催化剂的加热法和一种用铜催化剂的加热法。然而，近些年来一直沿用的一种方法是用含水溶性酶蛋白的细菌催化剂，也就是腈水合酶来催化水合反应（见日本专利申请待批公开申请号2693/1984和86889/1989;欧洲专利申请公开号188，316;204，555;444，639和93，782;USP5，130，235和4，001，081;UK专利申请公开号2，018，240;2，076，820和2，076，821）。人们认为使用细菌催化剂的方法优于其它的方法，该法可以在环境温度下完成水合反应并且该法能达到很高的转化率。
然而，在使用细菌催化剂时，在制备该细菌催化剂阶段必须采用许多检测，这取决于所使用的细菌催化剂的生物特性，如细菌的安全性评价、优化培养条件等。此外，作为生物催化剂的活性，从成本方面考虑未必很容易提高到工业应用的水平。
作为一种对这种细菌催化剂方法的改进方法，人们正在进行调查研究的一种方法包括通过遗传工程并将腈转化成相应的酰胺来制备一种细菌催化剂，即一种酶腈水合酶，例如日本专利申请待批公开号137688/1988，在酶的水平上描述了一种由两种异源亚单位组成并由红球菌属（Rhodocdccus）得到的腈水合酶;日本专利申请待批-公开号119778/1990公开了一种由两种异源亚单位组成并由红球菌属（Rhodocdccus）得到的腈水合酶基因;和欧洲专利申请公开号444，639公开了一种由两种异源亚单位组成并由假单胞菌属（Pseudomonas）得到的腈水合酶基因;和欧洲专利申请公开号455，646公开了一种由两种异源亚单位组成并由玫瑰色红球菌（Rhodocdccus  rhodochrous）得到的腈水合酶基因。
为了制取具有高催化活性的细菌催化剂，本发明者们进行了调查研究，从而在一种转化体中借助重组DNA技术生产大量的具有特别高的腈水合活性的（即腈水合酶活性）蛋白。由此，本发明者首次分离并纯化出了适用于这一目的新型的蛋白（经常称作“腈水合酶蛋白”、“腈水合酶AM24蛋白”、或下文的“AM24蛋白”）。此外，本发明者们还首次分离和离析出了编码该蛋白的基因。另外，他们还将所述基因整合到一种表达载体中以产生一种转化体，并且借助于该转化体成功地实现了大规模生产腈水合酶蛋白。因此，发明者们完成了本发明。
本发明的中心在于具有下列特征性物理化学性质的一种新型蛋白和编码该蛋白的基因，以及由腈借助于含有所述基因的转化体制备酰胺的方法：
1.一种水溶性酶蛋白，由三种亚单位组成且具有约110，000的分子量（它是由凝胶过滤法测定的），其中按SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的各亚单位的分子量如下：
亚单位α的分子量：26，000±500道尔顿
亚单位β的分子量：15，000±500道尔顿
亚单位γ的分子量：16，500±500道尔顿
2.具有腈水合酶活性。
本发明将详细地予以说明。
附图：
图1表明Charomide克隆，pchAM24-1的构建过程，它具有包括编码本发明AM24蛋白的基因区域在内的DNA片段和AM24蛋白表达载体，pEAM24×1。
在该图中，Ampr代表氨苄青霉素抗性基因;cos代表cos区域;和ori代表复制起始位点。
图2表明载体pEAM24×1的构建过程，该载体表达本发明的AM24蛋白。
在该图中，Ampr和cri与图1的相同;lacIq代表抑制基因;Ptac代表tac启动子;和Ipp3′代表Ipp基因终止区。
本发明所述的新型蛋白，腈水合酶AM24蛋白，能按如下所述进行纯化。正如下文实施例所描述的，将根瘤菌属（Rhizobium）sp.MCI2643（中国专利申请号92，110，448，0;作为在中国，湖北，武汉，武汉大学C/O生物系中国典型培养物保藏中心寄存号）破裂后离心，将所得到的上清液通过在Butyl-Toyopearl柱等（TOSOH公司制造）进行疏水色谱而分级分离。然后将合适的峰再进一步在DEAE-Toyopearl柱等上进行色谱而分级分离。将该馏份最后用TSK凝胶G3000SW等进行分子筛色谱，由此产生一种纯化的样品。本发明纯化的蛋白是一种由三种亚单位α、β和γ组成的水溶性蛋白，这些亚单位分别具有26，000±500道尔顿、15，000±500道尔顿和16，500±500道尔顿的分子量（由SDS-聚丙烯酰胺电泳法测定，并且具有借助水合反应能将腈转化成酰胺的活性，即腈水合酶活性。
本发明AM24蛋白是一种由三种亚单位组成的蛋白，该亚单位具有如SEQ  ID  No.1、2、3和4所示的氨基酸顺序，即α-亚单位（SEQ  ID  No.1）、β-亚单位（SEQ  ID  No.2）、和γ亚单位（SEQ  ID  No.3或4）。其修饰产物，例如部分氨基酸发生去除、取代、修饰或加成之后所产生的产物，也包括在本发明AM24蛋白范围之内。
编码AM24蛋白的基因包括例如具有如SEQ  ID  No.5或6所示的核苷酸顺序的那些基因。
编码本发明AM24蛋白的基因的DNA片段可通过下列方法产生。
