CN1944645A - 利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶ⅲ蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括：选哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架，在框架上建立一个唯一的酶切位点，再将人AT－III蛋白基因功能部分，乳蛋白分泌序列和肠激酶蛋白质酶切序列基因，连接在表达框架上，载体的末端再连接一个筛选基因；将表达载体转入体外培养的动物体细胞中；获得含有人的AT－III蛋白基因的细胞株；转基因细胞株移入山羊成熟的去核卵母细胞内，使供核细胞和去核卵母细胞融合；克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中，经妊娠获得转基因克隆羊；检测转基因动物乳汁中的人AT－III蛋白的含量和活性、提纯；经动物试验和人体试验；重组人AT－III蛋白在人体上的应用。

Description

利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法

技术领域

本发明属于一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人的抗凝血酶III的方法，具体涉及一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法。

背景技术

抗凝血酶III(antithrombin III，简称AT-III)是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子，它在血浆中承担着60％～70％抗凝血酶活性，在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起着重要的作用，是正常人血浆中存在的重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其主要功能是灭活凝血酶，如与凝血酶Xa及XIa结合。并主要由肝脏合成。

人体内与凝血系统功能相桔抗的是抗凝血系统，在正常情况下，两者保持动态平衡。AT-III主要反映机体是抗凝系统的功能。AT-III的升高一般不会引起病理性后果，但是AT-III在人体中的量的减少常见于以下病例：

a)遗传性抗凝血酶III缺乏；

b)获得性抗凝血酶III缺乏：见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等；

c)抗凝血酶III丢失增多：如肾脏疾病；

d)抗凝血酶III消耗增多：如各种原因所造成的血液凝固性增高，抗凝血酶III中和活化的凝血因子，以致消耗增加。

e)最重要的是：AT-III的先天性或后天获得性缺乏症可导致血栓的形成，而引起脑血栓或心肌梗塞等等非常严重的疾病。

因此，AT-III在临床上，有预防和治疗急慢性血栓血塞形成的作用，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果，

目前市场有从人体血浆中提取的人抗凝血酶III蛋白，也有用细胞和酵母作为表达载体在体外生产的重组人抗凝血酶III。世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶III(商品名：ATryn^，GTC生物治疗公司，美国)于2006年6月通过欧洲医药评价署人用医药产品委员会(EMEA)的上市评估，同年8月获得欧洲委员会的上市许可，并将在不久的未来(2007年)开始在欧洲市场上销售。这也证明利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人抗凝血酶III(AT-III)的可行性和市场价值。

GTC生物治疗公司在美国拥有几个专利：其中包括

1：转基因方法生产人抗凝血酶III(Transgenically produced antithrombin III，专利号5,843,705和6,441,145)；

2：人抗凝血酶III及其相关方法(Human antithrombin IIIs and methods related thereto，专利号：6,878,813)；

3：转基因羊生产的重组人抗凝血酶III的治疗(Treatments using transgenic goatproduced antithrombin III，专利号7,019,193)等。

本专利公开的一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法与GTC生物治疗公司的相关专利生产的人的抗凝血酶III的方法存在关键的区别：

1，本专利生产的重组人的抗凝血酶III蛋白质只是抗凝血酶III蛋白质的成熟部分(即功能部分：氨基酸33-464)，GTC生物治疗公司生产的重组人的抗凝血酶III蛋白质有抗凝血酶III蛋白质的信号部分(氨基酸1-32)和成熟功能部分(氨基酸33-464)；

2，本专利是将重组人的抗凝血酶III蛋白质表达载体首先转入体外培养的山羊胎儿成纤维细胞中，然后再用体细胞核移植技术(克隆技术)获得含有人的抗凝血酶III蛋白质基因的转基因动物，GTC生物治疗公司是将重组人的抗凝血酶III蛋白质表达载体直接注射到山羊受精卵的原核中(原核注射法)，所获得含有人的抗凝血酶III蛋白质基因的转基因动物；

3，本专利的重组人的抗凝血酶III蛋白质表达载体，是用的乳腺蛋白质的分泌信号多肽(MKVLILACLVALAIAL)将表达的重组人的抗凝血酶III蛋白质从转基因动物的乳腺细胞分泌到乳汁中，GTC生物治疗公司是用的人的抗凝血酶III蛋白质的信号肽(分泌多肽)，实验证明：乳腺蛋白质的分泌信号多肽在乳腺细胞中的分泌能力比其它信号多肽的分泌能力强。

4，本专利所表达的蛋白质中含有一个Enterokinase蛋白质酶切序列(DDDK)，可将分泌多肽和重组人的抗凝血酶III蛋白质(功能部分)分开，增强重组人的抗凝血酶III蛋白质的活性和治疗功能。

本发明专利采用体细胞核移植技术(克隆技术，Wilmut et al，1997)来获得转人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的动物，与原核注射法获得的转基因动物(GTC生物治疗公司所用的方法)相比，大动物转基因体细胞的克隆有以下的优点：

获得转基因动物的效率高，资金投入少；更重要的是，可以首先对体外培养的细胞进行遗传改造，如转基因的整合及检测，甚至监测转基因在细胞内的表达量。

中国还没有类似利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的专利，申请人检索到几个相关专利或申请：

从水蛭中分离抗凝血酶多肽的方法方面的专利(CN1066272和CN1452986等)，

抗凝血酶-III的生产方法纯化方法及含该酶的制剂(CN1189502)和凝血酶试剂，以及检查试剂套装(CN1504580)等专利。

本发明采用崂山奶山羊为研究动物，崂山奶山羊(Capra hircus)是我国的高产奶山羊之一，产奶量大，产奶期8个月以上，长者可达10个月，一胎羊平均年产奶310公斤，二胎羊平均年产奶590公斤，三胎羊平均年产奶700公斤以上，高者可达1300公斤，相当于1/3头奶牛的产奶量，而且山羊的研究周期短，饲养管理费用低，是乳腺生物反应器的重要研究对象之一。

