CN1228447C - 一种含有人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因的重组表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及编码人胰激肽释放酶成熟蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，携带编码人胰激肽释放酶成熟蛋白基因的分泌型和非分泌型重组载体以及转化的宿主细胞，本发明还涉及应用基因工程技术制备重组人激肽释放酶的方法。本发明的表达载体可高效表达具有胰腺激肽释放酶活性的蛋白产物，同时，本发明的表达载体中还融合了His亲和序列，包含该亲和序列的表达产物，在分离纯化时可利用His亲和树脂进行亲和层析纯化。本发明为开发人源组织激肽释放酶基因工程产品，开发人源组织激肽释放酶的基因药物奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种编码人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；
本发明还涉及携带人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因的重组表达载体。
本发明还涉及由该重组表达载体转化的宿主细胞。
本发明还涉及应用基因工程技术制备重组激肽释放酶的方法。
背景技术
人类激肽释放酶分为两大类，即血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。组织激肽释放酶为一簇性质相似的化合物，可以由肝脏、胰脏、脑神经等合成。组织激肽释放酶基因编码的蛋白首先表达生成前体完整蛋白，该前体蛋白在体内经过蛋白酶切割加工后成为具有生物活性的成熟蛋白。组织激肽释放酶基因编码组织激肽释放酶(E.C.3.4.21.35)，它是一种丝氨酸蛋白酶，通过裂解低分子量的激肽原生成具有血管活性的激肽，后者参与机体一系列的生理及病理过程。
一、胰激肽释放酶的生理作用
1.胰激肽释放酶与机体血压调节及肾脏功能的关系
激肽释放酶和激肽系统(KKS)是维持血压平衡中降压系统的一个重要组成部分，与利钠肽系统、EDRF/NO、PGE2/PDI2等共同参与血压的舒张调节。KKS的功能缺陷或抑制很可能参与了高血压的发生和维持。组织激肽释放酶(Kallikrein，KK)是机体激肽释放酶-激肽系统的重要成员。KK在人体的许多部位广泛表达，通过与其他血管活性物质的相互作用，参与肾脏功能的调节。组织激肽释放酶能够裂解低分子量激肽原(kininogen)生成具有血管活性的激肽(kinin peptide)，后者可与缓激肽(bradykinin)B2受体相结合产生广泛的生理效应，包括扩张肾内小动脉，增加肾血流量，抑制球旁细胞分泌肾素并促进髓质细胞分泌PGE2；抑制近曲小管对钠、水的重吸收；进入血循环后，扩张外周血管，增加血管通透性，使血压下降，并促进电解质及葡萄糖的转运。研究表明，肾组织受损时，由小管产生的激肽释放酶减少，肾激肽水平下降。在抗肾小球基底膜抗血清所致的肾病综合征模型大鼠中，尿激肽释放酶水平明显降低，且与蛋白尿程度成反比。由于尿中的激肽释放酶来源于肾脏，表明组织KK参与肾脏功能的调节及血压的自身平衡。将纯化后的大鼠组织KK对饲高盐饮食的Dah1-盐敏感大鼠进行长时间灌流发现，大鼠的肾小管硬化减轻。表明，施于组织KK对机体的血压调节及肾脏功能恢复均有重要作用。
2.胰激肽释放酶与心脑血管疾病的关系
胰激肽释放酶可以裂解低分子量的激肽原生成具有血管活性的激肽，扩张毛细血管，增加血管通透性，改善微循环。同时胰激肽释放酶又是一种活化因子，能使纤维酶原激活成纤维酶，使不溶性的纤维蛋白酶水解成可溶性的小肽，从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等疾病起到治疗作用，并可以治疗血栓、预防血栓再形成。
3.胰激肽释放酶对生殖的影响
研究表明，胰激肽释放酶可以提高纤溶活性，扩张周围血管，促进生精细胞增生，改善精子活力，促进精液液化。给大鼠注射胰激肽释放酶后，不但可以增加精子的产生，而且可以增进精子在体外的活动能力。有人利用胰激肽释放酶治疗男性不育症，取得明显疗效。