作为含有编码本发明蛋白的基因的DNA库，将由上述根瘤菌属（Rhizobium）sp.MCI2643制得的染色体DNA用于按已知 惯用方法制备phagemide库。按Saito等人的方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，8664-8668，1986），将来自DNA库的phagemide转化到以后进行培养的寄生细胞中，通过菌落杂交法（Molecular  Cloning，Cold'Spring  Harbor  Laboratory，320-328，1982），使用部分DNA片段或具有与部分经过鉴定的该蛋白的氨基酸顺序对应的核苷酸顺序的DNA片段作为一种探针对通过培养形成的菌落进行选择，以产生所需的DNA。
用于菌落杂交法的探针是一种DNA片段，该片段是编码由聚合酶链反应（下文缩写为“PCR”）产生的AM24蛋白的部分基因（Science，239，487-491，1982）。通过用SEQ  ID  7（对应于SEQ  ID  No.1氨基酸顺序的1号-7号氨基酸）的+链DNA引物和SEQ  ID  8（对应于SEQ  ID  No.3氨基酸顺序的2号-9号氨基酸或SEQ  ID  No.4氨基酸顺序的3号-9号氨基酸）的-链DNA引物进行PCR，所得到的示于SEQ  ID  No.5中的966-bp  DNA片段可用作为所述探针。可以使用以由AM24蛋白的氨基酸顺序获得的DNA顺序为基础而合成的寡核苷酸。
按Maniatis等人的方法（Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，85，1982），上述筛选中的阳性菌落可用于制备DNA，可以用合适的限制性酶，例如BamHI将其分裂，再克隆到质粒如pUC18中。该所需DNA片段的核苷酸顺序可按Sanger等人所述的二脱氧链终止法测定（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463，1977）。
这样确定的该DNA片段核苷酸顺序（例如SEQ  ID  No.5和6）编码三种蛋白，即α-亚单位（198个氨基酸残基）、β-亚单位（104个氨基酸残基）和γ-亚单位（115或116个氨基酸残基），其所含核苷酸顺序对应于示于SEQ  ID  No.1中的纯AM24蛋白的α亚单位的部分氨基酸顺序（SEQ  ID  No.1氨基酸顺序中的1-7号氨基酸）和示于SEQ  ID  No.3或4中的纯AM24蛋白γ-亚单位的部分氨基酸顺序（SEQ  ID  No.3氨基酸顺序中的2-8号氨基酸或SEQ  ID  No.4氨基酸顺序中的3-9号氨基酸）并且这三种蛋白分别由594、312和345或348个核苷酸组成。本发明的DNA片段不限于编码SEQ  ID  No.1-4氨基酸顺序的一种片段，它还包含编码修饰的氨基酸顺序的片段，只要该片段具有将腈转化为酰胺的水合活性。
将由此获得的DNA片段在其5′末端上修饰随后按已知方法将其插入在启动子下游的一种已知的表达载体中，并将具有插入的DNA的该表达载体按已知方法引入已知的寄主细胞内，如埃氏大肠杆菌（Escherichia  Coli）、酵母、动物细胞等。
所述的本发明的AM24蛋白的制备方法将详细地予以描述。作为表达载体，使用的表达载体在某个位点上含有启动子，在该位点处编码由上述方法获得的AM24蛋白的DNA能被转译。假若寄主是微生物，如埃氏大肠杆菌（Escherichia  Coli）和枯草杆菌（Bacillus  subtilus），表达载体最好含有启动子，Shine-Dalgarno（SD）顺序、AM24蛋白的基因、转译终止顺序和启动子调节基因。
所述启动子包括由埃氏大肠杆菌（Escherichia  Coli）、噬菌体等得到的启动子，例如色氨酸合酶（trp）、乳糖操纵子（lac）、λ噬菌体（lambda  phage）PL，PR和属于TS及其类似物的起始基因启动子的P25和P26启动子。
所述启动子可以是一种独立修饰和设计启动子。例如pac启动子（Agric.Biol.Chem.，52，983-88，1988）。
Shine-Dalgarno顺序可以是由埃氏大肠杆菌（Escherichia  coli）、噬菌体等获得的顺序，或那些具有一致（consensus）顺序的，该顺序具有4个或更多连续碱基的区域，它是与通过DNA合成产生的16S核蛋白体的3′终端区互补的顺序。
转译终止顺序不是必需的，但是最好是含有P-独立顺序的顺序，例如脂蛋白终止区、trp操纵子终止区等顺序。
此外，在表达质粒上进行这种表达所必须的元素顺序从5′上游端算起最好是启动子，SD顺序，AM24蛋白的基因和转译终止成分。
另外，所使用的方法包括在该载体上增加转译单位的拷贝数，此时通过在该表达载体上的相同方向插入多个SD顺序单位和AM24蛋白的基因而实现（日本专利申请待批-公开号95795/1989）。
所用的表达载体包括pUAI2（日本专利申请待批-公开号95798/1989）和市场上买得到的pKK233-2（由Pharmacia制造）及其类似物。另外，pGEX系列，能生产融合蛋白的表达载体同样可以使用。