本发明的特点是用体细胞克隆和转基因动物的方法在转基因动物的乳腺中生产重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法。

发明内容

本发明的目的是将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因，与乳腺蛋白基因的启动子和终止信号连接构建重组人的抗凝血酶III(AT-III)基因的表达载体，再通过转染体细胞和体细胞核移植的方法，将人的抗凝血酶III(AT-III)基因转入动物的基因组内，而表达重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白。在转基因动物的乳汁中特异高效表达人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白。然后通过蛋白质提纯的方法将转基因动物的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白质提纯，制成注射针剂，用于人的抗凝血酶III(AT-III)缺乏症的治疗。

本发明的技术解决方案是：

研制一种利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产人的抗凝血酶III(AT-III)的方法，包括下述步骤：

1.选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架，在乳蛋白基因的表达框架上建立一个唯一的酶切位点，然后将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)，乳蛋白分泌序列和肠激酶(Enterokinase)蛋白质酶切序列基因，连接在乳蛋白基因的表达框架上，转基因载体的末端再连接一个筛选基因。

2.所构建的载体经DNA序列分析，确定人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)和乳蛋白基因的DNA序列，并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致；

3.用电穿孔或脂质体诱导的方法将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因表达载体转入体外培养的动物的体细胞中；

4.在培养基中对细胞株进行筛选，获得筛选后的阳性细胞株；一部分细胞冷冻保存，一部分细胞用于制备DNA；

5.阳性细胞株的DNA，经PCR和Southern杂交分析，确定含有人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的细胞株；

6.转基因的细胞株的细胞移入山羊成熟的去核卵母细胞的卵周隙内，然后使供核细胞和去核卵母细胞融合；

7.将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中，经妊娠获得转基因克隆羊；

8.检测转人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因动物的乳汁中的人抗凝血酶IH(AT-III)蛋白的含量和活性；

9.含有人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白的提纯；

10.纯化的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的动物试验和人体试验；

11.重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白在人体上的应用。

上述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的乳蛋白基因包括晡乳动物的：乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳浆蛋白基因或乳铁蛋白基因。

上述的利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是将人的抗凝血酶III蛋白基因连接在乳蛋白基因的表达框架上，并转入哺乳动物的基因组内，然后在转基因动物的乳汁中获得特异高效表达。

上述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的哺乳动物包括牛、绵羊和山羊、猪、兔、马。

一种利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法，生产含有重组人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物，及其乳汁和制品。

上述的转基因动物的乳汁进行提纯得到的重组人的抗凝血酶III蛋白，在治疗抗凝血酶III缺乏症中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明是用体细胞核移植(克隆)技术获得人抗凝血酶III基因的转基因动物，比其他方法获得转基因动物的效率高。

本发明是从转基因动物的乳汁中获得重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白，提供制备重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的原料药；

从含有重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的转基因动物的乳汁中提取、纯化重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白，制成注射用针剂，经注射到人体内，达到治疗人体抗凝血酶III(AT-III)蛋白缺乏症的目的。

附图说明

图1是AT-III转基因克隆技术路线示意图；

图2-1、图2-2、图2-3是转基因克隆羊的Southern分析数据示意图；

图3是转AT-III基因克隆羊的后代奶中的AT-III含量分析数据示意图；

图4是转AT-III基因克隆羊的后代奶中的AT-III的活性分析数据示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请的技术方案作进一步阐述。

图1中，显示AT-III转基因克隆技术路线示意图。

分为11个步骤：

第1步：构建奶山羊基因组文库；

第2步：用绵羊的部分酪蛋白基因探针获得奶山羊β-酪蛋白基因；

第3步：去除部分外显子2与7之间的奶山羊β-酪蛋白基因序列，建立乳蛋白分泌序列，唯一的Not1和Xho1酶切位点；

图中， 代表乳蛋白分泌序列

第4步：人的抗凝血酶III蛋白基因和Enterokinase蛋白质酶切序列的PCR。

人肝细胞mRNA的获得，转录成cDNA，PCR反映获得全部的ATIII基因编码序列，序列分析。再用PCR反映获得AIII基因的成熟部分DNA和乳蛋白分泌序和Enterokinase蛋白质酶切序列。

图中，

代表酶切序列； 代表AT-III功能部分；

第5步：ATIII转基因表达载体的构建；

第6步：新酶素基因(Neomycin)的连接；

第7步：体外细胞培养和转化；

第8步：ATIII转基因体细胞的克隆；

第9步：克隆羊的繁殖和转基因检测；

第10步：奶中ATIII蛋白质的检测和提纯；

第11步：重组人的抗凝血酶III蛋白的在治疗抗凝血酶III缺乏症中的应用。

图2中，显示转基因克隆羊的Southern分析数据

图2-1左侧显示的小羊(箭头所指)是所获得的第一只ATIII转基因克隆，在出生后78天死亡；右侧显示克隆小羊羔DNA(1号)和供核细胞DNA(2号)的Southern杂交图；