4.胰激肽释放酶对其他疾病的作用
研究表明，胰激肽释放酶对糖尿病肾病、视网膜静脉阻塞等均有较好疗效。
二、研究现状
目前使用的胰激肽释放酶均为由猪脏器提取、纯化的产品。尚没有人源胰激肽释放酶产品，利用基因工程技术生产重组人胰腺组织激肽释放酶的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的一个目在于提供编码人胰激肽释放酶成熟蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.3，及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.4。
本发明的另一目的在于提供包含本发明编码人源胰激肽释放酶成熟蛋白基因的重组表达载体。
本发明另一目的在于提供由该重组载体转化的宿主细胞。
本发明的再一目的在于提供一种利用基因工程技术制备重组人胰腺组织激肽释放酶的方法。
根据本发明的一方面，根据GenBank报告的基因序列，利用计算机辅助系统设计了PCR引物，从中国人胰腺组织中提取RNA，逆转录后进行PCR扩增，克隆获得具有SEQ ID NO：1序列的DNA，其编码的多肽序列如SEQ IDNO：2。
本发明克隆的编码胰腺组织激肽释放酶的基因与GenBank报告的人胰腺激肽释放酶基因有一个碱基不同。以翻译起始密码子ATG为1，本发明克隆的激肽释放酶基因的第340位碱基为A，Genbank报告的为G。编码氨基酸的密码子Genbank为GAC，中国人为AAC，编码的氨基酸Genbank为天冬氨酸(Asp，Genbank)，中国人为天冬酰氨(Asn)。天冬氨酸与天冬酰氨分子量接近，Asp为133.1，Asn为132.1，结构也相近，但两者的侧链基团不同。Asp为酸性氨基酸，Asn则偏碱性。该位置氨基酸的变化对激肽释放酶的空间结构以及活性可能产生影响。
在合成胰腺组织激肽释放酶的过程中，由激肽释放酶原(由激肽释放酶全长基因表达的激肽释放酶完整蛋白)将进一步被蛋白酶切割和加工成为成熟的具有生物学活性的激肽释放酶。因此，由克隆的全长基因表达的激肽释放酶完整蛋白的活性大大低于激肽释放酶成熟蛋白的活性。本发明利用电脑软件分析比较了人(胰腺组织)、猪、大鼠、小鼠激肽释放酶的氨基酸序列，推测出激肽释放酶原(激肽释放酶完整蛋白)转换为激肽释放酶(激肽释放酶成熟蛋白)的可能蛋白切割位点及激肽释放酶成熟蛋白的氨基酸序列，合成PCR引物，进一步从克隆的人胰腺组织激肽释放酶基因全序列中调出编码激肽释放酶成熟蛋白的基因，其具有如SEQ ID NO.3所示序列。其编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，相应地表达的人胰腺组织激肽释放酶含有SEQ ID NO.4的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
根据本发明的另一方面，提供包含SEQ ID NO：3序列的重组载体。其中载体可以以质粒、病毒颗粒以及噬菌体等形式，构建的重组载体可表达具有高生物学活性的人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白。在本发明的一个实施方案中，构建了质粒形式的载体，在本发明的另一个实施方案中，构建了杆状病毒形式的转移载体。
可通过多种方法将目的DNA插入到载体中，一般而言，通过本领域技术人员已知的一些方法可以将本发明的DNA序列插入到一个适当的限制性内切酶位点上。表达载体中的DNA可操作地与一个适当的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA的合成，表达载体也含有一个用于翻译起始的核糖体结合位点以及一个转录终止子。表达载体同时含有用于筛选转化宿主细胞的表型性状基因。用于构建表达载体的质粒或病毒可通过商业途径获得。