转化寄主的方法可采纳常规方法。
可以按照在Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，1982中所描述的方法培养转化体。培养的温度大约为28-42℃。
转译所用寄主是埃氏大肠杆菌（Escherichia  coli），如下文实施例所描述的，但寄主并不仅限于埃氏大肠杆菌（Escherichia  coli）。寄主生物体如其它的微生物、动物细胞和昆虫细胞也同样能使用。
将通过培养转化体所获得的AM24蛋白按已知方法从寄主中分离并纯化。
为了将腈转化为本发明的酰胺，可使用该转化体的培养肉汤，由该培养肉汤分离出的微生物，经过处理的微生物，制动的微生物，粗酶溶液，经过处理的酶制动的酶等。
本发明的腈包括例如具有2-4个碳原子的腈，如乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、亚-丁腈、异丁腈等。丙烯腈是有代表性的。
利用下列实施例将详细描述本发明，除非偏离了本发明的精神和范围，否则本发明不限于这些实例。
例1
纯化AM24蛋白并确定部分氨基酸顺序。
将由土壤根瘤菌属（Rhizobium）sp.MCI2643分离出的一种细菌在培养基（20g/l葡萄糖、7.5g/l脲、0.5g/l KH2PO4、0.5g/l KH2PO4、0.5g/lMgSO4·7H2O、10mg/l CoCl2·6H2O、1g/l酵母汁、5g/l多胨）中于28℃下培养40小时，之后离心（6000×g，20分钟）采集。将采集的细菌在生理盐水中洗涤后再次悬浮于缓冲液中（50mM HEPES/NaOH，0.1M NaCl，pH8.0）。将该悬浮液在冰冷条件下超声处理（100W，10分钟），继之于25，000×g下离心20分钟以回收上清液。逐渐向该上清液中加入饱和的硫酸铵至终浓度25%（W/V），将所得到的沉淀于25，000×g下离心20分钟而后倒出。向该上清液中加入饱和硫酸铵至终浓度为65%（W/V），将所得到的沉淀物于25，000×g下离心20分钟后收集起来。将沉淀物于4℃下溶解在上述缓冲液中，随后加入饱和硫酸铵至终浓度25%（W/V）。将得到的溶液在Butyl-Toyopearl柱上（1.2×20Cm）分级分离，即将该柱用含25%的硫酸铵缓冲液充分洗涤，随后用25%-0%的硫酸铵进行梯度洗脱以收集具有腈水合酶活性的馏份。
将活性馏份以10mM双-tric-丙烷，pH6.5为背景进行渗析，然后加到用相同溶液平衡过的DEAE-Toyopearl柱（0.7×20Cm）中。将该柱用相同溶液洗涤，用0-0.7M  NaCl进行梯度洗脱以分级分离活性馏份。将该馏份用Millipore制造的Ultra-free（10，000切断）浓缩，随后放入用缓冲液（50mM  HEPES/NaOH，0.1M  NaCl，PH7.5）平衡过的TSK凝胶G3000SW柱中。在柱洗涤之后，进行0-0.7M  NaCl梯度洗脱。在馏份中，在体积13.5ml洗脱的主峰显示出腈水合酶活性，在非还原性条件下进行电泳表明它为单一谱带。
此外，将所述馏份加到YMC填充C4柱（AP-802  S-5  300A  C4，0.46×15Cm）中，该柱已用含0.1%TFA（三氟乙酸）的20%乙腈平衡过，继之用20%-60%乙腈进行梯度洗脱以分离三种类型的亚单位馏份。将这些馏份分别在减压下干燥，溶解于60μl的50%的TFA中，吸附到用溴化己二甲铵处理过的玻璃滤料上，再用477型顺序分析仪进行Edman降解以确定N-末端的氨基酸顺序，该顺序分析仪是由AAplied  Biosystems制造的。在纯化过的亚单位中，将β-亚单位溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液pH8.5中，再于37℃下以酶与基质比为1∶200与由WAKO化学公司制造的赖氨酰肽链内切酶反应18小时，然后再进行高效液相色谱（HPLC）以产生肽的片段。还确定了一种肽片段的氨基酸顺序。由此表明α-亚单位的N-末端氨基酸顺序是SEQ  ID  No.9;β-亚单位的N-末端氨基酸顺序是SEQ  ID  No.10;β-亚单位的赖氨酰肽链内切酶的氨基酸顺序是SEQ  ID  No.11;γ-亚单位的N-末端氨基酸顺序是SEQ  ID  No.12。
另外，用15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化过的AM24蛋白的结果表明各个亚单位即α-亚单位、β-亚单位和γ-亚单位的分子量分别为26，000±500道尔顿，15，000±500道尔顿和16，500±500道尔顿。
还有，AM24蛋白的α-亚单位，β-亚单位和γ-亚单位的氨基酸顺序分别如SEQ  ID  No.1、2、3或4中所示。
例2
AM24蛋白的腈水合酶活性的评价（1）