图2-2为转AT-III基因的克隆羊群；

图2-3为ATIII转基因的PCR结果图：1，2，5是寄母羊；3，4，6和7转抗凝血酶III基因的克隆羊，8是空白对照，MW是DNA分子量。

图3中，1.AT-HI标准品(30ug)；2.AT-IH标准品(10ug)；3.正常羊奶样(1∶5稀释，1ul)；4.正常羊奶样(1∶5稀释，3ul)；5.正常羊奶样(1∶6稀释，6.5ul)；6.编号A-08转AT-III克隆后代(编号A-25)奶样(1∶5稀释，1ul)；7.编号A-08转AT-III克隆后代(编号A-25)奶样(1∶5稀释，3ul)；8.编号A-08转AT-III克隆后代(编号A-25)奶样(1∶5稀释，6.5ul)；9.编号A-05转AT-III克隆后代(编号A-23)奶样(1∶5稀释，1ul)；10.编号A-05转AT-III克隆后代(编号A-23)奶样(1∶5稀释，3ul)；11.编号A-05转AT-III克隆后代(编号A-23)奶样(1∶5稀释，6.5ul)；12.蛋白质分子量标准(Bio-rad，货号：161-0373)；箭头是指重组人的抗凝血酶III蛋白带。

人血浆中的抗凝血酶III是一个432个氨基酸的糖蛋白(成熟功能部分)，分子量为：58kDa(没有糖基化的成熟AT-III的分子量为：49.0kDa)。本哺乳动物乳腺生物反应器生产的重组人的抗凝血酶III(AT-III)也是糖蛋白，分子量大约为：60kDa(没有糖基化的重组人的抗凝血酶III(AT-III)的分子量为：51.4kDa)。

图4中，奶样品经过离心脱脂处理，然后用于Elisa试验。采用US Biological公司(美国)的AT-III检测试剂。经过计算，编号A-23号羊奶中的AT-III蛋白为0.2-0.5ug/ml；编号A-25号羊奶中的AT-III蛋白为1-3mg/ml。

本发明包括下列步骤：

(1).选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架，在乳蛋白基因的表达框架上建立一个唯一的酶切位点和乳蛋白分泌序列。

(2)从人肝细胞cDNA，用PCR扩增的方法，获得人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因(功能部分)的DNA片断(参见附图1的第4步)

(3)然后将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因和Enterokinase蛋白酶切序列基因连接在乳蛋白基因的表达框架上，转基因载体的末端再连接一个筛选基因。

(4).所构建的载体经DNA序列分析，确定人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因和乳蛋白基因的DNA序列，并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致(参见重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的氨基酸序列)。

(5).用电穿孔或脂质体诱导的方法将人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因表达载体转入动物的体细胞中。

(6).在培养基中对细胞株进行筛选，获得筛选后的阳性细胞株；一部分细胞冷冻保存，一部分细胞用于制备DNA。

(7).阳性细胞株的DNA，经PCR和Southern杂交分析，确定含有人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因的细胞株。

(8).转基因的细胞移入山羊的成熟去核卵母细胞的卵周隙内，然后使供核细胞和去核卵母细胞融合，激活；

(9).将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中，通过妊娠获得转基因克隆羊；

(10).检测转人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III(AT-III)

蛋白的含量和活性。

(11).含有重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的乳汁中的人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的提纯(使用蛋白质亲和，浓缩，过柱等方法)。

(12).纯化的重组人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白的动物试验和人体试验。

(13).重组人的抗凝血酶III蛋白在人体上的应用。

实施例1

本实施例以崂山奶山羊(Capra hircus)为例，用人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因构建了以山羊酪蛋白基因(β-casein)为框架的转基因载体，并最终获得以人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因为功能基因的崂山奶山羊乳腺生物反应器。

具体操作程序如下：

功能基因的获得

人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白基因是用人的肝细胞cDNA为PCR底物，然后通过PCR扩增的方法建立两端的连接酶切位点，PCR产物连接在pUC19上，在进行DNA序列分析；克隆的AT-III基因的DNA序列与已公开的AT-III蛋白基因的DNA序列相同。

具体方法是：人的抗凝血酶III(AT-III)基因的制备是根据已公开的AT-III的DNA顺序(GeneBank：D29832和X68793)，设计PCR引物，获得1.45KB的AT-III基因的编码序列，PCR产物克隆到pUC19载体上，进行顺序分析。再将DNA顺序分析正确的AT-III pUC19质粒进行PCR克隆去除AT-III的分泌信号肽部分(碱基序列1-96)，并在引物前加入1个唯一的酶切位点(Xho1)，再通过PCR反应在AT-II基因前加一个Enterokinase蛋白质酶切序列。AT-III的基因片段连接到奶山羊β-酪蛋白基因DNA载体的表达框架上。

转基因载体的构建

用绵羊的β-酪蛋白基因的一片断为探针，从崂山奶山羊的基因组文库中分离出β-酪蛋白基因，并用PCR方法去除β-酪蛋白基因的部分第二外显子与第七外显子及其之间的DNA序列，建立一个唯一的Not1酶酶切位点，再合成一段含有Xho1酶酶切位点的乳蛋白分泌序列连接在Not1位点。然后将人的抗凝血酶III(AT-III)基因连接在β-酪蛋白基因的表达框架上，筛选基因连接在β-酪蛋白基因的P(A)后面，操作步骤见附图1。

转化受体细胞

从30至45天胎龄的崂山奶山羊胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，分离的细胞培养在DMEM-F12(1∶1)并添加10％胎牛血清(FCS)和抗菌素的培养基中。用电穿孔(Bio-rad)或脂质体介导法将基因打靶载体转入山羊胎儿成纤维细胞中，(Gene Targeting-APractical Approach，2^nd Edition，Oxford University Press 1999)然后在含有G418(600ug/ml)的培养基中筛选培养大约15-20天；细胞株再进行扩繁，一部分细胞冷冻保存.一部分用于制备DNA。