本发明的一个优选实施方案中，通过将人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因(SEQ ID NO.3)插入质粒pET20b的限制性内切酶EcoR1、Xho1位点，构建成分泌型表达载体，该载体可以在大肠杆菌中表达出具有高生物学活性的人组织激肽释放酶成熟蛋白，并在N端融合信号肽序列，使得表达的目的蛋白分布于细胞浆中；在本发明的另一个优选实施方案中，通过将表达人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因(SEQ ID NO.3)插入质粒pE28的限制性内切酶EcoR1、Xho1位点，构建成非分泌型表达载体，该载体可以在大肠杆菌中表达出具有高生物学活性的组织激肽释放酶成熟蛋白。更为特别的是，本发明进一步在该基因C端融合His Tag序列，使得表达的目的蛋白易于进行亲合层析纯化。在本发明的另一个优选实施方案中，将本发明的DNA插入病毒载体pBacPAK9的EcoR1、Xho1位点，构建出杆状病毒转移载体。
根据本发明的又一方面，进一步提供了由本发明的载体转化的宿主细胞，宿主细胞可以包括原核细胞和真核细胞，其中用于转化的原核细胞可以包括各种细菌，在本发明的一个优选实施方案中，以大肠杆菌作为本发明载体的宿主细胞。用于转化的真核细胞宿主可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)或是低等真核细胞(如酵母细胞)，本发明的一个优选实施方案以培养的昆虫细胞作为宿主细胞。
宿主细胞的转化可以通过各种方法，例如磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导、电穿孔等方法，本发明的一个实施方案中，采用本发明构建的杆状病毒转移载体通过共转染将本发明DNA导入培养的昆虫细胞，在昆虫细胞中表达的蛋白被高度糖基化，其较在大肠杆菌中表达的人胰组织激肽释放酶蛋白具有更接近天然蛋白的结构和更高的酶活力。
根据本发明的又一方面，提供制备重组激肽释放酶的方法。本发明的方法包括：1)将编码胰组织激肽释放酶成熟蛋白的基因(SEQ ID NO.3)可操作的连接于表达调控序列，构建表达载体；2)用该表达载体转化原核或真核细胞，形成宿主细胞；3)在适当的培养条件下培养本发明的宿主细胞；4)从培养液中分离出具有激肽释放酶活性的蛋白质；5)用亲和层析纯化获得重组激肽释放酶。
本发明成功地从中国人胰腺组织中克隆了编码具有胰激肽释放酶活性的蛋白的新基因(SEQ ID NO.1序列)，利用电脑软件比较分析人(胰腺组织)及猪、大鼠、小鼠激肽释放酶的氨基酸序列(图3)，同时利用软件进一步进行激肽释放酶蛋白的三维结果分析，确定了激肽释放酶原(激肽释放酶完整蛋白)转换为激肽释放酶(激肽释放酶成熟蛋白)的可能的蛋白酶切割位点及激肽释放酶成熟蛋白的氨基酸序列，再将该序列转换为相应的核苷酸序列，然后设计合成PCR引物，从该基因中调出了编码人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段(SEQ ID NO.3)，用该基因片段构建了携带编码人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因的分泌型、非分泌型表达载体以及杆状病毒表达载体，进而获得了由本发明表达载体转化的原核和真核细胞宿主。
本发明的表达载体可高效表达具有高生物学活性的胰腺激肽释放酶，采用国际药学联合会(FIP)、中国药品生物制品检定所改进的的电位滴定法以及Abe M等人使用的酶促荧光分光光度法检测了本发明表达载体表达的蛋白产物的活性，同时与采用编码人胰腺组织激肽释放酶完整蛋白的基因(SEQID NO.1)构建的表达载体比较。结果表明本发明构建的分泌型、非分泌型原核表达载体以及杆状病毒表达载体表达的产物均具有较高的胰腺激肽释放酶活力，可以用于进一步的动物实验研究，并可进一步用于治疗高血压等疾病的临床前研究。同时，本发明的表达载体中还融合了His亲和序列，包含该亲和序列的表达产物，在分离纯化时可利用His亲和树脂进行亲和层析纯化。本发明为开发人源组织激肽释放酶基因工程产品，开发人源组织激肽释放酶的基因药物奠定基础。
附图简述
下面，结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明但不限制本发明。
图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