分离的细菌和酶溶液（AM24蛋白溶液）的活性测定如下。将1份体积的7%（V/V）丙烯腈和3份体积的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0，加入1份体积的细菌悬浮液或酶溶液中，并在25℃下一块反应10分钟。反应之后，加入1份体积的1N  HCl以终止反应，继之用纯水稀释100倍。将所得到的稀释液（10μl）加到HPLC的ODS柱上（Nuceosil  100-5C18），然后用含10%乙腈的0.1M磷酸二氯钠溶液洗脱。将产物丙烯酰胺立即在λ＝195nm的光谱仪上检验。
例3  AM24蛋白腈水合酶活性的评价（2）
将1份体积的AM24蛋白溶液（其280nm的吸收率为0.1）和4份体积的0.5M磷酸盐缓冲液，pH7.0混合在一块，向其中添加90份体积的0.2%（V/V）腈化合物溶液，并于25℃下反应5分钟。反应后，加入5份体积的1N HCl以终止反应，再将所得到的溶液加到HPLC的ODS柱上，以测定所得到的酰胺化合物。当用腈化合物作基值时，可使用丙烯腈、丙腈、正-丁腈、异丁腈、乙腈、氯乙腈、氰基乙酰胺、甲基丙烯腈、3-氰基吡啶、苄腈和chrotononitrile。
每种基质的相对活性列于表1，此时假定用丙烯腈作反应基质时的活性为100。
这表明本发明的AM24蛋白能用于从各种腈生产相应的酰胺。
表1  AM24蛋白的基质特异性
基质  比活性(%)
丙烯腈  100
丙腈  59
正-丁腈  152
异丁腈  28
乙腈  47
氯乙腈  671
氰基乙酰胺  143
甲基丙烯腈  143
3-氰基吡啶  9
苄腈  251
chrotononitrile  34
例4  通过PCR制备部分DNA片段AM24蛋白
将由土壤，即根瘤菌属（Rhizobium）sp.MCI2643（如上所述）分离出来的基质细菌的染色体DNA按常规方法制备。也就是说，通过稍微改进的苯酸-氯仿法，由培养的细菌制备DNA，方式如下（Molecular  Cloming，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，1982）。
将菌株根瘤菌属（Rhizobium）sp.MCI2643接种并培养于100ml例1所述的培养基中，然后采集。将该菌株用TES（10mM  Tris-HCl，pH7.5，1mM  EDTA，50mM  NaCl）洗涤，再悬浮于5ml的TE中（10mM  Tris-HCl，pH7.5，1mM  EDTA），继之加入10mg的溶菌酶以在37℃下培养30分钟。通过不断地重复冻干和重组使细胞破裂。然后，在搅拌的同时逐渐加入1%（W/V）SDS至终浓度为0.33%，随后进一步加入蛋白酶K（由Sigma有限公司制造）至终浓度0.1mg/ml。将所得到的混合物于60℃下培养5小时。加入相同体积的TE饱和苯酚-氯仿并于室温下轻度振荡过夜（这一过程下文称作“苯酚处理”）。离心后，收集最上面的相，向该相中添加等体积的氯仿以再提取。离心后往最上面相中加入等体积的乙醇，使DNA受到创伤并用玻璃棒将其取出，接着依次用70%、85%和99.5%的乙醇将其脱水。然后将DNA溶解于3ml的TE缓冲液中，接着加入没有DNA酶的RNA酶A水溶液至终浓度为10μg/ml并于37℃下培养1小时。接着，通过苯酚处理和乙醇沉淀回收DNA。从而获得700μg的染色体DNA。
按制造商的说明使用Perkin Elmer Cetus DNA热循环控制装置和Gene AMP DNA扩增试剂盒（由TAKARA LIQUOR制造）一起完成PCR。也说是说，通过混合1μl（相当0.5μg的量）的基质DNA、10μl 10倍浓度的反应缓冲液（500mM KCl，100mM Tris-HCl，pH8.3，15mM MgCl2和0%（W/V）明胶）、16μl的1.25mM 4 dNTP、5μl各50μM+链DNA引物5′ATGGAA/GCCNTAC/TACNAAA/GCC3′[（20核苷酸，“N”意指“次黄苷”，SEQ ID No.7），对应于SEQ ID No.1氨基酸顺序的1-7号氨基酸]的引物＃1-链DNA引物5′ATA/GTCC/TTCIGGA/GTTIACICC3′[（20核苷酸，SEQ ID No.8），对应于SEQ ID No.3氨基酸顺序的2-9号氨基酸或SEQ ID No.4 氨基酸顺序的3-9号氨基酸]的引物＃2以及0.5μl  Taq  DNA聚合酶而制成100μl溶液。反应进行方式如下：重复35次循环，每次循环都包含在94℃下预处理10分钟随后于94℃下培养1分钟（修饰期），46℃下培养1.5分钟（退火期）和72℃下培养2分钟（伸长期）。最终在72℃下培养7分钟后而将反应终止。所得到的反应溶液用苯酚∶氯仿＝1∶1提取，随后用乙醇进行沉淀。沉淀物溶解于16μl的无菌去离子水中，接着进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并按常规方法回收966-bp的带接着用乙醇进行沉淀。将DNA沉淀物溶解于16μl的无菌去离子水中，接着加2μl  10倍浓度的T4DNA聚合酶缓冲液（0.33M  Tris-乙酸盐，pH7.9，0.66M乙酸钾，0.1M乙酸镁，5mMDTT），1μl  1.25mM  4dNTP和1μl  T4DNA聚合酶（6单位）以制备总计20μl的溶液，然后在37℃下反应30分钟。因此，收集到双链钝端DNA。