阳性细胞株的细胞核移植

山羊经同期发情和超排处理，获得体内成熟的卵母细胞和寄母羊。阳性细胞在体外饥饿2-5天后，移入去核卵母细胞的卵周隙内，用电刺激的方法将供核细胞与去核卵母细胞融合，体外培养4小时后，用离子霉素(Ionomycin)激活5分钟，再在含有6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培养基中培养5小时。最后，克隆胚胎移入正常培养基中培养；第二天，移入寄母羊输卵管中。寄母羊怀孕，产出克隆母羊羔，Southern和PCR分析表明(参见附图2)，克隆羊都含有转人的抗凝血酶III(AT-III)基因。到目前为止，两只克隆羊的后代母羊已产奶，奶中已检测出含有大量的人的抗凝血酶III(AT-III)蛋白质，用于提纯和临床试验(正在进行中)。

DNA的制备，Southern分析

将培养的细胞和少量克隆羊的组织转入DNA裂解液(含有蛋白酶K)中，在55℃水浴锅中过夜，然后加入两倍的纯酒精，混匀，离心；用70％的酒精洗DNA一次，自然干燥，然后加入适量的TRIS-EDTA溶液，待DNA全部溶解后，放入-20℃的冰箱中。用Pst1酶消化DNA溶液过夜，在0.8％的凝胶上电泳，然后将DNA转入纤维膜中，分别用P32标记探针进行杂交。获得DNA的Southern图片。

AT-III的含量和活性检测

AT-III的含量检测是将转有人的抗凝血酶III(AT-III)基因的羊的奶，离心脱脂，用0.5MEDTA稀释溶解酪蛋白质颗粒，蛋白质凝胶跑胶(Invitrogen)，然后用Coomassie蓝染色。与空白对照(羊奶)和阳性对照比较，获得奶中AT-III蛋白质的分子量和蛋白质含量。

AT-III的活性检测是用酶联(Elisa)的方法。用US Biological(美国)公司的检测人的抗凝血酶III蛋白试剂，进行检测。

                   重组人的抗凝血酶III(AT-III)的氨基酸序列

MKVLILACLV ALAIALEDDD DKHGSPVDIC TAKPRDIPMN PMCIYRSPEK KATEDEGSEQ

KIPEATNRRV WELSKANSRF ATTFYQHLAD SKNDNDNIFL SPLSISTAFA MTKLGACNDT

LQQLMEVFKF DTISEKTSDQ IHFFFAKLNC RLYRKANKSS KLVSANRLFG DKSLTFNETY

QDISELVYGA KLQPLDFKEN AEQSRAAINK WVSNKTEGRI TDVIPSEAIN ELTVLVLVNT

IYFKGLWKSK FSPENTRKEL FYKADGESCS ASMMYQEGKF RYRRVAEGTQ VLELPFKGDD

ITMVLILPKP EKSLAKVEKE LTPEVLQEWL DELEEMMLVV HMPRFRIEDG FSLKEQLQDM

GLVDLFSPEK SKLPGIVAEG RDDLYVSDAF HKAFLEVNEE GSEAAASTAV VIAGRSLNPN

RVTFKANRPF LVFIREVPLN TIIFMGRVAN

PCVK

利用哺乳动物乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法的DNA序列表

<110>青岛森淼生物技术研究所

<120>利用哺乳动物乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III(AT-III)的方法

<130>

<140>

<141>

<160>11

<170>Patent version 3.3

<210>1

<211>3866

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3866)