泳道1：100bp DNA ladder；
泳道2：人胰腺激肽释放酶基因；
图2为本发明克隆的新基因的测序图谱；
图3为人(胰腺组织)、猪、大鼠、小鼠激肽释放酶氨基酸序列比较分析；
图4本发明表达载体pE20mK结构示意图；
图5为本发明另一分泌型表达载体pE28pK的结构示意图；
图6为发明非分泌型表达载体pE28mK的结构示意图；
图7为本发明杆状病毒转移载体pBac-KK的结构示意图；
图8为采用电位滴定法分析表达产物活力的曲线。
发明的具体实施方式
实施例1 人胰组织激肽释放酶基因的克隆和测序
1材料与方法
1.1材料
胰腺组织取材于一例行胰腺切除术患者术后的部分新鲜组织，洗净血液，立即提取总RNA。
1.2质粒及菌株
质粒pBluescript II KS(+)，大肠杆菌XL1-Blue分别购于STRATAGENE(晶美公司)。
1.3工具酶及其它试剂
RNA分离试剂盒、逆转录试剂盒购于STRATAGENE(晶美公司)，限制性内切酶、修饰酶、pfu高保真Taq DNA聚合酶等分别购于promega、gene公司及上海生工。
1.4 PCR引物设计及合成
根据GENBANK报告的基因序列，利用计算机辅助系统设计一对PCR引物，由上海生工合成并聚丙烯凝胶电泳纯化。
引物序列为：上游引物如SEQ ID NO.5所示序列；
下游引物如SEQ ID NO.6所示序列。
1.5 RNA提取及PCR扩增
制备组织匀浆后，参照试剂盒说明提取总RNA。变性琼脂糖电泳确认RNA质量，紫外分光光度法测定RNA含量。采用oligo(dT)引物进行逆转录。使用eppendorf梯度PCR仪，95℃，40s；60℃，1min；72℃，1min；总温度梯度10℃扩增30循环，72℃延伸10min结束。确认最佳条件后取适量产物进行PCR扩增。直接将适量Klenow大片段加至扩增溶液中，25℃反应30min补平产物。
1.6重组质粒的构建
采用低溶点琼脂糖法回收PCR产物，插入质粒KS。连接后转化XL1-Blue受体菌，利用X-gal进行兰-白筛选，酶切鉴定。
1.7 DNA序列分析 碱裂解法提取质粒并用PEG-8000纯化，使用通用引物双向测序。
2结果
2.1激肽释放酶基因的扩增 将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在800-900bp之间可见特异DNA条带，与预计大小～830bp相符(图1)。
2.2激肽释放酶基因的克隆及鉴定 按常规方法进行基因克隆，分别使用限制性内切酶StyI、PvuII鉴定重组质粒，结果正确。
2.3激肽释放酶基因的序列分析 制备重组质粒后上海Sangon生物工程公司测序部进行序列分析。序列分析结果与GenBank报告的KK进行序列比较，结果两者有一个核苷酸不同。图2为激肽释放酶基因测序图谱，序列分析结果得到SEQ ID NO.1的序列，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例2 人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因的克隆
利用电脑软件比较分析人(胰腺组织)、猪、大鼠、小鼠激肽释放酶的氨基酸序列(图3)，推测激肽释放酶原(激肽释放酶完整蛋白)转换为激肽释放酶(激肽释放酶成熟蛋白)的可能蛋白酶切割位点及激肽释放酶成熟蛋白的氨基酸序列，合成如下序列的PCR引物：
上游(真核细胞)：SEQ ID NO.7所示序列；
上游(原核细胞)：SEQ ID NO.8所示序列；
下游：SEQ ID NO.9所示序列；
在上述引物设计中：
1.成熟蛋白前面增加一个ATG，用于真核表达；
2.成熟蛋白前面没有ATG，用于原核表达；
3.共用下游引物；
4.上下游均增加酶切位点利于克隆。
PCR扩增方法和条件同实施例1，扩增的成熟蛋白的编码序列起始SEQID NO 1序列的第72个碱基，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。其编码的相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3 表达载体的构建