在将该DNA片段插入VC118载体中的SmaI位点之后，用由Dupont制造的荧光DNA顺序分析仪确定其核苷酸顺序。PCR片段的核苷酸顺序确定如SEQ  ID  5所示。在由966-bp  DNA片段编码的氨基酸顺序中，对应于SEQ  ID  1氨基酸顺序中的5′端的40个氨基酸残基1-40号氨基酸，3′端的7个氨基酸残基对应于SEQ  ID  No.3氨基酸顺序中的2-7号氨基酸而3′端的8个氨基酸残基对应于SEQ  ID  No.4氨基酸顺序中1-8号氨基酸。由此，该氨基酸顺序与由纯化的AM24蛋白中确定的氨基酸顺序完全一致。
例5  筛选含有编码全长AM24蛋白的DNA片段的克隆
用32P将在上述例4中制备的966-bp PCR片段，按照在Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，1982中所描述的方法标记，然后将其用作筛选的探针。
往在上述例4中制备的10μl（相当于5μg的量）染色体DNA样品中加入浓缩10倍的限制性酶缓冲液（500mM  Tris-HCl，pH7.5，100mM氯化镁，1M氯化钠，10mM  DTT），16μl无菌的去离子水和1μl（15单位）限制性酶BglII并在37℃下反应2小时，继之进行琼脂糖凝胶电泳（65V，4小时）并用如Molecular  Cloning（Cold  Spring  Harbor  Laboratory，1982）中所述的探针进行Southern杂交。由此表明能与该探针强烈杂交的DNA片段存在于大约5.2Kb的位置上。
然后，往40μl（相应于20μg的量）的染色体DNA样品中加入8μl浓缩10倍的限制性酶缓冲液（500mM  Tris-HCl，pH7.5，100mM氯化镁，1M氯化钠，10mM  DTT）、29μl无菌去离子水和3μl（45单位）限制性酶BglII并在37℃下反应2小时，接着进行琼脂糖凝胶电泳（65V，5小时）以分离和回收大约5.2Kb的DNA片段（按Cold  Spring  Harbor  Laboratory在Molecular  Cloning，1982中所描述的方法）。
将由此回收的大约5.2Kb  DNA片段制成至少10pmole的数量，使用连接盒（ligation  Kit）（TAKARA  LIQUOR制造）将其插入Charomide9-36克隆载体（由Nippon  Gene股份有限公司制造）中多克隆位点中的BamHI位点中。将如下制得的1μg载体DNA用于这种连接。将Charomide  9-36克隆载体用限制性酶BamHI（由TOYOBO有限公司制造）裂解，接着用苯酚/氯仿进行处理和用乙醇沉淀，其后用碱性磷酸酶（由BOEHRINGER  MANNHEIM有限公司制造）使5′端脱去磷酸（Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，1982），接着进一步用苯酚-氯仿进行处理和用乙醇沉淀。
将这样制备的DNA用Giga Pack Gold Packaging Kit（由STRATAGENE制造）封装到λ-噬菌体颗粒中。按照该盒中所述的制造商说明，将2μl的连接DNA溶液用于反应。封装反应后，按所附的制造商说明进行转染。将系列稀释的细菌溶液涂于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基（10%酵母汁，0.5%细菌用胰化胨，0.5%氯化钠）上，该培养基位于15cm直径的阮氏培养皿中。将每只阮氏培养皿具有102-103克隆的培养皿用于库筛选。将TOYOBO公司制造的大肠杆菌5α竞争细胞（COMPETENE HIGH）用于转染。
按照所附的说明，用尼龙膜，即由NEN有限公司制造的Colony/Plaque筛将基因库筛选。也说是说，将在一块培养板上培养的菌落转移至两块膜上，然后将其放置于浸过0.1M氢氧化钠和0.5M氯化钠的滤纸上达2分钟，并另外置于只浸过1.5M氯化钠-0.5M Teis-HCl，pH7.5滤纸上达5分钟，在进一步用滤纸重复这种处理两次之后，将该滤纸用2×SSC（两倍SSC溶解）洗涤并在干燥的过滤纸上吹干。转移至膜上的DNA通过用120mJ/m2紫外照射而制动。
将如此处理过的4种膜（相应于5，000菌落）用15ml的杂交溶液[3×SSC，0.1%SDS，10×Denhardt（10倍浓度的Denhardt;1%牛血清清蛋白、1%聚乙烯基吡咯烷酮、1%  Ficoll  400）、10μg/ml鲑鱼精液DNA]于65℃下浸透2小时。在该过程中，将由例4制备的966-bp DNA片段用例4中所述的PCR引物＃2，按照常用的方法进行32P标记。将上述滤膜用15ml含有浓度为1μci/ml的32P标记DNA的新鲜杂交溶液于65℃下浸透20小时。取出膜后用含1%SDS的2×SSC溶液洗两遍，再于含0.1%SDS的0.2×SSC溶液中于65℃下15分钟内洗两遍，接着进行放射自显影。从而，菌落获得了识别，在一对膜的放射自显影图上的阳性信号彼此非常一致。