<223>奶山羊β-酪蛋白的启动区和第1外显子和内含子和部分，

     基因打靶载体的5’同源臂

<400>1

1   GGTACCTGAT GTCATCTTAA ATTGCTGGCT TTTTGATTTT CCATTGGACA 50

    AGCTTCTTTC TTTAGTATAT TGTTAAGGAT TTCCTTGATC AAGATTTTAC 100

    CTACTTTTCT GGTCCAATTG GTGAGAGACA GTCATAAGGA AATGCTGTGT 150

    TTATTGCACA ATATGTAAAG CATCTTCCTG AGAAAATAAA AGGGAAATGT 200

5   TGAATGGGAA GGATATGCTT TCTTTTGTAT TCCTTTTCTG AGAAATCAGA 250

    CTTTTTCACC TGTGGCCTTG GCCACCAAAA GCTAACAAAT AAAGGCATAT 300

    GAAGTAGCCA AGGCCTTTTC TAGTTATATC TATGACACTG AGTTCATTTC 350

    ATCATTTATT TTCCTGACTT CCTCCTGGGT CCATATGAGC AGTCTTAGAA 400

    TGAATATTAG CTGAATAATC CAAATACATA GTAGATGTTG ATTTGGGTTT 450

10  TCTAAGCAAT CCAAGACTTG TATGACAGTA AGATGTATTA CCATCCAACA 500

    CACATCTCAG CATGATATAA ATGCAAGGTA TATTGTGAAG AAAAATTTTT 550

    AATTATGTCA AAGTGCTTAC TTTAGAAGGT CATCTATCTG TCCCAAAGCT 600

    GTGAATATAT ATATTGAAGG TAATGAATAG ATGAAGCTAA CCTTGTAAAA 650

    ATGAGTAGTG TGAAATACAA CTACAATTAT GAACATCTGT CACTAAAGAG 700

15  GCAAAGAAAC TTGAAGATTG CTTTTGCAAA TGGGCTCCTA TTAATAAAAA 750

    GTACTTTTGA GGTCTGGCTC AGACTCTATT GTAGTACTTA GGGTAAGACC 800

    CTCCTCCTGT ATGGGCTTTC ATTTTCTTTC TTGCTTCCCT CATTTGCCCT 850

    TCCATGAATA CTAGCTGATA AACATTGACT ATAAAAGATA TGAGGCCAAA 900

    CTTGAGCTGT CCCATTTTAA TAAATCTGTA TAAATAATAT TTGTTCTACA 950

20  AAAGTATTAT CTAAATAAAT GTTACTTTCT GTCTTAAAAT CCCTCAACAA 1000

    ATCCCCACTA TCTAGAGAAT AAGATTGACA TTCCCTGGAA TCACAGCATG 1050

    CTTTGTCTGC CATTATCTGA CCCCTTTCTC TTTCTCTCTT CTCACCTCCA 1100

    TCTACTCCTT TTTCCTTGCA ATTCATGACC CAGATTCACT GTTTGATTTG 1150

    GCTTGCATGT GTGTGTGCTG AGTTGCGTCT GACTGTTATC AACCCCATGA 1200

25  ATGATAGTCC ACCAGGCTCT ACTGTCCATG AAATTTTCCA GTCAAGAATA 1250

    CTGGAGTGGA TTGCATTTCC TACTCCATTT GATTAATTTA GTGACTTTTA 1300

    AATTTCTTTT TCCATATTCG GGAGCCTATT CTTCCTTTTT AGTCTATACT 1350

    CTCTTCACTC TTCAGGTCTA AGGTATCATC GTGTGCTTGT TAGCTTGTTA 1400

    CTTTCTCCAT TATAGCTTAA GCACTAACAA CTGTTCAGGT TGGCATGAAA 1450

30  TTGTGTTCTT TGTGTGGCCT GTATATTTCT GTTGTGTATT AGAATTTACC 1500

    CCAAGATCTC AAAGACCCAC TGAATACTAA AGAGACCTCA TTGTGGTTAC 1550

    AATAATTTGG GGACTGGGCC AAAACTTCCG TGCATCCCAG CCAAGATCTG 1600

    TAGCTACTGG ACAATTTCAT TTCCTTTATC AGATTGTGAG TTATTCCTGT 1650

    TGAAATGCTC CCCAGAATTT CTGGGGACAG AAAAATAGGA AGAATTCATT 1700

35  TCCTAATCAT GCAGATTTCT AGGAATTCAA ATCCACTATT GGTTTTATTT 1750

    CAAACCACAA AATTAGCATG CCATTAAATA CTATATATAA ACAGCCACTA 1800

    AATCAGATCA TTATCCATTC AGCTTCTCCT TCACTTCTTC TCCTCTACTT 1850

    TGGAAAAAAG GTAAGAATCT CAGATATAAT TTCAGTGTAT CTGCTACTCA 1900

    TCTTTATTTT GGACTAGGTT AAAATGTAGA AAGAACATAA TTGCTTAAAA 1950

40  TAGATCTTAA AAATAAGGGT GTTTAAGATA AGGTTTACAC TATTTTCAGC 2000

    AGATATGTTA AAAAATAGAA GTGACTATAA AGACTTGATA AAAATTATAG 2050

    TGACTGCAAA TGTTTTAGGA ATATAATAAG ATATAATAAC AGTGGTTGCT 2100

    ATTTTCTTTA GCACAAGACT AGTCAACAGG CTGTATTAAA AGATCTTTTC 2150

    TTGAATTAAA TATTTTCAAT TTGATTAAAC CTACCTCAGC CATAAAGGCA 2200

45  AGCACATTTC ATTTATACTA TGGGGATTTG AATAATTATT ACTGAAGAAG 2250

    CTCTACCAAC AAAAAGTTTA TAGAGCTATC ATATTTAGTC AAGAGATAAA 2300

    GAGGGTTGTT AGGATATATA TGCTATTTGA AAGGTATTTA TAAAAGAAGA 2350

    GTATATTTAT CAAAATTTCT CAGAACATCC AAATTTCAAG TTTATCATTT 2400

    ATCTTACAAT ATTTCAAAAA TATTAAAATA GATACATGAA ATACAGAAGT 2450

50  AAATTAAAGA GAAAGTATTT TACTTGGTAA AAAAATTCTA GGTTGGACAG 2500

    AGAGTGCCAG GAAACAAAAA CAATGAAAAA TGTGACCTGA CTGGAATTAT 2550

    AGCTCAAAGT ATAGTAGTAA GTAATGAAAT GGCTTAAAAA TTGGTATATA 2600

    AAATGCTAGT TATAAAATAA ACAAAATGCA ATAATATCCT CCCTACATGT 2650

    AATGAATTCT AGGTATTATG CTCTTTTTTG AAGTCTTGAC AATAAAAATT 2700

55  TTTTTAGAAG TTTATAGGCA TCTTGAATAA AGTGAAACAA ATTAAGAATT 2750

    AGTATCCATG AGAAAAATAT AGAACAATTT TCCTAATTTA GTTTGAAAAT 2800

    CTGGGATTGA AGATGTGTGT CAAGAGATGT TGGTGGCAAG AACATTTTTT 2850

    TTTCAAGAAC TTATAAAAAT GCAACAAAAC AAACCATTTA ATACATTTTG 2900

    GTCAAAATCA ATAATGTATT TTATTTTATG CTCCAAGGAG CATAAAATTG 2950