1.人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白分泌型表达载体pE20mK的构建
图4所示为中国人胰腺组织激肽释放酶基因原核分泌型表达载体pE20mK。具体方法是从质粒KSKK中利用高保真Taq酶扩增成熟激肽释放酶基因(SEQ ID NO.3，mKK)，利用限制性内切酶EcoR I、XhoI消化后，将其插入质粒pET20b的EcoR I、XhoI位点，保证激肽释放酶基因与His读框正确，构建出分泌型表达载体pE20pK。该载体可以在大肠杆菌中表达出组织激肽释放酶成熟蛋白，并在N端融合信号肽序列，使得表达的目的蛋白倾向于分布在细胞质(periplasmic localization)中。
2.人胰腺组织激肽释放酶完整蛋白非分泌型表达载体pE28pK的构建
图5所示为中国人胰腺组织激肽释放酶基因原核非分泌型表达载体pE28pK。具体方法是从质粒KSKK中利用高保真Taq酶扩增完整激肽释放酶基因(SEQ ID NO.1，pKK)，利用限制性内切酶EcoR I、XhoI消化后，将其插入质粒pET28的EcoR I、XhoI位点，保证激肽释放酶基因与His读框正确，构建出非分泌型表达载体pE28pK。该载体可以在大肠杆菌中表达出组织激肽释放酶完整的前提蛋白，并在C端融合His Tag序列，使得表达的目的蛋白易于进行亲合层析纯化。
3.人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白非分泌型表达载体pE28mK的构建
图6所示为中国人胰腺组织激肽释放酶基因原核非分泌型表达载体pE28mK。具体方法是从质粒KSKK中利用高保真Taq酶扩增成熟激肽释放酶基因(SEQ ID NO.3，mKK)，利用限制性内切酶EcoR I、XhoI消化后，将其插入质粒pET28的EcoR I、XhoI位点，保证激肽释放酶基因与His读框正确，构建出非分泌型表达载体pE28mK。该载体可以在大肠杆菌中表达出组织激肽释放酶成熟蛋白，并在C端融合His Tag序列，使得表达的目的蛋白易于进行亲合层析纯化。
4.杆状病毒转移载体pBac-KK的构建
图7所示为中国人胰腺组织激肽释放酶基因的杆状病毒表达转移载体。具体方法是从质粒KSKK中利用限制性内切酶EcoR I、XhoI切出激肽释放酶基因(SEQ ID NO.3)，将其插入转移载体pBacPAK9的EcoR I、XhoI位点，构建出杆状病毒转移载体pBac-KK。
实施例4 人胰腺组织激肽释放酶基因在大肠杆菌中的表达
1.大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞制备，采用氯化钙制备法，具体方法参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)，第55～56页。只是采用由0.75mmol/L Tris-HCl代替水为溶剂配制0.1mol/L CaCl2。感受态细胞的转化方法，参照上述参考文献进行。
2.质粒的大量制备(除有特殊说明外，试剂配制均参照《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)
参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)，第26～28页，采用碱裂解法制备，用PEG沉淀法纯化。具体操作方法如下，离心收获经质粒转化、培养后的菌体，用STE悬浮、洗涤菌体一次，然后用特殊TE(10mmol/L Tris，50mmol/L EDTA pH8.0)，悬浮沉淀。加入2倍于TE体积的溶液II裂解，加入1.5倍体积的溶液III中和，离心后取上清，加入0.7倍体积的异丙醇沉淀。离心弃上清。用TE(pH8.0)溶解沉淀，加入等倍于TE体积的5mol/L LiCl，离心去除大分子RNA。移出上清至一新离心管中，加入2倍于上清体积的无水乙醇，沉淀DNA。加适量70％乙醇洗涤沉淀一次，凉干。用TE溶解沉淀，其中含无DNA酶的RNA酶终浓度为20Mg/ml，以去除RNA。加入等倍于TE体积的PEG溶液(20％PEG 6000，2.5mol/L NaCl)混匀，置4℃过夜后离心，弃上清。用TE溶解沉淀，用等倍于TE体积的饱合酚、酚∶氯仿，按顺序各抽提一次，然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀一次，凉干，最后溶于TE(pH8.0)中备用。