将所述菌落在LB培养介质中（1%酵母汁、0.5%细菌用胰化胨、0.5%氯化钠）培养接着稀释，将大约100个菌落接种到装有LB琼脂培养基（含50μg/ml氨苄青霉素）的各培养皿中，继之用32P标记DNA片段进行杂交以识别阳性单菌落克隆。
例6  亚克隆该DNA片段和确定其核苷酸顺序
由识别出的克隆，按常规方法制备质粒DNA（Molecular  Cloning，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，86-89（1982）），由此用限制性酶将所需的DNA区域恰当地裂解成较小的片段。再将该片段亚克隆到质粒载体pUC18和pUC19中。由所得到的亚克隆，按常用方法制成质粒DNA，其顺序用荧光顺序分析仪确定，该分析仪为Dupont制造的GENESIS  2000系统。作为顺序引物，可使用下列两种类型的合成引物;5′d(GTAAAACGACGGCCAGT)3′（SEQ  ID  No.13）和5′d(CAGGAAACAGCTATGAC)3′（SEQ  ID  No.14）以测定DNA片段+链和-链的核苷酸顺序。获得示于SEQ  ID  No.5中的核苷酸顺序。克隆全长5.2Kb的DNA片段（其中含有编码1和4中所鉴定的氨基酸顺序的区域）并确定所述片段的核苷酸顺序。
例7  构建产生AM24蛋白的质粒和获得转化体
将含有例6产生的AM24蛋白基因的DNA的Charomide  pchAM24-1（图1）按常用方法制备。在用限制性酶XbaI消化2μg该质粒DNA后，该DNA末端用T4DNA聚合酶钝化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳接着进行苯酚/氯仿提取分离含有所需AM24蛋白编码区的DNA片段，而后，将该DNA片段通过乙醇沉淀法纯化然后溶解于10μl的无菌水中。接着将1μl这种溶液与10ng的表达载体pVSI2混合（日本专利申请待批-公开号95798/1989），所述载体pVSI2用限制性酶SmaI裂解，再用由牛肠粘膜制成的碱性磷酸酶使其脱去磷酸，之后用DNA连接盒（由TAKARA  LIQUOR制造）将这两部分连接在一起。
使用该反应溶液转化埃氏大肠杆菌（Escherichia  Coli）DH5α细胞并用Maniatis等人的方法对其进行分析（Molecular  Cloning，365-381（1982）），由此获得包含AM24蛋白表达质粒，PEAM24×1（图2）并带有插入方向与该表达载体启动子转录方向相同的DNA片段的转化体。
例8  用转化体表达AM24蛋白并将腈转化为酰胺
将由例7所获得的含有pEAM24×1的转化体在27℃下于10ml的LB培养基（含50μg/ml氨苄青霉素）中培养过夜。将其中体积为百分之一的培养肉汤加入10ml的LB培养基（含50μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml COCl2·5H2O）中并在其中在27℃下培养2小时，然后加入作为转译诱导物的IPTG至终浓度为1mM，接着在27℃下进一步培养12小时。离心并采集菌株，在生理盐水中冲洗一次，再悬浮于1.6ml的磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.1M）。取悬浮液0.32ml作试样，接着与80μl的7%丙烯腈溶液混合以便在30℃下反应1小时。如前所述通过加入HCl终止该反应，而后，用HPLC测定反应溶液中的丙烯酰胺和丙烯腈的浓度。由此发现丙烯腈转化成丙烯酰胺是完全的。
相反，当使用缺少表达质粒，pEAM24×1的埃氏大肠杆菌（Escherichia  Coli）DH5α细胞时，在反应溶液中检测不到丙烯酰胺。
当将包含pEAM24×1的转化体在无钴的培养基内培养时，反应终止后在反应溶液中检测不到丙烯酰胺。因此钴对于腈水合酶活性是必不可少的。
例9  由转化体中提纯出AM24蛋白并确定部分氨基酸顺序
将用例8的方法培养的0.9克湿细胞重的转化体在生理盐水中进行洗涤，而后，将洗涤过的转化体悬浮于缓冲溶液中（50mM  HEPES/NaOH，0.1M  NaCl，pH8.0）。将该悬浮液在冰冷条件下超声处理（100W，5分钟）接着在25，000×g下离心20分钟以回收上清液。将该上清液用硫酸铵分级分离法，再经Butyl-Toyopearl柱色谱，DEAE-Toyopearl柱色谱和TSK凝胶G3000SW柱色谱，（如在例1中一样）加以纯化。这样，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时就会产生单一带的纯化产品。该纯化产品具有和由根瘤菌属（Rhizobium）sp.MCI2643菌株得到的纯化的AM24蛋白相同的分子量和相同的特异活性。