60  GGGACTGGGC AAGAGAAACT GACACCCTGG TAAATTACCA AGAGATAAGT 3000

    ACACAGTTCT ATGTAGAGAA AATAAGCATA GTGTATGATC TCTAAAATTA 3050

    TGTGAGACAA AGGAGAGATG ACATTAGGCA TGTGGGGATG AAGACTGAGT 3100

    AGAGAAGAAA CAATCTAATC AGTCCAAGAA AACATCTCGA TCAGTGGAAC 3150

    AAATAGAAGA AATGCTAAAA TGAAACAGAA GTCTTACTGG AAATAAAAGA 3200

65  TATGCATAAG ACAAAAATTC ATGAAAATCA CTTAGTTTAG CAGAGAAAAG 3250

    ATAAAAATAA AGTATGACCT TCTTCATATA CATTGTTTGA TCATATGCAC 3300

    CTCAATAAAA CTGAGTCTCC AACAGAAATG AAACATTAAT ATTTTGTTCA 3350

    CTGCTCTAAT CCCAGAATCT AAGCGATATC TGGCAATAAA AATAATAAAT 3400

    ATATATTTTT TAATAAATGA ATCAACCACT TAATTTTTCT GTAAATATCT 3450

70  GTAACTTCTC TTCTGTCTTT CCAAAAACAC TCATAAGTAC TGTGAATGAG 3500

    ATGAAAAAGA GTGAAGTAGG ATATAGGCTG TTAGCAGAAA ACATCTGAAT 3550

    GGCTGGCAGT GAAACATTAA CTTGAAATGT AAGATTAATG AGTAATAGTA 3600

    AATTTTAACC TTGGCCATAT GATAAAATGT TCATTAATAT TTTTCTAGAA 3650

    TACAGGGCTT TTTGTTTTTG CCATGAGGTT TGCAGGATCT TGGTTCCCTG 3700

75  ACCAGGGATC AAACCTGCAC TCCCCTGGAA GCATGGAGTC TTGGACATCT 3750

    GTATTATACA CTATCTTTGG TTCCTTTTAA AGGGAAGTAA TTTTACTTAA 3800

    ATAAGAAAAT AGATTGACAA GTAATACGCT GTTTCCTCAT CTTCCCATTC 3850

    ACAGGAATCG AGAGCC                                      3866

<210>2

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(9)

<223>Not1位点

<400>2

 1  GCGGCCGCC                                              9

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>蛋白质分泌序列

<400>3

1  ATGAAGGTCC TCATCCTTGC CTGTCTGGTG GCTCTGGCCA TTGCA       45

<210>4

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(6)

<223>Xho1位点

<400>4

1  CTCGAG                                                  6

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(15)

<223>Enterokinase蛋白酶切位点

<400>5

1  GACGACGACG ACAAG                                        15

<210>6

<211>1299

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1299)

<223>人的抗凝血酶III(AT-III)基因序列(功能部分)

<400>6

1   CACGGGAGCC CTGTGGACAT CTGCACAGCC AAGCCGCGGG ACATTCCCAT 50

    GAATCCCATG TGCATTTACC GCTCCCCGGA GAAGAAGGCA ACTGAGGATG 100

    AGGGCTCAGA ACAGAAGATC CCGGAGGCCA CCAACCGGCG TGTCTGGGAA 150

    CTGTCCAAGG CCAATTCCCG CTTTGCTACC ACTTTCTATC AGCACCTGGC 200

5   AGATTCCAAG AATGACAATG ATAACATTTT CCTGTCACCC CTGAGTATCT 250

    CCACGGCTTT TGCTATGACC AAGCTTGGTG CCTGTAATGA CACCCTCCAG 300

    CAACTGATGG AGGTATTTAA GTTTGACACC ATATCTGAGA AAACATCTGA 350

    TCAGATCCAC TTCTTCTTTG CCAAACTGAA CTGCCGACTC TATCGAAAAG 400

    CCAACAAATC CTCCAAGTTA GTATCAGCCA ATCGCCTTTT TGGAGACAAA 450

10  TCCCTTACCT TCAATGAGAC CTACCAGGAC ATCAGTGAGT TGGTATATGG 500

    AGCCAAGCTC CAGCCCCTGG ACTTCAAGGA AAATGCAGAG CAATCCAGAG 550

    CGGCCATCAA CAAATGGGTG TCCAATAAGA CCGAAGGCCG AATCACCGAT 600

    GTCATTCCCT CGGAAGCCAT CAATGAGCTC ACTGTTCTGG TGCTGGTTAA 650

    CACCATTTAC TTCAAGGGCC TGTGGAAGTC AAAGTTCAGC CCTGAGAACA 700

15  CAAGGAAGGA ACTGTTCTAC AAGGCTGATG GAGAGTCGTG TTCAGCATCT 750

    ATGATGTACC AGGAAGGCAA GTTCCGTTAT CGGCGCGTGG CTGAAGGCAC 800

    CCAGGTGCTT GAGTTGCCCT TCAAAGGTGA TGACATCACC ATGGTCCTCA 850

    TCTTGCCCAA GCCTGAGAAG AGCCTGGCCA AGGTAGAGAA GGAACTCACC 900

    CCAGAGGTGC TGCAAGAGTG GCTGGATGAA TTGGAGGAGA TGATGCTGGT 950

20  GGTCCACATG CCCCGCTTCC GCATTGAGGA CGGCTTCAGT TTGAAGGAGC 1000

    AGCTGCAAGA CATGGGCCTT GTCGATCTGT TCAGCCCTGA AAAGTCCAAA 1050

    CTCCCAGGTA TTGTTGCAGA AGGCCGAGAT GACCTCTATG TCTCAGATGC 1100

    ATTCCATAAG GCATTTCTTG AGGTAAATGA AGAAGGCAGT GAAGCAGCTG 1150

    CAAGTACCGC TGTTGTGATT GCTGGCCGTT CGCTAAACCC CAACAGGGTG 1200

25  ACTTTCAAGG CCAACAGGCC TTTCCTGGTT TTTATAAGAG AAGTTCCTCT 1250

    GAACACTATT ATCTTCATGG GCAGAGTAGC CAACCCTTGT GTTAAGTAA  1299

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(6)

<223>连接序列

<400>7

1  ACCCTAATAA AACCA                                        15

<210>8

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(6)