3.质粒的限制性内切酶消化与DNA片段的回收
质粒的限制性内切酶消化均参照下列反应条件进行，每微克质粒DNA用5单位限制性内切酶消化，加1/10体积的限制性内切酶反应缓冲液，加灭菌二馏水调整反应总体积为所用限制性内切酶体积的10倍，按各种限制性内切酶的供应商推荐的反应温度反应2～3小时。质粒用限制性内切酶消化后，DNA片段的回收采用DEAE-纤维素膜电泳回收法，具体方法参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)，第319～321页。本研究采用DE-81离子交换纸(Whatman公司产品)代替DEAE-纤维素膜。
4.线性质粒的末端去磷酸化和DNA片段的连接
酶切后线性质粒的末端去磷酸化，采用小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)，具体操作参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)，第40～41页。去磷酸化反应后，CIP的灭活采用5mmol/L EDTA(PH8.0)存在下，75℃加热10min。然后用酚∶氯仿抽提去除CIP，乙醇沉淀去磷酸化后的线性质粒，溶于灭菌双馏水中，用于连接反应。
线性质粒与DNA片段的连接反应按GIBCO-BRL公司提供的T4DNA连接酶推荐的条件进行。粘性末端的连接按质粒载体：目的DNA片段的摩尔比＝1∶2，25℃连接1h。平末端的连接采用质粒载体：目的DNA片段摩尔比＝1∶5的比例，14～16℃，连接17～24h，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。
5.重组质粒的筛选与鉴定
将连接反应物转化感受态细菌，涂于含抗生素的平板上，挑选过夜培养长出的单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，培养16～20h。然后参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)，第19～22页介绍的碱裂解法小量制备质粒，以空载体质粒作对照进行质粒的琼脂糖凝胶电泳，挑选重组质粒，作限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳，鉴定插入的目的基因及其插入方向。
实施例5 目的基因的表达
参照Novagen公司的实验指南进行。将重组质粒分别转化pET表达系统的表达菌株，如BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、HMS174(DE3)等以及非表达(对照)菌株BL21，挑选过夜培养长出的单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，于37℃培养至OD600达到0.6-1.0，4℃保存过夜。次日收集菌体，重悬于2ml新鲜培养基，然后接种于50ml培养基，于37℃培养至OD600达到0.6-1.0，加IPTG诱导，继续培养3hr。收集菌体，裂解后进行蛋白的纯化、分析。
实施例6 重组蛋白的分离纯化及活性测定
1.亲和层析纯化
融合His Tag蛋白的纯化：使用Qiageen公司生产的Ni2+-NTA金属亲和树脂，将菌体超声裂解后，上Ni2+-NTA亲和柱，依次使用不同的缓冲液进行剃度洗脱。分别收集洗脱液进行SDS-PAGE分析。将含目的蛋白洗脱液透析后冻干保存。
2.常规纯化：参照试剂盒说明书以及《精编分子生物学实验指南》第10章部分的实验步骤进行层析纯化。
3.激肽释放酶的活性分析
激肽释放酶的生物活性可以通过其催化活力进行测定。以纯化的猪激肽释放酶(Sigma产品，购自深圳晶美公司)为标准品，采用两种方法检测了重组人胰激肽释放酶活力。结果表明，本实验表达的激肽释放酶的初步纯化产物具有激肽释放酶催化活性。
采用两种方法检测重组人胰激肽释放酶活力