按与例1中相同方式用赖氨酸肽链内切酶使该纯化产品断裂，并确定两个片段的部分氨基酸顺序。各个肽段的氨基酸顺序与AM24蛋白氨基酸顺序的部分氨基酸顺序（SEQ  ID  No.1和No.3或4）（可由SEQ  ID  No.5导出）是相同的。
按照本发明，获得了一种新型的编码多肽的DNA片段，该多肽具有三种亚单位α.β和γ的氨基酸顺序并能显示出腈水合酶活性。此外，其核苷酸顺序也被确定。由于使用了微生物和微生物提取物及其类似物，而它们是通过培养包含本发明构建的表达质粒的转化体而获得的，故可以将腈化合物转化成相应的酰胺化合物。本发明可用于由腈有效地生产酰胺。
（1）有关SEQ  ID  NO.1的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：198个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.1：
Figure 931061229_IMG1
Figure 931061229_IMG2
（1）有关SEQ  ID  NO.2的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：104个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.2：
（1）有关SEQ  ID  NO.3的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：115个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.3：
Figure 931061229_IMG4
100              105                      110
Glu Asn Gln
（1）有关SEQ  ID  NO.4的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：116个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.4：
Figure 931061229_IMG5
Figure 931061229_IMG6
（1）有关SEQ  ID  NO.5的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：966碱基对
（B）类型：核酸
（C）链性：双链
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：基因组DNA
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅶ）直接来源
（B）克隆：J121
（ⅹⅰ）特征
（A）名称/检索表：P  CDS（α亚单位）
（B）位置：1..597
（C）鉴定方法：E
（ⅹⅰ）特征
（A）名称/检索表：P  CDS（β亚单位）
（B）位置：627..941
（C）鉴定方法：E
（ⅹⅰ）特征
（A）名称/检索表：（γ亚单位的N-末端顺序）
（B）位置：941..966
（C）鉴定方法：E
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.5：
Figure 931061229_IMG7
Figure 931061229_IMG8
Figure 931061229_IMG9
N∶A或G或C或T，R∶A或G，Y∶C或T
（1）有关SEQ  ID  NO.6的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：1291碱基对
（B）类型：核酸
（C）链性：双链
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：基因组DNA
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅶ）直接来源
（B）克隆：pChAM24-1
（ⅹⅰ）特征
（A）名称/检索表：P  CDS（α亚单位）
（B）位置：1..597
（C）鉴定方法：E
（ⅹⅰ）特征
（A）名称/检索表：P  CDS（β亚单位）
（B）位置：627..941
（C）鉴定方法：E
（ⅹⅰ）特征
（A）名称/检索表：P  CDS（γ亚单位）
（B）位置：941..1291
（C）鉴定方法：E
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.6：
Figure 931061229_IMG11
（1）有关SEQ  ID  NO.7的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：20碱基对
（B）类型：核酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.7：
ATGGARCCNTAYACNAARC      20