<223>Taq1位点

<400>8

1  CTCGAC                                                  6

<210>9

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(6)

<223>Xho1位点

<400>9

1  CTCGAG                                                  6

<210>10

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(9)

<223>Not1位点

<400>10

1  GCGGCCGCC                                               9

<210>11

<211>2233

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2233)

<223>奶山羊β-酪蛋白的部分第7外显子至第9外显子基因序列。，

     基因打靶载体的3’同源臂

<400>11

1   ATCCCTTCAC TGGGCCCATC CCTAACAGCC TCCCACAAAA CATCCTGCCT 50

    CTTACTCAAA CCCCTGTGGT GGTGCCGCCT TTCCTTCAGC CTGAAATAAT 100

    GGGAGTCCCC AAAGTGAAGG AGACTATGGT TCCTAAGCAC AAAGAAATGC 150

    CCTTCCCTAA ATATCCAGTT GAGCCCTTTA CTGAAAGCCA GAGCCTGACT 200

5   CTCACTGATG TTGAAAAGCT GCACCTTCCT CTGCCTCTGG TCCAGTCTTG 250

    GATGCACCAG CCTCCCCAGC CTCTTTCTCC AACCGTCATG TTTCCTCCTC 300

    AGTCCGTGCT GTCCCTTTCT CAGCCCAAAG TTCTGCCTGT TCCCCAGAAA 350

    GTAGTGCCCC AGAGAGATAT GCCCATCCAG GCCTTTCTGC TGTACCAGGA 400

    GCCTGTACTT GGTCCTGTCC GGGGACCCTT CCCTATTCTT GTAAGTCTAA 450

10  ATTTACTAAC TGTGCTGTTT AACTTCTGAT GTTTGTATGA TATTTGAGTA 500

    ATTAAGAGCC CTACAAAAAA TCAATAATGA ATGGTTCCAA AATAAGCATA 550

    GCTGAGATTA ATGATTCTCA GCATTGGTTA TAAATAGAAT AAGCTGGAAA 600

    ACCTTCACCT CCCCTCCACC ACCAGATCTC AATGTCTAGG CTTACCCATG 650

    GAGATTCTGA TTAACTGTTC TTTCTATGTA GAAGAAACTT ATTGGGAAGA 700

15  AATAATATAA TGGACTATGA TTTAATTGGT CTGTTGAGAA TTTAGATGAA 750

    GGGGATTAAG TTACAATAAA GCCAGAATTG AACTTGATAA TCTCACTTGG 800

    CTAAGAATAA CAAACCTAAG AAGGTTTGCT ATTTTCTACA ATTTTGAAGT 850

    TTTCCTTATG CACAATTATT TCACCACATG ACTCATTTCA CCTCTTGTTT 900

    TTGATATATG AGCATATGAG GGCAAAATAC TGAAGATGCT TATTTCAATA 950

20  CTCAGGGAAA ATTTTCTTGC CAAAAGGCAA GAATTGTATA ATTCATTCAC 1000

    TTATTTTATT TTTTTAATTT TTAAGGTCTA AGAGGATTTC AAAGTGAATG 1050

    CCCCCTCCTC ACTTTTGGTA AGCTTTAGGA GATTGGAGGC AGACTGATCA 1100

    TTTTTATAGT TAATATCTTT TACATTTCAT CTTCCTGGAT AAGCCCCAAT 1150

    AGTAGCAATT TCTATCAGTA TACCAGCGTA AAGATTAGTT TTAAATATAT 1200

25  TTTCAGTGAT TGACTGTTAT TTACTGACCT GAAATTATGT ATCTGTTATA 1250

    TTTCAAATAA TGCAAAACTG TATATATATG GTGTTGACAG ATTTGATTGG 1300

    TTTTCTTTCA ATTGCCTATA TCCTTATTAT TGATTGTAAT CATTTATAGA 1350

    AAAAACAAAA TAATTTCTTA TACTTTTATG TAAACCTGTT AGAGCTTATT 1400

    TTAAAGATCA ACTGCATTCA CATTTCTAAT CTAGTCATTA TGAGCTTCAA 1450

30  TTGTTTTATC TCACTTAAAA TTTATATATT GTCTTTTAAT TCATGAGTCA 1500

    AAATACAATC TCACAGTCCA GATATGGGAC TTAAAAGGGG AATAGCATAT 1550

    AGTTTTGATA TTCTTAAAGA AATACATCTT TTTGTGATCA TGATTCAGCA 1600

    GACATTTTAA TAAAACAATT CCAAGTGAGC CGACACTTGG TCCTAGAGGA 1650

    ATTTTTATAA TCTTAAGGTA AGGCACAGCA TGGTGTTTTT GTAATAAGAT 1700

35  TTCTTTTATG AAAAAGTCAC ACCAAAATTG GAAATGGGGT GAGATGAAGA 1750

    GTTATAACAT ATAACTAAAT GGACATTTGT TCTCTATTCC ACAGAATTGA 1800

    CTGCGACTGG AAATATGGCA ACTTTTCAAT CCTTGCATCA TGCTACTAAG 1850

    ATAATTTTTA AATGAGTATA CATGGAACAA AAAATGAAAC TTTATTCCTT 1900

    TATTTATTTT ATGCTTTTTC ATCTTAATTT GAATTTGAGT CATAAACCAT 1950

40  ATACTTTCAA AATGTTAATT CAACATTAGC ATAAAAGTTC AATTTTAACT 2000

    TGGAAATATC ATGAACATAT CAAATTATGT ATAAAAATAA TTTCTGGAAT 2050

    TGTGATTATT ATTTCTTTAA GAATCTATTT CCTAACCAGT CATTTCAATA 2100

    AATTAACCCT TAGGCATATT TAAGTTTTCT TGTCTTTATT ATATTTTTAA 2150

    AAATGAAATT GGTCTCTTTA TTGTTAACTT AAATTTATCT TTGATGTTAA 2200

    AAATAGCTGT GGAAAATTAA AATTGGATAG AAT                   2233

<210>12

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(6)

<223>Sma1位点

<400>12

1  CCCGGG                                                  6

<210>11

<211>1104

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1104)

<223>Neo基因序列

<400>11

1   ATCCGAACAA ACGACCCAAC ACCCGTGCGT TTTATTCTGT CTTTTTATTG 50

    CCGATCCCCT CAGAAGAACT CGTCAAGAAG GCGATAGAAG GCGATGCGCT 100

    GCGAATCGGG AGCGGCGATA CCGTAAAGCA CGAGGAAGCG GTCAGCCCAT 150

    TCGCCGCCAA GCTCTTCAGC AATATCACGG GTAGCCAACG CTATGTCCTG 200

5   ATAGCGGTCC GCCACACCCA GCCGGCCACA GTCGATGAAT CCAGAAAAGC 250

    GGCCATTTTC CACCATGATA TTCGGCAAGC AGGCATCGCC ATGGGTCACG 300

    ACGAGATCCT CGCCGTCGGG CATGCGCGCC TTGAGCCTGG CGAACAGTTC 350

    GGCTGGCGCG AGCCCCTGAT GCTCTTCGTC CAGATCATCC TGATCGACAA 400

    GACCGGCTTC CATCCGAGTA CGTGCTCGCT CGATGCGATG TTTCGCTTGG 450

10  TGGTCGAATG GGCAGGTAGC CGGATCAAGC GTATGCAGCC GCCGCATTGC 500

    ATCAGCCATG ATGGATACTT TCTCGGCAGG AGCAAGGTGA GATGACAGGA 550

    GATCCTGCCC CGGCACTTCG CCCAATAGCA GCCAGTCCCT TCCCGCTTCA 600

    GTGACAACGT CGAGCACAGC TGCGCAAGGA ACGCCCGTCG TGGCCAGCCA 650

    CGATAGCCGC GCTGCCTCGT CCTGCAGTTC ATTCAGGGCA CCGGACAGGT 700

15  CGGTCTTGAC AAAAAGAACC GGGCGCCCCT GCGCTGACAG CCGGAACACG 750

    GCGGCATCAG AGCAGCCGAT TGTCTGTTGT GCCCAGTCAT AGCCGAATAG 800

    CCTCTCCACC CAAGCGGCCG GAGAACCTGC GTGCAATCCA TCTTGTTCAA 850

    TGGCCGATCC CATATTGGCT GCAGGGTCGC TCGGTGTTCG AGGCCACACG 900

    CGTCACCTTA ATATGCGAAG TGGACCTGGG ACCGCGCCGC CCCGACTGCA 950

20  TCTGCGTGTT CGAATTCGCC AATGAAACCA CACTGCTCGA CATTGGGTGG 1000

    AAACATTCCA GGCCTGGGTG GAGAGGCTTT TTGCTTCCTC TTGCAAAACC 1050

    ACACTGCTCG AGGAATTCAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT 1100

    ATGC                                                   1104

Claims (6)

1.一种利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是该方法包括下述步骤：

(1)选用哺乳动物的乳蛋白基因为转基因的调控区和表达框架，在乳蛋白基因的表达框架上建立唯一的酶切位点和乳蛋白分泌序列，然后将重组人的抗凝血酶III蛋白基因和肠激酶蛋白质酶切序列连接在乳蛋白基因的表达框架上，转基因载体的末端再连接一个筛选基因；

(2)所构建的载体经DNA序列分析，确定人的抗凝血酶III蛋白基因与乳蛋白基因的DNA序列，并与乳蛋白基因本身的表达和功能基因的氨基酸组成一致；

(3)用电穿孔或脂质体诱导的方法，将人的抗凝血酶III蛋白基因表达载体，转入体外培养的动物的体细胞中；

(4)在培养基中对细胞株进行筛选，获得筛选后的阳性细胞株；一部分细胞冷冻保存，一部分细胞用于制备DNA；

(5)阳性细胞株的DNA，经PCR和Southern杂交分析，确定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的细胞株；

(6)转基因的细胞株的细胞移入山羊成熟的去核卵母细胞的卵周隙内，然后使供核细胞和去核卵母细胞融合；

(7)将克隆胚胎移植到寄母羊的输卵管中，经妊娠获得转基因克隆羊；

(8)检测转人的抗凝血酶III蛋白基因的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白含量；

(9)含有人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物的乳汁中的重组人的抗凝血酶III蛋白的提纯；

(10)纯化的重组人的抗凝血酶III蛋白的动物试验；

(11)重组人的抗凝血酶III蛋白在人体上的应用。

2.按照权利要求1所述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的乳蛋白基因包括晡乳动物的：乳球蛋白、α-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳浆蛋白基因或乳铁蛋白基因。

3.按照权利要求1所述的利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是将人的抗凝血酶III蛋白基因连接在乳蛋白基因的表达框架上，并转入哺乳动物的基因组内，然后在转基因动物的乳汁中获得特异高效表达。

4.按照权利要求1所述的利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是所述的哺乳动物包括牛、绵羊和山羊、猪、兔、马。

5.一种利用乳腺生物反应器制备重组人的的抗凝血酶III蛋白的方法，生产含有重组人的抗凝血酶III蛋白的转基因动物，及其乳汁和制品。

6.按照权利要求5所述的转基因动物的乳汁进行提纯得到的重组人的抗凝血酶III蛋白，在治疗抗凝血酶III缺乏症中的应用。

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