(1)用国际药学联合会(FIP)推荐(Ruyssen Rand Lauwers A.PharmaceuticalEnzymes Properties and Assay Methods：Kallikrein.1978.147-152)、中国药品生物制品检定所改进的的电位滴定法(扬化新，沈佳，刘金秀。药物分析杂志1994；14(2)：9-12)检测重组人胰激肽释放酶活力。
(2)采用Abe M等(Abe M，Nakamura F，Tan F，et al.Expression of ratkallikrein and epithelikrein polarity in transfected Madin-Darby canine kidneycells.Hypertension 1995；26：891-898)使用的酶促荧光分光光度法检测重组人胰激肽释放酶活力。
实施例7 人胰腺组织激肽释放酶基因在昆虫细胞(sf9)中的表达
1.共转染
(1)接种1.0×106sf9昆虫细胞于培养皿，加入1.5ml完全培养基，27℃培养4hr；
(2)将转移载体与线性化野生型杆状病毒DNA共转染；
a.使用含10％胎牛血清的完全培养基培养sf9昆虫细胞；
b.当细胞生长成片时更换新鲜培养基，重悬细胞；
c.计数细胞；
d.接种2×106sf9昆虫细胞于60mm培养皿；
e.逐滴加入Lipofectin-DNA复合物，混匀，27℃培养4-5小时；
(3)同源重组后进行空斑筛选，光学显微镜下筛选出重组杆状病毒。
2.表达
大规模培养重组杆状病毒后接种昆虫细胞中进行表达(参照试剂盒说明书以及《精编分子生物学实验指南》第16章部分的实验步骤进行表达)。
3.表达蛋白的初步纯化
参照试剂盒说明书以及《精编分子生物学实验指南》第16章部分的实验步骤进行层析纯化。
4.表达蛋白的活性检测
参照原核表达产物活性检测方法进行。
实施例8 大肠杆菌表达的人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白与完整蛋白的生物活性比较
分别构建激肽释放酶完整蛋白、成熟蛋白载体(本发明表达载体pE28pK以及表达载体pE28mK)并在大肠杆菌中进行表达，初步纯化、复性，利用凝血酶切除融合的氨基酸，采用电位滴定法检测产物活力，结果表明：pE28mK表达产物水解苯甲酰精氨胺酸乙酯的活力明显高于pE28pK的表达产物(图8)。说明，表达载体pE28mK可以表达具有生物活力的成熟激肽释放酶。表达载体pE28pK表达的激肽释放酶原在大肠杆菌中没有获得翻译后的切割加工。
以上实施例说明，本发明成功地从人基因组中克隆出了编码成熟人胰腺组织激肽释放酶蛋白的基因，并构建了可以携带人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白基因的重组表达载体，该载体在宿主细胞中表达的重组人胰腺组织激肽释放酶具有较高的生物学活性，并且可以利用亲和层析对重组蛋白进行纯化。
本发明不限于以上方式，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明精神，均应属于本发明的范围。
03P100123.ST25.txt
SEQUENCE LISTING
<110>深圳市人民医院
<120>一种编码人胰腺组织激肽释放酶成熟蛋白的基因、其重组表达载体及重组人胰腺组织激肽释放酶的制备
<130>SZ64-03P100123
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<150>CN 01104112.9
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cagacaagct tcaggagttc tccgctatg 29
Claims (2)
1、一种重组载体，其特征在于，在质粒载体pET28中包含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，并且所述质粒载体的C端融合His Tag序列，使得表达的目的蛋白易于进行亲合层析纯化。
2、一种由权利要求1所述重组载体转化的大肠杆菌宿主。
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