R∶G或A，N∶次黄苷，Y∶C或T
（1）有关SEQ  ID  NO.8的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：20碱基对
（B）类型：核酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.8：
ATRTCYTCNGGRTTNACNCC        20
R∶G或A，N∶次黄苷，Y∶C或T
（1）有关SEQ  ID  NO.9的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：40氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅴ）片段类型：N-末端片段
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.9：
（1）有关SEQ  ID  NO.10的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：28氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅴ）片段类型：N-末端片段
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.10：
Figure 931061229_IMG13
（1）有关SEQ  ID  NO.11的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：13氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅴ）片段类型：内部片段
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.11：
Gly Ile Phe Thr GLn Glu Glu Leu Asp Val Arg Leu Lys
1 5 10
（1）有关SEQ  ID  NO.12的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：20氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：肽
（ⅵ）来源
（B）菌株：根瘤菌属sp.MCI2643
（ⅴ）片段类型：N-末端片段
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.12：
Figure 931061229_IMG14
（1）有关SEQ  ID  NO.13的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：17碱基对
（B）类型：核酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.13：
GTAAAACGACGGCCAGT  17
（1）有关SEQ  ID  NO.14的信息
（ⅰ）顺序特征：
（A）长度：17碱基对
（B）类型：核酸
（D）拓扑型：线性
（ⅱ）分子类型：合成DNA
（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO.14
CAGGAAACAGCTATGAC  17

Claims (10)

1、一种新型蛋白，其特征在于具有下列物理-化学性质：
i一种水溶性酶蛋白，由三种亚单位组成，用凝胶过滤法测其分子量为约110，000，其中由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的亚单位分子量如下：
亚单位α分子量：26，000±500道尔顿
亚单位β分子量：15，000±500道尔顿
亚单位γ分子量：16，000±500道尔顿
ii具有腈水合酶活性。
2、一种按权利要求1的蛋白，其中亚单位α由SEQ  ID  No.1的氨基酸顺序表示。
3、一种按权利要求1的蛋白，其中亚单位β由SEQ  ID  No.2的氨基酸顺序表示。
4、一种按权利要求1的蛋白，其中亚单位γ由SEQ  ID  No.3或4的氨基酸顺序表示。
5、一种编码权利要求1-4中所述蛋白的基因。
6、一种按权利要求5的基因，由SEQ  ID  No.5戒6所描述的核苷酸顺序表示。
7、一种重组表达载体，它表达由权利要求5或6所述的基因编码的多肽。
8、一种转化体，它通过用权利要求7所述的重组表达载体转化寄主细胞而获得。
9、一种制备权利要求1所述蛋白的方法，包括培养权利要求8所述的转化体。
10、一处生产酰胺的方法，包括用通过培养权利要求8所述的转化体而获得的培养肉汤，由所述培养肉汤中分离出的微生物，经过处理的微生物，权利要求1或2所述的蛋白，或其制动产物处理腈。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication